JP2023529573A - 溶液の光学濃度を決定するための方法及び装置 - Google Patents

溶液の光学濃度を決定するための方法及び装置 Download PDF

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Abstract

Figure 2023529573000001
溶液の光学濃度を決定するための方法及び機器が開示される。少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃを有するフローセル１が設けられ（１００）、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有する。少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃで、溶液の吸光度の示度Ａが読み取られる（４００）。光路の各対で、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって、傾きαｃが計算される（５００）。計算した傾きαｃが比較され（６００）、（ａ）計算した傾きαｃが同じ場合、傾きは、溶液の光学濃度を決定するために使用され（７００）、または（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの最も急な傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用され（７０１ａ）、もしくは、計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用される（７０１ｂ）。

Description

本文書は、溶液の光学濃度を決定するための方法及び装置に関する。
分光光度法では、研究対象の試料物質が透明な容器（キュベットまたはフローセル）中に配置される。知られている波長λ（すなわち、紫外線、赤外線、可視光など）及び強度の電磁放射が、キュベットの片側に入射する。出射する光の強度を測定する検出器が、キュベットの反対側に配置される。光が試料を通って伝播する長さは距離ｄである。濃度ｃを有する単一で均質な物質からなる、たとえばタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡといった試料物質について、試料を透過した光は、ベールの法則、Ａ＝εｃｌとして知られている関係式にしたがうことになる。ここで、Ａは吸光度、εは吸光または減衰係数（通常は、所与の波長で一定）、ｃは試料の濃度、ｌは試料を通る光の経路長である。
そのようなシステムが、いわゆる固定経路長分光光度法システムである。機器の線形範囲内に入る吸光度値を測定するために、試料の希釈が必要なことが多い。しかし、監視者が長い時間にわたって連続的に吸光度を測定する必要があるクロマトグラフィまたはろ過システム中の検出器として使用するとき、希釈が可能でないことが多い。
希釈問題に対する１つの解決策は、吸光度測定をする際の経路長を減らすことである。測定経路長を減らすことによって、試料の体積を減らすことができる。経路長の減少によって、経路長の減少に比例して、測定される吸収がやはり減少する。試料の濃度が分光光度計の線形範囲外に出る場合、試料を依然として希釈する必要がある場合があり、または、さらに短い経路長を有する別のキュベットが必要となる場合があり、その後、正確な吸光度の読出しをすることができる。
可変経路長でフローセルに結合される分光光度計は、広いダイナミックレンジを有する試料物質の濃度を決定するため幅広く使用される技術になってきており、それによって、試料の濃度を、機器の吸光度検出の線形範囲内に入れるために調整する必要性が低下している。可変経路長を有する様々なそのようなシステムの例が、特許文献１、特許文献２，、及び特許文献３に示される。可変経路長を有するシステムを使用して、経路長に対してプロットするときに得られた吸光度曲線の傾きが、試料物質濃度の直接測定値である。複数の経路長が測定されて、傾きが連続的に計算され、その結果、スキャンサイクル毎に１つの吸光度値が得られる。絶対的な経路長を知る必要はない。可変経路長を有するシステムでは多くの利点があるが、そのようなシステムは、経路長の機械的な調整に起因する問題を経験する場合がある。さらに、異なる経路長での測定間に遅延があり、このことによって、遅い応答時間及び狭いピークでの不正確な結果がもたらされる場合がある。
吸光度検出器の線形ダイナミックレンジを拡大するため可変経路長を有するシステムを使用する代わりとして、固定多光路長フローセルを使用するシステムがある。たとえば、特許文献４を参照せよ。そこでは、その線形ダイナミックレンジを超える試料についての相対的な吸光度を開発する際に、比較的短い基準経路中の基準ビームの吸光度が、基準経路吸光度に対する比較的長い試料経路中の試料ビームの吸光度の比率で乗算される。
そのような手法では、それぞれの経路の経路長を正確に知る必要がある。さらに、短い経路長が依然としてシステムの線形ダイナミックレンジ内にあるかを決定するのが難しい場合がある。
米国特許第６，７４７，７４０号明細 米国特許第６，１８８，４７４号明細 米国特許第７，８０８，６４１号明細 米国特許第５，２１４，５９３号明細
溶液の光学濃度を決定するための改善した、または少なくとも代替の方法及び装置を提供することが本開示の目的である。したがって、添付した独立特許請求項によって規定されるような発明が提供される。従属請求項、添付図面、及び以下の記載から、非限定の実施形態が出てくる。
第１の態様によれば、溶液の光学濃度を決定するための方法が提供される。方法は、溶液入口及び溶液出口を有するフローセルを設けるステップを含み、フローセルは、溶液入口から溶液出口に向かう溶液の流れの方向が各光路を通過し、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有するように配置される、少なくとも３つの光路を備える。溶液は、溶液入口に加えられる。少なくとも３つの光路が照射され、少なくとも３つの光路を通過する電磁放射が検出されて、少なくとも３つの光路における溶液の吸光度の示度Ａが読み取られる。光路の各対で、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって、傾きαｃが計算される。その後、計算した傾きαｃが比較される。（ａ）計算した傾きαｃが同じ場合、傾きは、溶液の光学濃度を決定するために使用され、または（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの最も急な傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用され、もしくは、計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用される。
吸光度の示度は、光路の第１の側に配置される光源及び光路の反対側に配置される検出器を使用して、少なくとも３つの光路で読み取られる。使用される光は、可視スペクトル、近赤外線スペクトル、または紫外線スペクトルの光であってよい。
予め規定された経路長ｌを有する少なくとも３つの光路は、予想される光学濃度ＯＤの範囲に基づいて選択される。
経路長のうちの少なくとも２つは、吸光度の示度の線形ダイナミックレンジ内にある必要がある。線形ダイナミックレンジは、吸光度の示度が線形である試料の濃度の範囲である。定格濃度に対して異なる検体の濃度の吸光度の示度の応答をプロットすることによって、ダイナミックな線形濃度範囲にわたる直線がもたらされることになる。
ベール－ランベルトの法則は、Ａ＝αｌｃとして表され、ここで、Ａは測定される吸光度であり、αはモル吸光係数であり、ｌは経路長であり、ｃは試料の濃度である。この式は、次いで、傾き分光法で使用するために次のように並べ替えることができる。
Ａ／ｌ＝αｃ
計算した傾きが同じである場合、傾きαｃは、溶液の光学濃度を決定するために使用される。この場合、全部の経路長が、吸光度の示度の線形ダイナミックレンジ内にあると考えられる。このことは、全部の経路長が、（検出限度（ＬＯＤ）と線形ダイナミックレンジ（通常は、２ＡＵの線形限度）の間の吸光度範囲として規定される）許容範囲内であることを示している。
計算した傾きが同じでない場合、計算した傾きのうちの最も急な傾きを、溶液の光学濃度を決定するために使用することができる。最も急な傾きが最も正確な傾きである。非常に低い濃度では、この場合、最低値がＬＯＤに近く、したがって、より浅い傾きがもたらされる。計算した傾きが同じでない場合、計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きを、溶液の光学濃度を決定するために代わりに使用することができる。
計算した傾きが同じでない場合、第１のステップは、どの傾きがより急であるかを調べることとなる。次いで、第１の代替実施形態として、最も急な傾きをＯＤを決定するために使用することができる。絶対値を使用して、データの有効性を検証することができる。代わりに、第２の代替実施形態として、ＯＤの決定のために絶対値を使用することができる。最も急な傾きだけに基づいてＯＤ決定を行うことによって、絶対値を使用することよりも、ＯＤ決定がより不確実になる可能性がある。
溶液の光学濃度（ＯＤ）を決定するとは、本明細書では、溶液及びその中に懸濁する任意の粒子のＯＤを決定することを意味する。
溶液の光学濃度が一度決定されると、物質のモル吸光度Ｅが既に知られている場合、（上で規定される）ベール－ランベルトの法則を使用することによって、溶液の濃度を決定することができる。これは、手動で行うこと、またはコンピュータを使用して行うことができる。代わりに、溶液の濃度を、たとえば２８０ｎｍといった所与の波長で溶液またはその中に懸濁する物質について以前に作成された用量反応曲線を使用することによって決定することができ、または、異なる波長で生成される複数の反応曲線を使用することができる。いくつかの用途では、重要なのは、たとえば、クロマトグラフのカラム中のタンパク質を分離する期間の、吸光度の変化であって、そのために、物質の濃度を決定する必要はない。その場合、モル吸光度（Ｅ）を知る必要はない。第２のあまり吸収されない光に切り換えることにより、吸収の変化の割合のより良好な解像度、及びその結果濃度値の最大値または最小値に近づくことを実現することができるしきい値に吸光度が到達するとき、２つの周波数の光を使用することによって、この吸光度の変化をより詳細に監視することがやはり可能になる。
本方法では、可変経路長を有するフローセルを使用するとき、可動部品／再配置問題または漏洩の危険はない。また、より簡単な構成に起因して、洗浄するのが難しい停滞ゾーンが作られる危険が少ない。使用されるフローセルは、複数の予め規定された固定経路長を備える。本方法では、速い応答時間が得られ、傾きのどれが光学濃度の決定が基づくのに正しいのかを決めることが可能である。経路長がスキャンされる場合、全部の値を得るのに数秒かかる場合があり、そのときに濃度が変化する場合、示度が正確でないことになる。同時測定では、値を高い頻度で得ることができる。
フローセルは、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の光路を備えることができ、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有する。
より多くの光路を使用することによって、どの傾きが線形ダイナミックレンジ内にあり、どれが外側かを評価するための、より大きいダイナミックレンジ及びより良好なデータが得られる。通常は０．３ＡＵと１．５ＡＵの間の好ましい測定範囲にある範囲を見いだすことも容易となる場合がある。これが、検出限度（ノイズレベル）の十分上であり、検出器に到達するやはり十分な光がある（１．５ＡＵ＝３％が検出器に届く）範囲である。
少なくとも３つの光路から試料溶液の吸光度の示度Ａを同時に読み取ることができる。
タイミングは、流量及びチューブ直径とともに、溶液の流量に直接リンクする。ある吸光度を有するゾーンが異なる光路にいつ到達するかを計算することができ、次いで情報を使用して、測定の時間的解像度を向上させることができる。このことは、異なるセンサ（ＵＶ、導電率、ｐＨ）からの結果を整合させるために、クロマトグラフィの機器で一般的に行われる。
少なくとも３つの光路からの溶液の吸光度の示度Ａは、代わりに、連続的に読み取ることができる。
方法は、異なる経路長からの吸光度の示度間の遅延時間を計算するステップをさらに含むことができる。
この追加ステップは、たとえば、吸光度特性の速い変化を有する溶液を分析するときに使用することができる。
計算した傾きαｃを比較するときに、（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの０．０５～１．５または０．２～１の吸光度の示度の範囲にある傾きを、溶液の光学濃度を決定するために使用することができる。
一実施形態では、少なくとも３つの光路を同じ波長で照射することができる。
同じ波長を使用することで、未知の溶液及びその中に懸濁する任意の粒子の光学濃度（ＯＤ）を決定することが可能である。
別の実施形態では、少なくとも３つの光路のうちの少なくとも１つを、他の光路を照射するために使用される波長と異なる波長で照射することができる。
そのような方法は、たとえば、知られている吸光度係数を有する溶液の光学濃度（ＯＤ）が分析される場合に使用することができる。異なる波長で照射される異なる光路からの傾きを比較するとき、使用される波長の差異は補正されなければならない。
あるいは、方法において、最適化フェーズの期間に異なる波長を使用することができる。全光路の照射のための最適な波長を識別するため、光路が異なる波長で照射される。光路の照射のために使用される波長が飽和した（したがって、ＯＤ決定から除外される）光路をもたらす場合、この波長は、光路を照射するための波長として使用されない。
第２の態様によれば、溶液の光学濃度を決定するための機器が提供され、機器は、溶液入口及び溶液出口を有するフローセルを有し、フローセルは少なくとも３つの光路を備え、溶液入口から溶液出口に向かう溶液の流れの方向が各光路を通過し、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有するように各光路が配置される。光源は、少なくとも３つの光路を照射するように配置される。検出器は、光路の光源から反対側に置かれ、検出器が光源から光路を通る電磁放射を検出するように配置される。データ処理手段は、溶液の光学濃度を決定するために配置される。データ処理手段は、少なくとも３つの光路で溶液の吸光度の示度Ａを計算し、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって光路の各対についての傾きαｃを計算して計算した傾きαｃを比較し、（ａ）計算した傾きαｃが同じ場合、傾きは、溶液の光学濃度を決定するために使用され、または（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの最も急な傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用され、もしくは、計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きが溶液の光学濃度を決定するために使用されるように配置される。
光源は、各光路に１つの、複数の発光ユニットを備えることができる。
光源は、多重化発光ユニットであってよい。
多重化ユニットは、異なる光路間の速い切換のために配置することができる。
光源は、各光路に１つのチャネルを有する分割型光源であってよい。
そのような光源は、ビームスプリッタを含むことができる。高品質なデータのため、基準検出器があってもよい。光は、光源強度のばらつきを相殺できるように、ビームスプリッタで分割される。
検出器は、各光路に１つの、複数の検出器ユニットを備えることができる。
検出器は、多重化検出器ユニットであってよい。
そのような場合には、光路を通して検出される電磁放射は、同時に検出されないが、（プロセスを監視するのに必要なものよりはるかに速く（１秒のサイクル時間より短い））高速で順に検出される。
傾き分光分析の原理を示す図である。 溶液中の試料の濃度を決定するための機器で使用する、複数の固定経路長を有するフローセルを示す図である。 固定経路長を有する３つの照射光路を概略的に示す図である。 図２に示されるフローセルの概略断面図である。 溶液中の試料の濃度を決定するための方法を概略的に図示する図である。 ３つの光路を有するフローセル中の光路の各対についての計算した傾きαｃを示す図である。傾きは、光路の各対について、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって計算される。計算した傾きは同じである。 ３つの光路を有するフローセル中の光路の各対についての計算した傾きαｃを示す図である。傾きは、光路の各対について、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって計算される。計算した傾きは異なる。 ３つの光路を有するフローセル中の光路の各対についての計算した傾きαｃを示す図である。傾きは、光路の各対について、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって計算される。計算した傾きは異なる。 ３つの光路を有するフローセル中の光路の各対についての計算した傾きαｃを示す図である。傾きは、光路の各対について、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって計算される。計算した傾きは異なる。
図５に、分光光度法によって溶液の光学濃度を決定するための方法が概略的に図示される。溶液は、濃度ｃを有する単一で均質な物質からなる、たとえばタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡを含むことができる。溶液の光学濃度（ＯＤ）を決定するとは、本明細書では、溶液及びその中に懸濁する任意の粒子のＯＤを決定することを意味する。方法は、溶液入口２及び溶液出口３を備えるフローセル１を設けるステップ１００を含む。図２には、３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃを有するそのようなフローセル１が示され（光路の数は、４、５、６、またはそれ以上など、３より多くてよい）、フローセル１は、溶液または溶液中の試料／粒子の光学濃度を決定するための機器（図示せず）中で使用することができる。図４には、図２中のフローセルの断面が示される。図３には、固定経路長を有する３つの照射光路４ａ、４ｂ、４ｃが概略的に図示される。
光路４ａ、４ｂ、４ｃは、フローセル１中に交換可能に搭載可能な、それぞれ予め規定された固定経路長ｌを有する別個のユニットによって構成することができる。そのようなユニットは、たとえばキュベットであってよい。あるいは、光路４ａ、４ｂ、４ｃは、図４に図示されるようにフローセル中に配置することができる。予め規定された経路長ｌを有する光路／ユニットは、測定される溶液の範囲の、予想される光学濃度ＯＤに基づいて選択される。経路長のうちの少なくとも２つは、吸光度の示度の線形ダイナミックレンジ内にある必要がある。線形ダイナミックレンジは、吸光度の示度が線形である試料の濃度の範囲である。定格濃度に対して異なる検体の濃度の吸光度の示度の応答をプロットすることによって、ダイナミックな線形濃度範囲にわたる直線がもたらされることになる。
第２のステップ２００において、溶液が溶液入口２に加えられる。溶液出口３に向かう途中で溶液入口２でフローセルに加えられる溶液の流れの方向Ｆが、各光路４ａ、４ｂ、４ｃを通過するように、光路４ａ、４ｂ、４ｃが配置される。図３に図示されるように、少なくとも３つの異なる光路４ａ、４ｂ、４ｃは、フローセル１の入口２から出口３に向かって流れる溶液の流れの方向Ｆにほぼ垂直な方向で、フローセル１中に配置することができる。光路中の液体が停滞ゾーンを形成せず、光路４ａ、４ｂ、４ｃの体積全体を液体／溶液が満たす限り、光路に垂直以外の、他の流れの方向Ｆが可能である。たとえば、流れの少なくとも部分が光路に平行であってよい。光路が短い場合、たとえば、光路を過ぎた溶液の部分の方向を変えることによって、溶液の流れＦを調整する特殊な処置をとらなければならない場合がある。光路を照射するとき、溶液中の粒子の濃度が、少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃの全部でほぼ同じであるように、溶液／液体をやはり均質に混合しなければならない。
図３及び図４に図示されるように、１つの光路を照射する光が別個の隣接する光路を照射しない、すなわち、光路間に「クロストーク」がないように、光路４ａ、４ｂ、４ｃを配置しなければならない。したがって、図３及び図４に図示されるように、光路４ａ、４ｂ、４ｃは、互いにほぼ平行に配置する場合があり、または、それらは、光路間にクロストークがない限り、互いに対する任意の他の方法で配置することができる。あるいは、光路４ａ、４ｂ、４ｃは、ｚ方向に光路間に小さい距離を有する、らせん配置を形成した、互いに対してある角度（たとえば、９０度）で配置することができる。光路のそのような配置は、ほぼ平行な光路を有する配置より小型であって、フローセルの無効体積を最小化することになる。
少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃは、光路４ａ、４ｂ、４ｃの第１の側に配置される光源５ａ、５ｂ、５ｃを使用して、同じ波長で同時にまたは連続的に照射することができる（３００）。あるいは、少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃのうちの少なくとも１つを、他の光路を照射するのに使用される波長と異なる波長で照射することができる。
使用される光は、可視スペクトル、近赤外線スペクトル、または紫外線スペクトルの光であってよい。光路を通過する電磁放射が光路の光源から反対側に配置される検出器６ａ、６ｂ、６ｃによって検出されて、少なくとも３つの光路における溶液の吸光度の示度Ａが読み取られる（４００）。
吸光度は、光が試料溶液を通過するときの、減衰の量または強度の低下を測定する。ＯＤは、１センチメートルの経路長当たりの減衰の量を測定し、この値は、ここで濃度に直接関係する。散乱光は、吸光度と比較して非常に小さいことがほとんどである。
光源５ａ、５ｂ、５ｃは、図４に図示されるように、各光路４ａ、４ｂ、４ｃに１つの、複数の発光ユニットを備えることができる。光源５ａ、５ｂ、５ｃは、異なる光路間の速い切換のための多重化発光ユニットであってよい。あるいは、光源５ａ、５ｂ、５ｃは、各光路に１つのチャネルを有する分割型光源であってよい。
検出器６ａ、６ｂ、６ｃは、図４に図示されるように、各光路４ａ、４ｂ、４ｃに１つの、複数の検出器ユニットを備えることができる。検出器６ａ、６ｂ、６ｃは、多重化検出器ユニットであってよい。
光路４ａ、４ｂ、４ｃの各対で、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって、傾きαｃが計算される（５００）。
傾き分光法の原理が図１に図示される。ベール－ランベルトの法則は、Ａ＝αｌｃとして表され、ここで、Ａは測定される吸光度であり、αはモル吸光係数であり、ｌは経路長であり、ｃは試料の濃度である。この式は、次いで、傾き分光法で使用するために次のように並べ替えることができる。
Ａ／ｌ＝αｃ
回帰係数分析を使用して、方法についての品質データを計算することができる。傾き及び経路長を比較する測定について、線形回帰方程式は、Ａ＝ｍｌ＋ｂと書くことができ、ここで、ｍは回帰直線の傾きであり、ｂがｙ切片である。次いで、次元方程式によって、上の第２の式の左側を第３の式からの傾き項で置き換えることが可能になり、次式がもたらされる。
ｍ＝αｃ
その結果として得られた式は、傾き分光法方程式と呼ばれる。非常に小さい試料の濃度では、より浅い傾きを与えることによって、ノイズを制限することができる。
その後、計算した傾きαｃが比較される（６００）。（ａ）計算した傾きαｃが同じである場合、図４ａを参照し、傾きは、溶液／溶液中の試料の光学濃度（ＯＤ）を決定するために使用される（７００）。この場合、全部の経路長が、吸光度の示度の線形ダイナミックレンジ内にあると考えられる。
（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、図４ｂ～図４ｄを参照し、計算した傾きのうちの最も急な傾きを溶液のＯＤを決定するために使用することができる（７０１ａ）。代替として、計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの０．０１～２、または０．０５～１．０、または０．２～１の吸光度の示度の範囲にある傾きを、溶液の光学濃度を決定するために使用することができる（７０１ｂ）。
計算した傾きが同じでない場合、第１のステップは、どの傾きがより急であるかを調べることとなる。次いで、第１の代替実施形態として、最も急な傾きをＯＤを決定するために使用することができる。絶対値を使用して、データの有効性を検証することができる。代わりに、第２の代替実施形態として、ＯＤの決定のために絶対値を使用することができる。最も急な傾きだけに基づいてＯＤ決定を行うことによって、絶対値を使用することよりも、ＯＤ決定がより不確実になる可能性がある。
図４ｂでは、最も短い経路長が検出限度の下である場合が示される。図４ｃでは、最も長い経路長が飽和する一方で、２つのより短い経路長が０．２～０．１ＡＵの吸光度を有する場合が示される。図４ｄでは、最も短い経路長が飽和する一方で、より長い経路長が０．２～１．５の吸光度を有する場合が示される。飽和した経路長は、ＯＤ決定から除外しなければならない。
フローセルが３つより多い異なる光路を備え、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有するとき、光路の各対で、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって、傾きαｃが計算される（５００）。たとえば、５つの異なる光路がある場合、計算される傾きの数は４である。これらの傾きは、次いで、上で記載したように比較され（６００）、（ａ）計算した傾きαｃが同じ場合、傾きは、溶液の光学濃度を決定するために使用される（７００）。
（ｂ）計算した傾きαｃが同じでない場合、図４ｂ～図４ｄを参照し、計算した傾きのうちの最も急な傾きを溶液のＯＤを決定するために使用することができる（７０１ａ）。
代替として、計算した傾きαｃが同じでない場合、計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きを、溶液の光学濃度を決定するために使用することができる（７０１ｂ）。より多くの光路を使用することによって、より大きいダイナミックレンジ及びより良好なデータが得られ、どの傾きが線形ダイナミックレンジ内にあり、どれが外側かを評価することになる。
少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃが同じ波長で照射されるとき、未知の溶液及びその中に懸濁する任意の粒子のＯＤを決定することが可能である。
少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃのうちの少なくとも１つが、他の光路を照射するために使用される波長と異なる波長で照射されるとき、知られている吸光度係数を有する溶液のＯＤを分析することができる。異なる波長で照射される異なる光路からの傾きを比較するとき、使用される波長の差異は補正されなければならない。
あるいは、方法において、最適化フェーズの期間に異なる波長を使用することができる。光路４ａ、４ｂ、４ｃ全体の照射のための最適な波長を識別するため、光路が異なる波長で照射される。光路の照射のために使用される波長が飽和した（したがって、ＯＤ決定から除外される）光路をもたらす場合、この波長は、光路を照射するための波長として使用されない。
データ処理手段７（図２）は、少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃで溶液の吸光度の示度を読み取り（４００）、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって光路４ａ、４ｂ、４ｃの各対についての傾きαｃを計算して（５００）、計算した傾きαｃを比較し（６００）、（上で述べたように）溶液の光学濃度を決定する（７００、７０１ａ、７０１ｂ）ように配置することができる。
試料溶液の吸光度の示度Ａを少なくとも３つの光路４ａ、４ｂ、４ｃから同時に読み取ることができる。しかし、測定を同時に行う必要はない。異なる光路の場所間の、溶液の流量／運動が知られており補正することができる場合、異なる光路４ａ、４ｂ、４ｃの吸光度測定を順次行うことができる。このことによって、応答時間が改善されることになる。
方法は、異なる経路長４ａ、４ｂ、４ｃからの吸光度の示度間の遅延時間を計算するステップをさらに含むことができる。この追加ステップは、たとえば、吸光度特性の速い変化を有する（試料）溶液を分析するときに使用することができる。溶液の流量及びチューブ直径がわかると、異なる光路の異なる場所間の試料ピークの移行時間を計算することができ、これらの光路からの結果を整合させるために使用することができる。
１ フローセル
２ 溶液入口
３ 溶液出口
４ａ 光路
４ｂ 光路
４ｃ 光路
５ａ 光源
５ｂ 光源
５ｃ 光源
６ａ 検出器
６ｂ 検出器
６ｃ 検出器
７ データ処理手段

Claims (15)

  1. 溶液の光学濃度を決定するための方法であって、
    溶液入口（２）及び溶液出口（３）を有するフローセル（１）を設けるステップ（１００）であって、前記フローセル（１）が、前記溶液入口（２）から前記溶液出口（３）に向かう溶液の流れの方向（Ｆ）が各光路を通過し、各光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有するように配置される、少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を備える、ステップ；
    前記溶液を前記溶液入口（２）に加えるステップ（２００）と、
    前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を照射するステップ（３００）と、
    前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を通過する電磁放射を検出し、前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）における前記溶液の吸光度の示度Ａを読み取るステップ（４００）；
    吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）の各対についての傾きαｃを計算するステップ（５００）；
    前記計算した傾きαｃを比較するステップ（６００）；及び、
    （ａ）前記計算した傾きαｃが同じ場合、前記傾きを、前記溶液の光学濃度を決定するために使用するステップ（７００）、または
    （ｂ）前記計算した傾きαｃが同じでない場合、前記計算した傾きのうちの最も急な傾きを前記溶液の光学濃度を決定するために使用するステップ（７０１ａ）、もしくは、前記計算した傾きのうちの傾きが０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある場合、その傾きを前記溶液の光学濃度を決定するために使用するステップ（７０１ｂ）；
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記フローセル（１）が、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を備え、各光路がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）からの前記溶液の吸光度の示度Ａが、同時に読み取られる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）からの前記溶液の吸光度の示度Ａが、連続的に読み取られる、請求項１または２に記載の方法。
  5. 異なる経路長からの吸光度の示度間の遅延時間を計算するステップをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記計算した傾きαｃを比較する（６００）ときに、（ｂ）前記計算した傾きαｃが同じでない場合、前記計算した傾きのうちの０．０５～１．５または０．２～１の吸光度の示度の範囲にある傾きが、前記溶液の光学濃度を決定するために使用される（７０１ｂ）、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）が同じ波長で照射される（３００）、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）のうちの少なくとも１つが、他の光路を照射するのに使用される波長と異なる波長で照射される（３００）、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 溶液の光学濃度を決定するための機器であって、
    溶液入口（２）及び溶液出口（３）を有するフローセル（１）であって、前記フローセル（１）が少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を備え、前記溶液入口（２）から前記溶液出口（３）に向かう溶液の流れの方向（Ｆ）が各光路を通過し、各光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）がそれぞれ予め規定された経路長ｌを有するように各光路が配置される、フローセル（１）と、
    前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を照射するように配置される光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）と、
    前記光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）の前記光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）から反対側に置かれる検出器（６ａ、６ｂ、６ｃ）であって、前記光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）から前記光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）を通った電磁放射を検出するように配置される、検出器（６ａ、６ｂ、６ｃ）と、
    前記溶液の光学濃度を決定するためのデータ処理手段（７）であって、前記少なくとも３つの光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）で前記溶液の吸光度の示度Ａを計算し、吸光度の示度の差ΔＡを経路長の差Δｌで割ることによって光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）の各対についての傾きαｃを計算して、前記計算した傾きαｃを比較し、（ａ）前記計算した傾きαｃが同じ場合、前記傾きが、前記溶液の光学濃度を決定するために使用され、または（ｂ）前記計算した傾きαｃが同じでない場合、前記計算した傾きのうちの最も急な傾きが前記溶液の光学濃度を決定するために使用され、もしくは、前記計算した傾きのうちの０．０１～２の吸光度の示度の範囲にある傾きが前記溶液の光学濃度を決定するために使用されるように配置される、データ処理手段（７）と、
    を備えることを特徴する機器。
  10. 前記光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）が、各光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）に１つの、複数の発光ユニットを備える、請求項９に記載の機器。
  11. 前記光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）が、多重化発光ユニットである、請求項９または１０に記載の機器。
  12. 前記光源（５ａ、５ｂ、５ｃ）が、各光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）に１つのチャネルを有する分割型光源である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の機器。
  13. 前記検出器（６ａ、６ｂ、６ｃ）が、各光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）に１つの、複数の検出器ユニットを備える、請求項９から１２のいずれか一項に記載の機器。
  14. 前記検出器（６ａ、６ｂ、６ｃ）が、多重化検出器ユニットである、請求項９から１３のいずれか一項に記載の機器。
  15. 前記光路（４ａ、４ｂ、４ｃ）が、らせん配置で互いに対してある角度で配置される、請求項９から１３のいずれか一項に記載の機器。
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