JP2023528551A - 操作されたｇｙｒｉ様ムテインアプタマー、および関連する方法 - Google Patents

操作されたｇｙｒｉ様ムテインアプタマー、および関連する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、タンパク質工学、分子イメージング、および分子診断の分野に関する。より具体的には、本明細書では、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーを足場として使用して産生された新規の合成アプタマーが提供される。合成ムテインアプタマーを得る方法および使用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，６６８号に対する優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上述のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１１月４日に作成され、１２８６１７－００１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、８１，１８４バイトのサイズである。
本発明は、タンパク質工学、分子イメージング、分子診断、およびバイオ医薬品の分野に関する。
指向性進化法と組み合わせた生体分子工学は、バイオテクノロジー分野およびバイオ医薬分野のための重要なツールを提供している。機能を改善する能力、または新規な機能を選択する能力によって、産業、研究、および医学を変革した特殊な抗体、遺伝子編集ツール、抗体代替物、プロドラッグおよび薬物送達技術の重要な変化形がもたらされた。生体分子工学における課題は、好適なタンパク質、ＲＮＡ、または場合によってはＤＮＡアプタマーを、無作為化されたバリアントの大規模ライブラリーから見つけること、さらに、確固たる正確な選択方法を見つけることである。それにもかかわらず、生体分子工学は、比較ゲノミクスから識別されるタンパク質ドメインの数の増加、ならびに核酸合成および修飾の改善された方法に起因して、徐々にさらなる成功をおさめつつある。
タンパク質工学は、多数のバイオテクノロジーツールを提供してきた。生化学技術および分子生物学技術を使用して、いくつかの画期的な発明は、有用なバイオテクノロジー用途に向けて生体巨大分子を操作することによって、生体巨大分子の天然の機能を利用する。現在、目的の標的分子に結合する操作された抗体、ゲノム合成およびゲノム修飾ツール、治療用タンパク質、ならびに広範な機能性を有する操作された酵素などの重要なツールを識別することが可能である。バイオテクノロジーツールの最新の発展は、複数の用途のための汎用性のあるタンパク質の需要とともに、タンパク質工学の分野を推進し続けている。
操作された抗体は、研究、診断、および治療において極めて重要な役割を果たす。モノクローナル抗体が、核酸、タンパク質、糖、金属、および小分子を含む幅広い抗原を合理的な親和性で認識する天然の能力により、それらは、バイオテクノロジーにおける生物学的認識のための最上級の分子となる。過去１０年間で、最も良く売れており、最も効果的な薬物の大部分は、モノクローナル抗体の革新および操作である。さらに、抗体は、細胞イメージング、バイオマーカーを検出するための分子診断技術、および標的化薬物送達の新規な機構の重要な構成要素となっている。抗体は、研究およびバイオテクノロジーにとって非常に変革的であったにもかかわらず、その複雑さ、ならびに製造および維持の高い効果的なコストは、バイオテクノロジーおよび医学におけるツールとしての効率的な使用を妨げ続けている。
研究および生物工学の進歩により、モノクローナル抗酸化物と同様に機能するアプタマーバリアントの作製が可能になった。これらのアプタマーは、高い親和性および感受性で、目的の標的分子を認識することができる。小分子認識の場合、アプタマーは、特に抗体スクリーニングが失敗した場合に、生物学的認識モチーフを設計するという課題を克服した。アプタマーは、小さいサイズ、生産からのより高い収率、費用対効果、低い交差反応性、より長い貯蔵寿命、および非生理学的条件で機能する能力などの好ましい特性を示す。これまでに、バイオテクノロジーおよび医療用途で使用されるように設計されているアプタマーとしては、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｄｖｉｍｅｒ、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎ－フィンガーヌクレアーゼ、Ｋｎｏｔｔｉｎなどが挙げられる。アンチカリンおよびＤＡＲＰｉｎは、多くの用途において抗体を置き換えるように設計することができるほど、十分に汎用性が高い。実際、これらの技術のいくつかは現在、後期臨床試験で調査されている。
蛍光タンパク質ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、およびそれらの操作されたバリアントは、生理学的プロセスに関する膨大で詳細な情報を提供することによって、細胞イメージングに革命をもたらした分子技術を提供している。そのような技術を使用して、内因性タンパク質の発現は、細胞局在化または生物学的相互作用を追跡することに加えて、空間的および時間的にモニタリングすることができる。過去２０年間にわたって、蛍光イメージングは、がん、発生生物学、神経科学、薬理学における生物学的経路を研究するための先駆的な方法である。天然蛍光タンパク質のより明るく、より光安定性の高いバリアントの作製は、生物標本を画像化するために現在使用されている強力な細胞イメージング技術の開発において、重要なステップであった。これらのバリアントの細胞分解能は、単一分子の生物物理学的研究をナノメートルスケールほどの低さで行うことができるほど強力である。これらのバリアントは、より高い光安定性および改善された量子収率を有する変異体のための変異誘発およびスクリーニングによって作製された。蛍光タンパク質およびそれらの光安定性バリアントは、細胞イメージング技術の発展に深い影響を及ぼしたが、フルオロフォアの成熟およびタンパク質フォールディングの化学的プロセスは、依然としていくつかの制限を提示する。フルオロフォアの化学成熟に依存しない蛍光タンパク質、またはタンパク質フォールディングが改善されたタンパク質を設計することができる場合、天然蛍光タンパク質およびそれらの操作された誘導体の限界を克服するために、蛍光イメージング技術を作成することができる。
最近の進歩は、天然蛍光タンパク質と同様に機能する操作された蛍光モジュールを作製する合成方法を示している。これらのモジュールは、非蛍光アプタマーと非蛍光または弱蛍光フルオロフォアとが結合し、その後、複合体が蛍光性となる、蛍光増強の機構によって機能する。このようなモジュールは、蛍光が、フォールディングまたは化学的成熟に依存せず、２つの構成要素の会合のみに依存するスイッチ活性化蛍光システムを提供する。そのようなモジュールの最初のものは、非蛍光色素マラカイトグリーンに結合し、その蛍光を活性化するように選択されたＲＮＡベースの蛍光アプタマーであった。マラカイトグリーンアプタマーは、同様の様式で機能する、改善された細胞傷害性が低いモジュールを発見するための基礎を提供した。これらのモジュールはまた、それぞれ、ホウレンソウ、トウモロコシ、およびマンゴーと呼ばれるＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＹＦＰフルオロフォアの化学類似体に結合するように選択されたＲＮＡアプタマーである。まとめると、これらのＲＮＡアプタマーは、天然蛍光タンパク質の合成模倣物を表し、すべてが蛍光増強の同じ機構を介して機能する。すべての場合において、弱い蛍光フルオロフォアは、ＲＮＡアプタマー内のＧ－四重鎖二次構造によって形成される芳香族環境に閉じ込められる。このリガンド結合相互作用は、疎水性効果によって駆動され、フルオロフォア中の化学部分の回転自由度を厳しく制限し、したがって、より高い光の吸収および放出を引き起こす。これまでに、これらの蛍光ＲＮＡは、ｍＲＮＡ発現、タンパク質合成、ｍＲＮＡ局在化、スプライシング、またはＲＮＡベースのバイオセンサーとしての研究のために、細胞イメージング技術における発蛍光性レポーターとして利用されている。しかしながら、ＲＮＡベースの蛍光アプタマーにも制限がある。これは、フルオロフォア結合および蛍光活性化を制限するＲＮＡ四重鎖構造のインビボフォールディングがうまくいかないことに加えて、主にＲＮＡを伴うプロセスを研究するために使用することができるためである。
発蛍光性ＲＮＡと同様に機能する合成蛍光タンパク質を、選択的に識別することができ、または合理的に設計することができる。過去１０年間にわたって、いくつか発蛍光団活性化タンパク質（ＦＡＰ）が、抗体結合技術を使用して設計されている。これらのＦＡＰは、マラカイトグリーン、ジメチルインドールレッドおよびチアゾールオレンジなどの弱いフルオロフォアに結合し、それによってそれらの蛍光を活性化することができる。より最近では、計算研究により、ＧＦＰのフルオロフォア類似体に結合するように設計されたデノボβ－バレルが、蛍光増強アプタマーとして使用され得ることが示されている。このアプタマーは、天然に存在するβ－バレルと合成β－バレルとの間でフルオロフォア相互作用のタイプが著しく異なるにもかかわらず、ＧＦＰに同様に機能する。実際に、合成ＧＦＰ β－バレルは、インビボでも機能するが、操作されたＧＦＰよりも３５倍弱い。しかしながら、変異スクリーニングおよび計算設計によって、蛍光増強のかなりの改善の余地がある。
合理的に設計されたβ－バレル蛍光タンパク質およびＦＡＰは、他の蛍光増強タンパク質の設計に適用可能な重要な原理を示した。重要な相互作用は、ほとんどの疎水性環境によってさらに安定化されるフルオロフォア上の極性基との特異的水素結合であった。これらの相互作用を制限することにより、発蛍光団の回転の自由度が低下し、そのような相互作用を通じて蛍光を刺激する。蛍光ＲＮＡアプタマーの場合、蛍光を増強する相互作用は、極性相互作用からのわずかな寄与を伴う芳香族相互作用のみを介するものであった。これらの原理に基づいて、芳香族および極性残基の混合物を有する多重特異性結合部位を含有するタンパク質は、強力な蛍光増強アプタマーの設計のための重要なテンプレートとして機能し得る可能性が高い。
研究および診断混合物における分析物としての化学物質、生化学物質、および生物学的物質を検出し、定量化する迅速で非常に特異的な方法の必要性が継続的に拡大している。特に価値のあるのは、少量の核酸、ペプチド、糖、医薬品、代謝産物、微生物、および診断価値のある他の材料を測定するための方法である。かかる材料の例としては、治療目的で投与される麻薬および毒物、薬物、ホルモン、病原微生物およびウイルス、ペプチド、例えば、抗体および酵素、ならびに核酸、特に疾患状態に関与するものが挙げられる。
分子イメージングおよび分子診断における使用のための改良された酵素またはタンパク質の必要性が、当該技術分野に存在する。
本発明は、タンパク質工学、分子イメージング、および分子診断の分野に関する。より具体的には、本明細書では、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーを足場として使用して合成非天然バリアントアプタマーを設計するための新規の方法が提供され、これにより、非天然バリアントタンパク質は、ＧＹＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥとも称される。多数の標的有機分子に結合することができる非天然バリアントＧＹＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥアプタマーも、本明細書で提供される。特定の実施形態において、本発明のＧｙｒＩ様バリアントＧＹＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥアプタマーは、オン／オフバイオスイッチ（ｂｉｏｓｗｉｔｃｈ）として有用であり、現行のスイッチよりもはるかに複雑ではなく、プロテアーゼの使用を必要としない。他の実施形態において、ＧｙｒＩ様バリアントＧＹＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥアプタマーを利用する本発明の二重オン／オフバイオスイッチは、インビボおよびインビトロで複雑な生物学的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために使用することができる。
ＧｙｒＩ様タンパク質は、原核生物および真核生物に広く分布しており、小分子結合タンパク質として認識される。タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリー（ＰＦＡＭ ＰＦ０６４４５）は、汎用性があるアプタマーを作製するために必要な特性を含有する多重特異性結合足場を表す。この大きいファミリーは、シート－ヘリックス－シート－シートモチーフの対称的な複製によって定義される、小さいリガンド結合ドメイン（約１５ｋＤａ）を有するタンパク質を含有する。このファミリーは、部分的に特性決定されているが、いくつかのＧｙｒＩ様タンパク質は、有機色素、抗生物質、抗がん薬物、洗剤、および四級アミンを含む幅広い小分子に広範囲に結合することが示されている。最も良く特性決定されたメンバーは、薬物センサーおよび多剤耐性経路の活性化因子として作用する細菌転写因子であるＢｍｒＲである。ＢｍｒＲは、化学的特性および物理的特性が著しく異なる幅広い化学構造に結合することができる。ＢｍｒＲによる無差別なリガンド認識の機構は、理解されているが、その複数ドメインの複雑さのために、アプタマー設計に好適なテンプレートではない。それにもかかわらず、汎用性の高いアプタマー設計のための理想的な候補である複数の小さい単一ドメインＧｙｒＩ様タンパク質が存在し、そのいくつかは部分的に特性決定されている。これらには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＳＡＶ２４３５、Ｃ．ｔｅｐｉｄｉｕｍ由来のＣＴＲ１０７、およびＬ．ｉｎｎｏｃｕａ由来のＬＩＮ２１８９が含まれる（図１）。これらの３つは、いずれも構造的に特性決定されており、ＢｍｒＲの無差別なリガンド結合ドメインに類似する結合エレメントを含有する。それらの小さいサイズと、安定した三次元フォールディングにより、標的分子への結合について容易にスクリーニングすることができる変異体ライブラリーの生成が可能になる。ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７は、有機色素に結合することができ、一方、ＬＩＮ２１８９は、シクロプロパノイド抗生物質を加水分解することができる酵素であるが、その無差別度は不明である。３つすべてのタンパク質の結合部位の可変性は、機能し得る小分子結合アプタマーをスクリーニングするのに好適な出発テンプレートを提供し、広範囲の用途である。
本発明は、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーから設計された様々な有機分子に結合する、ＧＹＲＡＰＴと称される組換えアプタマーを識別するための材料および簡略化された方法を記載する。ここでは、設計された本願発明者らのスクリーニングアッセイを使用して、有機分子に結合することができる組み換え操作されたＧＹＲＡＰＴＳの集合体について説明する。さらに、本発明は、合理的な変異誘発を通じて、または変異体ライブラリースクリーニングを通じて、特異的な有機分子結合ＧＹＲＡＰＴＳを作製するためのプロトコルについて考察する。加えて、有機分子の化学構造を酵素的に修飾することができる、ＧＹＲＹＺＹＭＥと呼ばれる無差別酵素を作製する方法を説明する。本発明は、薬物特性および薬物作用を改善するために使用することができる薬物結合アプタマーを作製する方法を示す。本発明の汎用性のため、幅広いバイオテクノロジーツールを作成することができる。公的に入手可能なバイオインフォマティクスデータを使用して、ＧｙｒＩ様タンパク質の結合部位を無作為化して、初期スクリーニング後に望ましい標的結合を達成するための戦略を記載する。さらに、本発明は、異なるＧｙｒＩタンパク質が、異なるフルオロフォアの蛍光特性に対する様々な効果をどのように誘導することができるかを示し、最初に所望の機能について複数のＧｙｒＩ様タンパク質をスクリーニングし、続いて変異誘発および選択を行う戦略を概説する。本発明は、治療薬を含む、目的の任意の標的有機分子に結合することができるアプタマーの開発につながるであろう。さらに、本発明は、広範囲のバイオテクノロジー用途に適用可能なシャットオンまたはシャットオフ特性を制御した分子蛍光スイッチをもたらす。この種の分子スイッチは、バイオセンサー設計、分子診断ツール、細胞イメージング技術、および治療などの幅広い用途で使用することができる。全体として、本発明に列挙される実験的手法は、有機色素と併せて広範な機能性で作動することができる汎用性があるアプタマーの識別を示す。
本発明の方法は、選択されたＧｙｒＩ様タンパク質の蛍光化合物に結合し、活性化するか、またはシャットオフする天然の能力を操作することによって、蛍光増強モジュールを作製するための詳細なプロトコルを提供する。他の実施形態において、本明細書で提供される本発明の方法は、合理的なタンパク質工学を使用するか、またはタンパク質変異体ライブラリースクリーニングを通じて、ＧｙｒＩ様タンパク質の蛍光増強または消光特性をさらに改善する。本発明の方法および非天然バリアントアプタマーは、分子イメージングまたは分子診断目的のための汎用性のあるバイオテクノロジーツールとして使用することができる。
さらに、本発明の方法は、所望のアプタマー機能について様々なＧｙｒＩ様タンパク質ファミリーメンバーをスクリーニングするための効率的な戦略およびプロトコルを提供し、これらはすべて、標的有機化合物に対する異なる結合能力を示す。本明細書で提供される本発明の方法は、新規かつ有用な非天然バリアントアプタマーを、変異体の合理的な設計およびスクリーニングから単離することができる方法を示す。したがって、新規かつ汎用性の高い非天然バリアントアプタマー酵素（例えば、ＧＹＲＹＺＹＭＥ）が本明細書で提供され、ＧｒｙＩ様タンパク質の変異およびスクリーニングを通じて産生される。本明細書で提供される本発明の方法を使用して、追加の高親和性ＧＹＲＡＰＴＳまたはＧＹＲＹＺＹＭＥを容易に単離することができる。本発明の非天然バリアントアプタマーは、バイオテクノロジーおよび医学におけるいくつかの広範な用途において有用である。
したがって、本明細書で提供されるのは、以下の項目である。
１．図２０／配列番号２に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、非天然バリアントアプタマー。
２．バリアントアプタマーが、野生型ＳＡＶ２４３５と比較して、図２０／配列番号２に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３からなる群から選択される、項目１に記載の非天然バリアントアプタマー。
３．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、標的分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、項目１または２に記載の非天然バリアントアプタマー。
４．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、項目１～３のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
５．バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン（Ｃａｒｂｏｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、項目１～３のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
６．バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される標的分子への結合を可能にする、項目１～３のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
７．バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、項目１～３のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
８．バリアントアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ならびに配列番号４０～４５および配列番号５８～５９からなる群から選択される、項目１～７のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
９．図２０／配列番号４に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号４のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、非天然バリアントアプタマー。
１０．バリアントアプタマーが、野生型ＣＴＲ１０７と比較して、図２０／配列番号４に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される、項目９に記載の非天然バリアントアプタマー。
１１．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、項目９または１０に記載の非天然バリアントアプタマー。
１２．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、項目９～１１のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
１３．バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、項目９～１１のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
１４．バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする、項目９～１１のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
１５．バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、項目９～１１のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
１６．バリアントアプタマーが、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２６）、ならびに配列番号３３～３９および配列番号４６～５０からなる群から選択される、項目９～１５のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
１７．図２０／配列番号６に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号６のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、非天然バリアントアプタマー。
１８．バリアントアプタマーが、野生型ＬＩＮ２１８９と比較して、図２０／配列番号６に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択される、項目１７に記載の非天然バリアントアプタマー。
１９．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、項目１７または１８に記載の非天然バリアントアプタマー。
２０．バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、項目１７～１９のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
２１．バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、項目１７～１９のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
２２．バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする、項目１９に記載の非天然バリアントアプタマー。
２３．バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、項目１７～１９のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
２４．バリアントアプタマーが、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ（配列番号３２）、ならびに配列番号５２～５７からなる群から選択される、項目１７～２３のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマー。
２５．ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ）（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ、Ｅ１３３Ｑ）（配列番号２６）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ（Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ）（配列番号３２）、ならびに配列番号３３～５９からなる群から選択される、操作された非天然アプタマー。
２６．蛍光オン／オフバイオスイッチシステムであって、
第１のＧｙｒｌ様アプタマーと、
発蛍光性色素と、を含む、バイオスイッチシステム。
２７．色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン（ＦＡＭ）、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、オキサジン）、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、項目２６に記載のバイオスイッチシステム。
２８．Ｇｙｒｌ様アプタマーが、熱安定性および／またはｐＨ安定性である非天然バリアントＧｙｒｌ様アプタマーである、項目２６または２７に記載のバイオスイッチシステム。
２９．第２のＧｙｒｌ様アプタマーをさらに含む、項目２６～２８のいずれか１つに記載のバイオスイッチシステム。
３０．色素が、Ａｔｔｏ４９５であり、第１および第２のアプタマーが、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ならびにＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される、項目２６～２９のいずれか１つに記載のバイオスイッチシステム。
３１．色素が、アクリジンオレンジであり、第１のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択され、第２のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択される、項目２６～２９のいずれか１つに記載のバイオスイッチシステム。
３２．色素が、アクリジンオレンジであり、第１および第２のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ならびにＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、項目２６～２９のいずれか１つに記載のバイオスイッチシステム。
３３．生体シグナルを検出する方法であって、本方法が、フルオロフォア標識を有する分子プローブを生体試料に提供することと、分子プローブをＧｙｒｌ様タンパク質と接触させることと、を含む、方法。
３４．Ｇｙｒｌ様タンパク質と接触させると、分子プローブの蛍光は、増加するか、または減少するかのいずれかである、項目３３に記載の方法。
３５．利用されるＧｙｒｌ様タンパク質が、Ｇｙｒｌ様バリアントタンパク質である、項目３３または３４に記載の方法。
３６．蛍光が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ増加する、項目３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．蛍光が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ減少する、項目３３～３５のいずれか１つに記載の方法。
３８．フルオロフォアが、ＤＦＨＢＩまたはマレカイトグリーン（Ｍａｌｅｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．フルオロフォアが、チアゾールオレンジであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、配列番号５０～５１、および配列番号５４～５５からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４０．フルオロフォアが、チオフラビンＴであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＷＴからなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４１．フルオロフォアが、Ａｔｔｏ４９５であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４２．フルオロフォアが、アクリジンオレンジであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４３．フルオロフォアが、シアニン５であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｎ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＬＩＮ２１８９、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ、配列番号４２、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５６からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４４．フルオロフォアが、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＬＩＮ２１８９ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（三重変異体）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（別名ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）、および配列番号３３～４０からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４５．フルオロフォアが、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（別名ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４６．フルオロフォアが、オキサジン１７０であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４７．フルオロフォアが、ヨードニトロテトラゾリウムであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ四重変異体（ＱＵＡＤ）、およびＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｖ１０５Ｗ（ＴＲＩＰ）からなる群から選択される、項目３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
４８．分子プローブは、消光部分をさらに含み、消光部分は、フルオロフォアの蛍光が消光されるように、フルオロフォアと作動可能に近接している、項目３３～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．所望の生物学的特性を有する非天然バリアントアプタマーを識別する方法であって、本方法が、
分析のための試験分子を提供することと、
試験分子を、項目１～２５のいずれか１つに記載の非天然バリアントアプタマーのうちの少なくとも１つと接触させることと、
１つ以上の所望の生物学的特性を有する非天然バリアントアプタマーを選択することと、を含む、方法。
５０．所望の生物学的特性が、生物学的標的または標的分子への結合、蛍光増強、蛍光消光、または酵素活性から選択される、項目４９に記載の方法。
５１．生物学的標的が、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、項目５０に記載の方法。
５２．生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、イオンチャネル、受容体、腫瘍抗原、および疾患関連抗原からなる群から選択される、項目５０または５１に記載の方法。
５３．試験分子が、シタラビンまたはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である、項目４９または５０に記載の方法。
５４．試験分子が、シタラビンであり、非天然バリアントアプタマーが、配列番号４１、配列番号４３～４７、および配列番号５２～５３からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
５５．試験分子が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質であり、非天然バリアントアプタマーが、配列番号５７～５９からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
５６．図２０／配列番号１に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、ライブラリー。
５７．図２０／配列番号２に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号２のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、ライブラリー。
５８．図２０／配列番号３に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号３のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、ライブラリー。
選択されたＧｙｒＩ様タンパク質の結晶構造。図１Ａ 有機色素ローダミン６Ｇに結合したＳＡＶ２４３５（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５ＫＡＵ）、図１Ｂ 有機色素ローダミン６Ｇに結合したＣＴＲ１０７（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５ＫＡＸ）、図１Ｃ ヤタケマイシンに結合したＬＩＮ２１８９（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５Ｘ５Ｍ）。リガンドは、黒色の球として示され、一方、ＧｙｒＩ様タンパク質結合ポケット中の相互作用する残基は、白色の棒状物として示される。 ＧｙｒＩ様タンパク質についての組換え操作された遺伝子配列および発現されたタンパク質配列。図２Ａ ＳＡＶ２４３５、図２Ａ ＣＴＲ１０７、および図２Ｂ ＬＩＮ２１８９。太字は、クローニング、より高い発現、および親和性クロマトグラフィーのために追加された、操作された修飾を示す。 この実験設計においてＧｙｒＩ様タンパク質を得るために使用される精製プロセスの一例。図３Ａは、材料および方法に記載される手順に従って、ＳＡＶ２４３５をロードし、溶出した後の親和性クロマトグラフィー結果を示す。図３Ｂは、親和性クロマトグラフィー画分の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。ＳＡＶ２４３５は、その分子量１８ｋＤａと一致する高純度で得られた。 実施例１～１３で使用される化合物の化学構造。 図５Ａ 野生型ＧｙｒＩ様タンパク質によるＳＹＴＯ９蛍光増強を比較する棒グラフ。図５Ｂ 選択されたＧｙｒＩ様バリアントによるＳＹＴＯ９蛍光増強を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。図５Ｃ ＳＹＴＯ９およびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑによって形成された熱安定性蛍光モジュール。左パネルは、９５℃まで１０分間加熱され、次いでＵＶ光下でイメージングした試料である。右パネルは、加熱後に１０分間冷却した試料である。図５Ｄ ＣＴＲ１０７ ＷＴタンパク質濃度に対するＳＹＴＯ９の蛍光増強のプロット。Ｘ軸は、対数スケールで示される。各点は、二重実験の平均を表し、エラーバーは、平均された結果の標準偏差である。非線形回帰解析によって、データをヒルの式に当てはめた。 図６Ａ 野生型ＧｙｒＩ様タンパク質によるＤＦＨＢＩ蛍光増強を比較する棒グラフ。図６Ｂ 野生型ＧｙｒＩ様タンパク質によるマラカイトグリーン蛍光増強を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフの値は、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。 図７Ａ 選択された野生型ＧｙｒＩ様タンパク質によるチアゾールオレンジ蛍光増強を比較する棒グラフ。図７Ｂ チアゾールオレンジによる光の吸収に対するＧｙｒＩ様タンパク質の効果。図７Ｃ 合理的に設計されたＳＡＶ２４３５バリアントによるチアゾールオレンジ蛍光増強を比較する棒グラフ。図７Ｄ 合理的に設計されたＣＴＲ１０７バリアントによるチアゾールオレンジ蛍光増強を比較する棒グラフ。図７Ｅ チアゾールオレンジおよびＳＡＶ２４３５バリアントによって形成される蛍光モジュールのｐＨ安定性。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。図７Ｆ ＳＡＶ２４３５によるＵＶ蛍光増強。図７Ｇ チアゾールオレンジおよびＳＡＶ２４３５バリアントによって形成される増強モジュールの熱安定性および可逆性。 ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによるチオフラビンＴ蛍光増強を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。 図９Ａ ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによるＡｔｔｏ４９５蛍光増強を比較する棒グラフ。図９Ｂ ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによるアクリジンオレンジ蛍光増強を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。 図１０Ａ 短いオリゴヌクレオチドによって一緒に繋がれた接地状態のフルオロフォア消光剤対によって形成された蛍光スイッチの模式図、ならびに相補的な核酸によるそれらの活性化。図１０Ｂ ＧｙｒＩ様タンパク質によって結合した場合に、接地状態のフルオロフォア消光剤対によって形成される蛍光スイッチの仮想的な活性化。図１０Ｃ ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによるＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１スイッチの蛍光活性化を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。 図１１Ａ 野生型ＧｙｒＩ様タンパク質による５－（６）カルボキシフルオレセイン蛍光消光を比較する棒グラフ。図１１Ｂ ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによる５－（６）カルボキシフルオレセイン蛍光消光を比較する棒グラフ。図１１Ｃ ５－（６）カルボキシフルオレセイン標識された核酸上のＧｙｒＩ様バリアントの蛍光消光特性を比較する棒グラフ。図１１Ｄ ５－テトラメチルローダミン標識された核酸上のＧｙｒＩ様バリアントの蛍光消光特性を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。図１１Ｅ ５－（６）カルボキシフルオレセイン標識された核酸テンプレートおよび５－テトラメチルローダミン標識された核酸テンプレートのＬＩＮ２１８９による強力なＵＶ蛍光消光。 図１２Ａ 異なるタンパク質濃度でのＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによる５－テトラメチルローダミン標識された核酸の酵素蛍光消光。図１２Ｂ ５－テトラメチルローダミン標識された核酸と、他の非酵素ＬＩＮ２１８９バリアントとの酵素ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ消光の比較。各点は、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。図１２Ｃ 酵素ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢと、非酵素ＬＩＮ２１８９バリアントとの５－テトラメチルローダミン標識された核酸ＵＶ蛍光消光の比較。加熱した試料を９５℃で１０分間インキュベートし、次いで迅速にイメージングした。 図１３Ａ 野生型ＧｙｒＩ様タンパク質によるオキサジン１７０蛍光消光を比較する棒グラフ。図１３Ｂ ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによるオキサジン１７０蛍光消光を比較する棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。図１３Ｃ ＳＡＶ２４３５バリアントについてのタンパク質濃度の関数としてのオキサジン１７０蛍光消光の比較。各点は、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。図１３Ｄ ＳＡＶ２４３５バリアントによるオキサジン１７０ＵＶ蛍光消光の可逆性。加熱した試料を９５℃で１０分間インキュベートし、次いで迅速にイメージングした。 図１４Ａ 合理的に設計されたＣＴＲ１０７高親和性アプタマーによる蛍光スイッチの活性化。図１４Ｂ 相補的ＲＮＡおよびＬＩＮ２１８９酵素消光剤を使用した二重蛍光オンオフスイッチの設計。ＦＡＭデータを緑色チャネルの下で緑色チャネルの下で集め、一方、ＴＡＭＲＡおよびＣＹ５データを赤色チャネルの下で集めた。棒グラフは、図の凡例のスイッチに応じて着色されている。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。 図１５Ａ アルカリホスファターゼによるｐ－ニトロフェニルホスフェートからｐ－ニトロフェノールへの触媒変換の化学反応。図１５Ｂ ＧＹＲＹＺＹＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによるｐ－ニトロフェニルホスフェートからｐ－ニトロフェノールへの触媒変換。図１５Ｃ ヨードニトロテトラゾリウムからヨードニトロホルマザンへのＮＡＤＰＨ依存性触媒変換の比色反応。図１５Ｄ ５分間のインキュベーション後のＧｙｒｉ様アプタマーによるヨードニトロテトラゾリウムからヨードニトロホルマザンへのＮＡＤＰＨ依存性変換。図１５Ｅ ２分間のインキュベーション後のＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰアプタマーによるヨードニトロテトラゾリウムからヨードニトロホルマザンへのＮＡＤＰＨ依存性変換。 図１６Ａ 薬物隔離および耐性を使用してインビボで薬物結合性ＧｙｒＩ様アプタマーをスクリーニングするための仮説の概略図。高親和性ＧｙｒＩ様アプタマーを発現する細菌は、薬物がその天然の標的部位にアクセスするのを防ぐことによって耐性を誘導する。図１６Ｂ 酵素ＧｙｒＩ様タンパク質の試験のための仮説の概略図。薬物のエクスビボでの不活化は、非耐性細菌が、不活化された薬物の存在下で成長するときに、耐性を誘導する。図１６Ｃ タンパク質発現後のアンピシリン濃度の関数としてのＥ．Ｃｏｌｉ成長のプロット。図の凡例は、各実験のプラスミド発現タンパク質を示す。図１６Ｄ ２４時間後のＧｙｒＩ様タンパク質誘導によるＥ．Ｃｏｌｉ成長アンピシリンプレート。プレートは、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと、１ｍＭのＩＰＴＧとを含有する。図１６Ｅ エクスビボでＧｙｒＩ様タンパク質により不活性化されたアンピシリン中のＥ．Ｃｏｌｉ成長。細菌成長前に、アンピシリンを８０ｕｇ／ｍｌで不活性化した。 図１７Ａ ダウノルビシンへのＧｙｒＩ様アプタマーの結合によって誘導される蛍光減少を示す棒グラフ。黒色の棒グラフは、緑色チャネルの下で集められたデータを表し、灰色の棒グラフは、赤色チャネルの下で集められたデータを表す。各棒グラフは、二重実験で集められたデータの平均であり、エラーバーは、平均された結果の標準偏差を表す。アプタマーによる蛍光の倍率変化を各棒グラフの上に表示する。図１７Ｂ ダウノルビシン結合アプタマーによるＵＶ蛍光消光。図１７Ｃ 薬物ダウノルビシンへのＣＴＲ１０７野生型結合についての蛍光結合データの非線形回帰分析。図１７Ｄ 薬物ダウノルビシンへのＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗバリアント結合についての蛍光結合データの非線形回帰分析。解離定数およびヒル係数が各グラフに示される。データは、二重測定の平均を表す。 選択された野生型ＧｙｒＩ様タンパク質から高親和性ＧｙＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥをスクリーニングし、識別するための詳細なプロトコル。 実施例１～１７で使用される、合理的に設計された変異体アプタマーの遺伝子およびタンパク質配列。変異は、太字で示される。 ＧｙｒＩ様タンパク質のために設計されたコンビナトリアル変異体結合部位ライブラリー。図２０Ａ 汎用性がある有機分子結合アプタマーのスクリーニングおよび発見のために使用されるＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７、ならびに図２０Ｂ ＬＩＮ２１８９。結合部位残基は、太字で示される。 コンビナトリアル変異体ライブラリーの設計のために標的化された残基を提示する、図２１Ａ ＳＡＶ２４３５、図２１Ｂ ＣＴＲ１０７、および図２１Ｃ ＬＩＮ２１８９結合部位の構造。 ファージディスプレイ変異体ライブラリープロトコルで識別されたＦＡＭ結合ＣＴＲ１０７アプタマーの配列。 図２３Ａ ＧｙｒＩ様アプタマーを識別するファージディスプレイ変異体ライブラリープロトコルによるＦＡＭ蛍光消光。実験を二重に実施し、平均値を棒グラフとして示した。ＦＡＭテンプレートは、凡例の右側に示される。図２３Ｂ ＧｙｒＩ様アプタマーに対するＦＡＭ親和性と、ＦＡＭ抗体および野生型ＣＴＲ１０７との比較。実験を二重に実施し、平均値を棒グラフとして示した。Ｋｄ値は、ナノモル単位で各タンパク質についての凡例の次に示されている。グラフは、図の凡例のタンパク質の正体に応じて着色されている。 ＧｙｒＩ様タンパク質（ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、ＬＩＮ２１８９）のためのファージディスプレイ変異体ライブラリープロトコルにおいて識別された、ＦＡＭ結合アプタマー、シタラビン結合アプタマー、Ｃｙ５結合アプタマー、チアゾールオレンジ結合アプタマー、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合アプタマーの配列。
本発明の方法および本明細書で提供されるアプタマーは、ＧｙｒＩ様タンパク質ファミリーを選択のためのテンプレートとして使用して、蛍光活性化アプタマー、蛍光消光アプタマー、有機分子結合アプタマーおよび合成酵素を生成する新規の機構を利用する。ＧｙｒＩ様タンパク質は、多剤耐性におけるそれらの機能に対して多重特異性という天然の特性を有する。本発明によれば、本願発明者らは、タンパク質工学を通じて幅広いバイオテクノロジー用途で機能を発揮することができる複数のＧｙｒＩ様タンパク質バリアントアプタマーを識別し、提供する。本発明の方法は、ＧｙｒＩ様タンパク質を有機分子結合アプタマーに形質転換するためのフレームワークを提供し、このことは、ファミリーメンバーをスクリーニングし、続いて変異誘発および選択を行い、高親和性であり、汎用性があるアプタマーを生成することによって達成することができる（図１６）。特定の実施形態において、インビトロ進化方法論を使用して、ＧｙｒＩ様タンパク質を、目的の所望の結合特性を有する本発明のバリアントアプタマーに変換することができる。本発明の方法は、ＧｙｒＩ様タンパク質が標的分子に結合するために既に予め選択されているため、アプタマー選択のそれほど複雑ではない方法の利点を提供し、したがって、アプタマーの成功のために、厳密さが低いスクリーニングプロセスが必要とされる。本発明によれば、本願発明者らは、合理的に設計された変異体で所望のアプタマー機能を大幅に改善することができることを示した。本発明によれば、当業者は、ＧｙｒＩ様タンパク質を変異させ、高性能アプタマーについてスクリーニングすることができることを認識するであろう。別の実施形態において、本明細書で提供される本発明の方法を使用して、当業者は、目的の小分子に高い親和性で結合することが可能な本発明のアプタマーバリアントの合理的な設計のために、ＧｙｒＩ様タンパク質の公的に入手可能な結晶構造を使用することができる。この特定の実施形態はまた、結合残基が結晶構造または構造相同性から既知であるため、タンパク質全体にわたる変異体ライブラリーのスクリーニングに必要な時間および労力を大幅に低減する。本明細書で提供される本発明の方法は、入手可能な膨大な数のＧｙｒＩ様配列から３つのタンパク質をスクリーニングすることにより、改善された機能を有する複数の本発明の非天然バリアントアプタマーを生成したことを示す（図１８）。概略的には、本発明の方法は、他の従来の方法と比較して、標的分子の非天然バリアントアプタマーを識別し、設計する可能性を増加させる（図１８）。本発明の方法の一実施形態において、ＧＹＲＡＰＴＳと呼ばれる多数の有機分子結合非天然バリアントアプタマーを生成することができる。本発明の方法の別の実施形態において、ＧＹＲＹＺＭＥと呼ばれる酵素ＧＹＲＩ様非天然バリアントアプタマータンパク質を識別し、スクリーニングおよび変異誘発によって単離する。
ＧｙｒＩ様タンパク質の好ましい特性は、バイオテクノロジーおよび医学のための新規かつ有用なツールの設計を可能にする。非天然ＧｙｒＩ様バリアントアプタマーを操作して、操作された蛍光タンパク質と同様の特性を有する細胞イメージングツールを作り出すことができる。この能力において、ＧｙｒＩ様タンパク質の小さいサイズ、高い安定性、および迅速なフォールディングは、現在の技術に代わる、より良い蛍光を可能にする。改善された本発明の非天然バリアントアプタマーを提供することができる戦略としては、より光安定性の高い蛍光モジュール、および実験者の裁量で蛍光をオンおよびオフに切り替える能力が挙げられる。さらに、ＧｙｒＩ様タンパク質の安定性は、ＣＴＲ１０７およびＳＡＶ２４３５バリアントで示されるような、高／低ｐＨおよび高温などの幅広い実験条件において有利に機能することができる機能的な蛍光非天然バリアントアプタマーの作製に役立つであろう。特定の実施形態において、これらの本発明のバリアントアプタマーは、がん、代謝、発達、および他の生理学的経路におけるバイオマーカーの産生、輸送、局在化をモニタリングするのに強力である。他の実施形態において、ＧｙｒＩ様タンパク質由来の本発明の蛍光非天然バリアントアプタマーは、例えば、ラテラルフローデバイスまたはＥＬＩＳＡアッセイにおけるシグナル検出のための分子スイッチなどの他の目的にも使用することができる。本明細書で提供される本発明のバリアントアプタマーを利用して、フォールディングまたは酵素動態などのタンパク質特性をスクリーニングするために、使用され得る蛍光融合タンパク質タグ付けのための分子生物学的ツールを作成することができる。全体として、ＧｙｒＩタンパク質の蛍光増強能力は、広範囲の用途のための様々なタイプの本発明の非天然バリアントアプタマーの作製のための汎用性があるツールボックスを提供する。
したがって、本明細書では、図２０／配列番号１に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを含む非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーが提供される。特定の実施形態において、ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、野生型ＳＡＶ２４３５と比較して、図２０／配列番号２に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３からなる群から選択される。他の実施形態において、非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、標的分子結合、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする。特定の実施形態において、ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、色素の蛍光増強を可能にし、色素は、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される。他の実施形態において、ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される。なお他の実施形態において、ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする。さらなる実施形態において、非天然バリアントアプタマーは、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする。
特定の実施形態において、非天然バリアントＳＡＶ２４３５アプタマーは、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ならびに配列番号４０～４５および配列番号５８～５９からなる群から選択される。
また、本明細書には、図２０／配列番号４に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを含む非天然ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号２のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、非天然ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーが提供される。特定の実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、野生型ＣＴＲ１０７と比較して、図２０／配列番号２に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする。特定の実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、色素の蛍光増強を可能にし、色素は、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される。他の実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする。なおさらなる実施形態において、ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする。特定の実施形態において、本発明のバリアントアプタマーは、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｖ１０５Ｗ）であり、バリアントアプタマーは、ヨードニトロテトラゾリウムをそのホルマザン生成物に変換することができる。
特定の実施形態において、非天然バリアントＣＴＲ１０７アプタマーは、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２６）、ならびに配列番号３３～３９および配列番号４６～５０からなる群から選択される。
また、本明細書では、図２０／配列番号６に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを含む非天然ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーであって、バリアント位置が、配列番号３のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、非天然ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーが提供される。特定の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、野生型ＬＩＮ２１８９と比較して、図２０／配列番号３に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする。他の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、色素の蛍光増強を可能にし、色素は、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される。特定の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、色素の蛍光消光を可能にし、色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される。他の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする。特定の実施形態において、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする。特定の実施形態において、本発明のＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーは、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ（Ｅ１５７Ａ、Ｌ１８５Ｅ）であり、バリアントアプタマーは、色素基質の蛍光を酵素的に終結させることができ、かつ／または、ｐ－ニトロフェニルホスフェートを加水分解して、ｐ－ニトロフェノールを生成することができる。
特定の実施形態において、非天然バリアントＬＩＮ２１８９アプタマーは、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ（配列番号３２）、ならびに配列番号５２～５７からなる群から選択される。
また、本明細書には、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ）（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ、Ｅ１３３Ｑ）（配列番号２６）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ（Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ）（配列番号３２）、ならびに配列番号３３～５９からなる群から選択される、操作された非天然バリアントアプタマーが提供される。
抗体の機能を模倣するアプタマーは、バイオテクノロジー開発に不可欠である。したがって、本明細書では、様々な用途において、例えば、抗体などを置き換えることができる標的分子結合非天然バリアントアプタマーを生成するための本発明の方法が提供される。結合のための例示的な標的分子として、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、ポリマー、腫瘍抗原、およびヒト疾患の治療に関与する他の細胞表面タンパク質または部分が挙げられる。
抗体は、ＦＡＭまたはＣＹ５などの色素への結合のためのツールとして、分子診断目的のためのラテラルフローデバイスにおいて一般的に使用される。本発明の方法によれば、本明細書には、ＦＡＭおよびＣＹ５に結合する様々な非天然バリアントアプタマーＧＹＲＡＰＴが提供される。本発明の方法は、目的の標的小分子に結合することができる非天然バリアントアプタマーＧＹＲＡＰＴＳを開発するための原理の証明を提供する。本発明の非天然バリアントアプタマーが結合するこれらの標的分子は、薬物化合物、有機色素、フルオロフォア、酵素基質、生物学的に関連するオリゴ糖などのハプテン、および天然に存在するバイオマーカーであり得る。本発明の方法および本明細書で提供される非天然バリアントアプタマーを利用して、蛍光イメージング技術、薬物送達モジュール、バイオ医薬品、バイオセンサー、バイオスイッチ、合成バイオテクノロジー酵素などを含む様々なツールを開発することができる。
バイオテクノロジーおよびバイオ医薬用途のための任意の所望の有機分子に結合するための広範で汎用性がある本発明の非天然バリアントアプタマーを作製するために、本明細書には、選択されたＧｙｒＩ様タンパク質を変異させるか、または修飾するための本発明の方法および変異誘発スキームが提供される（図１８）。本発明の方法は、ＧｙｒＩ様野生型タンパク質の初期スクリーニングを利用して、どの候補が非天然バリアントアプタマー工学のための最良のテンプレートとして機能するかを識別する。その後、いくつかのラウンドの合理的または無作為な変異誘発、次いでスクリーニングを利用して、所望の改善された機能を有する本発明の非天然バリアントアプタマーを識別する。次に、生物物理学的分析および構造決定は、アプタマーを所望の機能にさらに調整するためのさらなる情報およびデータを提供する（図１８）。
したがって、本明細書に提供される本発明の方法を使用して、高親和性ＧＹＲＡＰＴまたはＧＹＲＹＺＹＭＥ産物を操作することができる。本発明の方法は、合理的な設計およびスクリーニングを通じて様々な小分子に結合するアプタマーの機能を設計し、改善することによって、複数の原理の証明を提供した（図１８、１９）。本発明の方法を使用して、ＧｙｒＩ様タンパク質ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、ＬＩＮ２１８９の結合部位の変異体ライブラリーを合成した（図２０、２１）。これらの本発明のコンビナトリアル変異体ライブラリーは、目的の任意の標的有機分子への結合について選択することができる本発明の非天然バリアントアプタマーの集合体としての役割を果たす（図２０、２１）。これらのライブラリーおよび本明細書で提供される本発明の方法を使用して、様々な用途のための本発明の非天然バリアントアプタマーを、本明細書で使用するために、または当業者によって、選択し、単離することができる。合わせて、本発明の方法は、任意の所望の有機分子に結合する本発明の非天然バリアントアプタマーを設計し、識別するための広範な手法を提供し、本発明のバリアントアプタマーは、多数のバイオテクノロジー用途およびバイオ医薬用途に組み込むことができる。
また、本明細書には、蛍光オン／オフバイオスイッチシステムであって、
第１のＧｙｒｌ様アプタマーと、
発蛍光性色素と、を含む、バイオスイッチシステムが提供される。
別の実施形態において、バイオスイッチシステムは、第２のＧｙｒｌ様アプタマーをさらに含む。なお別の実施形態において、Ｇｙｒｌ様アプタマーの一方または両方は、非天然バリアントＧｙｒｌ様アプタマーである。他の実施形態において、非バリアントＧｙｒｌ様アプタマーは、熱安定性および／またはｐＨ安定性である。
本発明の蛍光オン／オフバイオスイッチシステムは、典型的には、本明細書に記載されるように、二重標識分子プローブをさらに含む。したがって、本発明は、ＧｙｒＩ様バリアントアプタマータンパク質による可逆的かつ制御可能な蛍光スイッチ活性化のさらなる新規の機構を提供する。したがって、本明細書には、オリゴヌクレオチドプローブの場合、相補的な核酸を必要とすることなく、二重標識されたプローブ（例えば、核酸、リンカーなど）の蛍光スイッチ活性化の本発明の方法が提供される。本発明の方法は、二重標識された蛍光スイッチ活性化モジュール（別名二重標識分子プローブ）を提供することであって、消光部分が、フルオロフォアが消光されるように、フルオロフォアと作動可能に近接している、提供することと、蛍光スイッチ活性化モジュールをＧｙｒｌ様タンパク質と接触させることと、を含む。
本明細書で使用される場合、「バイオスイッチ」または「分子スイッチ」、「蛍光オン／オフバイオスイッチシステム」または「オン／オフスイッチ」という用語は、リガンド結合時にシグナルを提供する構築物を意味する。特定の実施形態において、例えば、シグナルは、リガンド結合時のセンサー構築物の立体配座変化によって引き起こされる蛍光シグナルの消光であり得る。他の実施形態において、本発明のバイオスイッチシステムのシグナルは、結合していない状態およびリガンド結合時に消光されてもよく、消光剤は、その後にシグナルが検出されるように、フルオロフォアの遠位に移動してもよい。
当業者は、追加のＧｙｒＩ様スイッチ活性化モジュールが、本明細書に記載されている本発明の方法を使用して、多数の他のフルオロフォア－消光剤対のために本明細書で生成され得ることを認識するであろう。これらのスイッチは、幅広いバイオテクノロジー用途において有用である。
本明細書で使用される場合、「蛍光スイッチ活性化モジュール」は、接地状態では、蛍光スイッチ活性化モジュールが消光されたままであるように、一方の末端にフルオロフォアを有し、他方の末端にそのそれぞれの消光剤（例えば、フルオロフォア－消光剤対からのもの）を有する二重標識されたリンカー分子（例えば、オリゴヌクレオチドまたは他の部分）を指す。「蛍光スイッチ活性化モジュール」はまた、二重標識されたプローブとして当該技術分野で知られている。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，６３５，５９８を参照されたい。特定の実施形態において、「リンカー」によって接続されるフルオロフォアおよび消光剤を両方とも含む誘導性蛍光二重標識プローブは、二重標識核酸プローブのアレイによって当該技術分野において例示される。特定の実施形態において、消光部分は、プローブ上のフルオロフォアと作動可能に近接しており、その結果、研究および診断用途を有する多数のアッセイにおいて有用な蛍光シグナルを産生することができる。
バイオスイッチシステムの特定の実施形態において、色素は、５（６）－カルボクスフルオロセイン（ＦＡＭ）、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、オキサジン）、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される。
本発明において本明細書で使用される好適なフルオロフォア－消光剤の対は、当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書に記載されるものの中で、表１に示されるものを含む。
表１
Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｄｙｅｓ ＢＨＱ－１ ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ａｌｅｘａ ４８８ ＦＡＭ Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＴＥＴ ＪＯＥ Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０（商標）ＢＨＱ－２ Ａｌｅｘａ ５４６ ＴＡＭＲＡ ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ Ｃｙ３．５ Ａｌｅｘａ ５９４ Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０（商標）。
特定の実施形態において、色素は、Ａｔｔｏ４９５であり、第１および第２のアプタマーは、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ならびにＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される。
バイオスイッチシステムの特定の実施形態において、色素は、アクリジンオレンジであり、第１のアプタマーは、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択され、第２のアプタマーは、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択される。
バイオスイッチシステムのなおさらなる実施形態において、色素は、アクリジンオレンジであり、第１および第２のアプタマーは、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ならびにＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｇｙｒｌ様バリアントアプタマーの添加は、蛍光を、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ増加させる。特定の実施形態において、利用されるＧｙｒｌ様タンパク質は、本発明のＧｙｒｌ様バリアントタンパク質である。
また、本明細書には、所望の生物学的特性を有する非天然バリアントアプタマーを識別する方法であって、本方法が、
分析のための試験分子を提供することと、
試験分子を、請求項１～２５のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマーのうちの少なくとも１つと接触させることと、
１つ以上の所望の生物学的特性を有する非天然バリアントアプタマーを選択することと、を含む、方法が提供される。
より具体的には、本明細書には、ＧｙｒＩ様タンパク質ファミリーをテンプレートとして使用して、汎用性のある非天然バリアントアプタマーを合理的に設計するための本発明の方法が提供される。これらの本発明の非天然バリアントアプタマーは、化学的特性および物理的特性が異なる広範囲の有機分子レパートリーに結合することが可能である。本発明のバリアントアプタマーは、その用途に基づいて様々な種類に一般化することができる。特定の実施形態において、その他の様式で弱いフルオロフォアに結合し、蛍光の増強を刺激することができる蛍光増強アプタマーが、本明細書に提供される。他の実施形態において、本発明の非天然バリアントアプタマーの蛍光消光は、強いフルオロフォアに結合し、スイッチ様の様式で作用する蛍光をシャットオフすることができる。薬物結合アプタマーは、治療用化合物に結合し、薬物機能および薬物作用を改善する。酵素アプタマーは、様々な有機分子を修飾して有用な生成物を生成することが可能である。本発明は、バイオテクノロジーおよび細胞イメージング技術への広範な用途を有するバイオセンサーおよびバイオスイッチ、医薬品におけるレポーターとして、これらのアプタマーの集合体をどのように利用することができるかを具体的に説明する。本発明は、変異誘発戦略を使用して、多重特異性ＧｙｒＩ様タンパク質を特異的かつ改善された機能のためにどのように体系的に進化させることができるかの第１の例をさらに示す。
本明細書で使用される場合、「所望の特性」という語句は、タンパク質、ペプチドまたは小分子によって示される当該技術分野で知られる任意の生物学的特性を指す。例示的な所望の特性として、例えば、結合親和性、消光能力の増加、消光能力の減少、ウイルスコートタンパク質結合（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質のリガンド）、色素への結合、消光剤への結合などが挙げられる。特定の実施形態において、所望の生物学的特性は、生物学的標的への結合、蛍光増強、蛍光消光、または酵素活性から選択される。
本明細書で使用される場合、「生物学的標的」という用語は、何らかの他の実体（内因性リガンド、薬物または本発明の非天然バリアントアプタマーなど）が指向するか、および／または結合し、その挙動または機能を変化させる、生体内の何らかのものを指す。生物学的標的の一般的な種類の例は、タンパク質および核酸である。その定義は、文脈依存的であり、薬理学的に活性な薬物化合物の生物学的標的、ホルモン（インスリンなど）の受容体標的、または外部刺激のいくつかの他の標的を指すことができる。特定の実施形態において、生物学的標的は、最も典型的には、酵素、イオンチャネル、および受容体などのタンパク質である。
特定の実施形態において、生物学的標的は、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される。他の実施形態において、生物学的標的は、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、イオンチャネル、受容体、腫瘍抗原、および疾患関連抗原からなる群から選択される。特定の実施形態において、試験分子は、シタラビンであり、非天然バリアントアプタマーは、配列番号４１、配列番号４３～４７、および配列番号５２～５３からなる群から選択される。なお別の実施形態において、試験分子は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質であり、非天然バリアントアプタマーは、配列番号５７～５９からなる群から選択される。
また、本明細書には、図２０／配列番号１に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、ライブラリーが提供される。
また、本明細書には、図２０／配列番号２に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号２のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、ライブラリーが提供される。
また、本明細書には、図２０／配列番号３に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーのライブラリーであって、バリアント位置が、配列番号３のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、ライブラリーが提供される。
アプタマー設計の重要なステップは、幅広い用途の使用のために操作することができる汎用性がある開始テンプレートを発見することである。多くの成功したアプタマースクリーニングにおいて、初期の巨大分子は、標的分子に対する親和性を示さないが、表面または結合部位残基の許容可能な変動によって、中程度の親和性を示すヒットが得られる１２、１３。親和性は、追加の変異および選択により、さらに増加させることができる。本発明によれば、重要なツールであり、かつ広範囲の分子を選択的に標的化することができる多重特異性結合特性を有するアプタマーを選択する能力を提供する、非天然バリアントアプタマーの非常に汎用性があるライブラリーが本明細書で提供される。本発明のライブラリーは、任意の標的分子に対する特異的アプタマーの迅速な作製および選択を可能にする。多重特異性アプタマーの本発明の変異体ライブラリーは、素因のある汎用性がある結合パートナーの集合体と、種々の所望の標的分子に好適なアプタマーを識別する選択のための手段を表す。本発明のバリアントアプタマーは、多くの用途において抗体の効果的な置き換えを提供するために本明細書で企図される。さらに、他の実施形態において、本発明のバリアントアプタマーは、分子診断、細胞イメージング、および治療のための新しいツールを提供する。
例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質、シタラビン、または任意の他の薬物化可能な標的に結合する、本発明のライブラリーに提供される特定の非天然バリアントアプタマーは、それぞれの治療用組成物で使用され、その標的に関連するそれぞれの疾患を治療することができることが本明細書で企図される。
本明細書で使用される場合、「薬物化可能な標的」という語句は、本明細書で提供される本発明の非天然バリアントアプタマーなどの薬物によって調節され得る活性を有するタンパク質、ペプチド、もしくは核酸、または他の生物活性部分を指す。本明細書において使用するための例示的な薬物化可能な標的としては、合計で８９０を超えるヒトおよび病原体由来の生体分子（本明細書において「生物学的標的」とも称される）を含む、承認薬物の分子標的が挙げられ、これにより、１，５７８種のＵＳ ＦＤＡ承認薬物が現在作用している。これらの生体分子には、ヒト疾患のための薬物によって標的化される６６７種のヒトゲノム由来タンパク質が含まれ、Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １６，ｐａｇｅｓ１９－３４（２０１７）に示されており、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
また、本明細書には、生体シグナルを検出する方法であって、本方法が、フルオロフォア標識を有する分子プローブを生体試料に提供すること（例えば、図１０Ａおよび１０Ｂ）と、分子プローブをＧｙｒｌ様タンパク質と接触させることと、を含む、方法が提供される。別の実施形態において、分子プローブは、消光部分をさらに含み、消光部分は、フルオロフォアの蛍光が消光されるように、フルオロフォアと作動可能に近接している。
本明細書で使用されるＦＡ、「生体シグナル」という用語は、生物学的特性の変化が生じた任意の証拠を指す。例示的な生物学的特性は、物理的または化学的であってもよく、例えば、蛍光、ｐＨ、イオン強度または結合強度、吸収、アルベド、面積、脆性、沸点、容量、色、濃度、密度、誘電定数、電荷、電気伝導度、電気インピーダンス、電界、電位、放射線、流速、流動性、周波数、インダクタンス、固有のインピーダンス、強度、照度、明るさ、光沢、柔軟性、磁界、磁束、品質、運動量、融点、透過性、誘電定数、圧力、放射線、溶解度、比熱、強度、温度、張力、熱伝達係数、流速、速度、粘度、体積、表面積、形状、および波動インピーダンスなどを含む。
本発明の方法の特定の実施形態において、Ｇｙｒｌ様タンパク質と接触させると、分子プローブの蛍光は、増加するか、または減少するかのいずれかである。特定の実施形態において、利用されるＧｙｒｌ様タンパク質は、Ｇｙｒｌ様バリアントタンパク質である。特定の実施形態において、蛍光は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ増加する。他の実施形態において、蛍光は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ減少する。
本発明の方法の特定の実施形態において、フルオロフォアは、ＤＦＨＢＩまたはマレカイトグリーン（Ｍａｌｅｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７からなる群から選択される。本発明の方法の別の実施形態において、フルオロフォアは、チアゾールオレンジであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、配列番号５０～５１、および配列番号５４～５５からなる群から選択される。本発明の方法の別の実施形態において、フルオロフォアは、チオフラビンＴであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＷＴからなる群から選択される。本発明の方法のなお別の実施形態において、フルオロフォアは、Ａｔｔｏ４９５であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される。本発明の方法のさらなる実施形態において、フルオロフォアは、アクリジンオレンジであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される。別の実施形態において、フルオロフォアは、シアニン５であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｎ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＬＩＮ２１８９、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ、配列番号４２、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５６からなる群から選択される。さらなる実施形態において、フルオロフォアは、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＬＩＮ２１８９ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（三重変異体）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（ａｋａ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）、および配列番号３３～４０からなる群から選択される。さらなる実施形態において、フルオロフォアは、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（別名ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）からなる群から選択される。なおさらなる実施形態において、フルオロフォアは、オキサジン１７０であり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される。別の実施形態において、フルオロフォアは、ヨードニトロテトラゾリウムであり、Ｇｙｒｌ様タンパク質は、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ四重変異体（ＱＵＡＤ）、およびＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｖ１０５Ｗ（ＴＲＩＰ）からなる群から選択される。
プローブ
特定の実施形態において、本発明のシステムおよび方法に有用である、本明細書では「プローブ」とも称される二重標識された「分子プローブ」は、フルオロフォアと、フルオロフォアからの蛍光発光を消光する消光剤と、を含む。本明細書で企図される他の実施形態および方法において、消光していないフルオロフォアのみを分子プローブ上で使用する。「リンカー」によって接続されるフルオロフォアおよび消光剤を両方とも含む誘導性蛍光二重標識プローブは、二重標識核酸プローブのアレイによって当該技術分野において例示される。核酸プローブは、例えば、５’－ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ならびに溶液相または固相（例えばアレイ）アッセイ中の標的の直接検出を含む、種々の核酸増幅／定量化戦略と組み合わせて使用される。
特定の実施形態において、本発明の方法の実施に使用するためのプローブには、酵素の基質であるか、または酵素反応の生成物と反応性である消光剤が含まれる。消光剤の構造は、酵素または酵素生成物によって変化し、フルオロフォアからの蛍光を消光する能力を低下させるか、またはなくす。例示的なプローブ設計は、以下
Ｆ－Ｌ－Ｑ
に示され、式中、Ｆは、フルオロフォアであり、Ｑは、消光剤であり、Ｌは、フルオロフォアおよび消光剤を結合するリンカー部分である。この実施形態において、リンカーは、任意の分子または部分であり得る。
これらの構成要素は、相補的反応性を有する反応性官能基の反応によって、ともに連結される。したがって、別の例示的な実施形態において、本発明のプローブは、下式
Ｆ－Ｘ－Ｌ－Ｘ１－Ｑ
を有し、式中、ＸおよびＸ１は、フルオロフォアの反応性基とリンカーの相補的反応性の反応性基、および消光剤の反応性基とリンカーの相補的反応性の反応性基との反応により形成される連結部である。ＸおよびＸ１の例示的な正体は、生理学的に関連する条件下で本質的に安定である部分、例えば、ＮＲ１０、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１０、Ｃ（Ｏ）、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｏ－であり、式中、Ｒ１０は、結合、置換もしくは非置換アルキル、および置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分から選択される。他の連結部は、当業者には明らかであろう。
他の例示的な実施形態において、二重酵素活性は、１つのプローブを使用して照会される。そのような例示的な実施形態において、以下の構造
Ｆ１－Ｘ１－Ｌ－Ｘ２－Ｑ－Ｘ３－Ｌ２－Ｘ４－Ｆ２、および
－Ｘ１－Ｌ１－Ｘ２－Ｆ－Ｘ３－Ｌ２－Ｘ４－Ｑのうちの１つ以上を有するプローブが有用であり、
式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４は、上のＸおよびＸ１としての連結部であり、Ｆ１およびＦ２は、フルオロフォアであり、Ｑは、消光剤であり、Ｌ１およびＬ２は、上述のリンカー部分である。
フルオロフォア
特定の実施形態において、本発明の方法およびシステムで使用するためのプローブは、選択された消光剤のドナーである実質的に任意のフルオロフォアとともに調製され得る。以下の参考文献に例示されるように、特定のプローブのための適切なドナー－アクセプター対を選択するための多くの実用的なガイダンスが文献において入手可能である。Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）など。文献はまた、レポーター－消光剤対を選択するための蛍光分子およびそれらの関連する光学的特性の網羅的なリストを提供する参考文献を含む（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）などを参照されたい）。さらに、以下の参考文献によって例示されるように、リンカーの構成要素である共通の反応性官能基を介した共有結合的接続のために、レポーター分子および消光剤分子の誘導体化に関する文献における広範なガイダンスが存在する。Ｈａｕｇｌａｎｄ（前記）、Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第３，９９６，３４５号、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，３５１，７６０号。したがって、特定の用途のためにエネルギー交換対を選択し、この対のメンバーをリンカーにコンジュゲートさせることは、当業者の能力の範囲内で十分である。
表２ ドナー－アクセプターエネルギー移動対においてドナーまたはアクセプターとして選択することができる好適な部分４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’ジスルホン酸アクリジンおよび誘導体：アクリジン アクリジンイソチオシアネート ５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）４－アミノ－Ｎ－［３－ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５ ジスルホネート Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミドアントラニルアミドＢＯＤＩＰＹ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗクマリンおよび誘導体：クマリン ７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）７－アミノ－４－トリフルオロメチルクルアリン（クマラン１５１）キサンテン色素シアノシン ４’，６－ジアミニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）５’，５”－ジブロモピロガロール－スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン ジエチレントリアミンペンタアセテート ４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸 ４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸 ５－［ジＮ－メチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）４－（４’－ジＮ－メチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）４－ジＮ－メチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）エオシンおよび誘導体：エオシン エオシンイソチオシアネート エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ エリスロシンイソチオシアネートエチジウムフルオレセインおよび誘導体：５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）２’，７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）フルオレセイン フルオレセインイソチオシアネートＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）フルオレスカミンＩＲ１４４ ＩＲ１４４６マラカイトグリーンイソチオシアネート ４－メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレインニトロチロシンパラロサニリンフェノールレッドＢ－フィコエリトリン ｏ－フタルジアルデヒドピレンおよび誘導体：ピレン ピレンブチレートスクシンイミジル １－ピレンブチレート量子ドットＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ－Ａ）ローダミンおよび誘導体：６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）ローダミンＢ ローダミン１２３ ローダミンＸイソチオシアネート スルホルホダミンＢ スルホローダミン１０１ スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）リボフラビンロゾール酸テルビウムキレート誘導体。
消光剤
特定の実施形態において、本発明のシステムおよび方法で使用される消光剤としては、とりわけ、プローブのフルオロフォア構成要素からの蛍光を消光させる能力を低下させる反応を受けるものが挙げられる。
特定の実施形態において、例示的な消光剤は、そのフレームワーク内にアゾ結合を含む。アゾ系消光剤のアレイは、ほとんどのフルオロフォアの放出を効率的にブロックするように設計されている（例えば、米国特許第６，６９９，９７５号を参照のこと）。アゾ系消光剤は、細菌アゾレダクターゼの基質としての役割を果たす。アゾ結合を還元すると、消光能力が破壊され、隣接するフルオロフォアの蛍光が回復する（スキーム１）。
特定の実施形態において、消光剤は、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、および置換もしくは非置換不飽和アルキルから独立して選択される２つのメンバーを共有結合的に連結するジアゾ結合を含む。
本発明において役に立つＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（「ＢＨＱ」）フォーマットによる例示的な消光剤としては、以下の式
Figure 2023528551000002

を有する消光剤が挙げられ、式中、ＸおよびＹは、Ｈ、反応性官能基、担体分子への結合（例えば標的化部分）、担体分子に結合したリンカー、固体支持体、固体支持体に接続したリンカー、フルオロフォアへの結合、およびフルオロフォアに結合したリンカーから独立して選択されるメンバーを表す。ＸおよびＹから選択される少なくとも１つのメンバーは、好ましくはＨ以外である。
別の実施形態において、消光剤は、アントラキノンなどのキノンである。例示的なアントラキノン消光剤は、以下の式を有し、
Figure 2023528551000003
式中、「Ｒ」基は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、および置換もしくは非置換ヘテロアリール部分から選択される。キノンレダクターゼによるキノンの還元は、当該技術分野で知られている。
リンカー
本発明のプローブは、フルオロフォアおよび消光剤の両方が結合するリンカー部分を含む。リンカーは、特定の用途のための任意の所望の構造から選択することができ、このことは、当業者が適切なリンカー部分を選択する能力の範囲内で十分である。リンカー構造に関する唯一の実用的な制限は、一般に、リンカーが、消光剤と酵素または酵素反応生成物との反応の前に、消光剤およびフルオロフォアが、作動可能な近接内に入ることを可能にする長さおよび立体配座を有することが好ましいことである。
例示的なリンカーは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリール部分から選択される。リンカー基は、親水性（例えば、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコール）であってもよく、または疎水性（例えば、ヘキサン、デカンなど）であってもよい。特定の例示的なリンカーとしては、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０アルキル基、ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール））、ポリアミン、アミノ酸（例えば、ポリアミノ酸）、糖（例えば、多糖）、および四級アミン、ホスフェートおよびリン酸エステル部分を含む種、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
なおさらなる実施形態において、本発明のプローブにおいて使用されるリンカー基は、それに結合する種、例えば、固体支持体、抗体、酵素からプローブを放出するか、またはプローブの構成要素である部分、例えば、フルオロフォア、消光剤、薬物部分、標的化部分、担体分子などをリンカー構成要素から放出するように切断され得る基を有するものが提供される。多くの切断可能な基は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２－１６２（１９８３）、Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８－１４５２５（１９９０）、Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３－９２０（１９８０）、Ｂｏｕｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１－１４７（１９８６）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５－２１０（１９８６）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９－１８６７（１９８９）を参照されたい（これらの各々は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、広範囲の切断可能な二官能性（ホモ官能性およびヘテロ二官能性の両方）リンカーアームは、Ｐｉｅｒｃｅなどの供給業者から市販されている。例示的な切断可能な基は、光によって切断されるもの（例えば、ニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステル）、加水分解によって切断されるもの（例えば、エステル、カーボネート）、ｐＨの変化によって切断されるものなどである。
例示的な実施形態において、リンカーは、プローブに水溶性を付与し、以下の式を有する。
Figure 2023528551000004
式中、Ｘ３は、ＣＨ２、ＮＲ１０、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１０、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｏ－、Ｏ、＋Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＲ１０、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１０、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０、およびＯ（ＣＨ２ＣＨ２）ｓから選択されるメンバーであり、ここで、ｓは、１～１０の整数である。Ｒ１０は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキルである。このリンカーアームを含むプローブの水溶性は、「Ｘ」を含まない以外は同一のプローブよりも大きい。
リンカーはまた、酵素反応によって切断される結合、例えば、アゾ結合であってもよい。例示的な実施形態において、アゾ結合の切断は、分子の蛍光（または「前蛍光」）構成要素を、その構成要素の蛍光を消光させる分子の第２の構成要素から分離することによって、非蛍光化合物を蛍光種へと変換する。蛍光種を生成する非蛍光アゾ含有化合物の切断の一例を以下に示す。
Figure 2023528551000005

上の例において、アゾ結合は、レダクターゼの作用によって切断される。本発明はまた、結合が別の酵素または化学還元剤、例えば、アスコルビン酸によって切断される実施形態も包含する。当業者には理解されるように、上述の部分のアリール環は、本明細書に示されるアリールまたはヘテロアリール部分の１つ以上の置換基で任意選択的に置換される。
反応性官能基
本発明で使用される分子プローブは、リンカー、フルオロフォアおよび消光剤部分上の相補的反応性官能基の反応によって組み立てられる。典型的には、２つの反応性官能基から形成される反応生成物である連結部は、生理学的に関連する条件下で安定である。本発明の例示的な化合物、特に別の種にコンジュゲートされるように設計されたこれらのプローブは、反応性官能基を有しており、これは、プローブが他の種にコンジュゲートされるプローブ分子上の任意の位置に位置し得る。
本発明の実施に有用な反応性基および反応の種類は、一般に、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。現時点で望ましい反応の種類は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子の多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールスアルダー付加）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のシステムおよび方法の特定の実施形態において、有用な反応性官能基としては、例えば、以下のものが挙げられる：
（ａ）限定されないが、活性化エステル、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステル、ペプチド合成および酸ハロゲン化物に使用される活性化基を含む、カルボキシル基およびその誘導体、
（ｂ）エステル、スルホネート、ホスホラミデート、エーテル、アルデヒドなどに変換され得る、ヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えられ、それによってハロゲン原子の部位での新しい基の共有結合的接続が起こる、ハロアルアキル基、
（ｄ）例えばマレイミド基などのディールスアルダー反応に関与することができる、ジエノフィル基、
（ｅ）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成による、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構による誘導体化を可能にする、アルデヒドもしくはケトン基、
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するための、アミンとの反応のためのスルホニルハロゲン化物基、
（ｇ）例えばジスルフィドに変換することができるか、またはハロゲン化アシルと反応させることができる、チオール基、
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化または酸化され得る、アミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば環化付加、アシル化、マイケル付加などを行うことができる、アルケン、
（ｊ）例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができる、エポキシド、ならびに
（ｋ）核酸合成において有用なホスホラミダイトおよび他の標準的な官能基。
反応性官能基は、プローブまたはそのコンジュゲートを組み立てるか、または利用するために必要な反応に関与しない、または干渉しないように選択することができる。代替的に、反応性官能基は、保護基の存在によって、選択された反応に関与することから保護され得る。当業者は、特定の官能基が選択された一連の反応条件に干渉しないように、どのように保護するかを理解している。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
本発明で使用される分子プローブが別の種、例えば担体分子、固体支持体、標的化部分に直接的に接続するそれらの実施形態に加えて、プローブはまた、間接的な手段によっても接続し得る。例示的な実施形態において、リガンド分子（例えばビオチン）は、一般に、プローブ種に共有結合する。次いで、リガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、これが、分析のための標的種である種に共有結合する。２つ以上のアッセイ構成要素の間接的な結合に依存する他のアッセイフォーマットは、当業者に既知である。
プローブ、またはプローブに対して反応性の酵素は、実質的に、任意のポリマー、生体分子、または任意の有用な構成を有する固体もしくは半固体の材料上に固定することができる。さらに、１つ以上のプローブ（または酵素）を含む任意のコンジュゲートを同様に固定することができる。支持体が固体または半固体である場合、核酸プローブの固定化のための好ましいタイプの支持体の例としては、孔制御ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンコーティングされたポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、および活性化デキストランが挙げられるが、これらに限定されない。これらの固体支持体は、その化学的安定性、官能化の容易さ、および明確に定義された表面積のため、好ましい。孔制御ガラス（ＣＰＧ、５００Å、１０００Å）および非膨張高架橋ポリスチレン（１０００Å）などの固体支持体が特に好ましい。
本発明の実施に好適な多数の固体支持体は、市販されており、例えば、接続したアミノ酸および／またはペプチドを有するものおよび有さないものの両方のペプチド合成樹脂（例えば、アルコキシベンジルアルコール樹脂、アミノメチル樹脂、アミノポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂など（Ｂａｃｈｅｍ））、官能化孔制御ガラス（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、イオン交換媒体（Ａｌｄｒｉｃｈ）、官能化膜（例えば、－ＣＯＯＨ膜、Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．、およびＴｏｋｕｙａｍａ Ｓｏｄａ Ｃｏ．）などが挙げられる。
さらに、適切な固体支持体が市販されていない用途については、固体支持体表面の官能化のために多種多様な反応型が利用可能である。例えば、ポリプロピレンなどのプラスチックで構築された支持体は、クロム酸酸化によって表面誘導体化され、その後、ヒドロキシル化表面またはアミノメチル化表面に変換され得る。次に、官能化支持体を、相補的反応性を有する本発明のキサンテン色素、例えば、本発明の活性エステルのキサンテン色素、酸塩化物またはスルホネートエステルと反応させる。高度に架橋されたジビニルベンゼンから作製された支持体は、クロロメチル化およびその後の官能基操作によって表面誘導体化することができる。加えて、官能化基質は、エッチングされ、還元されたポリテトラフルオロエチレンから作製することができる。
支持体がガラスなどのケイ素質材料で構築される場合、表面Ｓｉ－ＯＨ、ＳｉＯ－Ｈ、および／またはＳｉ－Ｓｉ基を官能化試薬と反応させることにより、表面を誘導体化することができる。
例示的な実施形態において、基質がガラスから作製される場合、ガラス表面に対する反応性基の共有結合は、基質表面上の基を、以下のようなシリコン修飾試薬によって変換することによって達成され、
（ＲａＯ）３－Ｓｉ－Ｒｂ－Ｘａ
式中、Ｒａは、メチルまたはエチルなどのアルキル基であり、Ｒｂは、ケイ素と反応性基Ｘａとの間の連結基である。ハロゲンまたはアルコキシ基以外の他の脱離基を有するシラン誘導体も、本発明において有用である。例示的な連結基には、置換もしくは非置換アルキルおよび置換もしくは非置換ヘテロアルキル基を含むものが含まれる。
別の好ましい実施形態において、固体支持体を官能化するために使用される試薬は、各試薬分子当たり１つより多い反応性基を提供する。以下の化合物などの試薬を使用して、基質表面上の各反応性部位は、本質的に、以下の２つ以上の官能基に「増幅」され、
（ＲａＯ）３－Ｓｉ－Ｒｂ－（Ｘａ）ｎ
式中、Ｒａは、アルキル基（例えばメチル、エチル）であり、Ｒｂは、ケイ素とＸａとの間の連結基であり、Ｘａは、反応性基または保護された反応性基であり、ｎは、２～５０、より好ましくは２～２０の間の整数である。シリコン含有基質への接続による本発明で使用される分子プローブの増幅は、増幅の一般的な概念の例示であることが意図される。この増幅戦略は、本発明において使用される分子プローブが別の分子または固体支持体に接続する本発明の他の態様に等しく適用可能である。
いくつかのシロキサン官能化試薬、例えば、以下のものを使用することができる。
１．ヒドロキシアルキルシロキサン（シリレート表面、ジボラン、およびＨ２Ｏ２で官能化し、アルコールに酸化する）
ａ．アリルトリクロロシラン→→３－ヒドロキシプロピル
ｂ．７－オクタ－１－エニルトリクロロクロロシラン→→８－ヒドロキシオクチル、
２．ジオール（ジヒドロキシアルキル）シロキサン（シリレート表面、およびジオールへの加水分解）
ａ．（グリシジルトリメトキシシラン→（２，３－ジヒドロキシプロピルオキシ）プロピル、
３．アミノアルキルシロキサン（中間官能化ステップを必要としないアミン）、
ａ．３－アミノプロピルトリメトキシシラン→アミノプロピル
４．二量体二級アミノアルキルシロキサン
ａ．ビス（３－トリメトキシシリルプロピル）アミン→ビス（シリルオキシルプロピル）アミン。
シロキサン以外の支持体構成要素が使用される場合、同様に有用な官能化化学物質のアレイが利用可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、例えば、シロキサン修飾試薬の文脈で上で考察されたように官能化されたアルキルチオール（例えば、自己組織化単層）を金属フィルムに接続させ、続いて本発明のキサンテン色素と反応させて、本発明の固定化された化合物を生成することができる。
本発明の上述の実施形態におけるＲｂのための使用の例示的な基としては、置換または非置換アルキル（例えば、置換または非置換アリールアルキル、アルキルアミノ、アルコキシ）、置換または非置換アリール（例えば、置換または非置換アリールアルキル、アリールオキシおよびアリールオキシアルキル）、アシル（例えば、アシルアミノ、アシルオキシ）、メルカプト、飽和または不飽和環状ヒドロカルビル、置換または非置換ヘテロアリール（例えば、置換または非置換ヘテロアリールアルキル）、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
別の例示的な実施形態において、本発明で使用される分子プローブにコンジュゲートされた種は、マトリックス、例えば、アクリルアミドマトリックス、例えば、「アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）」内に固定化される（例えば、Ｒｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：６４９－６５５（１９９９）を参照されたい）。
不可逆的に内部化されたプローブ
別の実施形態において、本発明は、分子プローブの細胞内への内在化を促進する基（典型的には親油性基）を含む分子プローブを使用する。促進する基は、好ましくは、通常の細胞プロセス、例えば、エステラーゼ、リパーゼなどによって切断される結合を介して、本発明のシステムおよび方法で使用される分子プローブの残りの部分に連結される。代替的に、その基は、細胞外環境からエンドサイトーシス空胞（例えば、ｐＨ７～ｐＨ４）に向かう際に生じるものなどのｐＨの変化によって切断することができる。促進する基は、誘導される細胞内プロセスによって切断することもできる。例示的なプローブおよびその異なる状態を以下の例に示す。
Figure 2023528551000006

Figure 2023528551000007
上の例において、プローブは、細胞壁を貫通し、細胞内に内在化する。アセチルエステルは、細胞内の構成要素によって加水分解され、負に帯電したプローブを細胞内に閉じ込める。続いて、プローブのアゾ結合が切断され、フルオロフォアを効率的に消光しない部分（図示せず）が残り、それによって蛍光性生成物が生成される。細胞内の生成物の存在は、顕微鏡法または分光法、共焦点顕微鏡法、細胞選別法などによって確認することができる。
別の例示的な実施形態において、以下に示すように、側鎖カルボン酸エステルが切断され、分子プローブが細胞内に閉じ込められ、アゾ結合が切断され、蛍光シグナルが生成される。
Figure 2023528551000008
当業者には理解されるように、本発明の様々な実施形態に有用な分子プローブは、上の例に示される切断可能な基または切断可能な基の数に限定されない。さらに、アゾ結合、または他の切断可能な結合によって連結されるアリール、コンジュゲート基、不飽和アルキル基、またはヘテロアリール基の一連の組み合わせに基づくプローブは、本発明の範囲内である。アルキル、アリールおよびヘテロアリール部分は、本明細書の定義のセクションに記載されているものなどの１つ以上の置換基で任意選択的に置換される。
マイクロアレイ
本発明はまた、本発明のアッセイを実行するのに有用な様々な形式の発明ｘｘｘを含むマイクロアレイシステムを提供する。例示的なマイクロアレイにおいて、本発明で使用される分子プローブ、または本発明で使用される分子プローブがコンジュゲートされる種を固定化し、これを使用して、プローブの消光剤と反応し、フルオロフォアからの蛍光を消光させる能力を妨害する酵素または他の種の存在について、アッセイ試料を調べる。別の例示的なフォーマットにおいて、酵素、または酵素が接続している種は、固定化される。
さらに、本発明は、本発明のプローブまたは方法を使用してマイクロアレイを調べる方法を提供する。例示的な実施形態において、酵素は、固定化された分析物に結合する標的化部分にコンジュゲートされる。分析物および標的化部分は、それらが相互作用するのに適切な条件下で接触され、マイクロアレイ上の標的化剤－酵素構築物を固定する。任意の必要な後に続くステップ（例えば、洗浄、緩衝液交換など）に続いて、プローブをマイクロアレイに添加する。蛍光の領域は、分析物の存在を確認する。アッセイは、標的化部分がプローブにコンジュゲートされるときに、多少異なるが類似の様式で実行することができる。この場合、マイクロアレイを酵素と接触させ、分析物が固定化されている領域で蛍光を生じさせる。
本発明のマイクロアレイは、核酸マイクロアレイを参照することによってより良く理解される。多数の固定化された核酸からなる核酸マイクロアレイは、ゲノム情報を生成するための画期的なツールであり、Ｄｅｂｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：４８－５０（１９９９）を参照されたい。以下の考察は、核酸マイクロアレイと組み合わせた本発明のキサンテン色素の使用に焦点を当てている。この焦点は、例示を意図しており、本発明のこの態様を実施することができる材料の範囲を限定しない。
例示的なマイクロアレイは、同一または異なる種（例えば、核酸配列、生物活性剤）のｎ個の領域を含む。好ましい実施形態において、ｎは、２～１００、より好ましくは１０～１０００、より好ましくは１００～１０，０００の数である。なおさらに好ましい実施形態において、ｎ個の領域は、ｎ個の位置の各々の正体が確認されることを可能にする様式で、ｎ個の異なる位置として基質上にパターン化される。
マイクロアレイを調製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｌｅｈｒａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＦＩＮＧＥＲＰＲＩＮＴＩＮＧ ＩＮ ＧＥＮＯＭＥ ＭＡＰＰＩＮＧ ＡＮＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ，ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｖｏｌ．１，Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９－８１（１９９０）、Ｐｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２年に発行された米国特許第５，１４３，８５４号（これらの各々は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ＩＩ．実施例
以下に記載される材料および方法を使用して、以下の実験データを集めた。
材料および方法
ＧｙｒＩ様タンパク質のクローニング、発現、および精製
操作された組換えＧｙｒＩタンパク質ＳＡＶ２４３５、ＬＩＮ２１８９、ＣＴＲ１０７のポリペプチド配列（図２）に対応する遺伝子を設計し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，）から購入した。すべての遺伝子を、確固たるタンパク質産生のための親和性精製６Ｘ－ヒスタグおよびイニシエーター開始アミノ酸配列を用いて操作した。すべての遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位の間のｐＥＴ２８Ｂベクターにクローニングし、ＢＬ２１ Ｔ７発現コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換した。
プラスミドにおいてＧｙｒＩ様タンパク質遺伝子で形質転換した細胞を、ＬＢ培地中で成長させ、０．６のＯＤ６００に達した後、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を細胞に添加することによって、４時間発現させた。細胞を遠心分離によって採取し、１時間インキュベートし、その後、３０秒間の音波処理、１２Ｗの出力での各サイクル間に４５秒間の待ち時間の１０サイクルによって、溶解緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、０．２％のＴｗｅｅｅｎ２０、０．１％のポリエチレンイミン体積／体積）に溶解した。上清を１４０００ＲＰＭでの遠心分離によって集め、次いで、平衡緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール）を用い、Ｎｉ－ＮＴＡスーパーフローカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）上にロードし、平衡緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール）で溶出させた。タンパク質を濃縮し、保管緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０％のグリセロール）に－２０℃で保管した。精製タンパク質の例を図３に示す。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのＱ５部位特異的変異誘発キットを使用して、ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、ＬＩＮ２１８９のバリアントを作製した。変異体を、野生型タンパク質と同じプロトコルを使用して精製した。
蛍光結合アッセイ
色素に結合する組換えＧｙｒＩ様タンパク質を調べるために、タンパク質の滴定時に有機ダイの固有蛍光の変化をモニタリングする蛍光ベースのアッセイを開発した。蛍光緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中のＱｕｂｉｔ３蛍光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して蛍光測定を実施した。実験は、２００μＬの反応体積で実施され、データを二重測定で集めた。データは、誤差を示すように計算された標準偏差を有する独立した実験の平均を表す。滴定実験において、タンパク質を、色素を含有する蛍光緩衝液中で最終濃度まで希釈し、データを集める前に完全に混合した。各実験において、蛍光緩衝液のみのブランク測定値を使用して、実験データを補正した。使用したすべての色素は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。色素を使用する前に、色素を蛍光緩衝液に溶解させた。色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。蛍光を使用して結合親和性を決定したとき、プロットをヒルの式に当てはめた。蛍光増強を、溶液中の遊離色素に対する、タンパク質－色素複合体を形成する蛍光増加の比率で計算した。
吸収試験
ＧｅｎｅＱｕａｎｔ １３００分光光度計を使用して、吸収データを集めた。吸収実験は、体積２００μＬの蛍光緩衝液中で実施した。
インビボ薬物結合アプタマースクリーニング
インビボ実験において、ＧｙｒＩ様タンパク質ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、およびＬＩＮ２１８９または対照タンパク質を含有するプラスミドで形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ細胞を、選択のために５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを使用して、０．３単位のＯＤ６００になるまで成長させた。細胞を１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で２時間成長させ、次いで、様々な濃度のアンピシリンを添加した。試料を２４時間成長させ、次いでＯＤ６００をＧｅｎｅＱｕａｎｔ １３００分光光度計を使用してモニタリングした。
１００μｌの細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含有する寒天プレート上に蒔き、コロニー形成のために一晩成長させた。
エクスビボ薬物代謝アプタマースクリーニング
蛍光緩衝液中の様々な濃度のアンピシリンに８０μｇ／ｍｌのＧｙｒＩ様タンパク質を添加し、薬物を不活性化するために、３７℃で２時間インキュベートした。次に、対数相成長細胞をアンピシリン－タンパク質混合物に添加し、２４時間インキュベートした。次いで、試料の吸光度をＯＤ６００でモニタリングし、細胞密度を決定した。
変異体ライブラリー設計
プログラムＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用し、ＳＡＶ２４３５（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５ＫＡＵ）、ＬＩＮ２１８９（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５ＫＡＸ）、およびＣＴＲ１０７（ＰＤＢ＿ＣＯＤＥ＝５Ｘ５Ｍ）結合部位の構造特性および生物物理学的特性を分析した。結合したリガンドとの分子相互作用を行うと推論された残基をアノテーションし、無作為変異誘発のために選択した。次いで、変異体ライブラリーを、ＮＮＫ変異誘発プロセスを通じて、ＳＡＶ２４３５、ＬＩＮ２１８９、ＣＴＲ１０７の野生型遺伝子から設計した。結合部位残基のコンビナトリアル変異体ライブラリーは、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。
結果
実施例１：ＧｙｒＩ様タンパク質による蛍光増強特性の証明
ＧｙｒＩ様タンパク質の汎用性を示すために、弱いフルオロフォアまたは非蛍光フルオロフォアに結合し、それらの蛍光を活性化することができる蛍光増強アプタマーを設計した。蛍光増強モジュールを作成するには、高い光安定性とともに広範囲の蛍光増強を示す発蛍光性色素を選択することが重要である。そのような色素の１つは、細胞イメージングにおける核酸のための、またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応におけるシグナル検出のための染色として一般的に使用されるＳＹＴＯ９である（図４）。ＳＹＴＯ９は、核酸の不在下で、５０３ｎｍの発光最大値で低い蛍光を示す。ＤＮＡの主要な溝の核酸塩基間にインターカレートすると、蛍光の強い増強が観察される。
ＧｙｒＩ様タンパク質の強い芳香族性および多重特異性のため、ＳＹＴＯ９および同様の機構を使用して蛍光を発する他の化合物が、分子結合時によって活性化され得る可能性がある。この仮説を試験するために、ＳＹＴＯ９を用いて、３つの選択されたＧｙｒＩタンパク質ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、およびＬＩＮ２１８９を使用して蛍光増強アッセイを行った（図５Ａ）。ＳＹＴＯ９は、４７０ｎｍで励起すると、１μＭの濃度で緩衝液中に弱い蛍光を示し、５１０～５８０ｎｍ（緑色チャネル）および６６５～７２０ｎｍ（赤色チャネル）の間で同時にモニタリングされた発光を示す（図４Ａ）。ＳＹＴＯ９に、４０マーの対照ＲＮＡを添加すると、それぞれ、緑色チャネルおよび赤色チャネルの下で、ほぼ９倍および２倍の蛍光発光の増加が観察される。ＳＹＴＯ９を含有する溶液にＧｙｒＩ様タンパク質を添加すると、可変する結果が得られた。ＳＹＴＯ９と混合した１０μＭのＳＡＶ２５３４は、それぞれ、緑色チャネルおよび赤色チャネルにおいて、適度な２１倍および１１倍の増強を引き起こした（図５Ａ）。１０μＭのＣＴＲ１０７とＳＹＴＯ９との添加は、強力な８４倍および３３倍の増強を引き起こした（図５Ａ）。両方とも高い蛍光増強特性を示したＣＴＲ１０７およびＳＡＶ２４３５とは異なり、ＧｙｒＩ様タンパク質ＬＩＮ２１８９は、対照の４０マーＲＮＡと同様に、赤色チャネルおよび緑色チャネルの下で小さい増強を示した。３つの結合ポケットはすべて、物理的特性および化学的特性が異なる結合部位を含有するため、そのような効果が期待される。これらの結果は、複数のＧｙｒＩ様タンパク質をスクリーニングして、標的フルオロフォアの最良の蛍光増強剤を識別することの重要性を強調する。全体として、これらのデータは、ＧｙｒＩ様タンパク質足場が、弱いフルオロフォアまたは非蛍光フルオロフォアの蛍光増強のための一般的なテンプレートとして使用可能である最初の証拠を示す。
実施例２：合理的な設計を介するＧｙｒＩ様タンパク質によるＳＹＴＯ９蛍光増強の改善
ＧｙｒＩ様タンパク質ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７は、実施例１に見られるように、非蛍光フルオロフォア色素または弱いフルオロフォア色素を活性化する能力を示す。これらのタンパク質の蛍光増強特性をさらに改善するには、結合部位における標的化変異が必要である。本発明によれば、ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、およびＬＩＮ２１８９の結晶構造を分析して、様々なフルオロフォアが相互作用する結合部位を形成する残基を決定した。次に、本明細書で識別されるこれらの結合部位において、変異の合理的な設計は、改善された色素結合活性を有するアプタマーを提供する。より具体的には、ＢｍｒＲの構造をＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７と重ね合わせることは、唯一の類似点が保存されたグルタメートであることを示す。このグルタメートは、ＢｍｒＲによるカチオン選択性において重要である。本発明によれば、ＣＴＲ１０７（Ｅ１３３）およびＳＡＶ２４３４（Ｅ１３５）におけるこの保存されたグルタメートの変異を構築してカチオン選択性を除去し、異なる方向で帯電していない色素および負に帯電した色素と結合する能力について分析した。
部位特異的変異誘発により、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、およびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑの３つの変異体を構築し、ＳＹＴＯ９の蛍光を増強する能力を試験した（図５Ｂ）。変異体増強データを、５００ｎＭのＳＹＴＯ９を有する組換え野生型ＣＴＲ１０７と比較して、標的結合部位残基の変異の影響を決定した。ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒは、この変異を通じて蛍光増強の喪失を示す野生型よりも弱い増強を示した（図５Ｂ）。ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗは、それぞれ、緑色チャネルおよび赤色チャネルの下で有望な１１５倍および１９倍の増加を示した。ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑの場合、それぞれ、緑色チャネルおよび赤色チャネルの下で蛍光の有意な１５７倍および５５倍の増加を観察した（図５Ｂ）。ＣＴＲ１０６ Ｙ１０６ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑアプタマーの両方において、ＳＹＴＯ９は、組換えＣＴＲ１０７よりも有利な方向で結合することができ、それにより、より高い蛍光増強をもたらす可能性が高い。
ＧｙｒＩ様タンパク質は、溶液中および高温で安定である。ＳＹＴＯ９に結合したＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑアプタマーの可逆性を試験した。典型的にはタンパク質を変性させるであろう試料を１０分かけて９０℃まで加熱した（図５Ｃ）。本願発明者らは、組換えＣＴＲ１０７およびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑの加熱試料のＵＶ蛍光を分析し、これらは両方ともＳＹＴＯ蛍光の強力な増加を示した。室温まで冷却した後、試料をＵＶ光を使用して分析した（図５Ｃ）。ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ試料のみが蛍光活性化を完全に回復することができ、このことは、ＳＹＴＯとの相互作用の安定性およびＧｙｒＩ様タンパク質の熱安定性を強調する（図５Ｃ）。本発明は、可逆的な熱安定性生体分子蛍光スイッチを示し、その種の最初のものである。ＣＴＲ１０７およびバリアントによる蛍光増強は、用量依存的である（図５Ｄ）。ＳＹＴＯ９の野生型ＣＴＲ１０７の解離定数を３０２ｎＭと推定する。より強力な増強剤は、値が類似しているか、またははるかに厳しい解離定数を有することが予想される。当業者であれば、合理的な操作を行って、ＧｙｒＩ様タンパク質による蛍光活性化を増加させることができることを容易に理解するであろう。さらに、これらの結果は、より明るいアプタマーが、ＧｙｒＩ様タンパク質のコンビナトリアル変異体ライブラリーから生成され得ることを示す。したがって、ＧｙｒＩ様タンパク質結合部位の変異を通じて、より高い親和性およびより明るいアプタマーを作製するための方法が本明細書に提供される。
実施例３：バイオテクノロジーで使用される一般的なフルオロフォアの蛍光活性化
ＤＦＨＢＩおよびマラカイトグリーンは、蛍光アプタマーがインビトロでの進化または合理的な計算設計によって設計されている、２つの弱いフルオロフォアである（図３）。ＤＦＨＢＩは、天然に存在するＧＦＰの発色団の安定した高量子収率誘導体である。マラカイトグリーンは、結合アプタマーの不在下で蛍光を示さないトリフェニルメタン色素である。両方のフルオロフォアがＧｙｒＩ様タンパク質の多重特異性ポケットに適度な親和性で結合し、それによって芳香族相互作用または直接水素結合網目構造を介して蛍光増強を誘導するかどうかを試験した。蛍光増強アッセイにおいて、ＤＦＨＢＩおよびマラカイトグリーンを活性化するＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、およびＬＩＮ２１８９の能力を探索した（図６）。
ＤＦＨＢＩは、それぞれ、４４７ｎＭおよび５０１ｎＭで励起最大値および発光最大値を示す。タンパク質不在下で、５００ｎＭのＤＦＨＢＩは、緑色チャネルおよび赤色チャネルの下でバックグラウンドに近い蛍光を示した。ＳＹＴＯ９の結果と同様に、３つのＧｙｒＩ様タンパク質はすべて、ＤＦＨＢＩに添加したときに可変の増強結果を示した。ＳＡＶ２４３５は、緑色チャネルの下で試験したすべてのＧｙｒＩ様タンパク質の中で最も高い増強を示した（図５）。５００ｎＭのＤＦＨＢＩに１０μＭのＳＡＶ２４３５を添加することにより、蛍光が２０倍増加した。ＣＴＲ１０７を１０μＭで添加したとき、ＤＦＨＢＩ蛍光の１０倍の増加を誘導した（図６Ａ）。ＳＹＴＯ９と同様に、ＬＩＮ２１８９は、蛍光に影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。
マラカイトグリーンは、結合アプタマーによって刺激されたときに遠赤外線領域で蛍光を発するため、６３５ｎｍで励起させた後、６６５～７２０ｎｍでその蛍光発光をモニタリングした。タンパク質５００ｎＭの不在下では、マラカイトグリーンは、赤色チャネルの下で弱い蛍光を示す（図６Ｂ）。１０μＭのＳＡＶ２４３５を添加することにより、マラカイトグリーンの蛍光が１０倍増加した。１０μＭのＣＴＲ１０７を添加することにより、最大の増強が生じ、蛍光強度が１８倍増加した（図６Ｂ）。ＬＩＮ２１８９は、蛍光増強に対する影響がないことを示した。
まとめると、これらの結果は、ＧｙｒＩ様タンパク質の蛍光増強特性を広範囲のフルオロフォアに調節することができることを示している。これらのデータは、ＧｙｒＩ様タンパク質によるフルオロフォアＤＦＨＢＩおよびマラカイトグリーンの蛍光活性化の最初の事例を表している。観察された可変効果は、ＧｙｒＩ様タンパク質の多様なリガンド結合部位が、各フルオロフォアに異なる効果を誘導することができることを示す。観察されたように、ＳＡＶ２４３５は、ＤＦＨＢＩに対してより確固たるものであり、ＣＴＲ１０７は、マラカイトグリーンに対してより確固たるものであった。本発明に従って高親和性アプタマーを設計するために、リガンド結合部位の変異誘発は、合理的な設計またはコンビナトリアルＮＮＫライブラリーのいずれかによって行われ、続いて、より厳密な結合またはより高い蛍光強度を示すバリアントアプタマーの選択が行われる。ＤＦＨＢＩおよびマラカイトグリーンに対して示される増強特性は、多数の他の弱い蛍光色素に適用可能な一般的な機構である。さらに、本発明のＧｙｒＩ様タンパク質は、広範囲の蛍光分子に結合し、蛍光を増強するように選択することができる。
実施例４：バイオテクノロジーへの有用な用途を有するチアゾールオレンジの強い蛍光活性化
組換え野生型ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７タンパク質によるマラカイトグリーンおよびＤＦＨＢＩ蛍光の観察された増強は、バイオテクノロジーおよび細胞イメージングに有用ではなく、蛍光活性化を改善するためにさらなる操作が必要であった。本発明によれば、細胞イメージングおよびインビトロ診断のための蛍光シグナル検出のための明るい蛍光スイッチが作成されている。より効率的な蛍光増強アプタマーを識別するために、細胞に対して非毒性である有望な弱い蛍光色素であるチアゾールオレンジの蛍光増強を探索した（図３）。以前の研究では、チアゾールオレンジ誘導体の蛍光を強く活性化することができる操作されたタンパク質およびＲＮＡアプタマーが示されている。マンゴーＲＮＡアプタマーは、ＤＦＨＢＩと同様のＧ－四重鎖を使用して、ビオチンリンカーと共有結合的に接続したチアゾールオレンジと結合する。色素ＲＮＡ複合体において、Ｇ－四重鎖によって形成される芳香族環境は、蛍光増強の機構にとって重要である。
本発明によれば、本願発明者らは、ＧｙｒＩ様タンパク質がその多重特異性芳香族結合ポケットを使用してそのような機構を模倣し、チアゾールオレンジの蛍光を増強することができるかどうかを試験した。チアゾールオレンジおよびＭＤＲタンパク質ＳＡＶ２４３５、ＬＩＮ２１８９、およびＣＴＲ１０７を用いて蛍光活性化アッセイを行い、ＧｙｒＩ様タンパク質による蛍光活性化の程度を決定した（図７Ａ）。１μＭのチアゾールオレンジおよび飽和濃度のＧｙｒＩ様タンパク質の実験において、ＳＡＶ２４３５ ＷＴのみが有意な増強を示した。ＳＡＶ２４３５は、緑色チャネルの下でチアゾールオレンジ蛍光の強力な５０倍の増加を示すが、一方、赤色チャネルの下ではわずかに５倍の増加しか観察されない（図７Ａ）。チアゾールオレンジは、それぞれ、５０５ｎｍの励起最大値および５３５ｎｍの発光最大値を有する。これらの波長で励起スペクトルおよび発光スペクトルに焦点を合わせることができる器具は、ＳＡＶ２４３５がチアゾールオレンジに結合したときに、より深い蛍光増強を生じさせる。Ｌｉｎ１２８９およびＣＴＲ１０７は、チアゾールオレンジ蛍光への影響を示さなかった（図７Ａ）。
ＧｙｒＩ様タンパク質の存在下または不在下でチアゾールオレンジに対して吸収実験を行うことにより、蛍光増強の機構をさらに分析した（図７Ｂ）。チアゾールオレンジは、５０５ｎＭで０．３単位の強い吸収ピークを示す。ＣＴＲ１０７の添加は、５０５ｎｍにおけるチアゾールオレンジのピークの強度に影響を及ぼさなかった。ＳＡＶ２４３５を添加したとき、５０５ｎｍでのチアゾールオレンジのピークは、０．７単位まで有意に増加した（図７Ｂ）。これらの結果は、ＳＡＶ２４３５がチアゾールオレンジ色素の励起を増加させ、これが全体的な蛍光活性化機構に部分的に寄与することを強く示している。ＧｙｒＩ様タンパク質の中で、２０倍の蛍光増加およびＳＡＶ２４３５に対する特異性により、このアプタマー－フルオロフォア対は、バイオテクノロジー開発の魅力的な候補となる。したがって、本発明によれば、より明るいアプタマーバリアントを識別し、選択するための蛍光スクリーニングと組み合わせた、ＳＡＶ２４３５結合部位の変異分析を含む方法が本明細書に提供される。
実施例５：ＧｙｒＩ様タンパク質の合理的な設計によるチアゾールオレンジの蛍光増強の改善
実施例１において、ＳＹＴＯ９のための著しく明るい蛍光増強アプタマーを産生するＣＴＲ１０７のバリアントが提供される。同様の合理的な設計手法を使用して、ＣＴＲ１０７およびＳＡＶ２４３５の変異体を用いるチアゾールオレンジの蛍光増強を改善する効果を評価した。したがって、本発明によれば、より明るいアプタマーバリアントを識別し、選択するための蛍光スクリーニングと組み合わせた、ＳＡＶ２４３５結合部位の変異分析を含む方法が本明細書に提供される。
この実施例は、変異誘発および蛍光増強アッセイによるスクリーニングを通じて、ＧｙｒＩ様バリアントアプタマータンパク質による蛍光活性化を改善する本発明の方法を示す。
ＳＡＶ２４３５ ＷＴに関して、増強は、チアゾールオレンジ蛍光活性化に特有のＳＡＶ２４３５結合部位の特徴を強調する、ＣＴＲ１０７ ＷＴよりも有意に高かった。ＳＡＶ２４３５の構造をガイドとして使用し、蛍光増強の機構において重要であると考えられる、重要なトリプトファン（Ｗ３４）を強調した。他の結合部位残基をトリプトファンに変異させると、蛍光の増強が相乗的に増加するかどうかを評価した。５つの残基を標的とし、チアゾールオレンジが安定して結合し、蛍光を活性化することができるＷ３４を有する「トリプトファンサンドイッチ」を作製する結合部位バリアントを作製した。これらの変異体のうち、いずれも結晶構造においてＷ３４から直接反対側に位置するＶ１０５ＷおよびＰ１０６Ｗは、野生型と比較して増加した増強を生じた（図７Ｃ）。どちらの場合も、野生型と比較して３倍高い増強が見られ、赤色チャネルの下での色素単独と比較して全体的に５０倍の増強が観察される（図７Ｃ）。ＳＡＶ２４３５バリアントによって観察された増強は、本願発明者らの計測によって測定されたものよりも高い可能性がある。チアゾールオレンジのピーク発光に対応する波長での計測による蛍光のモニタリングは、ＳＡＶ２４３５バリアントによるより高い増強を示すであろう。
ＣＴＲ１０７ ＷＴは、チアゾールオレンジ蛍光の増強を示さなかった（図７Ａ）。本願発明者らの合理的なトリプトファン設計は、ＳＡＶ２４３５による増強された蛍光を示したため、同様のＣＴＲ１０７バリアントが、その蛍光増強を活性化する可能性もあるかどうかを評価した。バリアントＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗは、それぞれ、緑色チャネルおよび赤色チャネルの下で１３倍および２０倍の増強を示した（図７Ｄ）。他のＣＴＲ１０７バリアントは、チアゾールオレンジ蛍光への影響を示さなかった（図７Ｄ）。これらの結果は、非活性化ＧｙｒＩ様タンパク質から蛍光活性化アプタマーを作製するためのプロトコルを示す。したがって、本発明によれば、蛍光増強活性を有する、より明るいアプタマーバリアントを識別し、選択するための蛍光スクリーニングと組み合わせた、ＧｙｒＩ様タンパク質結合部位の変異分析を含む、より明るい蛍光活性化アプタマーまたは増強アプタマーを単離するための方法が本明細書に提供される。本発明の変異体ライブラリーの使用は、より明るい蛍光活性化アプタマーの単離を促進するであろう。
ＧｙｒＩ様タンパク質は、広範囲の条件下で強い安定性を示すため、このファミリーから設計された蛍光増強アプタマーは、広範囲の環境で機能することが本明細書において企図される。広いｐＨ環境で機能する蛍光スイッチの設計は、バイオテクノロジーの重要なツールであり得る。酸性条件（ｐＨ３）および塩基性条件（ｐＨ１１）における蛍光増強ＳＡＶ２４３５バリアントのｐＨ安定性を試験した（図７Ｅ）。ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗについて酸性条件下での蛍光の２倍の減少を観察した。塩基性条件下では、３つのアプタマーすべてが、酸性よりもわずかに安定であった（図７Ｅ）。典型的なタンパク質は、酸性および塩基性ｐＨ下で変性し、アンフォールディングすると考えられているが、本明細書で提供される本発明のチアゾールオレンジ増強アプタマーは、これらの極端な環境にさらされた後も、予期せず高い機能性を示した（図７Ｅ）。したがって、本発明によれば、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗなどを含む、ｐＨ安定性の蛍光活性化アプタマーモジュールが本明細書に提供される。
ＳＡＶ２４３５結合チアゾールオレンジ複合体の明るさは、紫外光（ＵＶ）照射下で観察することができる（図７Ｆ）。通常、増強アプタマー不在下で、チアゾールオレンジは、ＵＶ蛍光を示さない。ＳＡＶ２４３５ ＷＴタンパク質は、色素の不在下でＵＶ蛍光を示さない（図７Ｆ）。対照実験において、非増強ＣＴＲ１０７ ＷＴをチアゾールオレンジに添加した場合、蛍光は観察されない（図７Ｆ）。ＳＡＶ２４３５をチアゾールオレンジに添加すると、ＵＶ光で励起したときに、アプタマー色素複合体から強く明るい蛍光を観察する（図７Ｆ）。したがって、本発明に従って本明細書で提供されるのは、ＳＡＶ２４３５ ＷＴの操作された非天然バリアントを含むＵＶ蛍光増強アプタマーである。
さらに、ＵＶ蛍光を使用して、蛍光増強ＳＡＶ２４３５アプタマーバリアントの熱安定性を確認した。９５℃での加熱は、タンパク質を変性させ、リガンド結合複合体を破壊するのに十分である。すべてのＳＡＶ２４３５バリアントを加熱することにより、チアゾールオレンジ蛍光増強が喪失したことを観察した。５分間冷却すると、かなり驚くべきことに、蛍光増強は、本発明のＳＡＶ２４３５アプタマーバリアントとチアゾールオレンジとの間に再形成された複合体から急速に戻ることが観察される。熱安定性は、バイオテクノロジーで使用されるタンパク質の重要な特性である。本発明のＧｙｒＩ様の操作された非天然のバリアントアプタマータンパク質は、熱安定性であり、それらの機能は、様々な温度変化の下で可逆的である。したがって、本発明で提供されるのは、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗなどを含む、可逆的かつ熱安定的な蛍光増強タンパク質スイッチである。当業者は、さらなる変異分析および蛍光スクリーニングが、改善された蛍光増強アプタマーの開発につながることを容易に理解するであろう。
実施例６：ＧｙｒＩ様タンパク質アプタマーバリアントによるチオフラビンＴ蛍光の増強
チオフラビンＴは、多くの蛍光用途にも使用されているベンゾチアゾール色素である。チオフラビンＴは、低いバックグラウンド蛍光を示すが、アミロイド線維または凝集したタンパク質に結合した場合、蛍光の強力な増強を示す。最近では、チオフラビンＴがＲＮＡアプタマーに結合し、強い蛍光を示すことが示されている２０。トウモロコシアプタマーは、Ｇ－四重鎖によって形成されたホモ二量体界面で２つのチオフラビンＴ分子に結合することができる。ＧｙｒＩ様タンパク質がチオフラビンＴの蛍光増強アプタマーとして機能し得るかどうかを試験した。チオフラビンＴは、それぞれ、４５０ｎＭおよび５２７ｎＭの励起最大値および発光最大値を有する。チオフラビンＴに対するＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７およびＬＩＮ２１８９バリアントの蛍光増強特性を探索した（図８）。これらのＧｙｒＩ様バリアントのうち、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＷＴのみが有意な増強を示した。ＣＴＲ１０７ ＷＴの場合、緑色チャネルと赤色チャネルの両方の下で、増強は５０倍であった。ＬＩＮ２１８９野生型は、緑色チャネルの下で１３倍の増強を示し、赤色チャネルの下で５０倍の増強を示した。ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＷＴの増強の差は、チアゾールオレンジと各結合部位との間の可変結合相互作用に起因する可能性が高い。すべての他のバリアントは、チオフラビンＴ蛍光の小さい４～６倍の増加を示すか、または増加を示さないかのいずれかである。多重特異性増強の欠如は、増強の機構が、チオフラビンＴとの結合部位相互作用に特異的であることを示す。単一の変異が蛍光活性化を完全に破壊または増強することができるという本明細書で提供される結果から、変異誘発を使用して、本発明のアプタマーを所望のフルオロフォア増強および親和性に調節することができることを当業者が容易に理解するように導くであろう。したがって、本発明によれば、より明るいチオフラビンＴ増強バリアントアプタマーを識別し、選択するための蛍光スクリーニングと組み合わせた、チオフラビンＴ結合部位のコンビナトリアル変異分析を含む方法が本明細書に提供される。
実施例７：ＧｙｒＩ様タンパク質アプタマーバリアントによるアクリジン色素類似体の蛍光増強
さらに、アクリジン類似体の蛍光増強を評価することによって、ＧｙｒＩ様タンパク質による蛍光増強の広範な特異性を示す。アクリジンオレンジおよびＡｔｔｏ４９５は、様々な蛍光イメージング目的で使用される細胞透過性蛍光色素である。増強アプタマーがないと、蛍光顕微鏡下での可視化には、高濃度のアクリジンおよびＡｔｔｏ４９５が必要である。以前の研究では、アクリジンオレンジ、Ａｔｔｏ４９５、および他の同様の類似体といった色素を増強することができる広範なＲＮＡアプタマーが報告されている。これらのＲＮＡアプタマーは、インビボで顕著に明るい蛍光増強を生じさせ、可視化のためにはるかに低い濃度の色素を必要とする。本発明のＧｙｒＩ様アプタマータンパク質が、ＲＮＡアプタマーと同じ機構を使用してアクリジンオレンジおよびＡｔｔｏ４９５を増強することができるかどうかを評価した。
ほとんどの場合、ＧｙｒＩ様バリアントは、５００ｎＭのＡｔｔｏ４９５に添加したときに、非常に小さい増強を生じる（図９Ａ）。バリアントＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑのみが、蛍光増強のほぼ４倍の増加を示した（図９Ａ）。この値は、ＳＲＢ－２ ＲＮＡアプタマーによるＡｔｔｏ４９５増強について観察された値と同様である。Ａｔｔｏ４９５の化学構造は、ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７中の保存されたグルタメートの変異が、Ａｔｔｏ４９５による蛍光の増加をもたらした理由を説明する（図４）。Ａｔｔｏ４９５のカルボキシ尾部は、各ポケットに埋め込まれた保存されたグルタメートの側鎖と好ましくない相互作用を形成すると推定される。グルタミンへの変異は、反発性の相互作用を除去し、より好ましい結合を促進する。アプタマーＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体による蛍光消光を観察した（図９Ａ）。すべての場合において、各バリアントをＡｔｔｏ４９５に添加すると、蛍光の４倍の減少が観察される。
これらの結果は、ＧｙｒＩ様タンパク質によって媒介される第１の（本発明）二重蛍光オン／オフバイオスイッチシステム（例えば、蛍光のオンおよび蛍光のオフ）を示す。例えば、以下の組み合わせは、Ａｔｔｏ４９５色素の固有の蛍光をオンおよびオフにする（例えば、活性化および消光する）ために一緒に機能し得る。ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ならびにＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体など。
アクリジンオレンジは、カルボキシ尾部を含まないＡｔｔｏ４９５と全体的な構造が類似している、正に帯電した色素である。アクリジンオレンジ蛍光に対するＧｙｒＩ様タンパク質の効果を評価した（図９Ｂ）。ＧｙｒＩ様バリアントは、アクリジンオレンジ蛍光の２倍の増加または減少のいずれかを示したか、またはまったく効果を示さなかった。バリアントＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、およびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑはすべて、５００ｎＭのアクリジンオレンジの蛍光強度を２倍にした。バリアントＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗはすべて、アクリジンオレンジ蛍光に対する２～３倍の消光効果を示した。本発明において、それぞれのＧｙｒＩ様の操作された非天然のバリアントアプタマータンパク質によって見られる二重の増強－消光効果は、蛍光モジュールの様々なタイプを作製することができることを示す。
例えば、以下の組み合わせは、一緒に機能し、アクリジンオレンジ色素の固有の蛍光をオンおよびオフにする（例えば、活性化および消光する）ことができる。以下ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑからなる群から選択される蛍光増強アプタマーのうちのいずれか１つを、以下ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される蛍光消光アプタマーのうちのいずれか１つと組み合わせる。したがって、アクリジンオレンジ色素の固有の蛍光を調節するための本発明の例示的な特定の蛍光のオン／オフの組み合わせとしては、例えば、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「固有の蛍光を調節する」という語句は、それぞれの色素による蛍光の活性化（増加）また消光（本明細書ではシャットオフ、低下または蛍光の減少とも称される）のいずれかを指す。
適度な増強を生じさせる能力は、ＧｙｒＩ様タンパク質のさらなる変異分析および選択がＡｔｔｏ４９５およびアクリジンオレンジのより明るい蛍光増強アプタマーを生成することを当業者が容易に理解するように導くであろう。Ａｔｔｏ４９５に対するＧｙｒＩ様タンパク質による増強効果は、類似のアクリジン類似体を、アプタマー設計のための蛍光基質として使用することができることを示す。この蛍光消光の機構は、アクリジン類似体の蛍光イメージングおよびアプタマー設計のための強力なツールとしても使用することができる。オン／オフ二重蛍光（例えば、オン／増強およびオフ／消光）を使用して、幅広い用途のための重要な分子スイッチを作成することができる。
実施例８：ＧｙｒＩ様タンパク質アプタマーによって活性化された蛍光スイッチの設計
本発明によれば、ＧｙｒＩ様タンパク質が蛍光色素に結合することができるという判定により、低バックグラウンド蛍光を有する分子蛍光活性化スイッチの作成が可能となる。当業者は、これらの本発明の二重オン／オフスイッチツールが、高感度細胞イメージングまたは診断技術を作成するために拡張され得ることを認識するであろう。例えば、各末端にフルオロフォアおよび消光剤で標識された短い一本鎖核酸を使用すると、蛍光スイッチとして機能することがわかっている。接地状態において、接触消光機構に起因して、標識されたオリゴヌクレオチドは蛍光オフ状態のままである（図１０Ａ）。相補的核酸鎖を添加すると、消光が妨害され、明るい蛍光が観察される。これらのフルオロフォア／消光剤標識されたオリゴヌクレオチドは、ｑＰＣＲにおいてプローブとして、または様々なアッセイにおいて応答スイッチとして使用されている。
本発明によれば、ＧｙｒＩ様タンパク質が複数の芳香族基質に結合し得ることが判明したため、本願発明者らは、Ｇｙｒｌ様バリアントアプタマータンパク質を構築し、それらがフルオロフォアまたは消光剤のいずれかに競合的に結合することによって分子スイッチとして使用し、それによって蛍光活性化および不活性化（すなわち、消光）を可逆的に制御することができるかどうかを評価した（図１０Ｂ）。本願発明者らは、５’末端にシアニン５（ＣＹ５）で、かつ３’末端にブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）分子で標識された短いオリゴヌクレオチド（ＣＹ５－オリゴ－ＢＨＱ１）プローブを設計し、購入し、ＧｙｒＩ様バリアントアプタマーがスイッチ状の様式で蛍光を活性化することができるかどうかを評価した。蛍光活性化アッセイにおいて、飽和濃度のＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５を１００ｎＭのＣＹ５－オリゴ－ＢＨＱ１に添加したときに、低い蛍光活性化のみが観察された（図１０Ｃ）。変異体ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＮおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗもまた、蛍光スイッチ活性化に対する小さい２～５倍の効果を示した（図１０Ｃ）。
しかしながら、ＬＩＮ２１８９ ＷＴ、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａおよび／またはＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌのいずれかを、二重標識されたＣＹ５－オリゴ－ＢＨＱ１（フルオロフォア／消光剤）に添加した場合、それらはそれぞれ劇的な蛍光スイッチ活性化を示し、１５～１７倍のＣＹ５蛍光増加をもたらした。蛍光増強は、ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーとＣＹ５またはＢＨＱ１との相互作用に起因する可能性が高く、この対によって接地状態で形成された接触消光複合体を破壊する（図１０Ｂ）。
したがって、本発明は、ＧｙｒＩ様バリアントタンパク質による可逆的かつ制御可能な蛍光スイッチ活性化のさらなる新規の機構を示す。したがって、本明細書には、オリゴヌクレオチドプローブの場合、相補的な核酸を必要とすることなく、二重標識されたプローブ（例えば、核酸、リンカーなど）の蛍光スイッチ活性化の本発明の方法が提供される。本発明の方法は、二重標識された蛍光スイッチ活性化モジュール（別名二重標識されたプローブ）を提供することであって、消光部分は、フルオロフォアが消光されるように、フルオロフォアと作動可能に近接している、提供することと、蛍光スイッチ活性化モジュールをＧｙｒｌ様タンパク質と接触させることと、を含む。
当業者は、この特定の実施形態において、さらなるＣＹ５蛍光増強を、本発明のＬＩＮ２１８９ ＷＴ変異誘発ライブラリーからのさらなるＬＩＮ２１８９非天然バリアントアプタマーについてスクリーニングすることによって得ることができ、本明細書に記載の本発明の方法を使用して、多数の他のフルオロフォア－消光剤対について、さらなるＧｙｒＩ様スイッチ活性化モジュールが本明細書で産生され得ることを認識するであろう。これらのスイッチは、幅広いバイオテクノロジー用途において有用である。
実施例９：バイオテクノロジー用途を有するＧｙｒＩ様ファミリーからの蛍光色素結合アプタマーの設計
ＧｙｒＩ様タンパク質の蛍光増強または消光特性は、標的有機化合物のアプタマーを識別するためのツールとして使用することができる。実施例１～８に基づき、蛍光色素５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）に結合するアプタマーを識別するためのプロトコルを設計した（図４）。両方の色素は、それぞれ、緑色領域および赤色領域において、構造および蛍光が類似している。ＧｙｒＩ様バリアントアプタマーによるＦＡＭおよびＴＡＭＲＡの結合は、蛍光の増強または消光を引き起こすであろう。本発明の方法は、３つの選択された野生型ＧｙｒＩ様タンパク質をスクリーニングして、どれが溶液中のＦＡＭの蛍光を変化させることができるかを決定することから始まる（図１１Ａ）。蛍光アッセイにおいて、ＣＴＲ１０７ ＷＴ（６倍）およびＬＩＮ２１８９ ＷＴ（２倍）のみが、飽和濃度で１μＭのＦＡＭ蛍光の減少を引き起こしたが、一方、ＳＡＶ２４３５ ＷＴは効果を示さなかった。このステップは、ＣＴＲ１０７およびＬＩＮ２１８９が、蛍光法によって分析することができるＦＡＭ結合アプタマーを設計するのに良好なテンプレートであることを示す。
次に、改善されたＦＡＭ結合アプタマーをさらに単離するために、ＣＴＲ１０７およびＬＩＮ２１８９のＧｙｒＩ様非天然バリアントアプタマーによって引き起こされる蛍光減少を分析した。ローダミン６Ｇに結合したＣＴＲ１０７ ＷＴの結晶構造に基づいて、ＦＡＭ結合を補完すると考えられる合理的な変異体を設計した。置換Ｅ３６Ｒ、Ｙ１０６Ｗ、およびＥ１３３ＱがＣＴＲ１０７ポケット内のＦＡＭの結合を増強するかどうかを評価した。また、Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、およびＹ１０６Ｗ変異の３つすべてを有する三重変異体が、ＦＡＭ結合を相乗的に改善することができるかどうかを評価した。蛍光アッセイにおいて、試験したすべてのＣＴＲ１０７バリアントアプタマーは、消光特性の損失を引き起こす（図１１Ｂ）。このことは、これらのバリアントによるＦＡＭ結合の喪失、または蛍光消光機構の破壊を伴う結合の保存の結果であり得る。ＬＩＮ２１８９については、その基質であるヤテカマイシン（Ｙａｔｅｋａｍｙｃｉｎ）に結合した結晶構造とその触媒機構に基づいて、変異体を設計した。変異Ｅ１５７ＡおよびＥ１８５Ｌは、リガンド結合を損なうことなく、触媒作用をノックアウトするのに十分である。両方のアミノ酸位置（ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ）における単一の変異または二重の変異が、非触媒的かつ緊密な結合アプタマーを作製するかどうかを評価した。
単一のバリアントＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７ＡおよびＥ１８５Ｌが、ＬＩＮ２１８９ ＷＴと比較して、蛍光消光に変化を引き起こさないことを観察した（図１１Ｂ）。しかしながら、二重変異体であるＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、ＦＡＭの全体的な蛍光のほぼ４０倍の減少を予期せず誘導した（図１１Ｂ）。この強い減少は、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによる強い結合を示す。本発明によれば、ＣＴＲ１０７およびＬＩＮ２１８９を出発テンプレートとして使用して、ＦＡＭ結合バリアントアプタマーを識別した。本発明のバリアントアプタマーへの結合時のＦＡＭの蛍光の急激な減少を使用して、分子スイッチ、バイオセンサー、または分子診断技術を作製することができる。当業者であれば、さらなる高親和性アプタマーも、本発明の変異体ライブラリー作製、続いて結合のスクリーニングを使用することによって単離することができることを認識するであろう。これらの発明のアプタマーは、細胞イメージングから分子診断までの幅広い革新的技術に使用することができる。
ＦＡＭおよび他の同様の化合物は、核酸の標識としてしばしば使用される。ラテラルフローデバイスおよび定量的ＰＣＲなどの多くのバイオテクノロジー用途は、高感度シグナル検出のためにこの種の標識されたオリゴヌクレオチドを使用する。本願発明者らの最も強力な消光ＧｙｒＩ様アプタマーバリアントが、ＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ－ＰＮＡ）に結合する能力を試験した（図１１Ｃ）。蛍光アッセイにおいて、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの両方が、ＦＡＭ－ＰＮＡを効率的にクエンチすることができたことを観察する。ＣＴＲ１０７ ＷＴの場合、消光は、１７．３倍の減少であり、これはＦＡＭのみによる消光よりも劇的に強力である（図１１Ｃ）。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、ＦＡＭ－ＰＮＡにおける蛍光を３１倍減少させ、ＤＮＡ標識されていないＦＡＭで見られる４０倍の低下に匹敵する。したがって、本明細書には、フルオロフォア標識された核酸からの蛍光減少を誘導する方法が提供される。本明細書ではまた、タンパク質を核酸の５’末端または３’末端に結合し、局在化する本発明の方法も提供する。内部標識された核酸は、ＧｙｒＩ様タンパク質を特定の塩基位置に局在化するために使用することもできる。本発明の方法はまた、バイオセンサー、バイオスイッチ、および分子診断に適用することができる、フルオロフォア標識された核酸を使用する強力なツールを提供する。
ＧｙｒＩ様バリアントの他の色素への結合を探索することによって、ＧｙｒＩ様バリアントの汎用性をさらに試験した。これらの実験において、１μＭのＴＡＭＲＡ標識されたＤＮＡ（ＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ）に結合し、その蛍光を消光させるＧｙｒＩ様バリアントを探索した。ＴＡＭＲＡは、それぞれ、５４６ｎｍおよび５７９ｎｍである励起最大値および発光最大値を有する（図１１Ｄ）。この分析において、赤色チャネルの下で蛍光をモニタリングする。ＦＡＭ結合試験と同様に、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢからの強力な消光のみを観察した。ＣＴＲ１０７ ＷＴは、ＴＡＭ－ＤＮＡに対する９倍の消光効果を示したが、一方、ＬＩＮ２１８９は、蛍光の２２倍の低下を有する（図１１Ｄ）。これらの結果は、ＧｙｒＩ様アプタマーによる色素結合の汎用性を示す。
ＦＡＭ色素およびＴＡＭＲＡ色素は両方とも、ＵＶ光を照射すると、それぞれ、明るい緑色とオレンジの蛍光を示す。強力な消光剤ＬＩＮ２１８９ ＷＴが、溶液中のＦＡＭ－ＰＮＡおよびＴＡＭＲＡ－ＤＮＡのＵＶ蛍光をシャットオフ（消光）することができるかどうかを試験した。１μＭで、ＬＩＮ２１８９ ＷＴは、タンパク質の不在下で観察されたＦＡＭからの緑色蛍光とＴＡＭＲＡからの赤色蛍光の両方を完全にシャットオフすることができた（図１１Ｅ）。本発明によれば、ＬＩＮ２１８９ ＷＴは、多くの用途で利用することができる強力なＵＶ蛍光消光スイッチであることがわかっている。ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡをタグ選択的ＤＮＡ結合剤として使用することにより、本発明のバリアントアプタマーを、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーから作製することができる。当業者は、このプロトコルを使用して、いくつかの他の色素－アプタマー対を作製することができることを認識するであろう。これらのツールは、バイオセンサー、バイオスイッチ、および分子診断デバイスなどの技術で実装することができる。
実施例１０：タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリー由来の高感度蛍光消光酵素（ＧＹＲＹＺＹＭＥ）の設計
本発明のＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、実施例９からわかるように、色素蛍光の強力な消光剤である。ＬＩＮ２１８９ ＷＴは、シクロプロパノイド加水分解に関与する酵素であるため、蛍光消光が、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢがフルオロフォアに結合して蛍光を破壊するか、蛍光の機構を破壊するフルオロフォアの触媒修飾を介する結果であり得るかどうかを評価した。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ蛍光消光の機構および感度を決定するために、様々なタンパク質濃度および異なる時点でＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ蛍光を変化させるその能力を分析した（図１２Ａ）。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、５ｎＭ～１μＭの濃度範囲内で、インキュベーション時間１分間で、１００ｎＭのＴＡＭＲＡ蛍光を完全にシャットオフすることができる。１ｎＭおよび５００ｐＭでは、蛍光消光活性が低下し、最大５分間のインキュベーション時間で、蛍光の２倍の低下のみが観察される。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによる非化学量論的消光は、触媒作用が蛍光減少の機構であることを強く示す。
ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ蛍光消光の酵素特性をさらに確認するために、非化学量論的濃度の他のＬＩＮ２１８９バリアントを、１００ｎＭのＴＡＭＲＡ－ＤＮＡと比較した。実施例１０において、すべてのバリアントは、過剰濃度でＦＡＭまたはＴＡＭＲＡ蛍光の減少を引き起こし、このことは、これらのタンパク質による色素結合に起因して説明され得る。５ｎＭの一定濃度で、ＬＩＮ２１８９ ＷＴ、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ、およびＬＩＮ２１８９ Ｌ１８５Ｅは、いずれもＴＡＭＲＡ蛍光への影響を示さなかった（図１２Ａ）。この濃度では、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、ＴＡＭＲＡ蛍光を効率的にシャットオフ（すなわち、消光）することができる。ＬＩＮ２１８９バリアント活性の差は、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢが複数の基質色素に作用することができる酵素であるという強力な証拠を提供する。
ＵＶ蛍光を使用して、ＴＡＭＲＡ蛍光消光におけるＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの酵素機能をさらに探索した。１００ｎＭのＴＡＭＲＡは、ＵＶ照射下で強い蛍光を示す。１～１００ｎＭのＬＩＮ２１８９ ＷＴの添加は、ＴＡＭＲＡのＵＶ蛍光に影響を及ぼさなかった。ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌは、１００ｎＭでＴＡＭＲＡ蛍光をシャットオフ／消光することができたが、１ｎＭおよび１０ｎＭでは効果がなかった。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの場合、蛍光を１００ｎＭおよび１０ｎＭで効率的に消光し、１ｎＭで約７０％を消光した。さらに、試料を９０℃で５分間加熱し、ＵＶ光下で直ちにイメージングし、蛍光消光が可逆的であるかどうかを決定した。加熱した試料は、１００ｎＭおよび１０ｎＭで蛍光の回復を示さず、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢについては、１ｎＭで部分的にのみ回復した。これらの結果をまとめると、蛍光消光が不可逆的であり、色素の酵素修飾が蛍光損失の機構であることを強く示唆している。
本発明によれば、蛍光色素の迅速かつ効率的な消光が可能な汎用性のある酵素を作製した。本発明のＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、スイッチオフのような様式で複数の色素の蛍光を不可逆的にシャットオフ（消光）することが可能である。さらに、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの広範な触媒特性は、本発明によれば、本発明の酵素ＧｙｒＩ様アプタマー（本明細書においてＧＹＲＹＺＹＭＥと称される）が変異誘発によって産生され得ることを実験的に証明する。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの特殊な特性を、幅広いバイオテクノロジー用途に組み込むことができることが本明細書において企図される。当業者は、変異誘発および選択のこのプロトコルを使用して、様々な用途のための追加の合成酵素を作製することができることを認識するであろう。
実施例１１：アクリジン類似体の高感度蛍光消光
実施例８において、アクリジン色素類似体を有するＧｙｒＩ様タンパク質アプタマーによる蛍光のオフ（すなわち、消光）の証明を提供した（図４、図９）。蛍光の減少は、バイオセンサーまたはバイオスイッチの開発に十分な強度または感度ではない、わずか４倍の低下であった。ＧｙｒＩ様タンパク質ファミリーからより高感度で強力な消光モジュールを単離するために、他のアクリジン様色素類似体をさらに探索した。オキサジン１７０は、それぞれ、６１５ｎＭおよび６４２ｎＭでの励起最大値および発光最大値を有する遠赤外線蛍光色素である。本願発明者らの蛍光アッセイを使用して、赤色チャネルの下で、飽和濃度の野生型ＧｙｒＩ様タンパク質を用いて、５００ｎＭのオキサジン１７０の蛍光の変化をモニタリングした（図１３Ａ）。ＳＡＶ２４２５ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ ＷＴのみが強力な消光効果を示した。ＣＴＲ１０７ ＷＴは、オキサジン１７０の蛍光の６倍の低下を示し、一方、ＳＡＶ２５３４ ＷＴは、顕著な３０３倍の減少を示した（図１３Ａ）。ＳＡＶ２４３５ ＷＴによって引き起こされる３０３倍の減少は、オキサジン１７０による蛍光のほぼ１００％のシャットオフに相当する（図１３Ａ）。ＳＡＶ２４３５ ＷＴによる強力な減少は、これまでにＧｙｒＩ様タンパク質から発見された最も強力な消光アプタマーである。
ＳＡＶ２４３５ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ ＷＴのさらなるバリアントを探索し、より強力な消光効果を有するアプタマーを識別した。蛍光アッセイにおいて、すべてのＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、わずかな減少しか示さなかったＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗを除き、強力な消光効果を示した。蛍光増強剤ＳＡＶ２３４５ Ｖ１０５Ｗ（－６５倍の減少）およびＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（－３７倍の減少）は、ＳＡＶ２４３５ ＷＴよりも約１０～２０倍弱かった（図１３Ｂ）。非増強変異体ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７ＷおよびＳＡＶ２３４５ Ｅ１３５Ｑは、それぞれ、蛍光の５２９倍および３０３倍の低下を示し、これは、ＳＡＶ２４３５野生型よりも１．５～２倍強力である（図１３Ｂ）。これらのアプタマーはまた、オキサジン１７０の蛍光のほぼ１００％のシャットオフを誘導した。ＣＴＲ１０７バリアントの場合、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗのみがオキサジン１７０に対して強力な消光効果を誘導した。このバリアントは、ＣＴＲ１０７ ＷＴよりも５倍強力であり、蛍光の全体的な４７倍の減少を引き起こした。これらの結果は、本発明によれば、ＣＴＲ１０７およびＳＡＶ２４３５結合ポケットの変異誘発が、色素蛍光のより強力な消光剤を産生することができることを示す。
オキサジンの吸光スペクトルに対するＳＡＶ２３４５ ＷＴの効果も分析した。タンパク質が存在しない場合、オキサジンは、６１５～６２５ｎｍで広い励起ピークを示す。ＳＡＶ２４３５が存在するとき、励起ピークは２倍になり、６４０～６４５ｎｍのより鮮明なピークにシフトした赤色である。オキサジン１７０に結合したときにＳＡＶ２４３５によって誘導される励起特性のこれらの変化は、観察される消光機構に寄与する。さらに、消光に対するＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーの濃度依存性を比較した。この実験において、ＳＡＶ２４３５ ＷＴを、弱い消光剤であるＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗと比較して、１００ｎＭのオキサジン１７０の蛍光消光の感度を分析した（図１３Ｃ）。３つすべてのＳＡＶ２４３５バリアントについて、５０％の消光は、１０～５０ｎＭで達成される。しかしながら、１００ｎＭで、ＳＡＶ２４３５ ＷＴは、ほぼ１００％の蛍光シャットオフを誘導することができ、一方で、両方の変異体は、この濃度で６０％の低下を誘導しただけである。飽和状態であっても、変異体は、蛍光をシャットオフする際に、ＳＡＶ２４３５ ＷＴよりも効果が低かった。
オキサジン１７０（目測で青色の色素）は、ＵＶ光を照射すると、明るい赤色の蛍光を示す。結合していない色素のＵＶ蛍光を、ＳＡＶ２４３５バリアントによって結合された色素と比較した。ＵＶ光下では、すべてのＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーは、非消光剤ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗを除いて、結合していない色素で見られる赤色蛍光を完全にシャットオフした（図１３Ｄ）。試料を９５℃まで加熱し、続いてＵＶ光下でイメージングすると、すべてのＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーによって蛍光の完全な回復が観察され、このことは、蛍光消光機構が可逆的であり、ＧＹＲＹＺＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢを用いる実施例１０で観察された不可逆的な消光とは異なっていることを意味する。これらの可逆的特性は、ＳＡＶ２４３５およびそのバリアントアプタマーが、リガンド結合機構を介して蛍光減少を引き起こし、触媒作用を引き起こさないことを証明する。
本発明によれば、本願発明者らは、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーからの一連の強力な蛍光消光アプタマーを開発した。これらのアプタマーは、オキサジン１７０の遠赤外線蛍光を完全にシャットオフすることができる。特定の実施形態において、本発明のアプタマーのスイッチおよびセンサー特性は、広範囲のバイオテクノロジーツールにおいて利用することができる。本発明の方法は、ＧｙｒＩ様ファミリーから強力な蛍光消光剤を識別するためのプロトコルを提供する。当業者は、本発明の方法をＧｙｒＩ様タンパク質の変異体ライブラリーとともに使用することにより、強力な蛍光消光剤として機能する多数の結合アプタマーを識別することができることを認識するであろう。
実施例１２：蛍光の変化を誘導しないＧｙｒＩ様色素結合アプタマーを識別するためのプロトコルの開発
実施例９において、ＦＡＭ色素結合を改善したが、飽和状態での蛍光の有意な減少を引き起こさなかったＣＴＲ１０７ ＷＴの合理的な変異体を設計した（図１１Ｂ）。これらのアプタマーは、依然として高い親和性で結合し得るが、蛍光によってモニタリングすることはできない。これらのアプタマーは、その非消光能力のため、特定のバイオスイッチ用途に好適である。
非消光アプタマーまたは非増強アプタマーの結合を試験するために、実施例８と同様の蛍光スイッチアッセイを開発した（図１０Ａ）。このアッセイにおいて、５’末端でフルオロフォアで、かつ３’末端でＢＨＱ１消光剤で標識されたＤＮＡは、接地状態接触消光に起因して、オフ状態である。相補的核酸または競合結合剤が、標識されたＤＮＡに結合する場合（実施例９を参照）、接触消光の破壊に起因して、蛍光が活性化される。ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ三重変異体（ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ）が、３つのバイオスイッチＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、ＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、ＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１を活性化し得るかどうかを試験した（図１４Ａ）。この実験において、ＣＴＲ１０７が、ＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、ＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、ＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１をそれぞれ、５６倍、２５倍および１０倍活性化することができることが観察された。このプロトコルは、蛍光に影響を与えないアプタマーの結合を、この手法によって研究することができることを示す。ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰの効力を比較するために、相補的ＲＮＡによるバイオスイッチの活性化を含めた。ＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１およびＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１バイオスイッチ活性化の場合は同等であったが、ＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１ ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰは、相補的ＲＮＡよりも５０％弱かった。この結果は、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが、ＣＹ５と比較して、構造および電荷が類似しているため、予想される（図４）。この結果は、合理的に設計されたＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰアプタマーが、他の無関係な化合物と比較して、ＦＡＭおよびその類似体に対してより選択的であることを強調する。本発明によれば、ＤＮＡベースの蛍光バイオスイッチを使用して、ＧｙｒＩ様バリアントアプタマーの結合を分析するための迅速かつ正確な方法が提供される。この種のＤＮＡバイオスイッチは、バイオセンサー、バイオスイッチとして、または分子診断技術で使用することができる。
実施例１３：ＧｙｒＩ様タンパク質を使用する二重蛍光オン／蛍光オフ（すなわち、オン／オフ）バイオスイッチの設計
実施例９において、ＦＡＭ色素およびＴＡＭＲＡ色素の蛍光を効率的にシャットオフするＧＹＲＹＺＹＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢを単離した。次に、実施例１２の蛍光をオンにすることができるアプタマーと、実施例９からの蛍光消光アプタマーとをカップリングさせることで、双方向の蛍光オン／オフバイオスイッチを作製することができるかどうかを評価した。この特定の実施形態において、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰまたは相補的ＲＮＡによってオンにし、その後ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの添加によってシャットオフ（例えば、消光）することができる二重蛍光バイオスイッチングモジュールを設計した（図１０Ａ）。
この実施形態において、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰまたは相補的ＲＮＡで予め活性化されたＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、ＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１、およびＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１からの蛍光をシャットオフするＬＩＮ２１８９ ＧＹＲＹＺＹＭＥの能力を比較した（図１４Ｂ）。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、ＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１－ＲＮＡ活性化複合体で４７倍の低下を引き起こすことができたが、ＦＡＭ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１が活性化したＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰには影響を及ぼさなかった。同様の結果は、ＴＡＭＲＡ－ＤＮＡ－ＢＨＱ１でも得られ、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、スイッチがＲＮＡによって活性化されたときに蛍光の１３倍の減少を引き起こすことができたが、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰによって活性化されたときには影響を及ぼさなかった（図１４Ｂ）。ＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１では、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、および相補的ＲＮＡによって活性化されると蛍光が３９倍低下するが、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰによって活性化されるとわずか２倍減少する。
これらの結果は、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰが、ＬＩＮ２１８９による酵素修飾からフルオロフォアを競合的に保護することができることを示している。さらに、これらの結果は、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰによる類似の化合物ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡの結合が、ＧＹＲＹＺＹＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢとの結合よりも緊密であることを強く示す。ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰによって活性化されたＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１の－２倍の低下は、ＣＹ５が緊密に結合しないことを示唆する。ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰによるＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１の活性化が、相補的ＲＮＡによる活性化と比較して弱いこともまた、ＣＹ５がＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰに対するより弱いリガンドであることを示唆する。ＣＹ５－ＤＮＡ－ＢＨＱ１テンプレートと混合した場合にＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによって引き起こされる急激な蛍光減少は、ＣＹ５がＧＹＲＹＺＭＥＳのための基質であることを示す証拠を提供する。
したがって、本明細書には、一方の末端でフルオロフォアで、他方の末端で消光剤で標識される分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、リンカーなど）を使用して、本発明の二重蛍光オン／オフバイオスイッチシステムが提供され、フルオロフォアまたは消光剤は、本発明のバリアントアプタマーによって調節され得る。一実施形態において、本発明のバイオスイッチシステムは、ＧＹＲＹＺＹＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによって後にシャットオフされ得る相補的ＲＮＡを使用して蛍光活性化を達成する。フルオロフォアおよび消光剤の両方が、特定の分子（例えば、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子など）のそれぞれの末端上で組み合わされるとき、本発明の二重オン／オフバイオスイッチシステムは、本発明のバリアントアプタマーのうちの少なくとも１つを組み込む多数の本発明の二重蛍光バイオスイッチを設計するための一般的なプロトタイプを表す。本明細書で提供される本発明の方法を使用して、多数の他の蛍光オン／オフ二重バイオスイッチシステムを、ＧｙｒＩ様タンパク質の変異誘発およびスクリーニングによって設計することができる。これらの本発明のバイオスイッチシステムは、核酸およびタンパク質を同時に検出するために多重化された用途で使用することができる。これらのツールは、バイオセンサー、バイオスイッチ、および分子診断技術などの幅広いバイオテクノロジー用途で使用することができる。
実施例１４：タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーからの追加の汎用性があるＧＹＲＹＺＹＭＥＳの設計
実施例９において、無関係の蛍光色素を修飾することによってそれらの蛍光を消光することができる新規の酵素ＧｙｒＩ様アプタマーＬＩＮ２１８９ ＤＵＢを操作した。本明細書に提供される本発明の方法を使用して、当業者は、いくつかの他の酵素ＧｙｒＩ様タンパク質が多数の化学基質に対して選択され得ることを認識する。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢおよび他のＧｙｒＩ様バリアントアプタマーが、バイオテクノロジーで使用される他の重要な化学反応を触媒するように機能するかどうかを調べた。アルカリホスファターゼは、バイオテクノロジーで化学的基質および生物学的基質の脱リン酸化に使用される重要な酵素である。単純な比色反応において、アルカリホスファターゼは、その無色の基質であるｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を脱リン酸化することができ、黄色の生成物であるｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）を生成する（図１５Ａ）。ＬＩＮ２１８９ ＷＴは、アルカリホスファターゼのようなヒドロラーゼとして分類されるため、無差別なＧＹＲＹＺＹＭＥ ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢがｐＮＰＰを加水分解してｐＮＰを生成することができるかどうかを評価した。試料中、１００μｌのｐＮＰＰ基質を、タンパク質と混合しないか、または１０μｇ／ｍｌもしくは１００μｇ／ｍｌのＬＩＮ２１８９ ＤＵＢと混合した。３時間のインキュベーション時間で、ｐＮＰＰからｐＮＰへの変換を示す、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢを含有する試料中の強い比色変化を検出することができた（図１５Ｂ）。これらの結果は、本発明のＬＩＮ２１８９ ＤＵＢバリアントアプタマーが部分的なホスファターゼ活性を示すことを確立する。
テトラゾリウム基質に作用するそれらの能力を評価することによって、より複雑な電子移動反応における他の本発明のＧｙｒＩ様バリアントアプタマーの酵素機能をさらに探索した。テトラゾリウム色素は、多くのバイオテクノロジー用途において比色指示薬として一般的に使用されている。複数ステップの反応における最終的な電子受容体またはプロトン受容体として作用するそれらの能力は、様々な酵素活性の検出を可能にする（図１５Ｃ）。通常は無色のテトラゾリウム色素のプロトン化後に、比色シグナルが観察され、無色のテトラゾリウム色素は、着色した不溶性ホルマザン生成物に変換される。本発明のＣＴＲ１０７バリアントアプタマーが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（ＮＡＤＨ）の存在下で無色のヨードニトロテトラゾリウムをその赤色のホルマザン生成物に酵素的に変換することができるかどうかを評価した（図１５Ｃ）。ＮＡＤＨを含まない実験において、５００μＭのヨードニトロテトラゾリウムと３７℃で５分間混合したＣＴＲ１０７のすべてのバリアントでは、色の変化は観察されない（図１５Ｄ）。ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ、Ｅ１３３Ｑ四重変異体）の存在下で１００μＭのＮＡＤＨ補因子を５００μＭのヨードニトロテトラゾリウムに添加すると、かすかな赤色シグナルが観察される。ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰは、５分ですべてのバリアントと比較して、はるかに強い赤色比色変化を示した（図１５Ｄ）。反応を２時間進行させると、基質とともにＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰおよびＮＡＰＨ補因子が存在する試料において、暗いバーガンディー色変化が観察される（図１５Ｅ）。これらの結果は、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰが、ヨードニトロテトラゾリウムをそのホルマザン生成物に酵素的に変換することができるという証拠を提供する。
本発明の方法によれば、バイオテクノロジー的に重要な試薬の加水分解を触媒することができる、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢおよびＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰといった２つの無関係のＧＹＲＹＺＹＭＥが識別されている。当業者は、本発明の方法を使用して、広範囲の生化学反応において触媒として機能することができる他の本発明の酵素ＧｙｒＩ様バリアントアプタマーを識別することができることを認識するであろう。ＧｙｒＩ様タンパク質の本発明の変異誘発ライブラリーは、様々なバイオテクノロジー的に重要な新規のＧＹＲＹＺＹＭＥを提供している。
実施例１５：ＧｙｒＩ様タンパク質からの新規のアンピシリンアプタマーの設計
いくつかのＧｙｒＩ様タンパク質は、触媒作用によって薬物に結合するか、またはその構造を修飾する天然の能力を有する。本発明の方法を使用して、高親和性薬物結合バリアントアプタマーを識別することができるかどうかを評価した。第１のステップは、選択された３つのＧｙｒＩ様タンパク質ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７およびＬＩＮ２１８９をスクリーニングし、薬物の毒性をアプタマー結合の間接的読み出しとして使用した。次に、選択されたＧｙｒＩ様タンパク質のインビボでの発現が、薬物の結合および隔離を通じて、または酵素修飾によって、Ｅ．Ｃｏｌｉの薬物耐性を誘導し、それによって、それらの標的に到達することを防止し、細胞毒性を低減するかどうかを決定した（図１６Ａ、Ｂ）。
本願発明者らは、抗生物質アンピシリンに結合することができる、または酵素修飾を通じてアンピシリンを不活性化することができるアプタマーを、本願発明者らの仮説の原理の証明として識別するためのインビボプロトコルおよびエクスビボプロトコルの両方を開発した。ＧｙｒＩ様タンパク質のインビボでの発現は、混合した結果を示した。ＳＡＶ２４３５ＷＴは、アンピシリンと同程度に感受性であり、プラスミドが存在しない状態で、タンパク質発現または細菌成長を制御した。ＧｙｒＩ様耐性タンパク質ＣＴＲ１０７ ＷＴは、最大１００μｇ／ｍｌまで部分的な耐性を示し、一方、酵素ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン濃度で最も高い耐性を示した。薬剤耐性を介したアプタマー結合のさらなるアッセイのために、タンパク質発現を誘導するために、アンピシリンおよびＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天プレート上でＧｙｒＩ様タンパク質または対照タンパク質を発現するプラスミドを保有するＥ．Ｃｏｌｉ細胞を蒔いた（図１６Ｄ）。これらのプレートを一晩成長させて、ＧｙｒＩ様タンパク質がアンピシリン耐性を誘導することができるかどうかを決定した。対照実験において、３７℃で２４時間インキュベーションした後、細菌コロニーは観察されない。同様に、ＣＴＲ１０７ ＷＴまたはＳＡＶ２４３５ ＷＴが細菌内で発現した実験は、プレート上に細菌コロニーを生成しなかった。ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢの発現のみが、２４時間後に細菌成長を示した（図１６Ｂ）。この実施例は、ＧｙｒＩ様タンパク質から薬物修飾アプタマーを識別するための本発明の方法を提供する。さらに、この実施例は、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢが、細菌内で発現したときに耐性を誘導することができるアンピシリンアプタマーであることを示す。
ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢは、幅広い基質に作用することができる本発明のＧＹＲＹＺＹＭＥである。アンピシリン耐性の機構は、結合および隔離を介して、または非毒性の生成物への酵素修飾を介して生じ得る可能性が高い。ＬＩＮ２１８９がアンピシリン耐性においてＧＹＲＹＺＹＭＥとして機能するかどうかを決定するために、細菌成長におけるアンピシリンのエクスビボでの不活性化を評価した。この実験において、酵素ＬＩＮ２１８９または非酵素対照タンパク質ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７を、インビトロでアンピシリンの様々な濃度で混合して、細菌成長の試験の前にアンピシリンを不活性化した（図１６Ｂ）。ＬＩＮ２１８９ ＧＹＲＹＺＹＭＥとともにインキュベートしたアンピシリンが触媒作用によって不活性化されるかどうかを評価した。したがって、培地に添加した場合、細菌の成長に対する毒性効果は観察されない。酵素修飾を引き起こさない対照実験については、アンピシリンは依然としてその活性状態にあるため、成長は観察されない。ＣＴＲ１０７実験において、５μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌのアンピシリンを細胞に添加することにより、ＳＡＶ２４３５の成長が実質的に阻害された。しかしながら、ＬＩＮ２１８９は、最大５００μｇ／ｍｌまでのアンピシリン耐性を誘導することができた。これらの結果は、ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢによるアンピシリンの酵素不活性化を確認する。
本発明によれば、アンピシリンに結合し、アンピシリンを不活性化することができるＧＹＲＹＺＹＭＥアプタマーＬＩＮ２１８９ ＤＵＢを識別した。当業者であれば、本明細書で提供される本発明の方法を使用してＬＩＮ２１８９ ｗｔの他の修飾が、広範な触媒活性を示す他の本発明のＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーを産生することを理解するであろう。当業者であれば、ＬＩＮ２１８９ ｗｔの他の修飾が、触媒活性を欠く追加の高親和性の本発明のアプタマー（例えば、本発明のＧＹＲＹＡＰＴＳ）を産生することができることを理解するであろう。本願発明者らのプロトコルは、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーを形成する薬物結合アプタマーまたは薬物代謝アプタマーを識別するための一般的な手法を確立する。
実施例１６：ＧｙｒＩ様タンパク質からの新規のダウノルビシンアプタマーの設計
本願発明者らの実験結果は、ＧｙｒＩ様ファミリーを、化学構造に関係なく、多種多様な有機分子に結合するように操作することができることを示した。このファミリーは、薬物増強モジュールまたは薬物送達技術のために設計することができる標的薬物分子に結合するアプタマーを設計するための強力なツールであり得る。薬物結合アプタマーを設計するには、選択方法と変異誘発戦略の両方が必要である。本明細書で提供される本発明の方法は、化学療法用ダウノルビシンのＧｙｒＩ様ファミリーからの薬物結合アプタマーを識別するために使用され得る。このスクリーニングおよびその後の変異誘発の方法は、バイオ医薬用途に使用することができるＧｙｒＩ様アプタマーの単離を可能にする。
その蛍光特性のため、ＧｙｒＩ様タンパク質によるダウノルビシン結合は、本願発明者らの蛍光アッセイを使用してスクリーニングすることができる。ダウノルビシンは、それぞれ、４８０ｎＭおよび５９０ｎＭで励起最大値および発光最大値を有する。これにより、蛍光特性の変化を緑色チャネルの下でモニタリングすることが可能になる。緊密に結合するアプタマーが、ダウノルビシンに結合すると蛍光減少を引き起こすと考えられている。５０μＭの濃度で、ダウノルビシンは、緑色チャネルの下で高い蛍光強度を示す（図１７Ａ）。結合についてＧｙｒＩ様バリアントをスクリーニングしたところ、ほとんどのバリアントアプタマーは、内因性ダウノルビシン蛍光にわずかに影響を及ぼしたが、バリアントＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗは、２倍を超える蛍光減少を示すことがわかった。単一変異体ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗは、蛍光の３倍の減少を誘導する最も強力な消光剤であった。全体的なＬＩＮ２１８９バリアントは、ダウノルビシン蛍光に影響を及ぼさなかった。紫外光を使用して、ダウノルビシン蛍光のインビトロでの消光をさらにＵＶ分析した（図１７Ａ）。これらの実験において、ＧｒｙＩ様タンパク質の不在下で５μＭのダウノルビシンを含む試料、または飽和量の非消光ＳＡＶ２４３５対照タンパク質もしくはＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗを含む試料にＵＶ光を照射した。予測通り、ＧｙｒＩ様タンパク質を含まない試料、またはＳＡＶ２４３５対照は、明るいＵＶ蛍光を示した。ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗを添加すると、蛍光の完全なシャットオフが観察される。
ダウノルビシン蛍光における視覚的変化は、ＧｙｒＩ様タンパク質バリアントによる薬物結合を分析するために使用することができる急速かつ高スループットの方法である。本願発明者らの蛍光結合アッセイを使用して、野生型ＣＴＲ１０７と比較して、ダウノルビシンに対するＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗの親和性を決定した。ヒルの式への非線形回帰モデル当てはめは、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗについては４２ｎＭ、ＣＴＲ１０７野生型については４μＭの解離定数を生じた（図１７Ｃ、Ｄ）。ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗダウノルビシン結合アプタマーは、多重特異性野生型ＣＴＲ１０７と比較して、ダウノルビシンに対する結合親和性が約１００倍増加することを示す。この結果は、ＧｙｒＩ様タンパク質の最小限の変異が、リガンド結合親和性の大幅な増加をもたらし得ることを強調する。
全体として、この実施例は、タンパク質のＧｙｒＩ様ファミリーから薬物結合アプタマーを識別する本発明の方法を提供する。変異誘発およびスクリーニングの両方を使用して、アプタマーを、目的の多数の治療用小分子への結合のために単離することができる。本発明の方法は、薬物機能および薬物作用を改善することができる薬物特異的アプタマーを作製するための汎用性があるプロトコルを提供する。これらのアプタマーは、高い有効性の生体療法剤を作製するための薬物送達技術に使用することができる。
実施例１７：コンビナトリアル変異体ライブラリーを使用してＦＡＭ結合のための高親和性ＧｙｒＩ様アプタマーの設計およびファージディスプレイによる選択
実施例１～１５において、ＧｙｒＩ様タンパク質を合理的に操作して、標的有機分子に適度な親和性で結合するアプタマーを作製することができることを示した。いくつかの場合において、高親和性アプタマーは、様々な用途に必要とされるであろう。本明細書には、コンビナトリアル変異誘発、その後のファージディスプレイによる選択を介して、特異的かつ高親和性のアプタマーを作製するためのＧｙｒＩ様タンパク質を操作するための本発明の方法が提供される（図１８）。本発明によれば、高親和性アプタマーは、ＧｙｒＩ様タンパク質ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、ＬＩＮ２１８９の変異体ライブラリーを使用して、または合理的なインシリコ設計を通じて作製される。
変異体ライブラリーの作製に関して、リガンド結合に関与する、選択されたＧｙｒＩ様テンプレートタンパク質の結合部位内の残基を識別した（図２０、２１）。次に、ＮＮＫ変異誘発スキームを使用して、結合部位残基を無作為化して、１３２０～１８２０の可能性のあるバリアントを含有する変異体ライブラリーを作製した。ＮＮＫ変異誘発ライブラリーの多様性は、１００のバリアントのＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。変異体ＤＮＡライブラリーをカプシドタンパク質１０にクローニングし、Ｔ７ファージの外側にバリアントを提示した。本願発明者らのファージディスプレイライブラリーには、１０８～１０１０バリアントが含まれる。表面上に固定化された標的リガンドを用いる４ラウンドのバイオパニングを使用して、ＧｙｒＩ様タンパク質の本願発明者らのファージディスプレイライブラリーは、ファージプラークアッセイからの陽性組換え体の配列決定から識別された高親和性標的結合アプタマーを生成した。バリアントを、様々な技術を使用して、発現し、精製し、結合について分析することができる。原理の証明として、ＦＡＭに結合するアプタマー（６－カルボキシフルオレセイン、図４）について、変異体ライブラリーを探索した。上述のプロトコルを使用して、ＣＴＲ１０７ライブラリーを使用するバイオパニング実験から独自の７つのＦＡＭ結合アプタマーを識別した（図２２）。
蛍光結合実験において、アプタマーが飽和濃度でＦＡＭ－ＤＮＡ蛍光の強力な消光を誘導することが観察された（図２３Ａ）。本願発明者らのＧｙｒＩ様アプタマーは、精製されたＦＡＭ対照ＤＮＡ（バイオパニングに使用されない）がバイオパニングテンプレートよりも強力な消光を示したため、ＤＮＡ配列に対する好ましさを示さなかった（図２３Ａ）。本願発明者らのアプタマーは、ＦＡＭ－ＤＮＡが好ましい高親和性リガンドであることを示唆する抗体と比較して、非標識ＦＡＭに対する弱い消光を示した（図２３Ｂ）。本願発明者らの蛍光結合アッセイを使用して、ＦＡＭ抗体および本願発明者らのＧｙｒＩ様アプタマーバリアントの解離定数を決定した（図２３Ｂ）。ヒルの式に当てはめる非線形回帰を使用すると、すべてのアプタマーが低いナノモル濃度親和性を示すことが観察される（図２３Ｂ）。ＦＡＭ抗体は、８ｎＭのＫｄで結合し、一方で、本願発明者らの最も弱いアプタマーは、３ｎＭのＫｄで結合した（図２３Ｂ）。本願発明者らの最も高い親和性のアプタマーは、ＦＡＭよりも１１倍強い７６０ピコモル濃度のＫｄ親和性で結合した。全体的に、本願発明者らのＦＡＭ結合アプタマーは、野生型ＣＴＲ１０７と比較して、５０～７００倍の親和性の増加を示す。これらのデータは、ＧｙｒＩ様タンパク質を操作して、リガンドの高親和性アプタマーを作製することができることを示す。本願発明者らの概略的なプロトコルは、大規模な変異誘発ライブラリーを介して、またはインシリコ設計および合理的な変異誘発を介してのいずれかで、アプタマーを作製することを可能にする。本発明の方法は、目的の任意のリガンドに対する高親和性アプタマーの作製を可能にする。
実施例１８：コンビナトリアル変異体ライブラリーを使用する様々な小分子のための高親和性ＧｙｒＩ様アプタマーの設計およびファージディスプレイによる選択
実施例１７において、ファージディスプレイ変異誘発ライブラリーを使用して、ＧｙｒＩ様タンパク質からの高親和性アプタマーの操作のための効率的な本発明のプロトコルを示した。本願発明者らの原理の証明プロトコルは、ＳＡＶ２４３５、ＣＴＲ１０７、ＬＩＮ２１８９のＧｙｒＩ様タンパク質ライブラリーから、リガンドＦＡＭ、ＣＹ５、ＴＯ１、シタラビン、およびＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のいくつかのアプタマー候補の識別に成功することを可能にした（図２４）。本発明のプロトコルに記載されている本願発明者らの広範な戦略を使用して、４ラウンドのバイオパニング後に、本願発明者らの変異誘発ライブラリーと組み合わせたファージディスプレイを使用してアプタマーを見つけることができた（図１８）。陽性組換え体の配列決定は、バリアントが多様であり、野生型タンパク質との類似性をほとんど示さないことを示す（図２４）。生物物理学的分析は、本発明のライブラリー集合体から最も高い親和性の候補をさらに識別することができる。他の実施形態において、本願発明者らのＧｙｒＩ様アプタマーをさらに操作して、医学のための重要なバイオテクノロジーツールを作製することができる。
特定の実施形態において、例えば、本発明のシタラビンアプタマーを使用して、この重要な化学療法剤を標的がん細胞に送達して、薬物の有効性を改善することができる。追加の実施形態において、本発明のスパイクタンパク質アプタマーは、新規のＳＡＲＳコロナウイルスパンデミックに関連する疾患を治療するための薬剤候補として使用され得る。これらの結果は、本願発明者らの変異誘発ライブラリーおよびファージディスプレイ方法論の汎用性をさらに確認する。追加の実施形態において、本発明のプロトコルは、本明細書において、目的の任意の標的分子に対する高親和性アプタマーを識別するために、ＧｙｒＩ様アプタマーをスクリーニングするために改変され得る。本明細書で提供される本発明の方法およびライブラリーを使用して、自然科学および生命科学研究、ナノテクノロジー、バイオテクノロジー、および医学のための大量の多様で革新的なツールを設計することができる。

Claims (58)

  1. 図２０／配列番号２に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、前記バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、非天然バリアントアプタマー。
  2. 前記バリアントアプタマーが、野生型ＳＡＶ２４３５と比較して、図２０／配列番号２に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、前記バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３からなる群から選択される、請求項１に記載の非天然バリアントアプタマー。
  3. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、標的分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、請求項１または２に記載の非天然バリアントアプタマー。
  4. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、前記色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  5. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、前記色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン（Ｃａｒｂｏｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  6. 前記バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される標的分子への結合を可能にする、請求項１～３のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  7. 前記バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、請求項１～３のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  8. 前記バリアントアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ならびに配列番号４０～４５および配列番号５８～５９からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  9. 図２０／配列番号４に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、前記バリアント位置が、配列番号４のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、非天然バリアントアプタマー。
  10. 前記バリアントアプタマーが、野生型ＣＴＲ１０７と比較して、図２０／配列番号４に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、前記バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される、請求項９に記載の非天然バリアントアプタマー。
  11. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、請求項９または１０に記載の非天然バリアントアプタマー。
  12. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、前記色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  13. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、前記色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  14. 前記バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする、請求項９～１１のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  15. 前記バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、請求項９～１１のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  16. 前記バリアントアプタマーが、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２６）、ならびに配列番号３３～３９および配列番号４６～５０からなる群から選択される、請求項９～１５のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  17. 図２０／配列番号６に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを含む非天然バリアントアプタマーであって、前記バリアント位置が、配列番号６のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、非天然バリアントアプタマー。
  18. 前記バリアントアプタマーが、野生型ＬＩＮ２１８９と比較して、図２０／配列番号６に示されるバリアント位置の数にバリアントアミノ酸を含み、前記バリアント位置の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択される、請求項１７に記載の非天然バリアントアプタマー。
  19. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強、または色素の蛍光消光、有機分子への結合、または酵素活性から選択される１つ以上の機能を可能にする、請求項１７または１８に記載の非天然バリアントアプタマー。
  20. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光増強を可能にし、前記色素が、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  21. 前記バリアントアプタマーが、色素の蛍光消光を可能にし、前記色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  22. 前記バリアントアプタマーが、小分子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、ペプチド、およびポリマーからなる群から選択される有機分子への結合を可能にする、請求項１９に記載の非天然バリアントアプタマー。
  23. 前記バリアントアプタマーが、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される分子への結合を可能にする、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  24. 前記バリアントアプタマーが、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ（配列番号３２）、ならびに配列番号５２～５７からなる群から選択される、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマー。
  25. ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ（配列番号８）、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ（配列番号１０）、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ（配列番号１２）、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ（配列番号１４）、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ（配列番号１６）、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ（配列番号１８）、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ（配列番号２０）、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ（配列番号２２）、ＣＴＲ１０７ ＴＲＩＰ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ）（配列番号２４）、ＣＴＲ１０７ ＱＵＡＤ（Ｅ３６Ｒ、Ｈ４０Ｙ、Ｙ１０６Ｗ、Ｅ１３３Ｑ）（配列番号２６）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ（配列番号２８）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ（配列番号３０）、およびＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ（Ｅ１５７Ａ、Ｅ１８５Ｌ）（配列番号３２）、ならびに配列番号３３～５９からなる群から選択される、操作された非天然アプタマー。
  26. 蛍光オン／オフバイオスイッチ（ｂｉｏｓｗｉｔｃｈ）システムであって、
    第１のＧｙｒｌ様アプタマーと、
    発蛍光性色素と、を含む、バイオスイッチシステム。
  27. 前記色素が、５（６）－カルボクスフルオロセイン（ＦＡＭ）、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、オキサジン）、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、およびアクリジンオレンジからなる群から選択される、請求項２６に記載のバイオスイッチシステム。
  28. 前記Ｇｙｒｌ様アプタマーが、熱安定性および／またはｐＨ安定性である非天然バリアントＧｙｒｌ様アプタマーである、請求項２６または２７に記載のバイオスイッチシステム。
  29. 第２のＧｙｒｌ様アプタマーをさらに含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載のバイオスイッチシステム。
  30. 前記色素が、Ａｔｔｏ４９５であり、前記第１および第２のアプタマーが、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ならびにＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のバイオスイッチシステム。
  31. 前記色素が、アクリジンオレンジであり、前記第１のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択され、前記第２のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗのうちのいずれか１つ以上からなる群から選択される、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のバイオスイッチシステム。
  32. 前記色素が、アクリジンオレンジであり、前記第１および第２のアプタマーが、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６ＷおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ならびにＣＴＲ１０７ Ｅ１３３ＱおよびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のバイオスイッチシステム。
  33. 生体シグナルを検出する方法であって、前記方法が、フルオロフォア標識を有する分子プローブを生体試料に提供することと、前記分子プローブをＧｙｒｌ様タンパク質と接触させることと、を含む、方法。
  34. 前記Ｇｙｒｌ様タンパク質と接触させると、前記分子プローブの蛍光が、増加するか、または減少するかのいずれかである、請求項３３に記載の方法。
  35. 利用される前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、Ｇｙｒｌ様バリアントタンパク質である、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記蛍光が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ増加する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記蛍光が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ超から選択される量だけ減少する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記フルオロフォアが、ＤＦＨＢＩまたはマレカイトグリーン（Ｍａｌｅｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５およびＣＴＲ１０７からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記フルオロフォアが、チアゾールオレンジであり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、配列番号５０～５１、および配列番号５４～５５からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記フルオロフォアが、チオフラビンＴであり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴおよびＬＩＮ２１８９ ＷＴからなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記フルオロフォアが、Ａｔｔｏ４９５であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ－Ｅ１８５Ｌ二重変異体からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記フルオロフォアが、アクリジンオレンジであり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｙ１３７Ｗ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記フルオロフォアが、シアニン５であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｎ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＬＩＮ２１８９、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１８５Ｌ、配列番号４２、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５６からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記フルオロフォアが、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＬＩＮ２１８９ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ、ＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗ、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ（三重変異体）、ＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（別名ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）、および配列番号３３～４０からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記フルオロフォアが、５－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、およびＬＩＮ２１８９ Ｅ１５７Ａ Ｅ１８５Ｌ（別名ＬＩＮ２１８９ ＤＵＢ、二重変異体）からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記フルオロフォアが、オキサジン１７０であり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＳＡＶ２４３５ ＷＴ、ＣＴＲ１０７ ＷＴ、ＳＡＶ２４３５ Ｖ１０５Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｐ１０６Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｎ２７Ｗ、ＳＡＶ２４３５ Ｅ１３５Ｑ、およびＣＴＲ１０７ Ｙ１０６Ｗからなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記フルオロフォアが、ヨードニトロテトラゾリウムであり、前記Ｇｙｒｌ様タンパク質が、ＣＴＲ１０７ Ｅ１３３Ｑ、ＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｙ１０６Ｗ Ｅ１３３Ｑ四重変異体（ＱＵＡＤ）、およびＣＴＲ１０７ Ｅ３６Ｒ Ｈ４０Ｙ Ｖ１０５Ｗ（ＴＲＩＰ）からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記分子プローブが、消光部分をさらに含み、前記消光部分は、フルオロフォアの蛍光が消光されるように、前記フルオロフォアと作動可能に近接している、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 所望の生物学的特性を有する非天然バリアントアプタマーを識別する方法であって、前記方法が、
    分析のための試験分子を提供することと、
    前記試験分子を、請求項１～２５のいずれか一項に記載の非天然バリアントアプタマーのうちの少なくとも１つと接触させることと、
    １つ以上の所望の生物学的特性を有する前記非天然バリアントアプタマーを選択することと、を含む、方法。
  50. 前記所望の生物学的特性が、生物学的標的もしくは標的分子への結合、蛍光増強、蛍光消光、または酵素活性から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記生物学的標的が、ＦＡＭ、ＣＹ５、チアゾール－オレンジ、シタラビン、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、ＳＹＴＯ９、ＤＨＭＢＩ、マラカイトグリーン、チアゾールオレンジ、チオフラビンＴ、Ａｔｔｏ４９５、アクリジンオレンジ、５（６）－カルボクスフルオロセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン、およびオキサジンからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、イオンチャネル、受容体、腫瘍抗原、および疾患関連抗原からなる群から選択される、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記試験分子が、シタラビンまたはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である、請求項４９または５０に記載の方法。
  54. 前記試験分子が、シタラビンであり、前記非天然バリアントアプタマーが、配列番号４１、配列番号４３～４７、および配列番号５２～５３からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記試験分子が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質であり、前記非天然バリアントアプタマーが、配列番号５７～５９からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  56. 図２０／配列番号１に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＳＡＶ２４３５に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１３個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＳＡＶ２４３５バリアントアプタマーのライブラリーであって、前記バリアント位置が、配列番号１のアミノ酸位置２７、３０、３１、３４、３８、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１３５、１３７、および１４２に対応する、ライブラリー。
  57. 図２０／配列番号２に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＣＴＲ１０７に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１２個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＣＴＲ１０７バリアントアプタマーのライブラリーであって、前記バリアント位置が、配列番号２のアミノ酸位置３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、７５、１０６、１３３、１３５、および１３８に対応する、ライブラリー。
  58. 図２０／配列番号３に示されるポリペプチド中のすべてのバリアント位置のうち、野生型ＬＩＮ２１８９に対して、バリアントアミノ酸の１個～最大１７個すべての任意の組み合わせを有する非天然バリアントアプタマーを含む非天然ＬＩＮ２１８９バリアントアプタマーのライブラリーであって、前記バリアント位置が、配列番号３のアミノ酸位置４１、４２、４６、５０、５４、５８、８１、８５、９３、９９、１５４、１５７、１８５、１８７、１９０、１９１、および１９２に対応する、ライブラリー。
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