JP2023526040A - 血栓性または出血性疾患の治療に使用するための徐放性プラスミノーゲン活性化因子製剤 - Google Patents

Abstract

血栓症または出血性疾患の治療に使用するための徐放性プラスミノーゲン活性化因子製剤。本発明は、徐放性プラスミノーゲン活性化因子組成物に関する。本発明はまた、前記組成物の治療的使用、特に血栓性または出血性疾患における治療的使用に関する。

Description

本発明は、徐放性（slow release）プラスミノーゲン活性化因子組成物に関する。本発明はまた、前記組成物の治療的使用、特に血栓性または出血性疾患における治療的使用に関する。

脳内出血（ＩＣＨ：Intracerebral haemorrhage）は、世界で年間５００万人もの住民が冒される最も重篤な脳卒中の形態である（Krishnamurthi, RV et al. 2015. Neuroepidemiology; 45(3): 190-202; Feigin, VL et al. 2014. Lancet; 383(9913): 245-54）。そのほとんどが死亡するか、重篤な障害が残る。３０日後の症例致死率は４０～５０％の範囲である一方、６ヶ月後に機能的に自立していると予想されるのはわずか２０％である（van Asch, et al. 2010, The Lancet. Neurology 9(2): 167-762010; Sacco, et al. 2009. Stroke 40(2): 394-99）。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析では、１０年生存率は２４．１％であった。ＥＵおよび米国における現行のガイドラインの推奨（Steiner et al. 2014. International Journal of Stroke: Official Journal of the International Stroke Society; 9(7): 840-55; Hemphill, et al. 2015. Stroke; 46 (7): 2032-60）は、卒中患者を、（１）あらゆる凝固異常を逆行させる、（２）正常血糖を維持する、（３）血圧をコントロールする、および（４）血栓塞栓イベントおよび褥瘡合併症を予防するという目的で、卒中に特化した集中治療室（ＩＣＵ）に入院させることを認めるものである。脳内出血（ＩＣＨ）に対しては、特定の治療法はまだ承認されていない。

ＩＣＨの多くの事例は、小動脈が破裂し、続いて血液が脳内に漏れた時に起こり、固形の巨大な脳内血腫の急速な形成に至る。血腫の腫瘤効果（mass-effect）が周囲の脳組織を破壊し、離れた脳領域を圧迫することで、高い致死率または重篤な運動および認知障害という一次的障害に至る。二次的障害である血腫が形成されるとすぐに引き起こされる炎症プロセスは、血腫周囲浮腫（ＰＨＥ：perihaematomal oedema）の形成という結果をもたらす。ＰＨＥの体積は、臨床試験において患者の転帰を予測するための有益なマーカーと思われうるが（Schlunk F, et al. 2015. Translational Stroke Research; 6(4): 257-63.; Urday, et al. 2015. Nat. Rev. Neurol.; 11(2): 111-22）、明確な優先事項は、最初の数時間以内に出血を止めるか、最初の数日以内に血腫を排出することで血腫の体積を減少させて、二次的障害を制限することである。

ＩＣＨの苦しみを軽減するための治療標的が、出血を早期に止める目的で（例えば、組み換え因子ＶＩＩａの使用、ＦＡＳＴ試験（Mayer, et al. 2008. The New England Journal of Medicine; 358(20): 2127-37）、または神経保護戦略を用いて後期の炎症プロセスを制限する目的で（例えば、鉄キレート剤デフェロキサミンの使用、Ｈｉ－Ｄｅｆ試験（Yeatts, et al. 2013. Neurocritical Care; 19(2): 257-66）、既存の薬剤の拡大適用として検討された。それにもかかわらず、これらの戦略のいずれもＩＣＨ患者への利益を示さなかった。

もう一つの戦略は、血腫の腫瘤効果と、その後の二次的障害を軽減するために、血腫を摘出することである。標準手術を用いた最初の結果は、主要評価項目に関してポジティブではなかった（Mendelow, et al. 2013. Lancet; 382(9890): 397-408.）が、手術の有害作用を軽減するために、血腫にアクセスするための新しい方法が検討された。脳内出血の排出における血栓溶解を伴う低侵襲手術（ＭｉｓＴＩＥ試験）では、副作用の劇的な減少が示された（Hanley et al. 2019. Lancet, 383(10175):1021-1032）。研究者らは、ＭｉｓＴＩＥ戦略がＩＣＨ死亡率を低下させることを示し、さらに興味深いことに、残存血腫体積とＩＣＨ患者の回復の間に強い関係があることも実証した（Awad, et al. 2019. Neurosurgery, 84(6):1157-1168）．したがって、ＭｉｓＴＩＥ戦略はＩＣＨ患者に正しい解決策でありうる。それでもなお、障害の低減の確率を確実に高めるために、適切な血栓溶解剤を使用する必要がある。

組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ：tissue plasminogen activator）は、虚血性脳卒中の治療に承認された唯一の医薬（組換え血栓溶解剤）である。この５２７アミノ酸の糖タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までの５つのドメイン：フィンガードメイン、ＥＧＦ様ドメイン、２つのクリングルドメイン、およびタンパク質分解ドメインから構成されている（Van Zonneveld, et al. 1986. Journal of Cellular Biochemistry; 32(3): 169-78）。低濃度でプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するその能力により、ｔＰＡは血栓の解消を支援する（Hoylaerts et al. 1982）。組換えｔＰＡ（ｒｔＰＡ：recombinant tPA）は、心筋梗塞、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ：acute ischemic stroke）および肺塞栓症の治療のための薬学的選択肢として提案されている（Quinn, et al. 2008. Expert Review of Neurotherapeutics; 8(2): 181-92）。

この２０年間、ｒｔＰＡは、血栓溶解剤として、脳卒中の治療のために、ＣＬＥＡＲ試験で脳室内出血、およびＭｉｓＴＩＥ試験で脳内出血において、深く評価されている。ＭｉｓＴＩＥプログラムでは、標的部位まで到達するための、およびｒｔＰＡの血栓溶解作用により液化した血液を排出するための、細いカテーテルを用いて、組換えｔＰＡ（ｒｔＰＡ、アルテプラーゼ）を脳内血腫に注入することを提案している。ＭｉｓＴＩＥ第３相試験では、主要評価項目（ＭｉｓＴＩＥ投与群におけるｍＲＳスコアの低下）には到達しなかった（Hanley et al. 2019. Lancet, 383(10175):1021-1032）。ｒｔＰＡは強力な血栓溶解剤ではあるが、急性の脳症状の治療では３つの限界に悩まされる：第１に、高速、効率的かつ安全な血腫除去が可能ではないこと。実際、ｒｔＰＡ処置では、７２時間後、最大９回の注射でおおよそ６９％しか血腫を縮小できない。第２に、再出血を誘発すること（対照群に対して２５％増）（Hanley et al. 2019. Lancet, 383(10175):1021-1032）。第３に、ｒｔＰＡは、ブタのＩＣＨのモデルにおいてその有益な治療効果を制限する潜在的な副作用につながるグルタミン酸神経伝達の神経調節因子であることが示されている（Rohde et al. 2002. Journal of Neurosurgery; 97(4): 954-62; Thiex, et al. 2007. Journal of Neurosurgery; 106(2): 314-20.; Keric et al. 2012. Translational Stroke Research; 3 (Suppl 1): 88-93）。

過去２０年間、いくつかの実験的研究では、血栓溶解効果を高めるために、ｒｔＰＡの治療時間の延長に焦点を当ててきた。しかしながら、ほとんどの薬剤は臨床試験で失敗している。ナノキャリアは、循環中のｒｔＰＡの失活を防ぎ、血栓領域付近でｒｔＰＡを迅速に放出できるように設計および製造された（Chung et al. 2008, Biomaterials; 29(2):228-23）。

しかし、担体へのタンパク質およびプロテアーゼの担持は常に問題となっている。実際、薬剤の製剤化に適用されるプロセスは、製剤化された化合物に化学的ストレスおよび物理的ストレスの両方を誘発する。その結果、タンパク質およびペプチドなどの感受性の高い治療薬の分解および活性喪失をもたらしうる。

ｒｔＰＡをカプセル化して長時間にわたり送達する取り組みが行われたが、カプセル化の効率（７５％未満）またはカプセル化されたタンパク質の濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかに関する限界が目立った（Chung et al.2008, Biomaterials; 29(2):228-237; Wang, et al.2009, J Biomed Mater Res; 91A:753-61; Zhou et al. 2014; ACS applied materials & interfaces; 6:5566-76; Sivaraman et al. 2016; Mater Sci eng C Mater Biol Appl. 59:145-156）。

したがって、プラスミノーゲン活性化因子の血栓溶解に対する有効性を高めつつ、副作用を抑えた新規の製剤を開発する必要性が残されている。

本発明者らは、驚くべきことに、血腫の中心部にプラスミノーゲン活性化因子を持続性放出（sustained release）することで、ゴールドスタンダードである組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）を同量繰り返し注射するよりも優れた血栓溶解効果（血栓重量減少）が得られることを示した。

そのため、本発明者らは、血腫の実質的な縮小を達成するために必要な注射回数および時間を減らすために、数時間かけて徐放することを可能にするために、高濃度ストック溶液からプラスミノーゲン活性化因子組成物を調製する方法を検討した。

そのために、プラスミノーゲン活性化因子の有効性を維持しながら、プラスミノーゲン活性化因子の高濃度担持（loading）および２４時間未満の放出を可能にするために、プラスミノーゲン活性化因子ナノ粒子および熱可逆性ポリマーを用いて、新規の脳適合性製剤（brain-compatible formulation）を開発した。

本開示は、熱可逆性ポリマーと、プラスミノーゲン活性化因子を含むナノ粒子とを含む組成物に関する。

特定の実施形態において、前記ナノ粒子は、ポロキサマー、好ましくは１８８、３３８および２３７からなる群から選択されるポロキサマー、より好ましくはポロキサマー１８８を含む。

別の特定の実施形態では、前記熱可逆性ポリマーはポロキサマーであり、好ましくはポロキサマー４０７である。前記ポロキサマー４０７は、好ましくは１５～２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１７～２３％（ｗ／ｖ）、再びより好ましくは１７％（ｗ／ｖ）の濃度である。

特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、パミテプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、デスモテプラーゼ、ウロキナーゼ、またはストレプトキナーゼからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化因子は、変異型プラスミノーゲン活性化因子、好ましくはＷ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ変異プラスミノーゲン活性化因子、より好ましくは配列番号：１の配列からなるＷ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ変異プラスミノーゲン活性化因子である。

別の態様において、本開示は、医薬として使用するための、好ましくは血栓性または出血性疾患を治療するための、前記組成物に関する。前記血栓性または出血性疾患は、血栓性または塞栓性虚血、動脈または静脈閉塞症、深部血腫、脳出血または血腫、および眼出血または血腫、好ましくは、実質内出血または血腫、脳室内出血または血腫、脳くも膜下出血または血腫、加齢黄斑変性、網膜中心閉塞症、硝子体出血、外傷性か否かを問わないあらゆる深部血腫、脳血腫または癌に対する介入後の血腫を含めたあらゆる術後血腫、より好ましくは実質内、脳室内、くも膜下出血または血腫などの脳出血または血腫からなる群から選択される。

さらなる態様において、本開示はまた、熱可逆性ポリマーとプラスミノーゲン活性化因子－ポロキサマーナノ粒子とを含む組成物を調製する方法に関し、前記方法は、ｉ）プラスミノーゲン活性化因子とポロキサマーとを含む水溶液を調製するステップ、ｉｉ）得られた溶液を、プラスミノーゲン活性化因子をポロキサマーと組み合わせて沈殿させるのに十分な量のタンパク質沈殿溶媒と接触させて、プラスミノーゲン活性化因子－ポロキサマーナノ粒子を形成するステップ、ｉｉｉ）熱可逆性ポリマー中に前記ナノ粒子を添加するステップを含む。

最後の態様において、本開示は、ポロキサマー、好ましくはポロキサマー１８８と組み合わせたプラスミノーゲン活性化因子を含む、ナノ粒子に関する。

ＯｐｔＰＡ 対 ｒｔＰＡのアミド分解および線溶の特性評価。Ａ）ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ｒｔＰＡ発色基質に対するｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡ（Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡ）の平均アミド分解活性、ウェルあたり０～２００ｎｇの濃度範囲で、フィブリン非存在下で測定（ｎ＝４）。Ｂ）ＯｐｔＰＡおよびｒｔＰＡの試験した異なる濃度におけるアミド分解活性の詳細。アミド溶解活性は、最大速度（１μｇあたりの１秒あたりの光学密度）として表される（試験した１０濃度、１濃度あたりｎ＝４）；Ｃ）試験したＯｐｔＰＡおよびｒｔＰＡの各濃度についての４０５ナノメートルにおける光学密度によって評価した最大濁度（ｎ＝５）；Ｄ）全血漿血栓溶解アッセイにおける、ＯｐｔＰＡまたはｒｔＰＡを用いて５０％溶解に達するまでの時間として測定した線溶活性（ヒト血漿のプール、ｎ＝５）。＊はｐ＜０．０５；＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する；ｎｓ＝有意でない；白抜きの四角、淡灰色＝ＯｐｔＰＡ；無地の四角、濃灰色＝ｒｔＰＡ。 ＯｐｔＰＡ_１５１ 対 ｒｔＰＡアルテプラーゼのアミド分解特性評価。Ａ）ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ｒｔＰＡ発色基質に対するアルテプラーゼおよびＯｐｔＰＡ_１５１の平均アミド分解活性、ウェルあたり０～２００ｎｇの濃度範囲で、フィブリン非存在下で測定。Ｂ）ＯｐｔＰＡ_１５１およびアルテプラーゼの試験した異なる濃度におけるアミド分解活性の詳細。Ｃ）ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍ（登録商標）ｒｔＰＡ発色基質に対するＯｐｔＰＡ（ミニプールから取得、クローン単離前、図１Ａ）およびＯｐｔＰＡ１５１（選択した研究用セルバンク由来、図２Ａ）の平均アミド分解活性の比較、ウェルあたり０～２００ｎｇの濃度範囲で、フィブリン非存在下で測定。＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する；白抜きの丸＝ＯｐｔＰＡ_１５１；白抜きの四角＝ｒｔＰＡ；無地の丸＝ＯｐｔＰＡ 無地の四角＝図１ＡからのｒｔＰＡ。 ＯｐｔＰＡ_１５１ 対 アルテプラーゼ（ｒｔＰＡ）を用いたプラスミノーゲン活性化アッセイ。プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン、およびプラスミンの特異的基質であるｐＮＡＰＥＰを、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ－ＮａＣｌ１５０ｍＭ ｐＨ＝８．０バッファー中でインキュベートした。変換されたプラスミン活性のレポーターとして、４０５ｎｍの吸光度を１８時間にわたって記録した。４０５ｎｍの吸光度の一次微分の最大値（最大酵素活性）は、時間の関数として、試験した濃度範囲における用量応答を示す（図３左）。ｔＰＡはフィブリン非存在下でのプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化の明らかな上昇を示すが、ＯｐｔＰＡは同じ濃度範囲（２～７ｎＭ）でプラスミノーゲンを活性化する能力が低く、プラスミノーゲンをプラスミノーゲンに活性化する能力が８４．４％（ＳＤ＝４．７）低下している（図３右）。（ｒｔＰＡは６濃度、ＯｐｔＰＡは３濃度で試験、デュプリケートで実施；ｎ＝５）；白抜きの円＝ＯｐｔＰＡ_１５１；白抜きの四角＝ｒｔＰＡ；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する。 トロンボエラストグラフィ試験で評価した凝固および血栓溶解パラメータのＯｐｔＰＡとｒｔＰＡの比較。Ａ－Ｃ）ＯｐｔＰＡおよびｒｔＰＡの０．６μｇ／ｍＬおよび０．９μｇ／ｍＬにおける凝固時間（ＣＴ－Ａ）、最大血栓硬度（ＭＣＦ－Ｂ）、および血栓形成率（ＣＦＲ－Ｃ）を含む凝固パラメータ；Ｄ－Ｅ）ＯｐｔＰＡおよびｒｔＰＡの０．６μｇ／ｍＬおよび０．９μｇ／ｍＬにおける溶解開始時間（ＬＯＴ－Ｄ）、血栓溶解率（ＣＬＲ－Ｅ）、および曲線下面積（ＡＵＣ－Ｆ）を含む血栓溶解パラメータ。曲線下面積は、血栓の形成およびこの血栓の線溶を考慮している。ｎｓ＝有意差なし；無地の四角および濃灰色（左）＝ｒｔＰＡ；白抜きの四角および／または淡灰色（右）＝ＯｐｔＰＡ。 １ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまでのｒｔＰＡ浴に浸漬した１ｍＬ血栓の時間経過血栓溶解。上段：すべての処置について、実験の各時点における相対的な残存血栓重量を２４時間にわたってモニターした。破線は、偽薬条件（２４時間０．９％ＮａＣｌに浸漬）を表す。黒い矢印は、対応する条件（１５分間の一過性のばく露を３回、続いて、０．９％ＮａＣｌ浴に浸漬）での３０μｇ／ｍＬへの繰り返しばく露を表す。結果は、相対残存重量の平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝７である。下段：単位時間ごと、単位濃度ごとの、血栓のｒｔＰＡへの代表的なばく露。 １μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬまでのｒｔＰＡ浴に浸漬した１ｍＬ血栓の時間経過血栓溶解。上段：すべての処置について、実験の各時点における相対的な残存血栓重量を２４時間にわたってモニターした。破線は、偽薬条件（２４時間０．９％ＮａＣｌに浸漬）を表す。黒い矢印は、対応する条件（１５分間の一過性のばく露を３回、続いて０．９％ＮａＣｌ浴に浸漬）での３０μｇ／ｍＬへの繰り返しばく露を表す。結果は、相対残存重量の平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝７である。下段：単位時間ごと、単位濃度ごとの、血栓のｒｔＰＡへの代表的なばく露。 １ｍＬヒト全血血栓に対するポロキサマー製剤候補の２４時間にわたる血栓溶解作用の観察試験。上段：一晩凝固させたヒト血液（１ｍＬ）。中段：血栓表面に製剤候補を１００μＬ添加した２４時間後にチューブの底を上に反転することにより、血栓の液化を評価。下段：血栓を抽出し、残存血栓と液化した血液の質感を比較した。偽薬処置した血栓のみ液化されていない。 ３つのポロキサマー候補で処置を開始してから９時間後の５ｍＬヒト血液血腫溶解。処置後の相対残存重量を表す（ｎ＝２）。 Ｐ４０７－ｒｔＰＡおよびＯ２Ｌ－００１（Ｐ４０７－ＯｐｔＰＡ）による処置開始の９時間後の５ｍＬヒト血液血腫溶解。Ｐ４０７－ｒｔＰＡを溶液１ｇあたり０．０３から１．００ｍｇまで（Ａ、ｎ＝７）、Ｐ４０７－ＯｐｔＰＡ、Ｏ２Ｌ－００１を溶液１ｇあたり０．０３から１．００ｍｇまで（Ｂ、ｎ＝６）用量増加した後の処置後の相対残存血栓重量を表す。＄は、他のすべての群、ｐ＜０．０００１とは異なる偽薬を意味する；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡに続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。 ＵＳＰ４システムにおけるＯ２Ｌ－００１からのＯｐｔＰＡの放出。ＯｐｔＰＡは，０．９％ＮａＣｌ溶出媒体を用いてＲＰ－ＨＰＬＣ法により定量化した（閉ループ系）。サンプリング時間は０（実験前）、１５分、３０分、４５分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、４８０分、１４４０分であった。この実験（ｎ＝６）では、担持されたＯｐｔＰＡの６０．２％（ＳＤ＝１４．９）が実験時間中に放出され、ｔ＝３６０分（６時間）で最大に達した。この量の８５％（ＳＤ＝３％）は最初の１時間で放出され、残りの１５％は次の数時間で放出され、ｔ＝６時間でプラトーに到達した。 ナノ沈殿物の特性評価。Ａ）４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＨＧ４）または２５ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＨＧ２５）または４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８および０．０５％ＰＳ２０（ＨＧ４ＰＳ）で補完したヘキシレングリコール中；または２５ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＴＧ２５）で補完したテトラグリコール中で得られたナノ沈殿物の再懸濁後のアミド溶解活性記録。Ｂ）２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＴＧ２０）で補完したテトラグリコール中で得られたナノ沈殿物の再懸濁後のアミド分解活性記録。ＣおよびＤ）２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＴＧ２０）で補完したテトラグリコール中で得られたナノ沈殿物の再懸濁後の線溶活性記録。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味し、ｎｓ＝有意でない。 ナノ沈殿後のテネクテプラーゼおよびＯｐｔＰＡのアミド分解活性の回復。４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＨＧ４）または２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＨＧ２０）で補完したヘキシレングリコール中；または、４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＴＧ４）または２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８（ＴＧ２０）で補完したテトラグリコール中で得られたテネクテプラーゼ（Ａ）およびＯｐｔＰＡ（Ｂ）ナノ沈殿物の再懸濁後に記録したアミド溶解活性。

発明の詳細な説明
プラスミノーゲン活性化因子ナノ粒子
本発明者らは、驚くべきことに、血腫の中心部にプラスミノーゲン活性化因子を持続性放出することにより、同じ量の遊離プラスミノーゲン活性化因子を繰り返し注射するよりも優れた血栓溶解効果（血栓重量の減少）が得られることを示した。本発明者らは、血腫の実質的な縮小を達成するために、プラスミノーゲン活性化因子を徐放することができる熱可逆性ポリマーを含む組成物を開発した。

熱可逆性ポリマーへのプラスミノーゲン活性化因子の取り込みは、ミセルの形成により制限され、ハイドロゲルの形成につながる。ミセルに捕捉されると、プラスミノーゲン活性化因子は、うまく放出されず、その活性を失う。この限界を克服するために選ばれた解決策は、タンパク質を変性させずに高濃度の担持を可能にし、ハイドロゲルの溶解に伴うプラスミノーゲン活性化因子の放出を支援するために、プラスミノーゲン活性化因子をナノ沈殿させること、好ましくはポロキサマー中でナノ沈殿させることである。

第１の態様において、本開示は、プラスミノーゲン活性化因子を含むナノ粒子に関する。

本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、固体材料の凝集した物理的単位を指す。

ナノ粒子は、１μｍに満たないメジアン径ｄ５０を有する粒子と理解される。本発明のナノ粒子のメジアン径は、好ましくは５０～５００ｎｍ、より好ましくは５０～２００ｎｍ、さらに好ましくは１００～３００ｎｍの範囲であり、再びより好ましくは、とりわけ約１５０ｎｍまたは２００ｎｍである。

本明細書で使用する場合、「中央値直径ｄ５０」という用語は、粒子集団の体積の５０％がより小さい直径を有するような粒径を指す。本発明によるメジアン径ｄ５０は、光回折および電子顕微鏡に基づく方法に従って懸濁液で行われる粒径測定によって決定される。

プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を触媒することにより線溶を促進するセリンプロテアーゼである。

プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ：plasminogen activator）は、内皮細胞、神経細胞、およびグリア細胞によって神経血管系（neurovascular unit）に分泌されるセリンプロテアーゼである組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）でありうる。ｔＰＡはＰＬＡＴ遺伝子によってコードされ、セリンプロテアーゼＥＣ３．４．２１．６８を指す。

本開示によれば、プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））、テネクテプラーゼ、パルミテプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、デスモテプラーゼ、ウロキナーゼ、アニソイル化精製ストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ：Anisoylated purified streptokinase activator complex；アニストレプラーゼ）、ストレプトキナーゼ、プローウロキナーゼ、スタフィロキナーゼ、またはＷ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡでありうる。

好ましい実施形態では、前記Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡは、ＷＯ２０１３／０３４７１０に開示されているように、良好な線溶活性を有し、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ：N-methyl-D-aspartate receptors）媒介神経毒性を促進しない変異型ｔＰＡである。好ましい実施形態では、該Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡは、ｔＰＡのクリングル２ドメインに存在するリジン結合部位、特にＬＢＳ構成トリプトファンに特異的な変異がある。より好ましい実施形態では、前記Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡは、二重変異Ｗ２５３ＲおよびＲ２７５Ｓを含む変異型プラスミノーゲン活性化因子である。より好ましい実施形態では、該Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ変異ｔＰＡは、ＯｐｔＰＡとも呼ばれ、配列番号：１を含むか、またはそれからなるものである。

ナノ粒子は、様々な方法から得ることができる。非限定的な例として、ナノ粒子は、プラスミノーゲン活性化因子のナノ沈殿によって、または、ポリマー、脂質、多糖類およびタンパク質を使用することによって得ることができる。熱可逆性ポリマーへのプラスミノーゲン活性化因子の組み込みは、さらにうまく放出されずプラスミノーゲン活性化因子活性の損失をもたらすミセルの形成のために制限される場合がある。プラスミノーゲン活性化因子のナノ沈殿は、タンパク質の変性を抑えて高濃度の担持を可能にし、ハイドロゲルの溶解とともに活性プラスミノーゲン活性化因子の放出を支援するために、好ましくはポロキサマー中で行われる。

好ましい実施形態において、ナノ粒子は、ナノ沈殿によって得られる。ナノ沈殿は、例えば、ｐＨ、塩濃度、溶解条件の変更、または当業者に良く知られている非溶媒の添加による、ナノ粒子の主構成成分が溶解している溶媒の質の低下に基づく方法である。

好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ポロキサマーの存在下で沈殿法により得られる。したがって、好ましい実施形態では、前記ナノ粒子は、プラスミノーゲン活性化因子およびポロキサマーを含む。

本明細書で使用する場合、用語「ポロキサマー」は当技術分野でよく知られており、ポリオキシエチレンの親水性鎖で挟まれたポリオキシプロピレンの中央疎水性鎖を含む非イオン性ブロックコポリマーを指す。該ブロックコポリマーは、以下の式で表すことができる：（Ｃ_２Ｈ_４０）_ｘ（Ｃ_３Ｈ_６０）_ｚ（Ｃ_２Ｈ_４０）_ｙＯＨ（式中、ｚは、（Ｃ_３Ｈ_６０）で表される疎水性基が少なくとも２２５０Ｄａの分子量を有するような整数であり、ｘまたはｙは約８から１８０、またはそれ以上の整数である。）。ポロキサマーはまた、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ」または「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ」（ＢＡＳＦ）の商品名で知られている。ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができ、その結果、多くのさまざまなポロキサマーが存在する。特に、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１１０７（ＢＡＳＦ）などのポロキサマーが挙げられる。特に好ましいポロキサマーは、親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）が１０以上、好ましくは１８以上、最も好ましくは２４以上であるものである。最も好ましいポロキサマーは、プラスミノーゲン活性化因子粒子の意図された投与経路に対して薬学的に許容されるものである。

好ましいポロキサマーは、ポリオキシプロピレンの中央疎水性鎖が、ポリオキシエチレンの２本の親水性鎖によって挟まれたものである。好ましくは、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８、３３８および２３７からなる群から選択され、より好ましくはポロキサマー１８８である。

熱可逆性ポリマーを含む組成物
プラスミノーゲン活性化因子のナノ粒子の徐放を促進するために、前記ナノ粒子は、熱可逆性ポリマー、特に、数時間かけて、２４時間以下で、可溶化物質を放出させることができる熱可逆性ポリマー中に再懸濁させることができる。

本開示は、上記のようなナノ粒子と、熱可逆性ポリマーとを含む組成物に関する。

本明細書で使用する場合、熱可逆性ポリマーは、温度によって物理的性質が急激にかつ不連続に変化するポリマーを指す。別の言い方をすれば、熱可逆性ポリマーは、その温度より下ではポリマーが流動性を維持し、その温度より上ではポリマーが半固体化する、ゾル－ゲル転移温度によって特徴付けられる。

好ましい実施形態では、プラスミノーゲン活性化因子ナノ粒子と熱可逆性ポリマーとを含む組成物を調製し、低温で溶液中に注入し、体温でゲルを形成して、ゲルからのプラスミノーゲン活性化因子の徐放を可能にすることができる。

前記熱可逆性ポリマーは、好ましくはポロキサマーであり、好ましくはポロキサマー４０７のような可逆的熱ゲル化を示すポロキサマーである。ポロキサマー４０７は、水溶液中で熱可逆性を示すので、本発明による使用に特に適しており、これは薬物製剤の最適化において大きな関心をもたらす。実際、低温ではポロキサマー４０７およびプラスミノーゲン活性化因子のナノ粒子は溶液状態であるが、体温ではゲルを形成し、ゲルからタンパク質を徐放させることが可能である。

より好ましい実施形態では、前記ポロキサマー４０７は、１５～２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１７％～２３％（ｗ／ｖ）、好ましくは１７％（ｗ／ｖ）の濃度である。

別の実施形態では、前記熱可逆性ポリマーはまた、非限定的な例として、キトサン、セルロース、ゼラチン、およびポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＡｍ）などの合成熱可逆性ポリマーであり得る。

治療的使用
プラスミノーゲン活性化因子ナノ粒子と熱可逆性ポリマーとを含む前記組成物は、血腫、特に、例えば、実質内出血、脳室内出血、およびくも膜下出血または血腫疾患において生じる脳血腫を低減するために特に好適である。

本開示はまた、先に記載したようなナノ粒子または組成物の治療的使用に関する。

特に、上記のようなナノ粒子または組成物は、それを必要とする対象における血栓性または出血性疾患を治療するために使用される。

本明細書では、「対象」および「患者」という用語は互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を示す。好ましくは、本発明による対象は、ヒトである。

本明細書で使用する場合、用語「治療（treatment）」、「治療（treat）」または「治療（treating）」は、疾患の治療（therapy）、防止（prevention）、予防（prophylaxis）および遅延（retardation）などの患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。特定の実施形態では、このような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する対象への１種以上の治療剤の投与の結果として、疾患の広がりまたは増悪を最小限にすることを指す。

特に、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、血栓性または出血性疾患を治療するために使用することができる。前記血栓性または出血性疾患としては、血栓性または塞栓性虚血、深部血腫、動脈または静脈閉塞症、脳出血または血腫、および眼出血または血腫が挙げられる。

より特定の実施形態では、前記血栓性または出血性疾患は、実質内出血または血腫、脳室内出血または血腫、くも膜下出血または血腫、加齢黄斑変性、網膜中心閉塞症、硝子体出血、外傷性または非外傷性の深部血腫、および、脳血腫または癌に対する介入後の血腫を含めたあらゆる術後血腫からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、血栓性または出血性疾患は、実質内出血または血腫、脳室内出血または血腫、およびくも膜下出血または血腫などの脳出血または血腫である。

本開示はまた、上記のようなナノ粒子または組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象における血栓性または出血性疾患を治療するための方法に関する。

本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「有効量」は、状態（state）、障害（disorder）または状況（condition）を治療するために対象に投与した場合、治療として奏功し、特に血栓溶解を誘導し、血栓の重量を減少させるのに十分である組成物の量を意味する。治療有効量は、化合物、製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、身体状況および応答性によって変化する。

本明細書に記載のナノ粒子または組成物の投与は、当業者に知られている任意の手段によって行うことができ、限定されるものではないが、静脈内投与または病変部内投与が挙げられる。

実質内または脳室内の出血または血腫を含む、脳内出血または血腫の特定の場合、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、脳内経路を介して投与することができる。

くも膜下出血または血腫の特定の場合、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、局所的に投与することができる。

深部血腫の特定の場合、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、筋肉内または関節内経路を介して投与することができる。

髄内脊髄出血の特定の場合、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、髄内経路を介して投与することができる。

眼出血の特定の場合、本明細書に記載のナノ粒子または組成物は、眼内経路を介して投与することができる。眼内経路としては、硝子体内投与および眼窩底経路投与が挙げられる。

したがって、好ましくは、ナノ粒子または組成物は、注射可能な製剤として処方されてもよく、また、注射可能な製剤に薬学的に許容可能な媒体、例えば等張、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等またはこれらの塩の混合物）、または、場合によっては、滅菌水または生理食塩水を添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする、乾燥、特に凍結乾燥組成物として処方されてもよい。

本開示に従った先に記載したようなナノ粒子または組成物の対象への投与は、用量依存的に有益な効果を示しうる。したがって、広い範囲内で、より大量の組成物の投与は、より少ない量の投与よりも高い有益な生物学的効果を達成することが期待される。さらに、毒性が見られるレベル未満の投与量での有効性も企図されており、任意の好都合な方法で実施することができる。

任意の場合に投与される上記のようなナノ粒子または組成物の特定の投与量は、当業者によく知られているように、投与されるナノ粒子または組成物、投与部位に有効に送達できる組成物の量、治療または抑制すべき疾患、対象の状況、および組成物の活性または対象の応答を改変し得る他の関連する医学的因子に従って調節されることが理解されよう。

例えば、特定の対象に対するナノ粒子または組成物の特定の用量は、年齢、体重、一般的な健康状態、食事、投与のタイミングおよび様式、排泄率、組み合わせて使用される薬物、ならびに治療が適用される特定の障害の重症度に依存する。所定の患者に対する投与量は、慣用の考慮事項、例えば、適切な慣用の薬学的プロトコルによる、本明細書に記載の組成物および既知の薬剤の活性差の慣用的比較によって決定することができる。組成物は、単回投与スケジュールで、または複数回投与スケジュールで投与することができる。

高濃度でプラスミノーゲン活性化因子の徐放を可能にする上記のような組成物の製剤は、有利には、任意にレスキュードーズの可能性を伴う単回投与で与えることができる。

先に述べたようなナノ粒子または組成物の適切な投与量範囲は、投与経路に応じて、約０．００５～１ｍｇ／ｍＬ血液／日、好ましくは０．０１～１ｍｇ／ｍＬ血液／日の範囲、好ましくは約０．０３～０．２０ｍｇ／ｍＬ血液／日の範囲の数百マイクログラムのオーダーの薬剤であってよい。

特定の実施形態では、先に述べたようなナノ粒子または組成物の好適な投与量は、血腫の体積に対して独立して０．３～３ｍｇ／日の範囲内であってもよい。

組成物の調製方法
別の態様では、本開示は、上記のような組成物を調製する方法に関する。特に、前記方法は、上記のようなナノ粒子を調製する工程と、熱可逆性ポリマー中に前記ナノ粒子を添加する工程とを含む。

本開示によるナノ粒子は、様々な方法から得ることができる。非限定的な例として、ナノ粒子は、プラスミノーゲン活性化因子のナノ沈殿によって、または、ポリマー、脂質、多糖類、およびタンパク質を使用することによって得ることができる。特定の場合、前記ナノ粒子は、例えば、ｐＨ、塩濃度、溶解度条件を変更することによって、または当業者によってよく知られている非溶媒の添加によって、ナノ沈殿によって得ることができる。

好ましい実施形態では、前記ナノ粒子は、ＷＯ２００９／０４３８７４に記載されるように、プラスミノーゲン活性化因子をポロキサマーと組み合わせてナノ沈殿させることによって得られる。前記方法は、前述のようにプラスミノーゲン活性化因子とポロキサマーとを含む水溶液を調製するステップと、得られた溶液を、プラスミノーゲン活性化因子をポロキサマーと組み合わせて沈殿させるのに十分な量のタンパク質沈殿試薬と接触させて、プラスミノーゲン活性化因子－ポロキサマーナノ粒子を形成させるステップと、を含む。

プラスミノーゲン活性化因子の酵素コアを保護しながらナノ沈降性を向上させる観点から、ナノ粒子形成前の水溶液中の前記ポロキサマーの濃度として、４ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは４ｍｇ／ｍＬを用い、ナノ粒子形成前の水溶液中の前記プラスミノーゲン活性化因子の濃度として、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１～４ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬを用いることが特に好ましい。

本明細書で使用する場合、「タンパク質沈殿試薬」とは、タンパク質、特に上述の本開示によるプラスミノーゲン活性化因子の沈殿を可能にする試薬を意味する。好ましい実施形態では、前記タンパク質沈殿試薬は、溶媒であり、より好ましくは生体適合性溶媒である。本明細書で使用する場合、「生体適合性」とは、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題となる合併症を起こさせることなくヒトおよび動物の組織と接触させるのに適している溶媒を指す。

好ましくは、タンパク質沈殿溶媒は、テトラグリコールまたはテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテルとも呼ばれるグリコフロール（ＣＡＳ：３１６９２－８５－０）、または２－メチル－２，４－ペンタンジオールとも呼ばれるヘキシレングリコール（ＣＡＳ：１０７－４１－５）、好ましくはタンパク質沈殿溶媒はグリコフロールまたはヘキシレングリコールである。

グリコフロールまたはヘキシレングリコールの量は、タンパク質沈殿溶媒および水溶液からなる最終量の８０％～９９％を占めうる。

水相とタンパク質沈殿溶媒の体積比、ポロキサマーの濃度、イオン強度およびタンパク質の質量の３つのパラメータを調整することによって、タンパク質の沈殿収率をさらに最適化することができる。

タンパク質沈殿溶媒は、ＰＡをナノサイズ粒子として沈殿させるのに十分な量で使用される。ポロキサマーの存在下でＰＡのナノ沈殿を誘導するためには、タンパク質沈殿溶媒／水溶液の体積比が、５～１００の範囲、好ましくは５、１０、２０、より好ましくは５であれば一般に十分である。好ましい実施形態では、水相とタンパク質沈殿溶媒の体積の比率は、１：５である。

ＰＡ－ポロキサマーナノ粒子の形成は、広い温度範囲で起こり得る。したがって、好ましくは、タンパク質沈殿溶媒は、１～２５℃の範囲の温度で、ＰＡおよびポロキサマーを含む前記溶液に接触される。より好ましくは、２～１０℃の範囲、最も好ましくは約４℃の温度でインキュベートされる。実際、ＰＡ－ポロキサマー粒子の形成は、低温でより再現性があることが観察されている。

非イオン性界面活性剤または塩をタンパク質沈殿試薬と組み合わせて使用することにより、タンパク質の沈殿を促進および／または増強し、特に沈殿のより良い収率に到達することができうる。

したがって、特定の実施形態では、水溶液は、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０、４０、６０または８０の群から選択されるもの、より好ましくはポリソルベート２０を含む。

別の特定の実施形態では、水溶液は塩を含む。塩の濃度は、好ましくは、０．０１Ｍ～３Ｍの範囲である。好ましくは、塩は、水溶性電解質である。トリス［ヒドロキシメチル］－アミノメタン、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４またはこれらの混合物を使用することができる。これらのうち、ＮａＣｌが特に好ましい。

水溶液の塩および界面活性剤濃度は、広い範囲で変化し得る。所定の量のプラスミノーゲン活性化因子について、一定の溶液ｐＨ、一定の温度、および水溶液／タンパク質沈殿溶媒の一定の体積比で、当業者は、タンパク質のナノ沈殿が認められるまで、典型的には塩および／または界面活性剤を増量することによって、ルーチンワークによって最小量の適切な塩濃度および／または界面活性剤を決定することができる。

上記のプロセスから得られたナノ粒子は、従来の任意の方法を用いて液相から回収することができる。

好ましい実施形態において、本開示の前記プラスミノーゲン活性化因子を含むナノ粒子を、上記のような熱可逆性ポリマー中にさらに添加して、室温で注射可能で、プラスミノーゲン活性化因子を体内で徐放することができる組成物を得ることができる。

好ましい実施形態において、前記熱可逆性ポリマーは、ポロキサマー４０７であり、好ましくは１５～２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１７～２３％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１７％（ｗ／ｖ）の濃度である。

発明の実施に使用するための配列
ＯｐｔＰＡ成熟タンパク質配列（配列番号：１）（下線はＷ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ変異）
SYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTREYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFSIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP

材料および方法
ヒト血液サンプル
ヒト血液サンプルおよび誘導体は、フランス血液事業団（French Establishment for Blood）から入手し（規約ＰＬＥＲ－ＵＰＲ／２０１８／０４１）、献血者に関する研究はフランス研究省に申告した（宣言書ＤＣ－２０１８－３１５４）。すべての血液サンプルを、２．７ｍｌの３．２％緩衝クエン酸ナトリウム溶液で予めクエン酸処理したチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標），Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，ＵＳＡ）に採取した。サンプルは、その抽出日に受け取り処理し、使用前は４℃で保存した。

ＯｐｔＰＡの製造およびｔＰＡバリアントの調製
ｒｔＰＡ（アルテプラーゼ）およびメタライズ（Metalyse）（テネクテプラーゼ，ＴＮＫａｓｅ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＯｐｔＰＡはＣａｔａｌｅｎｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、および塩化カルシウムはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ｄＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））およびＨＥＰＥＳはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。

合成リン脂質を添加した組換え組織因子（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標））は、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ４４４はＢｉｏｍｅｄｉｃａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。血栓溶解検査用Ｓ－ＥＸＴＥＭ基質およびＲＯＴＥＭ ｄｅｌｔａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔはＷｅｒｆｅｎ（Ｌｅ Ｐｒｅ Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）より入手した。

ｒｔＰＡおよびＴＮＫａｓｅは、製造業者の説明に従って再懸濁した。ＯｐｔＰＡは、Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の専有技術であるＧＰＥｘ（登録商標）技術を使用して製造した。タンパク質を単離するための３つの一連の交換クロマトグラフィーカラム、およびＮａＣｌ、ＰＯ_４およびアルギニンを含むバッファー中でコンディショニング後、おおよそ９０％の純度が達成された。すべてのサンプルを、ナノ製剤化前に、ＨＥＰＥＳ ０．３５Ｍ ｐＨ＝７．４でリコンディショニングした。ＯｐｔＰＡは、発現細胞のミニプール（本書の残りの部分ではＯｐｔＰＡと記載）または固有の選択クローン（ＯｐｔＰＡ_１５１）のいずれかから製造した。濃度は、モル吸光係数（ε＝１．６９Ｍ^－１．ｃｍ^－１）を用いて算出した。

活性測定
製品のための製剤選択の過程では、タンパク質の活性を測定するために４つの試験を使用した。

アミド分解活性
プラスミノーゲン活性化因子を発色性基質（２μＭ）（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ４４４（メチル－Ｄ－シクロヘキサチロシル－グリシル－アルギニンパラニトロアニリンアセテート））の存在下でインキュベートした。反応は、３００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ トリス－イミダゾール ｐＨ＝８．４を含むバッファー中、最終容量２００μＬで３７℃で行った。プラスミノーゲン活性化因子バリアントの酵素活性は、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ ＥＬｘ８０８）で、波長４０５ｎｍで３０分かけて単位時間当たりに発生する遊離発色団（ｐＮＡ）の吸光度の増加を測定することにより決定した（初速測定法）。解析は、２～５回の独立した実験から５～１０種類の濃度をデュプリケートで行った。中央値と分布をプロットする。

線溶活性
ヒト血漿のプール（３人のドナー）に、２０ｍＭ塩化カルシウム、および、ｔＰＡバリアントの各々を１．５、２．０、２．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。血栓溶解までの時間を、３７℃で４０５ｎｍでのＯＤ測定により記録した。解析は５つの独立した実験からデュプリケートで行った。結果は、フィブリン凝塊の濁度を比較するためにＯＤｍａｘとして表し（中央値と分布をプロット）、線溶を比較するために５０％の血栓溶解を得るために必要な時間として表した。中央値と分布をプロットする。

血栓溶解活性
Ｅｘ ｖｉｖｏトロンボエラストグラフィーアッセイのために、血液をフランス血液事業団により採取した。新鮮血液（アッセイ毎に３００μＬ、６時間以内に使用）を、ｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡ（０．６および０．９μｇ／ｍｌ）ならびにＳ－ＥＸＴＥＭ基質の存在下で回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ ｄｅｌｔａ、ＴＥＭ（登録商標））を用いて検討した。プラスミノーゲン活性化因子はＨＥＰＥＳバッファー（ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４，ＮａＣｌ １５０ｍＭ）で希釈した。凝固時間（ＣＴ：Clotting Time）、最大血栓硬度（ＭＣＦ：Maximal clot firmness）および血栓形成率（ＣＦＲ：Clot Formation Rate）を測定し、凝固ステップの変化の特徴付けと定量化を行った。溶解開始時間（ＬＯＴ：Lysis Onset Time、ＭＣＦが１５％減少するのに必要な時間）、血栓溶解率（ＣＬＲ：Clot Lysis Rate）および曲線下面積（ＡＵＣ：area under curve）を測定し、血栓溶解の特徴づけと定量化を行った。解析は５～７人の独立したドナーに対して行った。結果は平均値および９５％信頼区間で示した。

プラスミノーゲン活性化
プラスミノーゲン活性化因子は、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，０．２５μＭ）およびｐＮＡＰＥＰ１７５１（Ｃｒｙｏｐｅｐ，０．６ｍＭ）の存在下でインキュベートした。反応は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス－イミダゾール ｐＨ＝８．０を含むバッファー中、最終容量５０μＬで３７℃で行った。プラスミノーゲン（ＡｔＰＡ）にプラスミノーゲン活性化因子が作用して変換されたプラスミン（ＡＰｌｎ）の酵素活性は、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ ＥＬｘ８０８）で、波長４０５ｎｍで１８時間かけて単位時間当たりに発生する遊離発色団（ｐＮＡ）の吸光度の増加を測定することによって決定した。ＡＰｌｎは、時間の関数としての傾きの算出によって決定されるＡｔＰＡの一次導関数である（Ａｐｌｎ＝ｄＡｔＰＡ／ｄｔ（式中、ｄＡｔＰＡ≠０））。

ｒｔＰＡバスに浸漬したｅｘ ｖｉｖｏの１ｍＬのヒト血栓
血液はフランス血液事業団によって採取した。各実験に４人の血液サンプルをプールした。血栓形成は、合成リン脂質（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標））を添加した組換え組織因子と、塩化カルシウム溶液１Ｍを最終血栓体積１．００ｍＬのそれぞれ２％および２．５％添加することで誘導した。血栓は３７℃で一晩インキュベートした。実験当日、ｒｔＰＡ（アルテプラーゼ）の新鮮溶液を調製した。Ｅｘ ｖｉｖｏの１ｍＬの血栓を１５ｍｌバスで以下の条件に供した：
－ ＰＢＳへの連続ばく露（偽処置）、
－ ｒｔＰＡへの連続ばく露（３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および１ｎｇ／ｍＬ）、
－ ４時間毎に３０μｇ／ｍＬのｒｔＰＡに１５分間間欠的にばく露、その間に続いてＰＢＳ浸漬、
－ ３０μｇ／ｍＬのｒｔＰＡに１５分間ばく露、続いてＰＢＳに浸漬。

血栓溶解を推定するために、処置開始前と異なる時点（１ｈ、３ｈ、５ｈ、７ｈ、および２４ｈ）で血栓を採取し、重量を測定した。結果は、７つの独立した実験からの相対残存重量の平均±標準偏差（ＳＤ）として示した。

ナノ製剤化（nanoformulation）
ＰＥＰＴＩＤＯＴＳ（登録商標）は、ＣＡＲＬＩＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ専有のナノスケールのプレ製剤化／製剤化技術で、ペプチドおよびタンパク質をドラッグデリバリーシステムに封入する前に濃縮および安定化するための解決策を提供する。本技術は、タンパク質またはペプチドの水溶液にタンパク質沈殿溶媒を添加することで、安定したナノ粒子（ナノ沈殿物）の形成をもたらす。

プラスミノーゲン活性化因子のナノ沈殿のために、ポロキサマーＰ１８８を、ＨＥＰＥＳバッファー中のｒｔＰＡタンパク質の溶液に、室温で穏やかに混合して溶解する。ポロキサマーＰ１８８は、ｒｔＰＡタンパク質溶液中で濃度４ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬが得られるように添加する。ｒｔＰＡタンパク質の濃度は、一般に１～３ｍｇ／ｍｌである。

４ｍｇ／ｍｌ～２５ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を含むＨＥＰＥＳバッファーに溶解したｒｔＰＡタンパク質を、タンパク質沈殿溶媒を加えることでナノ沈殿させる。ｒｔＰＡタンパク質の沈殿に使用されているタンパク質沈殿溶媒は、テトラグリコール（グリコフロール）である。タンパク質のナノ沈殿に使用できる他のタンパク質沈殿溶媒の例は、ｍＰＥＧ４００およびへキシレングリコールである。

ｒｔＰＡタンパク質のナノ沈殿のために、溶媒（すなわちタンパク質水溶液）と非溶媒（すなわちテトラグリコール）の比率が１：５となるようにテトラグリコールを添加する。２つの溶液を穏やかに撹拌し、冷蔵庫で３０分間インキュベートする。その後、ナノ沈殿したタンパク質を遠心分離（１００００ｇ、３０分）により回収する。上清は廃棄する。

前のステップの完了後に得られた遠沈管内のタンパク質ペレットを、１７％（ｗ／ｖ）ポロキサマーＰ４０７溶液で再懸濁する。タンパク質ペレットを、Ｐ４０７溶液に再懸濁し、均一な混合物を得る。ポロキサマーＰ４０７溶液に懸濁したｒｔＰＡタンパク質の最終濃度を、ＨＰＬＣ－ＵＶ分析によって測定する。

Ｅｘ ｖｉｖｏ５ｍＬヒト血液血腫の分解
ＥＦＳからの血液サンプルを、同日に受け取り、抽出した。実験日当たり６名から２本の血液サンプルを受け取った。受け取ったサンプルをすべてプールし、５０ｍＬファルコンチューブに分注した。血栓形成を、先に詳述したように、合成リン脂質（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標））およびＣａＣｌ_２を添加したリコンビナント組織因子の添加によって誘導した。５ｍＬの血栓を３７℃で一晩（１２時間以上）インキュベートした。Ｅｘ ｖｉｖｏ５ｍＬ血栓を、以下の条件に供した：

ａ）作業者にとって容易な注入を達成するためのキャリア液およびその濃度の評価（１７％－Ｐ４０７、２０％－Ｐ４０７、２３％－Ｐ４０７）、
ｂ）血栓溶解を達成するためのＰ４０７溶液に担持させたｒｔＰＡナノ沈殿物の量の評価（０．０３ｍｇ／ｇゲル～１．００ｍｇ／ｇ）、
ｃ）血栓溶解を達成するためのＰ４０７溶液に担持させたＯｐｔＰＡナノ沈殿物の量の評価（０．０３ｍｇ／ｇゲル～１．００ｍｇ／ｇ）。

実験当日、２５Ｇ０．５ｍｍ×１６ｍｍシリンジ（ＢＤｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（商標）３）を用いて、試験溶液を血栓の中心部に注入した。ネガティブコントロールの血栓（偽薬群）には、４００μｌのｄＰＢＳを血栓の中心部に注入した。ポジティブコントロールの血栓には、ＭｉｓＴＩＥ臨床試験プロトコルを模倣して、再溶解した１．００ｍｇ／ｍＬｒｔＰＡ（アルテプラーゼ）を４時間間隔で３回（３＊１３３μｌ＝合計４００μｌ）、同じく血栓の中心部に注入した。血栓溶解を推定するため、処置開始前と実験終了時（９時間）に血栓を採取し、重量を測定した。結果を、最初の評価（ａ）については２回の実験から、最後の２つの評価（ｂ）および（ｃ）については６～７回の独立した実験から得られた相対残存重量の平均±標準偏差（ＳＤ）として示した。

統計解析
統計学的検定については、各結果について詳述する。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．０およびＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５．０）を用いて行った。

血栓溶解量は、処置後の相対残存重量パーセントで表した。これは、治療後の最終重量（Ｗｆｉｎａｌ）を処置前の初期重量（Ｗｉｎｉｔｉａｌ）で除し１００を掛けたものに相当する（式１）。
相対残存重量％＝Ｗ＿ｆｉｎａｌ／Ｗ＿ｉｎｉｔｉａｌ×１００
式１：処置後の相対残存重量パーセントを求めるために使用した計算式

放出試験
ＲＰ－ＨＰＬＣ法によるＯｐｔＰＡ測定
ＯｐｔＰＡは、ＵＳＰ４システムにおいてＨＰＬＣ法を用いて定量した。簡単に、パラメータは以下の通りであった：Ｃ４カラムＪｕｐｉｔｅｒ（１５０×４，６ｍｍ，５μｍ，３００Å）；移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、脱イオン水中Ｖ／Ｖ；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、アセトニトリル中Ｖ／Ｖ、および流速１．２ｍＬ／分。タンパク質は２２０ｎｍに検出され、予想される保持時間は約８．８～９．５分であった。

ＵＳＰ４溶出法
欧州薬局方（２．９．３章）および米国薬局方（＜７１１＞章）に記載されているコンベンショナルフロースルーセル法に基づき開発した。本法は、フロースルー・セル、または米国薬局方の用語であるＵＳＰ４と表記する。

溶出システム（ＳＯＴＡＸ ＣＥ７ Ｓｍａｒｔ）は、一定の溶出量を使用できる閉ループシステムとして構成され、ピストンポンプ（ＳＯＴＡＸ ＣＰ７－３５）およびオフラインＨＰＬＣ測定を使用するものであった。

実験は、５０ｍＬの溶出媒体（０．９％ＮａＣｌ、バッファーｐＨ７．４中）中５００ｍｇのＯ２Ｌ－００１（ゲル１ｇあたりタンパク質１ｍｇ）のサンプルサイズを使用することで行った。これは、溶出媒体中１０μｇ／ｍＬのタンパク質（ＯｐｔＰＡ）の最終濃度に相当する。

結果
ＯｐｔＰＡは、ｒｔＰＡと比較して、オフターゲット活性を低減している
フィブリン非存在下では、最適化された組換えｔＰＡ（ＯｐｔＰＡ、Ｗ２５３Ｒ／Ｒ２７５Ｓ ｔＰＡ）がプラスミノーゲンを模倣した発色基質であるＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ｒｔＰＡを切断する活性は、ｒｔＰＡと比較して６３％の顕著な低下を示した（ｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡの中央値はそれぞれ１．０１および０．３７，ｎ＝４，ｐ＜０．０５，両側Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定，図１Ａ）。

興味深いことに、ＯｐｔＰＡのアミド溶解活性は、試験した試験濃度範囲、０～２０μｇ／ｍｌにおいて、ｒｔＰＡで記録されたものより低い線形の用量応答性を示した（図１Ｂ，線形回帰，傾きおよび９５％信頼区間：ｒｔＰＡ ２８８．６ｍＯＤ／秒［２７５．０；３０２．２］およびＯｐｔＰＡ １０７．５ｍＯＤ／秒［９２．４；１２２．６］，各濃度についてｎ＝４，ｐ＜０．０００１，Ｆ検定）。次に、全血漿血栓溶解アッセイにおける線溶活性について、ＯｐｔＰＡをｒｔＰＡと比較した。

ＯｐｔＰＡの添加は、ｒｔＰＡと比較すると、線溶前のフィブリンマトリックスの形成を遅らせたり減少させたりしなかった（ＯＤｍａｘ中央値はｒｔＰＡについては０．８９，ＯｐｔＰＡについては０．９３，Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で有意差なし，ｎ＝５，図１Ｃ）。試験した濃度範囲では、ＯｐｔＰＡはｒｔＰＡと比較して５０％溶血に達するまでに有意差を示さなかった（ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は、１．５μｇ／ｍｌで－１３．７７分［－２４．００；－３．５３］，ｎｓ；２．０μｇ／ｍｌで－１３．９０分［－２４．１４；－３．６７］，ｎｓ；２．５μｇ／ｍｌで－２．３３分［－１２．５７；＋７．９１］，ｎ＝５，２ｗａｙ ＡＮＯＶＡ，続いてＳｉｄａｋの多重比較検定）。

ＯｐｔＰＡを生産する固有クローンの同定と単離に続き、本発明者らは、ＯｐｔＰＡ_１５１（ＧＰＥＸ（登録商標）テクノロジーで生産、クローン番号１５１－７９）と名付けた目的のタンパク質の酵素活性を、プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化に続いてｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ基質およびｐＮＡＰＥＰ－１７５１基質で特性評価した。ＯｐｔＰＡ_１５１の活性をアルテプラーゼ（ｒｔＰＡ）と比較した。

単離クローンから得られた組換えタンパク質ＯｐｔＰＡ_１５１は、ミニプールから得られた組換えタンパク質と同じプロファイルを示した。ＯｐｔＰＡ_１５１は、アルテプラーゼと比較して、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ｒｔＰＡを切断する活性が著しい６８％の低下を示した（ｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡ_１５１の正規化中央値はそれぞれ１．０３および０．３５，ｎ＝５，ｐ＜０．０１，両側Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定，図２Ａ－Ｃ）。

次に、例えばゼラチナーゼ（ＭＭＰ）を活性化することによって、今度は出血性形質転換の重要な役割を果たすことが知られているプラスミンにプラスミノーゲンを活性化するＯｐｔＰＡの活性を記録した。ｔＰＡもプラスミノーゲンもｐＮＡＰＥＰ基質を切断しないため（ここでは示していない）、４０５ｎｍでの吸光度の増大はプラスミンの生成を反映する。一次微分によりプラスミン活性を算出し、さらに濃度の関数として最大プラスミン活性をプロットすることができる。線形回帰の結果、アルテプラーゼ（ｒｔＰＡ）とＯｐｔＰＡ_１５１との間には、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を誘発する活性に差があり、ＯｐｔＰＡ_１５１は、著しく低い能力を有することが確認された（傾きおよび９５％ＣＩ：ｒｔＰＡ １．９ｍＯＤ／分／ｎＭ［１．６；２．２］およびＯｐｔＰＡ ０．３ｍＯＤ／分／ｎＭ［０．１；０．５］，ｎ＝５；ＯｐｔＰＡ_１５１およびｒｔＰＡについて、それぞれ６および３つの濃度を試験，ｐ＜０．０００１；Ｆ検定）（図３，左）。これらのデータを正規化すると、ｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡの中央値はそれぞれ９９％および１５％であることが示された（ｎ＝５，ｐ＜０．０１，両側Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定，図３，右）。

目的のタンパク質のレベルでも、プラスミノーゲンからプラスミンを生成する能力に関しても、ＯｐｔＰＡは、ｒｔＰＡに対して、フィブリン非存在下での酵素活性が低く、興味深いより安全なプロファイルを示した。

単離クローンから精製したＯｐｔＰＡタンパク質（ＯｐｔＰＡ_１５１）は、細胞株のプールから精製したタンパク質と同様の性能を示し、本発明の細胞株を用いた確実で予測可能な結果を示す。

ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡは同程度の血栓溶解能を示した
トロンボエラストグラフィ（ＲＯＴＥＭ ｄｅｌｔａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間のさらなる比較解析を行った。２つの血栓溶解剤を０．６および０．９μｇ／ｍｌで新鮮ヒト血液（採取６時間未満）で比較した。これらの濃度は、ＥＸＴＥＭ－Ｓ基質を用いて血栓の形成および１時間での完全な溶解を観察するために選択した。

２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、続いてＳｉｄａｋの多重比較検定により、凝固パラメータ（凝固時間、最大血栓硬度、血栓形成率）に対する試験した薬剤および濃度の影響は認められなかった（図４Ａ－Ｃ）。試験した濃度では、ｒｔＰＡおよびＯｐｔＰＡは、凝固プロセスの開始（凝固時間、試験開始から２ｍｍの大きさに達するまでの時間）（ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は－０．０．６μｇ／ｍｌで－０．４５秒［－３．９９；＋３．１０］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで－０．４７秒［－３．７２；＋２．７８］，ｎｓ，ｎ＝５－７）にも、血栓形成率（ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は０．６μｇ／ｍｌで－０．０１°［－１．８４；＋１．８１］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで＋１．３０°［－０．３７；＋２．９８］，ｎｓ，ｎ＝５－７）にも、最大血栓硬度（ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は０．６μｇ／ｍｌで－１．４３ｍｍ［－４．６６；＋１．８０］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで－１．５９ｍｍ［－４．５６；＋１．３８］，ｎｓ，ｎ＝５－７，２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、続いてＳｉｄａｋの多重比較検定、図４Ａ－Ｃ）にも、明確な影響を与えなかった。

溶解開始時間、血栓溶解率およびＡＵＣには薬物の影響がないことが２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより明らかとなった。これらの３つのパラメータには、濃度の非常に大きな影響が観察された（ｐ＜０．００１）。

多重比較では、溶解開始時間（図４Ｄ，ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は０．６μｇ／ｍｌで－３１８．９秒［－７２９．１；＋９１．３１］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで－２４５．８秒［－６３４．８；＋１４３．１］，ｎｓ，ｎ＝５－７）、血栓溶解率（図４Ｅ，ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は、０．６μｇ／ｍｌで－０．６９°［－１２．６０；＋１１．２２］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで－１．１４°［－１３．０５；＋１０．７７］，ｎｓ，ｎ＝５－７）、および、曲線下面積（図４Ｆ，ｒｔＰＡとＯｐｔＰＡの間の平均差［９５％ＣＩ］は、０．６μｇ／ｍｌで－１１４．１ｍｍ^２［－７４５；＋５１６］，ｎｓ；０．９μｇ／ｍｌで－１９９．８ｍｍ^２［－８２０；＋４２１］，ｎｓ，ｎ＝５－７，２－ｗａｙＡＮＯＶＡに続くＳｉｄａｋの多重比較検定）に関して、試験した濃度でＯｐｔＰＡとｒｔＰＡを区別することはできなかった。

低濃度ｒｔＰＡへの連続ばく露は、高濃度ｒｔＰＡへの短時間ばく露の繰り返しと同程度に、構成された血腫の液状化が効率的である
出血性脳卒中による血腫は、虚血性脳卒中の血栓とは、血栓の体積、血栓の構成、血栓に加わるせん断応力のパラメータが異なっている。したがって、血腫は血流の外で形成されるので、本発明者らは、接触時間を長くした低用量のプラスミノーゲン活性化因子の、より強く短いばく露に対する効果に驚いている。

効率的な血栓溶解を達成するために必要な最小限のｒｔＰＡ濃度を評価するために、一晩退縮させた（retracted）１ｍＬの血栓をｒｔＰＡ含有溶液に浸漬した。実験の最初の組では、発明者らは、１ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまでのｒｔＰＡ濃度に２４時間連続ばく露した場合と、３０μｇ／ｍＬに１５分間繰り返しばく露した場合を比較した（図５）。

２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより、血栓溶解に対する時間（ｐ＜０．０００１）および処置（ｐ＜０．００１）の非常に強い影響が明らかとなった。高濃度ｒｔＰＡへの短時間ばく露（３０μｇ／ｍｌに１５分ばく露）は、低濃度への長時間ばく露（試験した４濃度でｎｓ）と比較して、処置後１時間で早くも有意な効果が認められ、速い血栓溶解をもたらした（ｐ＜０．０５）。１時間時点以降では、３０μｇ／ｍｌのｒｔＰＡへの１５分の３回ばく露のみが、２４時間後を除く各時点でネガティブコントロールと有意差があり、ここで、ｐ＝０．０８であり（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）、７時間後に差がピークとなった（３ｘ３０μｇ ｒｔＰＡと偽剤との間の平均差［９５％ＣＩ］は－４８．１４％、［－８７．９２；－８．３６］、ｐ＜０．０５、ｎ＝７］）。

連続ばく露については、いずれの条件でも処置開始１時間後には有意な効果は認められなかったが、その後１μｇ／ｍＬ連続ばく露条件では２４時間までに有意な血栓溶解が観察された。７時間の時点では、１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの連続ばく露の両方で有意な血栓溶解が認められた（平均差［９５％ＣＩ］は、－３３．０％［－５．６；－６０．４］，ｐ＜０．０５；－３９．３％［－７．２；－７１．４］，ｐ＜０．０５，それぞれｎ＝７）。興味深いことに、１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬのｒｔＰＡへの連続ばく露は、偽薬（ｎ＝７）と全く変わらなかった（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。

このアッセイの結論として、低濃度のｒｔＰＡの連続ばく露は、高濃度ｒｔＰＡの短時間ばく露の繰り返しと、構成された血腫を２４時間かけて液化させるのに少なくとも同程度に効率的である。

このモデルの曲線下面積解析は、３０μｇ／ｍｌで１５分間連続ばく露した場合、１μｇ／ｍｌで連続ばく露した場合に比べて２５％高い（３０．２任意単位（ＡＵ）対２４．０ＡＵ）、および１００ｎｇ／ｍｌで連続ばく露した場合に比べて１１５８％高い（３０．２ＡＵ対２．４ＡＵ）グローバルばく露（global exposure）を呈することを示している（図５－下）。血栓を低用量のプラスミノーゲン活性化因子（ここではｒｔＰＡ）に連続ばく露すると、一過性の高濃度ばく露と比較して、低濃度で同等の効率で血栓溶解が起こり、グローバルばく露は２５％～１０００％の範囲で減少する。

実験の第２組では、本発明者らは、連続ばく露の増加とともにより多くの血栓溶解が観察され得るか、またはプラトーに達したかどうかを観察するために、連続ばく露におけるｒｔＰＡの濃度を増加させた。ここで、ｒｔＰＡの濃度は、２４時間にわたって、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび３０μｇ／ｍＬとした（図６）。２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡでは、時間の影響は非常に強かったが，血栓溶解に対するｒｔＰＡ濃度の影響はないことが明らかとなった（それぞれ，ｐ＜０．０００１，ｐ＝０．０８）。ｒｔＰＡの連続処置（１μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬまで）と一連の（successive）ばく露処置（３×３０μｇ／ｍＬ）との間には統計的な差はなかった（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。

大きな血腫溶解を迅速に、よりよく達成するためには、酵素動態のために、ｒｔＰＡを０．１μｇ／ｍｌ超の濃度で数時間、確実に３時間超にわたり放出できる技術が、高濃度での複数回の注入と同程度に効率的であるはずである。

ナノ製剤化されたｒｔＰＡ（Ｐ４０７－ｒｔＰＡ）は高い血栓溶解活性を保持する
本発明者らは、ｒｔＰＡナノ粒子を、時間スケールでの徐放を可能にするポロキサマー４０７の溶液に懸濁した。ポロキサマーは、Ｔｓｏｌ－ｇｅｌ（溶液からゲルまでの温度）を細かく調整できる熱応答性挙動を示す合成高分子である。

したがって、ゲル１グラムあたり最大３．６ｍｇのｒｔＰＡ溶液を製造して、小針（２５Ｇ ０．５ｍｍ×１６ｍｍシリンジ（ＢＤｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（商標）３））を用いて血腫の中心部にそのような材料を注入することが可能であることを評価し、および、そのようなｒｔＰＡ製剤が血液を分解することができる能力を確認した。ポロキサマー候補を１７％、２０および２３％（ｗ／ｖ）Ｐ４０７溶液に製造（以下それぞれ１７－Ｐ４０７、２０－Ｐ４０７および２３－Ｐ４０７（ｒｔＰＡの濃度はそれぞれ３．６ｍｇ／ｇ；３．６ｍｇ／ｇおよび３．５ｍｇ／ｇ）と名付ける）し、「二項式（binomial）」血栓溶解実験（血栓が溶解されるか否か）で試験した。全ヒト血液から１ｍＬの血栓を前述のように１．５ｍＬエッペンドルフ（登録商標）に調製し、ポロキサマー溶液１００μｌを血栓の上に滴下した。２４時間後に液化を観察し、残った血栓を採取した。４つの候補により、すべての血栓が液状化した（図７）。

１７％Ｐ４０７候補は、血腫の中心部への注入に最適な適合性を有している
次に、これらの製剤について、５ｍＬの全血血腫において、血腫の中心部に薬剤を注入し、以前の実験に基づいて選択した時点である９時間時の血腫液化を測定した（図５）。すべての候補で高い血栓溶解効果が得られた（図８）。候補２０－Ｐ４０７－ｒｔＰＡおよび２３－Ｐ４０７－ｒｔＰＡは、１７－Ｐ４０７と比較すると、注射器の圧力を高くする必要があり、扱い難かった。そこで、本発明者らは、この選択工程から、０．０１ｍｇ／ｇ ｒｔＰＡから１ｍｇ／ｇ ｒｔＰＡまでの用量所見で拡張評価するために１７－Ｐ４０７－ｒｔＰＡを選択した。

ナノ製剤化プラスミノーゲン活性化因子は、標準的なｒｔＰＡと比較すると、血栓溶解効果が向上している
同じモデルで、ｒｔＰＡ １ｍｇ／ｍＬ（アルテプラーゼ、４００μＬを３回で注入、ＭｉｓＴＩＥプログラムを模して４時間ごとに１３３μＬ）、１７％Ｐ４０７を含むＰ４０７－ｒｔＰＡ（４００μｌ、単回注入で投与された濃度、０．０３ｍｇ／ｇ，０．１０ｍｇ／ｇ，０．３０ｍｇ／ｇ，１．００ｍｇ／ｇの範囲の濃度）（図９Ａ）のいずれかを注入後９時間後に５ｍＬ血腫の相対重量を測定した。

Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて、血栓溶解について、異なる候補を偽薬およびｒｔＰＡ １ｍｇ／ｍＬと比較した。残存物の正規化はＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定で確認した。偽薬群とｒｔＰＡ １ｍｇ／ｍＬ群の間に有意差が認められた（平均差［９５％ＣＩ］は＋４２．７１％［＋２７．７６；＋５７．６７］，ｐ＜０．０００１，ｎ＝７）。ポストホック解析（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）では、ｒｔＰＡ １ｍｇ／ｍＬと１７－Ｐ４０７－ｒｔＰＡ １ｍｇ／ｇの間で有意差が認められた（平均差［９５％ＣＩ］は＋１８．００％［＋３．０５；＋３２．９５］，ｐ＜０．０５，ｎ＝７）。同じ濃度で注入した場合、１７－Ｐ４０７－ｒｔＰＡはナノ製剤化されていないｒｔＰＡよりも効率的である。興味深いことに、ｒｔＰＡ １ｍｇ／ｍＬと１７－Ｐ４０７－ｒｔＰＡ ０．１０ｍｇ／ｇで観察された結果は類似しており（平均差［９５％ＣＩ］は－０．４３％［－１５．３８；＋１４．５３］，ｎｓ，ｎ＝７）、これは１０倍濃度の低いナノ製剤化ｒｔＰＡが、ナノ製剤化していないｒｔＰＡと同様の血栓溶解を達成できることを意味する。すべてのｒｔＰＡ群（非製剤化およびナノ製剤化）はＰＢＳと有意差があり、低濃度の１７－Ｐ４０７－ｒｔＰＡでさえも効率的な血栓溶解作用を示した（ｐ＜０．０００１，ｎ＝７）。

これらの実験は、０．０３ｍｇ／ｇ、０．１０ｍｇ／ｇ、０．３０ｍｇ／ｇ、１．００ｍｇ／ｇの範囲の濃度のＯｐｔＰＡ（１７－Ｐ４０７－ＯｐｔＰＡ，別名Ｏ２Ｌ－００１）で再現され、同様の結果が得られた（図９Ｂ）。残存物の正規性はＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定により確認した。すべてのプラスミノーゲン活性化因子群（非製剤化ｒｔＰＡおよびナノ製剤化ＯｐｔＰＡ）はＰＢＳと有意に異なり、これは、これらの群における効率的な血栓溶解活性を意味する（ｐ＜０．０００１，ｎ＝６）。Ｄｕｎｎｅｔｔの比較検定では、偽薬群とｒｔＰＡ１ｍｇ／ｍＬ群の間に有意差が示され、前回の実験と比較して非常に保存的な効果が認められた（平均差［９５％ＣＩ］は＋５７．５％［＋４５．３；＋６９．７］，ｐ＜０．０００１，ｎ＝６）。さらに、ｒｔＰＡ１．００ｍｇ／ｍｌと１７－Ｐ４０７－ＯｐｔＰＡ１．００ｍｇ／ｇの間でＤｕｎｎｅｔｔの調整による二者比較を行ったところ、これら２群間に有意差が示された（平均差［９５％ＣＩ］は＋２１．０％［＋８．８；＋３３．２］，ｐ＜０．００１，ｎ＝６）。また、ｒｔＰＡ１．００ｍｇ／ｍＬと１７－Ｐ４０７－ＯｐｔＰＡ０．３０ｍｇ／ｇの間にも有意差が注目された（平均差［９５％ＣＩ］は＋１３．２％［＋０．９；＋２５．４％］，ｐ＜０．０５，ｎ＝６）。ここでも、ｒｔＰＡ１．００ｍｇ／ｍＬおよび１７－ＯｐｔＰＡ０．１ｍｇ／ｇについて観察された結果は同様であり（平均差［９５％ＣＩ］は＋４．５％［－７．７；＋１６．７］，ｎｓ，ｎ＝６）、これは、１０倍濃度の低いナノ製剤化ＯｐｔＰＡが、ナノ製剤化していないｒｔＰＡと同様の血栓溶解を達成することを意味している。

放出試験
ナノ製剤化ＯｐｔＰＡ（Ｏ２Ｌ－００１）は、より優れた利益／リスクのバランスを意図して血栓溶解活性を増加させるために、安全な血栓溶解剤であるＯｐｔＰＡを持続的に存在させることができる、革新的な血栓溶解技術である。血腫における目的は、２４時間未満で血栓溶解剤を放出させ、液化を支援するが、鉄の放出による毒性を回避し、腫瘤効果の減少を促進させることである。この放出時間の範囲を確認するために放出期間を検討した。

溶出プロセスを６回繰り返した実験を行った。溶出分析前のゲル化時間は明確には特定できなかったが、興味深いことに、目的のタンパク質の放出には、最初の３０分間の激しい放出時間（初期担持用量の５０％が放出される）と、次の４～６時間の遅い放出（初期担持用量の１０％が放出される）との、２つのステップがある（図１０）。

これらの予備的な結果は、初期容量の影響を分析するために、いくつかの担持容量を用いた追加実験によって確認する必要がある。しかしながら、現段階では、この実験で観察された速度論は、第２フェーズで観察された遅い放出によって、Ｏ２Ｌ－００１のｒｔＰＡと比較して際立った効果（初期バーストでＯｐｔＰＡ単独として放出）を説明できること、および、以前の実験で観察されたとおり５ｍｌ血栓の血栓溶解を引き起こすために低濃度のＯ２Ｌ－００１しか必要としないことを強く示唆している。

プラスミノーゲン活性化因子ナノ沈殿物の高収率製造
ポロキサマー熱硬化性ゲルへのプロテアーゼの組み込みは、温度シフトに伴い、また、粘性係数（Ｇ’’）が弾性係数（Ｇ’）と交差し、ハイドロゲルの形成に至るのに伴い、ミセルが形成されるために制限される。ミセル中に捕捉されたプロテアーゼは、うまく放出されず、活性を失う。この限界を克服するために選ばれた解決策は、ポロキサマー中への封入の前にプラスミノーゲン活性化因子をナノ沈殿させて、ハイドロゲルの溶解とともにプロテアーゼを放出しやすくすることである。

ナノ沈殿は、プラスミノーゲン活性化因子の可逆的なナノ沈殿物の形成を可能にするために、上記のように行った。高収率のナノ沈殿を可能にするための変数は、濃度、目的のタンパク質のバッファー、タンパク質沈殿溶媒の性質、目的のタンパク質の体積とタンパク質沈殿溶媒の体積の比率、および添加物、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）またはＮａＣｌである。

本発明者らは、ｒｔＰＡのナノ沈殿を３０条件まで解析し、ＨＰＬＣ分析後にナノ沈殿収率が９０％より優れる４つの条件を選択した（表１）。

表１：ｒｔＰＡで試験したナノ沈殿条件。３種類のタンパク質沈殿溶媒、２種類の濃度のポロキサマー１８８、および添加物（ＮａＣｌおよびポリソルベート２０、ＰＳ２０）の添加を、得られたナノ沈殿物の分析前に試験した。

ナノ沈殿させたプラスミノーゲン活性化因子は、再懸濁後、プラスミノーゲンを模倣した発色基質（Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ４４４）に対する酵素活性を分析した（図１１）。ナノ沈殿物を１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＰＯ_４を含む溶液、ｐＨ＝７．４に再懸濁し、３０分間氷上に置いて完全に再懸濁した。ｒｔＰＡは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定で確認されたとおり（ｐ＜０．０１）、使用したタンパク質沈殿溶媒（テトラグリコール、ＴＧ、またはヘキシレングリコール、ＨＧ）の性質に対して感受性を有していた。ＰＳ２０の添加は、ナノ沈殿物の酵素活性を特に向上させたが（平均順位差－１０．５，ｐ＜０．０５，ｎ＝４，Ｄｕｎｎの多重比較検定）、沈殿収率は同等であった（ＨＧ４ 対 ＨＧ４ＰＳ条件で９０．０％，±１３．１ 対 ９２．０％ ±４．７，ｎ＝３）。試験した他の条件では、統計的な差はなかった（図１１Ａ）。

テトラグリコールと２０ｍｇ／ｍｌ Ｐ１８８でナノ沈殿させた一連のｒｔＰＡ溶液の酵素活性を調査し、次いで、これらのナノ沈殿物の線溶活性を測定して、ナノ沈殿ステップの血栓溶解能の保存性を確認した（図１１Ｂ－Ｄ）。４つのサンプルを、ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ４４４ ｒｔＰＡ基質に対する酵素活性評価に供した（ｎ＝５）。４つのサンプル間に統計的な差はなく（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定，ｐ＝０．９７）、４つのサンプルの平均酵素活性は１０８％±２８；１０７％±２４；１０８％±２４；１１５％±３０であり、これは、該プロセスの高い再現性を意味している（図１１Ｂ）。

ナノ沈殿ｒｔＰＡは、９６ウェルプレートにおける血栓溶解モデル試験において、非ナノ沈殿ｒｔＰＡと同様に凝固を阻害せず、変曲点（４０５ｎｍにおける最大濁度の５０％）に達する時間は２９．１分～３４．５分であった（ｎ＝５，バッチまたは濃度の影響は非有意，ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ，図１１Ｃ）。線溶活性（図１１Ｄ）に関しては、ナノ沈殿は低濃度でのｒｔＰＡの線溶活性を低下させ（０．４μｇ／ｍＬでｐ＜０．０００１，０．８μｇ／ｍＬでｐ＜０．００１）、その差は試験した最高濃度（１．６μｇ／ｍＬ）では統計的にもう差がなかった。実際、試験した最高濃度である１．６μｇ／ｍＬでは、５０％の血栓溶解を達成する時間の差は払拭された（血栓形成から１９．０分±４．４ 対 ４サンプルでは３３．２分±４．６，３２．１分±７．９，３０．２分±６．６，２６．２分±８．７（ｎ＝５））。興味深いことに、すべての条件下で完全な溶解が観察された。

ｒｔＰＡで特徴づけられたナノ沈殿条件を、ＴＮＫａｓｅおよびＯｐｔＰＡでも検証した（図１２）。テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ、ｒｔＰＡの第二世代）は、テトラグリコール中ではＰ１８８添加物の濃度に関わらず低い回収率を示し（２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８で１２％，４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８で１４％，各ｎ＝２）、ＨＧではより高い回収率を示した（２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８で７４％，４ｍｇ／ｍＬのＰ１８８で４８％，各ｎ＝２）（図１２Ａ）。２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８を加えたヘキシレングリコールにおけるナノ沈降後に高い酵素活性が記録されたとしても（１５２％±３４）、ＯｐｔＰＡはｒｔＰＡとして、Ｐ１８８の濃度に非依存的にヘキシレングリコールおよびテトラグリコールにおいて効率的にナノ沈降した。テトラグリコールでは、ナノ沈殿は、４ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬのＰ１８８の存在下でそれぞれ１１３％±３０および１３５．５％±２０の酵素活性の保存とともに明確で目に見えるペレットをもたらした（ｎ＝５）（図１２Ｂ）。試験した群間で統計的差異は観察されなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定，ｐ＝０，１１９）。

Claims (15)

1. 熱可逆性ポリマーと、プラスミノーゲン活性化因子を含むナノ粒子とを含む組成物。
2. 前記ナノ粒子がポロキサマーを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ポロキサマーがポロキサマー１８８、３３８および２３７からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ポロキサマーがポロキサマー１８８である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記熱可逆性ポリマーがポロキサマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記熱可逆性ポロキサマーがポロキサマー４０７である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記ポロキサマー４０７が、１５～２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１７～２３％（ｗ／ｖ）、好ましくは１７％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記プラスミノーゲン活性化因子が、ｒｔＰＡ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、パミテプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、デスモテプラーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記プラスミノーゲン活性化因子が、好ましくは配列番号：１の配列からなる、二重変異Ｗ２５３ＲおよびＲ２７５Ｓ ｔＰＡである、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
10. 医薬として使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 血栓性または出血性疾患の治療に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
12. 血栓性または塞栓性虚血、動脈または静脈閉塞症、深部血腫、脳出血または血腫、および眼出血または血腫からなる群から、好ましくは実質内出血または血腫、脳室内出血または血腫、くも膜下出血または血腫、加齢黄斑変性症、網膜中心閉塞症、および硝子体出血、外傷性か否かを問わないすべての深部血腫、脳内血腫または癌に対する介入後の血腫を含むすべての術後血腫から選択される血栓性または出血性疾患を治療するための、請求項１１に記載の使用のための組成物。
13. 実質内出血または血腫、脳室内出血または血腫、およびくも膜下出血または血腫などの、脳出血または血腫を治療するための、請求項１２に記載の使用のための組成物。
14. 熱可逆性ポリマーと、プラスミノーゲン活性化因子－ポロキサマーナノ粒子とを含む組成物を調製する方法であって、前記方法は、
    ｉ）プラスミノーゲン活性化因子とポロキサマーとを含む水溶液を調製するステップ、
    ｉｉ）得られた溶液を、プラスミノーゲン活性化因子をポロキサマーと組み合わせて沈殿させるのに十分な量のタンパク質沈殿溶媒と接触させて、プラスミノーゲン活性化因子－ポロキサマーナノ粒子を形成するステップ、
    ｉｉｉ）熱可逆性ポリマー中に前記ナノ粒子を添加するステップ
    を含む、方法。
15. ポロキサマー、好ましくはポロキサマー１８８と組み合わせて沈殿させたプラスミノーゲン活性化因子を含むナノ粒子。

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