JP2023525904A - ランダムアクセスアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）リアクターシステム - Google Patents

Abstract

本生物学的分析用ランダムアクセスＰＣＲリアクターは、一つのプラットフォームにある複数のＰＣＲリアクター、および前記プラットフォームにおける前記ＰＣＲリアクターのすべてに共有される光学システムを含む。前記光学システムは任意のイメージングの用意ができたＰＣＲリアクターの上方に移動できるように横断機構に固定されている。前記プラットフォームにおけるほかのＰＣＲリアクターはアクセスおよび交換が可能である。前記光学システムは前記リアクターにおけるすべてのサンプルに均一な光の分布を提供するライトパイプおよびライトガイドを有する。本光学システムのライトガイドは、１組の光反射構造を有し、前記構造は入射光が均一にテスト中のＰＣＲリアクターにあるすべてのサンプルに反射するように策略的に位置する。【選択図】図１

Description

本発明は、全体的に、光に基づく検出システム、たとえば、アルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ｑＰＣＲと略す）用自動化システム、デジタルＰＣＲ機器、ＤＮＡシークエンシング機器および抗原－抗体ＥＬＩＳＡ機器に関し、具体的に、これらの機器のための照明システムに関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸の体外における定量である。ＰＣＲは、医学および生物学の研究実験室において様々なタスク、たとえば、遺伝性疾患の検出、遺伝子指紋の同定、伝染病の診断、遺伝子のクローニング、親子鑑定やＤＮＡコンピューティングのために使用される。当該方法は、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、および遺伝子サンプルの急速な加熱と冷却が可能な機器（サーマルサイクラーと呼ばれる）によって自動化を実現させる。

典型的なＰＣＲ実験において、標的ＤＮＡが二本鎖に分解され、プライマーで合成され、ＤＮＡの量が倍になる。当該過程は大量のＤＮＡが合成されるまで繰り返される。このようなシンプルな遺伝子増幅技術は、ＤＮＡを迅速に増幅させることができる。ＰＣＲ技術は、短時間でごく少量の標的ＤＮＡを百万倍に増幅させることができることで、ＤＮＡ分子の検出と解析能力を大幅に向上させている。

ＰＣＲ過程を進行させるには、ＤＮＡ含有溶液に特定の温度変化をさせることにより、分離（融解）、プライマー結合（アニーリング）および複製（伸長）をさせる必要がある。分離は、高温、たとえば、９５℃で、アニーリングは、低温、たとえば、６０℃で行われる。しかしながら、この過程はサンプル量に非常に敏感であるため、最終の増幅の結果に大きな違いが生じることがある。ＰＣＲ反応は、早期遅滞期、対数増殖期およびプラトー期を含む。機器の感度は、主に、遅滞期に表れる。特定の機器の検出に十分な量の産物が蓄積すると、対数増殖期は開始する。最後のプラトー期では、産物がより効率的にプラマーとアニーリングを競争し、そして酵素の量が限られるようになり、増幅効率が低下する。多くの定量の情報は対数サイクルで見られるが、対数サイクルには、通常、４０サイクルのうちの４または５サイクルしか含まれない。

光学検出システムは、通常、リアクターにおける各サンプル管の蛍光発光強度を測定する、ＰＣＲにおける反応のインターロゲートに使用される。蛍光を測定するには、励起光をサンプル容器におけるサンプルに照射させ、サンプルにおける蛍光体から放出する光を検出する。通常、有効かつ効率的な光の光源からウェルへの送達が望まれる。定量ＰＣＲのための各サイクルにおける熱循環および蛍光モニタリングは、迅速サイクリングＰＣＲを含む当業者に既知の標準技術によって行われる。従来のＰＣＲ方法では、対数サイクルの確認は反応を複数の反応管に分け、異なる数のサイクル後にＰＣＲサンプルを検出する必要がある。光をサンプルプレートに導く光学システムは既知のもので、たとえば、米国特許６，９４２，８３７、７，３６９，２２７、６，８５２，９８６、および７，４１０，７９３号に記載されている。光をプレートにおけるサンプル容器に導いてサンプル容器からの光を検出する光学システムは本分野で既に開発されている。しかしながら、より有効に光をサンプル容器に送って、そしてそこからの光を受け取る光学システムがまだ望まれている。

リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技術は、通常のＰＣＲに基づいた蛍光標識されたプローブにおける蛍光を定量し、またはＰＣＲ過程全体における各蛍光色素をリアルタイムでモニタリングし、そして既知の鋳型の最終標準曲線を定量的に分析する方法である。

また、一つのＰＣＲ反応を多くの小さい独立したＰＣＲ反応に分け、各小さい反応に平均で標的核酸分子が多くとも一つ含まれるようにする、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）のような方法もある。各小さい反応にほぼ１または０個の標的核酸分子が含まれ、そしてＰＣＲ増幅終了時に陽性または陰性の２進数の読み取り値が出される。標的遺伝子の絶対的量は実際の標的分子を計数することによって決定され、対数増幅サイクル数および初期量の定量のための参照遺伝子との比較に依存しない。大量の分画を使用することにより、ｄＰＣＲはｑＰＣＲよりも精確な倍率の差の検出に有用である。

一般的に、ｑＰＣＲ装置はリアルタイムＰＣＲ検出で、主に、温度制御システムと蛍光検出／モニタリングシステムの２つの機能モジュールがある。このような装置は、主に、サンプル台、遺伝子増幅熱循環部品、蛍光検出光学システムおよびマイクロ回路制御システムからなる。ここで、遺伝子増幅熱循環部品は基本的に同じようなものである。蛍光検出システムは、蛍光励起、放射、光学システム、蛍光検出、蛍光検出手段、および制御システムを含む。よく使用される蛍光励起光源は、ハロゲンランプ、レーザー、またはＬＥＤである。蛍光検出は、通常、光電子増倍管、冷却ＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラ、またはフォトダイオードによって実現される。

ｑＰＣＲは、現在、最も使用されるシステムの一つであるが、既存のシステムにいくつか問題がある。一つは、マイクロチップにおける測定されるサンプルのアレイ全体の熱の均一性を得ることである。ＰＣＲ反応の大半は、一括に大量のサンプルが使用できるように、マルチウェルマイクロチップにおいて行われる。各ウェル間の間隔が大きいと、マルチウェルマイクロチップでは、すべての温度均一性が困難になり、ＰＣＲサーマルサイクラーにおける大きいアレイのマイクロチップでは、もっと困難になる。この問題を解消するには、より小さい領域により多いウェルおよびサンプルが入るように、ウェル同士を近づける必要がる。既存のＰＣＲリアクターの多くは、ウェルの底部が検出に使用される。このようなデザインにより、ウェルを近づけることができないため、すべてのウェルの間で熱の均一性が劣る。ウェルをなるべく近づけるには、底部がサーマルサイクラーに設置されるため、マイクロチップの頂部から検出する必要がある。一部のシステムでは、多孔質半導体マイクロチップが使用されるが、このようなシステムは操作が困難で、高価である。また、多孔質半導体基板の加熱および冷却は、出力およびエネルギーの分布の不均一につながり、加熱および冷却が不均一で遅い。

ｑＰＣＲ装置は、使用される検出器の種類は、ポイント検出器（たとえば光電子増倍管やアバランシェダイオード）と二次元平面アレイ検出（ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳ）に分かれる。プローブによる二次元スキャンは速度が低いが、良い性能パラメーター、たとえば、高い信号対雑音比や大きいダイナミックレンジを有する。通常、スキャンなしの二次元アレイ検出器が使用され、検出速度は速いが、性能は比較的に低い。

現在のＰＣＲ装置は、主に、二つの様態がある。（ｉ）９６以上のホールであって、複数のサンプルスロットが一つの温度制御ユニットおよび固定された光学励起検出システムを共有するものである。このような場合、サンプルスロットは開始前に充填しないといけない。それによって応用およびターンアラウンドタイムが制限される。（ｉｉ）もう一つの様態は、単一ホールモジュール化ＰＣＲ装置であって、各サンプルスロットが独立した温度制御ユニットおよび光学励起検出システムを有するものである。当該システムは順応性が良い。しかしながら、単一サンプルスロット様態は、製造コストが高く、サンプルスループットの拡張能力が限られる。

本発明は、新たな様態のモジュール化ｑＰＣＲシステムであって、サンプル測定がランダムなアクセスが可能で、システムのスループットが大幅に向上するものを設計することを目的とする。当該システムは、特殊な種類の照明および光検出システムが使用される。現在の高機能で移動可能な光学検出ユニットは、一つの光学ユニットで同時に１０またはそれ以上のサーマルサイクラーモジュールをスキャンおよびモニタリングすることができるｑＰＣＲシステムを提供する。そのため、製造コストが顕著に低下する。

本発明は、自動化ランダムアクセスアルタイムｑＰＣＲである。複数のＰＣＲリアクターからなり、各リアクターはいずれも自分の温度制御システムを有するが、一つの検出用光学システムを共有する。当該システムは、一連のＰＣＲリアクターの上を快速に移動することができる、単一の光学システムを有するため、短い間隔で複数のｑＰＣＲリアクターを扱うことができる。

本生物学的分析用ランダムアクセスＰＣＲリアクターであって、プラットフォームに固定された複数のＰＣＲリアクターを含む。各ＰＣＲリアクターは複数のマイクロチップを有し、各マイクロチップは生物サンプルを収納するウェルアレイを有する。本ランダムアクセスＰＣＲリアクターは、前記プラットフォームにおけるすべてのＰＣＲリアクターが共有する光学システムを有する。前記光学システムは照明システムおよびイメージングシステムを有する。前記照明システムは、（ｉ）１組のレンズおよびフィルターを持つ光源、（ｉｉ）ライトパイプ、ならびに（ｉｉｉ）ライトガイドを含む。前記ライトパイプは、前記光源から光を受け取り、均一に前記ライトガイドに送る、ライトパイプのアレイからなる。前記ライトガイドは、前記プラットフォームにおける前記ＰＣＲリアクターの一つの頂部に位置することで、当該ＰＣＲリアクターにおけるすべてのマイクロチップのすべてのサンプル収納ウェルを照明する。前記ライトパイプおよび前記ライトガイドは、前記ライトガイドが水平方向のレグになり、その上に開いた空間があるように、Ｌ字状に配置されている。イメージングシステムは前記ライトガイドの上の開いた空間に位置し、当該リアクターのウェルにおける照明されたサンプルから放出する蛍光の画像を撮影する。前記ライトガイドは、測定中のリアクターにおけるすべてのウェルが均一な光の分布を有するように設計されている。均一な光の分布は、精確なサンプル分析にとって重要なパラメーターである。前記ライトガイドは、各光線の一部を各サンプルホルダーにおける各生物サンプルに反射する光反射構造アレイを有し、すべての複数の生物サンプルが同時に照明されることで複数の放射光が放射される。

前記光学システムは、前記光学システムを担持して前記プラットフォームにおける任意のＰＣＲリアクターの上を移動される、横断システムに固定されている。各リアクターの熱循環時間、前記横断システムによる前記光学システムの移動、および放射光のイメージングはコンピューターシステムによって調節される。前記光学システムが特定のＰＣＲリアクターに対して作動する場合、ほかのＰＣＲリアクターは新たなサンプルを持つ新たなＰＣＲリアクターに入れ替えられてもよいため、ランダムアクセスＰＣＲリアクターを提供する。

本ランダムアクセスＰＣＲは、複数のＰＣＲリアクターを含み、各ＰＣＲリアクターは温度制御エレメントと熱的に結合したアレイマイクロチップブロックを含み、各ＰＣＲリアクターの熱循環は独立に各自の温度制御エレメントによって制御される。本発明の一つの実施形態において、前記ＰＣＲリアクターは線状に配列されている。しかし、任意のほかの配列、たとえば、行と列のアレイでもよい。前記光学ユニットは、異なる時点でそれを前記ＰＣＲリアクターの上を移動させて当該ＰＣＲにおけるマイクロチップからの光放射を撮影する、１組のモーター駆動トラバーサー（ラック）である。前記光学システムは、一つのＰＣＲリアクターからもう一つに移動し、そして同時に励起して前記マイクロチップブロックにおける各リアクターからの蛍光を記録することができる。各ＰＣＲリアクターの温度および前記光学システムの移動はコンピュータープロセッサーによって制御される。

本装置の前記光学システムは、各ＰＣＲリアクターにおけるすべてのアレイマイクロチップに均一な光を提供するように設計されている。コンパクトな様態で構築されるため、高精度で移動させることが簡単にできる。ＬＥＤまたはハロゲンランプのような光源により、光学システムを介してＰＣＲリアクター全体を照明する。サンプリング領域の上方に位置するカメラはサンプルから励起される蛍光を記録する。

以下、図面と合わせて本明細書における実施形態を説明するが、前記図面は請求の範囲を制限するものではなく、説明のためのもので、ここで、同様の表記は同様の要素を表す。

図１は、本発明の光学システムを温度制御ヒーターの頂部に設置されたマイクロチップと共に示す。 図２は、マイクロチップのウェルに応用された本発明の照明システムを示す。 図３は、本発明のライトパイプを示す。 図４Ａは、本発明のライトガイドの第一実施形態の平面図を示す。 図４Ｂは、本発明のライトガイドの第二実施形態の平面図を示す。ここで、矢印は光路の方向を表す。 図５は、平行内部構造を有するライトガイドの実施形態の横断図を示す。 図６Ａは、何らの内部反射特徴もないライトガイドにおける光路を示す。 図６Ｂは、頂部の表面における内部構造を有するライトガイドの透視図を示す。 図６Ｃは、頂部の表面における内部構造を有するライトガイドの側面図を示し、ウェルへ反射する光路を示す。 図６Ｄは、底部の表面における内部構造を有するライトガイドの透視図を示す。 図６Ｅは、底部の表面における内部構造を有するライトガイドの側面図を示し、ウェルへ反射する光路を示す。 図７Ａは、頂部と底部の両表面における内部構造を有するライトガイドの透視図を示し、ウェルへ反射する光路を示す。 図７Ｂは、頂部と底部の両表面における内部構造を有するライトガイドの側面図を示す。 図８は、マイクロチップのウェルにマッチする予備形成をされたヒートリッドの平面図を示す。 図９Ａは、単一のＰＣＲリアクターの第一実施形態を示す。 図９Ｂは、単一のＰＣＲリアクターの第二実施形態を示す。 図１０は、１０のＰＣＲリアクターの線状アレイを示す。 図１１は、本発明の自動化ランダムアクセスＰＣＲシステムを示す。

図１は、単一の温度制御ユニットを用い、４つのマイクロチップを収納する、本ＰＣＲリアクターの一つの実施形態を示す。当該システムは、ＣＣＤカメラ１、カメラレンズ２、フィルターを持つカメラフィルターホイール３、ＬＥＤ冷却ファン４、ＬＥＤモジュール５、レンズ６、光源フィルター７、ライトパイプ８、ライトガイド９、ラジエーター冷却ファン１０、サーマルモジュール１１、ラジエーター１２、生物サンプルを収納するサンプルホルダーまたはウェル１４を有するいくつかのマイクロチップ１３、およびヒートリッド１５を含む。

図２は、本光学システムの操作を示す。ＬＥＤ源２１０（または任意の光源）からの光線２００がフィルターシステム２２０、およびレンズシステム２２５を透過する。そして、前記光線は複数のライトパイプからなるライトパイプ２３０に入る。前記ライトパイプアレイによって前記光を複数の独立した光線に分かれる。その後、前記光はライトガイド２４０に入り、サンプル収納ウェル２５０を有するマイクロチップの方向に沿うように水平になる。前記ライトガイド２４０を透過する光線は段々下方方向２１２に沿って前記ウェル２５０に反射される。前記ライトガイド２４０は、一部の光を透過させながら、一部を前記ウェルに反射させる構造２４５を有する。前記光２１２がサンプル収納ウェル２５０に入ると、前記サンプルにおける発光材料が励起光を吸収し、そしてレスポンスとして、自然放出によって発光する。前記ウェル２４０から放出される蛍光は、ヒートリッド２６０を透過し、さらに前記ライトガイドを透過した。前記発光はチップの上方にあるカメラシステム２７０によって拾われる。各ウェルはいずれも単独で励起され、放出された光はカメラによって記録される。前記カメラは電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器アレイ、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器アレイまたは光電子増倍管検出器でもよい。前記カメラの感度は放出される光を捕獲できるように高い。異なる解像度、たとえば、４メガピクセルのカメラを使用してもよい。前記光源フィルター７は特定の帯域の波長の光を透過させることで、前記蛍光色素の放射光と同様の波長の光を排除する。通常、光源フィルターを透過する光の波長はカメラフィルターホイールを透過する光の波長よりも短い。前記蛍光色素からの蛍光は前記フィルターホイールを透過し、前記デジタルカメラに受け取られる。前記光学素子は、短波長の励起光が反射し、長波長の放射光が透過するように設計されることが好ましい。任意のほかの組み合わせも可能である。前記フィルターホイールは、異なる放射フィルターの間で切り替えることで、注目の蛍光色素からの光の波長を選択的に優先するためのものである。前記検出ユニットを使用し、ＰＣＲの過程において各マイクロチップのリアルタイムの全視野画像を獲得する。

図３は、ＬＥＤモジュール５からの光３１０を前記ライトガイド９に送る前記ガイドパイプ８を示す。前記ガイドパイプはいくつかの透明材料３２０が一定のオーバーラップになるように交互に設置されている。各ライトパイプの形状および角度は光が低損失で前記ライトガイド９に導かれるように設計され、そして均一性の制御およびほかの照明の要求のため、各出射表面３３０における光出力百分率および角度が管理されている。前記ライトパイプ８は入口３４０およびいくつかの出射表面３３０からなり、前記出射表面３３０の側面の表面が所定の角度３５０を有する。前記ライトパイプは単一の部材に成形してもよく、光を分割するためにいくつかの部材を一体に組み合わせてもよい。前記透明材料は光学ガラス、ＰＭＭＡ、ポリアクリル酸、ポリカーボネート、ポリエチレンまたはほかの光学透明材料でもよい。光透過部材の数は各ＰＣＲリアクターにおける照明の必要のあるマイクロチップのサイズおよび数によって決まる。比較的に大きいシステムでは、１－１０またはそれ以上のガラス部材が好ましい。当該システムは異なる数の入口および出射表面があるように変更されてもよい。

前記ライトパイプ８は図４Ａに示すライトガイド９に連結している。前記ライトパイプおよびライトガイドは、光が一方の側面から前記ライトガイドに入り、前記ライトガイドの上方にカメラが位置するオープンスペースが空くように、Ｌ字状に配置されている。前記ライトガイドは基本的に長さと幅を持つ平面構造である。前記ライトガイドは、（ｉ）光結合または入口の特徴４１０と、（ｉｉ）均一性および効率のための光学的特徴または構造４２０と、（ｉｉｉ）反射表面４３０と、三つの主な特徴を有する。前記入口の特徴は、最小限の損失で各ライトパイプ部分から光を受け取るようにされている。ほぼ垂直の方向で到着する光はほぼ水平の方向に変えられる。前記ライトガイドは、光を導いて散乱させる。前記ライトガイドの前記表面は、前記ライトガイドの頂部の面と底部の面からの反射で光をガイドして前記ライトガイドを通るようになっている。前記ライトガイドは、光をサンプル領域全体に送り、そして各サンプル管を照らす特殊な特徴および構造を有する。本ライトガイドの一つの実施形態において、入口の特徴は複数の階段４４０の様態に配置され、サイズが前記ライトパイプの出射表面３３０に合うように設計されている。前記ライトガイドは任意の光透過材料で成形または製作されてもよい。光をサンプル領域全体に導いて照明する。

図４Ｂは、前記ライトガイドの入口の構造のもう一つの実施形態を示すが、前記ライトガイドはライトガイド４１０の入口部分に前記ライトガイドの縦軸４６５に沿って前記マイクロチップの表面と平行の方向に光を調節する構造を有する。前記ライトガイドはすべての表面に表面コーティングされてもよい。図４Ｂにおける前記ライトガイドの遠端４７０は三角形の構造を有し、光を反射して前記ライトガイドに戻し、光の損失を防止し、より均一で散乱したＰＣＲの光源にする。前記ライトガイドは、さらに、縦軸４６５に垂直する方向に光を下方または上方に反射させるノッチ４２０（図４Ａ）および４７５（図４Ｂ）のアレイを有する。前記ライトガイドは、さらに、最低限の損失で前記ライトガイドにおける光の分布がより均一になるように、縦軸に沿って三角形の開口４８０を有することで、光を前記ライトガイドの側面に散乱させる。

図５は、前記ライトガイド５１０の入口の構造のもう一つの実施形態を示すが、一方の段差は研磨されて平坦化になり、もう一方の段差は光を平行化する構造を有する。前記入口の構造５２０は、前記ライトパイプの出射表面と前記ライトガイドの入射表面のギャップが埋まるように、光学的に研磨されるか、ＯＣＡ（光学接触角）を有する。前記表面５３０における特徴は、前記表面５３０に到達する光線５５０が所定の方向、たとえば、５５６および５５７の方向にガイドされるように配置されている。

前記ライトガイドの表面は、材料の性質、またはＴＩＲ（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ、全内部反射）のための反射コーティング／材料によって反射性のもの５６０になっている。たとえば、前記反射表面５６０に到着した光線５７０は前記反射表面からはじかれ、前記ライトガイド５７５の方向に進行する。

図６Ａは、反射構造のない簡単なライトガイドの側面図を示す。ＴＩＲ（全内部反射）のための反射コーティング／材料の性質により、光線６１０は頂部の表面６１２および底部の表面６１４から反射される。好適な実施形態において、前記ライトガイドは反射構造を有し、光をマイクロチップのウェルに反射させる異なる内部構造を有してもよい。当該ライトガイドはテストされるＰＣＲリアクター全体に均一な光の分布を提供する。

図６Ｂおよび６Ｃは、ライトガイドの頂部の表面における反射構造を有するライトガイドの透視図および側面図を示す。好適な実施形態において、反射構造は前記ライトガイドの幅の方向に沿って作られ、基本的に前記ライトガイドの縦軸に垂直する、一組の平行ノッチである。一つの実施形態において、前記ノッチは三角形の断面を有し、前記三角形は所定の高さと角度を持つ。ただし、反射構造６３１－６３３は異なる形状、たとえば、三角形／矩形／円形を有してもよい。前記角度および形状は入射光の角度および反射光の進行方向によって左右される。前記角度は１０～９０度の範囲内でもよい。前記反射構造（光学的特徴）は光がチップに反射するように戦略的に配置される。これらの特徴は均一な光の分布を提供するのみならず、光の使用の総効率を向上させるように設計されている。前記ライトガイドにおける構造およびノッチはレーザーエッチング、射出成形、エンボスなどによって製造されてもよい。図６Ｃは光線６４１の例示を示すが、前記光線６４１は方向６４２で底部の表面に反射され、そして方向６４３で構造６３３によってウェル６５０に反射される。

図６Ｄおよび６Ｅはライトガイドのもう一つの実施形態を示すが、構造６６１がライトガイドの底部の表面に位置する。光線は下部の構造から反射され、さらに頂部の表面における光反射表面６６５からウェル６７０に反射される。図７Ａおよび７Ｂはライトガイドのもう一つの実施形態を示すが、前記ライトガイドは底部の表面と底部の表面の両方に反射構造（ノッチ）を有する。好適な実施形態において、頂部の表面６８１における構造は４５度の角度６８２を有する直角三角形で、その斜辺が入射光源に向かう（右側に向かう）。前記底部の三角形６８３は前記底部の表面で４１度の角度６８４を有し、その斜辺が入射光源に向かう（右側に向かう）。

反射構造の数および間隔６８５は各ＰＣＲリアクターにおけるウェルの列数および間隔と同様である。たとえば、ウェルの列間の間隔６８５が４ｍｍの場合、反射構造は４ｍｍ離れる。均一な光の分布になるように、三角形の高さ（ノッチの深さ）は前記ライトガイドに沿って増加していく。前記ライトガイドに２０のノッチがある一つの実施形態において、入射側から、高さが０．０６ｍｍのノッチが４つ、高さが０．０８ｍｍのノッチが４つ、高さが０．１８ｍｍのノッチが４つ、そして高さが０．４ｍｍのノッチが８つある。前記反射構造は前記ライトガイドの末端側の光の均一性の改善に貢献する。そのため、頂部の表面よりも、底部の表面におけるノッチが少ない。一つの実施形態において、頂部の表面に２０のノッチを持つライトガイドは、底部の表面に高さが０．４ｍｍのノッチが９つある。底部の表面におけるノッチは頂部の表面に対してオフセット６８６があることで、その下方から放出される光の遮断が防がれる。

図８はマイクロチップの頂部に位置するヒートリッドを示す。前記ヒートリッドはマイクロチップにおけるウェルの頂部の表面に合わせた開口のアレイを有する。図９Ａは、本ＰＣＲユニットの一つの実施形態を示す。ＰＣＲはラジエーター９１０を含み、前記ラジエーターはラジエーター冷却ファン９２０によって冷却される。サーマルモジュール９３０は、前記ラジエーターの頂部に設置され、マイクロチップ９４０を収納する。ヒートリッド９５０はマイクロチップ９４０の頂部に設置される。本実施形態において、一つのＰＣＲユニットは前記サーマルモジュールに設置される４つのマイクロチップを持つ。これらの装置は、サンプルを精確な温度に加熱および冷却することにより、ヌクレオチドの変性、アニーリングを促進し、さらに各サイクルのＤＮＡ増幅においてポリメラーゼを介する伸長を促進するためのものである。一つの実施形態において、ペルチェサーマルサイクラーが使用される。固体アクティブヒートポンプが使用され、電気エネルギーを消費することにより、温度勾配に逆らって熱を一方からもう一方に伝達させる。ペルチェブロックの一つの非常に有用な特徴は熱勾配を構築することで、一回の稼働においてアッセイのアニーリング工程を最適化させることができる。図９Ｂは、本ＰＣＲリアクターのもう一つの実施形態である。ヒートリッド９５０はサーマルユニット９３０におけるマイクロチップ９４０の上方に設置される。前記ヒートリッドは蛍光を透過させる開口を有する。プライマーのアニーリングの最適温度の決定は産物の効率的で特異的な増幅に重要である。本ＰＣＲシステムは各リアクターに任意の所望の温度勾配があるようにプログラミングすることができる。

マイクロチップは異なるウェルの行と列のセットを有してもよい。本システムの一つの実施形態において、各マイクロアレイは４×８のウェルのアレイ（サンプルホルダー）がある。各ウェルは異なる体積を有してもよいが、範囲が１～１２５ ｐｉである。より小さいか、より大きい体積を有する任意のほかのフォーマットを使用してもよい。本ＰＣＲの一つの実施形態において、各ユニットは４つのマイクロチップを有し、各マイクロチップは３２のウェルを有し、計１２８ウェルで、アニーリング、重合または変性温度が一回の稼働でテストされる。前記熱勾配を調整することで一回の稼働で反応条件を最適化し、複数のプライマーセットの最適アニーリング温度を確認し、同時に異なるアニーリング温度が必要な反応を行うことなどができる。そのため、各ＰＣＲリアクターから撮影される各写真は各ウェルの１２８枚の画像を含む。すべてのウェルの画像を一枚の写真に集中することで、画像分析および比較が既存技術よりも容易になる。蛍光レポーター、たとえば、ＤＮＡ結合染料または標識されたプローブにより、各ＰＣＲ反応の蛍光強度を測定することができるため、実験サンプルにおける目的標的の存在を確認することができる。

図１０は、本自動的ランダムアクセスＰＣＲ反応器システムを示すが、１０の線状に配列したＰＣＲリアクターが含まれる。各ユニットに各自の温度コントローラーがあるが、各ユニットの起動時間が独立に制御される。

図１１は、本システム１１００の完全なＰＣＲリアクターの一つの実施形態を示す。当該システムはプラットフォーム１１１０に１０の独立したＰＣＲユニットを有する。光学システム１１２０は横断システム１１３０に取り付けられる。前記横断システムは、前記光学システムを任意のイメージングの用意ができたＰＣＲリアクターの上方に移動させる。同時に、任意のほかのＰＣＲリアクターにおけるマイクロチップは新しいサンプルを含む、新しいセットのマイクロチップに入れ替えることができる。本システムにおいて、ＰＣＲリアクターが線状に配列するため、線状の横断が使用される。しかし、当該システムは任意のタイプのＰＣＲ配置、たとえば、行と列のセットに設計してもよく、そして同一の光学システムがシステムにおける任意の所望のＰＣＲリアクターの上方に移動するように、二次元または三次元の横断をプログラミングすることができる。

コンピューターは、各ＰＣＲリアクターの熱循環のパラメーターを設定し、電動横断システムを制御して光学素子を移動させ、検出ユニットを制御して撮影し、そして検出カメラから得られるデータを保存する。各ユニットのＰＣＲは異なる開始時間、熱循環温度および加熱時間を有する。光学システムおよびイメージングの運動が各リアクターの運動に合うように設置される。たとえば、一つのＰＣＲの蛍光放出の照明およびイメージングに数秒かかり、さらに光学素子をもう一つの照明およびイメージングの用意ができたＰＣＲの上方に移動させる。操作が終わったＰＣＲリアクターは新しいマイクロチップに入れ替えられてテストのためにセットされる。これによってランダムアクセスＰＣＲが可能になる。

計算ユニットはシステム制御ヒーター、横断システム、カメラおよびスイッチを含む。ヒーター制御システムはヒーター、冷却ファンおよび相応するセンサーを含む。各温度制御素子の熱循環パラメーターは任意のプログラムの開始前にソフトにおいて単独でセットして配置することができる。任意の予定の時点で撮影できるように、モーターをプログラミングすることによって検出ユニットを所要のリアクターの位置に移動させることができる。各ミニリアクターのＰＣＲプログラムの開始は統一されなくてもよい。各ミニリアクターの熱循環の同一の時点で写真を撮影できるように、順番に遅延してＰＣＲ熱循環を開始することが好ましい。撮影時間、露出時間、カメラゲイン、目的領域およびフレームレートなどのパラメーターを定義するためにソフトにカメラの設定が提供される。必要な放射フィルターの組み合わせを選択して高品質の画像を得るために、放射フィルターホイールの配置を提供する。

当該ソフトはさらに一式の画像処理およびデータ分析のツールを提供する。ソフトでは、全視野の画像を校正してイメージングのノイズを低下させる、多くのメソッドを実装することができ、フラットフィールド補正、カラーフィルター校正、暗視野差分、複数の画像の中央値平均、背景差分を含むが、これらに限定されない。

本光学システムはＰＣＲおよびｑＰＣＲ以外の多くの機器、たとえば、薬物探索およびほかの生命科学の研究のための蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、ラブオンチップ装置に使用することができる。また、測定領域に分布が一致し、再現可能で、安定して均一な光が必要な任意のシステムに使用することができる。

分析サンプルは種に関わる反応の一部でもよいが、生体高分子、たとえばオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、タンパク質（抗体、酵素、作動剤、抗原、ホルモン、毒素）、オリゴ糖および非重合体の種類、たとえば、ステロイド、脂質、リン脂質、小さい有機シグナル分子（たとえば、レチノイン酸）、殺虫剤および非ペプチド系毒素、ホルモンおよび抗原を含む。光とサンプルを含む溶液における化学物質の相互作用で、すべてのサンプルから放出される発光（蛍光または燐光）はその後にカメラまたは同じようなシステムに記録される。記録される画像はマイクロアレイチップにおけるすべてのウェルの画像を含むため、システムがコンパクトで、使用しやすくて低価格である。当該光学システムは多くのほかの光に基づいた検出システム、たとえば、ドロップレットデジタル ＰＣＲに使用することができる。ウェルに、生物サンプル、たとえば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、染色体またはタンパク質分子が含まれてもよい。本照明システムは、多くの生物分析ツール、たとえば、マイクロプレートリーダー、ＤＮＡシクエンシング装置、ＰＣＲ装置、ｑ－ＰＣＲ装置、顕微鏡、フローサイトメーター、ラブオンチップ装置、診断医療装置や治療性医療機械とともに使用してもよい。

本装置の光学システムは精確な定量化および標的認識に高感度の検出を提供する。サンプルプレートの上方でスキャンし、デバイスシャトルが高感度でクロストークなしで独立に照明して各ウェルからの蛍光を検出する。光学システムはデータ収集の過程で自動的にすべてのウェルのデータを収集するため、自分のプランでウェルの情報を入力または編集することができる。

前記は本発明の原理を説明したものである。当業者は多くの修正や変更に容易に想到することができるため、本発明が提示・記載された具体変化な構造および操作に制限されることが望ましくないため、すべての適切な修正および同等物が本発明の範囲に含まれる。

以上の記述について、もちろん本発明の部品のサイズ、形状、形態、材料、機能および操作形態、組み立ておよび使用における最適な関係は当業者にとって容易に想到できるものである。当業者には、図面で示されたか、明細書で記載された同様の効果のすべての同等の関係がいずれも本発明に含まれる。

Claims (30)

1. 生物学的分析用ランダムアクセスＰＣＲリアクターシステムであって、
   ａ） それぞれ複数のサンプルホルダーまたはウェルで複数の生物サンプルを受け取るように配置される複数のマイクロチップ、前記複数の生物サンプルを制御する温度制御素子を有するサーマルサイクラーを含む複数のＰＣＲリアクターと、
   ｂ） 照明システムおよびイメージングシステムを含み、各生物サンプルからの複数の放射光を受け取って記録するための光学システムで、前記照明システムは、
   ｉ） 光源からの光を光線アレイに分けるための、各ライトパイプが出射表面を有するライトパイプアレイ、
   ｉｉ） 前記複数のマイクロチップの頂部の表面に沿って各光線を受け取ってリダイレクトするための、各ライトパイプの出射表面と接触するように配置される入射表面を有するライトガイド、
   ｉｉｉ） 前記ライトガイドに各光線の一部が各サンプルホルダーにおける各生物サンプルに反射するように配置され、複数の生物サンプルのすべてが同時に照明されることで複数の放射光の放射が生じる光反射構造アレイを含む光学システムと、
   ｃ） 光学システムを支持するための横断システムで、前記イメージングシステムが前記複数のマイクロチップの頂部の表面に露出して前記複数の生物サンプルからの前記複数の放射光を受け取るように前記横断システムに設置され、そして所定の時間間隔で各ＰＣＲの上方で前記光学システムを移動させることにより、前記複数の放射光の画像を撮影するようにプログラミングされる横断システムと、
   ｄ） 各リアクターの熱循環時間、前記横断システムの移動および前記複数の放射光の画像の獲得を調節するコンピューターシステムとを含み、
   これによって、前記ランダムアクセスＰＣＲリアクターは複数のＰＣＲテストを実行することができ、そして前記光学システムが別のＰＣＲリアクターの上方に位置する場合、任意の所望の時点で各ＰＣＲリアクターの交換および入れ替えが可能であるシステム。
2. 照明システムおよびイメージングシステムを含み、複数のマイクロチップに収納されて露出した表面を有する生物サンプルアレイからの複数の放射光を受け取って記録するための光学システムであって、前記照明システムは、
   ｉ） 光源からの光を光線アレイに分けるための、各ライトパイプが出射表面を有するライトパイプアレイ、
   ｉｉ） 前記複数のマイクロチップの露出した表面に沿って各光線を受け取ってリダイレクトするための、各ライトパイプの出射表面と接触するように配置される入射表面を有するライトガイド、
   ｉｉｉ） 前記ライトガイドに各光線の一部が各サンプルホルダーにおける各生物サンプルに反射するように配置され、複数の生物サンプルのすべてが同時に照明されることで複数の放射光の放射が生じ、そして前記イメージングシステムが前記露出した表面の上方に位置し、前記生物サンプルアレイからの放射光を受け取って記録する光反射構造アレイを含む光学システム。
3. 前記横断システムは線状の方式で前記光学システムを一列の静止のＰＣＲリアクターの上方で移動させるリニアトラバースである、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
4. 前記横断システムは平面運動の方式で前記光学システムを複数列の静止のＰＣＲリアクターの上方で移動させる二次元トラバースである、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
5. 前記ライトパイプは矩形の断面またはほかの形状を有する光透明材料アレイを含むことで、低損失で光を前記ライトガイドにガイドし、そして各ライトパイプの各出射表面における光出力百分率および角度を管理することで均一性およびほかの照明の要求を制御する、請求項２に記載のシステム。
6. 各ライトパイプは基本的に短辺と長辺および厚さを有する台形断面形状を持ち、そして各台形形状の前記短辺は光源に露出し、前記長辺は前記ライトパイプに連結して光線を前記ライトパイプの一部に導くように配置されている、請求項２に記載のシステム。
7. 前記ライトガイドは基本的に頂部の表面、底部の表面および厚さを有する矩形で、前記光反射構造アレイは頂部の表面または底部の表面または頂部と底部の両方の表面に位置し、そして底部の表面における光反射アレイは放射光が前記ライトガイドを透過するようにさせる位置で、そして前記ライトガイドは反射コーティングまたは全内部反射用材料を有し、所定の位置に放射光が透過するようにさせる未コーティング領域がある、請求項２に記載のシステム。
8. 各光反射構造は前記ライトガイドにおけるノッチまたは切り口の部分で、そして各ノッチは高さを有して光をウェルの列に反射させるように位置づけされている、請求項２に記載のシステム。
9. 前記光反射構造は三角形の構造であることで光を前記ライトガイドに反射させ、光の損失を防止し、各ＰＣＲリアクターにより均一で散乱した光源を提供する、請求項２に記載のシステム。
10. 前記光反射構造は頂部の表面に位置し、角度４５度の直角三角形の断面を有し、各直角三角形の断面の斜辺が前記ライトガイドの入射表面からの入射光に向いている、請求項２に記載のシステム。
11. 前記光反射構造は底部の表面に位置し、底部の表面に対する角度４１度の直角三角形の断面を有し、斜辺が前記ライトガイドの入射表面からの入射光に向いている、請求項２に記載のシステム。
12. 前記頂部の表面は２０の光反射構造を有し、そのうち、最初の８つの構造は０．４ｍｍの高さを、次の４つの構造は０．１８ｍｍの高さを、そして次の４つの構造は０．０８ｍｍの高さを、最後の４つの構造は０．０６ｍｍの高さを有する、請求項２に記載のシステム。
13. 前記底部の表面は９つの光反射構造を有し、各光反射構造の高さが０．４ｍｍで、間隔が４ｍｍである、請求項２に記載のシステム。
14. ライトパイプは単一の部材に成形されるか、いくつかの透明材料部材を一体に組み合わせてなることで光を分割し、そして前記透明材料は光学ガラス、ＰＭＭＡ、ポリアクリル酸、ポリカーボネート、ポリエチレンまたはほかの光学透明材料である、請求項２に記載のシステム。
15. 同時に照明して１×１～３２×４８またはそれ以上のアレイの各マイクロチップの光放射を記録することに適する、請求項２に記載のシステム。
16. 前記光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）またはＬＥＤアレイまたはハロゲンランプまたは水銀ランプまたはレーザーを含む、請求項２に記載のシステム。
17. 前記光源はＬＥＤ光源を含み、すべての放射波長に少なくとも１０ｍＷ～１００Ｗの総光出力が発生する、請求項２に記載のシステム。
18. 前記光源が発生する光の波長は可視光、または紫外線または赤外線の範囲全体にわたるか、４５０ｎｍ～７００ｎｍである、請求項２に記載のシステム。
19. 光のスペクトルは各生物サンプルと混合する蛍光色素の励起および放射の波長の実現に使用される、請求項２に記載のシステム。
20. さらに、前記光源と前記ライトパイプの間に位置する、前記光源から放出される光のスペクトルの成分を制御するための光学フィルターを有する、請求項２に記載のシステム。
21. さらに、前記イメージングセンサーと前記マイクロアレイ反応チップの間に位置する、選ばれた波長のみの光信号がセンサーに到達して光のスペクトルの成分が所要の波長になるように配置される放射フィルターを含む、請求項２に記載のシステム。
22. イメージングシステムは、前記イメージングセンサーと前記マイクロアレイ反応チップの間に位置する、前記チップの表面全体をイメージングして光のスペクトルの成分を所要の波長にする、１組の光学レンズを含む、請求項２に記載のシステム。
23. 前記カメラは電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器アレイ、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器アレイ、または光電子増倍管検出器またはフォトダイオード、またはフォトダイオードアレイである、請求項２に記載のシステム。
24. 体積が１～１００μＬの複数の離散サンプルの画像を受け取って生成するように配置される、請求項２に記載のシステム。
25. 前記光源は励起ビームを発生するように配置され、前記励起ビームは約０．１ｃｍ^２～約１０００ｃｍ^２の範囲内の領域で基本的に均一な励起を引き起こす、請求項２に記載のシステム。
26. さらに、複数の窓を有するプレートを含み、前記複数の窓は前記マイクロチップの頂部に位置し、所要の波長の光が各窓を通過するように配置されている、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
27. さらに、前記生物サンプルにポリメラーゼ連鎖反応を行うのに適する手段で前記生物サンプルの温度を循環させるように配置される熱制御ユニットを含み、前記手段は直接接触型サーマルサイクラーのいずれか、金属ブロックまたはペルチェに基づいた熱制御システムである、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
28. さらに、離散生物サンプルの熱環境を制御するように、共に配置される加熱ブロックおよび電子コントローラーを含む、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
29. さらに、前記複数の生物サンプルの熱環境を制御するように配置されるヒートリッドを含む、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。
30. 前記ランダムアクセスＰＣＲリアクターはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ｑＰＣＲ装置またはＤＮＡシークエンシング装置、または抗原抗体ＥＬＩＳＡ装置、またはデジタルＰＣＲ装置である、請求項１に記載のＰＣＲリアクターシステム。

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