JP2023525480A - 分割鎖を有する多量体オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、サブユニットを含む多量体オリゴヌクレオチドに関し、サブユニットの各々は独立して、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。サブユニットの各々は、共有結合性リンカーによって別のサブユニットに連結され、少なくとも1つのサブユニットは、少なくとも1つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。本開示はまた、多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法および本明細書において開示される多量体オリゴヌクレオチドを用いる方法にも関する。TIFF2023525480000209.tif48128

Description

任意の優先出願に対する参照による組み入れ
本出願と共に提出されたPCT Requestにおいて外国または国内優先権主張が特定されている、いずれかのおよび全ての出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
開示の分野
本開示は、多量体オリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本開示は、分割鎖を用いて多量体オリゴヌクレオチド、分割鎖を有する多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法、および結果として生じるオリゴヌクレオチドを用いる方法に関する。
背景
オリゴヌクレオチドは現在、複数の応用および進行中の臨床試験を伴う、十分に確立された治療薬のクラスである。しかしながら、多くの要因、例えば、所望の治療効果を達成するのに十分な量での、標的細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達およびその後の標的細胞内へのオリゴヌクレオチドの内部移行が、依然としてオリゴヌクレオチド治療薬の開発および使用を制限している。
この課題に対応するために、特定の細胞表面受容体を標的とするリガンドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドが、研究されている。1つのそのようなリガンドであるN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）の使用は、肝細胞の表面上に多数で発現しているアシアロ糖タンパク質受容体へのその高度に特異的かつ効率的な結合のために、肝細胞へのオリゴヌクレオチド送達のために選択される方法となっている。
しかしながら、GalNAcコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを使用したとしても、高い割合の化合物が、腎臓による排出を介して失われる。これに対抗するために、個々のオリゴヌクレオチドサブユニットが、共有結合された中間体または「リンカー」を介して互いに連結されている、オリゴヌクレオチドの多量体が調製されている。これらのリンカーは、オリゴヌクレオチドの合成、脱保護、および精製後に合成機でまたは水溶液中で導入されている。
多種多様なリンカーが利用されており、これらには、インビボ条件下で安定なリンカー、および標的細胞の内部で切断されそれによって個々のオリゴヌクレオチドサブユニットを遊離させる他のリンカーが含まれる。用いられる切断可能なリンカーの最も一般的なタイプは、細胞内ヌクレアーゼによって切断される一本鎖の保護されていないヌクレオチドの短い配列、例えば、dTdTdTdTおよびdCdA、ならびに細胞の内部での還元環境によって切断されるジスルフィドに基づくリンカーである。
多量体オリゴヌクレオチドの合成で成功裏に利用されている別の技術は、リンカーを介して別のオリゴヌクレオチドに結合された一本鎖オリゴヌクレオチドが、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされることによる、非対称性アニーリング（asymmetric annealing）であり、任意で、リンカーを介して別のオリゴヌクレオチドにも結合され、これらの工程は、所望の長さの多量体が得られるまで繰り返される。
ホモ多量体とヘテロ多量体のどちらも、これらの方法を介して調製されており、4-merから8-merの範囲での多量体は、特に増強された血清半減期および生物活性を示す。
しかしながら、これらの方法には限界がある。ヌクレアーゼ切断可能なリンカーは、合成機を介してのみ導入することができる。ジスルフィド連結は、前駆体の精製後に合成機でおよび水溶液中での両方で導入することができる。しかしながら、その後の連結反応のために同時に末端ジスルフィドをチオールに還元しながら、多量体内に内部ジスルフィド基を維持することはできない。最終的に、非対称性アニーリング法は、ランダム重合が生じる可能性があることから、ホモ多量体に適用することは難しい。
したがって、多量体オリゴヌクレオチドの構築および合成で使用するためのさらなる方法および材料に対するニーズが存在する。
開示の態様
本開示は、少なくとも1つのサブユニットが「部分オリゴヌクレオチド」を含む、共有結合性リンカーによって互いに連結されたオリゴヌクレオチドサブユニットを含む多量体オリゴヌクレオチドに関する。
部分オリゴヌクレオチドは、インタクトなまたは全長オリゴヌクレオチドの短縮バージョンである。本開示の一部において、インタクトなまたは全長一本鎖オリゴヌクレオチドは、
Figure 2023525480000002
と表され、部分一本鎖オリゴヌクレオチドは、
Figure 2023525480000003
と表される。本開示の多数の態様において、インタクトなまたは全長オリゴヌクレオチド鎖および2本の部分オリゴヌクレオチド鎖は相補的であり、一緒にアニーリングされ、本開示の多量体オリゴヌクレオチドの二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットを形成する。
二本鎖siRNAの文脈において、siRNAの全長またはインタクトなセンス鎖は21塩基であり得るのに対して、部分センス鎖は、10塩基（例えば、全長センス鎖の5'端から最初の10塩基）または全長鎖の3’端までの次の11塩基であり得る。本開示およびその図の一部において、オリゴヌクレオチドの全長またはインタクトなセンス鎖は、5'-Sense-3'と表され、部分センス鎖は、5'-Se-3'または5'-nse-3'と表される。
本開示はまた、本明細書において開示される、新たな合成中間体、および多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法にも関する。
本開示はまた、例えば、遺伝子発現の調節において、生物学的研究において、医学的状態の処置もしくは予防において、および/または新たなもしくは改変された表現型を生じるために、多量体オリゴヌクレオチドを用いる方法にも関する。
本開示は、
サブユニットの各々が独立して、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含み；
サブユニットの各々が、共有結合性リンカーによって別のサブユニットに連結され；かつ
少なくとも1つのサブユニットが、少なくとも1つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、
サブユニットを含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも1つのサブユニットは、相補鎖にアニーリングされて二本鎖サブユニットを形成する、2つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造1：
Figure 2023525480000004
（構造1）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000005
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000006
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●は共有結合性リンカーである。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造2：
Figure 2023525480000007
（構造2）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000008
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000009
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●は共有結合性リンカーである。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造3：
Figure 2023525480000010
(構造3）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000011
は独立して、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●は共有結合性リンカーである。
ある態様において、構造3はホモ二量体である。別の態様において、構造3はヘテロ二量体である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造4：
Figure 2023525480000012
(構造4）
を含む少なくとも1つのサブユニットを含み、構造中：
各
Figure 2023525480000013
は、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●は部分一本鎖オリゴヌクレオチドおよび隣接するオリゴヌクレオチドサブユニットに連結された共有結合性リンカーであり；かつ
Figure 2023525480000014
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造5：
Figure 2023525480000015
(構造5）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000016
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000017
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、一本鎖オリゴヌクレオチドを部分一本鎖オリゴヌクレオチドに連結する共有結合性リンカーであり；かつ
Figure 2023525480000018
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造6：
Figure 2023525480000019
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000020
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000021
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
各
Figure 2023525480000022
は相補鎖であり；かつ
a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々は独立して、0以上の整数であり、但し、c、e、h、およびjの少なくとも1つは≧1である。ある態様において、a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々は独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、c、e、hおよびjの少なくとも1つは≧1である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造7：
Figure 2023525480000023
（構造7）
を含み、
構造中：
Figure 2023525480000024
は各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000025
は各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000026
は各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●は各々、共有結合性リンカーであり；
mおよびnは各々独立して、1以上の整数であり；かつ
oは0以上の整数である。ある態様において、mおよびnは各々独立して、1～10の範囲での整数であり、かつoは、0～10の範囲での整数である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造8：
Figure 2023525480000027
（構造8）
を含み、
構造中：
Figure 2023525480000028
は各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000029
は各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000030
は各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●は各々、共有結合性リンカーであり；かつ
pおよびqは各々独立して、0以上の整数である。ある態様において、pおよびqは各々独立して、0～10の範囲での整数である。ある態様において、pおよびqは各々独立して、0～3の範囲での整数である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造9：
Figure 2023525480000031
（構造9）
を含み、
構造中：
Figure 2023525480000032
は各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000033
は各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000034
は各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●は各々、共有結合性リンカーであり；
rは1以上の整数であり；かつ
sは0以上の整数である。ある態様において、rは1～10の範囲での整数であり、かつsは0～10の範囲での整数である。ある態様において、rは1～3の範囲での整数であり、かつsは0または1である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造10：
Figure 2023525480000035
（構造10）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000036
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000037
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000038
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造11：
Figure 2023525480000039
（構造11）
を含み、
構造中：
各
Figure 2023525480000040
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000041
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
各
Figure 2023525480000042
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造12：
Figure 2023525480000043
（構造12）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000044
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000045
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000046
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造13：
Figure 2023525480000047
（構造13）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000048
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000049
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000050
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造14：
Figure 2023525480000051
（構造14）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000052
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000053
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000054
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造15：
Figure 2023525480000055
（構造15）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000056
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000057
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000058
は相補鎖である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、構造16：
Figure 2023525480000059
(構造16）
を含み、
構造中、各
Figure 2023525480000060
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり；各
Figure 2023525480000061
は相補鎖であり；各
Figure 2023525480000062
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
tおよびuは各々独立して、0以上の整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つは、1以上の整数である。ある態様において、tおよびuは各々独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つは、1以上の整数である。ある態様において、tおよびuは各々独立して、0～3の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つは、1以上の整数である。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、各部分一本鎖オリゴヌクレオチドは、5～14ヌクレオチド長である。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも2つのサブユニットは、異なる細胞標的に対して活性を有する。ある態様において、サブユニットの全ては、異なる細胞標的に対して活性を有する。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも2つのサブユニットは、同じ細胞標的に対して活性を有する。ある態様において、サブユニットの全ては、同じ細胞標的に対して活性を有する。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチド内の各核酸は、RNA、DNA、または人工もしくは非天然の核酸類似体である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチド内の各核酸は、RNA、DNA、または人工もしくは非天然の核酸類似体である。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも1つのサブユニットは、siRNA、saRNA、またはmiRNAである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、サブユニットの全てはsiRNAである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、サブユニットの全てはsaRNAである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、サブユニットの全てはmiRNAである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも1つのサブユニットは一本鎖サブユニットである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも1つの一本鎖サブユニットは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、少なくとも1つの共有結合性リンカーは、切断可能な共有結合性リンカーを含む。
ある態様において、少なくとも1つの切断可能な共有結合性リンカーの1つまたは複数は、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物切断性（bio-cleavable）結合、または酵素で切断可能な結合を含有する。
ある態様において、共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。
ある態様において、共有結合性リンカーは各々独立して、ジスルフィド結合または構造25：
Figure 2023525480000063
(構造25）
の化合物であり、
構造中：
Sは、共有結合によってまたはリンカーによってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；
各R1は独立して、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリール基であり；
R2は、チオプロピオナートまたはジスルフィド基であり；かつ
各Xは独立して、
Figure 2023525480000064
から選択され、
後者の構造は、2種類の可能な「開環」位置異性体を表す複合構造であり、スクシンアミド酸の誘導体である。
ある態様において、構造25の化合物は、
Figure 2023525480000065
であり、構造中、各末端Sは、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される。
ある態様において、構造25の化合物は、構造26：
Figure 2023525480000066
の化合物であり、構造中、各末端Sは、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；かつ構造26内の開環は、2種類の可能な開環位置異性体を表す複合構造であり、スクシンアミド酸の誘導体である。
ある態様において、構造25の化合物は、構造27：
Figure 2023525480000067
の化合物であり、構造中、各末端Sは、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；かつ構造27内の開環は、2種類の可能な開環位置異性体を表す複合構造であり、スクシンアミド酸の誘導体である。
ある態様において、構造25の化合物は、構造28：
Figure 2023525480000068
の化合物であり、構造中、各末端Sは、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；かつ構造28内の開環構造は、各々が2種類の可能な「開環」位置異性体を表す複合構造であり、スクシンアミド酸の誘導体である。
ある態様において、構造25の共有結合性リンカーは、構造29：
Figure 2023525480000069
（構造29）
の共有結合性リンカー前駆体から形成され、
構造中、各R1は独立して、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリール基であり；かつR2は、チオプロピオナートまたはジスルフィド基である。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチド内の少なくとも1つの共有結合性リンカーは、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される。ある態様において、化合物または多量体オリゴヌクレオチド内の全ての共有結合性リンカーは、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される。
ある態様において、少なくとも1つの共有結合性リンカーは、オリゴヌクレオチドサブユニットの内部ヌクレオチドに結合される。
ある態様において、少なくとも1つの共有結合性リンカー●は、ヌクレオチドリンカーを含む。ある態様において、ヌクレオチドリンカーは、2～6ヌクレオチド長である。ある態様において、ヌクレオチドリンカーはUpUpUpであり、式中、「U」はウリジンであり、「p」はリン酸である。ある態様において、ヌクレオチドリンカーはdTpdTpdTpdTpであり、式中、「dT」はチミジンであり、「p」はリン酸である。
多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、各共有結合性リンカー●は同じである。多量体オリゴヌクレオチドのある態様において、各共有結合性リンカー●は異なっている。
ある態様において、少なくとも2つのサブユニットは、第1のサブユニットの3’端と第2のサブユニットの3’端との間の共有結合性リンカー●によって連結される。ある態様において、少なくとも2つのサブユニットは、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの3’端との間の共有結合性リンカー●によって連結される。ある態様において、少なくとも2つのサブユニットは、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの5’端との間の共有結合性リンカー●によって連結される。
ある態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドではない化学的または生物学的化合物をさらに含む。
ある態様において、化合物または多量体オリゴヌクレオチドは、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。
本開示は、構造16：
Figure 2023525480000070
(構造16）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供し、
構造中、各
Figure 2023525480000071
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000072
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000073
は相補鎖であり；各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつtおよびuは各々独立して、1以上の整数であり；前記方法は、構造17
Figure 2023525480000074
（構造17）
および構造18
Figure 2023525480000075
(構造18）
を相補鎖
Figure 2023525480000076
とアニーリングさせ、それによって構造16を形成する工程を含む。ある態様において、tおよびuは各々独立して、1～10の範囲での整数である。ある態様において、tおよびuは各々独立して、1～3の範囲での整数である。
ある態様において、本開示は、構造8：
Figure 2023525480000077
(構造8）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供し、
構造中、各
Figure 2023525480000078
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000079
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000080
は相補鎖であり；各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつpおよびqは各々独立して、1以上の整数であり；前記方法は、構造19
Figure 2023525480000081
（構造19）、
構造20
Figure 2023525480000082
（構造20）、
および1つまたは複数の構造21
Figure 2023525480000083
（構造21）
を相補鎖
Figure 2023525480000084
とアニーリングさせ、それによって構造8を形成する工程を含む。ある態様において、pおよびqは各々独立して、1～10の範囲での整数である。ある態様において、pおよびqは各々独立して、1～3の範囲での整数である。
ある態様において、本開示は、構造9A：
Figure 2023525480000085
（構造9A）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供し、
構造中、各
Figure 2023525480000086
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000087
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000088
は相補鎖であり；各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrおよびsは各々独立して、1以上の整数であり；前記方法は、構造22
Figure 2023525480000089
(構造22）、
構造23
Figure 2023525480000090
(構造23）、
および1つまたは複数の構造24
Figure 2023525480000091
(構造24）
を相補鎖
Figure 2023525480000092
とアニーリングさせ、それによって構造9Aを形成する工程を含む。ある態様において、rおよびsは各々独立して、1～10の範囲での整数である。ある態様において、rおよびsは各々独立して、1～3の範囲での整数である。
ある態様において、本開示は、構造9B：
Figure 2023525480000093
（構造9B）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供し、
構造中、各
Figure 2023525480000094
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000095
は部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000096
は相補鎖であり；各●は、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrが1以上の整数であり；前記方法は、構造22
Figure 2023525480000097
(構造22）、
1つまたは複数の構造24
Figure 2023525480000098
(構造24）、
および部分一本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023525480000099
を相補鎖
Figure 2023525480000100
とアニーリングさせ、それによって構造9Bを形成する工程を含む。ある態様において、rは1～10の範囲での整数である。ある態様において、rは1～3の範囲での整数である。
本開示は、多量体オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
本開示は、医薬の製造における多量体オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
本開示は、有効量の多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程を含む、対象の処置を提供する。
これらのおよび他の態様は、以下により詳細に説明される。
本開示による多量体オリゴヌクレオチドを調製するのに有用なビルディングブロックを誘導体化するための種々の合成ビルディングブロックおよびスキームを図示する。図示した態様では、インタクトなセンス鎖、5’-分割センス鎖、および3’-分割センス鎖は各々、チオール基と反応できるマレイミド（Mal）末端基を含有するように誘導体化される。 中央のサブユニットが分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの三量体を合成するためのスキームを図示する。 中央の2つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの四量体を合成するためのスキームを図示する。任意で、細胞または組織ターゲティングリガンド（Lig）が、末端サブユニットの一方または両方にコンジュゲートされる。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。 中央のサブユニットが分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの三量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「五量体へ」は、表示した合成中間体が、単離され、図6に図示するような二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの五量体の合成で用いられ得ることを意味する。 中央の2つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの四量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「五量体へ」は、表示した合成中間体が、単離され、図6に図示するような二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの五量体の合成で用いられ得ることを意味する。 中央の3つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの五量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「三量体から（Ex trimer）」は、表示した出発物質が、図4に図示される合成スキームから得られることを意味する。「四量体から」は、表示した合成中間体が、図5に図示される合成スキームから得られることを意味する。 中央の4つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの六量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「七量体へ」は、表示した合成中間体が、単離されて、図8に図示されるような二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの七量体の合成に用いられ得ることを意味する。「八量体へ」は、表示した合成中間体が、単離されて、図9に図示されるような二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの八量体の合成で用いられ得ることを意味する。 中央の5つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの七量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「六量体から」は、表示した出発物質または合成中間体が、図7に図示される合成スキームから得られることを意味する。「八量体へ」は、表示した合成中間体が、単離されて、図9に図示されるような二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの八量体の合成で用いられ得ることを意味する。 中央の6つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットの八量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「六量体から」は、表示した出発物質が、図7に図示される合成スキームから得られることを意味する。「七量体から」は、表示した合成中間体が、図8に図示される合成スキームから得られることを意味する。 中央の3つのサブユニットが各々、分割センス鎖を含んでいる、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットのヘテロ五量体を合成するためのスキームを図示する。ヘテロ五量体は、第1のオリゴヌクレオチドの4つのサブユニットを含み；それらの1つはインタクトなセンス鎖（5’-Sense-3’ と命名）を含み、それらのその他の3つは各々、5’-Seおよびnse-3’ と命名される2つの部分鎖で構成される分割センス鎖を含む。5’-OTHER-3’は、5’-Sense-3’とは異なるオリゴヌクレオチド配列を表す。容易に理解されるように、5’-OTHER-3’に対する相補鎖は、5’-Sense-3’に対する相補鎖と異なっている。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。「三量体から」は、表示した出発物質が、図4に図示される合成スキームから得られることを意味する。 ヒトDMPK mRNAを標的とするsiRNAの三量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。 ヒトハンチントンmRNAを標的とするsiRNAの三量体を合成するためのスキームを図示する。記号-SHはチオール基を表し；-Malはマレイミド基を表す。（Lig）は、細胞または組織ターゲティングリガンドを表し、存在しても存在しなくてもよい。記号-CL-は、切断可能なリンカーを表す。
詳細な説明
オリゴヌクレオチドサブユニット
本明細書において記載される多量体オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の共有結合性リンカーによって連結される2以上のオリゴヌクレオチドサブユニットで構成される。オリゴヌクレオチドサブユニットは、RNA、DNA、それらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、または人工もしくは非天然の核酸類似体を含み得る。種々の態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。種々の態様において、オリゴヌクレオチドは二本鎖（例えば、逆平行二本鎖）である。
二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットは、相補的な鎖から形成される。本開示において、二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットは、2つのインタクトなまたは全長の相補鎖を含んでもよく；または二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットは、全長相補鎖にアニーリングさせた2つの部分鎖を含んでもよい。相補性は、100％相補的であることができ、または100％未満相補的であることができる（オリゴヌクレオチドが、それにもかかわらず妥当な条件（例えば、生理化学的に妥当な条件）下でハイブリダイズし、二本鎖の状態のままである場合）。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも約80％、85％、90％、または95％相補的であることができる。いくつかの態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、平滑末端（対称性オリゴヌクレオチド）である。いくつかの態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、1つの鎖上に末端オーバーハング（例えば、2～5個のオーバーハングしたヌクレオチド）またはその鎖の各々の上に末端オーバーハング（各場合で、非対称性オリゴヌクレオチド）を有する。
構造または態様が、全長相補鎖にアニーリングされる2つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含有している各例において、それは、（A）全長相補鎖内のヌクレオチドの各々が、部分オリゴヌクレオチド鎖の一方またはもう一方におけるヌクレオチドと対形成する場合であって、部分オリゴヌクレオチドが共に、相補鎖の「ニック切断」バージョンである、場合；または（B）全長相補鎖内のヌクレオチドの一部が、部分オリゴヌクレオチドの一方またはもう一方におけるヌクレオチドと対形成しない場合であって、部分オリゴヌクレオチドが共に、相補鎖の「ギャップ」バージョンである、場合であり得る。場合（A）または場合（B）のいずれにおいても、相補鎖は、対形成して二本鎖構造を形成する部分一本鎖オリゴヌクレオチドに対して十分な相補性を有する。種々の内部セグメント化siRNA単量体の構造に関する詳細は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、US 8,329,888 B2に記載される。
本開示を通じて図示される構造の全てにおいて、別段の記載がない限り、オリゴヌクレオチド（全長または部分にかかわらず）の各々は、単一方向に限定されず、5’から3’方向または3’から5’方向を有するとして解釈されてもよく、その5’端または3’端を介して別のオリゴヌクレオチド（全長または部分にかかわらず）に連結され得る。
本開示は、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子活性化RNA（saRNA）、miRNA、piwi相互作用性RNA（piRNA）、全てのバリエーションでのアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、およびリボザイムを含む、二本鎖および一本鎖の全てのタイプのオリゴヌクレオチドに適用可能である。
種々の態様において、オリゴヌクレオチドは、RNA、例えば、アンチセンスRNA（aRNA）、CRISPR RNA（crRNA）、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、マイクロRNA（miRNA）、piwi相互作用性RNA（piRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、低分子ヘアピンRNA（shRNA）、低分子活性化（saRNA）、またはリボザイムである。
種々の態様において、オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAアプタマーである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、CRISPRガイドRNA、またはインビボ、インビトロ、もしくはエクスビボでCasヌクレアーゼとリボヌクレオ複合体（ribonucleocomplex）（RNP）を形成するのに関連するもしくは必須であるか、もしくは例えば野生型Casヌクレアーゼを含むCasヌクレアーゼ、もしくはニッカーゼおよびdead Cas（dCas）などの野生型Casの公知の改変のいずれかによるゲノム編集もしくは操作機能を実施するのに関連するもしくは必須である、他のRNAである。CRISPR-Casシステムは、例えば、米国特許第8,771,945号；Jinek et al., Science, 337(6096): 816-821 (2012)、および国際特許出願公開第WO 2013/176772号に記載される。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNA、例えば、アンチセンス DNA（aDNA）（例えば、アンタゴミル）またはアンチセンスギャップマーである。ギャップマーおよび多量体を含めたaDNAの例は、例えば、Subramanian et al., Nucleic Acids Res, 43(19): 9123-9132 (2015)および国際特許出願公開第WO 2013/040429号に記載される。アンタゴミルの例は、例えば、米国特許第7,232,806号に記載される。
種々の態様において、本開示によるオリゴヌクレオチドは、化学修飾をさらに含む。化学修飾は、修飾されたヌクレオシド、修飾された骨格、修飾された糖、および/または修飾された末端を含むことができる。
修飾はリン含有結合を含んでもよく、これには、ホスホロチオアート、鏡像異性的に濃縮したホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよび鏡像異性的に濃縮したホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'結合を有するボラノホスファート、これらの2'-5'結合した類似体、ならびに、ヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ結合している極性反転を有するものが含まれるが、これらに限定されない。
種々の態様において、オリゴヌクレオチドは、1または複数個のホスホロチオアート基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、5'端に1～3個のホスホロチオアート基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、3'端に1～3個のホスホロチオアート基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、5'端および3'端に1～3個のホスホロチオアート基を含んでもよい。種々の態様において、マルチコンジュゲートに含まれる各オリゴヌクレオチドは、1～10個の合計ホスホロチオアート基を含んでもよい。ある特定の態様において、各オリゴヌクレオチドは、10個未満、9個未満、8個未満、7個未満、6個未満、5個未満、4個未満、または3個未満の合計ホスホロチオアート基を含んでもよい。ある特定の態様において、マルチコンジュゲートに含まれるオリゴヌクレオチドは、より多いホスホロチオアート基を有する単量体形態での同じオリゴヌクレオチドと比べて、より少ないホスホロチオアート基で増加したインビボ活性を保有し得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、インビトロおよびインビボでの改善された効力および安定性を含む、様々な作用を生じるために、当技術分野において公知の種々の戦略を用いて修飾されてもよい。これらの戦略の中には、人工核酸、例えば、2'-O-メチル置換RNA；2'-フルオロ-2'デオキシRNA、ペプチド核酸（PNA）；モルホリノ；ロックド核酸（LNA）；アンロックド核酸（UNA）；架橋核酸（BNA）；グリコール核酸（GNA）；およびトレオース核酸（TNA）；またはより一般的には、天然に存在するRNAおよびDNAに構造上類似しているが、天然に存在する分子のホスファート骨格、糖、または核酸塩基部分の1つまたは複数において変更を有する、核酸類似体、例えば、二環式および三環式ヌクレオシド類似体がある。典型的には、類似体核酸塩基は、特に、異なる塩基対形成および塩基スタッキング特性を付与する。例としては、4種類の正規の塩基すべてと対形成することができるユニバーサル塩基が挙げられる。ホスファート-糖骨格類似体の例としては、これに限定されないが、PNAが挙げられる。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Braasch et al., Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002)、ならびに米国特許第5,539,082号；同第5,714,331号；同第5,719,262号；および同第5,034,506号に記載されている。
本明細書に記載される製造法において、オリゴヌクレオチドのいくつかは、化学官能基による置換によって末端で修飾される。置換は、オリゴヌクレオチドの3'または5'端で行うことができ、単量体のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の3'端で行われ得るが、常にそれに限定されるわけではない。化学官能基には、例えば、スルフヒドリル基（-SH）、カルボキシル基（-COOH）、アミン基（-NH2）、水酸基（-OH）、ホルミル基（-CHO）、カルボニル基（-CO-）、エーテル基（-O-）、エステル基（-COO-）、ニトロ基（-NO2）、アジド基（-N3）、またはスルホン酸基（-SO3H）が含まれ得る。
オリゴヌクレオチドは、追加的にまたは代替的に、核酸塩基（当技術分野において単純に「塩基」と呼ばれる）修飾または置換を含むように修飾されてよい。修飾された核酸塩基には、天然の核酸ではまれにまたは一過性にのみ見出される核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン類、5-メチルシトシン（5-メチル-2'デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野において多くの場合5-Me-Cと言及される）、5-ヒドロキシメチルシトシン（HMC）、グリコシルHMCおよびゲントビオシルHMC、ならびに合成核酸塩基、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン類、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 75-77 (1980)；Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res, 15: 4513 (1997)。当技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンまたはプソイドウリジンもまた含むことができる。5-Me-C置換は、0.6～1.2℃で核酸二重鎖安定性を増大させることができ（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp 276-278 (1993)）、塩基置換の局面である。修飾された核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、および2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュード-ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニン類およびグアニン類、5-ハロ、例えば5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、および他の5-置換ウラシル類およびシトシン類、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基を含むことができる。核酸の末端での水酸基（-OH）は、スルフヒドリル基（-SH）、カルボキシル基（-COOH）、またはアミン基（-NH2）などの官能基で置換することができる。置換は、3'端または5'端で行うことができる。
共有結合性リンカー
多量体オリゴヌクレオチド中に存在しかつ多量体オリゴヌクレオチドの合成で用いられる共有結合性リンカーは、切断可能であってもよくまたは切断可能でなくてもよい。切断可能なリンカーは、多量体オリゴヌクレオチドの個々のオリゴヌクレオチドサブユニットの機能的送達を促進するために、送達時に切断されながらも、投与時にまたは細胞内条件下で安定性を維持するように選択または設計され得る。本明細書において提供される共有結合性リンカーの例に加えて、当業者は、多種多様なリンカーが、それらの組成、合成および使用を含めて、当技術分野において公知であり、本開示と一致している使用に適合され得ることを理解するであろう。
ヌクレオチドリンカーは、共有結合性リンカーのクラスの一例であり、例えば、ウリジン-ウリジン-ウリジン（UUU）、エンドヌクレアーゼで切断可能なリンカーdCdA、およびdTdTdTdTなどの核酸配列を含む。ヌクレオチドリンカーは、配列が任意の他の指定された機能を実行しないように選択される1つまたは複数のヌクレオチドを含有する。本開示の種々の局面において、共有結合性リンカーは、2～6ヌクレオチド長のヌクレオチドリンカーを含むことができる。
本開示の種々の態様において、共有結合性リンカーは、求核基と求電子基との反応産物を含む。例えば、共有結合性リンカーは、チオールとマレイミド、チオールとビニルスルホン、チオールとピリジルジスルフィド、チオールとヨードアセトアミド、チオールとアクリラート、アジドとアルキン、またはアミンとカルボキシル基との反応産物を含むことができる。本明細書において記載されるように、これらの基の一方は、例えば、マルチコンジュゲートの置換基に接続され（例えば、置換基上のチオール（-SH）官能化）、もう一方の基は、最終的に2個のオリゴヌクレオチドを連結する第2の分子（例えば、連結剤）上に提示される（例えば、DTME中のマレイミド）。
チオールとマレイミドとの反応産物を含む共有結合性リンカーには、これらに限定されないが、DTME（ジチオビスマレイミドエタン）、BM(PEG)2（1,8-ビス(マレイミド)ジエチレングリコール）、BM(PEG)3（1,11-ビスマレイミド-トリエチレングリコール）、BMOE（ビスマレイミドエタン）、BMH（ビスマレイミドヘキサン）、またはBMB（1,4-ビスマレイミドブタン）が含まれる。DTMEは、サイトゾルの還元環境において、細胞内で切断可能な内部ジスルフィドを含有するという点で利点を有する。
本開示の種々の局面において、共有結合性リンカーは、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドン、およびポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性ポリマー、または、PLGAおよびPLAなどの疎水性ポリマーを含んでもよい。
共有結合のための媒介物質として用いられるポリマー連結剤には、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリン、もしくはそれらのコポリマーを含む非イオン性親水性ポリマー；または、ポリ-L-乳酸、ポリ-D-乳酸、ポリ-D,L-乳酸、ポリ-グリコール酸、ポリ-D-乳酸-co-グリコール酸、ポリ-L-乳酸-co-グリコール酸、ポリ-D,L-乳酸-co-グリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリヒドロキシブチラート、ポリヒドロキシバレラート、もしくはそれらのコポリマーを含む1種または複数種の生物切断性ポリエステルポリマーが含まれる。
連結剤は、約100～10,000ダルトンの分子量を有しうる。そのような連結剤の例としては、ジチオ-ビス-マレイミドエタン（DTME）、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール（BM(PEG)2）、トリス-(2-マレイミドエチル)-アミン（TMEA）、トリ-スクシンイミジルアミノトリアセタート（TSAT）、3-アーム-ポリ(エチレングリコール)（3-アームPEG）、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ビニルスルホン、ヨードアセチル、ニトロフェニルアジド、イソシアナート、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、およびヒドロキシフェニルアジドが挙げられる。
切断可能な結合または切断不可能な結合を含む連結剤が、本明細書において用いられてもよく、実際、一部の例では、同じマルチコンジュゲート内で一緒に用いられ得る。切断不可能な結合を含む連結剤には、これらに限定されないが、アミド結合またはウレタン結合を含むものが含まれる。切断可能な結合を含む連結剤には、これらに限定されないが、酸で切断可能な結合（例えば、エステル、ヒドラゾン、またはアセタールの共有結合）、還元剤で切断可能な結合（例えば、ジスルフィド結合）、生物切断性結合、または酵素で切断可能な結合（例えば、核酸に基づくリンカーまたはオリゴペプチドに基づくリンカー）を含むものが含まれる。いつくかの例において、切断可能な共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。追加的に、薬物コンジュゲーションに利用可能な任意の連結剤が、非限定的に、本発明の前述の局面において用いることができる。
さらに、官能基と連結剤との組み合わせは、以下を含み得る：（a）官能基がアミノまたはチオールである場合、連結剤は、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート、またはスクシンイミジル6-([3(2-ピリジルジチオ)プロピオアミド]ヘキサノアートであってもよい；（b）官能基がアミノである場合、連結剤は、3,3'ジチオジプロピオン酸ジ-(N-スクシンイミジルエステル)、ジチオ-ビス(エチル1H-イミダゾール-1-カルボキシラート)、またはジチオ-ビス(エチル1H-イミダゾール-1-カルボキシラート)であってもよい；（c）官能基がアミノまたはアルキンである場合、連結剤は、スルホ-N-スクシンイミジル3-[[2-(p-アジドサリチルアミド)エチル]-1,3'-ジチオ]プロピオナートであってもよい；および（d）官能基がチオールである場合、連結剤は、ジチオ-ビス-マレイミドエタン（DTME）、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール（BM(PEG)2）、またはジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)（DTSSP）であってもよい。
本明細書において提供される合成中間体および多量体オリゴヌクレオチドを調製および合成するための種々の方法において、官能基の活性化を伴う工程が存在してもよい。官能基の活性化において用いることができる化合物には、これらに限定されないが、1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、イミダゾール、N-ヒドロキシスクシンイミド、ジクロロヘキシルカルボジイミド、N-β-マレイミドプロピオン酸、N-β-マレイミドプロピルスクシンイミドエステル、またはN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナートが含まれる。
共有結合性リンカーのさらなる例ならびにそれらを作製および使用する方法は、それらの各々が参照により本明細書に組み入れられる、WO2016/205410、WO2018/145086、およびWO 2020/180897に記載される。
化学的または生物学的化合物
多量体オリゴヌクレオチドのいずれかは、オリゴヌクレオチドではない化学的または生物学的化合物を含んでもよい。そのような化学的または生物学的化合物には、これらに限定されないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボキシル酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、小分子（例えば、小分子治療剤または薬物分子）、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体が含まれる。
本開示のいくつかの局面において、化学的または生物学的化合物は、細胞または組織ターゲティング部分、例えば、これらに限定されないが、所定の細胞表面受容体に特異的なリガンドを含んでもよい。細胞または組織ターゲティング部分の例としては、これらに限定されないが、親油性部分、例えばリン脂質；（DNAもしくはRNA、またはそれらの誘導体の）アプタマー；ペプチドおよびタンパク質、例えば、抗原結合ペプチドまたはタンパク質；小分子；ビタミン、例えば、トコフェロールおよび葉酸；他の葉酸受容体結合リガンド；炭水化物、例えば、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）およびマンノース；他のマンノース受容体結合リガンド；コレステロール；カルボキシル酸、例えば、2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)-ウレイド]ペンタン二酸（DUPA）；ならびにベンズアミドの誘導体、例えばアニスアミドが挙げられる。
細胞または組織ターゲティング親油性部分は、カチオン基を含んでもよい。本開示のいくつかの局面において、親油性部分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン性色素（例えば、Cy3）を含む。他の親油性部分としては、これらに限定されないが、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。
抗原結合タンパク質の例としては、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、一本鎖可変断片（ScFv）、またはVHH抗原結合タンパク質が挙げられる。
GalNAcベースの生物学的部分の例としては、これらに限定されないが、一分岐型（mono-antennary）GalNAc、二分岐型（di-antennary）GalNAc、および三分岐型GalNAcが挙げられる。
その一部または全てが細胞または組織ターゲティング特性を有し得る、他の生物学的部分には、これらに限定されないが、脂肪酸、例えばコレステロール；リトコール酸（LCA）；エイコサペンタエン酸（EPA）；ドコサヘキサエン酸（DHA）；ドコサン酸（DCA）；ステロイド；セコステロイド；脂質；ガングリオシド；ヌクレオシド類似体；エンドカンナビノイド；ビタミン、例えば、コリン、ビタミンA、ビタミンE、レチノイン酸、およびトコフェリル；ならびに前述のいずれかの誘導体が含まれる。
その一部または全てが細胞または組織ターゲティング特性を有し得る、他のペプチドに基づく生物学的部分には、これに限定されないが、以下：
Figure 2023525480000101
が含まれる。
種々の局面において、本開示は、細胞核へ連結されるかまたはそれに取り込まれる物質の輸入を促進するための核局在化シグナルまたは配列（NLS）の使用および取り込みを提供する。NLSは典型的には、アミノ酸配列であり、それらの例は、薬物送達の分野におけるそのような研究によって公知である。
本開示のいくつかの局面において、化学的または生物学的化合物は、一緒に送達される他の生物学的に活性な部分がエンドソーム膜を破壊するかまたは他の方法でエンドソームまたは他のオルガネラ（その中に生物学的部分が細胞内送達時に（例えばエンドサイトーシスによって）内部移行される）を脱出することを支援または可能にするように選択される、エンドソーム脱出部分（EEM）を含んでもよい。エンドソーム脱出部分は多くの場合、脂質ベースまたはアミノ酸ベースであるが、エンドソームを破壊してそのカーゴを放出する他の化学物質を含んでもよい。EEMの例としては、これらに限定されないが、クロロキン、疎水性アミノ酸R基を含有するモチーフを有するペプチドおよびタンパク質、ならびにインフルエンザウイルス血球凝集素（HA2）が挙げられる。さらなるEEMは、Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016に記載される。
本開示の範囲内の他の化学的または生物学的化合物は、検出可能な標識を含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「検出可能な標識」は、当業者によって理解されるその通常の意味を有する。それは、マルチコンジュゲートの置換基でありかつ蛍光分光法などの画像化技術によって検出される、化学基を指す。例えば、検出可能な標識は、エネルギーの吸収後に規定された波長で放射線を放出する、フルオロフォアを含む色素であってもよい。多数の適した蛍光標識または色素が公知である。例えば、Welch et al. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999)は、ダンシルで官能化された蛍光部分を開示し、Zhu et al. (Cytometry 28:206-211, 1997)は、蛍光標識Cy3およびCy5の使用を記載する。他の標識は、Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987)、およびSmith et al. (Nature 321:674, 1986)に記載される。市販の蛍光標識の例としては、これらに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン（例えば、TMR、テキサスレッドまたはRox）、アレクサ、ボディパイ、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセン、およびシアニン（例えばCy2またはCy4）が挙げられる。検出可能な標識の他の形態には、量子ドット（Empodocles, et al., Nature 399:126-130, 1999）、金ナノ粒子（(Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000）、マイクロビーズ（Lacoste et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000）、および質量分析によって検出可能なタグを含む、マイクロ粒子が含まれる。検出可能な標識は、検出のために別の化合物との相互作用に依拠するマルチコンポーネント標識、例えば、ビオチン-ストレプトアビジンシステムであってもよい。
疾患を処置するためのおよび遺伝子発現を調節するための方法
本開示は、遺伝子発現を調節することによって、例えば、遺伝子発現を上方制御する、または下方制御もしくはサイレンシングすることによって、またはmRNAスプライシングに影響を与えることによって対応され得る疾患または障害の処置のための、開示された多量体オリゴヌクレオチドを用いるための方法を提供する。本開示の教示は、そのような状態の医学的もしくは獣医学的処置のために、または基礎研究、農業、診断、および畜産などの他の分野における遺伝子発現の調節のために、当業者が多量体オリゴヌクレオチドを設計および開発できるように機能する。複数の遺伝子標的に影響を及ぼすことが望ましい場合、本開示の多量体オリゴヌクレオチドは、単一の化学物質によってマルチターゲティングを達成するのを可能にする。
1つの局面において、本開示は、本開示による多量体オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む、遺伝子発現の調節から利益を得る疾患または障害を有する対象を処置するための方法を提供する。
1つの局面において、本開示は、本開示による多量体オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む、標的遺伝子の遺伝子発現を調節するための方法を提供する。そのような治療態様において、多量体オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する少なくとも1つのサブユニット、例えば、これらに限定されないが、siRNA、miRNA、saRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、CRISPRヌクレアーゼ、crRNA、および前述のいずれかの誘導体を含む。
同様に、本開示は、本開示による多量体オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む、2以上の標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供し、ここで、多量体オリゴヌクレオチドは、2以上の標的遺伝子または遺伝子産物における遺伝子発現を調節するサブユニットを含む。
本開示の前述の局面の全てにおいて、多量体オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を改変する1つまたは複数のサブユニットに加えて、これらに限定されないが、免疫刺激または抑制、チェックポイント阻害、および炎症低減を含む、他の治療効果を生じさせる他の置換基を含んでもよい。複数の治療効果をもたらす置換基を含むマルチコンジュゲートは、複雑な疾患および状態、例えば、がん、自己免疫障害、および神経障害のための処置を進歩させるのに役立つ。
対象
本明細書において開示される開示の処置の方法および投与の方法から恩恵を被る可能性のある対象には、これらに限定されないが、霊長類、げっ歯類、および家畜（agricultural animal）などの哺乳動物が含まれる。霊長類対象の例としては、これらに限定されないが、ヒト、チンパンジー、およびマカクが挙げられる。げっ歯類対象の例としては、これらに限定されないが、マウスおよびラットが挙げられる。家畜対象の例としては、これらに限定されないが、ウシ、ヒツジ、仔ヒツジ、ニワトリ、およびブタが含まれる。
この態様および他の態様において、本開示のマルチコンジュゲートは、送達ビヒクル中での、または細胞もしくは組織ターゲティングリガンドにカップリングさせた、薬学的組成物の形態で対象に投与することができる。
薬学的組成物
種々の局面において、本開示は、本明細書において記載される多量体オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。本明細書において用いられる場合、薬学的組成物には、疾患を予防、診断、緩和、処置、または治癒するために用いることができる、食物以外の活性剤が含まれる。同様に、本開示による種々の多量体オリゴヌクレオチドは、薬剤としての使用のため、および/または薬剤の製造における使用のための態様を含むように理解されるべきである。
薬学的組成物は、本開示による多量体オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。本明細書において用いられる場合、賦形剤は、活性成分と一緒に製剤化される天然または合成の物質であることができる。賦形剤は、長期安定化、体積の増大（例えば、増量剤、充填剤、または希釈剤）の目的で、または薬物吸収の促進、粘性の低減、もしくは溶解性の増強など、最終剤形において活性成分に対して治療上の増強を付与するために、含めることができる。賦形剤はまた、例えば、活性成分の取り扱いを助長するため、および/または保存可能安定性を延長するために（例えば、変性または凝集を阻止することにより）、製造および流通において有用であることもできる。当業者により理解されるように、適切な賦形剤の選択は、投与の経路、剤形、および活性成分を含む、種々の要因によって決定することができる。
多量体オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、局所的または全身的を含む、さまざまな方法で投与することができ、よって、本開示の薬学的組成物は、それに応じて変化することができる。投与は、いずれかの特定の送達経路、システム、または技術に限定されず、非限定的に、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、腹腔内、眼内、またはCNS注射を含む）、直腸、局所、経皮、経口、また吸入（例えばネブライザーの手段により鼻腔内または肺へ）によるものを含んでもよい。個体への投与は、単一用量でもしくは反復投与で、ならびに様々な生理学的に許容される塩形態のいずれかで、ならびに/または薬学的組成物の一部としての許容される薬学的担体および/もしくは添加物と共に行われてもよい。生理学的に許容される製剤、ならびに標準的な薬学的製剤の技法、投薬量、および賦形剤は、当業者に周知である（例えば、Physicians’ Desk Reference (PDR(登録商標)) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004;およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005を参照）。
薬学的組成物には、多量体オリゴヌクレオチドの有効量が含まれる。本明細書において用いられる場合、「有効量」は、特定の目的を達成することを結果としてもたらす濃度もしくは量、例えば、プラセボとの比較などにおいて生物学的作用を引き起こすのに妥当な量であることができる。有効量が「治療的有効量」である場合、それは、治療的使用に妥当な量、例えば、疾患を予防、診断、緩和、処置、または治癒するのに十分な量であることができる。有効量は、当技術分野において公知である方法によって決定することができる。例えば、治療的有効量は、例えばヒト臨床治験によって、経験的に決定することができる。有効量はまた、当技術分野において公知である換算係数を用いて、1種の動物（例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ）から別の動物（例えば、ヒト）における使用のために外挿することもできる。例えば、Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)を参照。
送達構築物および製剤
当業者によって理解されるように、作用の生物学的標的またはメカニズムにかかわらず、治療的オリゴヌクレオチドは、生物（例えば、治療の必要があるヒトなどの動物）における標的細胞または組織にアクセスするために一連の生理学的障害を克服しなければならない。治療的オリゴヌクレオチドは概して、望ましくない免疫応答を全て誘発することなく、血流におけるクリアランスを回避し、標的細胞型に進入し、細胞質に進入し、時として、核に進入しなければならない。種々の局面において、本開示は、細胞標的および組織標的への直接送達のための多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
直接送達戦略では、多量体オリゴヌクレオチドは、血清ヌクレアーゼおよび他の因子による分解をそれらが耐えられるようにするため、および自然免疫応答の誘発を避けるために、通常は置換基の化学修飾の形態での、安定化を必要とする。化学的安定化戦略は、当業者に公知であり、本明細書において開示される多量体オリゴヌクレオチドに関連して容易に用いられ得るかまたは適合され得る。
本開示のいくつかの局面において、多量体オリゴヌクレオチドは、送達ビヒクル内への製剤化の必要なしで標的細胞または組織へ直接送達するための、ターゲティング部分、例えば、細胞または組織ターゲティングリガンドを備えている。本開示に関連する使用に適したターゲティング部分の例としては、これらに限定されないが、親油性部分（例えば、リン脂質）；アプタマー；ペプチドまたはタンパク質（例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸[RGD]、トランスフェリン、モノクローナル抗体、もしくはその断片、例えば、一本鎖可変断片（ScFv）、またはVHH抗原結合タンパク質）；細胞成長因子、小分子、ビタミン（例えば、葉酸、トコフェロール）、炭水化物（例えば、単糖および多糖、N-アセチルガラクトサミン[GalNAc]、ガラクトース、マンノース）；コレステロール；グルタミン酸尿素（glutamate urea）（例えば、2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)-ウレイド]ペンタン二酸 [DUPA]）、ベンズアミド誘導体（例えば、アニスアミド）；および前述のいずれかの誘導体が挙げられる。いくつかの態様において、GalNacターゲティング部分は、一分岐型GalNAc、二分岐型GalNAc、または三分岐型GalNAcであってもよい。
親油性部分は、カチオン基を含むリガンドでもよい。特定の態様において、親油性部分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン性色素（例えば、Cy3）である。他の親油性部分としては、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。
ターゲティング部分は、脂肪酸、例えば、コレステロール、リトコール酸（LCA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、およびドコサン酸（DCA）、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシドもしくはヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ならびに/またはビタミン、例えば、コリン、ビタミンA、ビタミンE、およびそれらの誘導体または代謝物、またはレチノイン酸およびα-トコフェリルスクシナートなどのビタミンであってもよい。
ターゲティング部分は、これらに限定されないが、共有結合、アミド結合、もしくはエステル結合、またはビオチン-ストレプトアビジンもしくは金属-リガンド複合体などの非共有結合を介するものを含む、本開示の教示ならびに当技術分野において公知の他の技法を用いて多量体オリゴヌクレオチドに組み入れられてもよい。
ターゲティング部分は、末端の位置で、または一部の例では、内部の位置で、多量体オリゴヌクレオチドに結合することができる。いくつかの態様において、2つターゲティング部分が多量体オリゴヌクレオチドに取り入れられ、例えば、ターゲティング部分は、多量体オリゴヌクレオチドの各末端でコンジュゲートされている。3以上のターゲティング部分が、望ましければ、多量体オリゴヌクレオチド内に、かつ内部と末端の両方のさまざまな位置で、組み込まれてもよい。
種々の局面において、本開示は、細胞によってエンドサイトーシスされている多量体オリゴヌクレオチドのエンドソーム脱出を促進するためのエンドソーム脱出部分（EEM）の使用および取り込みを提供する。エンドソーム脱出部分は一般に、脂質ベースまたはアミノ酸ベースであるが、エンドソームを破壊して、多量体オリゴヌクレオチドまたはその代謝物（例えば、リンカーの切断によって遊離される多量体オリゴヌクレオチドのサブユニット）を放出する、他の化学物質を含んでもよい。EEMの例としては、これらに限定されないが、クロロキン、疎水性アミノ酸R基を含有するモチーフを有するペプチドおよびタンパク質、ならびにインフルエンザウイルス血球凝集素（HA2）が挙げられる。さらなるEEMは、Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016に記載される。
種々の局面において、本開示は、多量体オリゴヌクレオチドが送達されている細胞の核への多量体オリゴヌクレオチドまたは代謝物の輸入を促進するための核局在化シグナルまたは配列（NLS）の使用および取り込みを提供する。NLSは典型的には、アミノ酸配列であり、それらの例は、薬物送達の分野におけるそのような研究によって公知である。
当業者は、公知の送達製剤、ビヒクル、およびターゲティング部分は一般に、本開示による使用のために適合することができることを理解している。関連する教示および例は、それらの各々が参照によって本明細書にその全体が組み入れられる、米国特許第9,644,209号および同第10,597,659号；WO 2016/205410 A2；WO 2018/145086 A1；およびWO 2020/180897に記載される。
以下の実施例は、例証となるものであり、制限となるものではない。技術の多くのバリエーションが、本開示の検討時に当業者に明らかになるであろう。そのため、技術の範囲は、実施例に関連せずに決定されるべきであるが、その代わりに、添付の特許請求の範囲に関連して、等価物のそれらの完全な範囲と共に決定されるべきである。
実施例１：一本鎖オリゴヌクレオチド合成
オリゴリボヌクレオチドを、ホスホラミダイト化学を用いて、10 μmolスケールでABI 394および3900合成機（Applied Biosystems）で、または28 μmolスケールでOligopilot 10合成機でアセンブルした。固体支持体は、2'-デオキシチミジン（Glen Research, Sterling, Virginia, USA）をロードしたポリスチレン、またはコントロールされた多孔性ガラス（controlled pore glass）（CPG、520Å、75 μmol/gのローディングを有し、Prime Synthesis, Aston, PA, USAから入手）であった。補助的な合成試薬である、DNA-、2'-O-メチルRNA-、および2'-デオキシ-2'-フルオロ-RNAホスホラミダイトを、SAFC Proligo（Hamburg, Germany）から入手した。具体的には、2'-O-メチル-ウリジン（2'-OMe-U）、4-N-アセチル-2'-O-メチル-シチジン（2'-OMe-CAc）、6-N-ベンゾイル-2'-O-メチル-アデノシン（2'-OMe-Abz）、および2-N-イソブチリルグアノシン（2'-OMe-GiBu）の5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホラミダイト単量体を用いて、オリゴマー配列を構築した。2'-OMe RNAビルディングブロックと同じ核酸塩基保護基を保有する、対応するホスホラミダイトを利用して、2'-フルオロ修飾を導入した。すべてのホスホラミダイト（アセトニトリル中70 mM）についてのカップリング時間は、活性化物質として5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETT、アセトニトリル中0.5 M）を利用して3分であった。ピリジンとアセトニトリルの1:1（v/v）混合物中の50 mM 3-((ジメチルアミノ-メチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン（DDTT、AM Chemicals, Oceanside, California, USA）を用いて、ホスホロチオアート連結を導入した。公開されている方法（Wincott, F. et al: Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res, 23: 2677-2684 (1995)）にしたがって、DMT基の除去を含む固相合成（「DMTオフ合成」）の完了時に、オリゴヌクレオチドを、固体支持体から切断し、水性メチルアミン（41％）と濃アンモニア水（32％）からなる1:1混合物を用いて3時間、25℃で脱保護した。
その後、粗オリゴマーを、Source Q15（GE Healthcare）で充填されたカラムおよびAKTA Explorerシステム（GE Healthcare）を用いて陰イオン交換HPLCにより精製した。緩衝液Aは、20％水性アセトニトリル中、10 mM過塩素酸ナトリウム、20 mMトリス、1 mM EDTA、pH 7.4（Fluka, Buchs, Switzerland）であり、緩衝液Bは、500 mM過塩素酸ナトリウムを有して緩衝液Aと同じであった。32カラム体積（CV）内で22％Bから42％Bの勾配を利用した。280 nmでのUVトレースを記録した。適切な画分をプールし、3M NaOAc、pH＝5.2および70％エタノールで沈殿させた。ペレットを、遠心分離により収集した。あるいは、Sephadex HiPrepカラム（GE Healthcare）を用い、製造業者の推奨にしたがって脱塩を行った。
オリゴヌクレオチドを水中で再構成し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）により、オリゴヌクレオチドの同一性を確認した。純度を、分析用陰イオン交換HPLCにより評価した。
実施例2：チオール末端siRNAの作製
必要な場合、3'-または5'-末端チオール基を、1-O-ジメトキシトリチル-ヘキシル-ジスルフィド、1'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトリンカー（NucleoSyn, Olivet Cedex, France）を介して導入した。固相合成およびDMT基の最終除去（「DMTオフ合成」）の完了時に、オリゴヌクレオチドを、固体支持体から切断し、水性メチルアミン（41％）と濃アンモニア水（32％）からなる1:1混合物を用いて6時間、10℃で脱保護した。その後、粗オリゴヌクレオチドを、AKTA Explorer System（GE Healthcare, Freiburg, Germany）での陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。精製された(C6SSC6)-オリゴヌクレオチドを、エタノールの添加およびフリーザー中での一晩保存により沈殿させた。ペレットを、遠心分離により収集した。オリゴヌクレオチドを水中で再構成し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）により、オリゴヌクレオチドの同一性を確認した。純度を、分析用陰イオン交換およびRP HPLCにより評価した。
各ジスルフィド含有オリゴマーを、次いで、100 mM DL-ジチオスレイトール（DTT）溶液を用いて還元した。1.0 M DTTストック溶液（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, #646563）を、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（TEABc, 1M, pH 8.5, Sigma, #90360）および水で希釈して、各々DTTおよびTEABc中で100 mMの溶液をもたらした。オリゴヌクレオチドをTEABc緩衝液（100 mM, pH 8.5）中に溶解して、1 mM溶液を生じた。ジスルフィド還元を達成するために、50～100倍モルのDTT過剰量をオリゴヌクレオチド溶液に添加した。還元の進行を、Thermo Fisherから入手したDionex DNA Pac 200カラム（4×250 mm）上での分析用AEX HPLCによりモニタリングした。還元された物質、すなわち対応するチオール（C6SH）は、出発物質より前に溶出する。反応の完了後に、GE Healthcare由来のHiPrepカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーおよび溶出剤としての水により、過剰な試薬を除去した。その後、オリゴヌクレオチドを、3 M NaOAc（pH 5.2）およびエタノールを用いて沈殿させ、－20℃で保存した。
実施例3：モノ-DTMEオリゴマーの調製
チオール修飾されたオリゴヌクレオチドを、25％アセトニトリルを含有する300 mM NaOAc（pH 5.2）中に溶解し、20 OD/mL溶液をもたらした。40当量のジチオビスマレイミドエタン（DTME、Thermo Fisher、#22335）をアセトニトリル中に溶解し、15.6 mM溶液を準備した。DTME溶液を、オリゴヌクレオチド含有溶液に添加し、25℃でThermomixer（Eppendorf、Hamburg, Germany）で撹拌した。Dionex DNA Pac200カラム（4×250 mm）を用いた分析用AEX HPLCにより、反応の進行をモニタリングした。必要とされる純度レベルに応じて、過剰のDTMEを、HiPrepカラム（GE Healthcare）を用いるサイズ排除HPLCにより除去したか、または粗反応混合物を、GE Healthcareから市販されているSource 15 Q樹脂で充填されたカラムを用いる調製用AEX HPLCにより精製した。
実施例4：DTME官能性を介した二量体の調製
実施例2における手順にしたがって調製した、DTME修飾されたオリゴヌクレオチドを、チオールリンカーを備えた別のオリゴヌクレオチドと反応させた。この反応は、一本鎖配列に対して、または反応パートナーの1つの相補的オリゴヌクレオチドの事前のアニーリング後のいずれかに行うことができた。したがって、望ましい場合、DTME修飾されたオリゴヌクレオチドを、チオール修飾されたオリゴヌクレオチドと直接反応させたか、または、その相補鎖とアニーリングさせて、結果として生じた二重鎖を、チオール修飾されたオリゴヌクレオチドと反応させた。あるいは、チオール修飾されたオリゴヌクレオチドを、その相補鎖とアニーリングさせて、この二重鎖を、DTME修飾された一本鎖と反応させた。すべての場合で、反応を、300 mM NaOAc（pH 5.2）の存在下の水溶液中で行った。
実施例5：二本鎖RNA（dsRNA）を形成するための一本鎖RNA（ssRNA）のアニーリング
等モル量の相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖とを混合して、20 mM NaCl/4 mMリン酸ナトリウムpH 6.8緩衝液中でアニーリングさせることによって、dsRNAをRNA一本鎖から作製した。二重鎖形成の成功を、GE HealthcareからのSuperdex 75カラム（10×300 mm）を用いた未変性サイズ排除HPLCにより確認した。試料は、使用まで凍結保存した。
実施例6：3'-または5'-NH2誘導体化オリゴヌクレオチドの調製
センス鎖の5'-端にC-6-アミノリンカーを備えたRNAを、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg, Germany）および固体支持体としてのコントロールされた多孔性ガラス（CPG）（Prime Synthesis、Aston, PA, USA）を用いて、140 μmolのスケールで固相上での標準的なホスホラミダイト化学により産出した。2'-O-メチルおよび2'-Fヌクレオチドを含有するオリゴマーを、対応する2'-OMe-ホスホラミダイト、2'-F-メチルホスホラミダイトを利用して作製した。センス鎖の5'-端での5'-アミノヘキシルリンカーを、TFA保護されたヘキシルアミノリンカーホスホラミダイト（Sigma-Aldrich、SAFC, Hamburg, Germany）を利用して導入した。ヘキシルアミノ-リンカーが3'-位置で必要である場合は、CPG（Prime Synthesis、Aston, PA, USA）上に固定化されたフタルイミド保護されたヘキシルアミノ-リンカーを用いた。切断および脱保護を、水中41％メチルアミンと濃アンモニア水との混合物（1:1 v/v）を用いて達成した。粗オリゴヌクレオチドを、陰イオン交換HPLC、およびGE Healthcareから入手したSource 15Q樹脂で充填されたカラム（2.5×18 cm）を用いて精製した。
実施例7：1つの分割センス鎖へのアニーリングを介する分割鎖多量体オリゴヌクレオチドの合成
siRNAのホモ三量体を、図2に図示される方法論に従って合成する。siRNAセンス鎖の部分配列（5’-Se-3’）を調製し、合成機で全長siRNAセンス鎖（5‘-Sense-3‘）に対してジスルフィドリンカー（図3で-S-S-として表される）を介して連結する。siRNAセンス配列の残部（5‘-nse-3‘）が全長siRNA鎖に対してジスルフィドリンカーを介して連結されている第2の配列も合成される。任意で、リガンドを全長センス鎖の一方または両方の末端に結合する。次いで、2つの部分二量体を、実施例5に記載される条件下で3当量の相補的なアンチセンス鎖とアニーリングさせ、標的ホモ三量体siRNAを形成する。
実施例8：2つの分割センス鎖へのアニーリングを介する分割鎖多量体オリゴヌクレオチドの合成
siRNAのホモ四量体を、図3に図示される方法論に従って合成する。siRNAセンス鎖の部分配列（5’-Se-3’） を調製し、合成機で全長siRNAセンス鎖に対してジスルフィドリンカー（図3で-S-S-として表される）を介して連結し、化合物5’-Sense-3’-S-S-5’Se-3’を得る。任意で、リガンドを全長配列の末端に結合する。これとは別に、siRNA配列の残部に対応しかつ1つの末端に保護されたチオールを保有するオリゴマー（5’-nse-3’-SSR）を、合成機で調製する。精製後、チオールを実施例2に記載された条件下で脱保護し、部分siRNAのホモ二量体（5’-nse-3’S-CL-S3’-esn-5’）を、実施例3および4に記載されるようにDTME誘導体（5’-nse-3’-Mal）を介して調製する。1当量の5’-nse-3’-ホモ二量体（5’-nse-3’S-CL-S3’-esn-5’）および2当量の化合物5’-Sense-3’S-S5’Se-3’(任意で、リガンド有りまたは無し）を、実施例5に記載された条件下で4当量のアンチセンス鎖にアニーリングさせ、3つの切断可能な連結を含有する所望のホモ四量体siRNAを得る。
実施例9：逐次的チオール-マレイミド反応および非対称性アニーリングを介する分割鎖多量体オリゴヌクレオチドの合成。ビルディングブロックの調製
siRNAのホモ多量体（三量体から八量体）を、図1および4～9に記載される方法論に従って図1に図示されるビルディングブロックを用いて合成する。
5‘アミノ基および3‘ジスルフィドを有する全長siRNAセンス鎖（NH2-5’-Sense-3’-SSR）を合成機で調製し、図1に図示されるように、ブロッキング解除（unblocking）および精製後に、選択したリガンドを、アミノ官能基を介して産物の一部に結合する。実施例2に記載される手法により、ジスルフィドを、図1に図示されるように対応するチオール誘導体に変換する。
これとは別に、実施例2に記載される手法を介して図1に図示されるように対応するチオールに変換される5’-末端でのジスルフィドを有する（RSS-5’-Se-3’）、全長鎖5’-領域に対応するsiRNA鎖の部分配列（5’-Se-3’）を合成機で調製する。チオール化された産物の一部を、実施例3に記載される手法により図1に図示されるように対応する5‘-モノ-DTME誘導体（Mal-5’-Se-3’）にさらに変換する。
並行して、実施例2に記載される手法を介して図1に図示されるように対応するチオールに変換される3’-末端でのジスルフィドを有する（5’-nse-3’-SSR）、全長鎖の3’-領域に対応するsiRNA鎖の部分配列（5’-nse-3’）を合成機で調製する。チオール化された産物の一部を、実施例3に記載される手法を介して図1に図示されるように対応する3‘-モノ-DTME誘導体（5’-nse-3’-Mal）にさらに変換する。
並行して、全長siRNAアンチセンス鎖を合成機で調製し、ブロック解除し、精製する。
実施例10：逐次的チオール-マレイミド反応および非対称性アニーリングを介する分割鎖ホモ三量体の合成
図4に図示されるスキームに従って、実施例3の手法を介するチオール化された全長センス鎖と部分siRNA配列マレイミド誘導体 Mal-5’-Se-3’との反応、その後に続く、2当量のアンチセンス鎖
Figure 2023525480000102
とのアニーリングによって、siRNAのホモ三量体を調製する。産物と1当量の部分siRNA配列マレイミド誘導体 5’-nse-3’-Malとのアニーリング、その後に続く、1当量の全長二本鎖チオール化siRNAとの反応によって、所望のホモ三量体を得る。
実施例11：逐次的チオール-マレイミド反応および非対称性アニーリングを介する分割鎖ホモ四量体の合成
siRNAのホモ四量体を、図5に記載されたスキームに従って調製する。全長siRNAと末端マレイミドを有する分割鎖siRNAとの二量体を、実施例10でのように調製する。これとは別に、図5に図示されるように、チオール化されたsiRNAセンス鎖と分割鎖マレイミド誘導体 Mal-5’-Se-3’との反応、その後に続く、2当量のアンチセンス鎖
Figure 2023525480000103
および1当量のチオール化された分割鎖 5’-nse-3’-SHとの逐次的アニーリングによって、全長siRNAと末端チオールを有する分割鎖siRNAとの第2の二量体を調製する。マレイミド官能基を持つ二本鎖全長/分割鎖二量体とチオール官能基を持つ二本鎖全長/分割鎖二量体との反応によって、3つの切断可能なジスルフィド連結を有する所望のホモ四量体が得られる。
実施例12：逐次的チオール-マレイミド反応を介する分割鎖ホモ五量体の合成
siRNAのホモ五量体を、図6に図示されるスキームに従って調製する。実施例10で調製された全長siRNAと末端マレイミドを有する分割鎖siRNAとの二量体を、実施例5に記載された条件下でのアンチセンス鎖
Figure 2023525480000104
にアニーリングさせたHS-5’-Se-3’、その後の5’-nse-3’-Malの逐次的付加を介して伸長し、中間体全長/分割鎖/分割鎖三量体マレイミド誘導体を得る。実施例4に記載された条件下でのこの物質と実施例11で調製した全長/分割鎖チオール二量体との反応によって、所望のホモ五量体が得られる。
実施例13：逐次的チオール-マレイミド反応を介する分割鎖ホモ六量体の合成
実施例5に記載された条件下での図7に図示されるような5’-nse-3’-Mal、アンチセンス鎖
Figure 2023525480000105
にアニーリングさせたHS-5’-Se-3’、および5’-nse-3’-SHの逐次的添加による、実施例10で調製された中間体の鎖伸長の図7に図示されるスキームに従って、siRNAのホモ六量体を調製する。次いで、2本の三量体鎖を、実施例4に記載された条件下でのチオール/マレイミド反応によって連結する。
実施例14：逐次的チオール-マレイミド反応を介する分割鎖ホモ七量体の合成
図8に図示されるスキームに従って、実施例5に記載された条件下でのアンチセンス鎖
Figure 2023525480000106
にアニーリングさせたHS-5’-Se-3’、および5’-nse-3’-Malおよび5’-nse-3’-SHの逐次的付加による実施例13で調製されたマレイミド誘導体化三量体の鎖伸長、その後に続く、結果として生じるマレイミド誘導体化四量体と実施例13からのチオール誘導体化三量体との実施例4に記載された条件下でのチオール/マレイミド反応による連結によって、siRNAのホモ七量体を調製する。
実施例15：逐次的チオール-マレイミド反応を介する分割鎖ホモ八量体の合成
図9に図示されるスキームに従って、実施例5に記載された条件下での5’-nse-3’-Mal、アンチセンス鎖
Figure 2023525480000107
にアニーリングさせたHS-5’-Se-3’、および5’-nse-3’-SHの逐次的付加による実施例13からの部分三量体中間体の鎖伸長によって、siRNAのホモ八量体を調製する。次いで、実施例4に記載された条件下でのチオール部分とマレイミド部分との反応によって、結果として生じるチオール化された四量体を、実施例14で得たマレイミド官能基を持つ四量体に連結する。
実施例16：逐次的チオール-マレイミド反応および非対称性アニーリングを介するsiDMPKの分割鎖ホモ三量体の合成
筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼmRNA（DMPK）を標的とするsiRNAのホモ三量体を、図11におけるスキームに従って調製する。実施例2に記載される方法を用いて、3‘-チオール残基を有する全長DMPKセンス鎖を合成機で調製する。5’-チオールを有する（HS-5’-DM-3’）DMPKセンス鎖の部分配列（5’-DM-3’）もまた、合成機で調製し、実施例2および3に記載される方法によって対応するモノ-DTME誘導体（Mal-5’-DM-3’）を変換する。次いで、チオール化された全長鎖および DTME誘導体化部分長DMPK鎖を一緒に反応させ、対応する一本鎖部分二量体を形成し、次いで、実施例5における条件に従って、2当量の全長DMPKアンチセンス鎖
Figure 2023525480000108
とアニーリングさせる。
3‘-チオールで誘導体化された（5‘-PK-3‘-SH）siRNAセンス配列の残部（5‘-PK-3‘）を含む第2の配列も合成し、実施例3における手法にしたがって対応するモノ-DTME誘導体に変換し、二本鎖部分二量体とアニーリングさせ、3’末端マレイミド基を有するDMPKの二本鎖全長/分割鎖二量体を得る。次いで、この物質を3‘-チオール化された二本鎖全長DMPK siRNAと反応させ、所望のDMPK siRNAのホモ三量体を形成する。
実施例17：逐次的チオール-マレイミド反応および非対称性アニーリングを介するsiHTTの分割鎖ホモ三量体の合成
ハンチントンmRNA（HTT）を標的とするsiRNAのホモ三量体を、図12に図示されるスキームに従って調製する。3‘-チオール残基を有する全長 HTTセンス鎖（HTT）を、実施例2に記載される方法を用いて合成機で調製する。5’-チオールを有する（HS-5’-HT-3’） HTTセンス鎖の部分配列（5’-HT-3’）も合成機で調製し、実施例2および3に記載される方法によって対応するモノ-DTME誘導体（Mal-5’-HT-3’）を変換する。次いで、チオール化された全長（HTT）鎖およびDTME部分長（HT）鎖を一緒に反応させ、対応する一本鎖部分二量体を形成し、次いで、実施例5における条件に従って、2当量の全長HTTアンチセンス鎖
Figure 2023525480000109
とアニーリングさせる。
siRNAセンス配列の残部（5‘-Ts-3‘）が3‘-チオールで誘導体化されている（5‘-Ts-3‘-SH）第2の配列も合成され、実施例3における手法に従って対応するモノ-DTME誘導体に変換され、二本鎖部分二量体とアニーリングさせ、3’-末端マレイミド基を有するHTTの二本鎖全長/分割鎖二量体を得る。次いで、この物質を3‘-チオール化された二本鎖全長HTT siRNAと反応させ、所望のHTT siRNAのホモ三量体を形成する。
実施例18：逐次的チオール-マレイミド反応を介する分割鎖ヘテロ五量体の合成
siRNAのヘテロ五量体を、図10に図示されるスキームに従って調製する。インタクトなサブユニットを有する第1のsiRNAと末端マレイミドを有する分割鎖サブユニットとの二量体（実施例10で調製される）を、実施例5に記載される条件下でのアンチセンス鎖
Figure 2023525480000110
にアニーリングさせたHS-5’-Se-3’、その後に続く、5’-nse-3’-Malの逐次的付加を介して伸長し、中間体のインタクト/分割鎖/分割鎖三量体マレイミド誘導体を得る。
これとは別に、3’-チオールを有するインタクトな二本鎖の第2のsiRNA（第1のsiRNAと異なる配列を有する）を、第1のsiRNAのセンス鎖の5’-部分配列の5’-マレイミド誘導体（Mal-5’-Se-3’）と反応させ、産物を、第1のsiRNAの全長アンチセンス鎖
Figure 2023525480000111
、続いて、第1のsiRNAのセンス鎖の3’-部分配列の3’-チオール化された誘導体（5‘-nse-3‘-SH）と逐次的にアニーリングさせ、チオール化されたヘテロ二量体中間体を得る。
チオール化されたヘテロ二量体中間体とホモ三量体マレイミド誘導体との反応によって、第1のsiRNAの4つのサブユニットおよび第2のsiRNAの1つのサブユニットを有する所望のヘテロ五量体が得られる。
[本発明1001]
サブユニットを含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
サブユニットの各々が独立して、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含み；サブユニットの各々が、共有結合性リンカーによって別のサブユニットに連結され；かつ少なくとも1つのサブユニットが、少なくとも1つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、
前記多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1002]
少なくとも1つのサブユニットが、相補鎖にアニーリングされて二本鎖サブユニットを形成する2つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1003]
構造1：
Figure 2023525480000293
（構造1）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000294
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000295
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●が共有結合性リンカーである、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1004]
構造2：
Figure 2023525480000296
（構造2）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000297
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000298
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●が共有結合性リンカーである、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1005]
構造3：
Figure 2023525480000299
(構造3）
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、構造中：各
Figure 2023525480000300
が独立して、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
●が共有結合性リンカーである、
前記多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1006]
構造3がホモ二量体である、本発明1005の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1007]
構造3がヘテロ二量体である、本発明1005の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1008]
少なくとも1つのサブユニットが、構造4：
Figure 2023525480000301
(構造4）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000302
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●が、部分一本鎖オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドおよび隣接するオリゴヌクレオチドサブユニットに連結された共有結合性リンカーであり；かつ
Figure 2023525480000303
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1009]
構造5：
Figure 2023525480000304
(構造5）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000305
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000306
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、一本鎖オリゴヌクレオチドを部分一本鎖オリゴヌクレオチドに連結する共有結合性リンカーであり；かつ
Figure 2023525480000307
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1010]
構造6：
Figure 2023525480000308
(構造6）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000309
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000310
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
各
Figure 2023525480000311
が相補鎖であり：かつ
a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々が独立して、0以上の整数であり、但し、c、e、h、およびjの少なくとも1つが≧1である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1011]
a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々が独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、c、e、hおよびjの少なくとも1つが≧1である、本発明1010の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1012]
構造7：
Figure 2023525480000312
（構造7）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000313
が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000314
が各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000315
が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●が各々、共有結合性リンカーであり；
mおよびnが各々独立して、1以上の整数であり；かつ
oが0以上の整数である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1013]
mおよびnが各々独立して、1～10の範囲での整数であり；かつoが0～10の範囲での整数である、本発明1012の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1014]
構造8：
Figure 2023525480000316
（構造8）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000317
が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000318
が各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000319
が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●が各々、共有結合性リンカーであり；かつ
pおよびqが各々独立して、0以上の整数である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1015]
pおよびqが各々独立して、0～10の範囲での整数であるか；またはpおよびqが各々独立して、0～3の範囲での整数である、本発明1014の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1016]
構造9：
Figure 2023525480000320
（構造9）
を含み、構造中：
Figure 2023525480000321
が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000322
が各々、相補鎖であり；
Figure 2023525480000323
が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●が各々、共有結合性リンカーであり；
rが1以上の整数であり；かつ
sが0以上の整数である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1017]
rが1～10の範囲での整数であり、かつsが0～10の範囲での整数であるか；またはrが1～3の範囲での整数であり、かつsが0または 1である、本発明1016の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1018]
構造10：
Figure 2023525480000324
（構造10）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000325
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000326
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000327
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1019]
構造11：
Figure 2023525480000328
（構造11）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000329
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000330
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
各
Figure 2023525480000331
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1020]
構造12：
Figure 2023525480000332
（構造12）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000333
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000334
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000335
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1021]
構造13：
Figure 2023525480000336
（構造13）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000337
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000338
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000339
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1022]
構造14：
Figure 2023525480000340
（構造14）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000341
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000342
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000343
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1023]
構造15：
Figure 2023525480000344
（構造15）
を含み、構造中：
各
Figure 2023525480000345
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各
Figure 2023525480000346
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
各
Figure 2023525480000347
が相補鎖である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1024]
構造16：
Figure 2023525480000348
(構造16）
を含み、構造中、各
Figure 2023525480000349
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
Figure 2023525480000350
が相補鎖であり；
Figure 2023525480000351
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
●が共有結合性リンカーであり；かつ
tおよびuが各々独立して、0以上の整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数である、
本発明1001の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1025]
tおよびuが各々独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数であるか；またはtおよびuが各々独立して、0～3の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数である、本発明1024の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1026]
各部分一本鎖オリゴヌクレオチドが、5～14ヌクレオチド長である、本発明1001～1025のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1027]
少なくとも2つのサブユニットが、異なる細胞標的に対して活性を有する、本発明1001～1026のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1028]
サブユニットの全てが、異なる細胞標的に対して活性を有する、本発明1027の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1029]
少なくとも2つのサブユニットが、同じ細胞標的に対して活性を有する、本発明1001～1026のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1030]
サブユニットの全てが、異なる細胞標的に対して活性を有する、本発明1029の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1031]
4つ以上のサブユニットを含む、本発明1001～1030のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1032]
4、5、6、7、8、9、または10個のサブユニットを含む、本発明1031の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1033]
多量体オリゴヌクレオチド内の各核酸が、RNA、DNA、または人工もしくは非天然の核酸類似体である、本発明1001～1032のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1034]
少なくとも1つのサブユニットが、siRNA、saRNA、またはmiRNAである、本発明1001～1033のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1035]
サブユニットの全てがsiRNAである、本発明1034の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1036]
サブユニットの全てがsaRNAである、本発明1034の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1037]
サブユニットの全てがmiRNAである、本発明1034の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1038]
少なくとも1つのサブユニットが一本鎖サブユニットである、本発明1001～1033のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1039]
少なくとも1つの一本鎖サブユニットがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、本発明1038の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1040]
少なくとも1つの共有結合性リンカー●が切断可能な共有結合性リンカーである、本発明1001～1039のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1041]
切断可能な共有結合性リンカーが、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物切断性（bio-cleavable）結合、または酵素で切断可能な結合を含む、本発明1040の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1042]
切断可能な共有結合性リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、本発明1040または 1041の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1043]
各共有結合性リンカーが、独立して、ジスルフィド結合または構造25：
Figure 2023525480000352
(構造25）
の化合物であり、
構造中：
Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；
各R 1 が独立して、C 2 ～C 10 アルキル、C 2 ～C 10 アルコキシ、または C 1 ～C 10 アリール基であり；
R 2 が、チオプロピオナートまたはジスルフィド基であり；かつ
各Xが独立して、
Figure 2023525480000353
から選択される、
本発明1001～1042のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1044]
構造25の化合物が、
Figure 2023525480000354
であり、
構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
本発明1043の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1045]
構造25の化合物が、構造26：
Figure 2023525480000355
（構造26）
の化合物であり、
構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
本発明1043の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1046]
構造25の化合物が、構造27：
Figure 2023525480000356
（構造27）
の化合物であり、
構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
本発明1043の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1047]
構造25の化合物が、構造28：
Figure 2023525480000357
(構造28）
の化合物であり、
構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
本発明1043の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1048]
構造25の共有結合性リンカーが、構造29：
Figure 2023525480000358
(構造29）
の共有結合性リンカー前駆体から形成され、
構造中、各R 1 が独立して、C 2 ～C 10 アルキル、C 2 ～C 10 アルコキシ、またはC 1 ～C 10 アリール基であり；かつ
R 2 が、チオプロピオナートまたはジスルフィド基である、
本発明1043～1047のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1049]
少なくとも1つの共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される、本発明1001～1048のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1050]
全ての共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される、本発明1049の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1051]
少なくとも1つの共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの内部ヌクレオチドに結合される、本発明1001～1049のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1052]
少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、ヌクレオチドリンカーを含む、本発明1001～1051のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1053]
ヌクレオチドリンカーが、2～6ヌクレオチド長である、本発明1052の多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1054]
各共有結合性リンカー●が同じである、本発明1001～1053のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1055]
少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、他の共有結合性リンカーと異なっている、本発明1001～1053のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1056]
少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの3’端と第2のサブユニットの3’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、本発明1001～1055のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1057]
少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの3’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、本発明1001～1056のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1058]
少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの5’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、本発明1001～1057のいずれかにおける多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1059]
オリゴヌクレオチドではない化学的または生物学的部分をさらに含む、本発明1001～1058のいずれかの多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1060]
少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である、本発明1001～1059のいずれかにおける多量体オリゴヌクレオチド。
[本発明1061]
構造16：
Figure 2023525480000359
(構造16）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
構造中、各
Figure 2023525480000360
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000361
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000362
が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつtおよびuが各々独立して、1以上の整数であり；
前記方法が、構造17
Figure 2023525480000363
（構造17）
および構造18
Figure 2023525480000364
(構造18）
を相補鎖
Figure 2023525480000365
とアニーリングさせ、それによって構造16を形成する工程を含む、
前記方法。
[本発明1062]
構造8：
Figure 2023525480000366
(構造8）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
構造中、各
Figure 2023525480000367
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000368
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000369
が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつpおよびqが各々独立して、1以上の整数であり；
前記方法が、構造19
Figure 2023525480000370
（構造19）、
構造20
Figure 2023525480000371
（構造20）、
および1つまたは複数の構造21
Figure 2023525480000372
（構造21）
を相補鎖
Figure 2023525480000373
とアニーリングさせ、それによって構造8を形成する工程を含む、
前記方法。
[本発明1063]
構造9A：
Figure 2023525480000374
（構造9A）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
構造中、各
Figure 2023525480000375
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000376
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
Figure 2023525480000377
が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrおよびsが各々独立して、1以上の整数であり；
前記方法が、構造22
Figure 2023525480000378
(構造22）、
および構造23
Figure 2023525480000379
(構造23）、
および1つまたは複数の構造24
Figure 2023525480000380
(構造24）
を相補鎖
Figure 2023525480000381
とアニーリングさせ、それによって構造9Aを形成する工程を含む、
前記方法。
[本発明1064]
構造9B：
Figure 2023525480000382
（構造9B）
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
構造中、各
Figure 2023525480000383
が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；各
Figure 2023525480000384
が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；各
Figure 2023525480000385
が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrが1以上の整数であり；
前記方法が、構造22
Figure 2023525480000386
（構造22）、
および1つまたは複数の構造24
Figure 2023525480000387
（構造24）、
および部分一本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023525480000388
を相補鎖
Figure 2023525480000389
とアニーリングさせ、それによって構造9Bを形成する工程を含む、
前記方法。
[本発明1065]
本発明1001～1060のいずれかの多量体オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
[本発明1066]
医薬の製造における使用のための、本発明1001～1060のいずれかの多量体オリゴヌクレオチドを含む組成物。
[本発明1067]
本発明1001～1060のいずれかの多量体オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む、対象を処置するための方法。
これらのおよび他の態様は、以下により詳細に説明される。

Claims (67)

  1. サブユニットを含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
    サブユニットの各々が独立して、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含み；サブユニットの各々が、共有結合性リンカーによって別のサブユニットに連結され；かつ少なくとも1つのサブユニットが、少なくとも1つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、
    前記多量体オリゴヌクレオチド。
  2. 少なくとも1つのサブユニットが、相補鎖にアニーリングされて二本鎖サブユニットを形成する2つの部分一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  3. 構造1：
    Figure 2023525480000112
    （構造1）
    を含み、構造中：
    Figure 2023525480000113
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000114
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
    ●が共有結合性リンカーである、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  4. 構造2：
    Figure 2023525480000115
    （構造2）
    を含み、構造中：
    Figure 2023525480000116
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000117
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
    ●が共有結合性リンカーである、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  5. 構造3：
    Figure 2023525480000118
    (構造3）
    を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、構造中：各
    Figure 2023525480000119
    が独立して、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
    ●が共有結合性リンカーである、
    前記多量体オリゴヌクレオチド。
  6. 構造3がホモ二量体である、請求項5記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  7. 構造3がヘテロ二量体である、請求項5記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  8. 少なくとも1つのサブユニットが、構造4：
    Figure 2023525480000120
    (構造4）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000121
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    ●が、部分一本鎖オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドおよび隣接するオリゴヌクレオチドサブユニットに連結された共有結合性リンカーであり；かつ
    Figure 2023525480000122
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  9. 構造5：
    Figure 2023525480000123
    (構造5）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000124
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000125
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、一本鎖オリゴヌクレオチドを部分一本鎖オリゴヌクレオチドに連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    Figure 2023525480000126
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  10. 構造6：
    Figure 2023525480000127
    (構造6）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000128
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000129
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
    各
    Figure 2023525480000130
    が相補鎖であり：かつ
    a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々が独立して、0以上の整数であり、但し、c、e、h、およびjの少なくとも1つが≧1である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  11. a、b、c、d、e、f、g、h、i、jおよびkの各々が独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、c、e、hおよびjの少なくとも1つが≧1である、請求項10記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  12. 構造7：
    Figure 2023525480000131
    （構造7）
    を含み、構造中：
    Figure 2023525480000132
    が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000133
    が各々、相補鎖であり；
    Figure 2023525480000134
    が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    ●が各々、共有結合性リンカーであり；
    mおよびnが各々独立して、1以上の整数であり；かつ
    oが0以上の整数である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  13. mおよびnが各々独立して、1～10の範囲での整数であり；かつoが0～10の範囲での整数である、請求項12記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  14. 構造8：
    Figure 2023525480000135
    （構造8）
    を含み、構造中：
    Figure 2023525480000136
    が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000137
    が各々、相補鎖であり；
    Figure 2023525480000138
    が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    ●が各々、共有結合性リンカーであり；かつ
    pおよびqが各々独立して、0以上の整数である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  15. pおよびqが各々独立して、0～10の範囲での整数であるか；またはpおよびqが各々独立して、0～3の範囲での整数である、請求項14記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  16. 構造9：
    Figure 2023525480000139
    （構造9）
    を含み、構造中：
    Figure 2023525480000140
    が各々、一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000141
    が各々、相補鎖であり；
    Figure 2023525480000142
    が各々、部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    ●が各々、共有結合性リンカーであり；
    rが1以上の整数であり；かつ
    sが0以上の整数である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  17. rが1～10の範囲での整数であり、かつsが0～10の範囲での整数であるか；またはrが1～3の範囲での整数であり、かつsが0または 1である、請求項16記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  18. 構造10：
    Figure 2023525480000143
    （構造10）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000144
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000145
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    各
    Figure 2023525480000146
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  19. 構造11：
    Figure 2023525480000147
    （構造11）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000148
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000149
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；
    各
    Figure 2023525480000150
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  20. 構造12：
    Figure 2023525480000151
    （構造12）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000152
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000153
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    各
    Figure 2023525480000154
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  21. 構造13：
    Figure 2023525480000155
    （構造13）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000156
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000157
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    各
    Figure 2023525480000158
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  22. 構造14：
    Figure 2023525480000159
    （構造14）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000160
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000161
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    各
    Figure 2023525480000162
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  23. 構造15：
    Figure 2023525480000163
    （構造15）
    を含み、構造中：
    各
    Figure 2023525480000164
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各
    Figure 2023525480000165
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつ
    各
    Figure 2023525480000166
    が相補鎖である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  24. 構造16：
    Figure 2023525480000167
    (構造16）
    を含み、構造中、各
    Figure 2023525480000168
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    Figure 2023525480000169
    が相補鎖であり；
    Figure 2023525480000170
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；
    ●が共有結合性リンカーであり；かつ
    tおよびuが各々独立して、0以上の整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数である、
    請求項1記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  25. tおよびuが各々独立して、0～10の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数であるか；またはtおよびuが各々独立して、0～3の範囲での整数であり、但し、tおよびuの少なくとも1つが、1以上の整数である、請求項24記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  26. 各部分一本鎖オリゴヌクレオチドが、5～14ヌクレオチド長である、請求項1～25のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  27. 少なくとも2つのサブユニットが、異なる細胞標的に対して活性を有する、請求項1～26のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  28. サブユニットの全てが、異なる細胞標的に対して活性を有する、請求項27記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  29. 少なくとも2つのサブユニットが、同じ細胞標的に対して活性を有する、請求項1～26のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  30. サブユニットの全てが、異なる細胞標的に対して活性を有する、請求項29記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  31. 4つ以上のサブユニットを含む、請求項1～30のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  32. 4、5、6、7、8、9、または10個のサブユニットを含む、請求項31記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  33. 多量体オリゴヌクレオチド内の各核酸が、RNA、DNA、または人工もしくは非天然の核酸類似体である、請求項1～32のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  34. 少なくとも1つのサブユニットが、siRNA、saRNA、またはmiRNAである、請求項1～33のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  35. サブユニットの全てがsiRNAである、請求項34記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  36. サブユニットの全てがsaRNAである、請求項34記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  37. サブユニットの全てがmiRNAである、請求項34記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  38. 少なくとも1つのサブユニットが一本鎖サブユニットである、請求項1～33のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  39. 少なくとも1つの一本鎖サブユニットがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項38記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  40. 少なくとも1つの共有結合性リンカー●が切断可能な共有結合性リンカーである、請求項1～39のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  41. 切断可能な共有結合性リンカーが、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物切断性（bio-cleavable）結合、または酵素で切断可能な結合を含む、請求項40記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  42. 切断可能な共有結合性リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、請求項40または 41記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  43. 各共有結合性リンカーが、独立して、ジスルフィド結合または構造25：
    Figure 2023525480000171
    (構造25）
    の化合物であり、
    構造中：
    Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合され；
    各R1が独立して、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、または C1～C10アリール基であり；
    R2が、チオプロピオナートまたはジスルフィド基であり；かつ
    各Xが独立して、
    Figure 2023525480000172
    から選択される、
    請求項1～42のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  44. 構造25の化合物が、
    Figure 2023525480000173
    であり、
    構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
    請求項43記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  45. 構造25の化合物が、構造26：
    Figure 2023525480000174
    （構造26）
    の化合物であり、
    構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
    請求項43記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  46. 構造25の化合物が、構造27：
    Figure 2023525480000175
    （構造27）
    の化合物であり、
    構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
    請求項43記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  47. 構造25の化合物が、構造28：
    Figure 2023525480000176
    (構造28）
    の化合物であり、
    構造中、各末端Sが、共有結合によってまたはリンカーよってオリゴヌクレオチドサブユニットに結合される、
    請求項43記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  48. 構造25の共有結合性リンカーが、構造29：
    Figure 2023525480000177
    (構造29）
    の共有結合性リンカー前駆体から形成され、
    構造中、各R1が独立して、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリール基であり；かつ
    R2が、チオプロピオナートまたはジスルフィド基である、
    請求項43～47のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  49. 少なくとも1つの共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される、請求項1～48のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  50. 全ての共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの3’または5’末端に結合される、請求項49記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  51. 少なくとも1つの共有結合性リンカーが、オリゴヌクレオチドサブユニットの内部ヌクレオチドに結合される、請求項1～49のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  52. 少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、ヌクレオチドリンカーを含む、請求項1～51のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  53. ヌクレオチドリンカーが、2～6ヌクレオチド長である、請求項52記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  54. 各共有結合性リンカー●が同じである、請求項1～53のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  55. 少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、他の共有結合性リンカーと異なっている、請求項1～53のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  56. 少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの3’端と第2のサブユニットの3’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、請求項1～55のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  57. 少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの3’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、請求項1～56のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  58. 少なくとも2つのサブユニットが、第1のサブユニットの5’端と第2のサブユニットの5’との間の共有結合性リンカー●によって連結される、請求項1～57のいずれか一項における多量体オリゴヌクレオチド。
  59. オリゴヌクレオチドではない化学的または生物学的部分をさらに含む、請求項1～58のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチド。
  60. 少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である、請求項1～59のいずれか一項における多量体オリゴヌクレオチド。
  61. 構造16：
    Figure 2023525480000178
    (構造16）
    を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
    構造中、各
    Figure 2023525480000179
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000180
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000181
    が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつtおよびuが各々独立して、1以上の整数であり；
    前記方法が、構造17
    Figure 2023525480000182
    （構造17）
    および構造18
    Figure 2023525480000183
    (構造18）
    を相補鎖
    Figure 2023525480000184
    とアニーリングさせ、それによって構造16を形成する工程を含む、
    前記方法。
  62. 構造8：
    Figure 2023525480000185
    (構造8）
    を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
    構造中、各
    Figure 2023525480000186
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000187
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000188
    が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり、かつpおよびqが各々独立して、1以上の整数であり；
    前記方法が、構造19
    Figure 2023525480000189
    （構造19）、
    構造20
    Figure 2023525480000190
    （構造20）、
    および1つまたは複数の構造21
    Figure 2023525480000191
    （構造21）
    を相補鎖
    Figure 2023525480000192
    とアニーリングさせ、それによって構造8を形成する工程を含む、
    前記方法。
  63. 構造9A：
    Figure 2023525480000193
    （構造9A）
    を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
    構造中、各
    Figure 2023525480000194
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000195
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各
    Figure 2023525480000196
    が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrおよびsが各々独立して、1以上の整数であり；
    前記方法が、構造22
    Figure 2023525480000197
    (構造22）、
    および構造23
    Figure 2023525480000198
    (構造23）、
    および1つまたは複数の構造24
    Figure 2023525480000199
    (構造24）
    を相補鎖
    Figure 2023525480000200
    とアニーリングさせ、それによって構造9Aを形成する工程を含む、
    前記方法。
  64. 構造9B：
    Figure 2023525480000201
    （構造9B）
    を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
    構造中、各
    Figure 2023525480000202
    が一本鎖オリゴヌクレオチドであり；各
    Figure 2023525480000203
    が部分一本鎖オリゴヌクレオチドであり；各
    Figure 2023525480000204
    が相補鎖であり；各●が、隣接するオリゴヌクレオチドを連結する共有結合性リンカーであり；かつrが1以上の整数であり；
    前記方法が、構造22
    Figure 2023525480000205
    （構造22）、
    および1つまたは複数の構造24
    Figure 2023525480000206
    （構造24）、
    および部分一本鎖オリゴヌクレオチド
    Figure 2023525480000207
    を相補鎖
    Figure 2023525480000208
    とアニーリングさせ、それによって構造9Bを形成する工程を含む、
    前記方法。
  65. 請求項1～60のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  66. 医薬の製造における使用のための、請求項1～60のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチドを含む組成物。
  67. 請求項1～60のいずれか一項記載の多量体オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む、対象を処置するための方法。
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