KR20230003579A - 분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR20230003579A
KR20230003579A KR1020227041998A KR20227041998A KR20230003579A KR 20230003579 A KR20230003579 A KR 20230003579A KR 1020227041998 A KR1020227041998 A KR 1020227041998A KR 20227041998 A KR20227041998 A KR 20227041998A KR 20230003579 A KR20230003579 A KR 20230003579A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
multimeric
stranded
subunit
multimeric oligonucleotide
Prior art date
Application number
KR1020227041998A
Other languages
English (en)
Inventor
조나단 마일스 브라운
Original Assignee
엠펙 엘에이, 엘.엘.씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엠펙 엘에이, 엘.엘.씨. filed Critical 엠펙 엘에이, 엘.엘.씨.
Publication of KR20230003579A publication Critical patent/KR20230003579A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 개시내용은 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드로서, 각각의 서브유닛은 독립적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 각각의 서브유닛은 공유 링커에 의해 또 다른 서브유닛에 연결되고, 적어도 하나의 서브유닛은 적어도 하나의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법, 및 본원에 개시된 다량체 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드
임의의 우선권 출원에 대한 참조 인용
본 출원과 함께 제출된 PCT 출원서에서 외국 또는 국내 우선권 청구가 확인되는 임의의 출원 및 모든 출원은 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 개시내용의 분야
본 개시내용은 다량체 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드, 분할된 가닥을 사용하여 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법, 및 생성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드는 이제 여러 응용 분야와 진행 중인 임상 시험에서 잘 확립된 부류의 치료제이다. 그러나, 많은 요인들이 여전히 올리고뉴클레오타이드 치료제의 개발 및 사용, 예를 들어, 표적 세포로의 올리고뉴클레오타이드의 전달 및 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양으로 표적 세포 내로의 올리고뉴클레오타이드의 후속적인 내재화를 제한한다.
이 문제를 해결하기 위해, 특정 세포 표면 수용체를 표적화하는 리간드에 접합된 올리고뉴클레오타이드가 조사되었다. 한 가지 이러한 리간드인 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)의 사용은 이들 세포의 표면 상에서 많은 수로 발현되는 아시알로당단백질 수용체에 대한 그의 매우 특이적이고 효율적인 결합으로 인해 간세포로 올리고뉴클레오타이드를 전달하기 위한 선택 방법이 되었다.
그러나, GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드를 사용하더라도, 높은 비율의 화합물이 신장을 통한 배설을 통해 손실된다. 이에 대응하기 위해, 개별 올리고뉴클레오타이드 서브유닛이 공유 결합된 중간체 또는 "링커"를 통해 함께 연결된 올리고뉴클레오타이드의 다량체가 제조되었다. 이들 링커는 올리고뉴클레오타이드의 합성, 탈보호 및 정제 후에 합성기 상에서 또는 수용액에서 도입되었다.
생체내 조건 하에서 안정한 링커 및 표적 세포 내부에서 절단되어 개별 올리고뉴클레오타이드 서브유닛을 유리시키는 다른 링커를 포함하는, 다양한 링커가 사용되어 왔다. 사용된 절단가능한 링커의 가장 일반적인 유형은 세포 내 뉴클레아제에 의해 절단되는 dTdTdTdT 및 dCdA와 같은 단일 가닥의 비보호된 뉴클레오타이드의 짧은 서열, 및 세포 내부의 환원 환경에 의해 절단되는 디설파이드계 링커였다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 합성에 성공적으로 사용된 또 다른 기술은 링커를 통해 또 다른 올리고뉴클레오타이드에 결합된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 선택적으로 또한 링커를 통해 또 다른 올리고뉴클레오타이드에 결합된 상보적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 어닐링되는 비대칭 어닐링이며, 이들 단계는 원하는 길이의 다량체가 수득될 때까지 반복된다.
동종 및 이종다량체 모두는 이러한 방법을 통해 제조되었고, 4-머 내지 8-머 범위의 다량체는 현저하게 향상된 혈청 반감기 및 생체활성을 나타낸다.
그러나, 이러한 방법은 한계가 있다. 뉴클레아제 절단가능한 링커는 합성기를 통해서만 도입될 수 있다. 디설파이드 연결은 전구체의 정제 후에 합성기 상에 그리고 수용액에서 모두 도입될 수 있다. 그러나, 후속 연결 반응을 위해 말단 디설파이드를 티올로 환원시키는 동시에 다량체에서 내부 디설파이드 기를 유지하는 것은 불가능하다. 마지막으로, 비대칭 어닐링 방법은 무작위 중합이 발생할 수 있으므로 동종다량체에 적용하기 어렵다.
따라서, 다량체 올리고뉴클레오타이드의 조립 및 합성에 사용하기 위한 추가의 방법 및 물질이 필요하다.
본 개시내용은 공유 링커에 의해 함께 결합된 올리고뉴클레오타이드 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드로서, 적어도 하나의 서브유닛은 "부분적 올리고뉴클레오타이드"를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
부분적 올리고뉴클레오타이드는 온전한 또는 전장 올리고뉴클레오타이드의 축약된 버전이다. 본 개시내용의 일부에서, 온전한 또는 전장 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 "
Figure pct00001
"로서 표시되고, 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 "
Figure pct00002
"로서 표시된다. 본 개시내용의 많은 구현예에서, 온전한 또는 전장 올리고뉴클레오타이드 가닥 및 2개의 부분적 올리고뉴클레오타이드 가닥은 상보적이고, 함께 어닐링되어 본 개시내용의 다량체 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛을 형성한다.
이중 가닥 siRNA의 맥락에서, siRNA의 전장 또는 온전한 센스 가닥은 21개 염기일 수 있는 반면, 부분적 센스 가닥은 10개 염기(예컨대, 전장 센스 가닥의 5' 말단으로부터 처음 10개 염기) 또는 전장 가닥의 3' 말단까지의 다음 11개 염기일 수 있다. 본 개시내용 및 그의 도면의 부분에서, 올리고뉴클레오타이드의 전장 또는 온전한 센스 가닥은 5'-Sense-3'으로 표시되고, 부분적 센스 가닥은 5'-Se-3' 또는 5'-nse-3'으로 표시된다.
본 개시내용은 또한 새로운 합성 중간체 및 본원에 개시된 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한, 예를 들어 유전자 발현 조절, 생물학적 연구, 의학적 병태의 치료 또는 예방, 및/또는 새롭거나 변경된 표현형을 생성하기 위해 다량체 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드로서:
각각의 서브유닛은 독립적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 서브유닛은 공유 링커에 의해 또 다른 서브유닛에 연결되며;
적어도 하나의 서브유닛은 적어도 하나의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 이중 가닥 서브유닛을 형성하기 위해 상보적 가닥에 어닐링된 2개의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 1을 포함하고:
Figure pct00003
(구조 1), 여기서:
Figure pct00004
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00005
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
Figure pct00006
는 공유 링커이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 2를 포함하고:
Figure pct00007
(구조 2), 여기서:
Figure pct00008
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00009
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
Figure pct00010
는 공유 링커이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 3을 포함하고:
Figure pct00011
(구조 3), 여기서:
각각의
Figure pct00012
는 독립적으로 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00013
는 공유 링커이다.
일 구현예에서, 구조 3은 동종이량체이다. 또 다른 구현예에서, 구조 3은 이종이량체이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 4를 포함하는 적어도 하나의 서브유닛을 포함하고:
Figure pct00014
(구조 4), 여기서:
각각의
Figure pct00015
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00016
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 인접한 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 연결된 공유 링커이며;
Figure pct00017
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 5를 포함하고:
Figure pct00018
(구조 5), 여기서:
각각의
Figure pct00019
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00020
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00021
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 연결시키는 공유 링커이고;
Figure pct00022
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 6을 포함하고:
Figure pct00023
(구조 6)
여기서:
각각의
Figure pct00024
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00025
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00026
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00027
는 상보적 가닥이며;
a, b, c, d, e, f, g, h, i, j 및 k는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이며, 단, c, e, h 및 j 중 적어도 하나는 1 이상이다. 일 구현예에서, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j 및 k는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이고, 단, c, e, h 및 j 중 적어도 하나는 1 이상이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 7을 포함하고:
Figure pct00028
(구조 7)
여기서:
Figure pct00029
는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00030
는 각각 상보적 가닥이며;
Figure pct00031
는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00032
는 각각 공유 링커이며;
m 및 n은 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
o는 0 이상의 정수이다. 일 구현예에서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수이고 o는 0 내지 10 범위의 정수이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 8을 포함하고:
Figure pct00033
(구조 8)
여기서:
Figure pct00034
는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00035
는 각각 상보적 가닥이며;
Figure pct00036
는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00037
는 각각 공유 링커이며;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이다. 일 구현예에서, p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 9를 포함하고:
Figure pct00038
(구조 9),
여기서:
Figure pct00039
는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00040
는 각각 상보적 가닥이며;
Figure pct00041
는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
Figure pct00042
는 각각 공유 링커이며;
r은 1 이상의 정수이고;
s는 0 이상의 정수이다. 일 구현예에서, r은 1 내지 10 범위의 정수이고, s는 0 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, r은 1 내지 3 범위의 정수이고, s는 0 또는 1이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 10을 포함하고:
Figure pct00043
(구조 10), 여기서:
각각의
Figure pct00044
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00045
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00046
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00047
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 11을 포함하고:
Figure pct00048
(구조 11),
여기서:
각각의
Figure pct00049
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00050
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00051
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00052
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 12를 포함하고:
Figure pct00053
(구조 12), 여기서:
각각의
Figure pct00054
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00055
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00056
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00057
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 13을 포함하고:
Figure pct00058
(구조 13), 여기서:
각각의
Figure pct00059
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00060
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00061
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00062
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 14를 포함하고:
Figure pct00063
(구조 14), 여기서:
각각의
Figure pct00064
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00065
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00066
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00067
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 15를 포함하고:
Figure pct00068
(구조 15), 여기서:
각각의
Figure pct00069
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00070
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
각각의
Figure pct00071
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
각각의
Figure pct00072
는 상보적 가닥이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 16을 포함하고:
Figure pct00073
(구조 16)
여기서,
각각의
Figure pct00074
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
각각의
Figure pct00075
는 상보적 가닥이며;
각각의
Figure pct00076
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
t 및 u는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수이다. 일 구현예에서, t 및 u는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수이다. 일 구현예에서, t 및 u는 각각 독립적으로 0 내지 3 범위의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 각각의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5-14개 뉴클레오타이드 길이이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 2개의 서브유닛은 상이한 세포 표적에 대해 활성이다. 일 구현예에서, 모든 서브유닛은 상이한 세포 표적에 대해 활성이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 2개의 서브유닛은 동일한 세포 표적에 대해 활성이다. 일 구현예에서, 모든 서브유닛은 동일한 세포 표적에 대해 활성이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드 내의 각각의 핵산은 RNA, DNA, 또는 인공 또는 비천연 핵산 유사체이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드 내의 각각의 핵산은 RNA, DNA, 또는 인공 또는 비천연 핵산 유사체이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 siRNA, saRNA, 또는 miRNA이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 모든 서브유닛은 siRNA이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 모든 서브유닛은 saRNA이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 모든 서브유닛은 miRNA이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 단일 가닥 서브유닛이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 단일 가닥 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 공유 링커는 절단가능한 공유 링커를 포함한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 적어도 하나의 절단가능한 공유 링커는 산 절단가능한 결합, 환원제 절단가능한 결합, 생체 절단가능한 결합, 또는 효소 절단가능한 결합을 함유한다.
일 구현예에서, 공유 링커는 세포내 조건 하에서 절단가능하다.
일 구현예에서, 공유 링커는 각각 독립적으로, 이황화 결합 또는 구조 25의 화합물이며:
Figure pct00077
(구조 25)
여기서:
S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되고;
각각의 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴 기이며;
R2는 티오프로피오네이트 또는 디설파이드 기이고;
각각의 X는 독립적으로
Figure pct00078
로부터 선택되며,
후자의 구조는 석신산의 유도체인 2개의 가능한 "고리 개방" 위치 이성질체를 나타내는 복합 구조이다.
일 구현예에서, 구조 25의 화합물은
Figure pct00079
이고,
여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착된다.
일 구현예에서, 구조 25의 화합물은 구조 26에 따른 화합물이며:
Figure pct00080
,
여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되고; 구조 26에서의 개방 고리는 석신산의 유도체인 2개의 가능한 고리 개방된 위치 이성질체를 나타내는 복합 구조이다.
일 구현예에서, 구조 25의 화합물은 구조 27에 따른 화합물이며:
Figure pct00081
,
여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되고; 구조 27에서 개방 고리는 석신산의 유도체인 2개의 가능한 고리 개방된 위치 이성질체를 나타내는 복합 구조이다.
일 구현예에서, 구조 25의 화합물은 구조 28에 따른 화합물이며:
Figure pct00082
,
여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되고; 구조 28에서 개방 고리 구조는 각각 석신산의 유도체인 2개의 가능한 고리 개방된 위치 이성질체를 나타내는 복합 구조이다.
일 구현예에서, 구조 25의 공유 링커는 구조 29의 공유 링커 전구체로부터 형성되며:
Figure pct00083
(구조 29),
여기서, 각각의 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴 기이고, R2는 티오프로피오네이트 또는 디설파이드 기이다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드 내의 적어도 하나의 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 3' 또는 5' 말단에 부착된다. 일 구현예에서, 화합물 또는 다량체 올리고뉴클레오타이드 내의 모든 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 3' 또는 5' 말단에 부착된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 내부 뉴클레오타이드에 부착된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 공유 링커
Figure pct00084
는 뉴클레오타이드 링커를 포함한다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 링커는 2-6개 뉴클레오타이드 길이이다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 링커는 UpUpUp이고, 여기서 "U"는 우리딘이며 "p"는 포스페이트이다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 링커는 dTpdTpdTpdTp이고, 여기서 "dT"는 티미딘이고 "p"는 포스페이트이다.
다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 각각의 공유 링커
Figure pct00085
는 동일하다. 다량체 올리고뉴클레오타이드의 일 구현예에서, 각각의 공유 링커
Figure pct00086
는 상이하다.
일 구현예에서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 3' 말단과 제2 서브유닛의 3' 말단 사이에서 공유 링커
Figure pct00087
에 의해 연결된다. 일 구현예에서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 3' 말단 사이에서 공유 링커
Figure pct00088
에 의해 연결된다. 일 구현예에서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 5' 말단 사이에서 공유 링커
Figure pct00089
에 의해 연결된다.
일 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 아닌 화학적 또는 생물학적 화합물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 화합물 또는 다량체 올리고뉴클레오타이드는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수하다.
본 개시내용은 구조 16을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법을 제공하며:
Figure pct00090
(구조 16),
여기서, 각각의
Figure pct00091
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고; 각각의
Figure pct00092
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
Figure pct00093
는 상보적 가닥이고; 각각의
Figure pct00094
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, t 및 u는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
방법은 구조 17
Figure pct00095
(구조 17)
및 구조 18
Figure pct00096
(구조 18)
을 상보적 가닥
Figure pct00097
과 어닐링하여 구조 16을 형성하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, t 및 u는 각각 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, t 및 u는 각각 독립적으로 1 내지 3 범위의 정수이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 구조 8을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법을 제공하며:
Figure pct00098
(구조 8)
여기서, 각각의
Figure pct00099
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
Figure pct00100
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
Figure pct00101
는 상보적 가닥이고; 각각의
Figure pct00102
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, p 및 q는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
방법은 구조 19,
Figure pct00103
(구조 19),
구조 20,
Figure pct00104
(구조 20),
및 하나 이상의 구조 21
Figure pct00105
(구조 21)
을 상보적 가닥
Figure pct00106
과 어닐링하여 구조 8을 형성하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 3 범위의 정수이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 구조 9A를 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법을 제공하며:
Figure pct00107
(구조 9A)
여기서, 각각의
Figure pct00108
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
Figure pct00109
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
Figure pct00110
는 상보적 가닥이고; 각각의
Figure pct00111
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, r 및 s는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
방법은 구조 22,
Figure pct00112
(구조 22)
구조 23
Figure pct00113
(구조 23)
및 하나 이상의 구조 24
Figure pct00114
, (구조 24)
을 상보적 가닥
Figure pct00115
과 어닐링하여 구조 9A를 형성하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 3 범위의 정수이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 구조 9B를 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법을 제공하며:
Figure pct00116
(구조 9B)
여기서, 각각의
Figure pct00117
는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
Figure pct00118
는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
Figure pct00119
는 상보적 가닥이고; 각각의
Figure pct00120
는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, r은 1 이상의 정수이고;
방법은 구조 22,
Figure pct00121
(구조 22)
하나 이상의 구조 24
Figure pct00122
, (구조 24)
및 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00123
를 상보적 가닥
Figure pct00124
과 어닐링하여 구조 9B를 형성하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, r은 1 내지 10 범위의 정수이다. 일 구현예에서, r은 1 내지 3 범위의 정수이다.
본 개시내용은 다량체 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 약제의 제조에서의 다량체 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 치료를 제공한다.
이들 및 다른 구현예는 하기에서 더 상세히 설명된다.
도 1은 본 개시내용에 따른 다량체 올리고뉴클레오타이드를 제조하는데 유용한 빌딩 블록을 유도체화하기 위한 다양한 합성 빌딩 블록 및 도식을 예시한다. 예시된 구현예에서, 온전한 센스 가닥, 5'-스플릿센스 가닥 및 3'-스플릿센스 가닥은 각각 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드(Mal) 말단기를 함유하도록 유도체화된다.
도 2는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 삼량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 서브유닛은 스플릿 센스 가닥을 포함한다.
도 3은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 사량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 2개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 선택적으로 세포 또는 조직 표적화 리간드(Lig)는 말단 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두에 접합된다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다.
도 4는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 삼량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 서브유닛은 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "오량체로(To Pentamer)"는 지시된 합성 중간체가 단리되어 도 6에 예시된 바와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 오량체의 합성에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 5는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 사량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 2개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "오량체로"는 지시된 합성 중간체가 단리되어 도 6에 예시된 바와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 오량체의 합성에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 6은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 오량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 3개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "Ex 삼량체"는 지시된 출발 물질이 도 4에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다. "Ex 사량체"는 지시된 합성 중간체가 도 5에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다.
도 7은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 육량체를 합성하기 위한 도식을 도시하며, 여기서 중앙 4개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "칠량체로(To Heptamer)"는 지시된 합성 중간체가 단리되어 도 8에 예시된 바와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 칠량체의 합성에 사용될 수 있음을 의미한다. "팔량체로(To Octamer)"는 지시된 합성 중간체가 단리되어 도 9에 예시된 바와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 팔량체의 합성에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 8은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 칠량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 5개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "Ex 육량체"는 지시된 출발 물질 또는 합성 중간체가 도 7에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다. "팔량체로"는 지시된 합성 중간체가 단리되어 도 9에 예시된 바와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 팔량체의 합성에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 9는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 팔량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 6개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "Ex 육량체"는 지시된 출발 물질이 도 7에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다. "Ex 칠량체"는 지시된 합성 중간체가 도 8에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다.
도 10은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 이종오량체를 합성하기 위한 도식을 예시하며, 여기서 중앙 3개의 서브유닛은 각각 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 이종오량체는 제1 올리고뉴클레오타이드의 4개의 서브유닛을 포함하고; 이들 중 하나는 온전한 센스 가닥(5'-Sense-3'으로 지정됨)을 포함하고 이들 중 다른 3개는 각각 5'-Se 및 nse-3'으로 지정된 2개의 부분적 가닥으로 구성된 스플릿 센스 가닥을 포함한다. 5'-OTHER-3'은 5'-Sense-3'와 상이한 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 5'-OTHER-3'에 대한 상보적 가닥은 5'-Sense-3'에 대한 상보적 가닥과 상이하다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다. "Ex 삼량체"는 지시된 출발 물질이 도 4에 예시된 합성 도식으로부터 나온다는 것을 의미한다.
도 11은 인간 DMPK mRNA를 표적화하는 siRNA의 삼량체를 합성하기 위한 도식을 예시한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다.
도 12는 인간 헌팅틴 mRNA를 표적화하는 siRNA의 삼량체를 합성하기 위한 도식을 예시한다. 기호 -SH는 티올기를 나타내고; -Mal은 말레이미드기를 나타낸다. (Lig)는 존재하거나 부재할 수 있는 세포 또는 조직 표적화 리간드를 나타낸다. 기호 -CL-은 절단가능한 링커를 나타낸다.
올리고뉴클레오타이드 서브유닛
본원에 기재된 다량체 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 공유 링커에 의해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 서브유닛으로 구성된다. 올리고뉴클레오타이드 서브유닛은 비제한적으로 RNA, DNA, 이들의 조합을 포함하거나, 또는 인공 또는 비천연 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥(예컨대, 역평행 이중 가닥)이다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛은 상보적 가닥으로부터 형성된다. 본 개시내용에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛은 2개의 온전한 또는 전장 상보적 가닥을 포함할 수 있거나; 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서브유닛은 전장 상보성 가닥에 어닐링된 2개의 부분적 가닥을 포함할 수 있다. 상보성은 100% 상보적일 수 있거나, 또는 100% 미만의 상보적일 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 그럼에도 불구하고 혼성화하고 관련 조건(예컨대, 생리학적으로 관련된 조건) 하에서 이중 가닥으로 유지된다. 예를 들어, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 평활 말단이다(대칭 올리고뉴클레오타이드). 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하나의 가닥 상에 말단 오버행(예컨대, 2-5개의 오버행 뉴클레오타이드) 또는 그의 각각의 가닥 상에 말단 오버행(각각의 경우, 비대칭 올리고뉴클레오타이드)을 갖는다.
구조 또는 구현예가 전장 상보성 가닥에 어닐링된 2개의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 각각의 경우에, 그것은 (A) 전장 상보성 가닥 내의 각각의 뉴클레오타이드가 부분적 올리고뉴클레오타이드 가닥 중 하나 또는 다른 하나 내의 뉴클레오타이드와 쌍을 이루고, 이 경우 부분적 올리고뉴클레오타이드는 함께 상보적 가닥의 "닉(nicked)" 버전을 나타내는 경우일 수 있거나; 또는 (B) 전장 상보성 가닥 내의 뉴클레오타이드 중 일부가 부분적 올리고뉴클레오타이드 중 하나 또는 다른 하나 내의 뉴클레오타이드와 쌍을 이루지 않으며, 이 경우 부분적 올리고뉴클레오타이드는 함께 상보적 가닥의 "갭(gap)" 버전을 나타내는 경우일 수 있다. 경우 (A) 또는 경우 (B)에서, 상보적 가닥은 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대해 충분한 상보성을 가질 것이며, 이와 함께 그것은 쌍을 이루어 이중 가닥 구조를 형성할 것이다. 다양한 내부적으로 분절된 siRNA 단량체의 구조에 관한 세부사항은 US 제8,329,888호 B2에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 도시된 모든 구조에서, 달리 언급되지 않는 한, 각각의 올리고뉴클레오타이드(전장이든 또는 부분적이든 간에)는 단일 배향에 제한되지 않고, 5' 내지 3' 배향 또는 3' 내지 5' 배향을 갖는 것으로 해석될 수 있으며, 그의 5' 또는 3' 말단을 통해 또 다른 올리고뉴클레오타이드(전장 또는 부분적이든 간에)에 연결될 수 있다.
본 개시내용은, 예를 들어 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 활성화 RNA(saRNA), miRNA, piwi-상호작용 RNA(piRNA), 모든 변형에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 및 리보자임을 포함하는, 이중 가닥 및 단일 가닥의 모든 유형의 올리고뉴클레오타이드에 적용가능하다.
다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 안티센스 RNA(aRNA), CRISPR RNA(crRNA), 긴 비코딩 RNA(lncRNA), 마이크로RNA(miRNA), piwi-상호작용 RNA(piRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 메신저 RNA(mRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 활성화(saRNA), 또는 리보자임이다.
다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 앱타머이다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 Cas 뉴클레아제와 함께 리보뉴클레오복합체(RNP)를 형성하는 것과 관련되거나 필수적인, 또는, 예를 들어 야생형 Cas 뉴클레아제, 또는 야생형 Cas의 알려진 임의의 변형, 예컨대 닉카제(nickase) 및 데드(dead) Cas(dCas)를 포함하는 Cas 뉴클레아제를 이용하여 게놈 편집 또는 조작 기능을 수행하는 것과 관련되거나 필수적인 CRISPR 가이드 RNA, 또는 다른 RNA이다. CRISPR-Cas 시스템은, 예를 들어 미국 특허 제8,771,945호; Jinek et al., Science, 337(6096): 816-821 (2012) 및 국제 특허 출원 공개 WO 제2013/176772호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 DNA, 예를 들어 안티센스 DNA(aDNA)(예컨대, 안타고미르(antagomir)) 또는 안티센스 갭머(antisense gapmer)이다. 갭머 및 다량체를 포함하는 aDNA의 예는, 예를 들어 Subramanian et al., Nucleic Acids Res, 43(19): 9123-9132 (2015) 및 국제 특허 출원 공개 WO 제2013/040429호에 기재되어 있다. 안타고미르의 예는, 예를 들어 미국 특허 제7,232,806호에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 올리고뉴클레오타이드는 화학적 변형을 추가로 포함한다. 화학적 변형은 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 백본, 변형된 당, 및/또는 변형된 말단을 포함할 수 있다.
변형은 인 함유 연결을 포함할 수 있으며, 이는 비제한적으로 포스포로티오에이트, 거울상이성질체적으로 농축된 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 거울상이성질체적으로 농축된 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오사이드 단위의 인접한 쌍이 3'-5' 대 5'-3' 또는 2'-5' 대 5'-2'로 연결된 역 극성을 갖는 것들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 다중접합체에 함유되는 각각의 올리고뉴클레오타이드는 1-10개의 총 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만의 총 포스포로티오에이트기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중접합체에 함유된 올리고뉴클레오타이드는 더 많은 포스포로티오에이트기를 갖는 단량체 형태의 동일한 올리고뉴클레오타이드에 비해 더 적은 포스포로티오에이트기에도 증가된 생체내 활성을 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는, 예컨대 시험관내 및 생체내에서 개선된 효능 및 안정성을 포함하는 다양한 효과를 생성하기 위해 당업계에 공지된 다양한 전략을 사용하여 변형될 수 있다. 이들 전략 중에는 인공 핵산, 예컨대, 2'-O-메틸-치환된 RNA; 2'-플루오로-2'데옥시 RNA, 펩타이드 핵산(PNA); 모르폴리노; 잠금 핵산(LNA); 비잠금 핵산(UNA); 가교 핵산(BNA); 글리콜 핵산(GNA); 및 트레오스 핵산(TNA); 또는 보다 일반적으로, 핵산 유사체, 예컨대, 구조적으로 자연 발생 RNA 및 DNA와 유사하지만 자연 발생 분자의 포스페이트 골격, 당 또는 핵염기 부분 중 하나 이상에 변화를 갖는 바이사이클릭 및 트리사이클릭 뉴클레오사이드 유사체가 있다. 전형적으로, 유사체 핵염기는 그 중에서도 상이한 염기쌍 형성 및 염기 적층 특성을 부여한다. 예는 4개의 모든 표준 염기와 쌍을 이룰 수 있는 유니버설 염기를 포함한다. 포스페이트-당 골격 유사체의 예는 비제한적으로 PNA를 포함한다. 모르폴리노계 올리고머 화합물은 Braasch et al., Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002) 및 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 제5,719,262호; 및 제5,034,506호에 기재되어 있다.
본원에 기재된 제조 방법에서, 일부 올리고뉴클레오타이드는 화학적 작용기로 치환함으로써 말단에서 변형된다. 치환은 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에서 수행될 수 있고, 단량체의 센스 및 안티센스 가닥 모두의 3' 말단에서 수행될 수 있지만, 항상 이에 한정되는 것은 아니다. 화학적 작용기는 예컨대, 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 하이드록시기(-OH), 포르밀기(-CHO), 카르보닐기(-CO-), 에테르기(-O-), 에스테르기(-COO-), 니트로기(-NO2), 아지드기(-N3), 또는 설폰산기(-SO3H)를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 추가적으로 또는 대안적으로, 핵염기(당업계에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 핵염기는 천연 핵산에서 드물게 또는 일시적으로만 발견되는 핵염기, 예컨대, 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 5-메틸시토신(또한 5-메틸-2' 데옥시시토신으로 지칭되고 당업계에서 종종 5-Me-C로 지칭됨), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 겐토비오실 HMC뿐만 아니라 합성 핵염기, 예컨대, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 이종치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로무우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res, 15: 4513 (1997). 당업계에 공지된 "유니버설" 염기, 예컨대, 이노신 또는 슈도우리딘이 또한 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 핵산 이합체 안정성을 0.6-1.2℃까지 증가시킬 수 있고(Sanghvi, Y. S., in Crooke, ST and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp 276-278 (1993)), 염기 치환의 측면들이다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 예컨대 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸쿠아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 핵산의 말단에 있는 하이드록시기(-OH)는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 또는 아민기(-NH2)와 같은 작용기로 치환될 수 있다. 치환은 3' 말단 또는 5' 말단에서 수행될 수 있다.
공유 링커
다량체 올리고뉴클레오타이드에 존재하고 다량체 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용되는 공유 링커는 절단가능하거나 비절단가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 다량체 올리고뉴클레오타이드의 개별 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 기능적 전달을 용이하게 하기 위해, 전달시 또는 세포내 조건 하에서 절단되면서, 투여시 안정성을 유지하도록 선택되거나 설계될 수 있다. 본원에 제공된 공유 링커의 예 외에도, 당업자는 조성, 합성 및 용도를 포함하여 광범위한 공유 링커가 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용과 일치하는 용도를 위해 개조될 수 있음을 인식할 것이다.
뉴클레오타이드 링커는 예를 들어 핵산 서열, 예컨대 우리딘-우리딘-우리딘(UUU), 엔도뉴클레아제 절단가능한 링커 dCdA, 및 dTdTdTdT를 포함하는 공유 링커의 한 부류의 한 가지 예이다. 뉴클레오타이드 링커는 서열이 임의의 다른 지정된 기능을 수행하지 않도록 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 함유한다. 본 개시내용의 다양한 양태에서, 공유 링커는 2-6개 뉴클레오타이드 길이의 뉴클레오타이드 링커를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 양태에서, 공유 링커는 친핵성 및 친전자성 기의 반응 생성물을 포함한다. 예를 들어, 공유 링커는 티올과 말레이미드, 티올과 비닐설폰, 티올과 피리딜디설파이드, 티올과 아이오도아세트아미드, 티올과 아크릴레이트, 아지드와 알킨, 또는 아민과 카르복실기의 반응 생성물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 기 중 하나는, 예컨대 다중접합체의 치환기에 연결되고(예컨대, 치환기 상의 티올(-SH) 관능화), 다른 기는 궁극적으로 2개의 올리고뉴클레오타이드(예컨대, DTME 중의 말레이미드)를 연결하는 제2 분자(예컨대, 연결제) 상에 존재한다.
티올 및 말레이미드의 반응 생성물을 포함하는 공유 링커는 비제한적으로 DTME(디티오비스말레이미도에탄), BM(PEG)2(1,8-비스(말레이미도)디에틸렌 글리콜), BM(PEG)3(1,11-비스말레이미도-트리에틸렌글리콜), BMOE(비스말레이미도에탄), BMH(비스말레이미도헥산), 또는 BMB(1,4-비스말레이미도부탄)을 포함한다. DTME는 세포질의 환원 환경에서 세포내에서 절단가능한 내부 디설파이드를 함유한다는 점에서 유리하다.
본 개시내용의 다양한 양태에서, 공유 링커는 비이온성 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린, 또는 소수성 중합체, 예컨대 PLGA 및 PLA를 포함할 수 있다.
공유 결합을 위한 매개체로서 사용되는 중합체 연결제는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 플루로닉, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 또는 이들의 공중합체를 포함하는 비이온성 친수성 중합체; 또는 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D-락틱-코-글리콜산, 폴리-L-락틱-코-글리콜산, 폴리-D,L-락틱-코-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리하이드록시발레레이트, 또는 이들의 공중합체를 포함하는 하나 이상의 생체 절단가능한 폴리에스테르 중합체를 포함한다.
연결제는 약 100 내지 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 이러한 연결제의 예는 디티오-비스-말레이미도에탄(DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜(BM(PEG)2), 트리스-(2-말레이미도에틸)-아민(TMEA), 트리석신이미딜 아미노트리아세테이트(TSAT), 3-암-폴리(에틸렌 글리콜)(3-암 PEG), 말레이미드, N-하이드록시석신이미드(NHS), 비닐설폰, 아이오도아세틸, 니트로페닐 아지드, 이소시아네이트, 피리딜디설파이드, 히드라지드, 및 하이드록시페닐 아지드를 포함한다.
절단가능한 결합 또는 비절단가능한 결합을 포함하는 연결제가 본원에서 사용될 수 있으며, 실제로, 일부 예에서, 동일한 다중접합체에서 함께 사용될 수 있다. 비절단가능한 결합을 포함하는 연결제는 비제한적으로 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 포함하는 것을 포함한다. 절단가능한 결합을 포함하는 연결제는 비제한적으로 산 절단가능한 결합(예컨대, 에스테르, 히드라존, 또는 아세탈의 공유 결합), 환원제 절단가능한 결합(예컨대, 이황화 결합), 생체 절단가능한 결합, 또는 효소 절단가능한 결합(예컨대, 핵산 기반 링커 또는 올리고펩타이드 기반 링커)을 포함한다. 일부 경우, 절단가능한 공유 링커는 세포내 조건 하에서 절단가능하다. 추가적으로, 약물 접합에 이용가능한 임의의 연결제가 제한 없이 본 발명의 전술한 양태에 사용될 수 있다.
또한, 작용기 및 연결제의 조합은 다음을 포함할 수 있다: (a) 작용기가 아미노 또는 티올인 경우, 연결제는 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 또는 석신이미딜 6-([3(2-피리딜디티오)프로피오아미도]헥사노에이트일 수 있고; (b) 작용기가 아미노인 경우, 연결제는 3,3' 디티오디프로피온산 디-(N-석신이미딜 에스테르), 디티오-비스(에틸 1H-이미다졸-1-카르복실레이트), 또는 디티오-비스(에틸 1H-이미다졸-1-카르복실레이트)일 수 있고; (c) 작용기가 아미노 또는 알킨인 경우, 연결제는 설포-N-석신이미딜3-[[2-(p-아지도살리실아미도)에틸]-1,3'-디티오]프로피오네이트일 수 있고; (d) 작용기가 티올인 경우, 연결제는 디티오-비스-말레이미도에탄(DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜(BM(PEG)2), 또는 디티오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP)일 수 있다.
본원에 제공된 합성 중간체 및 다량체 올리고뉴클레오타이드를 제조 및 합성하기 위한 다양한 방법에서, 작용기의 활성화를 수반하는 단계가 있을 수 있다. 작용기의 활성화에 사용될 수 있는 화합물은 비제한적으로 1-에틸-3,3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 이미다졸, N-하이드록시석신이미드, 디클로로헥실카르보디이미드, N-베타-말레이미도프로피온산, N-베타-말레이미도프로필 석신이미드 에스테르 또는 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 포함한다.
공유 링커의 추가의 예 및 이의 제조 및 사용 방법은 WO제2016/205410호, WO제2018/145086호, 및 WO 제2020/180897호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
화학적 또는 생물학적 화합물
임의의 다량체 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 아닌 화학적 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화학적 또는 생물학적 화합물은 비제한적으로 아미노산, 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자(예컨대, 소분자 치료제 또는 약물 분자), 유기금속 화합물, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 몇몇 양태에서, 화학적 또는 생물학적 화합물은 세포 또는 조직 표적화 모이어티, 예컨대 비제한적으로 주어진 세포 표면 수용체에 특이적인 리간드를 포함할 수 있다. 세포 또는 조직 표적화 모이어티의 예는 비제한적으로 친유성 모이어티, 예컨대 인지질; 앱타머(DNA 또는 RNA, 또는 그의 유도체의 앱타머); 펩타이드 및 단백질, 예컨대 항원 결합 펩타이드 또는 단백질; 작은 분자; 비타민, 예컨대 토코페롤 및 폴레이트; 다른 폴레이트 수용체 결합 리간드; 탄수화물, 예컨대 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 및 만노스; 다른 만노스-수용체 결합 리간드; 콜레스테롤; 카르복실산, 예컨대 2-[3-(1,3-디카르복시프로필)-우레이도]펜탄디오산(DUPA); 및 벤즈아미드의 유도체, 예컨대 아니사미드를 포함한다.
세포 또는 조직 표적화 친유성 모이어티는 양이온성 기를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 또는 양이온성 염료(예컨대, Cy3)를 포함한다. 다른 친유성 모이어티는 비제한적으로 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진을 포함한다.
항원 결합 단백질의 예는 비제한적으로 단일클론 항체, 단쇄 가변 단편(ScFv) 또는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다.
GalNAc 기반 생물학적 모이어티의 예는 비제한적으로 모노-안테나리 GalNAc, 디-안테나리 GalNAc, 및 트리-안테나리 GalNAc를 포함한다.
일부 또는 전부가 세포 또는 조직 표적화 특성을 가질 수 있는 다른 생물학적 모이어티는, 비제한적으로 지방산, 예컨대 콜레스테롤; 리토콜산(LCA); 에이코사펜타에노산(EPA); 도코사헥사에노산(DHA); 도코사노산(DCA); 스테로이드; 세코스테로이드; 지질; 강글리오사이드; 뉴클레오사이드 유사체; 엔도칸나비노이드; 비타민, 예컨대 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 레티노산 및 토코페릴; 및 전술한 것 중 어느 것의 유도체를 포함한다.
일부 또는 전부가 세포 또는 조직 표적화 특성을 가질 수 있는 다른 펩타이드 기반 생물학적 모이어티는 비제한적으로 APRPG, cNGR(CNGRCVSGCAGRC), F3(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK), CGKRK, 및/또는 iRGD(CRGDKGPDC)를 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 그것이 세포핵에 연결되거나 혼입되는 물질의 수입을 용이하게 하기 위해 핵 국소화 신호 또는 서열(NLS)의 사용 및 혼입을 제공한다. NLS는 전형적으로 아미노산 서열이며, 그 예는 약물 전달 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 화학적 또는 생물학적 화합물은 그와 함께 전달되는 다른 생물학적 활성 모이어티가 엔도솜 막을 파괴하거나 세포내 전달시 생물학적 모이어티가 내재화되는(예컨대, 엔도사이토시스에 의해) 엔도솜 또는 다른 소기관을 탈출하는 것을 돕거나 가능하게 하도록 선택된, 엔도솜 탈출 모이어티(EEM)를 포함할 수 있다. 엔도솜 탈출 모이어티는 종종 지질 기반 또는 아미노산 기반이지만, 엔도솜을 파괴하여 그의 화물(cargo)을 방출하는 다른 화학적 엔티티를 포함할 수 있다. EEM의 예는 비제한적으로 클로로퀸, 소수성 아미노산 R 기를 함유하는 모티프를 갖는 펩타이드 및 단백질, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA2)을 포함한다. 추가의 EEM은 문헌[Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016]에 기재되어 있다.
본 개시내용 범위 내에 있는 다른 화학적 또는 생물학적 화합물은 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "검출가능한 표지"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 통상의 의미를 갖는다. 그것은 다중 접합체의 치환기이고 형광 분광법과 같은 이미징 기술에 의해 검출가능한 화학적 기를 지칭한다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 형광단을 포함하는 염료일 수 있고, 이는 에너지의 흡수 후에, 정의된 파장에서 방사선을 방출한다. 많은 적합한 형광 표지 또는 염료는 공지되어 있다. 예를 들어, Welch 등(Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999)은 단실 관능화된 형광 모이어티를 개시하고, Zhu 등(Cytometry 28:206-211, 1997)은 형광 표지 Cy3 및 Cy5의 사용을 기술한다. 다른 표지는 문헌[Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) 및 Smith et al. (Nature 321:674, 1986)]에 기재되어 있다. 상업적으로 이용가능한 형광 표지의 예는 비제한적으로 플루오레세인, 로다민(예컨대, TMR, 텍사스 레드 또는 록스), 알렉사, 보디피, 아크리딘, 쿠마린, 피렌, 벤즈안트라센 및 시아닌(예컨대, Cy2 또는 Cy4)을 포함한다. 검출가능한 표지의 다른 형태는 양자점(Empodocles, et al., Nature 399:126-130, 1999), 금 나노입자(Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000), 마이크로비드(Lacoste et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000), 및 질량 분석법에 의해 검출가능한 태그를 포함하는 마이크로입자를 포함한다. 검출가능한 표지는 검출을 위해 또 다른 화합물과의 상호작용에 의존하는 다중 구성요소 표지, 예컨대 비오틴-스트렙타비딘 시스템일 수 있다.
질환을 치료하고 유전자 발현을 조절하는 방법
본 개시내용은 유전자 발현을 조절함으로써, 예를 들어 유전자 발현을 상향조절하거나, 하향조절하거나, 침묵시키거나, 또는 mRNA 스플라이싱에 영향을 줌으로써 해결될 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위한 개시된 다량체 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 교시는 숙련자가 그러한 병태의 의학적 또는 수의학적 치료를 위해, 또는 기초 연구, 농업, 진단 및 축산업과 같은 다른 분야에서 유전자 발현을 조절하기 위해, 다량체 올리고뉴클레오타이드를 설계 및 개발하는 것을 가능하게 하는 역할을 할 것이다. 다수의 유전자 표적이 영향을 받기를 원하는 경우, 본 개시내용의 다량체 올리고뉴클레오타이드는 다중 표적화가 단일 화학적 엔티티로 달성되는 것을 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 유전자 발현 조절로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 치료적 구현예에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 유전자 발현을 조절하는 적어도 하나의 서브유닛, 예를 들어 비제한적으로 siRNA, miRNA, saRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, CRISPR 뉴클레아제, crRNA, 및 전술한 것들 중 어느 것의 유도체를 포함할 것이다.
유사하게, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 2개 이상의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 표적 유전자 또는 유전자 산물에서 유전자 발현을 조절하는 서브유닛을 포함한다.
본 개시내용의 전술한 모든 양태에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는, 유전자 발현을 변형시키는 하나 이상의 서브유닛 이외에, 비제한적으로 면역 자극 또는 억제, 체크포인트 억제, 및 염증 감소를 포함하는 다른 치료 효과를 생성하는 다른 치환기를 포함할 수 있다. 다중 치료 효과를 제공하는 치환기를 포함하는 다중접합체는 암, 자가면역 및 신경 장애와 같은 복합 질환 및 병태에 대한 치료를 발전시키는 역할을 할 것이다.
대상체
개시된 치료 방법 및 본원에 개시된 투여 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체는 비제한적으로 포유동물, 예컨대 영장류, 설치류, 및 농업 동물을 포함한다. 영장류 대상체의 예는 비제한적으로 인간, 침팬지, 및 마카크(macaque)를 포함한다. 설치류 대상체의 예는 비제한적으로 마우스 및 래트를 포함한다. 농업 동물 대상체의 예는 비제한적으로 소, 양, 새끼양, 닭, 및 돼지를 포함한다.
본 구현예 및 다른 구현예에서, 본 개시내용의 다중접합체는 약학적 조성물의 형태로, 전달 비히클로, 또는 세포 또는 조직 표적화 리간드에 결합된 형태로 대상체에게 투여될 수 있다.
약학적 조성물
다양한 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 다량체 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 약학적 조성물은 질환을 예방, 진단, 완화, 치료 또는 치유하는데 사용될 수 있는 식품 이외의 활성제를 포함한다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 다양한 다량체 올리고뉴클레오타이드는 약제로서 사용하기 위한 및/또는 약제의 제조에 사용하기 위한 구현예를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
약학적 조성물은 본 개시내용에 따른 다량체 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 부형제는 활성 성분과 함께 제제화된 천연 또는 합성 물질일 수 있다. 부형제는 장기 안정화, 부피 증가(예컨대, 증량제, 충전제 또는 희석제)의 목적을 위해, 또는 약물 흡수 촉진, 점도 감소, 또는 용해도 향상과 같은 최종 투여 형태의 활성 성분에 치료 향상을 부여하기 위해 포함될 수 있다. 부형제는 또한 예를 들어, 활성 성분의 취급을 돕고/돕거나 저장 수명 안정성을 연장하기 위해(예컨대, 변성 또는 응집을 방지함으로써) 제조 및 유통에 유용할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 적절한 부형제 선택은 투여 경로, 투여 형태, 및 활성 성분(들)을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
다량체 올리고뉴클레오타이드는 비제한적으로 국소 또는 전신을 포함하는 다양한 방식으로 투여될 수 있으며, 따라서 본 개시내용의 약학적 조성물은 그에 따라 달라질 수 있다. 투여는 임의의 특정 전달 경로, 시스템, 또는 기술에 한정되지 않으며, 비제한적으로, 비경구(피하, 정맥내, 골수내, 관절내, 근육내, 복강내, 안내 또는 CNS 주사 포함), 직장, 국소, 경피, 경구, 또는 흡입에 의한 것(예컨대, 분무기를 경유하여, 비강내 또는 폐로)을 포함할 수 있다. 개체로의 투여는 단일 용량으로 또는 반복 투여로, 그리고 임의의 다양한 생리학적으로 허용가능한 염으로, 및/또는 약학적 조성물의 일부로서 허용가능한 약학적 담체 및/또는 첨가제와 함께 발생할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 제제 및 표준 약학적 제제 기술, 투여량 및 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, Physicians' Desk Reference (PDR®) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004; 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005 참고).
약학적 조성물은 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 특정 목적을 달성하는 농도 또는 양, 예를 들어 위약과 비교하여, 예를 들어 생물학적 효과를 유발하기에 적합한 양일 수 있다. 유효량이 "치료학적 유효량"인 경우, 그것은 치료 용도에 적합한 양, 예를 들어 질환을 예방, 진단, 완화, 치료 또는 치유하기에 충분한 양일 수 있다. 유효량은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 경험적으로, 예를 들어 인간 임상 시험에 의해 결정될 수 있다. 유효량은 또한 당업계에 공지된 전환 인자를 사용하여, 또 다른 동물(예컨대, 인간)에 사용하기 위해 하나의 동물(예컨대, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개)로부터 외삽될 수 있다. 예컨대, 문헌[Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)]을 참고한다.
전달 구조물 및 제제
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 생물학적 표적 또는 작용 기전에 관계없이, 치료학적 올리고뉴클레오타이드는 유기체(예컨대, 치료를 필요로 하는 인간과 같은 동물)에서 표적 세포 또는 조직에 접근하기 위해 일련의 생리학적 장애물을 극복해야 한다. 치료학적 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 바람직하지 않은 면역 반응을 유발하지 않으면서, 혈류에서의 제거를 피하고, 표적 세포 유형에 들어가고, 세포질에 들어가고, 때로는 핵에 들어가야 한다. 다양한 양태에서, 본 개시내용은 세포 및 조직 표적으로의 직접 전달을 위한 다량체 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
직접 전달 전략에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 이들이 혈청 뉴클레아제 및 다른 인자에 의한 분해를 견디고 선천성 면역 반응의 촉발을 피하기 위해 일반적으로 치환기의 화학적 변형의 형태로 안정화가 필요할 것이다. 화학적 안정화 전략은 당업자에게 공지되어 있고, 본원에 개시된 다량체 올리고뉴클레오타이드와 관련하여 용이하게 사용되거나 개조될 수 있다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 전달 비히클에서 제제화할 필요 없이 표적 세포 또는 조직으로의 직접 전달을 위해 표적화 모이어티, 예컨대 세포 또는 조직 표적화 리간드를 구비한다. 본 개시내용과 관련하여 사용하기에 적합한 표적화 모이어티의 예는 비제한적으로 친유성 모이어티(예컨대, 인지질); 앱타머; 펩타이드 또는 단백질(예컨대, 아르기닌-글리신-아스파르트산[RGD], 트랜스페린, 단일클론 항체 또는 그의 단편, 예컨대 단일쇄 가변 단편(ScFv), 또는 VHH 항원 결합 단백질); 세포 성장 인자, 소분자, 비타민(예컨대, 폴레이트, 토코페롤), 탄수화물(예컨대, 단당류 및 다당류, N-아세틸갈락토사민[GalNAc], 갈락토스, 만노스); 콜레스테롤; 글루타메이트 우레아(예컨대, 2-[3-(1,3-디카르복시프로필)-우레이도]펜탄디오산[DUPA]), 벤즈아미드 유도체(예컨대, 아니사미드); 및 전술한 것 중 어느 것의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, GalNac 표적화 모이어티는 모노-안테나리 GalNAc, 디-안테나리 GalNAc, 또는 트리-안테나리 GalNAc일 수 있다.
친유성 모이어티는 양이온성 기를 포함하는 리간드일 수 있다. 특정 구현예에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 또는 양이온성 염료(예컨대, Cy3)이다. 다른 친유성 잔기는 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진을 포함한다.
표적화 모이어티는 지방산, 예컨대 콜레스테롤, 리토콜산(LCA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사헥사에노산(DHA), 및 도코사노산(DCA), 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 강글리오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 엔도칸나비노이드, 및/또는 비타민, 예컨대 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 및 이들의 유도체 또는 대사산물, 또는 비타민, 예컨대 레티노산 및 알파-토코페릴 석시네이트일 수 있다.
표적화 모이어티는 비제한적으로 공유 결합, 아미드 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 비공유 결합, 예컨대 비오틴-스트렙타비딘, 또는 금속-리간드 복합체를 통하는 것을 포함하는, 당업계에 공지된 다른 기술뿐만 아니라 본 개시내용의 교시를 사용하여 다량체 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입될 수 있다.
표적화 모이어티는 말단 위치에서, 또는 일부 경우, 내부 위치에서 다량체 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 표적화 모이어티는, 예컨대 표적화 모이어티가 다량체 올리고뉴클레오타이드의 각 말단에서 접합되는 경우, 다량체 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입된다. 2개 초과의 표적화 모이어티는 원하는 경우 다량체 올리고뉴클레오타이드 내로, 그리고 내부 및 말단 모두의 다양한 위치에 혼입될 수 있다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 세포에 의해 세포내이입된 다량체 올리고뉴클레오타이드의 엔도솜 탈출을 용이하게 하기 위한 엔도솜 탈출 모이어티(EEM)의 사용 및 혼입을 제공한다. 엔도솜 탈출 모이어티는 일반적으로 지질 기반 또는 아미노산 기반이지만, 엔도솜을 파괴하여 다량체 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 대사산물(예컨대, 링커의 절단에 의해 유리된 다량체 올리고뉴클레오타이드의 서브유닛)을 방출하는 다른 화학적 엔티티를 포함할 수 있다. EEM의 예는 비제한적으로 클로로퀸, 소수성 아미노산 R 기를 함유하는 모티프를 갖는 펩타이드 및 단백질, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA2)을 포함한다. 추가의 EEM은 문헌[Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016]에 기재되어 있다.
다양한 양태에서, 본 개시내용은 다량체 올리고뉴클레오타이드가 전달된 세포의 핵으로 다량체 올리고뉴클레오타이드 또는 대사산물의 수입을 용이하게 하기 위한 핵 국소화 신호 또는 서열(NLS)의 사용 및 혼입을 제공한다. NLS는 전형적으로 아미노산 서열이며, 그 예는 약물 전달 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
당업자는 공지된 전달 제제, 비히클 및 표적화 모이어티가 일반적으로 본 개시내용에 따라 사용하기 위해 개조될 수 있음을 이해할 것이다. 관련 교시 및 예는 미국 특허 제9,644,209호 및 제10,597,659호; WO 제2016/205410호 A2; WO 제2018/145086호 A1; 및 WO 제2020/180897호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 예시적이며 제한하는 것이 아니다. 기술의 많은 변형은 본 개시내용의 검토시 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서 기술 범위는 실시예를 참조하여 결정되는 것이 아니라 첨부된 청구범위와 이들의 등가물의 전체 범위를 참조하여 결정되어야 한다.
실시예
실시예 1: 단쇄 올리고뉴클레오타이드 합성
올리고리보뉴클레오타이드를 포스포르아미다이트 화학을 사용하여, 10 μmol 규모로 ABI 394 및 3900 합성기(Applied Biosystems) 상에서, 또는 28 μmol 규모로 Oligopilot 10 합성기 상에서 조립하였다. 고체 지지체는 2'-데옥시티미딘이 로딩된 폴리스티렌(Glen Research, Sterling, Virginia, USA) 또는 제어된 공극 유리(CPG, 520Å, 75 μmol/g의 로딩을 가짐, Prime Synthesis, Aston, PA, USA로부터 수득됨)였다. 보조 합성 시약, DNA-, 2'-O-메틸 RNA-, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-RNA 포스포르아미다이트를 SAFC Proligo(Hamburg, Germany)로부터 수득하였다. 구체적으로, 2'-O-메틸우리딘(2'-OMe-U), 4-N-아세틸-2'-O-메틸-시티딘(2'-OMe-CAc), 6-N-벤조일-2'-O-메틸-아데노신(2'-OMe-Abz) 및 2-N-이소부티릴구아노신(2'-OMe-GiBu)의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트 단량체를 사용하여 올리고머 서열을 구축하였다. 2'-OMe RNA 빌딩 블록과 동일한 핵염기 보호기를 갖는 상응하는 포스포르아미다이트를 사용하여 2'-플루오로변형을 도입하였다. 모든 포스포르아미다이트(아세토니트릴 중 70 mM)에 대한 커플링 시간은 활성화제로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT, 아세토니트릴 중 0.5 M)을 사용하여 3분이었다. 포스포로티오에이트 연결을 피리딘과 아세토니트릴의 1:1(v/v) 혼합물 중의 50 mM 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT, AM Chemicals, Oceanside, California, USA)을 사용하여 도입하였다. DMT 기의 제거("DMT 오프 합성")를 포함하는 고체상 합성이 완료되면, 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체로부터 절단하고 공개된 방법(Wincott, F. et al: Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozyme. Nucleic Acids Res, 23 : 2677-2684 (1995))에 따라 25℃에서 3시간 동안 수성 메틸아민(41%) 및 농축 암모니아수(32%)로 구성된 1:1 혼합물을 사용하여 탈보호시켰다.
이어서, 조 올리고머를 Source Q15(GE Healthcare)가 충전된 컬럼 및 AKTA Explorer 시스템(GE Healthcare)을 사용한 음이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 20% 수성 아세토니트릴 중의 10 mM 과염소산나트륨, 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 7.4(Fluka, Buchs, Switzerland)였고, 완충액 B는 500 mM 과염소산나트륨을 갖는 완충제 A와 동일하였다. 32 컬럼 부피(CV) 내에서 22% B부터 42% B까지의 구배를 사용하였다. 280 nm에서의 UV 트레이스(trace)를 기록하였다. 적절한 분획을 모으고 3 M NaOAc, pH=5.2 및 70% 에탄올로 침전시켰다. 펠렛을 원심분리에 의해 수집하였다. 대안적으로, 제조업체의 권장 사항에 따라 Sephadex HiPrep 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 탈염을 수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 물에서 재구성하고, 올리고뉴클레오타이드의 신원을 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 확인하였다. 순도를 분석용 음이온 교환 HPLC에 의해 평가하였다.
실시예 2: 티올 말단화된 siRNA의 생성
필요한 경우 3'- 또는 5'-말단 티올기를 1-O-디메톡시트리틸-헥실-디설파이드,1'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 링커(NucleoSyn, Olivet Cedex, France)를 통해 도입하였다. 고체상 합성의 완료 및 DMT 기의 최종 제거("DMT 오프 합성")시, 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체로부터 절단하고 10℃에서 6시간 동안 수성 메틸아민(41%)과 농축 암모니아수(32%)로 구성된 1:1 혼합물을 사용하여 탈보호시켰다. 이어서, 조 올리고뉴클레오타이드를 AKTA Explorer 시스템(GE Healthcare, Freiburg, Germany) 상에서 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하였다. 에탄올을 첨가하고 냉동실에서 밤새 저장하여 정제된 (C6SSC6)-올리고뉴클레오타이드를 침전시켰다. 펠렛을 원심분리에 의해 수집하였다. 올리고뉴클레오타이드를 물에서 재구성하고, 올리고뉴클레오타이드의 신원을 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 확인하였다. 순도를 분석용 음이온 교환 및 RP HPLC에 의해 평가하였다.
이어서, 각각의 디설파이드 함유 올리고머를 100 mM DL-디티오트레이톨(DTT) 용액을 사용하여 환원시켰다. 1.0 M DTT 스톡 용액(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, #646563)을 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액(TEABc, 1M, pH 8.5, Sigma, #90360) 및 물로 희석하여 DTT 및 TEABc 중에서 각각 100 mM 용액을 수득하였다. 올리고뉴클레오타이드를 TEABc 완충액(100 mM, pH 8.5)에 용해시켜 1 mM 용액을 수득하였다. 디설파이드 환원을 달성하기 위해 50-100배 몰 DTT 과량을 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 환원의 진행을 Thermo Fisher로부터 수득한 Dionex DNA Pac 200 컬럼(4x 250 mm) 상에서 분석용 AEX HPLC에 의해 모니터링하였다. 환원된 물질, 즉 상응하는 티올(C6SH)은 출발 물질에 앞서 용리한다. 반응 종료 후, GE Healthcare의 HiPrep 컬럼과 용리액으로서 물을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 시약을 제거하였다. 이어서, 올리고뉴클레오타이드를 3 M NaOAc(pH 5.2) 및 에탄올을 사용하여 침전시키고, -20℃에서 저장하였다.
실시예 3: 모노-DTME 올리고머의 제조
티올 변형된 올리고뉴클레오타이드를 25% 아세토니트릴을 함유하는 300 mM NaOAc(pH 5.2)에 용해시켜 20 OD/mL 용액을 수득하였다. 40 당량의 디티오비스말레이미도에탄(DTME, Thermo Fisher, #22335)을 아세토니트릴에 용해시켜 15.6 mM 용액을 제공하였다. DTME 용액을 올리고뉴클레오타이드 함유 용액에 첨가하고, Thermomixer(Eppendorf, Hamburg, Germany) 상에서 25℃에서 교반하였다. 반응의 진행을 Dionex DNA Pac200 컬럼(4x 250 mm)을 사용하여 분석용 AEX HPLC에 의해 모니터링하였다. 요구되는 순도 수준에 따라, 과량의 DTME를 HiPrep 컬럼(GE Healthcare)을 사용한 크기 배제 HPLC에 의해 제거하거나, 또는 조 반응 혼합물을 GE Healthcare로부터 상업적으로 이용가능한 Source 15 Q 수지가 충전된 컬럼을 사용한 분취용 AEX HPLC에 의해 정제하였다.
실시예 4: DTME 관능화를 통한 이량체의 제조
실시예 2의 절차에 따라 제조된 DTME 변형된 올리고뉴클레오타이드를 티올 링커가 장착된 또 다른 올리고뉴클레오타이드와 반응시켰다. 이 반응은 단일 가닥 서열 상에서 또는 하나의 반응 파트너의 상보적 올리고뉴클레오타이드의 사전 어닐링 후에 수행될 수 있다. 결과적으로, 원하는 경우, DTME 변형된 올리고뉴클레오타이드를 티올 변형된 올리고뉴클레오타이드와 직접 반응시키거나, 또는 그의 상보적 가닥과 어닐링하였고, 생성된 이합체를 티올 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시켰다. 대안적으로, 티올 변형된 올리고뉴클레오타이드를 그의 상보적 가닥과 어닐링하고, 이 이합체를 DTME 변형된 단일 가닥과 반응시켰다. 모든 경우에, 반응을 300 mM NaOAc(pH 5.2)의 존재 하에 수용액에서 수행하였다.
실시예 5: 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 어닐링하여 이중 가닥 RNA(dsRNA) 형성
등몰 양의 상보적 센스 및 안티센스 가닥을 혼합하고 20 mM NaCl/4 mM 인산나트륨 pH 6.8 완충액에서 어닐링함으로써 RNA 단일 가닥으로부터 dsRNA를 생성하였다. 성공적인 이합체 형성을 GE Healthcare의 Superdex 75 컬럼(10 x 300 mm)을 사용한 천연 크기 배제 HPLC에 의해 확인하였다. 샘플을 사용시까지 냉동 보관하였다.
실시예 6: 3'- 또는 5'-NH 2 유도체화된 올리고뉴클레오타이드의 제조
AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 고체 지지체로서 제어된 공극 유리(CPG)(Prime Synthesis, Aston, PA, USA)를 사용하여 140 μmol 규모로 고체상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 센스 가닥의 5'-말단에 C-6-아미노링커가 장착된 RNA를 생산하였다. 2'-O-메틸 및 2'-F 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머를 상응하는 2'-OMe-포스포르아미다이트, 2'-F-메틸 포스포르아미다이트를 사용하여 생성하였다. 센스 가닥의 5'-말단에 있는 5'-아미노헥실 링커를 TFA-보호된 헥실아미노링커 포스포르아미다이트(Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany)를 사용하여 도입하였다. 헥실아미노-링커가 3'-위치에 필요한 경우, CPG(Prime Synthesis, Aston, PA, USA) 상에 고정된 프탈이미도 보호된 헥실아미노-링커를 사용하였다. 절단 및 탈보호를 물 중의 41% 메틸아민 및 농축된 암모니아수의 혼합물(1:1 v/v)을 사용하여 달성하였다. 조 올리고뉴클레오타이드를 음이온 교환 HPLC 및 GE Healthcare로부터 수득한 Source 15Q 수지가 충전된 컬럼(2.5 x 18 cm)을 사용하여 정제하였다.
실시예 7: 하나의 분할된 센스 가닥에의 어닐링을 통한 스플릿-가닥 다량체 올리고뉴클레오타이드의 합성.
siRNA의 동종삼량체를 도 2에 예시된 방법론에 따라 합성한다. siRNA 센스 가닥의 부분 서열(5'-Se-3')을 제조하고, 합성기 상에서 디설파이드 링커(도 3에서 S-S-로 표시됨)를 통해 전장 siRNA 센스 가닥(5'-Sense-3')에 연결한다. siRNA 센스 서열의 나머지(5'-nse-3')가 디설파이드 링커를 통해 전장 siRNA 가닥에 연결된 제2 서열을 또한 합성한다. 선택적으로, 리간드를 전장 센스 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 말단에 부착한다. 이어서, 2개의 부분적 이량체를 실시예 5에 기재된 조건 하에 3 당량의 상보적 안티센스 가닥과 어닐링하여 표적 동종삼량체 siRNA를 형성한다.
실시예 8: 2개의 분할된 센스 가닥에의 어닐링을 통한 스플릿-가닥 다량체 올리고뉴클레오타이드의 합성.
siRNA의 동종사량체를 도 3에 예시된 방법론에 따라 합성한다. siRNA 센스 가닥의 부분적인 서열(5'-Se-3')을 제조하고, 합성기 상에서 디설파이드 링커(도 3에서 -S-S-로 표시됨)를 통해 전장 siRNA 센스 가닥에 연결하여 화합물 5'-Sense-3'-S-S-5'Se-3'을 수득한다. 선택적으로, 리간드를 전장 서열의 말단에 부착한다. 별도로, siRNA 서열의 나머지에 해당하고 하나의 말단에 보호된 티올을 갖는 올리고머(5'-nse-3'-SSR)를 합성기 상에서 제조한다. 정제 후 티올을 실시예 2에 기재된 조건 하에서 탈보호시키고, 부분적 siRNA의 동종이량체(5'-nse-3'S-CL-S3'-esn-5')를 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 DTME 유도체(5'-nse-3'-Mal)를 통해 제조한다. 1 당량의 5'-nse-3'-동종이량체(5'-nse-3'S-CL-S3'-esn-5') 및 2 당량의 화합물 5'-Sense-3'S-S5'Se-3'(선택적으로 리간드를 포함하거나 포함하지 않음)을 실시예 5에 기재된 조건 하에서 4 당량의 안티센스 가닥에 어닐링하여 3개의 절단가능한 연결을 함유하는 원하는 동종사량체성 siRNA를 수득한다.
실시예 9: 순차적 티올-말레이미드 반응 및 비대칭 어닐링을 통한 스플릿-가닥 다량체 올리고뉴클레오타이드의 합성. 빌딩 블록의 제조.
siRNA의 동종다량체(삼량체 내지 팔량체)를 도 1 및 4-9에 기재된 방법론에 따라 도 1에 예시된 빌딩 블록을 사용하여 합성한다.
5' 아미노기 및 3' 디설파이드를 갖는 전장 siRNA 센스 가닥(NH2-5'-Sense-3'-SSR)을 합성기 상에서 제조하고, 도 1에 예시된 바와 같이, 비차단 및 정제 후, 선택된 리간드를 아미노 기능을 통해 생성물의 일부에 부착한다. 디설파이드는 실시예 2에 기재된 절차에 의해 도 1에 예시된 바와 같은 상응하는 티올 유도체로 전환된다.
별도로, 전장 가닥의 5'-영역에 상응하는 siRNA 가닥의 부분적 서열(5'-Se-3')을 합성기 상에서 5'-말단에 있는 디설파이드를 사용하여 제조하고(RSS-5'-Se-3'), 이는 실시예 2에 기재된 절차를 통해 도 1에 예시된 바와 같은 상응하는 티올로 전환된다. 티올화된 생성물의 일부는 실시예 3에 기재된 절차에 의해 도 1에 예시된 바와 같은 상응하는 5'-모노-DTME 유도체(Mal-5'-Se-3')로 더 전환된다.
동시에, 전장 가닥의 3'-영역에 상응하는 siRNA 가닥의 부분적 서열(5'-nse-3')을 합성기 상에서 3'-말단에 있는 디설파이드를 이용하여 제조하고(5'-nse-3'-SSR), 이는 실시예 2에 기재된 절차를 통해 도 1에 예시된 바와 같이 상응하는 티올로 전환된다. 티올화된 생성물의 일부는 실시예 3에 기재된 절차를 통해 도 1에 예시된 바와 같이 상응하는 3'-모노-DTME 유도체(5'-nse-3'-Mal)로 더 전환된다.
동시에, 전장 siRNA 안티센스 가닥을 합성기 상에 제조하고, 비차단하고 정제한다.
실시예 10: 순차적 티올-말레이미드 반응 및 비대칭 어닐링을 통한 스플릿-가닥 동종삼량체의 합성.
실시예 3의 절차를 통해 티올화된 전장 센스 가닥과 부분적 siRNA 서열 말레이미드 유도체 Mal-5'-Se-3'과의 반응 후, 2 당량의 안티센스 가닥(..............)과 어닐링하여 도 4에 예시된 도식에 따라 siRNA의 동종삼량체를 제조한다. 생성물을 1 당량의 부분적 siRNA 서열 말레이미드 유도체 5'-nse-3'-Mal과 어닐링한 후, 1 당량의 전장 이중 가닥 티올화된 siRNA와 반응시켜 원하는 동종삼량체를 수득한다.
실시예 11: 순차적 티올-말레이미드 반응 및 비대칭 어닐링을 통한 스플릿-가닥 동종사량체의 합성.
siRNA의 동종사량체를 도 5에 기재된 도식에 따라 제조한다. 말단 말레이미드를 갖는 전장 및 스플릿-가닥 siRNA의 이량체를 실시예 10과 같이 제조한다. 별도로, 티올화된 siRNA 센스 가닥과 스플릿-가닥 말레이미드 유도체 Mal-5'-Se-3'의 반응 후 2 당량의 안티센스 가닥 ............ 및 1 당량의 티올화된 스플릿-가닥 5'-nse-3'-SH과의 순차적 어닐링에 의해 도 5에 예시된 바와 같이 말단 티올을 갖는 전장 및 스플릿 가닥 siRNA의 제2 이량체를 제조한다. 말레이미드 관능화된 이중 가닥 전장/스플릿-가닥 이량체와 티올 관능화된 이중 가닥 전장/스플릿 가닥 이량체를 반응시켜 3개의 절단가능한 이황화 결합을 갖는 원하는 동종사량체를 생성한다.
실시예 12: 순차적 티올-말레이미드 반응을 통한 스플릿-가닥 동종오량체의 합성.
siRNA의 동종오량체를 도 6에 예시된 반응식에 따라 제조한다. 실시예 10에서 제조된 말단 말레이미드를 갖는 전장 및 스플릿-가닥 siRNA의 이량체를 안티센스 가닥(..............)에 어닐링된 HS-5'-Se-3' 후 실시예 5에 기재된 조건 하에서 5'-nse-3'-Mal의 순차적 첨가를 통해 연장하여 중간 전장/스플릿-가닥/스플릿-가닥 삼량체 말레이미드 유도체를 수득한다. 이 물질을 실시예 4에 기재된 조건 하에서 실시예 11에서 제조된 전장/스플릿-가닥 티올 이량체와 반응시켜 원하는 동종오량체를 생성한다.
실시예 13: 순차적 티올-말레이미드 반응을 통한 스플릿-가닥 동종육량체의 합성.
실시예 5에 기재된 조건 하에서 도 7에 예시된 바와 같이 5'-nse-3'-Mal, 안티센스 가닥(.........)에 어닐링된 HS-5'-Se-3', 및 5'-nse-3'-SH의 순차적 첨가에 의해 실시예 10에서 제조된 중간체의 사슬 연장의 도 7에 예시된 도식에 따라 siRNA의 동종육량체를 제조한다. 이후, 2개의 삼량체 사슬을 실시예 4에 기재된 조건 하에서 티올/말레이미드 반응에 의해 연결한다.
실시예 14: 순차적 티올-말레이미드 반응을 통한 스플릿-가닥 동종칠량체의 합성.
실시예 5에 기재된 조건 하에서 안티센스 가닥(..........)에 어닐링된 HS-5'-Se-3' 및 5'-nse-3'-Mal 및 5'-nse-3'-SH의 순차적 첨가를 통한 실시예 13에서 제조된 말레이미드 유도체화된 삼량체의 사슬 연장 후, 생성된 말레이미드 유도체화된 사량체를 실시예 13으로부터의 티올 유도체화된 삼량체와 실시예 4에 기재된 조건 하에서 티올/말레이미드 반응에 의해 연결함으로써 도 8에 예시된 도식에 따라 siRNA의 동종칠량체를 제조한다.
실시예 15: 순차적 티올-말레이미드 반응을 통한 스플릿-가닥 동종팔량체의 합성.
실시예 5에 기재된 조건 하에서 5'-nse-3'-Mal, 안티센스 가닥(............)에 어닐링된 HS-5'-Se-3', 및 5'-nse-3'-SH의 순차적 첨가를 통해 실시예 13으로부터의 부분적 삼량체 중간체의 사슬 연장에 의해 도 9에 예시된 도식에 따라 siRNA의 동종팔량체를 제조한다. 이후, 생성된 티올화된 사량체를 실시예 4에 기재된 조건 하에서 티올 및 말레이미드 잔기의 반응에 의해 실시예 14에서 수득된 말레이미드 관능화된 사량체에 연결한다.
실시예 16: 순차적 티올-말레이미드 반응 및 비대칭 어닐링을 통한 siDMPK의 스플릿-가닥 동종삼량체의 합성.
근긴장성 이영양증 단백질 키나아제 mRNA(DMPK)를 표적화하는 siRNA의 동종삼량체를 도 11의 도식에 따라 제조한다. 전장 DMPK 센스 가닥을 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 3'-티올 잔기를 사용하여 합성기 상에서 제조한다. 5'-티올(HS-5'-DM-3')을 갖는 DMPK 센스 가닥의 부분적 서열(5'-DM-3')을 또한 합성기 상에서 제조하고, 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 의해 상응하는 모노-DTME 유도체(Mal-5'-DM-3')로 전환시킨다. 이어서, 티올화된 전장 가닥 및 DTME 유도체화된 부분 길이 DMPK 가닥을 함께 반응시켜 상응하는 단일 가닥 부분 이량체를 형성한 다음, 이를 실시예 5의 조건에 따라 2 당량의 전장 DMPK 안티센스 가닥(..........)과 어닐링한다.
3'-티올(5'-PK-3'-SH)로 유도체화된 siRNA 센스 서열의 나머지를 포함하는 제2 서열(5'-PK-3')을 또한 합성하고, 실시예 3의 절차에 따라 상응하는 모노-DTME 유도체로 전환하고, 이중 가닥 부분적 이량체와 어닐링하여 3' 말단 말레이미드기를 갖는 DMPK의 이중 가닥 전장/스플릿-가닥 이량체를 수득한다. 이어서, 이 물질을 3'-티올화된 이중 가닥 전장 DMPK siRNA와 반응시켜 DMPK siRNA의 원하는 동종삼량체를 형성한다.
실시예 17: 순차적 티올-말레이미드 반응 및 비대칭 어닐링을 통한 siHTT의 스플릿-가닥 동종삼량체의 합성.
헌팅틴 mRNA(HTT)를 표적화하는 siRNA의 동종삼량체를 도 12에 예시된 도식에 따라 제조한다. 전장 HTT 센스 가닥(HTT)을 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 3'-티올 잔기를 갖는 합성기 상에서 제조한다. 5'-티올(HS-5'-HT-3')을 갖는 HTT 센스 가닥의 부분적 서열(5'-HT-3')을 또한 합성기 상에서 제조하고, 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 의해 상응하는 모노-DTME 유도체(Mal-5'-HT-3')로 전환시킨다. 이후, 티올화된 전장(HTT) 가닥과 DTME 부분 길이(HT) 가닥을 함께 반응시켜 상응하는 단일 가닥 부분적 이량체를 형성한 다음, 이를 실시예 5의 조건에 따라 2 당량의 전장 HTT 안티센스 가닥(..........)과 어닐링한다.
siRNA 센스 서열의 나머지(5'-Ts-3')가 3'-티올(5'-Ts-3'-SH)로 유도체화된 제2 서열을 또한 합성하고, 실시예 3의 절차에 따라 상응하는 모노-DTME 유도체로 전환시키고, 이중 가닥 부분적 이량체와 어닐링하여 3'-말단 말레이미드기를 갖는 HTT의 이중 가닥 전장/스플릿-가닥 이량체를 생성한다. 이후, 이 물질을 3'-티올화된 이중 가닥 전장 HTT siRNA와 반응시켜 HTT siRNA의 원하는 동종삼량체를 형성한다.
실시예 18: 순차적 티올-말레이미드 반응을 통한 스플릿-가닥 이종오량체의 합성.
siRNA의 이종오량체를 도 10에 예시된 도식에 따라 제조한다. 온전한 서브유닛을 갖는 제1 siRNA 및 말단 말레이미드를 갖는 스플릿-가닥 서브유닛(실시예 10에 제조된 바와 같음)의 이량체를 실시예 5에 기재된 조건 하에서 안티센스 가닥(..........)에 어닐링된 HS-5'-Se-3' 후 5'-nse-3'-Mal의 순차적 첨가를 통해 연장시켜 중간 온전한/스플릿-가닥/스플릿-가닥 삼량체 말레이미드 유도체를 수득한다.
별도로, 3'-티올을 갖는 온전한 이중 가닥 제2 siRNA(제1 siRNA와 상이한 서열을 가짐)를 제1 siRNA의 센스 가닥의 5'-부분적 서열의 5'-말레이미도 유도체(Mal-5'-Se-3')와 반응시키고, 생성물을 제1 siRNA의 전장 안티센스 가닥(..........) 후 제1 siRNA의 센스 가닥의 3'-부분적 서열의 3'-티올화된 유도체(5'-nse-3'-SH)와 순차적으로 어닐링하여 티올화된 이종이량체 중간체를 수득한다.
티올화된 이종이량체 중간체와 동종삼량체 말레이미드 유도체를 반응시켜 제1 siRNA의 4개의 서브유닛 및 제2 siRNA의 1개의 서브유닛을 갖는 원하는 이종오량체를 수득한다.
SEQUENCE LISTING <110> MPEG LA, L.L.C. <120> MULTIMERIC OLIGONUCLEOTIDES WITH DIVIDED STRANDS <130> MPEG.013WO <140> PCT/US2021/029984 <141> 2021-04-29 <150> US 63/018406 <151> 2020-04-30 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is deoxyThymidine <400> 1 nnnn 4 <210> 2 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is deoxyCytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is deoxyAdenosine <400> 2 nn 2 <210> 3 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 uuu 3 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Pro Arg Pro Gly 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys 20 25 30 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Cys Gly Lys Arg Lys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys 1 5 <210> 9 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is Uridine phosphate <400> 9 nnn 3 <210> 10 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is deoxyThymidine phosphate <400> 10 nnnn 4

Claims (67)

  1. 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드로서,
    각각의 서브유닛은 독립적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 각각의 서브유닛은 공유 링커에 의해 또 다른 서브유닛에 연결되며; 적어도 하나의 서브유닛은 적어도 하나의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 서브유닛은, 이중 가닥 서브유닛을 형성하기 위해 상보적 가닥에 어닐링된 2개의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 1을 포함하고:
    Figure pct00125
    (구조 1), 여기서:
    Figure pct00126
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00127
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    Figure pct00128
    는 공유 링커인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 2를 포함하고:
    Figure pct00129
    (구조 2), 여기서:
    Figure pct00130
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00131
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    Figure pct00132
    는 공유 링커인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  5. 구조 3을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드로서:
    Figure pct00133
    (구조 3), 여기서:
    각각의
    Figure pct00134
    는 독립적으로 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00135
    는 공유 링커인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 구조 3은 동종이량체인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제5항에 있어서, 구조 3은 이종이량체인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 서브유닛은 구조 4를 포함하고:
    Figure pct00136
    (구조 4), 여기서:
    각각의
    Figure pct00137
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00138
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 인접한 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 연결된 공유 링커이며;
    Figure pct00139
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 5를 포함하고:
    Figure pct00140
    (구조 5), 여기서:
    각각의
    Figure pct00141
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00142
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00143
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 연결하는 공유 링커이고;
    Figure pct00144
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 6을 포함하고:
    Figure pct00145

    (구조 6)
    여기서:
    각각의
    Figure pct00146
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00147
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00148
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00149
    는 상보적 가닥이며;
    a, b, c, d, e, f, g, h, i, j 및 k는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이며, 단, c, e, h 및 j 중 적어도 하나는 1 이상인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j 및 k는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이고, 단, c, e, h 및 j 중 적어도 하나는 1 이상인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 7을 포함하고:
    Figure pct00150
    (구조 7), 여기서:
    Figure pct00151
    는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00152
    는 각각 상보적 가닥이며;
    Figure pct00153
    는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00154
    는 각각 공유 링커이며;
    m 및 n은 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
    o는 0 이상의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수이고 o는 0 내지 10 범위의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  14. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 8을 포함하고:
    Figure pct00155
    (구조 8),
    여기서:
    Figure pct00156
    는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00157
    는 각각 상보적 가닥이며;
    Figure pct00158
    는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00159
    는 각각 공유 링커이며;
    p 및 q는 각각 독립적으로 0 이상의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이거나; 또는 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 3 범위의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  16. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 9를 포함하고:
    Figure pct00160
    (구조 9),
    여기서:
    Figure pct00161
    는 각각 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00162
    는 각각 상보적 가닥이며;
    Figure pct00163
    는 각각 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00164
    는 각각 공유 링커이며;
    r은 1 이상의 정수이고;
    s는 0 이상의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, r은 1 내지 10 범위의 정수이고, s는 0 내지 10 범위의 정수이거나; 또는 r은 1 내지 3 범위의 정수이고, s는 0 또는 1인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  18. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 10을 포함하고:
    Figure pct00165
    (구조 10), 여기서:
    각각의
    Figure pct00166
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00167
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00168
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00169
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  19. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 11을 포함하고:
    Figure pct00170
    (구조 11),
    여기서:
    각각의
    Figure pct00171
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00172
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00173
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00174
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  20. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 12를 포함하고:
    Figure pct00175
    (구조 12), 여기서:
    각각의
    Figure pct00176
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00177
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00178
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00179
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  21. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 13을 포함하고:
    Figure pct00180
    (구조 13), 여기서:
    각각의
    Figure pct00181
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00182
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00183
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00184
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  22. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 14를 포함하고:
    Figure pct00185
    (구조 14), 여기서:
    각각의
    Figure pct00186
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00187
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00188
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00189
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  23. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 15를 포함하고:
    Figure pct00190
    (구조 15), 여기서:
    각각의
    Figure pct00191
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    각각의
    Figure pct00192
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며;
    각각의
    Figure pct00193
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이고;
    각각의
    Figure pct00194
    는 상보적 가닥인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  24. 제1항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드는 구조 16을 포함하고:
    Figure pct00195
    (구조 16),
    여기서, 각각의
    Figure pct00196
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00197
    는 상보적 가닥이며;
    Figure pct00198
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고;
    Figure pct00199
    는 공유 링커이며;
    t 및 u는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  25. 제24항에 있어서, t 및 u는 각각 독립적으로 0 내지 10 범위의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수이거나; 또는 t 및 u는 각각 독립적으로 0 내지 3 범위의 정수이고, 단, t 및 u 중 적어도 하나는 1 이상의 정수인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5-14개 뉴클레오타이드 길이인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 서브유닛은 상이한 세포 표적에 대해 활성인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  28. 제27항에 있어서, 모든 서브유닛은 상이한 세포 표적에 대해 활성인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 서브유닛은 동일한 세포 표적에 대해 활성인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  30. 제29항에 있어서, 모든 서브유닛은 상이한 세포 표적에 대해 활성인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 4개 이상의 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  32. 제31항에 있어서, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 서브유닛을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체 올리고뉴클레오타이드 내의 각각의 핵산은 RNA, DNA, 또는 인공 또는 비천연 핵산 유사체인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 서브유닛은 siRNA, saRNA, 또는 miRNA인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  35. 제34항에 있어서, 모든 서브유닛은 siRNA인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  36. 제34항에 있어서, 모든 서브유닛은 saRNA인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  37. 제34항에 있어서, 모든 서브유닛은 miRNA인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 서브유닛은 단일 가닥 서브유닛인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  39. 제38항에 있어서, 적어도 하나의 단일 가닥 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커
    Figure pct00200
    는 절단가능한 공유 링커인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  41. 제40항에 있어서, 절단가능한 공유 링커는 산 절단가능한 결합, 환원제 절단가능한 결합, 생체 절단가능한 결합, 또는 효소 절단가능한 결합을 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 절단가능한 공유 링커는 세포내 조건 하에서 절단가능한 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 공유 링커는 독립적으로 이황화 결합 또는 구조 25의 화합물이며:
    Figure pct00201
    (구조 25)
    여기서:
    S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되고;
    각각의 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴 기이며;
    R2는 티오프로피오네이트 또는 디설파이드 기이고;
    각각의 X는 독립적으로
    Figure pct00202
    로부터 선택되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  44. 제43항에 있어서, 구조 25의 화합물은
    Figure pct00203
    이고,
    여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  45. 제43항에 있어서, 구조 25의 화합물은 구조 26에 따른 화합물이며:
    Figure pct00204
    (구조 26),
    여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  46. 제43항에 있어서, 구조 25의 화합물은 구조 27에 따른 화합물이며:
    Figure pct00205
    (구조 27),
    여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  47. 제43항에 있어서, 구조 25의 화합물은 구조 28에 따른 화합물이며:
    Figure pct00206
    (구조 28),
    여기서, 각각의 말단 S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 올리고뉴클레오타이드 서브유닛에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 25의 공유 링커는 구조 29에 따른 공유 링커 전구체로부터 형성되며:
    Figure pct00207
    (구조 29),
    여기서, 각각의 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴 기이고, R2는 티오프로피오네이트 또는 디설파이드 기인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 3' 또는 5' 말단에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  50. 제49항에 있어서, 모든 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 3' 또는 5' 말단에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커는 올리고뉴클레오타이드 서브유닛의 내부 뉴클레오타이드에 부착되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커
    Figure pct00208
    는 뉴클레오타이드 링커를 포함하는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  53. 제52항에 있어서, 뉴클레오타이드 링커는 2-6개 뉴클레오타이드 길이인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 공유 링커
    Figure pct00209
    는 동일한 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  55. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커
    Figure pct00210
    는 다른 공유 링커와 상이한 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 3' 말단과 제2 서브유닛의 3' 말단 사이에서 공유 링커
    Figure pct00211
    에 의해 연결되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 3' 말단 사이에서 공유 링커
    Figure pct00212
    에 의해 연결되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 서브유닛은 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 5' 말단 사이에서 공유 링커
    Figure pct00213
    에 의해 연결되는 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 아닌 화학적 또는 생물학적 모이어티를 추가로 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수한 것인 다량체 올리고뉴클레오타이드.
  61. 구조 16을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서:
    Figure pct00214
    (구조 16),
    여기서, 각각의
    Figure pct00215
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
    Figure pct00216
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
    Figure pct00217
    는 상보적 가닥이고, 각각의
    Figure pct00218
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, t 및 u는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
    방법은 구조 17
    Figure pct00219
    (구조 17)
    및 구조 18
    Figure pct00220
    (구조 18)
    을 상보적 가닥
    Figure pct00221
    과 어닐링하여 구조 16을 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 구조 8을 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서:
    Figure pct00222
    (구조 8)
    여기서, 각각의
    Figure pct00223
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
    Figure pct00224
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
    Figure pct00225
    는 상보적 가닥이고, 각각의
    Figure pct00226
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, p 및 q는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
    방법은 구조 19,
    Figure pct00227
    (구조 19),
    구조 20,
    Figure pct00228
    (구조 20),
    및 하나 이상의 구조 21
    Figure pct00229
    (구조 21)
    을 상보적 가닥
    Figure pct00230
    과 어닐링하여 구조 8을 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  63. 구조 9A를 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서:
    Figure pct00231
    (구조 9A)
    여기서, 각각의
    Figure pct00232
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
    Figure pct00233
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
    Figure pct00234
    는 상보적 가닥이고, 각각의
    Figure pct00235
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, r 및 s는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
    방법은 구조 22,
    Figure pct00236
    (구조 22)
    구조 23
    Figure pct00237
    (구조 23)
    및 하나 이상의 구조 24
    Figure pct00238
    (구조 24)
    를 상보적 가닥
    Figure pct00239
    과 어닐링하여 구조 9A를 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  64. 구조 9B를 포함하는 다량체 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서:
    Figure pct00240
    (구조 9B)
    여기서, 각각의
    Figure pct00241
    는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 각각의
    Figure pct00242
    는 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 각각의
    Figure pct00243
    는 상보적 가닥이고, 각각의
    Figure pct00244
    는 인접한 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 공유 링커이며, r은 1 이상의 정수이고;
    방법은 구조 22,
    Figure pct00245
    (구조 22)
    하나 이상의 구조 24
    Figure pct00246
    (구조 24)
    및 부분적 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드
    Figure pct00247
    를 상보적 가닥
    Figure pct00248
    과 어닐링하여 구조 9B를 형성하는 것을 포함하는 것인 방법. 　　　　　　　　
  65. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 다량체 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  66. 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 다량체 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  67. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 다량체 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
KR1020227041998A 2020-04-30 2021-04-29 분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드 KR20230003579A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063018406P 2020-04-30 2020-04-30
US63/018,406 2020-04-30
PCT/US2021/029984 WO2021222635A2 (en) 2020-04-30 2021-04-29 Multimeric oligonucleotides with divided strands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230003579A true KR20230003579A (ko) 2023-01-06

Family

ID=78374246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227041998A KR20230003579A (ko) 2020-04-30 2021-04-29 분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20230220388A1 (ko)
EP (1) EP4143320A4 (ko)
JP (1) JP2023525480A (ko)
KR (1) KR20230003579A (ko)
CN (1) CN115997019A (ko)
AU (1) AU2021263932A1 (ko)
CA (1) CA3177114A1 (ko)
IL (1) IL297570A (ko)
MX (1) MX2022013475A (ko)
WO (1) WO2021222635A2 (ko)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080311040A1 (en) * 2007-03-06 2008-12-18 Flagship Ventures METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED THERAPEUTIC EFFECTS WITH siRNA
JP5529895B2 (ja) * 2009-02-04 2014-06-25 ソンギュングヮン ユニバーシティ ファウンデーション フォー コーポレート コラボレーション 細胞内の伝達能が増加した低分子干渉ｒｎａ複合体
KR101141544B1 (ko) * 2009-03-13 2012-05-03 한국과학기술원 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
EP2756080B1 (en) * 2011-09-14 2019-02-20 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
JP2015529469A (ja) * 2012-09-14 2015-10-08 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 多量体オリゴヌクレオチド化合物
US11352629B2 (en) * 2015-06-15 2022-06-07 Mpeg La, L.L.C. Defined multi-conjugate oligonucleotides
AU2016295168B2 (en) * 2015-07-17 2021-08-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10689654B2 (en) * 2016-10-18 2020-06-23 Augusta University Research Institute, Inc. Bivalent siRNA chimeras and methods of use thereof
CA3051480A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Mpeg La, Llc Multimeric oligonucleotides having decreased kidney clearance

Also Published As

Publication number Publication date
IL297570A (en) 2022-12-01
EP4143320A4 (en) 2024-06-19
EP4143320A2 (en) 2023-03-08
MX2022013475A (es) 2022-11-30
CA3177114A1 (en) 2021-11-04
CN115997019A (zh) 2023-04-21
JP2023525480A (ja) 2023-06-16
WO2021222635A3 (en) 2021-12-16
US20230146956A1 (en) 2023-05-11
US20230220388A1 (en) 2023-07-13
AU2021263932A1 (en) 2022-12-08
WO2021222635A2 (en) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016280709B2 (en) Defined multi-conjugate oligonucleotides
AU2018215684B2 (en) Multimeric oligonucleotides having decreased kidney clearance
JP2018518186A5 (ko)
US20230114023A1 (en) Subcutaneous delivery of multimeric oligonucleotides with enhanced bioactivity
WO2021026476A1 (en) Complement targeting with multimeric oligonucleotides
WO2021026490A1 (en) Cns targeting with multimeric oligonucleotides
KR20230003579A (ko) 분할된 가닥을 갖는 다량체 올리고뉴클레오타이드
US20230287406A1 (en) Multimeric oligonucleotides with enhanced bioactivity
CA3195631A1 (en) Multi-conjugates comprising a mono-substituted homo-bivalent linker

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination