JP2023525476A - 調節核酸配列 - Google Patents

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Abstract

本発明は、調節核酸配列、特にCNS特異的プロモーター及びそのエレメントに関する。本発明はまた、このようなプロモーターを含む、発現構築物、ベクター、ビリオン、医薬組成物及び細胞に、及びその使用方法に関する。調節核酸配列は、遺伝子療法適用にとって特に有用である。

Description

本発明は、調節核酸配列、特に、CNS特異的プロモーター及びそのエレメントに関する。本発明はまた、このようなプロモーターを含む発現構築物、ベクター、ビリオン、医薬組成物及び細胞に、並びにその使用方法に関する。調節核酸配列は、遺伝子療法適用にとって特に有用である。
以下の考察は、本開示の理解において読者を補助するために提供されており、先行技術の内容又は関連性についての何らかの承認を構成するものではない。
体内の遺伝子調節の内部機構の広範な研究の後に、研究の焦点は最近、細胞中に外因性核酸配列を導入することによる遺伝子発現の調節に移行した。
これは、研究及びバイオプロセシングにおいて従来的に行われ、プロモーターに作動可能に連結された所望の発現産物の核酸配列が、しばしばベクターの形態で産生細胞株中に導入される。
遺伝子療法の分野では、これは、患者の細胞における欠陥のある遺伝子の存在によって引き起こされる単一遺伝子障害又はメンデル型障害にとって特に興味深いものであった。患者の細胞へのプロモーターに作動可能に連結した欠陥のある遺伝子の野生型対立遺伝子の核酸配列の導入は、従来の医薬は症状に対処できるだけでありながら、理論的には、状態を治癒できるので好都合な治療選択肢である。
遺伝子療法では、細胞に導入された外因性核酸の発現を制御することは、患者の健康及び安全にとって極めて重要である。発現産物のレベルが、治療濃度域内である必要があるだけでなく、発現が、必要とする組織内又は必要とする組織内の特定の領域中にあることも必要である。治療濃度域の外側の(すなわち、より低い又はより高い)発現又は治療領域の外側の、若しくは必要とする組織内の特定の領域の外側でさえの発現が、治療上有用ではない、又は更に有害でさえある場合がある。
小児パーキンソニズムの1種であるドーパミン輸送体欠乏症候群は、それが単一遺伝子、DAT1/SLC6A3における機能喪失型変異によって引き起こされるので(Kurianら、2009)、置換遺伝子を導入することによる遺伝子療法の候補である。DAT1/SLC6A3は、神経外ドーパミンのドーパミン作動性ニューロンへの移行に関与するシナプス前ドーパミン輸送体をコードする。ドーパミン輸送体は、細胞膜をわたるナトリウム勾配の駆動力を使用してドーパミン、2つのナトリウムイオン及び1つの塩化物イオンを細胞中に輸送する。結果として、DAT1/SLC6A3は、ドーパミンシグナル伝達の持続期間及び強度の調節において役割を果たし(Ngら、2014)、その機能不全は、さまざまな精神神経障害、例えば、注意欠陥多動障害と関連している(Kurianら、2009)。
置換DAT1/SLC6A3遺伝子の導入において特に困難なことは、図1Aに示されるように、非疾患状態では、DAT1/SLC6A3は中脳において特異的に発現されるということである。DAT1/SLC6A3の天然発現を最良に模倣するためには、置換DAT1/SLC6A3遺伝子が中脳内で発現される(これがドーパミン作動性ニューロンの位置であるの)ことを確実にすることが望ましいが、脳の他の部分における発現が最小であることも好ましい。
したがって、他のCNS領域の中でも中脳において発現を駆動するプロモーター並びに中脳においてドーパミン作動性ニューロンにおいて発現を特異的に駆動するプロモーターが必要である。
アンジェルマン症候群も、置換遺伝子を導入することによる遺伝子療法の候補である。アンジェルマン症候群は、単一遺伝子、UBE3Aの突然変異又は不在によって最もよく引き起こされる。UBE3Aは、分解のためにタンパク質を標的化することに関与している。ほとんどのニューロンでは、母方から受け継がれたUBE3A遺伝子のコピーのみが活性であり、母系性UBE3A遺伝子の喪失がアンジェルマン症候群につながる。
置換UBE3A遺伝子の導入において特に困難なことは、図1Bに示されるように、非疾患状態では、UBE3Aは、脳において広く発現されるということである。UBE3A遺伝子の天然発現を最良に模倣するためには、置換UBE3A遺伝子が脳において広く発現されることが好ましい。
したがって、脳の多くの又はすべての領域において発現を駆動するプロモーターが必要である(例えば、汎CNS)。
CNSの他の疾患は、遺伝子療法の適した標的であり、一部のこのような疾患では、特定のCNS組織における治療遺伝子の標的化された発現が望ましい場合があり、他のより一般化されたものでは、CNSにおける非特異的発現が適したものである場合がある。
WO2014/144229 WO2019/028306 WO2000/28004 WO2001/23001 WO2004/112727 WO2005/005610 WO2005/072364 US6204059 US5756283 US6258595 US6261551 US6270996 US6281010 US6365394 US6475769 US6482634 US6485966 US6943019 US6953690 US7022519 US7238526 US7291498 US7491508 US5064764 US6194191 US6566118 US8137948 WO1996039530 WO1998010088 WO1999014354 WO1999/015685 WO1999/047691 WO2000/055342 WO2000/075353 WO2001/023597 WO2002/031137 米国特許第4,683,195号 米国特許出願第20050272923号 米国特許出願第20050266552号 米国特許出願第20050142581号 米国特許出願第20050075492号
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本発明の1つ又は複数の態様は、上記の問題のうち1つ又は複数に対処するよう意図される。
本発明の第1の態様では、配列番号1～8、21～26のいずれか1つに従う配列又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成中枢神経系(CNS)特異的プロモーターが提供される。
一部の実施形態では、合成CNS特異的プロモーターは、配列番号1～8、21～26のいずれか1つに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含むか又はそれらからなる。
本発明はしたがって、種々の合成CNS特異的プロモーター及びその機能的バリアントを提供する。配列番号1～8、21～26のいずれか1つのバリアントである本発明によるプロモーターは、参照プロモーターの活性の少なくとも25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%を保持することは一般に好ましい。適宜、前記活性は本明細書で記載されるような例を使用して評価されるが、他の方法も使用できる。
一部の実施形態では、合成CNS特異的プロモーターは、SYNP_CRE151(配列番号12)及び以下のCREのうち少なくとも1つを含む:
- CRE0004_Lmx1b(配列番号9)、
- CRE0003_Pitx3(配列番号10)、
- CRE0005_faf1_short(配列番号28)、
- CRE0006_Pitx2_short(配列番号29)、
- CRE0007_Pitx2_short(配列番号30)、及び
- CRE0008_Pitx2_short(配列番号31)。
本発明の別の態様では、配列番号9～11、28～31のいずれか1つに従う配列又はそれらのいずれかの機能的バリアントを含むか又はそれらからなるCNS特異的シス調節エレメント(CRE)が提供される。一部の実施形態では、CNS特異的CREは、配列番号9～11、28～31のいずれか1つに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む。
配列番号9～11、28～31のいずれか1つのバリアントである本発明によるCNS特異的CREが、参照CREの活性の少なくとも25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%を保持することは一般に好ましい。活性の保持は、参照プロモーターの制御下で適したリポーターの発現を、同等の条件下で置換されたCREを含むその他の点で同一のプロモーターと比較することによって評価できる。適宜、前記活性は、本明細書で記載されるような例を使用して評価されるが、他の方法も使用できる。
適宜、本発明によるCREを、追加のCREと組み合わせて、シス調節モジュール(CRM)を形成することができる。適宜、追加のCREは、配列番号9～11、28～31によるCRE又はその機能的バリアントであり得る、又はそれらは他のCREである場合もある。適宜、追加のCREは、CNS特異的である。
本発明の別の態様では、配列番号9～11、28～31のいずれか1つに従うCRE又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。一部の実施形態では、CREは、プロモーターエレメントに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、最小又は近位プロモーターであり得る。好ましくは、近位プロモーターは、CNS特異的近位プロモーターである。
本発明のさらなる態様では、配列番号12～13のいずれか1つに従う配列又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる最小又は近位プロモーターが提供される。本発明の別の態様では、前記最小又は近位プロモーターを含む合成プロモーター、適切には、前記最小又は近位プロモーターを含む合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、最小又は近位プロモーターの機能的バリアントは、配列番号12～13に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一である配列を含む。
適宜、CNS-4、CNS-5_v2、CNS-6_v2、CNS-7_v2、CNS-8_v2(配列番号4～8)のいずれか1つは、最小又は近位プロモーターとして機能できる。したがって、配列番号12～13又は配列番号4～8のいずれか1つに従う最小又は近位プロモーターを含む合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、最小又は近位プロモーターを、CRE又はCRMと作動可能に連結できる。CREは、本発明によるCRE又は任意の他のCREであり得る。CRMは、本発明によるCREを含み得る。適宜、CRE又はCRMは、CNS特異的である。
本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの特定の領域において、好ましくは、脳の特定の領域において、又は脳の特定の細胞種(単数若しくは複数)において、又は両方の組合せにおいて活性であり得る。
本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの種々の部分のうち1つ又は複数において活性であり得る。CNSは、主に脳及び脊髄からなるからなる。網膜、視神経、嗅覚神経及び嗅上皮は、脳及び脊髄と並んでCNSの部分と考えられることもある。これは、それらが中間神経線維を伴わずに脳組織と直接的に接続しているためである。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳及び脊髄において活性であり得る。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳で活性であるが、脊髄又はCNSの任意の他の部分では活性ではない場合がある。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脊髄で活性であるが、脳では活性ではない場合がある。好ましくは、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳で活性であり得る。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳内の種々の領域のうち1つ又は複数において活性であり得る。
脳領域の限定されない例として、前頭葉、頭頂葉(pariental lobe)、後頭葉、側頭葉(海馬及び扁桃体を含む)、小脳、中脳、脳橋、延髄及び間脳(視床及び視床下部を含む)が挙げられる。脊髄領域の限定されない例として、頸椎、胸椎、腰椎、仙椎及び尾椎が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターが脳において広範な活性を示すことが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳又はCNSのすべての部分において(汎CNS)、好ましくは、脳のすべての領域において活性である。一部の実施形態では本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳において活性であるが、CNSの他の部分、例えば、脊髄では活性ではない。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で列挙された脳の領域のうち1、2、3、4、5、6、7、8又は9つにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脳中の領域の大部分、すなわち、上記で列挙された脳の9つの領域のうち少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8又は9つすべてにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で列挙された脳の4～6の領域において活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で列挙された脳の2～4の領域、例えば、中脳、側頭葉及び間脳等において活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、脳及び脊髄の上記の領域において活性であり得る。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、脊髄において活性であるが、CNSの他の部分、例えば、脳では活性ではない。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、上記で列挙された脊髄の領域のうち1、2、3、4又は5つにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、脊髄中の領域の大部分、すなわち、上記で列挙された脊髄の5つの領域のうち少なくとも3、少なくとも4又は5つすべてにおいて活性である。
一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターが、CNSの1つの領域において、適宜、脳の1つの領域において優勢な活性を示すことが望ましい場合がある。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターが、脳の1つの領域において活性を示すが、脳又はCNSの残りの部分では活性を示さない又は最小の活性のみを示すことが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で列挙された脳のCNS領域の1つの領域、例えば、中脳においてのみ活性である。一部の好ましい実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、中脳において特異的に活性である(中脳特異的)。1つの好ましい実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、中脳において特異的に活性(中脳特異的)であるが、脳の他の領域では活性を示さない、又は最小の活性のみを示す。
本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの種々の細胞において活性である場合がある。脳における優勢な細胞種は、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及び上衣細胞である。特に、炎症状態では、他の細胞種が存在する場合もある。一部の実施形態では、プロモーターにとって多数の異なる細胞種において活性であることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの実質的にすべての細胞(例えば、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞)において活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で収載されたCNS細胞種から少なくとも4つのCNS細胞種、例えば、ニューロン、星状細胞、ミクログリア及びオリゴデンドロサイトにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で収載されたCNS細胞種から少なくとも3つのCNS細胞種、例えば、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトにおいて活性である。
一部の実施形態では、プロモーターにとって制限された数のCNS細胞種において、又は1以下のCNS細胞種において活性であることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で収載されたCNS細胞種から4、3、2又は1以下のCNS細胞種において活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で収載されたCNS細胞種から2以下のCNS細胞種、例えば、ニューロン及びオリゴデンドロサイトにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、上記で収載されたCNS細胞種から1つのみのCNS細胞種、例えば、ニューロンにおいて活性である。
一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNS細胞の特定のサブタイプ、例えば、ドーパミン作動性ニューロン等において活性である。一部の特定の好ましい実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて活性である。一部の好ましい実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて活性であるが、他のCNS細胞種又は他のCNS細胞サブタイプでは活性ではない。一部の好ましい実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、GABA作動性又はグルタミン酸作動性ニューロンにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNS細胞の特定のタイプ又はCNS細胞の特定のサブタイプにおいて、また脳の特定の領域において活性である。
本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの外側の組織において活性である場合も、活性ではない場合もある。CNSの外側の組織の限定されない例として、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋及び脾臓がある。適宜、一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、CNSの外側の組織又は細胞において活性ではない、又は最小にしか活性ではない。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、ICV送達において上記のCNSの外側の組織のうち1、2、3、4以下の組織において活性である。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、IV送達において上記のCNSの外側の組織のうち1、2、3、4以下の組織において活性である。
適宜、一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターにとって、CNSにおいて活性であるが、CNSの外側の他の組織においても活性を有することが望ましい場合がある。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、ICV送達において上記のCNSの外側の組織のうち少なくとも1、2、3、4又は5つにおいて活性であり得る。適宜、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターは、IV送達において上記のCNSの外側の組織のうち少なくとも1、2、3、4又は5つにおいて活性であり得る。
一部の実施形態では、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、CNSにおいて、及び末梢神経系(PNS)において活性である場合がある。本発明のCRE、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターがCNS及びPNSにおいて活性である場合には、本発明のCRE、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、神経系特異的(NS特異的)と呼ばれることがある。PNSとは、脳及び脊髄の外側である神経系の部分を指す。末梢神経系の限定されない例として、脳神経、腕神経叢、胸腹神経、腰神経叢、仙骨神経叢及び神経筋接合部が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又はプロモーターが、PNSにおいて広範な活性を示すことが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、上記で列挙されたPNSの領域のうち1、2、3、4、5又は6つにおいて活性である。一部の実施形態では、本発明のCRE、CRM、最小/近位プロモーター又は合成プロモーターは、PNS中の領域の大部分、すなわち、上記で列挙されたPNSの6領域のうち少なくとも4、少なくとも5又は6つすべてにおいて活性である。
一部の実施形態では、合成プロモーターCNS-5及びCNS-5_v2は、CNSにおいて、及びPNS中の領域の大部分、上記で列挙されたPNSの6領域のうち少なくとも4、少なくとも5又は6つすべてにおいて活性である。一部の実施形態では、合成プロモーターCNS-2、CNS-3及びCNS-4は、CNS及び上記で列挙されたPNSの領域のうち少なくとも1つにおいて活性である。一部の実施形態では、合成プロモーターCNS-2、CNS-3及びCNS-4は、CNSにおいて、及びPNS交感神経ニューロンにおいて活性である。
CNS特異的プロモーターは、他の非CNS細胞において発現させることができる。しかし、脳及び脊髄中の神経細胞等のCNS細胞並びに脳及び脊髄中に位置する非神経細胞又は神経支持細胞においてより高い程度の発現を有する。例えば、CNS特異的プロモーターは、CNSの外側に位置する細胞と比較して、脳及び脊髄中に位置する神経細胞及び非神経細胞を含むCNS中に位置する細胞において、少なくとも25%又は少なくとも35%又は少なくとも45%又は少なくとも55%又は少なくとも65%又は少なくとも75%又は少なくとも80%又は少なくとも90%又は少なくとも95%又は25%～95%の間の任意の整数の%高い遺伝子を発現する。
所望の組織又は細胞において本発明のプロモーターによって駆動される発現は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、1 1時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、13日、2週間、15日、16日、17日、18日、19日、20日、3週間、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、31日、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年又は10年より長い期間であり得る。発現は、1～5時間、1～12時間、1～2日、1～5日、1～2週間、1～3週間、1～4週間、1～2ヶ月、1～4ヶ月、1～6ヶ月、2～6ヶ月、3～6ヶ月、3～9ヶ月、4～8ヶ月、6～12ヶ月、1～2年、1～5年、2～5年、3～6年、3～8年、4～8年又は5～10年の間であり得る。
本発明のさらなる態様では、発現産物をコードする配列に作動可能に連結した本発明の任意の態様の合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットが提供される。適宜、発現産物は、遺伝子、例えば、導入遺伝子である。一部の実施形態では、発現産物は、治療用発現産物である。
さらなる態様では、本発明に従う合成CNS特異的プロモーター又は発現カセットを含むベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、遺伝子療法ベクター、適宜、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスベクター又はレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、CNSにおいて遺伝子導入ツールとして広く使用されており、ニューロン、星状細胞お及びオリゴデンドロサイトに成功裏に形質導入することができると知られている(Jakobsson及びLundberg、2006)。それらは、比較的大きなクローニング能を有するので、またウイルス遺伝子が発現されないので有益である。特に好ましいレンチウイルスベクターシステムは、HIV-1に基づいている(Jakobsson及びLundberg、2006)。単純ヘルペスウイルスベクター及びアデノウイルスベクターはまた、それらがCNS細胞の形質導入の成功を示すので、CNSにおいて遺伝子導入ツールとして使用するための可能性を示すが、その毒性のためにあまり好ましくない。
AAVベクターは、当技術分野で広く論議されてきた。AAVベクターは通常、ゲノムに組み込まれず、免疫応答を誘発しないので、AAVベクターは、特に興味深い。AAV血清型1、2、4、5、8、9、rh10、DJ8及び2g9(AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVDJ8及びAAV2g9)は、CNSにおいて効率的な形質導入を達成すると注目されてきた。したがって、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVVDJ8、AAV2g9及びそれらの誘導体は、特に好ましいAAV血清型である。一部の実施形態では、AAV9は特に好ましいAAVベクターである。他の実施形態では、AAV2g9は、特に好ましいAAVベクターである(WO2014/144229)。更に他の実施形態では、特に好ましいAAVベクターは、AAVDJ8である。一部の実施形態では、AAVrh10は、特に好ましいAAVベクターである。適宜、AAVベクターは、2つの逆方向末端反復配列(ITR)の間に位置する本発明の核酸配列を含むウイルスゲノムを含む。WO2019/028306には、例えば、CNSにおいて使用できる、種々の野生型及び改変されたAAVベクターが開示されている。一実施形態では、AAVベクターは、AAVベクターの送達後に血液脳関門を透過可能である。一実施形態では、本発明のAAVベクターは、そのウイルスゲノム内に機能的Rep及びCapタンパク質をコードする配列を欠く、複製欠損のある組換えAAVウイルスベクターである。これらの欠陥のあるAAVベクターは、親のコード配列のほとんど又はすべてを欠き、1つ又は2つのAAV ITR配列及び細胞、組織、臓器又は生物への送達のための目的の核酸のみを本質的に保持する場合がある。適宜、本明細書において使用するためのAAVベクターは、目的の核酸ペイロード又はカーゴの形質導入のために必要な最小の成分に低減されているウイルスを含む。この方法では、AAVベクターは、野生型ウイルスにおいて見られる有害な複製及び/又は組込み機構を欠きながら、特異的送達のための媒体として操作される。一実施形態では、本発明のAAV粒子は、scAAVである。別の実施形態では、本発明のAAV粒子はssAAVである。AAV粒子を生成及び/又は改変する方法は、当技術分野で広く開示されている(例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2000/28004、WO2001/23001、WO2004/112727、WO2005/005610号びWO2005/072364を参照されたい)。一実施形態では、AAVベクターは、血管内(例えば、静脈内又は動脈内)投与後に血液脳関門透過を可能にするカプシドを含む(例えば、例えば、血液脳関門の効率的な横断のために操作されたカプシド、例えば、VOY101、VOY201、AAVPHP.N、AAVPHP.A、AAVPHP.B、PHP.B2、PHP.B3、G2A3、G2B4、G2B5、PHP.S及びそれらのバリアントを含むカプシド又はペプチド挿入物を論じるWO2014/144229を参照されたい)。
AAVベクターを作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許US6204059、US5756283、US6258595、US6261551、US6270996、US6281010、US6365394、US6475769、US6482634、US6485966、US6943019、US6953690、US7022519、US7238526、US7291498及びUS7491508、US5064764、US6194191、US6566118、US8137948、又は国際公開WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999/015685、WO1999/047691、WO2000/055342、WO2000/075353及びWO2001/023597; Methods In Molecular Biology、Richard編、Humana Press、NJ (1995); O'Reillyら、Baculovirus Expression Vectors、A Laboratory Manual、Oxford Univ. Press (1994); Samulskiら、J Fir.63: 3822～8頁(1989); Kajigayaら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646～50頁(1991); Ruffingら、J. Vir. 66: 6922～30頁(1992); Kimbauerら、Vir.、219: 37～44頁(1996); Zhaoら、Vir.272: 382～93頁(2000)に記載されており、それらの各々の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。組換えAAVウイルス粒子の生成のためによく使用されるウイルス複製細胞には、それだけには限らないが、HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞及び他の哺乳動物細胞株が含まれる。
一部の実施形態では、ベクターは、例えば、当技術分野で公知であるようにカチオンポリマー又はカチオン脂質を使用する非ウイルスベクターである。種々の非ウイルスベクターは、Selene Ingusciら(Gene Therapy Tools for Brain Diseases. Front. Pharmacol. 10:724. doi: 10.3389)に論じられている。
さらなる態様では、本発明に従うベクター、適宜、ウイルスベクターを含むビリオン(ウイルス粒子)が提供される。一部の実施形態では、ビリオンはAAVビリオンである。
さらなる態様では、本発明に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター又はビリオンを含む医薬組成物が提供される。
例えば、AAVベクター粒子は、医薬組成物として調製できる。このような組成物は、1つ又は複数の有効成分、最も多くは、薬学的に許容される賦形剤を必ず含むことは理解されよう。
本開示に従う医薬組成物は、単回単位用量として、及び/又は複数の単回単位用量として調製され、パッケージングされ、及び/又はバルクで販売され得る。本明細書において、「単位用量」とは、所定量の有効成分を含む医薬組成物の別個の量を指す。有効成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう有効成分及び/又はこのような投与量の好都合な割合、例えば、このような投与量の2分の1又は3分の1等の投与量に等しい。
さらなる態様では、医薬として使用するための本発明に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物が提供される。
さらなる態様では、療法、すなわち、医学的状態又は疾患の予防又は治療において使用するための本発明に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物が提供される。
適宜、医学的状態又は疾患は、異常な遺伝子発現、任意選択で、CNS組織又は細胞における異常な遺伝子発現と関連する。適宜、使用は、遺伝子療法のため、好ましくは、異常な遺伝子発現が絡む疾患の治療において使用するためである。適宜、異常な遺伝子発現が絡む医学的状態又は疾患は、CNSの疾患であり得る。適宜、医学的状態又は疾患は、CNSの単一遺伝子障害であり得る。適宜、遺伝子療法は、CNS細胞又は組織における治療用発現産物の発現を含む。本態様に関連する例示的医学的条件又は疾患は、以下に論じられる。
さらなる態様では、本発明の合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター又はビリオンを含む細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、任意選択で、ヒト細胞である。適宜、細胞は、CNS細胞である。適宜、細胞は、ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞、上衣細胞又は小グリア細胞であり得る。適宜、細胞は、ヒトニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞、上衣細胞又は小グリア細胞であり得る。合成CNS特異的プロモーターは、エピソーマルである場合も、細胞のゲノム中である場合もある。
さらなる態様では、医学的状態又は疾患の治療のための医薬組成物の製造において使用するための本明細書において記載されるような合成CNS特異的CRE、合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物が提供される。本態様に関連する例示的医学的状態又は疾患は、以下に論じられる。
さらなる態様では、発現産物を生成する方法であって、CNS細胞又は組織において本発明の合成CNS特異的発現カセット、ベクター又はビリオンを提供すること及び合成CNS特異的発現カセット、ベクター又はビリオンにおいて存在する目的の遺伝子を発現させることを含む方法が提供される。方法は、in vitro若しくはex vivoであり得る、又はin vivoであり得る。
さらなる態様では、CNS細胞において治療用導入遺伝子を発現させる方法であって、CNS細胞中に本明細書において記載されるような合成CNS特異的発現カセット、ベクター又はビリオンを導入する工程及び合成CNS特異的発現カセット、ベクター又はビリオンにおいて存在する発現産物(例えば、目的の遺伝子)を発現させる工程を含む方法が提供される。CNS細胞は、例えば、ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞、上衣細胞又は小グリア細胞であり得る。
さらなる態様では、それを必要とする対象、好ましくは、ヒトの療法の方法であって、
- 対象に、本発明に従うプロモーターに作動可能に連結した治療用産物をコードする配列を含む、本明細書において記載されるような発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物を投与する工程;及び
- 前記対象のCNSにおいて治療用産物の治療量を発現させる工程
を含む方法が提供される。
適宜、方法は、神経疾患及び/又は障害の治療、予防、緩和又は寛解のためである。本態様に関連する例示的医学的状態又は疾患は、以下に論じられる。
投与の適した方法は、経腸(例えば、経口、舌下及び直腸)又は静脈内、動脈内、頭蓋内、筋肉内、皮下、関節内、くも膜下腔内及び皮内注射を含む非経口(例えば、注射)であり得る。好ましい投与方法は、静脈内、動脈内、頭蓋内及びくも膜下腔内注射である。
一部の実施形態では、方法は、対象のCNS中に、治療用産物をコードする遺伝子を含む、本明細書において記載されるような発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物を導入することを含む。CNS中に発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物を導入することに関して特に困難なことは、血液脳関門である。血液脳関門は、血流中のある特定の化学物質及び分子がある特定の神経系の細胞外液中に入ることを防ぐ内皮細胞の半透性境界である。動物研究では、この障壁は、動物の脳中への直接的な注射、例えば、頭蓋内注射、適宜、脳室内(ICV)注射によって克服されてきた(例えば、Keiserら、Curr Protoc Mouse Biol. 2018 Dec;8(4):e57を参照されたい)。この投与方法は、実施することが困難であり、対象にとって危険である場合があるので、ヒトにおける遺伝子療法にとって不利であり得る。
代わりに、ヒトにおける遺伝子療法設定では、発現カセットを含むウイルスベクターの静脈内又は動脈内(例えば、頸動脈内)投与によって本明細書で記載されるような発現カセットがCNS中に導入されることが好ましい。適宜、ウイルスベクターはAAVベクターである。AAVのいくつかの血清型の静脈内又は動脈内投与によって、AAVベクターの脳への透過が可能となる。非CNS組織及び細胞における最小発現は、本発明に従う合成CNS特異的プロモーターのCNS特異性によると予測される。更に、CNS透過のための改善されたAAVカプシドの開発によって、AAVベクターの透過が改善されると予測される。静脈内又は動脈内投与は、依然として血液脳関門を介した透過を可能にしながら頭蓋内投与よりも安全であり、侵襲性が低い。
適宜、医学的状態又は疾患は、CNSの医学的状態又は疾患、例えば、神経疾患及び/又は障害である。適宜、医学的状態又は疾患は、例えば、ドーパミン輸送体欠乏症候群、注意欠陥/多動障害(ADHD)、双極性障害、てんかん、多発性硬化症、タウオパチー、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、クラッベ病、副腎白質ジストロフィー、運動ニューロン疾患、脳性麻痺、バッテン病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、レット症候群、サンドホフ病、シャルコー・マリー・トゥース病、アンジェルマン症候群、カナバン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ムコ多糖症IIIA、ムコ多糖症IIIB、異染性白質ジストロフィー、遺伝性リソソーム蓄積症、例えば、ニーマン・ピック病C1型及び/又は神経セロイドリポフスチン症、例えば、バッテン 疾患、進行性核上性麻痺、皮質基底核症候群及び脳癌(星状細胞腫及び神経膠芽腫を含む)から選択され得る。
適宜、発現産物をコードする核酸は、NPC1、EAAT2、NPY、CYP46A1、GLB1、APOE (又はAPOE2)、HEX、CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6、SUMF1、DCTN1、PRPH、SOD1、NEFH、GBA、IDUA、NAGLU、GUSB、ARSA、MANB、AADC、GDNF、NTN、ASP、MECP2、PTCHD1、GJB1、UBE3A、HEXA、FXN及びMOGからなる群から選択される遺伝子のうちの1つであり得る。
更に、又は或いは、発現産物は、抗体、抗体断片又は抗体様足場タンパク質であり得る。
更に、又は或いは、発現産物は、疾患対立遺伝子に向けられた遺伝子編集システム(例えば、CRISPR-Cas9システム、TALEN、ZFN等)であり得る。
更に、又は或いは、発現産物は、1つ又は複数の調節性ポリヌクレオチド、例えば、治療薬としてのRNA又はDNA分子であり得る。例えば、調節性ポリヌクレオチドは、miRNA又はsiRNAであり得る。標的遺伝子は、任意の神経疾患、例えば、それだけには限らないが、本明細書において収載されたものと関連する遺伝子のいずれかであり得る。例えば、siRNA二重鎖又はコードされるdsRNAは、CNS細胞において標的遺伝子発現を低減又はサイレンシングし、それによって、神経疾患の症状を寛解できる。限定されない一例では、標的遺伝子は、ハンチンチン(HTT)である。別の限定されない例では、標的遺伝子は、微小管関連タンパク質タウ(MAPT)である。
さらなる態様では、配列番号1又は配列番号21を含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与された場合にCNS特異的プロモーターに作動可能に連結した発現産物の広範な頭蓋内発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳の少なくとも6領域において活性である。適宜、合成CNS特異的プロモーターがICV注射によって投与される場合、合成CNS特異的プロモーターは、脳におけるシナプシン-1(配列番号14)と比較して少なくとも100%、150%又は200%のレベルでシナプシンのCNS特異的発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与された場合に皮質及び海馬において促進可能である。
さらなる態様では、CNSにおいて発現産物を発現する方法であって、CNS細胞中に発現産物に作動可能に連結した配列番号1又は配列番号21を含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットを導入することを含む方法が提供される。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、脳において広範である。適宜、脳における発現産物の発現は、脳の少なくとも6領域においてである。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳におけるシナプシン-1(配列番号14)と比較して少なくとも100%、150%又は200%のレベルで発現産物のCNS特異的発現を促進可能である。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、皮質及び海馬において発現される。
さらなる態様では、上記で論じられるような配列番号2、配列番号25又は配列番号7又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、このような合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与された場合にCNS特異的プロモーターに作動可能に連結した核酸からの発現産物の脳における広範な発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳の少なくとも6領域において活性である。適宜、配列番号2又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、IV注射によって投与された場合にCNS特異的プロモーターに作動可能に連結した発現産物の広範な頭蓋内発現を促進可能である。適宜、配列番号2又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、中脳においてプロモーター発現しない。適宜、配列番号7又は配列番号25又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、IV注射によって投与された場合にCNS特異的プロモーターに作動可能に連結した発現産物の皮質、海馬及び中脳における発現を促進可能である。
さらなる態様では、CNSにおいて発現産物を発現させる方法であって、CNS細胞中に発現産物をコードする核酸に作動可能に連結した配列番号2若しくはその機能的バリアント、配列番号25若しくはその機能的バリアント又は配列番号7若しくはその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットを導入することを含む方法が提供される。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物の発現は、脳において広範である。適宜、脳における発現産物の発現は、上記で論じられるように脳の少なくとも6領域においてである。適宜、配列番号2又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる発現カセットは、IV注射によってCNS中に導入され、発現産物の発現は、脳において広範であるが、中脳では広範ではない。適宜、配列番号7又は配列番号25又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる発現カセットは、IV注射によってCNS中に導入され、発現産物の発現は、皮質、海馬及び中脳において発現されるが、中脳では発現されない。
さらなる態様では、上記で論じられるような配列番号3、配列番号22又は配列番号4又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与された場合に皮質及び海馬において発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳の他の領域では、活性ではない、又は最小にしか活性ではない。適宜、配列番号3若しくはその機能的バリアント、配列番号22若しくはその機能的バリアント又は配列番号4若しくはその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、IV注射によって投与された場合に、皮質、線条体及び海馬において発現を促進可能である。適宜、配列番号4又は配列番号22又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、中脳において発現を更に促進可能である。
さらなる態様では、CNSにおいて発現産物を発現する方法であって、発現産物をコードする核酸に作動可能に連結した、配列番号3若しくはその機能的バリアント、配列番号22若しくはその機能的バリアント又は配列番号4若しくはその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットをCNS細胞中に導入することを含む方法が提供される。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、皮質及び海馬において発現される。適宜、発現の発現は、脳の他の領域では最小である。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物の発現は、皮質及び海馬において発現される。適宜、発現カセットは、IV注射によってCNS中に導入され、発現産物の発現は、皮質、線条体及び海馬において発現される。
さらなる態様では、上記で論じられるような配列番号5又は配列番号23又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、皮質、線条体、海馬及び中脳において発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳の他の領域では活性ではない、又は最小にしか活性ではない。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与される。
さらなる態様では、CNSにおいて発現産物を発現させる方法であって、発現産物をコードする核酸に作動可能に連結した配列番号5又は配列番号23又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットをCNS細胞中に導入することを含む方法が提供される。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入される。適宜、発現産物は、皮質、線条体、海馬及び中脳において発現される。適宜、発現は、脳の他の領域では最小である。
さらなる態様では、上記で論じられるような配列番号6、配列番号24、配列番号26又は配列番号8又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターが提供される。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、ICV注射によって投与された場合に海馬、皮質及び中脳において発現を促進可能である。適宜、配列番号6又は配列番号24又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、IV注射によって投与された場合に海馬、中脳及び小脳において発現を促進可能である。適宜、配列番号8又は配列番号26又はその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、IV注射によって投与された場合に海馬及び中脳において発現を促進可能である。適宜、合成CNS特異的プロモーターは、脳の他の領域において活性ではない、又は最小にしか活性ではない。適宜、配列番号6若しくはその機能的バリアント、配列番号24若しくはその機能的バリアント、配列番号26若しくはその機能的バリアント又は配列番号8若しくはその機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、主にニューロンにおいて活性である。適宜、配列番号8又は配列番号26又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターは、主にドーパミン作動性ニューロンにおいて活性である。
さらなる態様では、CNSにおいて発現産物を発現させる方法であって、CNS細胞中に発現産物をコードする核酸に作動可能に連結した配列番号6、配列番号24、配列番号26又は配列番号8を含むか又はそれらからなる合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセットを導入することを含む方法が提供される。適宜、発現カセットは、ICV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、海馬、皮質及び中脳において発現される。適宜、配列番号6又は配列番号24又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる発現カセットは、IV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、海馬、中脳及び小脳において発現される。適宜、配列番号8又は配列番号26又はそれらの機能的バリアントを含むか又はそれらからなる発現カセットは、IV注射によってCNS中に導入され、発現産物は、海馬及び中脳において発現される。適宜、発現の発現は、脳の他の領域において最小である。
さらなる態様では、ドーパミン作動性ニューロンにおいて発現産物を発現する方法であって、IV注射によって合成CNS特異的発現カセットをドーパミン作動性ニューロン中に導入することを含む方法提供され、CNS特異的発現カセットは、配列番号8又は配列番号26又はそれらの機能的バリアントを含む。
成体マウス脳から得た冠状断面におけるDAT1/SLC6A3遺伝子の発現パターン(Alanマウス脳アトラスから取得; mouse.brain-map.org)を示す図である。DAT1/SLC6A3は、中脳において高度に発現される。 成体マウス脳から得た冠状切片におけるUBE3A遺伝子の発現パターン(Alanマウス脳アトラスから取得; mouse.brain-map.org)を示す図である。UBE3Aは、脳において広く発現される。 ICV及びIVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)並びに対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの矢状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 ICV及びIVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの矢状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 ICVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 ICVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)並びに対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 IVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 IVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 ICVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)並びに対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの脳の種々の部分における、より高倍率での頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、100μmである。 ICVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)並びに対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの脳の種々の部分における、より高倍率での頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、100μmである。 IVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)の制御下の、並びに注射されていない対照の導入遺伝子GFPの脳の種々の部分における、より高倍率での頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、100μmである。 IVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)の制御下の、並びに注射されていない対照の導入遺伝子GFPの脳の種々の部分における、より高倍率での頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、100μmである。 ICVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)並びに対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの中脳における体内分布を示す図である。左の列はGFP発現を示し、中央の列はTH+陽性細胞(ドーパミン作動性ニューロン)を示し、右の列は核染料DAPIと一緒に2つのオーバーレイを示す。スケールバーは、25μmである。 ICVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの中脳における体内分布を示す図である。左の列はGFP発現を示し、中央の列はTH+陽性細胞(ドーパミン作動性ニューロン)を示し、右の列は核染料DAPIと一緒に2つのオーバーレイを示す。スケールバーは、25μmである。 IVによって送達されたCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)の制御下の、並びに注射されていない対照の導入遺伝子GFPの中脳における体内分布を示す図である。左の列はGFP発現を示し、中央の列はTH+陽性細胞(ドーパミン作動性ニューロン)を示し、右の列は核染料DAPIと一緒に2つのオーバーレイを示す。スケールバーは、25μmである。 IVによって送達されたCNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)及びCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの中脳における体内分布を示す図である。左の列はGFP発現を示し、中央の列はTH+陽性細胞(ドーパミン作動性ニューロン)を示し、右の列は核染料DAPIと一緒に2つのオーバーレイを示す。スケールバーは、25μmである。 ICV又はIVによって送達されたCNS-1～8(配列番号1～4、23～26)及び対照プロモーターシナプシン1(配列番号14)の制御下の導入遺伝子GFPの種々の組織における体内分布を示す図である。このデータについて、全身の臓器から抽出されたRNAをRNAに変換し、qPCRによって定量化した。CNS-1～8(配列番号1～4、23～26)の種々のプロモーターが、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋又は脾臓においてオフターゲット発現を示した。 CNS 1～8(配列番号1～4、23～26)又はシナプシン-1(配列番号14)によって駆動されるGFPのICV又はIV送達後の種々の脳領域におけるGFP免疫反応性のパーセンテージを示す図である。データは、皮質、海馬、線条体、中脳及び小脳における閾値分析によるGFP染色強度の10の重複しないRGB画像の定量的測定によって得た(平均±SEM)。画像は、一定設定を維持しながら別個の脳領域全体で×40の倍率で撮った。前景の免疫染色は、最高と最低シグナルの平均化によって定義された。データは、目的の各領域のフィールドあたりの免疫反応性の平均面積パーセンテージとして表された(n=3)。ICV送達を用いた場合、発現は皮質及び海馬脳領域において最高である。CNS 1～8(配列番号1～4、23～26)は、hSyn1対照よりも海馬においてより高い発現を示す。CNS-1(配列番号1)は、ICV送達を用いたhSyn1と比較して、海馬、中脳及び小脳においてより高い発現を示す。 ICV送達におけるCNS-1(配列番号1)の制御下のGFPの発現を示す図である。倍率は、×40である。NeuNは、ニューロン核のマーカーである。GFAPは、星状細胞のマーカーであり、IBA1は、ミクログリアのマーカーである。CNS-1(配列番号1)プロモーターによって駆動されるGFP発現は、主にニューロンのものである。 ICV及びIVによって送達されたCNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの矢状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。スケールバーは、1mmである。 ICVによって送達されたCNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。左側では、スケールバーは、1mmである。右側では、脳の領域はより高倍率で示されている。スケールバーは、100μmである。 IVによって送達されたCNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターhSyn1の制御下の導入遺伝子GFPの冠状断面における頭蓋内体内分布を示す図である。左側では、スケールバーは、1mmである。右側では、脳の領域はより高倍率で示されている。スケールバーは、100μmである。 ICV(上部)及びIV(下部)によって送達されたCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの中脳における体内分布を示す図である。左の列はTH+陽性細胞(ドーパミン作動性ニューロン)を示し、中央の列はGFP発現を示し、右の列は、核染料DAPIと一緒に2つのオーバーレイを示す。スケールバーは、25μmである。 すべてのドーパミン作動性ニューロンのうちGFP発現を示すドーパミン作動性ニューロン(TH+GFP+細胞)のパーセンテージの定量化を示す図である。グラフの左側の部分は、ICV及びIV送達における対照プロモーターSyn-1の制御下でGFPを示すドーパミン作動性ニューロンのパーセンテージを示す。グラフの中央部分は、ICV及びIV送達において低用量が投与された場合(実施例1)の、CNS-8(配列番号26)の制御下でGFP発現を示すドーパミン作動性ニューロンのパーセンテージの定量化を示す。グラフの右側部分は、ICV及びIV送達において高用量が投与された場合(実施例2)の、CNS-8(配列番号26)の制御下でGFP発現を示すドーパミン作動性ニューロンのパーセンテージを示す。 低又は高用量が投与された場合のCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの種々の組織における体内分布の比較を示す図である。左側は、低用量が投与された場合の、CNS-8(配列番号26)の制御下のGFPの体内分布を示し、右側は、高用量が投与された場合の、CNS-8(配列番号26)の制御下のGFPの体内分布を示す。低用量が投与された場合の、CNS-8(配列番号26)の制御下のGFPの体内分布のデータは、図9に示されるデータと同一である。このデータについて、全身の臓器から抽出されたRNAをRNAに変換し、qPCRによって定量化した。 単細胞トランスクリプトームデータから得たマウスPNSニューロンにおけるfaf1遺伝子の発現パターンを示す図である(Zeiselら、2018)。暗灰色は、高発現を表し、白色は、発現がないことを表し、淡灰色は、低発現を表す。faf1は、多数のPNSニューロンにおいて発現される。 単細胞トランスクリプトームデータから得たPNSニューロンにおけるpitx3遺伝子の発現パターンを示す図である(Zeiselら、2018)。暗灰色は、高発現を表し、白色は、発現がないことを表し、淡灰色は、低発現を表す。pixt3は、交感神経PNSニューロンにおいて発現される。
CRE及びその機能的バリアント
CNS特異的プロモーターの構築において使用できる種々のCREが、本明細書において開示される。適宜、CREはCNS特異的である。これらのCREは、一般に、ゲノムプロモーター及びエンハンサー配列に由来するが、それらは、その天然ゲノム環境とは全く異なる状況で本明細書において使用される。一般に、CREは、それらが通常関連している遺伝子の発現を制御する、かなり大きなゲノム調節ドメインの小さい部分を構成する。驚くべきことに、これらのCREは、その多くが極めて小さく、その通常の環境から単離され、CNS特異的調節活性を保持できるということを見い出した。ゲノムの複雑な「三次元の」天然の状態からの調節配列の回収は、活性の著しい喪失をもたらすことが多く、そのため、所与のCREは、その天然環境からひとたび回収されると観察された活性のレベルを保持することを期待する理由はないので、これは驚くべきことである。CREが、AAVベクター中でCNS特異的活性を保持する場合には、更により驚くべきことである。これは特に、AAVベクターが逆方向末端反復配列(ITR)を含み、ゲノムと比較して異なるDNA構造を有し、ITRとDNA構造の両方がCREの活性に影響を及ぼすと知られているような場合である。
本発明のCREの配列を、活性の実質的な喪失を引き起こさずに変更できるということは注目すべきである。CREの機能的バリアントは、CREの活性に対して著しく有害である改変は避けられるという条件で、CREの配列を改変することによって調製できる。本開示において提供される情報を考慮して、機能的バリアントを提供するためのCREの改変は容易である。更に、本開示は、任意の所与のCREバリアントの機能性を簡単に評価するための方法論を提供する。
本発明に従うある特定のCREの相対的に小さいサイズは、それによって、CRE、より詳しくは、それを含有するプロモーターが、ベクターのペイロードの最小量しか占めずにベクター中に提供されることを可能となるので有利である。これは、CREが容量が制限されたベクター、例えば、AAVをベースとするベクターにおいて使用される場合には特に重要である。
本発明のCREは、ある特定のCNS特異的TFBSを含む。一般に、CREの機能的バリアントでは、これらのCNS特異的TFBSが機能性を保持することが望まれる。当業者は、TFBS配列は変わるが機能性を保持できることを十分に承知している。これを考慮して、TFBSの配列は、通常、ある程度の変動が通常存在するコンセンサス配列によって例示される。TFBSにおいて生じる変動についてのさらなる情報は、頻度を表す位置重み行列(PWM)を使用して例示でき、これを用いて所与のヌクレオチドは通常、コンセンサス配列中の所与の位置で見出される。TFコンセンサス配列の詳細及び関連する位置重み行列は、例えば、Jaspar又はTransfacデータベースhttp://jaspar.genereg.net/及びhttp://gene-regulation.com/pub/databases.html)に見出すことができる。この情報によって、CRE機能性を保持する、一部の場合には、増大さえする方法で、CREの任意の所与のTFBSにおいて当業者が配列を改変することが可能となる。これを考慮して、当業者は、所望のTFに結合する能力を維持しながら、任意の所与のTFについてTFBSを改変できる方法に関して十分なガイダンスを有する;Jasparシステムは、例えば、所与のPWMに対するその類似性に基づいて推定TFBSをスコア付けする。更に、CREをJASPARデータベースからのすべてのPWMに対してスキャンして、すべてのTFBSを同定/分析できる。当業者は、もちろん、文献で追加のガイダンスを見出すことができ、更に、日常的な実験法を使用して、任意のバリアントCREにおいて推定TFBSへのTF結合を確認できる。機能を保持しながらCREにおけるTFBS内でさえのCREにおける著しい配列改変を行うことができることが明らかであろう。
本発明のCREを、さまざまな適した最小プロモーター又はCNS特異的近位プロモーターと組み合わせて使用できる。
CREの機能的バリアントは、参照CREエレメントとは異なるが、CNS特異的CREとしての活性を実質的に保持する配列を含む。適したCNS特異的転写因子(TF)を動員し、それによって発現を増強するその能力を保持しながら、CREの配列を変えることが可能であるということは当業者には明らかであろう。CREの機能的バリアントは、CREを実質的に非機能性にしないという条件で、参照CREと比較して置換、欠失及び/又は挿入を含み得る。
一部の実施形態では、CREの機能的バリアントは、プロモーターにおいて参照CREの代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するCREと見なすことができる。例えば、所与のCREの機能的バリアントを含むCNS特異的プロモーターは、好ましくは、その活性の少なくとも80%、より好ましくは、その活性の少なくとも90%、より好ましくは、その活性の少なくとも95%、更により好ましくは、その活性の100%を保持する(未改変CREを含む参照プロモーターと比較して)。
適宜、CREの機能的バリアントは、参照CREに対して著しいレベルの配列同一性を保持する。適宜、機能的バリアントは、参照CREに対して少なくとも70%同一である、より好ましくは、参照CREに対して少なくとも80%、90%、95%又は99%同一である配列を含む。
活性の保持は、参照プロモーターの制御下の適したリポーターの発現を、同等の条件下で置換されたCREを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって評価できる。CNS特異的プロモーター活性を評価するための適したアッセイは、本明細書に、例えば、実施例において開示されている。
一部の実施形態では、CREを1つ又は複数の追加のCREと組み合わせて、シス調節モジュール(CRM)を作出することができる。追加のCREは、本発明に従うCREの上流に、又は本発明に従う下流に提供され得る。追加のCREは、本明細書において開示されるCREであり得る、又はそれらは他のCREであり得る。適宜、追加のCREはCNS特異的である。
本発明に従うCRE又は本発明に従うCREを含むCRMは、1つ又は複数の追加の調節エレメントを含み得る。例えば、それらは、誘導可能又は抑制可能エレメント、境界制御エレメント、インスレーター、遺伝子座制御領域、応答エレメント、結合部位、末端リピートのセグメント、応答部位、安定化エレメント、不安定化エレメント及びスプライシングエレメント等を、それらがCRE又はCRMを実質的に非機能性にしないという条件で含み得る。
本発明に従うCREを含むことは、CRMと最小又は近位プロモーターの間及び/又はCREの間にスペーサーを含み得る。更に、又は或いは、スペーサーは、CRMの5'末端に存在し得る。
本発明に従う合成CNS特異的プロモーターを提供するために、本発明に従うCRE又は本発明に従うCREを含むCRM又はその機能的バリアントを、任意の適したプロモーターエレメントと組み合わせることができるということは明らかであろう。適宜、プロモーターエレメントは、CNS特異的近位プロモーターである。
多くの例では、特に、ベクター(例えば、AAV等のウイルスベクター)が制限された容量を有する状況において使用するためには、より短いプロモーター配列が好ましい。したがって、一部の実施形態では、配列番号9～11、28～31又はそれらの機能的バリアントに従うCREのうち少なくとも1つを含む合成CNS特異的CRMは、1000又はそれより少ないヌクレオチド、例えば、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50又はそれより少ないヌクレオチドの長さを有する。
合成CNS特異的プロモーター及びその機能的バリアント
種々の合成CNS特異的プロモーターが本明細書において開示されている。参照合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントとは、参照合成CNS特異的プロモーターとは異なるが、CNS特異的プロモーター活性を実質的に保持するプロモーターである。合成CNS特異的プロモーターの配列は、適したCNS特異的転写因子(TF)を動員し、RNAポリメラーゼIIを動員して、作動可能に連結された配列(例えば、オープンリーディングフレーム)のCNS特異的発現を提供する能力を保持しながら変わることが可能であるということは当業者には理解されるであろう。合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照プロモーターと比較して置換、欠失及び/又は挿入を、このような置換、欠失及び/又は挿入が、合成CNS特異的プロモーターを参照プロモーターと比較して実質的に非機能性にしないという条件で含み得る。
したがって、一部の実施形態では、合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照プロモーターのCNS特異的プロモーター活性を実質的に保持するバリアントとして見なすことができる。例えば、合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、好ましくは、参照プロモーターの活性の少なくとも70%、より好ましくは、その活性の少なくとも80%、より好ましくは、その活性の少なくとも90%、より好ましくは、その活性の少なくとも95%、更により好ましくは、その活性の100%を保持する。
合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーターに対して著しいレベルの配列類似性を保持することが多い。一部の実施形態では、機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーターに対して少なくとも70%同一である、より好ましくは、参照合成CNS特異的プロモーターに対して少なくとも80%、90%、95%又は99%同一である配列を含む。
機能的バリアントにおける活性は、参照合成CNS特異的プロモーターの制御下の適したリポーターの発現を、同等の条件下で推定機能的バリアントと比較することによって評価できる。CNS特異的プロモーター活性を評価するための適したアッセイは、本明細書に、例えば、実施例において開示されている。
所与の合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーター中に存在するCREの機能的バリアントを含み得る。所与の合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーター中に存在するCREの機能的バリアントを含み得る。所与の合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーターと比較した場合に、プロモーターエレメントの機能的バリアント又は異なるプロモーターエレメントを含み得る。
所与の合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、参照合成CNS特異的プロモーター中に存在するものに対して1つ又は複数の追加のCREを含み得る。追加のCREは、例えば、参照合成CNS特異的プロモーター中に存在するCREの上流に、又は参照合成CNS特異的プロモーター中に存在するCREの下流に提供され得る。追加のCREは、本明細書において開示されるCREであり得る、又はそれらは他のCREであり得る。
所与の合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントは、隣接するエレメント(CRE、CRM又はプロモーターエレメント)の間に追加のスペーサーを含み得る、又は1つ若しくは複数のスペーサーが参照合成CNS特異的プロモーター中に存在する場合には、前記の1つ若しくは複数のスペーサーは、参照合成CNS特異的プロモーターにおいてよりも長い場合も短い場合もある。
本発明の合成CNS特異的プロモーターは、本発明のCRE又は本発明のCREを含むCRM及び追加の調節配列を含み得るということは明らかとなろう。例えば、それらは、1つ又は複数の追加のCRE、誘導可能又は抑制可能エレメント、境界制御エレメント、インスレーター、遺伝子座制御領域、応答エレメント、結合部位、末端リピートのセグメント、応答部位、安定化エレメント、不安定化エレメント及びスプライシングエレメント等を、それらがプロモーターを実質的に非機能性にしないという条件で含み得る。
一部の実施形態では、上記のようなCNS特異的プロモーターは、1つ又は複数の追加の調節配列に作動可能に連結される。追加の調節配列は、例えば、追加の調節配列に作動可能に連結されていないCNS特異的プロモーターと比較して発現を増強できる。一般に、追加の調節配列が、CNS特異的プロモーターの特異性を実質的に低減しないことが好ましい。
例えば、本発明に従うCNS特異的プロモーターは、UTR(例えば、5'及び/又は3'UTR)及び/又はイントロン又はそのようなものをコードする配列に作動可能に連結され得る。
一部の実施形態では、CNS特異的プロモーターは、UTR、例えば、5'UTRをコードする配列に作動可能に連結される。5'UTRは、遺伝子発現を調節できる種々のエレメントを含有し得る。天然遺伝子中の5'UTRは、転写開始部位で始まり、コーディング領域の開始コドンの1ヌクレオチド前で終わる。本明細書において言及されるような5'UTRは、天然に存在する5'UTR全体である場合も、天然に存在する5'UTRの一部分である場合もあるということは注目すべきである。5'UTRはまた、部分的又は全体的に合成である場合もある。真核生物では、5'UTRは、およそ150ヌクレオチドの中央値の長さを有するが、場合によっては、かなり長い場合もある。5'UTR中に見出すことができる調節配列として、それだけには限らないが:
- mRNAの安定性又は翻訳に影響を及ぼす可能性がある、タンパク質の結合部位、
- リボスイッチ、
- 翻訳開始を促進又は阻害する配列、及び
- 遺伝子発現の調節及びmRNA核外輸送と関連している5'UTR内のイントロン
が挙げられる。
調節配列が、5'UTR及びイントロンの両方を含む場合には、5'UTR及びイントロンと呼ばれることがある。
一部の実施形態では、上記のような合成CNS特異的プロモーターは、5'UTR及びイントロンをコードする配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、5'UTR及びイントロンは、CMV主要即時遺伝子(CMV-IE遺伝子)に由来する。例えば、CMV-IE遺伝子由来の5'UTR及びイントロンは、適宜、CMV-IE遺伝子エクソン1及びCMV-IE遺伝子エクソン1又はその部分を含む。
一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、5'UTRへの連結を考慮して改変できる、例えば、プロモーターエレメント中の転写開始部位(TSS)の下流の配列を取り除く(例えば、5'UTRと置き換える)ことができる。
CMV-IE 5'UTR及びイントロンは、参照により本明細書に組み込まれる、Simariら、Molecular Medicine 4: 700～706頁、1998 「Requirements for Enhanced Transgene Expression by Untranslated Sequences from the Human Cytomegalovirus Immediate-Early Gene」に記載されている。Simariらにおいて論じられたCMV-IE 5'UTR及びイントロン配列のバリアントはまた、参照により組み込まれるWO2002/031137においても記載され、そこで開示された調節配列も使用できる。
プロモーターと組み合わせて使用できる他の調節エレメント、例えば、他のUTRは、当技術分野で、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Leppek, K.、Das, R. & Barna, M.「Functional 5'UTR mRNA structures in eukaryotic translation regulation and how to find them」 Nat Rev Mol Cell Biol 19、158～174頁(2018)において公知である。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるCNS特異的プロモーター又はそのバリアントのいずれか1つは、5'UTR及び/又は5'UTR及びイントロンをコードする配列に連結される。
一部の実施形態では、5'UTR及びイントロンをコードする配列は、配列番号27又はその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を有する場合がある。配列番号27は、CMV-IE 5'UTR及びイントロンをコードする。
Figure 2023525476000002
一部の実施形態では、CNS特異的プロモーターCNS-1(配列番号1)は、CMV-IE 5'UTR及びイントロン(配列番号27)に作動可能に連結されて、配列番号21を提供する。
一部の実施形態では、CNS特異的プロモーターCNS-4(配列番号4)は、CMV-IE 5'UTR及びイントロン(配列番号27)に作動可能に連結されて、配列番号22を提供する。
一部の実施形態では、CNS特異的プロモーターCNS-2、CNS-3、CNS-5、CNS-5_v2、CNS-6、CNS-6_v2、CNS-7、CNS-7_v2、CNS-8、CNS-8_v2のいずれも、CMV-IE 5'UTR及びイントロン(配列番号27)に作動可能に連結される。
本発明の好ましい合成CNS特異的プロモーターは、CNS細胞においてシナプシン-1、Camk2a又はNSEプロモーターによって示される活性の少なくとも15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%又は400%であるCNS特異的プロモーター活性を示す。多くの場合、より高いレベルのプロモーター活性が好ましいが、これは常に当てはまるわけではなく、したがって、一部の場合には、より中程度のレベルの発現が好ましいこともある。一部の場合には、発現のレベルを必要条件に合わせることを可能にするために、異なる活性レベルのさまざまなプロモーターを利用可能にすることが望ましく、本開示は、このようなさまざまな活性を有するプロモーターを提供する。Syn-1と比較される本発明の所与の合成CNS特異的プロモーターの活性は、2つのプロモーターが、そうでなければ同等の発現構築物で、及び同等の条件下で提供される場合に、合成CNS特異的プロモーターの制御下のリポーター遺伝子のCNS特異的発現を、Syn-1プロモーターの制御下の同一リポーターの発現と比較することによって評価できる。
異なる活性レベルに加えて、一部の場合には、脳の異なる領域において活性を有するさまざまなプロモーターを利用可能にすることが望ましい。したがって、発現のレベルを必要条件に合わせることを可能にするために、脳の異なる領域全体で異なる活性レベルを有するさまざまなプロモーターを有することが望ましい場合があり、本開示は、このようなさまざまな活性を有するプロモーターを提供する。一部の場合には、脳の特定の領域における発現が望まれる。一部の実施形態では、脳の特定の領域における発現が望まれ、脳の残りの部分では発現がほとんどないか、全くない。これは、例えば、中脳において発現が望まれるドーパミン輸送体欠乏症候群等の疾患の治療において当てはまる場合がある。一部の好ましい実施形態では、本発明に従うCNS特異的プロモーターは、中脳において活性を示す。一部の好ましい実施形態では、本発明に従うCNS特異的プロモーターは、中脳において活性を示し、脳の他の領域では活性はほとんどないか、全くない。一部の好ましい実施形態では、本発明に従うCNS特異的プロモーターは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて活性を示す。一部の実施形態では、本発明に従うCNS特異的プロモーターは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて活性を示し、他のCNS細胞種又はCNSサブタイプでは発現はほとんどないか、全くない。本発明の好ましい合成CNS特異的プロモーターは、ドーパミン作動性ニューロンにおいてチロシンヒドロキシラーゼによって示される活性の少なくとも15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%又は400%であるドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター活性を示す。チロシンキナーゼに対して比較される本発明の所与の合成CNS特異的プロモーターの活性は、2つのプロモーターが、そうでなければ同等の発現構築物で、及び同等の条件下で提供される場合に、合成CNS特異的プロモーターの制御下のリポーター遺伝子のドーパミン作動性ニューロン特異的発現を、ドーパミン作動性ニューロンにおけるチロシンヒドロキシラーゼプロモーターの制御下の同一リポーターの発現と比較することによって評価できる。一部の実施形態では、本発明の合成CNS特異的プロモーターは、対象のドーパミン作動性ニューロンにおける遺伝子(例えば、治療用遺伝子又は目的の遺伝子)の発現を、既知ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、適宜、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターに対して少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、少なくとも1000%又はそれより多く増大可能である。
或いは、脳のすべて又はほとんどすべての領域において広範な発現を有することが好ましい場合がある。これは、例えば、脳全体の広範な発現が必要であるアンジェルマン症候群等の疾患の治療において当てはまる場合がある。
一部の実施形態では、本発明の合成CNS特異的プロモーターは、対象のCNSにおける、又はCNS細胞における遺伝子(例えば、治療用遺伝子又は目的の遺伝子)の発現を、既知CNS特異的プロモーター、適宜、Syn1、Camk2a又はNSEプロモーターに対して少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、少なくとも1000%又はそれより多く増大可能である。
本発明の好ましい合成CNS特異的プロモーターは、CMV-IEと比較して50%以下である、好ましくは、CMV-IEの25%以下、より好ましくは、CMV-IEの10%以下、一部の場合には、CMV-IEの5%以下又はCMV-IEの1%以下の非CNS細胞(例えば、Huh7及びHEK293細胞)における活性を示す。
多くの例では、特に、ベクター(例えば、AAV等のウイルスベクター)が制限された容量を有する状況において使用するためには、より短いプロモーター配列が好ましい。したがって、一部の実施形態では、合成CNS特異的プロモーターは、1000又はそれより少ないヌクレオチド、例えば、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100又はそれより少ないヌクレオチドの長さを有する。
特に好ましい合成CNS特異的プロモーターは、短く、高レベルの活性を示す両方のものである。
AAVベクターのITR及びゲノムと比較して異なるDNA構造は、プロモーターの活性に影響を及ぼすと知られており、しばしば、ITR及び異なるDNA構造は、プロモーターの活性に負の影響を及ぼすので、CNS特異的プロモーターがAAVベクターにおいてCNS特異的活性を保持するとは驚くべきことである。
合成CNS特異的発現カセット
本発明はまた、発現産物、適宜、遺伝子(例えば、導入遺伝子)をコードする配列に作動可能に連結した本発明の合成CNS特異的プロモーターを含む合成CNS特異的発現カセットを提供する。
遺伝子がタンパク質をコードする場合には、本質的に任意のタイプのタンパク質である可能性がある。限定されない例として、タンパク質は、酵素、抗体又は抗体断片(例えば、モノクローナル抗体)、ウイルスタンパク質(例えば、REP-CAP、REV、VSV-G又はRD114)、治療用タンパク質又は毒性タンパク質(例えば、カスパーゼ3、8又は9)であり得る。
本発明の一部の好ましい実施形態では、遺伝子は、任意選択で、CNSにおける異常な遺伝子発現と関連する疾患又は状態の治療において使用するのに適した治療用発現産物、好ましくは、治療用ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、治療用発現産物には、CNS疾患の治療において有用であるものが含まれる。「CNS疾患」という用語は、原則として、当業者によって理解される。この用語は、CNSへの、特に、CNS細胞への活性化合物の投与による治療及び/又は予防に適している疾患に関する。一部の実施形態では、CNS疾患は、神経疾患及び/又は障害である。
限定されない例として、CNS疾患は、透明中隔欠損、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠陥・多動性障害(ADHD)、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティーエール症候群障害、AIDS-神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質抗体症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張症性運動失調症、運動失調及び小脳又は脊髄小脳変性症、心房細動及び脳卒中、注意欠陥・多動性障害、自閉症スペクトラム障害、自律神経障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型筋強直症、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルンハルト・ロート症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、分娩時腕神経叢損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー・エッグルストン症候群、脳及び脊椎腫瘍、脳動脈瘤、脳損傷、ブラウン・セカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症(CADASIL)、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、カベルノーマ、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、中心性脊髄症候群、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭蓋障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮、脳性脚気、脳海綿状血管奇形(Cerebral Cavemous Malformation)、脳性巨人症、低酸素性脳症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群(COFS)、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、コレステロールエステル蓄積症、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIDP)、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群II型、コフィン・ローリー症候群、コルポセファリー、昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性海綿状血管奇形、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ・ダンシングフィート症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジュリン・クルンプケ麻痺、認知症、多発脳梗塞性認知症、意味性認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、歯状核小脳運動失調症、歯状赤核萎縮、皮膚筋炎、発達性失行、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経異常、書字障害、失読症、嚥下障害、統合運動障害、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳症、脳症(家族性新生児)、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、てんかん性片麻痺、エルブ型麻痺、エルブ・デュシェンヌ及びデジュリン・クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性異形成、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺(Hemiplegia Alterans)、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹、耳帯状疱疹、平山症候群、ホームズ・アディー症候群、全前脳胞症、HTLV-1関連ミエロパチー、ヒューズ症候群、ハンチントン病、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質ホルモン過剰症、過眠、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、小児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパチー、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群(KTS)、クリューバー・ビューシー症候群(Kliiver-Bucy Syndrome)、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レビン・クリチリー症候群、レビー小体型認知症、脂質蓄積症、リポイドタンパク症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス-神経学的後遺症、ライム病-神経学的合併症、マチャド・ジョセフ病、大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎及び脳炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、びまん性骨髄破壊性硬化症、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、筋強直症、先天性筋強直症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経線維腫症、神経遮断薬悪性症候群、AIDSの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的転帰、ポンペ病の神経症状、ループスの神経学的後遺症、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、遺伝性ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧、過用症候群、慢性疼痛、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、異常知覚、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンバーグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカー症候群II型、神経根嚢胞、周期性麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、偽トーチ症候群、偽性トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイ・ハント症候群I型、ラムゼイ・ハント症候群II型、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経ジストロフィー症候群、レフサム病、乳児型レフサム病、反復動作障害、反復性ストレイン損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢腫、聖ヴィトゥス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニーてんかん(SMEI)、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙攣、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短時間持続性片側神経痛様(SUNCT)頭痛、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、タルロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン筋強直症、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性遺伝性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管性勃起性腫瘍、中枢及び抹消神経系の血管炎症候群、フォン・エコノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病(VHL)、フォン・レックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、X連鎖性球脊髄性筋萎縮症から選択され得る。
一部の実施形態では、CNS疾患は、ドーパミン輸送体欠乏症候群、注意欠陥/多動性障害(ADHD)、双極性障害、てんかん、多発性硬化症、タウオパチー、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、クラッベ病、副腎白質ジストロフィー、運動ニューロン疾患、脳性麻痺、バッテン疾患、ゴーシェ病、テイ・サックス病、レット症候群、サンドホフ病、シャルコー・マリー・トゥース病、アンジェルマン症候群、カナバン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ムコ多糖症IIIA、ムコ多糖症IIIB、異染性白質ジストロフィー、遺伝性リソソーム蓄積症、例えば、ニーマン・ピック病C1型及び/又は神経セロイドリポフスチン症、例えば、バッテン病、進行性核上性麻痺、皮質基底核症候群及び脳がん(星状細胞腫及び神経膠芽腫を含む)からなるリストから選択される。
上記の状態を治療するのに適した種々の発現産物は、当技術分野で記載されている。適宜、本発明に従うCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターに作動可能に連結した発現産物をコードする核酸は、NPC1、EAAT2、NPY、CYP46A1、GLB1、APOE(例えば、ApoE2、ApoE3又はApoE4)、HEX、CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6、SUMF1、DCTN1、PRPH、SOD1、NEFH、GBA、IDUA、NAGLU、GUSB、ARSA、MANB、AADC、GDNF、NTN、ASP、MECP2、PTCHD1、GJB1、UBE3A、HEXA、MOからなる群から選択される遺伝子のうち1つであり得る。更に、又は或いは、本発明に従うCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターに作動可能に連結した発現産物は、疾患対立遺伝子に向けられたmiRNA/CRISPR Cas9であり得る。
CYP46A1は、コレステロール分解の律速酵素であり、複数のCNS疾患において有益な役割を果たすとわかっている。CYP46A1阻害は、参照により本明細書に組み込まれる(Djeltiら、2015)に記載されるように、ウイルスコレステロールの量の増大によってアルツハイマー病の誘導及び/又は増悪に寄与する可能性がある。CYP46A1はまた、参照により本明細書に組み込まれる(Boussicaultら、2016)に記載されるように、ハンチントン舞踏病において神経保護的であるとわかっている。したがって、CYP46A1遺伝子は、発現産物をコードする特に好ましい核酸である。一部の好ましい実施形態では、CYP46A1遺伝子は、本発明に従うCRE、最小/近位プロモーター又はプロモーターに作動可能に連結される。適宜、CYP46A1遺伝子は、CNSのすべての領域において活性である(汎CNS)合成プロモーター又は上記で列挙された脳の領域のうち5、6、7、8若しくは9よりも多くで活性であるプロモーターに作動可能に連結される。CNSのすべての領域又は上記で列挙された脳の領域のうち5、6、7、8若しくは9よりも多くにおけるCYP45A1の発現は、遍在性プロモーターCMV又はCAGによるCYP46A1発現はマウスハンチントン舞踏病モデルにおいて有益であるとわかった(Kacherら、2019)ので有益である可能性がある。適宜、CYP46A1遺伝子は、配列番号1、配列番号21又は配列番号2からなる、又は含む合成プロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、有用な発現産物として、ジストロフィン(マイクロ-ジストロフィンを含む)、ベータ1,4-n-アセチルガラクトサミンガラクトシルトランスフェラーゼ(GALGT2)、カルバモイルシンセターゼI、アルファ-1アンチトリプシン、オルニチンvトランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンベータ-シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼグルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、H-タンパク質、T-タンパク質及び嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)が挙げられる。
更に他の有用な発現産物として、酵素補充療法において有用な酵素が挙げられ、これは酵素の活性の欠乏に起因するさまざまな状態において有用である。例えば、マンノース-6リン酸を含有する酵素は、リソソーム蓄積症の療法において利用できる(例えば、適した遺伝子には、β-グルクロニダーゼ(GUSB)をコードするものが含まれる)。
一部の実施形態では、例示的ポリペプチド発現産物として、神経保護ポリペプチド及び抗血管新生ポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドとして、それだけには限らないが、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)、ナーチュリン(nurturin)、繊毛様神経栄養因子(CNTF)、神経成長因子(NGF;例えば、神経成長因子-ベータ)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-4)、ニューロトロフィン-6(NT-6)、上皮成長因子(EGF)、色素上皮由来因子(PEDF)、Wntポリペプチド、可溶性Fit-1、アンギオスタチン、エンドスタチン、VEGF、抗VEGF抗体、可溶性VEGFR、第VIII因子(FVIII)、第IX因子(FIX)及びヘッジホッグファミリーのメンバー(ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ及びデザートヘッジホッグ等)が挙げられる。
一部の実施形態では、有用な治療用発現産物として、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン増殖因子I及びII(IGF-I及びIGF-II)、TGFa、アクチビン、インヒビン又は骨形成タンパク質(BMP)のいずれかBMP1～15を含むトランスフォーミング増殖因子アルファスーパーファミリーのいずれか1つ、ヘレグリン(heregluin)/ニューレグリン/ARIA/増殖因子のNeu分化因子(NDF)ファミリーのいずれか1つ、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT-3及びNT-4/5、繊毛様神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン/コラプシンのファミリーのいずれか1つ、ネトリン-1及びネトリン-2、肝細胞増殖因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモン並びに成長及び分化因子が挙げられるが、これに限定されない。
一部の実施形態では、有用な発現産物として、サイトカイン及びリンホカイン、例えば、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL)IL-1からIL-25(IL-2、IL-4、IL-12及びIL-18を含む)、単球化学誘引物質タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、インターフェロン(アルファ、ベータ及びガンマ)、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンドを含む免疫系を調節するタンパク質が挙げられるが、それに限定されない。免疫系によって生成された遺伝子産物も本発明において有用である。これらとして、免疫グロブリンIgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスII MHC分子並びに操作された免疫グロブリン及びMHC分子が挙げられるが、それに限定されない。有用な遺伝子産物としてまた、補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、補体調節タンパク質(MCP)、崩壊促進因子(DAF)、CR1、CF2及びCD59が挙げられる。
一部の実施形態では、有用な発現産物として、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質の受容体のいずれか1つが挙げられる。有用な異種核酸配列としてまた、コレステロール調節及び/又は脂質調節の受容体が挙げられ、低比重リポタンパク質(LDL)受容体、高比重リポタンパク質(HDL)受容体、極低比重リポタンパク質(VLDL)受容体及びスカベンジャー受容体が含まれる。本発明はまた、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンD受容体及び他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー等の遺伝子産物の使用を包含する。更に、有用な遺伝子産物として、jun、fos、max、mad、血清応答因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MyoD及びミオゲニン、ETS-ボックス含有タンパク質、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子(IRF-1)、ウィルムス腫瘍タンパク質、ETS-結合タンパク質、STAT、GATA-ボックス結合タンパク質、例えば、GATA-3及びウィングヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリー等の転写因子が挙げられる。
一部の実施形態では、有用な発現産物として、天然に存在しないポリペプチド、例えば、挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドが挙げられる。
更に適した発現産物として、マイクロRNA(miRNA)、干渉RNA、アンチセンスRNA、リボザイム及びアプタマーが挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、合成CNS特異的発現カセットは、遺伝子編集にとって有用な遺伝子、例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ(TALEN)をコードする遺伝子又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートシステム(clustered regularly interspaced short palindromic repeats system)(CRISPR-Cas)を含む。適宜、部位特異的ヌクレアーゼは、切断(通常、部位特異的二重鎖切断)を行い、次いで、これを非相同末端結合(NHEJ)又は相同性依存性修復(HDR)を介して修復し、結果として、所望の編集を得ることによって所望の標的ゲノム遺伝子座を編集するように適応している。編集は、機能障害性又は機能的遺伝子のノックダウン若しくはノックアウトである遺伝子の部分的又は完全修復である場合がある。或いは、編集は、当技術分野で公知の適したシステムを使用する塩基編集又はプライム編集を介してであり得る。
適宜、合成CNS特異的発現カセットは、リボソーム結合部位、開始コドン、停止コドン及び転写終結配列のうち1つ又は複数の、及び好ましくは、すべてを提供する又はコードする配列を含む。適宜、発現カセットは、転写後調節エレメントをコードする核酸を含む。適宜、発現カセットは、ポリAエレメントをコードする核酸を含む。
ベクター及びウイルス粒子
本発明は、本発明に従う合成CNS特異的プロモーター又は発現カセットを含むベクターを更に提供する。
本発明の一部の実施形態では、ベクターはプラスミドである。このようなプラスミドは、さまざまな他の機能的核酸配列、例えば、1つ又は複数の選択マーカー、1つ又は複数の複製の起点、多重クローニング部位等を含み得る。本発明の一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
本発明の一部の実施形態では、ベクターは、真核細胞における発現のための発現ベクターである。真核細胞の発現ベクターの例として、それだけには限らないが、Stratageneから入手可能であるpW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl及びpSG;Amersham Pharmacia Biotechから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG及びpSVL;並びにClontechから入手可能なpCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFPが挙げられる。多数の他のベクターが周知であり、市販されている。哺乳動物細胞アデノウイルスベクターについては、pSV及びpCMVシリーズのベクターが特によく知られている限定されない例である。酵母統合プラスミド(YIp)及び酵母複製プラスミド(YRp)を含む多数のよく知られている酵母発現ベクターがあるが、これに限定されない。植物のためには、アグロバクテリウムのTiプラスミドが例示的発現ベクターであり、植物ウイルスも、適した発現ベクターを提供する、例えば、タバコモザイクウイルス(TMV)、ジャガイモウイルスX及びササゲモザイクウイルス。
一部の好ましい実施形態では、ベクターは、遺伝子療法ベクターである。種々の遺伝子療法ベクターは、当技術分野で公知であり、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを言及できる。ベクターが遺伝子療法ベクターである場合には、ベクターは好ましくは、治療用産物、適宜、治療用タンパク質をコードする、本発明の合成CNS特異的プロモーターに作動可能に連結した核酸配列を含む。治療用タンパク質は、分泌可能タンパク質であり得る。分泌可能タンパク質の限定されない例は、上記で論じられており、例示的分泌可能治療用タンパク質として、凝固因子、例えば、第VIII因子又は第IX因子、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体又はナノボディ、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子、毒性タンパク質等が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。一部の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、適宜、HIV-1に基づくレンチウイルスベクターである。一部の好ましい実施形態では、ベクターは、AAVベクターである。一部の好ましい実施形態では、AAVは、CNS形質導入に適した、又は具体的に最適化された血清型を有する。一部の実施形態では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVDJ8及びAAV2g9又はそれらの誘導体からなる群から選択される。
AAVベクターは、好ましくは、AAV形質導入における制限ステップの1つ(すなわち、一本鎖から二本鎖AAVへの変換)を克服するために、自己相補的、二本鎖AAVベクター(scAAV)として使用されるが、一本鎖AAVベクター(ssAAV)の使用も本明細書において包含される。本発明の一部の実施形態では、AAVベクターはキメラであり、これは、少なくとも2つのAAV血清型、例えば、AAV2のITR及びAAV5のカプシドタンパク質に由来する成分を含むことを意味する。AAV9は、CNS細胞に効率的に、及び組織に特に効率的に形質導入することが知られており、したがって、AAV9及びその誘導体は、CNS細胞及び組織を標的化するために特に興味深い。AAV2g9は、CNS細胞に効率的に、及び組織に特に効率的に形質導入することが知られており、したがって、AAV2g9及びその誘導体は、CNS細胞及び組織を標的化するために特に興味深い。AAVrh10は、CNS細胞に効率的に、及び組織に特に効率的に形質導入することが知られており、したがって、AAVrh10及びその誘導体は、CNS細胞及び組織を標的化するために特に興味深い。AAVrh10の全身又は静脈内送達は、参照により本明細書に組み込まれる(Tanguyら、2015)に記載されるように、中枢神経系において高い導入遺伝子発現を提供するとわかっているので、AAVrh10は特に好ましい。AAVDJ8は、CNS細胞に効率的に、及び組織に特に効率的に形質導入することが知られており、したがって、AAVDJ8及びその誘導体は、CNS細胞及び組織を標的化するために特に興味深い。AAVDJ8は、参照により本明細書に組み込まれる(Hammondら、2017)に記載されるように、脳の複数の領域を効率的に標的とする、及び星状細胞を効率的に標的とすることが示されているので好ましい。AAV1、AAV2、AAV4、AAV5及びAAV8はまた、CNS細胞及び組織を標的とすると知られており、したがって、これらのAAV血清型及びその誘導体はまた、CNS細胞及び組織を標的化するために特に興味深い。
本発明は更に、上記のようなベクターを含む組換えビリオン(ウイルス粒子)を提供する。
医薬組成物
本発明のベクター又はビリオンを、薬学的に許容される賦形剤、すなわち、1つ又は複数の薬学的に許容される担体物質及び/又は添加剤、例えば、バッファー、担体、賦形剤、安定化剤等を用いて医薬組成物に製剤化できる。医薬組成物はキットの形態で提供される場合がある。AAVベクター又は及びその方法及び使用にとって適切な医薬組成物及び送達システムは、当技術分野で公知である。
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書において記載されるようなベクター又はビリオンを含む医薬組成物を提供する。
本開示に従う医薬組成物中の有効成分(例えば、AAVベクター粒子)、薬学的に許容される賦形剤及び/又は任意の追加の成分の相対量は、治療されている対象の同一性、大きさ及び/又は状態に応じて、更に組成物が投与されるべき経路に応じて変わる場合がある。例えば、組成物は、0.1パーセントから99パーセント(w/w)の間の有効成分を含み得る。例として、組成物は、0.1パーセントから100パーセントの間、例えば、5から50パーセントの間、1～30パーセントの間、5～80パーセントの間、少なくとも80パーセント(w/w)の有効成分を含み得る。
医薬組成物は、(1)安定性を増大する、(2)細胞トランスフェクション又は形質導入を増大する、(3)ペイロードの持続放出又は遅延放出を可能にする、(4)体内分布を変更する(例えば、特定の組織又は細胞種へウイルス粒子を標的化する)、(5)コードされたタンパク質の翻訳を増大する、(6)コードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する、及び/又は(7)本発明のペイロードの調節可能な発現を可能するように1つ又は複数の賦形剤又は希釈剤を使用して製剤化できる。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95パーセント、少なくとも96パーセント、少なくとも97パーセント、少なくとも98パーセント、少なくとも99パーセント又は100パーセント純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒト用及び獣医用の使用が承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認される場合がある。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品等級のものであり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方(USP)、欧州薬局方(EP)、英国薬局方及び/又は国際薬局方の基準を満たす場合がある。賦形剤には、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、所望の特定の投与形に適したような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存料等が含まれる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤及び組成物を調製するための技術は、当技術分野で公知である(参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro、Lippincott、Williams and Wilkins、Baltimore、MD、2006を参照されたい)。従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内で企図され得るが、任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果をもたらすことによって、又はそうではなく有害な方法で医薬組成物の任意の他の成分と相互作用すること等によって、物質又はその誘導体と不適合である可能性がある場合を除く。
治療薬及び他の方法及び使用
本発明はまた、疾患、好ましくは、任意選択で、CNSにおける異常な遺伝子発現と関連する疾患(例えば、遺伝性CNS疾患)の治療において使用するための、本発明の種々の態様に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物を提供する。関連状態、疾患及び治療用発現産物は、上記で論じられている。
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明の種々の態様に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオンを提供する。
本発明はまた、本明細書において記載される任意の状態又は疾患の治療のための医薬組成物の製造において使用するための、本発明の種々の態様に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオンを提供する。
本発明は、本発明の種々の態様に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター、ビリオンを含む細胞を更に提供する。適宜、細胞は真核細胞である。真核細胞は、適宜、動物の(後生動物の)細胞(例えば、哺乳動物細胞)であり得る。適宜、細胞はヒト細胞である。
本発明の一部の実施形態では、細胞は、ex vivo、例えば、細胞培養中である。本発明の他の実施形態では、細胞は、組織又は多細胞生物の一部であり得る。
好ましい実施形態では、細胞は、CNS細胞であり、これは、ex vivoである場合も、in vivoである場合もある。CNS細胞は、一次ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞、小グリア細胞又は上衣細胞であり得る。或いは、CNS細胞は、CNS由来細胞株、例えば、不死化細胞株であり得る。
細胞は、CNS組織環境内(例えば、動物のCNS内)に存在する場合も、CNS組織から単離されている場合もあり、例えば、細胞培養中である場合もある。適宜、一次細胞又は細胞株は、ヒト細胞である。
本発明に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット又はベクターは、細胞のゲノム中に挿入できる、又はエピソーム性であり得る(例えば、エピソームベクター中に存在する)。
さらなる態様では、本発明は、発現産物を生成する方法であって、細胞、好ましくは、CNS細胞において本発明に従う(好ましくは、上記のようなベクター中の)合成CNS特異的発現カセットを提供すること、及び合成CNS特異的発現カセット中に存在する遺伝子を発現させることを含む方法を提供する。方法は、適宜、前記CNS細胞を遺伝子の発現のために適した条件下で維持することを含む。培養では、これは、細胞又は細胞を含む組織を適した培養条件下でインキュベートすることを含み得る。発現は、もちろん、in vivoで、例えば、対象のCNS中の1つ又は複数の細胞においてであり得る。
適宜、方法は、合成CNS特異的発現カセットをCNS細胞中に導入するステップを含む。CNS細胞をトランスフェクトする広範な方法は、当技術分野で周知である。CNS細胞をトランスフェクトする好ましい方法は、細胞に合成CNS特異的発現カセットを含むウイルスベクター、例えば、AAVベクターを形質導入することである。
本発明の種々の態様に従う合成CNS特異的プロモーター、発現カセット、ベクター又はビリオンを、遺伝子療法のために使用できるということは当業者には明らかであろう。したがって、遺伝子療法におけるこのような核酸構築物の使用は、本発明の一部を形成する。
本発明はしたがって、一部の実施形態では、対象において遺伝子療法、好ましくは、治療用遺伝子のCNS特異的発現による遺伝子療法における使用のために本発明に従う発現カセット、ベクター又はビリオンを提供する。療法は、CNS細胞からの治療用産物の分泌による疾患、適宜、上記で論じられたようなCNSにおける異常な遺伝子発現が絡む疾患の治療を含む場合がある。
本発明はまた、CNS細胞において治療用導入遺伝子のを発現させる方法であって、CNS細胞中に、本発明に従う発現カセット又はベクターを導入することを含む方法を提供する。CNS細胞は、in vivoである場合も、ex vivoである場合もある。
本発明はまた、それを必要とする対象、好ましくは、ヒトの遺伝子療法の方法であって、
- 対象に、治療用産物をコードする遺伝子を含む、本発明の合成CNS特異的発現カセット、ベクター、ビリオン又は医薬組成物を投与すること(適宜、対象のCNS中に導入すること)
を含む方法を提供する。
方法は、適宜、前記対象のCNSにおいて遺伝子から治療用産物の治療量を発現させることを含む。治療できる種々の状態及び疾患は、上記で論じられている。適した治療用産物をコードする遺伝子は、上記で論じられている。
方法は、適宜、本発明に従うベクター又はビリオンを対象に投与することを含む。適宜、ベクターは、ウイルス遺伝子療法ベクター、例えば、AAVベクターである。
一部の実施形態では、方法は、遺伝子療法ベクターを全身に投与することを含む。全身投与は、経腸(例えば、経口、舌下及び直腸)又は非経口(例えば、注射)であり得る。好ましい注射経路として、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、関節内、くも膜下腔内及び皮内注射が挙げられる。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、注射によってCSF経路中に送達され得る。CSF経路への送達の限定されない例には、くも膜下腔内及び脳室内投与が含まれる。
本発明に従う合成CNS特異的プロモーター又は発現カセットを含むAAVベクター又はビリオンの特に好ましい投与経路は、血管内である。適宜、本発明に従う合成CNS特異的プロモーター又は発現カセットを含むAAVベクター又はビリオンは、手の甲の静脈又は前腕の静脈に投与できる。前腕における適した静脈は、橈側皮静脈、正中静脈又は尺側皮静脈である。これは、この投与経路が一般に、CNS中への幾分かの透過を依然として可能にしながら患者にとって安全であるためである。
一部の実施形態では、ウイルス遺伝子療法ベクターは、1つ若しくは複数の追加の治療薬と、又は網状内皮系によるベクターのクリアランスを防ぐように設計された1つ若しくは複数の飽和剤と同時に又は逐次投与できる。
ベクターがAAVベクターである場合には、ベクターの投与量は、1×1010gc/kg～1×1015gc/kg又はそれより多く、適宜、1×1012gc/kg～1×1014gc/kg、適宜、5×1012gc/kg～5×1013gc/kgであり得る。
一般に、それを必要とする対象は、哺乳動物、好ましくは、霊長類、より好ましくは、ヒトである。通常、それを必要とする対象は、疾患に特徴的な症状を示す。方法は、通常、治療用産物の治療用を発現させることによって、それを必要とする対象によって示された症状を寛解させることを含む。一実施形態では、本発明の治療方法を使用して、それだけには限らないが、総機能的能力(TFC)スケール等の標準評価システムによって測定されるような機能的能力及び日常生活動作の低下を低減できる。一実施形態では、本発明の方法を使用して、神経疾患の症状を測定するために使用される任意の評価でパフォーマンスを改善できる。このような評価として、それだけには限らないが、ADAS-cog(アルツハイマー病評価尺度-認知)、MMSE(ミニメンタルステート検査)、GDS(老年期うつ病尺度)、FAQ(機能活動質問票)、ADL(日常生活動作)、GPCOG(認知の総合診療医評価)、Mini-Cog、AMTS(略式メンタルテストスコア)、時計描画試験、6-CIT(6項目認知障害テスト)、TYM(Test Your Memory)、MoCa(モントリオール認知評価)、ACE-R(アデンブルック(Addenbrookes)認知評価)、MIS(記憶障害スクリーニング)、BADLS(ブリストル(Bristol)日常生活動作尺度)、バーセルインデックス(Barthel Index)、機能的自立度評価法(Functional Independence Measure)、手段的日常生活動作、IQCODE(高齢者の認知機能低下に関する情報提供者アンケート(Informant Questionnaire on Cognitive Decline in the Elderly))、神経精神症状評価、コーエン・マンスフィールドAgitation評価表(The Cohen-Mansfield Agitation Inventory)、BEHAVE-AD、EuroQol、ショートフォーム(Short Form)-36及び/又はMBR介護者ひずみ指数(MBR Caregiver Strain Instrument)又は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Sheehan B(Ther Adv Neurol Disord. 5(6):349～358頁(2012))に記載されるような他の試験のいずれかが挙げられる。
in vitro及びin vivoでの標的細胞における治療用遺伝子発現のための遺伝子療法プロトコールは、当技術分野で周知であり、ここでは詳細に論じない。手短には、それらは、プラスミドDNAベクター(裸の又はリポソーム中)又はウイルスベクターの、静脈内又は動脈内投与(例えば、頸動脈内(intra-corotid artery)、肝動脈内、肝静脈内)、頭蓋内投与、筋肉内注射、間質性注射、気道における滴下注入、内皮及び肝実質内への適用を含む。標的細胞へのDNAの利用可能性を増強するために種々のデバイスが開発された。簡単なアプローチは、標的細胞を関連ベクターを含有するカテーテル又は埋め込み可能な材料と物理的に接触させることであるが、より複雑なアプローチは、ジェット注射デバイス及びそのようなものを使用できる。哺乳動物CNS細胞中への遺伝子導入は、ex vivo及びin vivo手順の両方を使用して実施されている。ex vivoアプローチは、通常、CNS細胞の収集、適した発現ベクターを用いるin vitro形質導入と、それに続く、形質導入されたCNS細胞のCNS中への再導入を必要とする。このアプローチは、一般に、脳におけるCNS細胞の収集及び再導入の困難性及び危険のためにあまり好ましくない。In vivo遺伝子導入は、例えば、ウイルスベクターの頭蓋内注射によって、又は静脈内若しくは動脈内注射によって、DNA又はウイルスベクターを直接的にCNS中に注射することによって達成された。
一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、対象の神経疾患の症状を低減する(例えば、既知評価法を使用して決定される)ために治療上有効量で対象(例えば、対象のCNS)に投与され得る。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクター及び遺伝子療法ベクターを含む組成物は、それらが血液脳関門、血管障壁又は他の上皮障壁を超えることを可能にする方法で投与され得る。
遺伝子療法ベクターは、1つ又は複数の他の治療薬、予防薬、研究又は診断剤と組み合わせて使用され得る。「と組み合わせて」とは、薬剤が、同時に投与されなければならに、及び/又は一緒の送達のために製剤化されなければならないということを暗示するように意図されるものではないが、これらの送達方法は、本発明の範囲内である。組成物は、1つ又は複数の他の所望の治療薬又は医療処置と同時に、その前に、又はその後に投与され得る。本明細書で記載されたAAV粒子と組み合わせて使用できる化合物として、それだけには限らないが、コリンエステラーゼ阻害剤(ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン)、NMDA受容体アンタゴニスト、例えば、メマンチン、統合失調症治療薬、抗うつ薬、抗痙攣薬(例えば、ミオクローヌスのためのバルプロ酸ナトリウム及びレベチラセタム)、セクレターゼ阻害剤、アミロイド凝集阻害剤、銅又は亜鉛モジュレーター、BACE阻害剤、タウ凝集の阻害剤、例えば、メチレンブルー、フェノチアジン、アントラキノン、n-フェニルアミン又はローダミン、微小管安定化剤、例えば、NAP、タキソール又はパクリタキセル、キナーゼ又はホスファターゼ阻害剤、例えば、GSK3(リチウム)又はPP2Aを標的化するもの、?ベータペプチド又はタウホスホエピトープを用いる免疫化、抗タウ又は抗アミロイド抗体、ドーパミン枯渇剤(例えば、舞踏病のためのテトラベナジン)、ベンゾジアゼピン(例えば、ミオクローヌス、舞踏病、ジストニア、硬直及び/又は痙縮のためのクロナゼパム)、ドーパミンのアミノ酸前駆体(例えば、硬直のためのレボドパ)、骨格筋弛緩薬(例えば、硬直及び/又は痙縮のためのバクロフェン、チザニジン)、筋肉麻痺を引き起こす神経筋接合部でのアセチルコリン放出(acety choline release)の阻害剤(例えば、歯ぎしり及び/又はジストニアのためのボツリヌス毒素)、非定型神経遮断薬(例えば、精神病及び/又は被刺激性のためのオランザピン及びクエチアピン、精神病、舞踏病及び/又は被刺激性のためのリスペリドン、スルピリド及びハロペリドール、治療耐性精神病クロザピン、顕著な陰性症状を伴う精神病のためのアリピプラゾール)、選択的セロトニン再取り込み阻害剤(SSRI)(例えば、鬱病、不安神経症、強迫性挙動及び/又は被刺激性のためのシタロプラム、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、ミルトラザピン、ベンラファクシン)、睡眠薬(例えば、睡眠・覚醒サイクルの変更のためのゾピクロン及び/又はゾルピデム)、抗痙攣薬(例えば、躁病又は軽躁病のためのバルプロ酸ナトリウム及びカルバマゼピン)及び気分安定剤(例えば、躁病又は軽躁病のリチウム)が挙げられる。
一部の好ましい実施形態によれば、上記の方法を、上記で論じられるようなCNS関連疾患、例えば、ドーパミン輸送体欠乏症候群を有する対象の治療のために使用できる。
定義及び一般的なポイント
本発明の種々の実施形態の作製及び使用が以下の詳細に論じられるが、当然のことではあるが、本発明は、多種多様な特定の状況で具体化できる多数の適用可能な発明の概念を提供する。本明細書で論じられる特定の実施形態は、単に、本発明を作製及び使用するための特定の方法の例示であって、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する領域の当業者によって一般に理解されるような意味を有する。「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」等の用語は、単数の実体のみを指すように意図されず、例示のために特定の例が使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書において技術用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、その利用は、特許請求の範囲において概説される場合を除き本発明の限界を定めるものではない。
本明細書における本発明の背景の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及される材料のいずれかが、特許請求の範囲のいずれかの優先日の時点でいずれかの国において公開された、知られている、共通の一般的な知識の一部であったことの承認と解釈されるべきではない。
本開示を通じて、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は、特定する引例によって参照される。本明細書において引用されるすべての文書は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において具体的に参照されるこのような文書の教示又はセクションは、参照により組み込まれる。
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の従来の技術を利用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、2000、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA); Molevular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(Sambrookら、2001、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編、1984);米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (Harries及びHiggins編 1984); Transcription and Translation (Hames及びHiggins編 1984); Culture of Animal Cell (Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987); Immobilized Cell and Enzymes (IRL Press、1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);シリーズ、Methods in Enzymology (Abelson及びSimon編集長、Academic Press, Inc.、New York)、特に、154及び155巻 (Wuら編)及び185巻、「Gene Expression Technology」(Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cell (Miller及びCalos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer及びWalker編、Academic Press、London、1987); Handbook of Experimental Immunology、I～IV巻(Weir及びBlackwell編、1986);及びManipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986)を参照されたい。
「中枢神経系」又は「CNS」という用語は、当業者によって十分に理解されている。CNSは、脳及び脊髄からなる。好ましくは、合成CNS特異的プロモーターは、脳において活性である。本発明のプロモーターは、脳及び/又は脊髄において活性であり得る。好ましくは、CNSは、哺乳動物の、更により好ましくは、ヒト対象のCNSである。
「CNS細胞(単数又は複数)」は、CNS(CNS組織)において見出される、又はCNS組織に由来する細胞に関する。CNS細胞は、一次細胞又は細胞株(例えば、SH-Sy5y、Neuro2A、U87-MG)であり得る。CNS細胞は、in vivo(例えば、CNS組織中)又はin vitro(例えば、細胞培養物中)であり得る。CNS細胞は、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、小グリア細胞及び上衣細胞からなる。CNS組織において見出されるようなニューロンは、細胞体、長い軸索及びシナプス終末を含む。ニューロンは、細胞体において受け取られた電気信号を、その長い軸索を介して、そのシナプス終末に近い他の細胞に伝達する。オリゴデンドロサイトは、CNS中のグリア細胞の1種であり、より速い電気信号伝導のためにニューロンの軸索を包み込むミエリン鞘を生成する。星状細胞は、星形であり、脳において最も豊富にある細胞種である。それらは、電気インパルスの伝達を補助し、調節する複数の役割及び神経機能を有する。ミクログリアは、脳における常在性マクロファージ細胞であり、免疫防御に関与している。上衣細胞は、脳室の上皮内層を形成する。「CNS細胞(単数又は複数)」という用語は、本明細書で使用される場合、ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、小グリア細胞及び/又は上衣細胞を含む。本発明のプロモーターは、CNS細胞のいずれか(例えば、ニューロン)において活性であり得る。本発明のプロモーターは、CNS細胞のうち1より多い種類(例えば、ニューロン及び星状細胞)において活性であり得る。本発明のプロモーターは、CNS細胞のすべての種類(ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、小グリア細胞及び上衣細胞)において活性であり得る。更に、本発明の合成CNS特異的プロモーターは、CNS細胞の1種のサブタイプ、例えば、ドーパミン作動性ニューロン又は成熟したオリゴデンドロサイトにおいて活性であり得る。一部の実施形態では、本発明の合成CNS特異的プロモーターは、CNS細胞の1種のサブタイプ、例えば、ドーパミン作動性ニューロン又は成熟したオリゴデンドロサイトにおいてのみ活性であり得る。本発明のCRE、近位/最小プロモーター及びプロモーターは、CNSの特定の領域において、特定のCNS細胞又はCNS細胞サブタイプ又は両方において活性であり得る。一部の実施形態では、本発明のCRE、近位/最小プロモーター及びプロモーターは、特定のCNS細胞種、例えば、ニューロンにおいて、CNSのすべての領域内で活性であり得る。他の実施形態では、本発明のCRE、近位/最小プロモーター及びプロモーターは、特定のCNS細胞種、例えば、ニューロンにおいて、CNSの1以下の領域、例えば、中脳内で活性であり得る。一部の実施形態では、本発明のCRE、近位/最小プロモーター及びプロモーターは、すべてのCNS細胞において、CNSのすべての領域において活性であり得る。一部の実施形態では、本発明のCRE、近位/最小プロモーター及びプロモーターは、すべてのCNS細胞において、CNSの1以下の領域、例えば、中脳において活性であり得る。
「シス調節エレメント」又は「CRE」という用語は、当業者に周知の用語であり、隣接遺伝子の転写を(すなわち、シスで)調節又はモジュレートできる核酸配列、例えば、エンハンサー、プロモーター、インスレーター又はサイレンサーを意味する。CREは、調節する遺伝子のの近くに見出される。CREは通常、TFへの結合によって遺伝子転写を調節する、すなわち、それらはTFBSを含む。単一TFは、多数のCREに結合する、ひいては、多数の遺伝子の発現を制御する(多面発現性)場合がある。CREは普通、常にではないが、調節する遺伝子の転写開始部位(TSS)の上流に位置する。本文脈において「エンハンサー」とは、調節する遺伝子に作動可能に関連している、その上流、下流に、そのイントロン内にさえ見出すことができる、遺伝子の転写を増強する(すなわち、上方制御する)CREである。複数のエンハンサーが協調的な方法で作用して、1つの遺伝子の転写を調節する場合がある。この文脈において「サイレンサー」とは、リプレッサーと呼ばれるTFに結合するCREに関し、遺伝子の転写を妨げる又は下方制御するように作用する。「サイレンサー」という用語はまた、そのmRNA分子の翻訳を抑制するタンパク質に結合する、メッセンジャーRNAの3'非翻訳領域中の領域を指す場合があるが、この利用は、CREの説明におけるその使用とは異なる。一般に、本発明のCREは、CNS特異的エンハンサーエレメントである(CNS特異的CRE又はCNS特異的CREエンハンサー又はそのようなものと呼ばれることが多い)。本文脈では、CREは、転写開始部位(TSS)から2500ヌクレオチド又はそれより少ないところ、より好ましくは、TSSから2000ヌクレオチド又はそれより少ないところ、より好ましくは、TSSから1500ヌクレオチド又はそれより少ないところ、適宜、TSSから1000、750、500、250、200、150又は100ヌクレオチド又はそれより少ないところに位置することが好ましい。本発明のCREは、好ましくは、比較的短い長さ、好ましくは、1000ヌクレオチド又はそれより短い長さである、例えば、それらは、800、700、600、500、400、300、200、175、150、90、80、70、60又は50ヌクレオチド又はそれより短い長さである場合もある。本発明のCREは通常、最小プロモーター又は近位プロモーターであり得る作動可能に連結されたプロモーターエレメントと組み合わせて提供され、本発明のCREは、プロモーターエレメントのCNS特異的活性を増強し得る。
「シス調節モジュール」又は「CRM」という用語は、普通、2つ又はそれより多いCREを含む機能的調節核酸モジュールを意味し、本発明では、CREは通常、CNS特異的エンハンサーであり、したがって、CRMは、合成CNS特異的調節核酸である。CRMは、複数のCNS特異的CREを含み得る。適宜、CRM中に含まれるCREの少なくとも1つは、配列番号9～11、28～31に従うCRE又はその機能的バリアントである。通常、CRM内の複数のCREは、一緒に作用して(例えば、相加的に、又は相乗的に)、CRMを含むプロモーターが作動可能に関連される遺伝子の転写を増強する。CRM内のCREをシャッフルする(すなわち、並べ替える)、反転する(すなわち、配向を逆転させる)及びそのスペーシングを変更する余地はかなりある。したがって、本発明のCRMの機能的バリアントは、とりわけ、それら内のCREがシャッフルされている、及び/又は反転されている、及び/又はCREの間のスペーシングが変更されている、言及されたCRMのバリアントを含む。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という語句は一般に、転写が生じる必要がある、すなわち、転写を開始する、転写されるべき核酸配列の上流に位置するDNAの領域を指す。プロモーターによって、その制御下のコード配列の転写の適切な活性化又は転写の抑制が可能となる。プロモーターは通常、複数のTFによって認識及び結合される特定の配列を含有する。TFは、プロモーター配列に結合し、RNAポリメラーゼ、遺伝子のコーディング領域からRNAを合成する酵素の動員をもたらす。多数の多様なプロモーターが当技術分野で公知である。
「合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に生じないプロモーターに関する。本文脈では、通常、最小(又はコア)プロモーター又はCNS特異的近位プロモーター(プロモーターエレメント)に作動可能に連結した本発明のCRE及び/又はCRMを含む。本発明のCRE及び/又はCRMは、合成プロモーターに作動可能に連結した遺伝子のCNS特異的転写を増強するよう働く。合成プロモーターの一部は、天然に存在する場合がある(例えば、プロモーター中の最小プロモーター又は1つ若しくは複数のCRE)が、実体としての合成プロモーターは、天然に存在しない。或いは、合成プロモーターは、天然に存在するプロモーターの短い、末端切断型バージョンである場合がある。
本明細書で使用される場合、「最小プロモーター」(「コアプロモーター」としても知られる)とは、通常、それ自体で不活性であるか、又はほとんど不活性であるが、他の転写調節エレメントと組み合わされると転写を媒介できる短いDNAセグメントを指す。最小プロモーター配列は、原核生物及び真核細胞の遺伝子を含む種々の異なる供給源に由来し得る。最小プロモーターの例として、SYNP_CRE151(配列番号12)が含まれる。最小プロモーターの他の例示として、ドーパミンベータ-ヒドロキシラーゼ遺伝子最小プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子最小プロモーター(CMV-MP)及びヘルペスチミジンキナーゼ最小プロモーター(MinTK)がある。最小プロモーターは通常、転写開始部位(TSS)及びすぐ上流のエレメント、RNAポリメラーゼIIの結合部位及び一般的な転写因子結合部位(しばしば、TATAボックス)を含む。最小プロモーターはまた、TSSの下流の一部のエレメントを含む場合があるが、これらは通常、追加の調節エレメントがなければ機能性がほとんどない。
本明細書で使用される場合、「近位プロモーター」は、最小プロモーター及び少なくとも一部の追加の調節配列、通常、主な調節エレメントを含有する傾向がある遺伝子の近位配列上流に関する。しばしば、TSSの上流およそ250塩基対に広がり、特定のTFBSを含む。近位プロモーターはまた、TSSの下流の1つ又は複数の調節エレメント、例えば、UTR又はイントロンを含み得る。本場合には、近位プロモーターは、適宜、天然に存在するCNS特異的近位プロモーターの短い、末端切断型バージョンである場合がある。本発明の近位プロモーターは、本発明の1つ又は複数のCRE又はCRMと組み合わせてもよい。しかし、近位プロモーターはまた、合成でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーターエレメント」とは、上記で定義されるような最小プロモーター又は近位プロモーターのいずれかを指す。本発明の文脈において、プロモーターエレメントは、本発明の合成CNS特異的プロモーターを提供するために、1つ又は複数のCREと組み合わせることができる。
本発明の文脈においてCRE、CRM、プロモーターエレメント、プロモーター又は他の調節核酸の「機能的バリアント」は、参照配列と、例えば、CNS特異的CRE、CNS特異的CRM又はCNS特異的プロモーターと同じ方法で機能する能力を保持する参照配列のバリアントである。このような機能的バリアントの代替用語として、「生物学的等価物」又は「等価物」が挙げられる。
CNS特異的エンハンサーとして機能する所与のCRE、CRM、プロモーター又は他の調節配列の能力は、参照配列に結合する同一CNS特異的TFに結合する配列の能力によって有意に決定されるということが認められよう。したがって、ほとんどの場合、CRE又はCRMの機能的バリアントは、参照CRE、CRM又はプロモーターと同一のTFのほとんど又はすべてのTFBSを含有する。機能的バリアントのTFBSは、参照CRE、CRM又はプロモーターと同一の相対位置(すなわち、順序及び全体的な位置)にあることが好ましいが、必須ではない。また、機能的バリアントのTFBSが、参照配列と同一配向にあることも好ましいが、必須ではない(一部の場合には、例えば、参照配列中の配列と相対する逆補体として逆配向で存在する場合があるということは留意されたい)。機能的バリアントのTFBSが、参照配列と同一鎖上にあることも好ましいが、必須ではない。したがって、好ましい実施形態では、機能的バリアントは、参照配列と同一TFのTFBSを、同一順序、同一位置で、同一配向で、及び同一鎖上に含む。TFBSの間にある配列(一部の場合には、スペーサー配列又はそのようなものと呼ばれる)は、CRE又はCRMの機能にとってあまり重要性はないことも理解されるであろう。このような配列は通常、大幅に変わる場合があり、その長さが変更される場合がある。しかし、好ましい実施形態では、スペーシング(すなわち、隣接するTFBS間の距離)は、参照配列におけるものと、機能的バリアントにおいて実質的に同一である(例えば、20%よりも多く変わらない、好ましくは、10%よりも多く変わらない、より好ましくは、ほぼ同一である)。一部の場合には、CREの機能的バリアントは、逆配向で存在する場合がある、例えば、上記のようにCREの逆補体又はそのバリアントであり得るということは明らかであろう。
機能的バリアントと参照配列の間の配列同一性のレベルはまた、指標又は保持された機能性であり得る。CRE、CRM又はプロモーターのTFBSにおける高レベルの配列同一性は、スペーサー配列(配列の任意の保存の必要性がほとんど又は全くない)における配列同一性よりも一般に高い重要性のものである。しかし、機能的TFBSの配列は、コンセンサス配列と正確に対応する必要はないということを考慮すると、TFBS内でさえ相当な程度の配列変動が適応され得るということが認められよう。
1つ又は複数のTFの、所与の機能的バリアント中のTFBSに結合する能力は、それだけには限らないが、 電気移動度シフトアッセイ(EMSA)、結合アッセイ、クロマチン免疫沈降(ChIP)及びChIPシーケンシング(ChIP-seq)を含む当技術分野で公知の任意の関連手段によって決定できる。好ましい実施形態では、1つ又は複数のTFの、所与の機能的バリアントに結合する能力は、EMSAによって決定される。EMSAを実施する方法は、当技術分野で周知である。適したアプローチは、上記で引用されたSambrookらに記載されている。この手順を記載する多数の関連文献が入手可能である、例えば、Hellman及びFried、Nat Protoc. 2007; 2(8): 1849～1861頁。
「CNS特異的」又は「CNS特異的発現」とは、他の組織(例えば、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、筋肉及び肺)と比較して優先的な又は優勢な方法でCNS細胞において(又はCNS由来細胞において)遺伝子の発現を増強又は駆動する、シス調節エレメント、シス調節モジュール又はプロモーターの能力を指す。遺伝子の発現は、mRNA又はタンパク質の形態であり得る。好ましい実施形態では、CNS特異的発現は、他の(すなわち、非CNS)組織又は細胞において無視できる発現がある、すなわち、発現は高度にCNS特異的であるようなものである。
CRE、CRM又はプロモーターの、CNS特異的CRE、CRM又はプロモーターとして機能する能力は、当業者によって容易に評価できる。当業者は、したがって、上記で列挙された特異的CRE、CRM又はプロモーターの任意のバリアントが機能的のままである(すなわち、上記で定義されたような機能的バリアントである)か否かを容易に決定できる。例えば、評価されるべき任意の所与のCRMを、最小プロモーター(例えば、CMV-MPの上流又は配列番号12若しくは13の上流に位置する)に作動可能に連結でき、シス調節エレメントの、遺伝子(通常、リポーター遺伝子)のCNS特異的発現を駆動する能力を測定する。或いは、CRE又はCRMのバリアントを、参照CRE又はCRMの代わりに合成CNS特異的プロモーター中に置換でき、前記改変プロモーターによって駆動されるCNS特異的発現に対する作用を決定し、未改変形態と比較できる。同様に、プロモーターの、CNS特異的発現を駆動する能力は、当業者によって容易に評価され得る(例えば、以下の実施例に記載されるように)。参照プロモーターのバリアントによって駆動される遺伝子の発現レベルは、参照プロモーターによって駆動される発現レベルと比較され得る。一部の実施形態では、バリアントプロモーターによって駆動されるCNS特異的発現レベルが、参照プロモーターによって駆動される発現レベルの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも100%である場合には、バリアントは機能的なままであると言われ得る。CNS特異的発現増強を評価するための適した核酸構築物及びリポーターアッセイは、容易に構築でき、以下に記載される実施例によって適した方法論が与えられる。
遺伝子(例えば、治療用又はリポーター遺伝子)の発現がCNS由来細胞において優先的に又は優勢に生じるCNS特異性を同定できる。例えば、発現のレベルが、CNS由来細胞において他の種類の細胞(すなわち、非CNS由来細胞)よりも有意に大きい場合に、優先的又は優勢な発現が定義され得る。例えば、CNS由来細胞における発現は、適宜、非CNS細胞においてよりも少なくとも5倍高い、好ましくは、非CNS細胞においてよりも少なくとも10倍高く、一部の場合には50倍高い場合もある。便宜上、CNS特異的発現は、適宜、種々の非CNS細胞株における発現レベルの比較によって実証され得る、例えば、筋肉由来細胞株、例えば、C2C12又はH2K細胞(骨格筋)又はH9C2細胞(心臓)における、肝臓由来細胞株(例えば、Huh7又はHepG2)、腎臓由来細胞株(例えば、HEK-293)、子宮頸部組織由来細胞株(例えば、HeLa)及び/又は肺由来細胞株(例えば、A549)における発現レベルと比較した、一次CNS細胞又はCNS由来細胞株、例えば、SH-Sy5y、Neuro2A、U87-MG。
本発明の合成CNS特異的プロモーターは、好ましくは、非組織特異的プロモーター、例えば、CMV-IEと比較した場合に、非CNS由来細胞において、適宜、C2C12、H9C2、Huh7、HEK-293、HeLa、及び/又はA549細胞において発現の低減を示す。本発明の合成CNS特異的プロモーターは好ましくは、非CNS由来細胞において(適宜、C2C12、H9C2、Huh7、HEK-293、HeLa及び/又はA549において)CMV-IEプロモーターの50%以下、適宜、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下又は1%以下の活性を有する。一般に、非CNS由来細胞における発現は最小化されることが好ましいが、一部の場合には、これは必ずしも必要ではない場合がある。本発明の合成CNS特異的プロモーターが、例えば、1つ又は2つの非CNS細胞においてより高い発現を有する場合であっても、全般的に、非CNS細胞に対してさまざまなCNS細胞において全体的により高い発現を有する限り、依然としてCNS特異的プロモーターであり得る。
本発明の合成CNS特異的プロモーターは、好ましくは、対象のCNSにおける発現の促進、例えば、導入遺伝子、好ましくは、治療用導入遺伝子のCNS特異的発現の駆動に適している。本発明の好ましい合成CNS特異的プロモーターは、CNS特異的導入発現の促進に適しており、CNS細胞において、シナプシン-1プロモーターの活性の少なくとも15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%又は400%である活性を有する。一部の実施形態では、本発明の合成CNS特異的プロモーターは、シナプシン-1プロモーターの活性の少なくとも100%、好ましくは、シナプシン-1プロモーターの活性の150%、200%、300%又は500%のレベルでのCNS特異的導入遺伝子発現の促進に適している。このようなCNS特異的発現は、CNS由来細胞、例えば、SH-Sy5y、Neuro2A、U87-MG細胞株又は一次CNS細胞(適宜、一次ヒトニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及び/又は上衣細胞)において適宜決定される。
本発明の合成CNS特異的プロモーターはまた、CNS由来細胞、例えば、SH-Sy5y、Neuro2A、U87-MG細胞株又は一次CNS細胞(適宜、一次ヒトニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及び/又は上衣細胞)中のCMV-IEと比較して少なくとも50%、100%、150%又は200%のレベルで遺伝子のCNS特異的発現を促進可能であり得る。
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、通常、本質的にヌクレオチドからなる任意の長さのオリゴマー又はポリマー(好ましくは、直鎖状ポリマー)を指す。ヌクレオチド単位は、一般に、複素環式塩基、糖基及び少なくとも1つの、例えば、1、2又は3つの改変された又は置換されたリン酸基を含むリン酸基を含む。複素環式塩基には、とりわけ、プリン及びピリミジン塩基、例えば、広範に天然に存在する核酸であるアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)及びウラシル(U)、他の天然に存在する塩基(例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン)並びに化学的又は生化学的に改変された(例えば、メチル化)もの、非天然又は誘導体化された塩基を含まれ得る。糖基には、とりわけ、ペントース(ペントフラノース)基、例えば、好ましくは、天然に存在する核酸に共通するリボース及び/又は2-デオキシリボース又はアラビノース、2-デオキシアラビノース、トレオース又はヘキソース糖基並びに改変された又は置換された糖基が含まれ得る。本明細書において意図されるような核酸には、天然に存在するヌクレオチド、改変されたヌクレオチド又はそれらの混合物が含まれ得る。改変されたヌクレオチドには、改変された複素環式塩基、改変された糖部分、改変されたリン酸基又はそれらの組合せが含まれ得る。リン酸基又は糖の改変は、安定性、酵素分解に対する耐性又はいくつかの他の有用な特性を改善するために導入され得る。「核酸」という用語は、更に好ましくは、DNA、RNA及びDNA RNAハイブリッド分子を包含し、具体的には、hnRNA、プレmRNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、増幅産物、オリゴヌクレオチド及び合成(例えば、化学的に合成された)DNA、RNA又はDNA RNAハイブリッドを含む。核酸は、天然に存在する、例えば、自然界に存在する又は自然界から単離されたものである場合も、天然に存在しない、例えば、組換え、すなわち、組換えDNA技術によって生成された、及び/若しくは部分的に若しくは全体的に、化学的若しくは生化学的に合成されたものである場合もある。「核酸」は、二本鎖、部分的に二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合には、核酸は、センス鎖である場合も、アンチセンス鎖である場合もある。更に、核酸は、環状である場合も、直鎖状である場合もある。
「単離」とは、核酸に言及する場合には、自然界ではそれと普通関連している配列を全部又は一部欠く核酸分子又は核酸配列、又は自然界で存在するとおりであるが、それを関連する異種配列を有する配列、又は染色体から解離された分子を意味する。
「同一性」及び「同一の」等の用語は、2つのポリマー分子間、例えば、2つの核酸分子間、例えば、2つのDNA分子間の配列類似性を指す。配列アラインメント及び配列同一性の決定は、例えば、Altschulら1990 (J Mol Biol 215: 403～10頁)によって元々記載された基本ローカルアラインメント検索ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)、例えば、Tatusova及びMadden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247～250頁)によって記載された「BLAST2配列」アルゴリズムを使用して行うことができる。
比較のために配列をアラインする方法は、当技術分野で周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、例えば、Smith及びWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482、Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins及びSharp (1988) Gene 73:237～44頁; Higgins及びSharp (1989) CABIOS 5:151～3頁; Corpetら(1988) Nucleic Acids Res. 16:10881～90頁; Huangら(1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155～65頁、Pearsonら(1994) Methods Mol. Biol. 24:307～31頁; Tatianaら(1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247～50頁に記載されている。配列アラインメント法及び相同性算出の詳細な考察は、例えば、Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403～10頁に見出すことができる。
国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)基本ローカルアラインメント検索ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST(商標); Altschulら(1990))は、いくつかの配列分析プログラムに関連して使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(メリーランド州、ベゼスダ)を含むいくつかの供給源から、及びインターネットで入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、BLAST(商標)の「ヘルプ」の節のもとでインターネットで入手可能である。核酸配列の比較のために、BLAST(商標)の「BLAST2配列」機能(Blastn)プログラムを、デフォルトパラメーターを使用して利用できる。参照配列に対して更に大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価される場合に同一性パーセンテージの増大を示す。通常、配列同一性パーセンテージは、配列の長さ全体にわたって算出される。
例えば、グローバル最適アラインメントは、適宜、以下のスコアリングパラメーターを用いてNeedleman-Wunschアルゴリズムによって見出される:マッチスコア:+2、ミスマッチスコア:-3、ギャップペナルティー:ギャップオープン5、ギャップ伸長2。得られた最適グローバルアラインメントの同一性パーセンテージは、適宜、アラインされた塩基の数の、アラインメントの長さ全体に対する比によって算出され、アラインメントの長さは、マッチとミスマッチの両方を含み、100が掛けられる。
「転写因子結合部位」(TFBS)という用語は、当技術分野で周知である。TFBS配列は、意図される転写因子(TF)によって結合される限り改変されてもよいということは当業者には明らかであろう。本明細書で開示される種々のTFBSのコンセンサス配列は、当技術分野で公知であり、当業者ならば、この情報を容易に使用して、代替TFBSを決定できる。更に、所与の推定配列に結合する能力は、当業者によって実験的に(例えば、EMSA及び当技術分野で周知であり、本明細書において論じられる他のアプローチによって)容易に決定できる。
「コンセンサス配列」の意味は、当技術分野で周知である。本出願では、文脈が別に示さない限り、コンセンサス配列には以下の表示法が使用される。以下の例示的DNA配列を考えると:
A[CT]N{A}YR
Aは、Aが常にその位置に見出されることを意味する、[CT]は、その位置でのC又はTのいずれかを表す、Nは、その位置での任意の塩基を表す、{A}は、Aを除く任意の塩基がその位置で見出されることを意味する。Yは、任意のピリミジンを表し、Rは、任意のプリンを示す。
本出願において「合成」とは、自然界では生じない核酸分子を意味する。本発明の合成核酸は、人工的に、通常、組換え技術又はde novo合成によって生成される。このような合成核酸は、天然に存在する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン及び他のこのような調節配列)を含有する場合があるが、これらは天然に存在しない状況で存在する。例えば、合成遺伝子(又は遺伝子の部分)は通常、自然界では連続ではない1つ又は複数の核酸配列を含有する(キメラ配列)、及び/又は置換、挿入及び欠失及びそれらの組合せを包含する場合もある。
「相補的」又は「相補性」とは、本明細書で使用される場合、2つの核酸配列のワトソン-クリック塩基対合を指す。例えば、配列5'-AGT-3'については、相補的配列3'-TCA-5'に結合する。2つの核酸配列間の相補性は、塩基の一部のみがその相補体に結合する「部分的」である場合も、配列中の全塩基がその相補的塩基に結合する場合には完全である場合もある。
「投与」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト又は動物身体中への生体異物の導入を指す。投与は、例えば、静脈内、動脈内又は頭蓋内であり得る。
本出願において「トランスフェクション」とは広く、細胞中に核酸を計画的に導入する任意のプロセスを指し、ウイルス及び非ウイルスベクターの導入を対象とし、形質転換、形質導入並びに同様の用語及びプロセスを含む又はそれと同等である。例として、それだけには限らないが、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション、プラスミドベクターを用いる形質転換、エレクトロポレーション(Frommら(1986) Nature 319:791～3頁)、リポフェクション(Feignerら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413～7頁)、マイクロインジェクション(Muellerら(1978) Cell 15:579～85頁)、アグロバクテリウム媒介性導入(Fraleyら(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803～7頁)、直接DNA取り込み、ウィスカー媒介性形質転換及び微粒子銃(Kleinら(1987) Nature 327:70)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という語句は、外因性核酸配列を指す。一例では、導入遺伝子は、産業的に又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子又は望ましい形質をコードする遺伝子である。更に別の実施例では、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列等の有用な核酸をコードし、アンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、好ましくは、治療用産物、例えば、タンパク質をコードする。
「ベクター」という用語は、当技術分野で周知であり、本明細書で使用される場合、本発明に従う核酸配列が挿入されている可能性がある核酸分子、例えば、二本鎖DNAを指す。ベクターは、挿入された核酸分子を適した宿主細胞中に輸送するために、適宜使用される。ベクターは通常、挿入核酸分子の転写を、好ましくは、転写物のポリペプチドへの翻訳を可能にする必要なエレメントのすべてを含有する。ベクターは通常、ひとたびベクターが宿主細胞中にあると、ベクターが宿主染色体DNAと独立に、又は宿主染色体DNAと同時に複製でき、ベクターのいくつかのコピー及びその挿入された核酸分子が生成されるように必須のエレメントのすべてを含有する。本発明のベクターは、エピソームベクター(すなわち、宿主細胞のゲノム中に組み込まれない)である場合も、宿主細胞ゲノム中に組み込まれるベクターである場合もある。この定義には、非ウイルス及びウイルスベクターの両方が含まれる。非ウイルスベクターとして、それだけには限らないが、プラスミドベクター(例えば、pMA-RQ、pUCベクター、bluescriptベクター(pBS)及びpBR322又は細菌配列(ミニサークル)を欠くそれらの誘導体)、トランスポゾンベースのベクター(例えば、PiggyBac(PB)ベクター又はSleeping Beauty(SB)ベクター)等が挙げられる。より大きな挿入部分を収容するために、人工染色体(細菌(BAC)、酵母(YAC)又はヒト(HAC))等のより大きなベクターが使用され得る。ウイルスベクターは、ウイルスに由来し、それだけには限らないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスベクター等を含む。必ずしもではないが通常は、ウイルスベクターは、複製に必須のウイルス遺伝子がウイルスベクターから排除されているため、それらが所与の細胞において増殖する能力を喪失しているので、複製欠損性である。しかし、一部のウイルスベクターはまた、所与の細胞、例えば、がん細胞等において特異的に複製するよう適応させることができ、通常、(がん)細胞特異的(腫瘍)溶解を引き起こすために使用される。ビロソームは、ウイルス及び非ウイルスエレメントの両方を含むベクターの限定されない例であり、特に、それらは、リポソームを不活化HIV又はインフルエンザウイルスと組み合わせる(Yamadaら、2003)。別の例は、カチオン性脂質と混合されたウイルスベクターを包含する。
「作動可能に連結された」、「作動可能に接続された」という用語又は同等の表現は、本明細書で使用される場合、エレメントが機能的に接続され、意図される方法で互いに相互作用できるような、互いに対する種々の核酸エレメントの配置を指す。このようなエレメントとして、プロモーター、CRE(例えば、エンハンサー又は他の調節エレメント)、プロモーターエレメント、ポリアデニル化配列、1つ又は複数のイントロン及び/又はエクソン並びに発現されるべき目的の遺伝子のコード配列が挙げられるが、それに限定されない。核酸配列エレメントは、適切に配向される又は作動可能に連結される場合に、一緒に作用して、互いの活性をモジュレートする、最終的には発現産物の発現のレベルに影響を及ぼす場合もある。モジュレートするとは、特定のエレメントの活性のレベルを増大、減少又は維持することを意味する。他のエレメントに対する各エレメントの位置は、各エレメントの5'末端及び3'末端又は別のエレメント若しくは部分(例えば、TSS又はプロモーターエレメント)の上流若しくは下流のその位置の観点で表すことができ、任意の特定のエレメント間の距離は、エレメントの間の介在するヌクレオチド又は塩基対の数によって言及することができる。当業者によって理解されるように、作動可能に連結されたとは、機能活性を暗示し、必ずしも天然の位置的連結と関連しない。実際、核酸発現カセット中で使用される場合には、CREは通常、プロモーターエレメントのすぐ上流に位置する(これは一般的な場合であるが、核酸発現カセット内の位置の制限又は除外として明確に解釈されるべきではない)が、in vivoではそうである必要はなく、例えば、その転写が影響を受ける遺伝子の下流に天然に存在する調節エレメント配列が、プロモーターの上流に位置する場合と同一方法で機能できる。したがって、特定の具体例によれば、調節エレメントの調節又は増強効果は、位置に依存しない場合がある。
「スペーサー配列」又は「スペーサー」とは、本明細書で使用される場合、2つの機能的核酸配列(例えば、TFBS、CRE、CRM、プロモーターエレメント等)を分ける核酸配列である。それは、機能的核酸配列(例えば、シス調節エレメント)が望まれるように機能するのを妨げない限り(例えば、これはサイレンサー配列を含む場合に起こる可能性があり、所望の転写因子又はそのようなものの結合を妨げる)、本質的に任意の配列を有し得る。通常、隣接する機能的核酸配列を互いから距離をあけて配置するためだけにその中に存在するので、非機能的である。一部の実施形態では、スペーサーは、75、50、40、30、30又は10ヌクレオチド又はそれより短い長さを有し得る。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野と一致しており、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないことを意味する。
「治療上有効量」及び同様の語句は、例えば、CNSにおいて治療用遺伝子を発現させる、所望の特定の薬理学的効果を提供する、対象における用量又は血漿中濃度を意味する。治療上有効量は、本明細書で記載される状態の治療において常に有効ではない場合もあるが、このような投与量は、当業者によって治療上有効量であると見なされる。治療上有効量は、投与経路及び投与形、対象の年齢及び体重並びに/又は治療されている疾患若しくは状態に基づいて変わり得る。
「AAVベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野で周知であり、一般に、種々の核酸配列を含むAAVベクター核酸配列を指す。AAVベクターとは、本明細書で使用される場合、通常、ベクターの一部としてAAV起源のものではない異種核酸配列を含む。この異種核酸配列は、通常、本明細書で開示されるようなプロモーター並びに細胞の遺伝的形質転換のための目的の他の配列を含む。一般に、異種核酸配列は、少なくとも1つの、一般に、2つのAAV逆方向末端反復配列配列(ITR)に隣接する。「AAVビリオン」又は「AAVウイルス」又は「AAVウイルス粒子」又は「AAVベクター粒子」とは、少なくとも1つのAAVカプシドポリペプチド(バリアントAAVカプシドポリペプチド及び非バリアント親カプシドポリペプチドの両方を含む)及びカプシド形成されたポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種核酸(すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞へ送達されるべき導入遺伝子)を含む場合には、「AAVベクター粒子」又は簡単に「AAVベクター」と呼ばれる場合もある。したがって、AAVビリオン又はAAV粒子の生成は、AAVベクターの生成を必ず含むが、これは、このようなベクターがAAVビリオン又はAAV粒子内に含有されるからである。ITRは、Table 1に列挙された血清型のいずれかから選択される、カプシドと同一の血清型に由来する場合もあれば、カプシドとは異なる血清型に由来する場合もある。AAVベクターは、通常、1つより多くのITRを有する。限定されない例では、AAVベクターは、2つのITRを含むウイルスゲノムを有する。一実施形態では、ITRは、互いと同一の血清型のものである。別の実施形態では、ITRは、異なる血清型のものである。限定されない例には、カプシドと同一の血清型を有するITRのうち0、1つ又は両方が含まれる。独立に、各ITRは、約100～約150ヌクレオチドの長さであり得る。ITRは、約100～105ヌクレオチドの長さ、106～110ヌクレオチドの長さ、111～115ヌクレオチドの長さ、116～120ヌクレオチドの長さ、121～125ヌクレオチドの長さ、126～130ヌクレオチドの長さ、131～135ヌクレオチドの長さ、136～140ヌクレオチドの長さ、141～145ヌクレオチドの長さ又は146～150ヌクレオチドの長さであり得る。一実施形態では、ITRは、140～142ヌクレオチドの長さである。ITR長の限定されない例は、102、105、130、140、141、142、145ヌクレオチドの長さである。
本明細書で使用される場合、「マイクロRNA」という用語は、それだけには限らないが、内因性マイクロRNA及び人工マイクロRNA(例えば、合成miRNA)を含む任意の種類の干渉RNAを指す。内因性マイクロRNAは、mRNAの生成的利用を調節可能なゲノム中に天然にコードされる小さいRNAである。人工マイクロRNAは、mRNAの活性を調節可能な、内因性マイクロRNA以外の任意の種類のRNA配列であり得る。マイクロRNA配列は、これらの配列のうち任意の1つ又は複数から構成されるRNA分子であり得る。マイクロRNA(又は「miRNA」)配列は、Limら、2003、Genes & Development、17、991～1008頁、Limら、2003、Science、299、1540、Lee及びAmbrose、2001、Science、294、862、Lauら、2001、Science 294、858～861頁、Lagos-Quintanaら、2002、Current Biology、12、735～739頁、Lagos-Quintanaら、2001、Science、294、853～857頁並びにLagos-Quintanaら、2003、RNA、9、175～179頁等の刊行物に記載されている。マイクロRNAの例として、大きなRNAの任意のRNA断片が挙げられ、又はmiRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA若しくは他の小さい非コーディングRNAがある。例えば、米国特許出願第20050272923号、同20050266552号、同20050142581号及び同20050075492号を参照されたい。「マイクロRNA前駆体」(又は「プレmiRNA」)とは、マイクロRNA配列が組み込まれたステム-ループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロRNA」(又は「成熟miRNA」)には、マイクロRNA前駆体(「プレmiRNA」)から切断された、又は合成された(例えば、細胞不含合成によって実験室で合成された)マイクロRNAが含まれ、約19ヌクレオチド～約27ヌクレオチドの長さを有し、例えば、成熟マイクロRNAは、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt又は27ntの長さを有し得る。成熟マイクロRNAは、標的mRNAに結合し、標的mRNAの翻訳を阻害できる。
「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患又は状態の1つ又は複数の症候、症状又は作用を低減すること、寛解すること又は排除することを指す。「治療」は、本明細書で使用される場合、したがって、哺乳動物における、特に、ヒトにおける疾患の任意の治療を含み、(a)疾患にかかりやすい、又は疾患を獲得するリスクにあるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が生じるのを防ぐこと、(b)疾患を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、及び(c)疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。
対象への薬剤の「投与」は、その意図された機能を発揮するための対象への薬剤の任意の導入又は送達経路を含む。投与は、経口的、鼻腔内に、眼内に、点眼によって、非経口的に(血管内に、筋肉内に、腹膜内に又は皮下に)又は局所的にを含めて任意の適した経路によって実施できる。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。静脈内又は動脈内投与は、本発明において特に興味深い。
「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、同義的に使用され、治療を必要とする疾患又は状態を有する任意の個々の対象を指す。本開示の目的上、対象は、霊長類、好ましくは、ヒト又は別の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヤギ又はウシ等であり得る。
「領域において、又は組織において特異的に活性である」という用語は、その領域又は組織において優勢に活性である、すなわち、その領域又は組織において、他の領域又は組織においてよりも活性であるプロモーターを指す。
(実施例1)
GFPに作動可能に連結したCNS1～8(配列番号1～4、23～26)のCNS形質導入及びベクター体内分布をAAV9を使用して研究した。
AAVプラスミド調製:
ssAAV2逆方向末端反復配列を含有するhSyn.GFPプラスミドをAddgeneから入手し、これを使用して、対照AAVベクター(シナプシン-1)を生成した。CNS 1～8(配列番号1～4、23～26)プロモーターをhSyn.GFPプラスミド中にクローニングして、GeneArt(登録商標)(Thermo Fisher Scientific、ドイツ)によってhSynプロモーターを置き換えた。すべてのプラスミドDNAは、PureLink(商標)HiPure Plasmid Maxiprepキット(番号K210007;Thermo Fisher Scientific、ドイツ)を製造業者の使用説明書に従って使用して調製し、Omega FLUOstar分光光度計(BMG Labtech、英国)で定量化した。
AAVベクター調製:
GFPをコードする組換えAAV2/9(全体を通じて、AAV9と呼ばれる)ベクターを、標準トリプルプラスミドトランスフェクション法によって生成した。手短には、ウイルス産生株ヒト胎児由来腎臓(HEK)293T細胞を、3種のプラスミド、種々のプロモーター(配列番号1～4、23～26)によって制御されるpGFP、AAV9カプシドをコードするpGD9及びヘルパー機能を含有するpHGTIをポリエチレンイミン(PEI)(番号24765;Polysciences、英国)を使用して、ストック濃度1mg/mlで、モル割合1:3:1で用いて同時トランスフェクトした。72時間後、細胞を収集し、溶解した。細胞溶解物及び上清をヌクレアーゼ処置し、濾過し、POROSTM CaptureSelectTM AAVX樹脂(Thermo Fisher Scientific、ドイツ)を用いPrimeview 5.0ソフトウェアを用いたAKTAprime plus(GE Healthcare Ltd、英国)でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
AAVベクタータイトレーション:
すべてのベクター調製物を、QuantStudio(商標)3システムリアルタイムPCR(Thermo Fisher Scientific、英国)でLuna(登録商標)Universal qPCR Master Mix製造業者の使用説明書(番号M3003; New England Biolabs、英国)に従って、GFP導入遺伝子に対するqPCRによってタイトレーションした。データは、QuantStudio設計及び分析ソフトウェアV5を使用して分析した。GFP導入遺伝子のセグメントを増幅するように設計されたプライマー(Table 5)を使用して、ベクターゲノム数を決定した。すべてのベクターを1×1013ベクターゲノム/mL(vg/mL)に力価を一致させた。
動物手順:
すべての動物実験は、ロンドン大学ユニバーシティ・カレッジ倫理審査委員会のガイドライン内で英国内務省の規制及び動物(科学的処置)法1986に準拠して実施した。非近交系CD1マウス(Charles River、英国)を、12時間明暗周期、一定温度(21～23℃)、湿度(60%±5)、固形飼料食物及び水の自由な利用を用いる標準条件下で、Central Biological Services Unit、UCLで個別に換気されたケージ(IVC)ケージ中に収容した。実験用繁殖ペアを、6週齢後に交配期を合わせ(time-mated)、新生同腹仔をこれらのプロモーター研究に使用した。仔をP21で離乳させ、P35で組織分析のために安楽死させた。
動物注射:
すべての仔に誕生の日(P0)に注射した。仔を、いずれかの注射方法の前に一過性の低体温麻酔に付した。各注射方法について、ベクターの種類あたり4匹のマウスに注射し、4匹の未注射対照を伴い、各々は足の刺青によって一意的に同定した。仔を正常温度まで加温し、その後、雌親に戻した。
ウイルスベクターの新生仔頭蓋内注射:
仔に、参照により本明細書に組み込まれる確立された座標(Kim, Ji-Yoenら、2013)を使用して33ゲージのHamiltonニードル(Fisher Scientific、英国)を使用して、5μlのウイルスベクター(5×1010ウイルスゲノム/仔)を大脳側脳室中に注射した。脳室への注射は血液脳関門を迂回する。
ウイルスベクターの新生仔静脈内注射:
仔に、20μlのウイルスベクター(2×1011vg/仔)を表在側頭静脈中に注射した。光ファイバー透過照明を使用して静脈を可視化し、33ゲージのHamiltonニードルを使用し、実体手術用顕微鏡(Zeiss、ドイツ)を使用して注射を実施した。
灌流及び組織調製:
動物にイソフラン(ノーズコーンを介した5%誘導チャンバー、1.5%維持)を用いて麻酔した。経心腔的灌流を、右心房を切断し、左心室に10mLのオートクレーブ処理PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を肝臓の白化が達成されるまで注射することによって実施した。脳及び内臓器官を次の実験に応じて異なる処理技術を可能にするために2つに分けた。免疫組織化学用に使用される半分を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で48時間後固定し(post-fixed)、切片作製までの4℃での凍結保護のために30%スクロース溶液中に移した。半分の脳を冠状又は矢状面のいずれかで40mm厚で凍結ミクロトーム(Thermo Fisher HM430)上に取り付け、TBSAF(Tris緩衝生理食塩水(TBS)、30%エチレングリコール、15%スクロース、0.05%ナトリウムアジド)、4℃で保存した。分子生物学評価実験に使用される脳の半分及び内臓器官組織は、ドライアイス中でスナップ凍結し、-80℃で保存した。標準DNA及び/又はRNA抽出プロトコールに従って、それぞれ、ベクターコピー数(VCN)及び遺伝子発現(cDNA)qPCR分析を実施した。
GFP発現の組織分析:
マウス脳におけるGFP発現を、免疫組織化学(IHC)及び免疫蛍光(IHF)によって評価した。
ジアミノベンジジン(DAB)免疫ペルオキシダーゼ染色を用いるフリーフローティングIHC:
脳全体分析又は種々の脳領域(嗅球、前頭前皮質、線条体、海馬、中脳及び小脳)からのそれぞれの切片のいずれかに関する脳切片を選択した。すべての洗浄工程は、1×TBS中、室温(RT)で3回実施した。
すべての脳切片を洗浄し、その後、1xTBS中の30% H2O2(Sigma Aldrich、英国)を用いて30分間処置し、TBST(1xTBS、0.3% Triton X-100)中の15%正常ヤギ血清(Vector Laboratories、英国)を用いて30分間、RTでブロッキングした。サンプルを、一次抗体(Table 6からのウサギ又はニワトリ抗GFP抗体)中、4℃で、軌道シェーカー上で一定撹拌しながら12～14時間インキュベートした。切片を洗浄し、軌道シェーカー上で対応するビオチン化二次抗体(Table 6からの抗ウサギ又は抗ニワトリビオチン化二次抗体)とともにRTで2時間インキュベートした。切片を洗浄し、ベクタステインアビジン-ビオチン溶液(ABC Vector Stain、Vector Laboratories、英国)とともにインキュベートした。切片を洗浄し、反応をDAB(Sigma Aldrich、英国)(20mL TBS、6ml 30% H202中の10mg DAB)を用いて可視化した。氷冷1xTBSを使用して最大7分後に反応を停止し、その後、ガラススライド上にマウントした。
フリーフローティング免疫蛍光:
DAB免疫ペルオキシダーゼ染色と同様のプロトコールを使用した。切片を1xTBSで洗浄し、15%正常ヤギ血清中で30分間ブロッキングした。切片を10%正常ヤギ血清TBSTで希釈した最適の一次抗体(Table 6からの導入遺伝子マーカー及び細胞種マーカー、ウサギ/ニワトリ抗GFP及びウサギ/ニワトリ抗チロシンヒドロキシラーゼ)とともにインキュベートし、4℃で一晩インキュベートした。切片をTBSで洗浄し、RTで覆われた10%正常ヤギ血清で希釈された二次フルオロフォア(Table 6からの抗ニワトリ/ウサギAlexa flour二次抗体)中で2時間インキュベートした。切片を洗浄し、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Sigma Aldrich、英国)を用いて2分間処置し、氷冷1xTBSに移し、次いで、ガラススライド上にマウントした。
顕微鏡:
Leica DM4000Bを使用して光学顕微鏡法及び蛍光イメージングを実施し、すべての画像は、光強度、露出、顕微鏡のキャリブレーション、写真カメラの設定を一定に維持しながらLeica DFC420カメラ及びLeicaアプリケーションスイートV3.7ソフトウェアを使用して取り込んだ(Leica Microsystems、UK)。
GFP染色強度のx40の倍率での10の重複しないRGBの画像の定量的測定を、選択された脳領域:皮質、海馬、線条体、中脳及び小脳での閾値分析によって実施した。前景の免疫染色は、最高と最低シグナルの平均化によって定義し、目的の各領域のフィールドあたりの免疫反応性の平均面積パーセンテージは、Image-Pro 10ソフトウェア(Media Cybernetics、米国)を使用して算出した。
中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの定量化を、TH陽性ニューロン及びベクター駆動性GFP発現細胞をカウントすることによって実施し、二重陽性ニューロンのパーセンテージを算出した。
ベクター発現分析のためのqRT-PCR:
TRIzol(商標)Plus RNA精製キット(Thermo Fisher Scientific、ドイツ)又はRNeasyミニキット(Qiagen、英国)を使用して脳及び臓器からRNAを抽出し、Omega FLUOstar(BMG Labtech、英国)で定量化した。DNアーゼI(DNAse I)精製キット(NEB、英国)を使用して、混入DNAを全RNA(1～2μg)から除去し、その後、High-Capacity cDNA逆転写キット(Applied Bioscience、Thermo Fisher Scientific、ドイツ)を用いて逆転写を実施した。10ngのcDNAを使用し、QuantstudioTMリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、英国)でLuna Taqmanマスターミックス(NEB、英国)を用い、300nMのプライマー(Table 5)を用い、qPCRを実施した。
GFP転写物の定量化のために、GFP及びmGAPDH転写物に対して特異的なプラスミド構築物からの増幅によって作成された標準曲線に対する比較によって標準化を達成した。mGAPDHを内因性対照として使用し、相対変化倍数をベクターゲノムコピー数分析のために記載されるように算出した。
Figure 2023525476000003
Figure 2023525476000004
CNS 1～8構築物設計
本発明におけるプロモーターは、生物情報学分析及び文献レビューの混合によって設計した。
CNS-5_v2、CNS-6_v2、CNS-7_v2及びCNS-8_v2(配列番号5～8)は、プロモーターCNS-5、CNS-6、CNS-7及びCNS-8(配列番号23～26)の長いバージョンである。すなわち、CNS-5_v2、CNS-6_v2、CNS-7_v2及びCNS-8_v2(配列番号5～8)は短縮化されており、最小プロモーターSYNP_CRE151(配列番号12)が、この短いバージョンに付加され、CNS-5、CNS-6、CNS-7及びCNS-8(配列番号23～26)に到達した。これらの合成プロモーターのより長い及び短いバージョン(例えば CNS-5_v2及びCNS-5)の間の高い配列類似性のために、それらは類似した発現を有すると予測され得る。
結果
CNS-1～CNS-8プロモーター(配列番号1～4、23-26)からの、及び対照プロモーターSyn1(配列番号14)からのGFP発現を、矢状断面において最初に評価し、結果は、図2A～Bに示されている。試験されたプロモーターはすべてCNS発現を示し、種々の脳領域全体でさまざまな強度及び分布を有する。
ICV注射された動物では、CNS-1(配列番号1)が最強発現を示し、CNS-3(配列番号3)が最弱を示し、プロモーターの残りは、2つの極値の間にあった。特に、CNS-1(配列番号1)の発現は、対照プロモーターSyn1(配列番号14)からの発現よりも脳においてより強く、より均一であった。
IV注射された動物では、CNS-4(配列番号4)が最強発現を示し、CNS-3(配列番号3)が最弱を示し、プロモーターの残りは、2つの極値の間にあった。プロモーターCNS-1～CNS-8(配列番号1～4、23～26)はすべて、対照プロモーターSyn1よりも弱い発現を示した。
したがって、投与の方法(ICV対IV)は、CNSプロモーターの強度及び分布の両方に影響を及ぼす。
ICVによって送達されたCNS-1～CNS-8(配列番号1～4、23～26)プロモーターからの、及び対照プロモーターSyn1(配列番号14)からのGFP発現を、次いで、冠状断面において評価し、結果は、図3A～Bに示されている。やはり、試験されたプロモーターはすべてCNS発現を示し、種々の脳領域全体でさまざまな強度及び分布を有する。プロモーターCNS-1、CNS-2(配列番号1～2)及びCNS-7(配列番号25)は最強発現を示し、CNS-3(配列番号3)は最弱発現を示し、プロモーターの残りは、2つの極値の間にあった。プロモーターCNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)及びCNS-7(配列番号25)は、対照プロモーターSyn1に対して同様の発現レベルを示す。
IVによって送達されたCNS-1～CNS-8(配列番号1～4、23～26)プロモーターからのGFP発現も冠状断面において評価し、結果は、図4A～Bに示されている。やはり、試験されたプロモーターはすべてCNS発現を示し、種々の脳領域全体でさまざまな強度及び分布を有する。プロモーターCNS-3(配列番号3)は最強発現を示し、CNS-8(配列番号26)は最弱発現を示し、プロモーターの残りは、2つの極値の間にあった。
ICVによって送達されたCNS-1～CNS-8(配列番号1～4、23～26)プロモーターからの、及び対照プロモーターSyn1(配列番号14)からのGFP発現を、次いで、冠状断面においてより高倍率で可視化し、結果は、図5A～Bに示されている。このより高い倍率で、CNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)及びCNS-7(配列番号25)は、広範な頭蓋内発現を示し、CNS-1(配列番号1)は、最強発現を示した。この発現は、CNS-1(配列番号1)及びCNS-2(配列番号2)について、主にニューロン性であると思われた。図11に示されるように、GFPがICV送達においてCNS-1(配列番号1)によって駆動される場合のGFPの主にニューロン性の発現はまた、CNS細胞種についての二重染色で確認された。CNS-7(配列番号25)によって駆動される場合のGFPの発現は、ニューロン性及び星状細胞性であった。CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)は、より弱い発現を示し、これは皮質及び海馬に局在されていた。発現は、CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)の両方について主にニューロン性及び星状細胞性であると思われた。CNS-5(配列番号23)は、皮質、線条体、海馬及び中脳においてより強力に活性であったが、小脳ではあまりそうではなかった。CNS-6(配列番号24)及びCNS-8(配列番号26)は、海馬において強力に活性であり、皮質及び中脳が続き、脳の他の試験された部分では少ない発現であった。CNS-6(配列番号24)及びCNS-8(配列番号26)の発現は、主にニューロン性であると思われた。
IVによって送達されたCNS-1～CNS-8(配列番号1～4、23～26)プロモーターからのGFP発現をまた冠状断面においてより高倍率で可視化し、結果は、図6A～Bに示されている。CNS-1(配列番号1)は、皮質及び海馬において高度に活性であった。中脳から離れたほとんどの試験された領域において少量のCNS-2(配列番号2)発現が見られた。CNS-3(配列番号3)及びCNS-4(配列番号4)は、皮質、線条体及び海馬において発現を示し、CNS-4(配列番号4)を用いた場合に中脳において発現を示し、CNS-3(配列番号3)を用いた場合は示さなかった。CNS-5(配列番号23)は、脳の試験された領域すべてにおいて最小の発現を有していた。CNS-6(配列番号24)は、海馬、中脳及び小脳において発現を有する。CNS-7(配列番号25)は、皮質、海馬及び中脳において発現を示す。CNS-8(配列番号26)は、海馬及び中脳において活性である。
ICVによって送達されたCNS1-8(配列番号1～4、23～26)プロモーター及び対照プロモーターSyn1からの発現は、中脳において更により高倍率で可視化され、結果は、図7A～Bに示されている。CNS1～4(配列番号1～4)及びSyn1(配列番号14)は、中脳において幾分かのGFP発現を示した。ドーパミン作動性ニューロン(TH+)のマーカーを用いる二重染色は、Syn1(配列番号14)プロモーターからの幾分かのGFP発現が、ドーパミン作動性ニューロンに局在しているが、CNS1～4(配列番号1～4)からのGFP発現のわずかのみがドーパミン作動性ニューロンに局在していることを示す。CNS-6(配列番号24)及びCNS-7(配列番号25)は、中脳において最小発現を示した。CNS-5(配列番号23)は、中脳において発現を示したが、 その発現は、ドーパミン作動性ニューロンに局在すると思われなかった。CNS-8(配列番号26)プロモーターによって駆動されたGFP発現の大部分は、ドーパミン作動性ニューロンに局在している。
IVによって送達されたCNS1～8(配列番号1～4、23～26)プロモーターからの発現はまた、中脳において可視化され、結果は図7A～Bに示されている。CNS-1～4(配列番号1～4)は、中脳において最小のGFP発現を示し、GFP陽性であった細胞の大部分は、ドーパミン作動性ニューロンではなかった。CNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)及びCNS-7(配列番号25)は、IV送達後に中脳においてGFP発現を全く示さなかった。他方、CNS-8(配列番号26)は、中脳において強力な発現を示し、GFP発現を示す多数の細胞は、ドーパミン作動性ニューロンであった。
ICVによって、及びIVによって送達されたCNS-1～8(配列番号1～4、23～26)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)の制御下の導入遺伝子GFPの種々の組織における体内分布が、図9に示されている。
ICV送達では、CNS-1～4(配列番号1～4)は、心臓において活性を示し、一方で試験されたプロモーターの残り、CNS-5～8(配列番号23～26)は、心臓では活性ではない。IV送達では、CNS-1～4(配列番号1～4)は、心臓において活性を示し、一方で試験されたプロモーターの残り、CNS-5～8(配列番号23～26)は、心臓では活性ではない。対照プロモーターSyn-1も、ICV送達及びIV送達において心臓において極めて低い活性を示す。
ICV送達では、CNS-1-4(配列番号1～4)、CNS-6(配列番号24)、CNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、肝臓において活性を示し、一方で試験されたプロモーターの残りは示さない。IV送達では、CNS-1～4(配列番号1～4)、CNS-6(配列番号24)、CNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、肝臓において活性を示し、一方で試験されたプロモーターの残りは示さない。
ICV送達では、CNS1～3(配列番号1～3)及びCNS-8(配列番号26)は、腎臓において活性を示し、一方でCNS-4～7(配列番号4、23～25)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、腎臓において活性を示さない。IV送達では、CNS-2～3(配列番号2～3)及びCNS-8(配列番号26)は、腎臓において活性を示し、一方で試験されたプロモーターの残り及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は示さない。
ICV送達では、CNS-3(配列番号3)は、骨格筋において活性を示し、一方でCNS-1～2(配列番号1～2)及びCNS-4～8(配列番号4、23～26)は、骨格筋において活性を示さない。IV送達では、CNS 1～3(配列番号1～3)は、骨格筋において活性を示し、一方でCNS-4～8(配列番号4、23～26)は、骨格筋において活性を示さない。対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、骨格筋において活性を示さない。
ICV送達では、CNS-1(配列番号1)、CNS-7～8(配列番号25～26)は、脾臓において活性を示し、一方でCNS-2～6(配列番号2～4、23～24)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、脾臓において活性を示さない。IV送達では、CNS-2(配列番号2)及びCNS-7～8(配列番号25～26)は、脾臓において活性を示し、一方でCNS-1(配列番号1)、CNS-3～6(配列番号3～4、23～24)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、脾臓において活性を示さない。
mm2あたりのGFP免疫反応性パーセンテージを脳の種々の領域において測定し、結果は図10に示されている。前述のように、GFPは、ICVによって、及びIVによって送達される、CNS-1(配列番号1)、CNS-2(配列番号2)、CNS-3(配列番号3)、CNS-4(配列番号4)、CNS-5(配列番号23)、CNS-6(配列番号24)、CNS-7(配列番号25)、CNS-8(配列番号26)及び対照プロモーターSyn-1(配列番号14)の制御下に置かれた。ICV送達では、対照プロモーターSyn-1(配列番号14)、CNS-1(配列番号1)及びCNS-2(配列番号2)が、皮質において極めて高いGFP免疫反応性パーセンテージを有し、CNS-7(配列番号25)及びCNS-4(配列番号4)が続き、試験されたプロモーターの残りは、皮質においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く示さなかった。IV送達では、対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、皮質において高いGFP免疫反応性パーセンテージを有していたが、試験されたプロモーターの残りは、皮質においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く有さなかった。
ICV送達では、CNS-1(配列番号1)及びCNS-2(配列番号2)が、線条体において極めて高いGFP免疫反応性パーセンテージを有し、CNS-4(配列番号4)、CNS-5(配列番号23)及びCNS-7(配列番号25)が続き、試験されたプロモーターの残りは、線条体においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く示さなかった。IV送達では、CNS-2(配列番号2)及びCNS-3(配列番号3)は、線条体において低いGFP免疫反応性パーセンテージを有し、試験されたプロモーターの残りは、線条体においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く有さなかった。対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、ICV及びIV送達の両方において線条体において極めて高いGFP免疫反応性を示した。
ICV送達では、CNS-1～8(配列番号1～4、23～26)は、海馬において中間の又は高いGFP免疫反応性パーセンテージを示し、対照プロモーターSyn-1(配列番号14)よりも海馬においてより高いGFP免疫反応性パーセンテージを有していた。IV送達では、CNS-1～8(配列番号1～4、23～26)は、海馬においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く有さず、一方で対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、海馬において極めて高いGFP免疫反応性を示した。
ICV送達では、CNS-1(配列番号1)及びCNS-2(配列番号2)が、中脳において極めて高いGFP免疫反応性パーセンテージを有し、CNS-7(配列番号25)、CNS-5(配列番号23)及びCNS-4(配列番号4)が続き、試験されたプロモーターの残りは皮質においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く示さなかった。IV送達では、CNS-1～8(配列番号1～4、23～26)は、中脳においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く示さず、一方で対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、中脳において極めて高いGFP免疫反応性を示した。特に、IV送達におけるCNS-8(配列番号26)は、中脳において極めて低いGFP免疫反応性を示すが、図8Bに示されるように、中脳においてドーパミン作動性ニューロンにおいて活性を示した。
ICV送達では、CNS-1～8(配列番号1～4、23～26)は、小脳において中間の又は低いGFP免疫反応性パーセンテージを示した。CNS-1(配列番号1)及びCNS-5～8(配列番号23～26)のGFP免疫反応性パーセンテージは、対照プロモーターSyn 1(配列番号14)のGFP免疫反応性パーセンテージよりも高かった。IV送達では、対照プロモーターSyn-1(配列番号14)は、小脳において高いGFP免疫反応性パーセンテージを有していたが、試験されたプロモーターの残りは、小脳においてGFP免疫反応性を極めてわずかにしか、又は全く有さなかった。
特に、CNS-1(配列番号1)は、ICV送達において試験された脳領域すべてにおいて領域あたり高い又は中間のGFP免疫反応性パーセンテージを有していた。同様に、CNS-2(配列番号2)は、ICV送達において5つの試験された領域のうち4つ(小脳から離れた)において領域あたり高いGFP免疫反応性パーセンテージを有していた。CNS-8(配列番号26)は、試験された脳領域すべてにおいて領域あたり極めて低いGFP免疫反応性パーセンテージを有するか、又は全く有さなかったが、ドーパミン作動性ニューロンにおける発現を依然として示した。
(実施例2)
CNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの体内分布を、IV及びICV送達においてより高い用量(本明細書において高用量と呼ばれる)で更に調査した。頭蓋内及び静脈内注射を実施例1に記載されるように実施したが、頭蓋内注射で5×1011ウイルスゲノム/仔を注射し、2×1012vg/仔を静脈内注射で注射した(10倍高い用量)。実施例1においてIV及びICV送達において使用された用量は、本明細書において低用量と呼ばれる。
図2B及び図12に示されるように、低用量が投与された場合(実施例1)のCNS-8の制御下のGFPの体内分布は、ICV及びIV送達の両方において矢状断面において高用量が投与された場合(実施例2)のCNS-8の制御下のGFPの体内分布と極めて類似していた。
同様に、図3B、図5B及び図13Aに示されるように、低用量が投与された場合のCNS-8(配列番号26)の制御下のGFPの体内分布は、高倍率及び低倍率でICV送達において冠状断面において、高用量が投与された場合のCNS-8の制御下のGFPの体内分布と極めて類似していた。
図4B、図6B及び図13Bに示されるように、低用量が投与された場合のCNS-8(配列番号26)の制御下のGFPの体内分布は、高倍率及び低倍率でIV送達において冠状断面において高用量が投与された場合のCNS-8の制御下のGFPの体内分布と極めて類似していた。
同様に、図7B、図8B及び図14Aに示されるように、低用量が投与された場合の中脳におけるCNS-8(配列番号26)の制御下のGFP発現は、ICV及びIV送達の両方において高用量が投与された場合のCNS-8(配列番号26)の制御下のGFP発現と極めて類似していた。これは、図14Bに示されるように、ICV及びIV送達の両方において低及び高用量投与間でGFP陽性ドーパミン作動性ニューロンのパーセンテージに相違はなかったことを示したGFP陽性ドーパミン作動性ニューロンの定量化によって支持された。したがって、低及び高用量投与間でCNS-8プロモーター(配列番号26)の制御下でのGFP発現において全体的な相違はなかったが、これは、低用量はドーパミン作動性ニューロンにおいてGFP発現を示すのに十分であるということ及び用量の増大は、より高いGFP発現をもたらさないということを示す。適宜、必要な発現パターンを示す最低用量が好ましい場合がある。
低又は高用量が投与された場合のCNS-8(配列番号26)の制御下の導入遺伝子GFPの種々の組織における体内分布の比較によって、用量がGFP発現に影響を及ぼしたことが示された。肝臓では、ICV送達における用量間でGFP発現は極めて類似していたが、IV送達における低用量では低かった。心臓(hearth)では、低用量ではICV又はIV送達のいずれでもGFP発現は検出されなかったが、高用量では、IV送達においてGFP発現が検出された。同様に、骨格筋では、低用量ではICV又はIV送達のいずれでもGFP発現は検出されなかったが、高用量では、ICV及びIV送達の両方においてGFP発現が検出された。しかし、脾臓では、高用量と比較して低用量において、IV及びICV送達の両方においてより高いGFP発現が検出された。同様に、腎臓では、高用量と比較して低用量において、IV及びICV送達の両方においてより高いGFP発現が検出された。このデータは、異なる用量のウイルスゲノムの投与は、CNS以外の組織において異なる発現パターン及び発現レベルをもたらす場合があることを示す。
したがって、用量を変えることは、CNSにおけるGFP発現及びレベルを変更しなかったが、CNS以外の組織において発現パターン及び発現レベルを変更した。したがって、CNSにおける発現パターン及びレベルを維持しながら、CNS以外の組織における発現パターン及びレベル必要条件に応じて最適用量を見出すことが可能であり得る。例えば、CNSにおける活性並びに肝臓、脾臓及び腎臓における活性が必要であった場合には、ICV又はIVを介して低用量を投与してもよい。或いは、CNSにおける活性並びに少なくとも心臓(heath)及び骨格筋における活性が必要される場合には、IV送達を介して高用量を投与してもよい。
(実施例3)
CNS-5、CNS-5_v2、CNS-2、CNS-3及びCNS-4由来のCRE/近位プロモーターが設計された faf1及びpitx3遺伝子の組織発現パターンは、単細胞トランスクリプトームデータセットにおいて調査された(Zeiselら、2018)。その遺伝子に対するCRE/近位プロモーターの近接のために、CRE/近位プロモーターは遺伝子の調節を補助することが予測される(Heら、2014)。CRE/近位プロモーターがその最も近い遺伝子の発現を調節すると仮定すると、遺伝子の発現パターンによって、CRE/近位プロモーターを含む合成プロモーターの可能性ある発現プロファイルの指標が提供される。
単細胞トランスクリプトームデータセット(Zeiselら、2018)は、成体マウスのCNS及びPNSに由来する任意の種類の500000個の細胞の単細胞RNAシーケンシングを含有する。リソースは、mousebrain.org/genesearch.htmlで公的に入手可能であり、PNSにおける合成プロモーターCNS-5、CNS-5_v2、CNS-2、CNS-3及びCNS-4の可能性ある発現を決定するための有用なツールを提供する。CNS-5、CNS-5_v2、CNS-2、CNS-3及びCNS-4のCRE/近位プロモーターが設計された遺伝子がウェブツールに加えられ、faf1及びpitx3遺伝子の発現パターンは、図16A及び16Bに示されている。灰色の勾配は、データベースにおいて検出されたRNA発現の強度を示す(Zeiselら、2018)。faf1は、多数のPNSニューロンにおいて発現され、そのためfaf1遺伝子から設計されたCRE又は近位プロモーターを含む合成プロモーター、例えば、CNS-5及びCNS-5_v2は、PNSにおいて強力な発現を有すると予測される。pitx3は交感神経PNSニューロンにおいて発現され、そのため、pitx3遺伝子から設計されたCREを含む合成プロモーター、例えば、CNS-2、CNS-3又はCNS-4は、PNS交感神経ニューロンにおいて発現を有すると予測される。lmx1b及びpitx2の同様の分析によって、分析のカットオフスコアより上のPNSにおける発現がないことが示され(3値化(trinization)スコアは0.95未満、データは示していない)、そのため、CNS-1、CNS-6、CNS-6_v2、CNS-7、CNS-7_v2、CNS-8及びCNS-8_v2は、PNSニューロンにおいて活性であると予測されない。
参考文献
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配列情報
Figure 2023525476000005
Figure 2023525476000006
Figure 2023525476000007
Figure 2023525476000008
Figure 2023525476000009
Figure 2023525476000010
Figure 2023525476000011
Figure 2023525476000012
Figure 2023525476000013
シナプシン-1(配列番号14)
Figure 2023525476000014

Claims (34)

  1. 配列番号1～8、21～26のいずれか1つに従う配列又はその機能的バリアントを含む合成CNS特異的プロモーター。
  2. 配列番号1～8、21～26のいずれか1つに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む、請求項1に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  3. 合成CNS特異的プロモーターの機能的バリアントが、参照プロモーターの活性の少なくとも25%、50%、75%、80%、85%、80%、95%又は100%を保持する、請求項1又は2に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  4. 配列番号9～11、28～31のいずれか1つに従う配列又はそれらの機能的バリアントを含むCNS特異的シス調節エレメント(CRE)。
  5. 配列番号9～11、28～31のいずれか1つに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む、請求項4に記載のCNS特異的シス調節エレメント(CRE)。
  6. 請求項4又は5に記載のCREを含む、合成CNS特異的シス調節モジュール(CRM)。
  7. 請求項4又は5に記載のCRE又は請求項6に記載のCRMを含む、合成CNS特異的プロモーター。
  8. 配列番号12～13のいずれか1つに従う配列又はその機能的バリアントを含む、単離された最小又は近位プロモーター。
  9. 配列番号12～13のいずれか1つに対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む、請求項8に記載の単離された最小又は近位プロモーター。
  10. 請求項8又は9に記載の最小又は近位プロモーターを含む合成CNS特異的プロモーター。
  11. 配列番号1又は配列番号21又はそれらの機能的バリアントを含む又はそれらからなり、脳室内(ICV)注射によって投与された場合に脳において広く活性である、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  12. 脳におけるシナプシン-1(配列番号14)の活性の少なくとも100%、150%又は200%のレベルで活性である、請求項11に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  13. 配列番号8又は配列番号26を含む又はそれらからなり、静脈内(IV)注射によって投与された場合に、中脳において活性である、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  14. ドーパミン作動性ニューロンにおいて活性である、請求項13に記載の合成CNS特異的プロモーター。
  15. 発現産物をコードする核酸配列に作動可能に連結した、請求項1、2、3、7、10、11、12、13又は14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーターを含む発現カセット。
  16. 請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター又は請求項15に記載の発現カセットを含むベクター。
  17. ウイルスベクター、例えば、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項16に記載のベクター。
  18. レンチウイルスベクターである、請求項17に記載のベクター。
  19. AAVベクターである、請求項17に記載のベクター。
  20. 請求項17、18又は19のいずれか一項に記載のベクターを含むビリオン。
  21. 請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター、請求項15に記載の発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター又は請求項20に記載のビリオンを含む医薬組成物。
  22. 医薬として使用するための、請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター、請求項15に記載の発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター、請求項20に記載のビリオン又は請求項21に記載の医薬組成物。
  23. 請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター、請求項15に記載の発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター又は請求項20に記載のビリオンを含む細胞。
  24. 医学的状態又は疾患の治療のための医薬組成物の製造において使用するための、請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載の合成CNS特異的プロモーター、請求項15に記載の発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター、請求項20に記載のビリオン又は請求項21に記載の医薬組成物。
  25. 発現産物を生成する方法であって、CNS細胞において請求項15に記載の合成CNS特異的発現カセットを提供する工程及び合成CNS特異的発現カセット中に存在する発現産物を発現させる工程を含む、方法。
  26. 合成CNS特異的発現カセットが、配列番号1又は配列番号21又はそれらの機能的バリアントを含む又はそれらからなり、発現カセットがICV注射によって提供される場合に、発現産物が脳において広く発現される、請求項25に記載の方法。
  27. CNS特異的発現カセットが、脳におけるシナプシン-1(配列番号14)の活性と比較して少なくとも100%、150%又は200%のレベルで発現を駆動する、請求項26に記載の方法。
  28. 合成CNS特異的発現カセットが、配列番号8又は配列番号26又はそれらの機能的バリアントを含む又はそれらからなり、血管内注射によって投与された場合に発現産物が中脳において発現される、請求項25に記載の方法。
  29. 発現産物がドーパミン作動性ニューロンにおいて発現される、請求項28に記載の方法。
  30. CNS細胞において治療用導入遺伝子を発現させる方法であって、CNS細胞中に請求項15に記載の合成CNS特異的発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター又は請求項20に記載のビリオンを導入する工程を含む、方法。
  31. 発現カセット、ベクター又はビリオンが静脈内注射によって導入される、請求項30に記載のCNS細胞において治療用導入遺伝子を発現させる方法。
  32. 注射が、橈側皮静脈、正中静脈又は尺側皮静脈のうち1つにおいてである、請求項31に記載の方法。
  33. それを必要とする対象、好ましくは、ヒトの療法の方法であって、
    - 対象に、請求項1、2、3、7、10、11、12、13若しくは14のいずれか一項に記載のプロモーターに作動可能に連結した治療用産物をコードする配列を含む、請求項15に記載の発現カセット、請求項16、17、18若しくは19に記載のベクター、請求項20に記載のビリオン又は請求項21に記載の医薬組成物を投与する工程、及び
    - 前記対象のCNSにおいて治療用産物の治療量を発現させる工程
    を含む、方法。
  34. ドーパミン作動性ニューロンにおいて発現産物を発現させる方法であって、ドーパミン作動性ニューロン中に、血管内注射によって請求項15に記載の合成CNS特異的発現カセットを導入する工程を含み、CNS特異的発現カセットが、配列番号8又は配列番号26又はそれらの機能的バリアントを含む、方法。
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