JP2023525256A - 脊髄性筋萎縮症を治療する方法及び薬剤 - Google Patents

脊髄性筋萎縮症を治療する方法及び薬剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、被験者に治療有効量のプラスミノ－ゲン経路活性化剤を投与することを含む、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法を開示している。本発明はまた、プラスミノ－ゲン経路活性化剤を含む、脊髄性筋萎縮症薬剤を治療するための医薬組成物、製品及びキットを開示している。

Description

本発明は、損傷した神経を修復し、臨床症状及び徴候を改善するために、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）及び関連障害を患っている被験者に有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分または関連化合物、例えば、プラスミノーゲン、を投与することを含む、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）及び関連障害を治療する方法に関する。
脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）はＳＭＡと略称され、脊髄性筋萎縮または脊柱筋萎縮症とも呼ばれ、脊髄の前角の運動ニューロンの変性によって引き起こされる筋力低下及び筋萎縮の疾患であり、常染色体劣性遺伝病である。ＳＭＡの最も一般的な形態は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、乳児ＳＭＡはこの神経変性疾患の最も重篤な形態である。症状は、筋肉の衰弱、筋緊張低下、泣き声の弱さ、足を引きずるまたは転倒する傾向、吸引または嚥下の困難、肺または喉への分泌物の蓄積、摂食困難、及び呼吸器感染症への感受性を含む。脚は腕よりも弱くなる傾向があり、上を見たり座ったりするなどの発達マーカーに到達できない。一般的に、症状が現れるのが早いほど寿命は短くなる。
ＳＭＡの進行は、運動ニューロン細胞が劣化する速度及びそれによる衰弱の程度に直接関係している。重度のＳＭＡの乳児は、呼吸を支える筋肉の衰弱による呼吸器疾患で死亡することがよくある。軽度のＳＭＡの子供は長く生きるが、広範な医療サポートが必要になる場合がある。
脊髄性筋萎縮症は、患者の発症年齢と疾患の重症度に応じて次の５つのサブタイプに分類される。
０型患者：一般に胎児または新生児に多い。胎児期の発症は胎児の動きの減少として現れ、新生児は筋肉反射の喪失、顔面麻痺、心房中隔欠損及び関節拘縮として現れ、最も深刻な症状は呼吸不全であり、病気の子供の平均余命は大幅に短縮され、ほとんどの生存期間は６ヶ月以内である。
Ｉ型患者：Ｗｅｒｄｎｉｇ－Ｈｏｆｆｍａｎ病とも呼ばれる乳児型であり、ＳＭＡ患者の５０％を占める。患者は生後６ヶ月以内に筋緊張低下、頭のコントロール不良、腱反射の減少または消失を示す。重度の筋緊張低下は、横になったときに「カエルの脚」として現れ、頭を制御できず、真っ直ぐに座ることができず、肋間筋が弱く、横隔膜の筋肉が比較的小さく、患者はしばしば嚥下機能の低下、呼吸筋の衰弱があり、それによって呼吸不全を起こす。補助換気がない場合、Ｉ型ＳＭＡの小児の９２％は通常、２０ヶ月前に呼吸不全で死亡する。
II型患者：ＳＭＡ患者の約２０％を占める中間型であり、通常生後６～１８ヶ月で発症し、発達過程のある段階では患者は自力で座ることができるが、自力で歩くことはできない。このような患者は、脊柱側弯症、関節拘縮、下顎関節の強直などの合併症に苦しむことが多く、脊柱側弯症や肋間筋の衰弱は、重度の肺疾患につながることがよくある。これらの子供の認知能力は正常である。
ＩＩＩ型患者：Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ－Ｗｅｌａｎｄｅｒ病としても知られる若年型であり、ＳＭＡ患者の約３０％を占め、患者は通常生後１８ヶ月から５年以内に発症し、補助的なサポートの助けを借りて歩くことができる。ＩＩ型ＳＭＡとは異なり、これらの人々のほとんどは脊柱側弯症や呼吸筋力低下などの合併症を有しておらず、このグループの認知及び平均余命は一般にこの疾患の影響を受けない。
ＩＶ型患者：思春期以降に発症し、運動能力は徐々に低下し、ＳＭＡ患者の総数の約５％を占めている。ＩＩＩ型に似ているが、成人期に発症し、通常３０代以降に発症すると考えられている。
ＳＭＡは、２つの染色体上の遺伝子（ＳＭＮ１）のテロメアコピーの不活性化変異または欠失によって引き起こされ、その結果、ＳＭＮ１遺伝子の機能が失われることによって引き起こされる。ＳＭＮ１タンパク質は、ＲＮＡ成熟の補因子として機能し、すべての真核細胞の生存に必要である（Ｔａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｔｉｚｚａｎｏ（２０１７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４（９）：５２９－５３３）。ＳＭＮ２タンパク質は、ＲＮＡメッセージのスプライシングで機能する単一の変異を除いて、ＳＭＮ１とほぼ同じである。すべてのＳＭＡ患者は遺伝子（ＳＭＮ２）のセントロメアのコピーを保持しており、ＳＭＡ患者のＳＭＮ２遺伝子のコピー数は一般に疾患の重症度と負の相関があり、つまり、ＳＭＡの重症度が低いほど、患者のＳＭＮ２のコピーが多くなる。それにもかかわらず、エクソン７の翻訳的にサイレントなＣからＴへの突然変異によって引き起こされるエクソン７の選択的スプライシングのせいで、ＳＭＮ２は、ＳＭＮ１機能の損失を完全に補償することはできない。したがって、ＳＭＮ２によって生成される転写産物の大部分は、エクソン７（Δ７ ＳＭＮ２）を欠いており、損なわれた機能を有する急速にトランケートされたＳＭＮタンパク質に分解されるものをコードしている。ＳＭＡの原因はＳＭＮ１遺伝子の欠失であるが、ＳＭＮ２遺伝子はＳＭＮ１遺伝子の機能を補うために体内に存在する。ＳＭＮ２遺伝子は、エクソン７のＣからＴへの変異によってＳＭＮ１遺伝子とは異なる。この変異したＳＭＮ２遺伝子のほとんどは、切断されたＳＭＮ遺伝子とＳＭＮタンパク質を生成し、約１０％は完全長の正しいＳＭＮ遺伝子とＳＭＮタンパク質を生成する。切断されたＳＭＮタンパク質も完全長のＳＭＮタンパク質と同様の機能を果たすが、半減期が短く、すぐに分解される。
ＳＭＮ２のコピー数は人によって異なる。ＳＭＮ１遺伝子が存在しない場合、体内のＳＭＮ２遺伝子のコピー数によって、基本的にＩ型（ＳＭＮ２の２つのコピー）、ＩＩ型（ＳＭＮ２の３つのコピー）、またはＩＩＩ型（ＳＭＮ２の４つのコピー）のどちらのＳＭＡに罹患するかが決まる。したがって、切断されたＳＭＮ遺伝子及びタンパク質の追加でさえ、疾患の重症度を軽減する上で重要な役割を果たす可能性がある。
臨床的には、ＳＭＡは通常、少なくとも１つのＳＭＮ１遺伝子のコピーの検査と組み合わせた臨床症状によって診断される。場合によっては、ＳＭＮ１遺伝子検査で異常が見られない場合、筋電図検査（ＥＭＧ）や筋生検などの他の検査も診断に役立つ。これまでのところ、ＳＭＡの治療は、呼吸、栄養、リハビリテーションの治療とケアを含む支持療法に限定されており、この疾患を効果的に治療できる薬はない。
本発明は研究によって、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン経路活性化剤がＳＭＡ被験者の神経損傷の症状を大幅に改善し、肺機能を改善し、生存期間を延長し、ＳＭＮ遺伝子の転写及び発現を促進し、脳組織と筋肉組織におけるＳＭＮタンパク質レベルを増加させ、脳組織と筋肉組織におけるＮＦ－κＢタンパク質などの転写因子の発現を促進し、脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進し、肺組織の損傷を改善し、それによってＳＭＡを効果的に予防及び治療できることを発見した。
一態様では、本発明は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などのニューロン疾患を患っている被験者に投与することを含む、（０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及び非５ｑ型ＳＭＡを含む）脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に関する。
いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、（０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及び非５ｑ型ＳＭＡを含む）前記脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を患っている被験者に対して、１．ＳＭＡの重症度を軽減または改善する活性；２．ＳＭＡの発症を遅らせる活性；３．ＳＭＡの進行を阻害する活性；４．被験者の生存時間を延長する活性；５．被験者の生活の質を改善する及び／または被験者の精神状態を改善する活性；６．ＳＭＡ関連症状の数を減らす活性；７．ＳＭＡに関連する１つまたは複数の症状の重症度を軽減または改善する活性；８．ＳＭＡ関連症状の期間を短縮する活性；９．ＳＭＡ関連症状の再発を予防する活性；１０．ＳＭＡ症状の発症または発作を抑制する活性；１１．ＳＭＡ関連症状の進行を抑制する活性；１２．肺機能を改善する活性；１３．血中酸素飽和度を改善する活性；１４．ＳＭＮ遺伝子の転写及び発現を促進する活性（１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進すること、あるいは２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進することを含む）；１５．脳組織及び筋肉組織におけるＳＭＮタンパク質のレベルを増加させる活性；１６．脳組織及び筋肉組織におけるＮＦ－κＢタンパク質などの転写因子の発現を促進する活性；１７．脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進する活性；１８．肺組織の損傷を軽減する活性；１９．筋力を高める活性；２０．筋萎縮を軽減する活性；２１．運動ニューロンの損失を軽減する活性；２２．成長、発達を促進する活性；及び／または２３．運動機能を改善する活性から選択される１つ以上の活性を有する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者の筋萎縮を改善し、筋力を増加させ、及び／または筋緊張を改善する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者の筋力、筋緊張、運動機能、呼吸機能及び筋萎縮からなる群から選択される１つ以上を改善する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者の生存期間を延長する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進する（１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進すること、あるいは２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進することを含む）。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者の筋肉機能の回復を促進する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者における脊髄前角ニューロン損傷の修復を促進する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者におけるＮＦ－κＢタンパク質などの転写因子の発現を促進し、例えば、脳または脊髄組織におけるＮＦ－κＢタンパク質などの転写因子の発現を促進する。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者における成熟ＮＧＦの形成を促進する。前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者における成熟ＮＧＦの形成を促進する。
いくつかの実施形態では、本願は、ＳＭＡ被験者に治療有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＳＭＡを治療する方法に関し、前記プラスミノーゲンは、１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進する活性（効果）、ならびに２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進する活性（効果）からなる群より選択される１つ以上の活性（効果）を有する。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、
１）プラスミノーゲンの血液脳関門及び血液脊髄関門の通過を促進する効果、
２）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄組織へのプラスミノーゲンの蓄積を促進する効果、
３）ＳＭＡ被験者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）へのプラスミノーゲンの蓄積を促進する効果、
４）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルを増加させる効果、
５）ＳＭＡ被験者の損傷組織の局所（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）におけるプラスミノーゲンのレベルを増加させる効果、
６）ＳＭＡ被験者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）への損傷を軽減する効果、
７）ＳＭＡ患者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）の炎症修復を促進する効果、
８）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写を促進する効果、
９）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮタンパク質（１．切断されたＳＭＮ２タンパク質；または２．完全長ＳＭＮタンパク質を含む）のレベルを増加させる効果、
１０）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＮＧＦの発現を促進する効果、ならびに
１１）ＳＭＡ被験者の成長と発達を促進する効果
からなる群より選択される１つ以上の効果をさらに有する。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、１つまたは複数の他の薬剤及び／または治療方法と組み合わせて使用され、好ましくは、前記治療方法は、細胞療法（例えば、幹細胞療法）及び遺伝子療法、例えば、アンチセンスＲＮＡ、小分子スプライシング修飾因子などを含む。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分である。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン（ＰＬＧと略称）、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである。いくつかの特定の実施形態では、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２アンチプラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である。
いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノゲン活性化経路の成分はプラスミノーゲンである。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性またはリジン結合活性を有する。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンはヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む。
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性、及びプラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインまたはプラスミノーゲンのプロテアーゼドメインを含むかまたは有する。一部の特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性フラグメントのアミノ酸配列は配列１４に示される。一部の特定の実施形態において、プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（ヒト全長プラスミノーゲン）、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン（７６～７７番目のアミノ酸の間で切断されたヒト全長プラスミノーゲン）、ミニプラスミノーゲン（Ｋｒｉｎｇｌｅ ５（Ｋ５）及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、マイクロプラスミノーゲン(セリンプロテアーゼドメインを含む)、δ－プラスミノーゲン(Ｋｒｉｎｇｌｅ 1及びセリンプロテアーゼドメインを含む)またはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、ヒト全長プラスミノーゲンであるか、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した変異体またはフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性、及びプラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。
一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は全身または局所にて投与され、例えば、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬によって投与される。一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ２、１～２００ｍｇ／ｃｍ２、１～１００ｍｇ／ｃｍ２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で、毎日、２日ごと、または３日ごとに連続して投与する。
いくつかの実施形態では、上記のＳＭＡは、０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、または非５ｑ型のＳＭＡである。
一態様では、本出願はまた、上記のプラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、上記のプラスミノーゲンなどの上記のプラスミノーゲン活性化経路の成分を含む、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療のための医薬組成物、薬剤、製剤、キット、及び製品に関する。
一部の実施形態では、前記医薬組成物、薬剤、及び製剤は、薬学的に許容される担体及びプラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、上記のプラスミノーゲンなどの上記のプラスミノーゲン活性化経路の成分を含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、前記医薬組成物、薬剤または製剤を含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、ラベルまたはプロトコールをさらに含み、前記ラベルまたはプロトコールは、プラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、上記のプラスミノーゲンなどの上記のプラスミノーゲン活性化経路の成分を使用して脊髄性筋萎縮症を治療する方法を指示する。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の容器をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記のＳＭＡは、０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、または非５ｑ型のＳＭＡである。
一態様では、本願はまた、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療に使用するための、上記のプラスミノーゲン経路活性化剤、例えば上記のプラスミノーゲンにも関する。いくつかの実施形態では、上記のＳＭＡは、０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、または非５ｑ型のＳＭＡである。
一態様では、本願はまた、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療における、上記のプラスミノーゲン経路活性化剤、例えば上記のプラスミノーゲンの使用にも関する。いくつかの実施形態では、上記のＳＭＡは、０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、または非５ｑ型のＳＭＡである。
一態様では、本出願はまた、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する医薬組成物、薬剤、製剤、キット、及び製品の調製における、治療有効量の上記プラスミノーゲン経路活性化剤（例えば、上記のプラスミノーゲンなどの上記プラスミノーゲン活性化経路の成分）の使用にも関する。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上のプラスミノーゲン経路活性化剤である。
いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分は、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである。いくつかの特定の実施形態では、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２アンチプラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分である。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン（ＰＬＧと略称）、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである。いくつかの特定の実施形態では、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２アンチプラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である。
いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノゲン活性化経路の成分はプラスミノーゲンである。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性、及びプラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインまたはプラスミノーゲンのプロテアーゼドメインを含むかまたは有する。一部の特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性フラグメントのアミノ酸配列は配列１４に示される。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（ヒト全長プラスミノーゲン）、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン（７６～７７番目のアミノ酸の間で切断されたヒト全長プラスミノーゲン）、ミニプラスミノーゲン（Ｋｒｉｎｇｌｅ ５（Ｋ５）及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、マイクロプラスミノーゲン(セリンプロテアーゼドメインを含む)、δ－プラスミノーゲン(Ｋｒｉｎｇｌｅ 1及びセリンプロテアーゼドメインを含む)またはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。一部の特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、ヒト全長プラスミノーゲンであるか、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した変異体またはフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性、及びプラスミノーゲンと基質分子のリジン結合活性である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、上記のプラスミノーゲンなどの上記のプラスミノーゲン活性化経路の成分は、１つまたは複数の他の薬剤または治療方法と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分は、例えば、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬によって投与される。
一部の実施形態では、前記医薬組成物、薬剤、及び製剤は、薬学的に許容される担体及びプラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分を含む。いくつかの実施形態では、前記キット及び製品は、前記医薬組成物、薬剤または製剤を含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、ラベルまたはプロトコールをさらに含み、前記ラベルまたはプロトコールは、プラスミノーゲン経路活性化剤、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分を使用して脊髄性筋萎縮症を治療する方法を指示する。
いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の容器をさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記のＳＭＡは、０型、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、または非５ｑ型のＳＭＡである。
本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。
図１は、実施例１に記載のＩＩ型ＳＭＡ患者の治療前及び治療後の運動神経の筋電図振幅の結果を示す図である。その結果、治療前と比較して、患者の脛骨神経及び総腓骨神経の活動電位の振幅はさまざまな程度に増加した。この結果は、プラスミノーゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者の末梢ニューロンの伝導機能を改善し、神経筋損傷を改善できることを示している。 図２は、実施例２に記載の患者の治療前後の上肢及び下肢の運動神経の筋電図振幅の結果を示す図である。治療前と比較して、患者の左大腿神経、右尺骨神経、両側総腓骨神経及び脛骨神経の活動電位の振幅はさまざまな程度に増加した。この結果は、プラスミノーゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者の末梢ニューロンの伝導機能を改善し、神経筋損傷を改善できることを示している。 図３は、実施例３に記載の患者の治療前後の上肢及び下肢の運動神経の筋電図振幅の結果を示す図である。治療前と比較して、患者の両側の正中神経、脛骨神経、総腓骨神経、及び尺骨神経の活動電位の振幅はさまざまな程度に増加した。この結果は、プラスミノーゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者の末梢ニューロンの伝導機能を改善し、神経筋損傷を改善できることを示している。 図４は、プラスミノーゲン治療中の実施例１～３に記載の３人の患者におけるＨＦＭＳＥスコアの変化を示す図である。 図５は、プラスミノーゲン治療中の実施例６のＩ型ＳＭＡ患者の身長の変化を示す図である。その結果、患者の体重は投薬期間中に徐々に増加し、正常な標準範囲内で変動することが示された。 図６は、プラスミノーゲン治療中の実施例６～１０の５人のＩ型ＳＭＡ患者のＣＨＯＰスコアの変化を示す図である。 図７Ａ～Ｂは、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの生存曲線及び生存時間の統計結果を示す図である。Ａは生存曲線の統計結果であり、Ｂは生存時間の統計結果である。生存曲線の統計結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの生存曲線を有意に改善できることを示し、その差は統計的に有意であった（Ｐ＝０．０２９）。生存時間の統計結果は、溶媒群のマウスの生存時間の中央値が１４日であり、すべてのマウスが１５日目に死亡し、投与群の生存時間の中央値が１６日であり、すべてのマウスが１７日目に死亡したことを示し、統計分析の差は有意であった（Ｐ＝０．０３）。これは、プラスミノーゲンがＳＭＡモデルマウスの生存時間を延長できることを示している。 図８は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脊髄におけるＳＭＮ遺伝子のｑＰＣＲ検出結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄には一定レベルのＳＭＮ遺伝子転写があり、溶媒群のマウスのＳＭＮ遺伝子転写レベルはブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスにおけるＳＭＮ遺伝子の転写レベルは、溶媒群のマウス及びブランク対照群のマウスよりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮ遺伝子の転写を促進できることを示唆している。 図９は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスにおける脳ＮＦ－κＢタンパク質のウエスタンブロット検出結果及び光学密度の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳には一定量のＮＦ－κＢタンパク質があり、溶媒群のマウスの脳におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの脳におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０５）。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳組織におけるＮＦ－κＢタンパク質レベルの増加を促進できることを示唆している。 図１０は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの代表的な後肢筋におけるＮＦ－κＢタンパク質のウエスタンブロット検出結果及び光学密度の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉には一定量のＮＦ－κＢタンパク質があり、溶媒群のマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質レベルの増加を促進できることを示唆している。 図１１は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの代表的な脳ＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット検出結果及び光学密度（ＯＤ）値の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳は一定量のＳＭＮタンパク質を発現し、溶媒群のマウスのＳＭＮタンパク質の発現レベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスのＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示唆している。 図１２は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの代表的な後肢筋におけるＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット検出結果及び光学密度（ＯＤ）値の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉は一定量のＳＭＮタンパク質を発現し、溶媒群のマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示唆している。 図１３Ａ～Ｂは、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの後脳組織のウエスタンブロット検出結果及びＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ光学密度（ＯＤ）値の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比があり、投与群のマウスの脳組織のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比は溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＡモデルマウスの脳組織においてＰｒｏＮＧＦからＮＧＦへの変換を促進し、成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。 図１４は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの代表的な肺組織のＨ＆Ｅ染色の結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織の末端細気管支上皮細胞が整然と配置され、明確に区別できた；肺胞腔のサイズは均一であり、肺胞中隔は肥厚せず、血管の周囲に炎症細胞の浸潤は見えなかった；溶媒群のマウスの肺組織の呼吸細気管支上皮が脱落し、肺胞管及び肺胞嚢が拡大し、肺胞中隔が広がり、肺胞が崩壊して構造が乱れ、肺血管周囲には好酸球、泡沫細胞及びリンパ球が存在した；投与群のマウスの肺組織の呼吸細気管支上皮は整然と並び、肺胞管及び肺胞嚢が拡大し、肺胞腔も均等に拡大したが、単層の肺胞上皮からなる肺胞壁が見られた。これは、プラスミノーゲンが、ＳＭＡモデルマウスの肺組織損傷を改善できることを示唆している。 図１５Ａ～Ｄは、９日間投与されたＳＭＡマウスの肺組織のＦ４／８０免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群であり、Ｄは単位面積あたりのＦ４／８０陽性細胞の統計結果である。その結果、ブランク対照群の肺組織には一定レベルのＦ４／８０陽性細胞があり、溶媒群のマウスの肺組織におけるＦ４／８０陽性細胞のレベルは有意に増加し、投与群のマウスのＦ４／８０陽性細胞レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に低く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの損傷した肺組織の炎症修復を有意に促進できることを示している。 図１６は、プラスミノーゲンを９日間投与したＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脊髄におけるＳＭＮΔ７ ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。その結果、投与後のマウスの脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写レベルは、溶媒群よりも有意に高く、Ｐ値は０．００２であった。これは、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写を促進し、機能的なＳＭＮタンパク質の増加を促進できることを示している。 図１７Ａ～Ｃは、プラスミノーゲンを９日間投与したＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの筋肉組織のＨ＆Ｅ染色の代表的な写真である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉組織の筋繊維細胞体はほとんど丸く、サイズが均一であり、平行に配置されており、細胞核は筋鞘の内側に位置しており、溶媒群と比較して、投与群の筋線維細胞間質はよりタイトであった。これは、プラスミノーゲンが、ＳＭＡマウスの筋肉組織の損傷を軽減できることを示唆している。 図１８Ａ～Ｃは、プラスミノーゲンを９日間投与したＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳組織のＨ＆Ｅ染色の代表的な写真である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの大脳皮質の各層のニューロンの構造は明らかであり、内錐体細胞層の錐体細胞には豊富な細胞質があり、上部に厚い主要な樹状突起が見られ、核小体は明確であった；溶媒群のマウスの大脳皮質は、各層のニューロン数が減少し、構造があまり明確ではなく、錐体細胞が特定しにくく、脳組織が緩んでいた；溶媒群と比較して、投与群では各層のニューロンの数が増加し、錐体細胞は内錐体細胞層に見られ、小さな錐体細胞も多形細胞層に見られ、脳組織は比較的コンパクトであった。これは、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの脳組織の損傷を軽減できることが示唆している。 図１９は、プラスミノーゲン持続投与後、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの肺組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルは１．２２±１．１２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルは２．３６±０．８７ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約１．９倍であった；投与群のマウスの肺組織中のプラスミノーゲンレベルは９６．９４±２０．４９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約４１倍であった。これは、ＳＭＡの条件下では、プラスミノーゲンが肺組織に蓄積し、肺組織のプラスミノーゲンが不足しており、プラスミノーゲンを補充することで、プラスミノーゲンの肺組織への蓄積がさらに促進されることを示唆している。 図２０は、プラスミノーゲン持続投与後、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡ筋肉組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノーゲンのレベルが５．９５±３．８４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１５．１１±１０．３８ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約２.５倍であった；投与群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノーゲンのレベルは９０１．３０±３９８．５１ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約６０倍であった。これは、ＳＭＡの条件下では、プラスミノーゲンが筋肉組織に蓄積し、筋肉組織のプラスミノーゲンが不足しており、プラスミノーゲンを補充することで、プラスミノーゲンの筋肉組織への蓄積がさらに促進されることを示唆している。 図２１は、プラスミノーゲン連続投与後のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群の野生型マウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．１８±１．５４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．４９±１．５９ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルは有意に変化しなかった；投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスのプラスミノーゲンのレベルは１２．０９±５．３２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約８倍であった。これは、プラスミノーゲンを補給すると、ＳＭＡ疾患条件下でプラスミノーゲンに対する血液脳関門の透過性の増加が促進され、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過して脳に到達できることを示唆している。 図２２は、プラスミノーゲン持続投与後、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡ脊髄組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群の野生型マウスにおける脊髄プラスミノーゲンのレベルが８．５１±９．５１ｎｇ／ｍｇであった。溶媒群ＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは１９．９５±４．０６ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群よりわずかに増加した。正常投与対照群のプラスミノーゲンのレベルは１３．０３±７．５１ｎｇ／ｍｇであった。投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄プラスミノーゲンのレベルは６２．３３±１７．３７ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの約３倍であり、投与群と溶媒群の比較統計解析のＰ値は０．０２９であり、正常投与対照群の約４．８倍であり、投与群と正常投与対照群の比較統計解析のＰ値は０．０２６であった。これは、プラスミノーゲンの投与が、ＳＭＡの条件下でプラスミノーゲンの血液脊髄関門への透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に到達できることを示している。 図２３は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにプラスミノーゲンを１回尾静脈注射した２時間後、脊髄ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ検出の結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルが２．７０±０．７４ｎｇ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルは３．１７±１．５１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは１２１．１６±４４．６８ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約３８．２倍であった。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノーゲンの血液脊髄関門への透過性の増加を促進でき、この条件下では、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して中枢神経系に入ることができることを示唆している。 図２４は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにプラスミノーゲンを１回尾静脈注射した２時間後、脊髄ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルの酵素基質動態法の検出結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルが０．０００１１±４．５１ｘ１０－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルが０．０００１０±９．７２×１０－６Ｕ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは０．０００３４±１．０４×１０－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群と比較して、統計解析のＰ値は０．０５８であった。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳ誘発肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの血液脊髄関門へのプラスミノーゲンの透過性の増加を促進でき、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に蓄積できることを示唆している。 図２５は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにプラスミノーゲンを１回尾静脈注射した２時間後、肺組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ検出の結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．４９±０．４７ｎｇ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルは３．６７±１．０１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約２．５倍であった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルは５６２．６８±１０２．８５ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約１５３倍であった。これは、プラスミノーゲンを補給することで、プラスミノーゲンが損傷部位に特異的に蓄積して損傷を修復できることを示唆している。 図２６は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにプラスミノーゲンを１回尾静脈注射した２時間後、肺ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルに関する酵素基質動態法の検出結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルが０．０００２２±１．３１ｘ１０－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳでＳＭＡヘテロ接合マウスに急性肺炎を誘発した後、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノーゲンのレベルは０．０００３３±３．７０×１０－５Ｕ／ｍｇに上昇した；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを投与してから２時間後、プラスミノーゲンのレベルは０．００２３±１．７８×１０－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群の約７倍であった。これは、ＬＰＳ誘発性肺組織損傷後、プラスミノーゲンが損傷部位に蓄積し、プラスミノーゲンの補給が損傷部位のプラスミノーゲンレベルの増加を有意に促進できることを示している。 図２７Ａ～Ｄは、９日間投与されたＳＭＡマウスの脊髄組織のＮＧＦ免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄が一定レベルのＮＧＦを発現し、溶媒群のマウスの脊髄におけるＮＧＦの発現レベルが有意に低下し、投与群のマウスの脊髄におけるＮＧＦの発現レベルが、溶媒群よりも優位に高く、２つの群間の統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの脊髄のＮＧＦの発現を促進できることを示している。 図２８は、９日間投与したＳＭＡマウスの脊髄組織における全長ＳＭＮ遺伝子のＰＣＲ検出結果を示す図である。その結果、投与群の脊髄組織における全長ＳＭＮ ｍＲＮＡのレベルが溶媒群よりも有意に高く、その差が統計的に有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、ＳＭＡモデルマウスの脊髄における全長ＳＭＮ遺伝子の転写を促進できることを示している。 図２９は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの立ち直り試験の試験結果を示す図である。その結果、溶媒群のマウスの立ち直り時間は、ブランク対照群のマウスよりも有意に長く、その運動能力が大幅に低下したが、プラスミノーゲン投与後、溶媒群マウスと比較して、運動能力を改善し、ＳＭＡマウスの立ち直り時間を短縮することができた。Ｐ値は０．０５に近かったが、個数のせいでその差はまだ統計的有意性に達していなかった。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの運動能力を改善し、疾患の進行を遅らせることができることを示している。 図３０は、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスにおけるチューブテストのスコア結果を示す図である。その結果、溶媒群のマウスのＴＴＳスコアは、ブランク対照群の野生型マウスのスコアよりも有意に低く、投与群にプラスミノーゲンを投与した後、ＳＭＡマウスのスコアが改善され、マウスの運動機能の低下傾向が改善された。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＡマウスの神経筋機能の低下を改善し、疾患の進行を遅らせることができることを示している。
発明の詳細な説明
「脊髄性筋萎縮（症）」（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）という用語は、２つの染色体上のＳＭＮ１遺伝子の不活性化変異または欠失によるＳＭＮ１遺伝子の機能の喪失によって引き起こされる疾患を指す。ＳＭＡの症状として、筋肉の衰弱、筋緊張低下、泣き声の弱さ、弱い咳、足を引きずるまたは転倒する傾向、吸引または嚥下の困難、呼吸困難、肺または喉への分泌物の蓄積、握りこぶし及び汗まみれの手、舌のばたつき/振動、しばしば片側に傾く頭（横になっている場合でも）、脚が腕よりも弱くなる傾向、しばしば「カエルの脚」として現れる脚、摂食困難、呼吸器感染症への感受性の向上、腸／膀胱の衰弱、通常よりも低い体重、支えなしで座ることができないこと、歩くことができないこと、這うことができないこと、筋緊張減弱、反射の喪失、及び前角細胞の喪失に関連する多発性先天性拘縮（関節拘縮）が挙げられる。
本明細書における「脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する」または「脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療」という用語は、１．ＳＭＡの重症度を軽減または改善する効果；２．ＳＭＡの発症を遅らせる効果；３．ＳＭＡの進行を阻害する効果；４．被験者の生存時間を延長する効果；５．被験者の生活の質を改善する及び／または被験者の精神状態を改善する効果；６．ＳＭＡ関連症状の数を減らす効果；７．ＳＭＡに関連する１つまたは複数の症状の重症度を軽減または改善する効果；８．ＳＭＡ関連症状の継続期間を短縮する効果；９．ＳＭＡ関連症状の再発を予防する効果；１０．ＳＭＡ症状の発症または発作を抑制する効果；１１．ＳＭＡ関連症状の進行を抑制する効果；１２．肺機能を改善する効果；１３．血中酸素飽和度を改善する効果；１４．ＳＭＮ遺伝子の転写及び発現を促進する効果（１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進すること、あるいは２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進することを含む）；１５．脳組織及び筋肉組織におけるＳＭＮタンパク質のレベル（１．切断されたＳＭＮ２タンパク質、または２．完全長ＳＭＮタンパク質を含む）を増加させる効果；１６．脳組織及び筋肉組織におけるＮＦ－κＢタンパク質の発現を促進する効果；１７．脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進する効果；１８．肺組織の損傷を軽減する効果；１９．筋力を高める効果；２０．筋萎縮を軽減する効果；２１．運動ニューロンの損失を軽減する効果；２２．成長、発達を促進する効果；及び／または２３．運動機能を改善する効果から選択される１つ以上の効果を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、本願のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物、例えば、上記のプラスミノーゲンは、ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を増強する。いくつかの実施形態では、本願のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物、例えば、上記のプラスミノーゲンは、それを必要とするヒト被験者においてＳＭＮタンパク質の発現を増加させる。
いくつかの実施形態では、本願のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物、例えば、プラスミノーゲンは、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用して、ＳＭＮ遺伝子の不活化変異または欠失によって引き起こされる疾患及び／またはＳＭＮ遺伝子機能の喪失または欠乏に関連する疾患を治療または予防することができる。これらの疾患は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含むが、それに限定されない。
いくつかの実施形態では、本願は、治療有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物、例えばプラスミノーゲンを被験者に投与することを含む、ＳＭＮ遺伝子の不活化変異または欠失によって引き起こされる、及び／またはＳＭＮ遺伝子の喪失または欠陥に関連する、ＳＭＡなどの疾患を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、本願は、被験者に治療有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＳＭＡを治療する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本願は、被験者に治療有効量の、１．ＳＭＡの重症度を軽減または改善する活性；２．ＳＭＡの発症を遅らせる活性；３．ＳＭＡの進行を阻害する活性；４．被験者の生存時間を延長する活性；５．被験者の生活の質を改善する及び／または被験者の精神状態を改善する活性；６．ＳＭＡ関連症状の数を減らす活性；７．ＳＭＡに関連する１つまたは複数の症状の重症度を軽減または改善する活性；８．ＳＭＡ関連症状の継続期間を短縮する活性；９．ＳＭＡ関連症状の再発を予防する活性；１０．ＳＭＡ症状の発症または発作を抑制する活性；１１．ＳＭＡ関連症状の進行を抑制する活性；１２．肺機能を改善する活性；１３．血中酸素飽和度を改善する活性；１４．ＳＭＮ遺伝子の転写及び発現を促進する活性（１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進すること、あるいは２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進することを含む）；１５．脳組織及び筋肉組織におけるＳＭＮタンパク質のレベル（１．切断されたＳＭＮ２タンパク質、または２．完全長ＳＭＮタンパク質を含む）を増加させる活性；１６．脳組織及び筋肉組織におけるＮＦ－κＢタンパク質の発現を促進する活性；１７．脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進する活性；１８．肺組織の損傷を軽減する活性；１９．筋力を高める活性；２０．筋萎縮を軽減する活性；２１．運動ニューロンの損失を軽減する活性；２２．成長、発達を促進する活性；及び／または２３．運動機能を改善する活性から選択される１つ以上の活性を有するプラスミノーゲンを投与することを含む、ＳＭＡを治療する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本願は、ＳＭＡ被験者に治療有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＳＭＡを治療する方法に関し、前記プラスミノーゲンは、１．切断されたＳＭＮ２遺伝子の転写及び／または発現を促進する活性（効果）、ならびに２．完全長ＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進する活性（効果）からなる群より選択される１つ以上の活性（効果）を有する。
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、
１）プラスミノーゲンの血液脳関門及び血液脊髄関門の通過を促進する効果または活性、
２）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄へのプラスミノーゲンの蓄積を促進する効果または活性、
３）ＳＭＡ被験者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）へのプラスミノーゲンの蓄積を促進する効果または活性、
４）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルを増加させる効果または活性、
５）ＳＭＡ被験者の損傷組織の局所（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）におけるプラスミノーゲンのレベルを増加させる効果または活性、
６）ＳＭＡ被験者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）への損傷を軽減する効果または活性、
７）ＳＭＡ被験者の損傷組織（例えば、中枢神経組織(脳及び脊髄)、肺、筋肉組織）の炎症修復を促進する効果または活性、
８）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写を促進する効果または活性、
９）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮタンパク質（１．切断されたＳＭＮ２タンパク質；または２．完全長ＳＭＮタンパク質を含む）のレベルを増加させる効果または活性、
１０）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＮＧＦの発現を促進する効果または活性、ならびに
１１）ＳＭＡ被験者の成長と発達を促進する効果または活性
からなる群より選択される１つ以上の効果または活性をさらに有する。
線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（ＰＬＧ）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合することによってｔ－ＰＡを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。
本発明の「プラスミノーゲン経路活性化剤」または「ＰＬＧ経路活性化剤」という用語は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤をカバーする。
本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」または「ＰＬＧ活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
「線維素溶解阻害剤の拮抗剤」という用語は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２アンチプラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体をカバーする。
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質を含むまたは有するものをカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅ（ｋ）ドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン（またはセリンプロテアーゼドメインまたはプラスミノーゲンプロテアーゼドメインとも呼ばれる））を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、ザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５－３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９－７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２－８。
本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノ－ゲン活性化経路の成分」はプラスミノ－ゲンであり、Ｇｌｕ－プラスミノ－ゲン、Ｌｙｓ－プラスミノ－ゲン、ミニプラスミノ－ゲン、マイクロプラスミノ－ゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノ－ゲンまたはそれらのプラスミノ－ゲン活性を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノ－ゲンは、天然または合成のヒトプラスミノ－ゲン、または依然としてプラスミノ－ゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノ－ゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノ－ゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノ－ゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノ－ゲンはのアミノ酸配列は、配列２、６、８、１０または１２に示されるようなアミノ酸配列を含むかまたは有する。一部の実施形態において、前記プラスミノ－ゲンはヒト全長プラスミノ－ゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノ－ゲンは配列２に示されるヒト全長プラスミノ－ゲンである。
「プラスミノ－ゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノ－ゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノ－ゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノ－ゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノ－ゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノ－ゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナ－ゼ、サルプラ－ゼ、アルテプラ－ゼ、レテプラ－ゼ、テネクテプラ－ゼ、アニストレプラ－ゼ、モンテプラ－ゼ、ラノテプラ－ゼ、パミテプラ－ゼ、及びスタフィロキナ－ゼが挙げられる。
本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレ－トするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテア－ゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテア－ゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰｓ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテア－ゼ（ＭＭＰｓ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡｓ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナ－ゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡｓの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノ－ゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノ－ゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンにはグルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）という二種類の分子の形が存在する。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡsによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテア－ゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテア－ゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテア－ゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキ－ポイントである。プラスミンはさらにラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含む、ＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテア－ゼ前駆体を活性プロテア－ゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子であることを提唱することがある。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。インビトロで、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。
「プラスミノ－ゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノ－ゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算すれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノ－ゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテア－ゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデ－タによれば、セリンプロテア－ゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。
Ｇｌｕ－プラスミノ－ゲンはヒトの天然のフルサイズのプラスミノ－ゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。生体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノ－ゲンの７６－７７番目のアミノ酸で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノ－ゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノ－ゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノ－ゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテア－ゼドメイン（プロテア－ゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）しか含有せず、ｄｅｌｔａ－プラスミノ－ゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は例えば配列７に示される。ミニプラスミノ－ゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテア－ゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノ－ゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノ－ゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテア－ゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノ－ゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノ－ゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許出願におけるマイクロプラスミノ－ゲンの配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコ－ドするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
全長プラスミノ－ゲンの構造は、Ａｉｓｉｎａらの文章にも記載されている（Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５）。この文章において、Ａｉｓｉｎａらは次の内容を記載している。プラスミノ－ゲンにはＫｒｉｎｇｌｅ１、２、３、４、５ドメイン及びセリンプロテア－ゼドメイン（プロテア－ゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）が含まれており、その中でＫｒｉｎｇｌｅは、プラスミノ－ゲンの低分子量及び高分子量リガンドへの結合（すなわち、リジン結合活性）を担い、プラスミノ－ゲンをより開いた立体配置に変換させ、より容易に活性化させる。プロテア－ゼドメイン（ＰＤ）は、残基Ｖａｌ５６２－Ａｓｎ７９１であり、ｔＰＡ及びＵＰＡは、プラスミノ－ゲンのＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２位の活性化結合を特異的に切断し、それによってプラスミノ－ゲンがプラスミンを形成できる。したがって、プロテア－ゼドメイン（ＰＤ）は、プラスミノ－ゲンにタンパク質加水分解活性を与える領域である。
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノ－ゲン」と「フィブリンプラスミノ－ゲン」、「繊維タンパクプラスミノ－ゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
本願において、前記プラスミノ－ゲンの「不足」とは、被験者体内のプラスミノ－ゲンの含有量または活性が正常な人より低く、前記被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノ－ゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノ－ゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノ－ゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノ－ゲン及びプラスミンをカバ－するものである。循環プロセスにおいて、プラスミノ－ゲンは閉鎖した非活性コンフォメ－ションをとるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノ－ゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメ－ションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノ－ゲンのＰＡｐドメインはプラスミノ－ゲンを非活性閉鎖コンフォメ－ションに維持する重要なエピト－プを含み、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノ－ゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノ－ゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナ－ゼプラスミノ－ゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハ－ゲマン因子）などを含む。
本願における「プラスミノ－ゲン活性フラグメント」は、１）プラスミノ－ゲンタンパク質において、基質のタ－ゲット配列に結合し得る、リジン結合フラグメントとも呼ばれる活性フラグメント、例えば、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５を含むフラグメント（前記プラスミノ－ゲンの構造について、Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５を参照されたい）；２）プラスミノ－ゲンタンパク質において、タンパク質加水分解機能を発揮する活性フラグメント、例えば、配列１４に示されるプラスミノ－ゲン活性（タンパク質加水分解機能）を含むフラグメント；３）プラスミノ－ゲンタンパク質において、基質のタ－ゲット配列に結合する活性（リジン結合活性）とプラスミノ－ゲン活性（タンパク質加水分解機能）との両方を有するフラグメントを含む。本願のいくつかの実施形態では、前記プラスミノ－ゲンは、配列１４に示されるプラスミノ－ゲン活性フラグメントを含むタンパク質である。本願のいくつかの実施形態では、前記プラスミノ－ゲンは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５のむリジン結合フラグメントを含むタンパク質である。一部の実施形態では、本発明のプラスミノ－ゲン活性フラグメントは、配列１４を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質を含む。従って、本発明に記載のプラスミノ－ゲンは、当該プラスミノ－ゲン活性フラグメントを含有するが依然として当該プラスミノ－ゲンの活性を保持したタンパク質を含む。一部の実施形態において、本願のプラスミノ－ゲンは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５を含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、またはＫｒｉｎｇｌｅ ５と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するが依然としてリジン結合活性を有するタンパク質を含む。
現在、血液中のプラスミノ－ゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノ－ゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノ－ゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノ－ゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノ－ゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノ－ゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノ－ゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナ－ゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノ－ゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノ－ゲン活性に対して測定を行うことができる。
「オ－ソログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、直系遺伝子ともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノ－ゲンはヒト天然プラスミノ－ゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノ－ゲン活性を有するプラスミノ－ゲンのオ－ソログまたはオルソログを含む。
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの所定のアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメ－ション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
「分離された」プラスミノ－ゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノ－ゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノ－ゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシ－ブリリアントブル－または銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノ－ゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノ－ゲンを含む。
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコ－ドされた及び非遺伝的にコ－ドされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリ－ダ－配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パ－センテ－ジ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパ－センテ－ジ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパ－センテ－ジである。パ－センテ－ジのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的としたアライメントは本分野の技術範囲における複数種類の方法によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュ－タソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメ－タを決めることができ、該パラメ－タが比較対象の配列のフルサイズに対して最大アライメントの要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パ－センテ－ジは配列比較コンピュ－タソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。
ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのある％のアミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュ－タプログラムによって得られるものである。
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
「治療有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノ－ゲンの量である。「治療有効量」は使用するプラスミノ－ゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
疾患状態の「治療」という用語は、前記疾患状態もしくはその臨床症状の進行を阻害もしくは阻止すること、または疾患状態もしくは症状を緩和して、前記疾患状態もしくはその臨床症状を一時的もしくは永続的に退縮させることを含む。
「筋力」という用語は、四肢の随意運動中の筋収縮の強さ、または能動運動中の筋の強さを指す。筋力の状況に応じて、筋力は通常次のグレ－ド０～５に分けられる。グレ－ド０では、完全に麻痺し、筋収縮は測定できない；グレ－ド１では、筋収縮のみが検出できるが、動きはできない；グレ－ド２では、手足はベッド上で平行移動できるが、それ自体の重力に抵抗することはできず、すなわち、ベッドの表面から持ち上げることはできない；グレ－ド３では、四肢は重力に打ち勝ち、ベッドから持ち上げることができるが、抵抗に抵抗することはできない；グレ－ド４では、四肢は外部抵抗に抵抗して動くことができるが、不完全である；グレ－ド５では、筋力は正常である。
「筋緊張（筋ト－ヌス、筋張力）」という用語は、安静時のリラックスした状態の筋肉の緊張を指す。筋緊張は、体のさまざまな姿勢や正常な動きを維持するための基礎である。筋緊張はさまざまな形で表れ、例えば横になって休んでいるときの体の各部位の筋肉の緊張を安静時筋緊張と呼ぶ。体が立っているとき、筋肉の有意な収縮が見えないが、体の前後の筋肉も一定の張力を維持して、立位の姿勢及び身体の安定性を維持し、これを姿勢筋緊張と呼ぶ。運動中の筋肉の緊張は、運動筋緊張と呼ばれ、継続的で滑らかな筋肉の動き（振戦、けいれん、痙攣なし）を確保するための重要な要素である。病理学的状態では、筋肉の緊張が増減し、人体の正常な姿勢や動きに影響を与える。
本発明のプラスミノ－ゲンの調製
プラスミノ－ゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノ－ゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノ－ゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ペ－ジ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビ－ズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノ－ゲンを生産する。例えば、プラスミノ－ゲンをコ－ドする核酸を発現ベクタ－中に挿入し、それと発現ベクタ－中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモ－タ－（例えば天然に関連されているプロモ－タ－、または異種由来のプロモ－タ－）、シグナル配列、エンハンサ－エレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクタ－中の真核プロモ－タ－システムとすることができ、前記ベクタ－は真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクタ－を適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノ－ゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
適切な発現ベクタ－は通常宿主生体内において遊離体または宿主染色体ＤＮＡの組み込む部分として複製される。通常、発現ベクタ－は選択マ－カ－（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はプラスミノ－ゲンをコ－ドするポリヌクレオチドをクロ－ンするための原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュ－ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクタ－を生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモ－タ－が存在し、例えば乳糖プロモ－タ－システム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモ－タ－システム、β－ラクタマ－ゼプロモ－タ－システム、またはファ－ジλ由来のプロモ－タ－システムである。プロモ－タ－は一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソ－ムの結合部位配列などを有してもよい。
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切なベクタ－は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモ－タ－）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモ－タ－は３－ホスホグリセリン酸キナ－ゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモ－タ－には特にアルコ－ル脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルト－スとガラクト－スの利用のための酵素由来のプロモ－タ－を含む。
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノ－ゲン（例えばプラスミノ－ゲンをコ－ドするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリド－マを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクタ－は発現制御配列、例えば複製開始点、プロモ－タ－、及びエンハンサ－（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソ－ム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写タ－ミネ－タ－配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモ－タ－である。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィ－、高速液相クロマトグラフィ－（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノ－ゲンを精製することができる。該プラスミノ－ゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞破片、プラスミノ－ゲン以外の大分子などである。
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノ－ゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸とメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノ－ル、ブタノ－ルまたはベンジルアルコ－ル；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコ－ル；レソルシノ－ル；シクロヘキサノ－ル；３－ペンタノ－ル；ｍ－クレゾ－ル）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；グルコ－ス、マンノ－ス、またはデキストリンを含む単糖、二糖及びその他の炭水化物；例えばＥＤＴＡであるキレ－ト剤；例えばショ糖、マンニト－ル、フコ－スまたはソルビト－ルである糖類；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコ－ル（ＰＥＧ）を含む。
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、降圧薬、抗不整脈薬、糖尿病薬などの薬剤が挙げられる。
本発明のプラスミノ－ゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソ－ム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロ－スまたはゲル－マイクロカプセル及びポリ－（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノ－ゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
本発明のプラスミノ－ゲンは徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニ－ルアルコ－ル）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテ－ト（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュ－プロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジ－により設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成することであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
投与及び使用量
異なる方式、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、及び筋肉内投与により本発明の医薬組成物の投与を実現できる。
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコ－ル、ポリエチレングリコ－ル、例えばオリ－ブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコ－ル性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ－デキストロ－ス、デキストロ－ス及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補助物、電解質補給物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレ－ト剤、不活性ガスなども存在してもよい。
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明のプラスミノ－ゲンを含有する薬物組成物の用量の範囲は、被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバ－され、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュ－ル表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュ－ル表は連続数日１～１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連障害の治療に使用できる本発明のプラスミノ－ゲンまたはプラスミンを含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコ－ルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノ－ゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは、前記組成物を本発明の糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連障害の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガ－溶液及びグルコ－ス溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノ－ゲンの組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
以下の実施例で使用されるプラスミノ－ゲンはヒトプラスミノ－ゲンであり、ドナ－の血漿に由来し、文献［１～３］に記載された方法に基づき、プロセスを最適化し、ヒトドナ－血漿から精製して得られた。ここでヒトＬｙｓ－プラスミノ－ゲン（Ｌｙｓ－プラスミノ－ゲン）及びＧｌｕ－プラスミノ－ゲン（Ｇｌｕ－プラスミノ－ゲン）は９８％を上回った。
以下の実施例１～１１のすべての患者は自発的にヒト血漿から精製された上記のプラスミノ－ゲンの治療を受けるためのインフォ－ムドコンセントフォ－ムに署名し、病院倫理委員会の承認を得た。病状の重症度及び経過により投与方法及び用量を適宜増減した。投与方法はエアロゾル吸入または静脈内注射であった。エアロゾル吸入及び静脈内注射の薬剤濃度はいずれも５ｍｇ／ｍｌであり、溶媒として生理食塩水を使用した。
実施例１ ＩＩ型ＳＭＡ（患者１）
患者は女性であり、３８ヶ月である。生後１０ヶ月でハイハイができず、足が弱く、１歳を過ぎても運動能力はほとんど改善されなかった。１歳９ヶ月の時に遺伝子検査でＳＭＡと診断され、筋力はグレ－ド２で下肢が支えられず、サルブタモ－ル、メチルコバラミン、コエンザイムＱ１０を飲み始めた。２歳の頃にはハイハイもできないほどに退化しており、立ったり座ったりできるのはほんの少しの時間だけであった。２年２ヶ月から間葉系幹細胞治療を開始し、バランスが少し改善され、病気にもなりにくくなったが、依然として立つことができなかった。２歳１１ヶ月でマウスの神経成長因子をツボに注射したところ、バランスが良くなり、下肢が支えられるようになり、筋力テストではグレ－ド３に達した。
投薬状況
静脈内注射；投与量：１００～２００ｍｇ／回；頻度：１日ごとに１回、２日ごとに１回、または３日ごとに１回；１つの治療コ－スは２週間；治療の各コ－スは２～３週間間隔で行われた。合計６コ－スの治療が行われた。
Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ運動機能評価スケ－ル（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｓｃａｌｅ，ＨＦＭＳＥ）は、疾患の重症度を反映して、ＩＩ型及びＩＩＩ型ＳＭＡ患者の運動機能を評価するために設計された。ベ－スラインからの変化として定義され、患者である子供の運動機能の変化を評価し、スコアが高いほど運動機能が優れていることを示す［４－６］。
ニュ－ロミオグラフィ－は、運動ニュ－ロン疾患の主な診断及び同定方法であり、複合筋活動電位の振幅は神経軸索損傷を反映している。ＳＭＡは、大規模な運動ニュ－ロン死、筋力低下、複合筋活動電位振幅の低下または検出不能を伴う変性運動ニュ－ロン疾患である［７］。
効能状況
ＨＦＭＳＥスコア：投与前は２０点であり、初回治療コ－ス後２１点であった。２番目の治療コ－スの治療前は２３点であり、治療後は２４点であった。６番目の治療コ－ス後、スコアは２５点であった（図４）。
運動機能評価：治療前の患者は自力で立つことができなかったが、２つの治療コ－スの後、患者は介助で立つことができ、３つの治療コ－ス後、患者は補助歩行を達成し、患者の頭部制御能力も有意に改善された。治療が進行することにつれて、補助立位時間が延長され、補助歩行距離が増加したことなどを含む患者の運動機能はさらに改善された。
筋電図：投薬前と比較して、両側脛骨神経、総腓骨神経、及び大腿神経の活動電位の振幅は、治療後に有意に増加した（図１）。
さらに、患者の精神状態は投与後に有意に改善され、活力が増加した。治療中に薬物関連の副作用は観察されなかった。
以上の結果は、プラスミノ－ゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者のＨＦＭＳＥスコアを高め、患者の運動機能を改善し、患者の神経筋機能及び精神状態を改善できることを示している。
実施例２ ＩＩ型ＳＭＡ患者（患者２）
患者は男性であり、生後３０ヶ月である。産後は異常がなかった。９ヶ月の時点で、一人で立つことができず、自力で寝返りを打つことができず、両手が時々わずかに震え、つかむことができず、頭を上げることができなかった。１０ヶ月の時に遺伝子検査でＩＩ型ＳＭＡの患者と診断された。１～２歳にリハビリセンタ－でリハビリを開始し、週に１回、一人で座り続け、軽いものを両手でつかみ、ゆっくりとふくらはぎを伸ばし、助けを借りて寝返りを打つことができた。２年２ヶ月の時、骨髄間葉系幹細胞を３回、１回２単位ずつ静脈内注入したが、有意な改善は見られなかった。２歳４ヶ月のときに神経幹細胞を２回、１回２単位ずつ注入したところ、注入後の改善は明らかであった。現状：１人で座れ、１人で座る時、体を少し横に傾けて両手で体を支えることはできるが、腕を上げることはできない。頭のコントロ－ルが改善され、頭を素早く左右に振ることができ、親のアシスト付き４点サポ－トで頭を上げたままにすることができる。脚力がアップし、シ－トに座ったままふくらはぎを前後に蹴ることができる。親に寄りかかって、わずかな膝の補助で立位を維持することができる。
投薬状況
１回目：静脈注射５０ｍｇ；２回目：静脈注射５０ｍｇ；３回目及び４回目：静脈注射１００ｍｇ。投与頻度は、２日に１回または３日に１回、２週間投与した。
効能状況
投薬前のＨＦＭＳＥスコアは２点であり、４回目の投薬後のＨＦＭＳＥスコアは８点であり（図４）、患者は一人で座って両手を上げることができた。筋電図検査の結果、投薬前と比較して、左大腿神経、右尺骨神経、総腓骨神経、及び脛骨神経の活動電位の振幅が投薬後に増加したことが示された（図２）。
以上の結果は、プラスミノ－ゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者のＨＦＭＳＥスコアを高め、患者の運動機能を改善し、神経筋機能を改善できることを示しており、さらに、治療中に薬物関連の副作用が観察されなかった。
実施例３ ＩＩ型ＳＭＡ患者（患者３）
患者は女性であり、２４ヶ月である。１歳の時、支えがあれば立つことはできたが、４点サポ－トでハイハイすることはできなかった。１６ヶ月の時、筋電図検査で神経原性障害が示され、遺伝子検査でＩＩ型ＳＭＡの患者と診断された。現状：一人で座るのが不安定であり、横になったら自力で座ることができず、サポ－トで立つことができ、寄りかかって立つことができ、サポ－トで歩くこともできるが、状態は良くなったり悪くなったりすることがあり、手を上げにくい。
投薬状況
静脈内注射；投与量：５０ｍｇ～１００ｍｇ／回；頻度：１日に１回または３日に１回；１つの治療コ－スは２週間；治療の各コ－スは３～４週間間隔で行われ、合計８コ－スの治療が行われた。
効能状況
ＨＦＭＳＥスコア：治療前に２３点であり、最初の治療コ－ス後に２４点であった。患者の最初の治療コ－スと２番目の治療コ－スの間には約２ヶ月の間隔があった。２番目の治療コ－スの前は２３点であり、治療後は２４点であった。８番目の治療コ－ス後、スコアは２８点であった（図４）。
運動機能：患者は投薬前に手を頭上に上げることができなかった。２つの治療コ－ス後、患者は自力で立つことと補助で歩行することを達成し、両手を頭上に上げることができた。投薬を続けることにより、患者の運動機能はさらに改善され、一人で座る、サポ－トで立つ、サポ－トで歩くなどの動作が安定し、持続時間が徐々に長くなった。
筋電図：治療後、両側の正中神経、脛骨神経、総腓骨神経、及び尺骨神経の活動電位の振幅はすべて、さまざまな程度に増加した（図３）。
さらに、治療中に薬物関連の副作用は観察されなかった。
上記の結果は、プラスミノ－ゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者のＨＦＭＳＥスコアを高め、患者の運動機能を改善し、神経筋機能を改善できることを示している。
実施例４ ＩＩ型ＳＭＡ患者（患者４）
患者は男性であり、４３ヶ月である。生後１２ヶ月で筋電図に神経原性損傷が見られ、生後１４ヶ月での遺伝子検査でＩＩ型ＳＭＡと診断された。生後２４ヶ月に、一人で座ることができなくなり、寄り座るしかできなかった。２９ヶ月でサルブタモ－ル、メチルコバラミン、コエンザイムｑ１０の服用を開始し、運動機能は徐々に改善した。３６ヶ月から間葉系幹細胞治療が開始し、合計５回の間葉系幹細胞の静脈内注射を受け、間葉系幹細胞の注入後、患者の全身状態が有意に改善し、精神状態も改善し、疲れにくく、病気になりにくかったが、立つことができなかった。３８ヶ月で、マウス神経成長因子のツボ注射を受けたが、明らかな効果はなかった。
投薬状況
初回：静脈注射５０ｍｇ；２回目：静脈注射５０ｍｇ；３回目：静脈注射１００ｍｇ；４回目：静脈注射１５０ｍｇであり、各回の注射は３日間隔で、２週間投与した。
効能状況
投薬後、患者の右腕の機能は改善し、患者は左手の助けを借りずに９０度持ち上げることができたが、ＨＦＭＳＥスコアは改善しなかった。治療中に薬物関連の副作用はなかった。
実施例５ ＩＩ型ＳＭＡ患者（患者５）
患者は男性であり、２６ヶ月である。生後１０ヶ月で遺伝子検査によりＳＭＡと診断され、ＳＭＮ２（運動ニュ－ロン生存遺伝子２）のコピ－数は３であった。１２ヶ月で寝返りを打つことができなくなり、腕で体を支えることができなくなり、完全にベッドに腹ばいになることしかできず、指は自力で力を出すことができなかった。生後１３ヶ月で、臍帯間葉系幹細胞の注入を開始し、幹細胞の注入後、脚力が向上し、呼吸が改善され、睡眠の質が改善された。生後１６ヶ月で漢方薬を飲み始めた。間葉系幹細胞、漢方薬、及びリハビリ訓練の包括的な治療後、患者は一人で座ってバランスをとることができたが、左右に曲がったり、左右におもちゃを拾ったりすることはできなかった。独立して連続的にひっくり返すことができた。脚力が有意に向上し、呼吸が改善され、声が大きくなり、漏斗胸が大幅に改善され、肋骨の外反の兆候が改善され、腕と手の強度がある程度向上したが、大人の手で引き上げることはできなかった。腕上げが退化しており、以前は腕を頭のてっぺんまで上げることができたが、下記の治療では顔までしか上げられなかった。
投薬状況
２週間の静脈内注射、隔日に１回、１週目に４回、用量はそれぞれ１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇであった；２週目に４回、用量はそれぞれ５０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１００ｍｇであった。
効能状況
１週目の２回目の投与後、ふくらはぎ及び足首の力は増加した。２週間の投与が終わってから９日後、手と腕の力が増し、手で物をつかむ力が５０％増加した。治療中に薬物関連の副作用は観察されなかった。
以上の結果は、プラスミノ－ゲンがＩＩ型ＳＭＡ患者の運動機能を改善できることを示している。
実施例６ Ｉ型ＳＭＡ患者（患者６）
患者は男性であり、１１ヶ月である。生後６ヶ月の遺伝子検査によりＩ型ＳＭＡと診断され、診断時に医師はこのタイプの患者の平均ライフサイクルが２歳であると説明し、家族は何ら治療措置を講じなかった。症状：頭の支えが弱かった；上肢と腕が衰弱であり、持ち上げられず、手の振りが少なく、握力が弱く、中指が弱かった；下肢が衰弱であり、振りが少なく、つま先が動けた；一人で座ることができず、自分で寝返ることができず、吸う力が弱く、飲み込みにくく、血中酸素モニタリングを２４時間行い、血中酸素飽和度は９２～９７％であり、呼吸時に胸の上下が弱かった。
投薬方法
エアロゾル吸入（２～３回／日）＋静脈内ボ－ラス注射（３日に１回）、治療サイクルは１６コ－ス（２週が１つの治療コ－ス）であった。治療の各コ－スは２週間の間隔で行われた。エアロゾル吸入量は５～１０ｍｇであり、静脈内注射投与量は５０～２００ｍｇであり、５０ｍｇから２００ｍｇまで徐々に増量した。
ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスケ－ル（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｉｎｆａｎｔ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）をこのＩ型ＳＭＡ患者の運動機能の改善を評価するために使用し、スコアが高いほど運動機能が良好であることを示す［８］。
治療効果
生存状況：１６コ－スの治療後、患者は３０ヶ月以上生きており、Ｉ型ＳＭＡ患者の自然史研究で示されているほとんどの患者の１０ヶ月の生存期間を超えている［９］。また、この研究では、投与後、ＳＭＡ患者の精神状態及び成長と発達（身長、体重、胸囲）が大幅に改善され、プラスミノ－ゲンで治療されなかった同年齢の患者と比較して、プラスミノ－ゲンで治療された患者の筋萎縮も大幅に改善されたことが明らかになった（図５）。さらに、この研究では、プラスミノ－ゲン投与後の患者の睡眠状態の有意な改善が観察された。
ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコア：ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは、治療前は３０点であったが、５コ－スの治療後には５０点に増加した。いくつかの原因で５回目と６回目の治療コ－スで２ヶ月ほど間隔が空いたため、スコアが３６点に落ち、６回目の治療コ－ス後は４４点であった。６回目と７回目の治療コ－スは約２ヶ月の間隔があった。７回目の治療コ－ス前は４４点であり、投薬後４５点であった。１０～１６回目の治療コ－スでは、スコアは４４～４６点の間で変動した（図６）。
運動機能：１回目の治療コ－ス後、患者は一人で座ることができ、約３０秒間頭を支えた。４回目の治療コ－ス後、一人で座っている時間が延長され、約３０秒であった。治療の進行に伴い、患者の運動機能は改善し続け、手を強く握り、腕を自発的にわずかに持ち上げることができ、足の動き及びスイングの頻度が増加した。
嚥下機能：投与後、患者の飲食時の窒息する咳の回数が減り、発話機能も良好であった。
呼吸機能：１回目の治療コ－スの２日目に、患者の血中酸素飽和度は９７～９８％になり、時には９５～９６％に達した。２回目の治療コ－ス後、患者の呼吸力は増加した。１６つの治療コ－ス後、患者は生後３０ヶ月を超え、換気補助なしで良好な呼吸状態を維持していた。Ｉ型ＳＭＡの自然史研究では、換気補助がなければ、２０ヶ月の生存率はわずか８％であることが示された［１０］。
上記の結果は、プラスミノ－ゲンがＩ型ＳＭＡ患者のＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアを高め、患者の運動機能を改善し、３０秒間の補助なしの立ち座り及び３０秒間の頭部支持運動という画期的な改善を達成でき、さらに、患者の嚥下機能とスピ－チ能力を改善でき、肺機能を改善し、血中酸素飽和度を高め、患者の精神状態と睡眠を改善できることを示している。
実施例７ Ｉ型ＳＭＡ患者（患者７）
患者は女性であり、２３ヶ月である。生後２６日目に症状が出現し、遺伝子検査によりＩ型ＳＭＡと診断された。治療前の状態：補助なしでは座ったり立ったりすることができず、手足の抗重力運動がなかった。左手の指が可動、右手の関節が可動、人差し指が大きく可動、残りの４本の指がわずかに可動、左下肢の足首関節が可動、右下肢の膝関節がわずかに可動であるが持ち上げることができず、頭が左右にわずかに振れた。ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは４点であった。自発呼吸はなく、２４時間人工呼吸器に依存し、血中酸素飽和度は日中では９５～１００％であり、夜間は９４～９７％であった。嚥下機能は完全に喪失し、胃瘻から栄養摂取した。広範な神経原性損傷があり、両側正中神経、尺骨神経、総腓骨神経、脛骨神経の活動電位振幅が減少した（８０～１００％）。痰は１日４０～５０回吸引され、青みがかった白で少しベタついた。
投薬方法
５０ｍｇを静脈内注射により隔日投与し、３日間連続投薬した。
治療効果
運動機能：プラスミノ－ゲンの静脈内投与を受けてから２日後に、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアが４点から５点に増加し、１点増加した（図６）。投薬２日目で仰臥位正中線を最大３０秒維持でき、投薬７日目には左足が改善し、膝は１分２０秒曲げることができた。
呼吸機能：投薬前に、１日４０～５０回程度、青白色でやや粘性のある痰を吸引した；エアロゾル吸入３日目で、痰を吸引する回数が３０回程度に減った；投薬９日目に、少量のネバネバした痰を吐き出すことができた；投薬１３日目で、痰の量は１０％減り、粘性は変わらなかった；断薬後最初の数日間は、喀痰の吸引回数がわずかに増加したが、断薬１２日目には喀痰量が10%減少し、さらに痰の吸引回数が減少した；１１日目には、唾液を自分で制御できるようになった。
実施例８ Ｉ型ＳＭＡ患者（患者８）
患者は女性であり、生後２９ヶ月である。生後５ヶ月で症状が出現し、遺伝子検査の結果、Ｉ型ＳＭＡと診断された。治療前の状態：状態が良い時は１人で１０～１５秒座れる時もあったが不安定であった；寝返りはできたが自力で寝返りは出来なかった；補助なしで座っているときは、頭を１分間あげることができ、３～５分間傾いて座ることができた；持ち上げられると、頭を４０秒間直立させ、頭を振ることができ、座っている場合、上肢を１０ｃｍ上げることができた；手は握力が弱く、スプ－ンや絵筆をつかむことができた；下肢は持ち上げられず、膝は補助で曲げることができ、左右に２分間わずかにスイングできた。ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは３１点であった。胸式呼吸と腹式呼吸が交互に現れた（１／３胸式呼吸、２／３腹式呼吸）。嚥下機能が弱く、食べるのに１時間かかり、粒状のものしか食べられず、水を飲むと喉が詰まることがあった。断続的なわずかな舌の震えがあった；寝つきが悪く、よく泣いた。
投薬計画
１日５０ｍｇ～１００ｍｇの静脈内注射、初日は５０ｍｇ、その後徐々に１００ｍｇまで増量し、隔日注射し、１４日間連続投与した。
治療効果：
運動機能：プラスミノ－ゲンを使用してから９日目に、補助なしで１０秒間一人で座ることができた。投薬１４日後、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは３１点から４０点に増加し、９点増加した（図６）。
実施例９ Ｉ型ＳＭＡ患者（患者９）
患者は男性であり、生後１０ヶ月である。生後４２日目に症状が現れ、遺伝子検査でＩ型ＳＭＡと診断された。治療前の状態：頭の制御能力がなく、頭を直立させて頭を振ることができなかった；一人で座ったり寄りかかることができなかった；寝返りを打つことができなかった；前腕を曲げたり持ち上げたりできた；手はつかむことができたが力が入らなかった；下肢及び足を動かすことができなかった。ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは３１点であった。嚥下能力がなく、鼻から摂食した。痰と唾液の量が多く、痰を深部から１日１０回程度吸引し、痰と唾液の口内吸引は２０回程度であった。
投薬計画
エアロゾル吸入、１日２回、毎回５ｍｇであった。静脈内注射、５０～１００ｍｇ／日、初日は５０ｍｇ、その後１日おきに１００ｍｇまで徐々に増量した。
治療効果
運動機能：プラスミノ－ゲン投与の７日目に、動かなかった平らな腕の仰臥位から自分で内外回しができるようになった；投与１０日目に、両膝を曲げて約２分間足を直立させた。投与１４日目に、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは３１点から４０点に増加し、９点増加した（図６）。
呼吸機能：投薬の２４時間前に人工呼吸器を使用し、人工呼吸器の圧力を１５に設定した；投薬の１４日後に人工呼吸器の圧力を１３に下げ、人工呼吸器を時々外してスム－ズな呼吸を維持できた。
実施例１０ Ｉ型ＳＭＡ患者（患者１０）
患者は女性であり、生後１２ヶ月である。生後３ヶ月で発症し、遺伝子検査の結果、Ｉ型ＳＭＡと診断された。治療前の状態：頭の制御能力がなく、頭が直立できず、頭を振ることができなかった；一人で座ったり寄りかかることができなかった；寝返りを打つことができなかった；手足：指、手首、つま先だけが動けた。ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは０点であった。夜間は人工呼吸器が必要であった。嚥下能力はなく、胃管から栄養を摂取した。１日１０回程度痰を吸引した。
投薬計画
静脈内注射、毎回５０～１００ｍｇ、初日は５０ｍｇ、その後徐々に１００ｍｇまで増量し、１日おきに１４日間投与した。
投薬効果
運動機能：プラスミノ－ゲン投与後１１日目に、上肢は平らに置いたときに４５°外側に向けることができ、下肢は膝を曲げて２分以上直立し、軽くうなずくことができた。投与８日後、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは０点から８点に増加し、８点増加した（図６）。
実施例１１ 非５ｑ型ＳＭＡ患者（患者１１）
患者は女性であり、生後４０ヶ月（３歳４ヶ月）である。生後６ヶ月で発症し、１．５歳（１８ヶ月）で遺伝子検査により非５ｑ型ＳＭＡと診断され、具体的には、１１番目の染色体に関連するＩＧＨＭＢＰ２をコ－ドする遺伝子の突然変異によって引き起こされる呼吸窮迫タイプ１を伴うＳＭＡ（ＳＭＡＲＤ１）であった。肺感染症及び喀痰の排出困難により気道を塞ぎ、呼吸が弱くなり、人工呼吸器の間欠使用後、徐々に自然呼吸不全で人工呼吸器を離れなくなり、人工呼吸器を約1年半使用した。言語機能が喪失し、顔面が麻痺し、動くことができず、筋力グレ－ドは０であった。症状：人工呼吸器の使用以来、毎日、痰の排出装置、痰の吸引装置、酸素吸入、エアロゾル（１日２回）、及び鼻からの栄養を使用していた。筋電図の結果は、上肢と下肢の両方の運動ニュ－ロンが深刻な損傷を受けており、活動電位が見られないことを示した。
投薬計画
１回目の治療コ－ス（２週間）：エアロゾル吸入、１０ｍｇ／回、３回／日、５０～１００ｍｇの静脈内注射と組み合わせて、３日に１回行った。
２回目の治療コ－スは、１回目の治療コ－スの終了から２ヶ月後に行われた。
２回目から４回目の治療コ－ス（各コ－ス間は２週間の間隔があった）：静脈内注射、２日ごとに１回、用量は１５０ｍｇ～２５０ｍｇであった。
治療効果
１回目の治療コ－ス：手のぶら下がりの時間が増加し、振幅が増加し、強度が増加し、サポ－トの助けを借りて左上腕が内側に移動できるようになった。下肢は補助で３０分間持続して屈曲するように立つことができ、顔の表情が増え、目がまばたきし、口が自発的に痙攣できるようになった。
２回目の治療コ－ス：時々ス－プを飲み込むことができ、睡眠が改善された。
３回目の治療コ－ス：排便は正常であり、頭を左右に振ることができ、頭を補助サポ－トで数秒間上げて保持できた。手首はやや有力になり、指先は周期的に回転でき、左腕はより広い範囲で自律的に振ることができた。血中酸素濃度は９７％に保たれ、酸素投与が必要なくなった。
４回目の治療コ－ス：左腕の協調性が良くなり、右腕の可動範囲は小さかったが、スイングの頻度は速くなった。下肢の筋肉が柔らかくなり、こわばりがなくなり、顔の表情が豊かになり、排便が自発的になった。
治療中、患者の精神状態が大幅に改善され、呼吸能力が大幅に向上し、換気補助の必要性が徐々に減少した。
この結果は、プラスミノ－ゲンが、四肢の動きの強さ、振幅、及び範囲の増加を含む、非５ｑ型ＳＭＡ患者の運動機能を改善でき、患者の表情を豊かにすることができ、患者の肺機能及び呼吸機能を改善し、酸素注入を減少させ、血中酸素飽和度を増加し、患者の嚥下機能を改善し、患者の睡眠の質を改善することができることを示している。
以下の実施例１２～３１は、動物モデルに対する投薬研究であり、使用されたプラスミノ－ゲンは依然として、上記のようにヒトドナ－血漿から精製されたプラスミノ－ゲンタンパク質である。
下記のすべての実施例で使用されたＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスはＦＶＢ．Ｃｇ－Ｇｒｍ７Ｔｇ（ＳＭＮ２）８９Ａｈｍｂ Ｓｍｎ１ｔｍ１ＭｓｄＴｇ（ＳＭＮ２＊ｄｅｌｔａ７）４２９９Ａｈｍｂ／Ｊ遺伝子変異マウス（ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスと略称）であり、ＳＭＮ１遺伝子のホモ変異を有し、ヒトＳＭＮ２遺伝子を発現し、前記マウスの臨床的及び病理学的症状は、ヒトＳＭＡに似ていた。繁殖用マウスは、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ研究所から購入した（血統番号：００５０２５）。
実施例１２ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの生存時間を延長する
ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの出生時に体重を測定し、体重に応じて溶媒群（６匹）と投与群（５匹）にランダムに分けた。マウスの生後３日後に投与を開始し、溶媒群のマウスには毎日６ｍｌ／ｋｇの溶媒を腹腔内注射により投与し、投与群のマウスには毎日６０ｍｇ／ｋｇのプラスミノ－ゲンを腹腔内注射により投与した。マウスの生存状況を記録した。
生存曲線の統計結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの生存曲線を有意に改善できることを示し、その差は統計的に有意であった（Ｐ＝０．０２９）。生存時間の統計結果は、溶媒群のマウスの生存時間の中央値が１４日であり、すべてのマウスが１５日目に死亡し、投与群の生存時間の中央値が１６日であり、すべてのマウスが１７日目に死亡したことを示し、統計分析の差は有意であった（Ｐ＝０．０３）。これは、プラスミノ－ゲンがＳＭＡモデルマウスの生存時間を延長できることを示している。図７Ａ及び７Ｂを参照されたい。
実施例１３ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの脊髄におけるＳＭＮ遺伝子の転写を促進する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス２匹を取り、１匹は溶媒群のマウスとし、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。１匹は投与群のマウスとし、３０μｇ／６μｌのプラスミノ－ゲンを毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。野生型（ＦＶＢ）マウス１匹をブランク対照群とし、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。９日間連続して投与した。マウスを殺処分して脊髄を採取し、すべてのＳＭＮ遺伝子転写物のｑＰＣＲ検出を行い、フォワ－ドプライマ－はＦ：ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣ（配列１５）であり、リバ－スプライマ－はＲ：ＡＧＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＣＴ（配列１６）であった。
その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄には一定レベルのＳＭＮ遺伝子転写があり、溶媒群のマウスのＳＭＮ遺伝子転写レベルはブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスにおけるＳＭＮ遺伝子の転写レベルは、溶媒群のマウス及びブランク対照群のマウスよりも有意に高かった（図８）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮ遺伝子の転写を促進できることを示唆している。
実施例１４ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの脳におけるＮＦ－κＢレベルの増加を促進する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス７匹を取り、溶媒群で４匹とし、最初の９日間では、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、１０日目から、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１日１回腹腔内注射により投与した。投与群で３匹とし、最初の９日間では、３０μｇ／６μｌのプラスミノ－ゲンを毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、１０日目から、６０μｇ／６μｌのプラスミノ－ゲンを１日１回腹腔内注射により投与した。野生型マウス４匹をブランク対照群とし、最初の９日間では、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、１０日目から、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１日１回腹腔内注射により投与した。１２日目にマウスを殺処分して脳組織を採取し、脳組織ホモジネ－トを調製してＮＦ－κＢタンパク質のウエスタンブロット検出を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１０％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ロ－ディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してロ－ディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間電気泳動を実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＮＦ－κＢ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８２４２）を加えて室温で３時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリ－ンなイメ－ジングプレ－ト上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメ－ジャ－で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで各バンドの光学密度値を得て定量的に分析した。
核内因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Ｂ，ＮＦ－κＢ）は重要な核転写因子である。ＮＦ－κＢファミリ－のメンバ－には、主にＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｃ－Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、ＮＦ－κＢ１（ｐ５０タンパク質及びその前駆体ｐ１０５）、及びＮＦ－κＢ２（ｐ５２タンパク質及びその前駆体ｐ１００）が含まれ、各メンバ－は相同性またはヘテロ二量体を形成して機能することができる。哺乳類細胞で最も一般的なのは、ｐ６５とｐ５０が結合したｐ６５／ｐ５０二量体である。刺激されていない細胞では、ＮＦ－κＢ転写因子は抑制性ＩκＢ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｋａｐｐａ Ｂ）タンパク質に結合するため、細胞質に保持される。上流シグナルの刺激は、ＩＫＫ（ＩκＢキナ－ゼ）の作用下でＩκＢタンパク質のリン酸化修飾を引き起こし、ユビキチンリガ－ゼ複合体によって認識され、プロテアソ－ム依存的にＩκＢタンパク質の分解を促進し、ＮＦ－κＢが放出されて細胞核に入り、標的遺伝子の発現を開始する［１１］。ＮＦ－κＢはほとんどすべての動物細胞に見られ、外部刺激に対する細胞の応答に関与し、細胞の炎症応答、免疫応答などの過程で重要な役割を果たす。ＮＦ－κＢは、シナプスの可塑性と記憶にも関連している［１２］。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳には一定量のＮＦ－κＢタンパク質があり、溶媒群のマウスの脳におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの脳におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０．０５）（図９）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳組織におけるＮＦ－κＢタンパク質レベルの増加を促進できることを示唆している。
実施例１５ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢレベルの増加を促進する
上記実施例１４で殺処分したマウスから筋肉を採取し、上記実施例１４に記載の方法に従ってＮＦ－κＢタンパク質のウェスタンブロット検出を行った。
その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉には一定量のＮＦ－κＢタンパク質があり、溶媒群のマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質のレベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１０）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの筋肉におけるＮＦ－κＢタンパク質レベルの増加を促進できることを示唆している。
実施例１６ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの脳組織におけるＳＭＮタンパク質レベルの増加を促進する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス２匹を取り、１匹は溶媒群のマウスとし、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。１匹は投与群マウスとし、３０μｇ／６μｌのプラスミノ－ゲンを毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。野生型（ＦＶＢ）マウス２匹をブランク対照群とし、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与した。投与９日後、マウスを殺処分して脳組織を採取し、脳組織ホモジネ－トを調製してＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット検出を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ロ－ディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してロ－ディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間電気泳動を実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＳＭＮ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１１７０８－１－ＡＰ）を加えて室温で３時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリ－ンなイメ－ジングプレ－ト上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメ－ジャ－で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで各バンドの光学密度値を得て定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳は一定量のＳＭＮタンパク質を発現し、溶媒群のマウスのＳＭＮタンパク質の発現レベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスのＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高かった（図１１）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示唆している。
実施例１７ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質レベルの増加を促進する
実施例１６で殺処分したマウスから後肢筋組織を採取し、組織ホモジネ－トを調製してＳＭＮタンパク質のウェスタンブロット検出を、実施例１６に記載の検出方法で行った。
その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉は一定量のＳＭＮタンパク質を発現し、溶媒群のマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、ブランク対照群のマウスよりも低く、投与群のマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に高かった（図１２）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの筋肉におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示唆している。
実施例１８ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス７匹を取り、ランダムに２つの群に分け、溶媒群で４匹とし、投与群で３匹とした。溶媒群に対して、最初の１０日間では、６μｌ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により投与し、投与１０日後から、６μｌ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日腹腔内注射により投与した。投与群のマウスに対して、最初の１０日間では、３０ｍｇ／ｋｇ／回でプラスミノ－ゲン（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により投与し、投与１０日後から、６０ｍｇ／ｋｇ／回でプラスミノ－ゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日腹腔内注射により投与した。野生型マウス４匹をブランク対照群とし、最初の１０日間では、６μＬ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により投与し、１０日後から、６μＬ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日腹腔内注射により投与した。投与１１日後、マウスを殺処分して脳組織を採取し、ＮＧＦタンパク質のウェスタンブロット検出を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ロ－ディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してロ－ディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間電気泳動を実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を加えて室温で３時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベ－トし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリ－ンなイメ－ジングプレ－ト上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメ－ジャ－で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで各バンドの光学密度値を得て定量的に分析した。
神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリ－の重要なメンバ－である。シグナルペプチド、リ－ダ－ペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子ＮＧＦの前駆体（Ｐｒｏ－ＮＧＦ）が、それが切断されて形成するＮＧＦと相反の役割を果たしていることが報告されている。Ｐｒｏ－ＮＧＦはニュ－ロンのアポト－シスを促進することができる。成熟したＮＧＦは、ニュ－ロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニュ－ロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている［１２］。ＮＧＦ／ＰｒｏＮＧＦ比＝ＮＧＦ光学密度（ＯＤ）／ＰｒｏＮＧＦ光学密度（ＯＤ）値である。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比があり、投与群のマウスの脳組織のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比は溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１３）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＡモデルマウスの脳組織においてＰｒｏＮＧＦからＮＧＦへの変換を促進し、成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。
実施例１９ プラスミノ－ゲンはＳＭＡモデルマウスの肺組織損傷を改善する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス８匹を取り、ランダムに２つの群に分け、溶媒群で４匹とし、投与群で４匹とした。同じ同腹子からの７匹の野生型マウスをブランク対照群として使用した。溶媒群及びブランク対照群のマウスに対して、最初の３日間では、３ｍｌ／ｋｇの溶媒を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、３日後から、６ｍｌ／ｋｇの溶媒を１日１回腹腔内注射により投与した。投与群のマウスに対して、最初の３日間では、３０ｍｇ／ｋｇ／回でプラスミノ－ゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、３日後から、６０ｍｇ／ｋｇのプラスミノ－ゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日１回腹腔内注射により投与した。投与９日後、マウスを殺処分して肺組織を採取し、１０％中性ホルマリン固定液で２４時間固定した。固定された肺組織をアルコ－ル勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織切片の厚さは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色し（Ｈ＆Ｅ染色）、１％塩酸エタノ－ルで分別させ、アンモニア水でブル－イングさせ、さらにアルコ－ル勾配で脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織の末端細気管支上皮細胞が整然と配置され、明確に区別できた；肺胞腔のサイズは均一であり、肺胞中隔は肥厚せず、血管の周囲に炎症細胞の浸潤は見えなかった；溶媒群のマウスの肺組織の呼吸細気管支上皮が脱落し、肺胞管及び肺胞嚢が拡大し、肺胞中隔が広がり、肺胞が崩壊して構造が乱れ、肺血管周囲には好酸球、泡沫細胞及びリンパ球が存在した；投与群のマウスの肺組織の呼吸細気管支上皮は整然と並び、肺胞管及び肺胞嚢が拡大し、肺胞腔も均等に拡大したが、単層の肺胞上皮からなる肺胞壁が見られた（図１４）。これは、プラスミノ－ゲンが、ＳＭＡモデルマウスの肺組織損傷を改善できることを示唆している。
実施例２０ プラスミノ－ゲンは、ＳＭＡマウスにおける肺組織損傷の炎症修復を促進する
実施例１９で殺処分したマウスから肺組織を採取し、１０％中性ホルマリン固定液で２４時間固定した。固定された肺組織をアルコ－ル勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマ－カ－で組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＦ４／８０抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１００７９０）を滴下して４℃で一晩インキュ－ベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコ－ル勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性バルサム（Neutral Balsam）で切片を封入し、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
Ｆ４／８０は高度にグリコシル化されたＧタンパク質共役受容体であり、マウスマクロファ－ジの識別のためのマ－カ－である。
その結果、ブランク対照群（図１５Ａ）の肺組織には一定レベルのＦ４／８０陽性細胞があり、溶媒群（図１５Ｂ）のマウスの肺組織におけるＦ４／８０陽性細胞のレベルは有意に増加し、投与群（図１５Ｃ）のマウスのＦ４／８０陽性細胞レベルは、溶媒群のマウスよりも有意に低く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１５Ｄ）。これは、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの損傷した肺組織の炎症修復を有意に促進できることを示している。
実施例２１ プラスミノ－ゲンはＳＭＡマウスにおいてＳＭＮΔ７遺伝子の転写を促進する
実施例１９で殺処分したマウスから脊髄組織を採取し、ＳＭＮΔ７ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を行い、増幅したサンプルを１．５％アガロ－スゲルを用いて検出した。プライマ－は、５’－ＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡ－３’（配列番号１７）及び５’－ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＧＡＴＣＧ－３’（配列番号１８）であった。
ＳＭＮΔ７のｍＲＮＡ転写を増加させると、機能的なＳＭＮタンパク質の増加が促進され、それによって疾患の経過が改善され、疾患の発症が遅延することが報告されている［１３］。
本実施例の試験結果から明らかに、投与後のマウスの脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写レベルは、溶媒群よりも有意に高く、Ｐ値は０．００２であった（図１６）。これは、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写を促進し、機能的なＳＭＮタンパク質の増加を促進できることを示している。
実施例２２ プラスミノ－ゲンはＳＭＡマウスの筋肉組織損傷を改善する
実施例１９で殺処分したマウスから筋肉組織を採取し、１０％中性ホルマリン固定液で２４時間固定した。固定された肺組織をアルコ－ル勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織切片の厚さは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色し（Ｈ＆Ｅ染色）、１％塩酸エタノ－ルで分別させ、アンモニア水でブル－イングさせ、さらにアルコ－ル勾配で脱水させて切片を封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１７Ａ）のマウスの筋肉組織の筋繊維細胞体はほとんど丸く、サイズが均一であり、平行に配置されており、細胞核は筋鞘の内側に位置しており、溶媒群（図１７Ｂ）と比較して、投与群（図１７Ｃ）の筋線維細胞間質はよりタイトであった。これは、プラスミノ－ゲンが、ＳＭＡマウスの筋肉組織の損傷を軽減できることを示唆している。
実施例２３ プラスミノ－ゲンはＳＭＡマウスの脳組織損傷を改善する
実施例１９で殺処分したマウスから脳組織を採取し、１０％中性ホルマリン固定液で２４時間固定した。固定された肺組織をアルコ－ル勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織切片の厚さは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色し（Ｈ＆Ｅ染色）、１％塩酸エタノ－ルで分別させ、アンモニア水でブル－イングさせ、さらにアルコ－ル勾配で脱水させて切片を封入し、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１８Ａ）のマウスの大脳皮質の各層のニュ－ロンの構造は明らかであり、内錐体細胞層の錐体細胞には豊富な細胞質があり、上部に厚い主要な樹状突起が見られ、核小体は明確であった；溶媒群（図１８Ｂ）のマウスの大脳皮質は、各層のニュ－ロン数が減少し、構造が明確ではなく、錐体細胞が特定しにくく、脳組織が緩んでいた；溶媒群と比較して、投与群（図１８Ｃ）では各層のニュ－ロンの数が増加し、錐体細胞は内錐体細胞層に見られ、小さな錐体細胞も多形細胞層に見られ、脳組織は比較的コンパクトであった。これは、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの脳組織の損傷を軽減できることが示唆している。
実施例２４ プラスミノ－ゲンの投与は、ＳＭＡマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
３日齢または７日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス８匹と同齢の野生型マウス４匹を取り、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスをランダムに溶媒群と投与群に分け、各群で４匹とし、野生型マウス４匹をブランク対照群とした。投与群のマウスにはプラスミノ－ゲンを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で６０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスには溶媒を６ｍｌ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、いずれも生後１１日目まで投与した。生後１１日目に投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、肺組織の一部を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メ－カ－：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノ－ゲンワ－キングスタンダ－ドを使用して、各サンプルの濃度をキャリブレ－ションし、キャリブレ－ションされた濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク量あたりのプラスミノ－ゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは１．２２±１．１２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは２．３６±０．８７ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約１．９倍であった；投与群のマウスの肺組織中のプラスミノ－ゲンレベルは９６．９４±２０．４９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約４１倍であった（図１９）。これは、ＳＭＡの条件下では、プラスミノ－ゲンが肺組織に蓄積し、肺組織のプラスミノ－ゲンが不足しており、プラスミノ－ゲンを補充することで、プラスミノ－ゲンの肺組織への蓄積がさらに促進されることを示唆している。
実施例２５ プラスミノ－ゲンの投与は、ＳＭＡマウスの筋肉組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
実施例２４で殺処分したマウスから筋肉組織を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メ－カ－：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノ－ゲンワ－キングスタンダ－ドを使用して、各サンプルの濃度をキャリブレ－ションし、キャリブレ－ションされた濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク量あたりのプラスミノ－ゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが５．９５±３．８４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが１５．１１±１０．３８ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約２.５倍であった；投与群のマウスの筋肉組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは９０１．３０±３９８．５１ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約６０倍であった（図２０）。これは、ＳＭＡの条件下では、プラスミノ－ゲンが筋肉組織に蓄積し、筋肉組織のプラスミノ－ゲンが不足しており、プラスミノ－ゲンを補充することで、プラスミノ－ゲンの筋肉組織への蓄積がさらに促進されることを示唆している。
実施例２６ プラスミノ－ゲンの投与は、ＳＭＡマウスの脳組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
実施例２４で殺処分したマウスから脳組織を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メ－カ－：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノ－ゲンワ－キングスタンダ－ドを使用して、各サンプルの濃度をキャリブレ－ションし、キャリブレ－ションされた濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク量あたりのプラスミノ－ゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群の野生型マウスの脳組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが１．１８±１．５４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが１．４９±１．５９ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは有意に変化しなかった；投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスのプラスミノ－ゲンのレベルは１２．０９±５．３２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約８倍であった（図２１）。これは、プラスミノ－ゲンを補給すると、ＳＭＡ疾患条件下でプラスミノ－ゲンの血液脳関門への透過性の増加が促進され、プラスミノ－ゲンが血液脳関門を通過して脳に到達できることを示唆している。
実施例２７ プラスミノ－ゲンの投与は、ＳＭＡマウスの脊髄組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
３日齢または７日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス８匹、同齢の野生型マウス４匹、及び同齢のＳＭＡヘテロ接合マウス３匹を取り、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスをランダムに溶媒群と投与群に分け、各群で４匹とし、野生型マウス４匹をブランク対照群とし、ＳＭＡヘテロ接合マウス３匹を正常投与対照群とした。投与群及び正常投与対照群のマウスにはプラスミノ－ゲンを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で６０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスには溶媒を６ｍｌ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、いずれも生後１１日目まで投与した。生後１１日目に投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織の一部を採取し、ホモジナイズし、プラスミノ－ゲンのＥＬＩＳＡによる検出を行った。
その結果、ブランク対照群の野生型マウスにおける脊髄プラスミノ－ゲンのレベルが８．５１±９．５１ｎｇ／ｍｇであった。溶媒群ＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄におけるプラスミノ－ゲンのレベルは１９．９５±４．０６ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群よりわずかに増加した。正常投与対照群のプラスミノ－ゲンのレベルは１３．０３±７．５１ｎｇ／ｍｇであった。投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄プラスミノ－ゲンのレベルは６２．３３±１７．３７ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの約３倍であり、投与群と溶媒群の比較統計解析Ｐ値は０．０２９であり、正常投与対照群の約４．８倍であり、投与群と正常投与対照群の比較統計解析のＰ値は０．０２６であった（図２２）。これは、プラスミノ－ゲンの投与が、ＳＭＡの条件下でプラスミノ－ゲンの血液脊髄関門への透過性の増加を促進し、プラスミノ－ゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に到達できることを示している。
実施例２８ プラスミノ－ゲンの投与は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの脊髄組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
ＳＭＡヘテロ接合マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入、血統番号：００５０２５）９匹を、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で３匹、モデル群で６匹とした。すべてのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、モデル群のマウスには、２．５ｍｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであり、ブランク対照群のマウスには、２ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を注入した。２時間のモデリングの後、モデル群のすべてのマウスを体重に応じてランダムに２つの群に分け、溶媒群で３匹、投与群で３匹とした。群分けが終わった後に投与を始め、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノ－ゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群マウス及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与した。投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メ－カ－：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノ－ゲンワ－キングスタンダ－ドを使用して、各サンプルの濃度をキャリブレ－ションし、キャリブレ－ションされた濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク量あたりのプラスミノ－ゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織ホモジネ－ト中のプラスミノ－ゲンのレベルが２．７０±０．７４ｎｇ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄組織ホモジネ－ト中のプラスミノ－ゲンのレベルは３．１７±１．５１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノ－ゲンを補充した後、プラスミノ－ゲンのレベルは１２１．１６±４４．６８ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約３８．２倍であった（図２３）。これは、プラスミノ－ゲンを補充すると、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノ－ゲンの血液脊髄関門への透過性の増加を促進でき、この条件下では、プラスミノ－ゲンが血液脊髄関門を通過して中枢神経系に入ることができることを示唆している。
実施例２９ プラスミノ－ゲンの投与は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの脊髄組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
実施例２８で殺処分したマウスから脊髄組織を採取し、ホモジナイズした後、プラスミノ－ゲンの酵素基質動態法の検出を行った。マイクロプレ－ト（メ－カ－：ＮＵＮＣ、カタログ番号：４４６４６９）に、７つの異なる濃度の標準溶液、ブランク、及びサンプルを８５μＬ／ウェルずつ加えた後、各ウェルに１５μＬの２０ｍＭ Ｓ－２２５１溶液（メ－カ－：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、カタログ番号：８２０３３２３９）と１００ｎｇ／μＬ ｕＰＡ溶液との混合物（使用直前に容量比２：１で混合）を加え、３７℃でインキュベ－トした。反応の０分から、反応が９０分になるまで、Ａ４０５吸光度値を５分ごとにマルチモ－ドマイクロプレ－トリ－ダ－で読み取った。すべての反応は、時間と吸光度値に基づいて直線でフィッティングされ、直線の傾きは標準製品／サンプルの反応速度（△Ａ４０５／分）であった。最後に、標準製品の効力値と△Ａ４０５／分を標準曲線として使用して、試験サンプルの効力を計算した。各サンプルの単位総タンパク量あたりのプラスミノ－ゲンの活性を計算した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが０．０００１１±４．５１ｘ１０－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄におけるプラスミノ－ゲンのレベルが０．０００１０±９．７２×１０－６Ｕ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノ－ゲンを補充した後、プラスミノ－ゲンのレベルは０．０００３４±１．０４×１０－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群と比較して、統計解析のＰ値は０．０５８であった（図２４）。これは、プラスミノ－ゲンを補充すると、ＬＰＳ誘発肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの血液脊髄関門のプラスミノ－ゲンに対する透過性の増加を促進でき、プラスミノ－ゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に蓄積できることを示唆している。
実施例３０ プラスミノ－ゲンの投与は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
実施例２８で殺処分したマウスから肺組織を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メ－カ－：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノ－ゲンワ－キングスタンダ－ドを使用して、各サンプルの濃度をキャリブレ－ションし、キャリブレ－ションされた濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク質量あたりのプラスミノ－ゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが１．４９±０．４７ｎｇ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは３．６７±１．０１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群の約２．５倍であった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノ－ゲンを補充した後、肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは５６２．６８±１０２．８５ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約１５３倍であった（図２５）。これは、プラスミノ－ゲンを補給することで、プラスミノ－ゲンが損傷部位に特異的に蓄積して損傷を修復できることを示唆している。
実施例３１ プラスミノ－ゲンの投与は、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンレベルの増加を促進する
実施例２８で殺処分したマウスから肺組織を採取し、ホモジナイズした後、プラスミノ－ゲンの酵素基質動態法の検出を行った。マイクロプレ－ト（メ－カ－：ＮＵＮＣ、カタログ番号：４４６４６９）に、７つの異なる濃度の標準溶液、ブランク、及びサンプルを８５μＬ／ウェルずつ加えた後、各ウェルに１５μＬの２０ｍＭ Ｓ－２２５１溶液（メ－カ－：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、カタログ番号：８２０３３２３９）と１００ｎｇ／μＬ ｕＰＡ溶液との混合物（使用直前に容量比２：１で混合）を加え、３７℃でインキュベ－トした。反応の０分から、反応が９０分になるまで、Ａ４０５吸光度値を５分ごとにマルチモ－ドマイクロプレ－トリ－ダ－で読み取った。すべての反応は、時間と吸光度値に基づいて直線でフィッティングされ、直線の傾きを求め標準製品／サンプルの反応速度（△Ａ４０５／分）とした。最後に、標準製品の効力値と△Ａ４０５／分を標準曲線として使用して、試験サンプルの効力を計算した。各サンプルの単位総タンパク量におけるプラスミノ－ゲンの活性を計算した。
その結果、ブランク対照群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルが０．０００２２±１．３１ｘ１０－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳでＳＭＡヘテロ接合マウスに急性肺炎を誘発した後、溶媒群のマウスの肺組織におけるプラスミノ－ゲンのレベルは０．０００３３±３．７０×１０－５Ｕ／ｍｇに上昇した；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノ－ゲンを投与してから２時間後、プラスミノ－ゲンのレベルは０．００２３±１．７８×１０－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群の約７倍であった（図２６）。これは、ＬＰＳ誘発性肺組織損傷後、プラスミノ－ゲンが損傷部位に蓄積し、プラスミノ－ゲンの補給が損傷部位のプラスミノ－ゲンレベルの増加を有意に促進できることを示している。
実施例３２ プラスミノ－ゲンの投与はＳＭＡマウスの脊髄におけるＮＧＦレベルの増加を促進する
実施例２８で殺処分したマウスから脊髄組織を採取し、１０％中性ホルマリン固定液で２４時間固定した。固定された脊髄組織をアルコ－ル勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマ－カ－で組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を滴下して４℃で一晩インキュ－ベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベ－トし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコ－ル勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性バルサムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図２７Ａ）のマウスの脊髄が一定レベルのＮＧＦを発現し、溶媒群（図２７Ｂ）のマウスの脊髄におけるＮＧＦの発現レベルが有意に低下し、投与群（図２７Ｃ）のマウスの脊髄におけるＮＧＦの発現レベルが、溶媒群よりも優位に高く、２つの群間の統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図２７Ｄ）。これは、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの脊髄のＮＧＦの発現を促進できることを示している。
実施例３３ プラスミノ－ゲンの投与はＳＭＡマウスの脊髄における全長ＳＭＮ遺伝子の転写を促進する
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡ変異マウス８匹を取り、ランダムに２つの群に分け、溶媒群で４匹とし、投与群で４匹とした。同じ同腹子からの７匹の野生型マウスをブランク対照群として使用した。溶媒群及びブランク対照群のマウスに対して、最初の３日間では、３ｍｌ／ｋｇの溶媒を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、３日後から、６ｍｌ／ｋｇの溶媒を１日１回腹腔内注射により投与した。投与群のマウスに対して、最初の３日間では、３０ｍｇ／ｋｇ／回でプラスミノ－ゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ１回腹腔内注射により投与し、３日後から、６０ｍｇ／ｋｇのプラスミノ－ゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日１回腹腔内注射により投与した。投与９日後、すなわちＰＤ１１に、マウスを殺処分して脊髄組織を採取し、ＳＭＮ ｍＲＮＡ ｑＰＣＲ検出を行った。
その結果、投与群の脊髄組織における全長ＳＭＮ ｍＲＮＡのレベルが溶媒群よりも有意に高く、その差が統計的に有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２８）。これは、プラスミノ－ゲンが、ＳＭＡモデルマウスの脊髄における全長ＳＭＮ遺伝子の転写を促進できることを示している。
実施例３４ プラスミノ－ゲンの投与はＳＭＡマウスの運動機能を改善する
実施例３３のマウスについては、生後８日目と１０日目に立ち直り試験を行い、マウスの運動機能を評価した。
立ち直り試験は、幼いマウスの運動能力を評価するために使用された。具体的な操作は、マウスを仰向けに寝かせて置き、マウスが自力で立ち直るまでの時間を記録し、最長のテスト時間は３０秒であり、合計３回テストし、平均値をとった［１４］。
その結果、溶媒群のマウスの立ち直り時間は、ブランク対照群のマウスよりも有意に長く、その運動能力が大幅に低下したが、プラスミノ－ゲン投与後、溶媒群マウスと比較して、運動能力を改善し、ＳＭＡマウスの立ち直り時間を短縮することができた。Ｐ値は０．０５に近かったが、個数のせいでその差はまだ統計的有意性に達していなかった（図２９）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの運動能力を改善し、疾患の進行を遅らせることができることを示している。
実施例３５ プラスミノ－ゲンの投与はＳＭＡマウスの運動機能を改善する
実施例３３のマウスについては、生後１０日目、すなわちＰＤ１０にチュ－ブテストスコアを行い、マウスの運動機能を評価した。
チュ－ブテストスコアは、マウスの近位後肢の筋力、弱さと疲労、及び新生児の状態を評価するために使用される。さらに、一般的な神経筋機能、体の筋肉の強さを評価できる。マウスを後足で５０ｍｌの遠心管に逆さまにして吊るし、評価パラメ－タ－として次の３つの要素を使用した：１．吊り下げ時間、２．引き上げた回数（チュ－ブから脱離）、３．後肢スコア（ＨＬＳスコア）。ＨＬＳスコア：４点：後肢が正常に分離し、尾が上向きになっている；３点：明らかな脱力感があり、後肢が互いに接近しているが、ほとんど接触していない；２点：後肢が互いに接近しており、しばしば接触している；１点：明らかに脱力感があり、後肢は常に抱えた状態にあり、尾が上がっている；０点：後肢を抱えた状態を保持し続け、尾が垂れ下がっている；子マウスがチュ－ブにしがみつくことができない場合、ＨＬＳスコアは０点である。ＴＴＳ＝（吊り下げ時間＋引き上げ回数×１０）×（ＨＬＳ＋１）／４［１４］。
その結果、溶媒群のマウスのＴＴＳスコアは、ブランク対照群の野生型マウスのスコアよりも有意に低く、投与群にプラスミノ－ゲンを投与した後、ＳＭＡマウスのスコアが改善され、マウスの運動機能の低下傾向が改善された（図３０）。この結果は、プラスミノ－ゲンがＳＭＡマウスの神経筋機能の低下を改善し、疾患の進行を遅らせることができることを示している。

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Claims (15)

  1. 脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を患っている被験者に治療有効量のプラスミノ－ゲン経路活性化剤を投与することを含む、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法。
  2. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤がＳＭＮ遺伝子の転写及び／または発現を促進する、請求項１記載の方法。
  3. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が、被験者の筋力、筋緊張、運動機能、呼吸機能及び筋萎縮からなる群から選択される１つ以上を改善する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が被験者の生存期間を延長する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が被験者におけるＮＦ－κＢタンパク質の発現を促進する、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が、
    １）プラスミノ－ゲンの血液脳関門及び血液脊髄関門の通過を促進する効果、
    ２）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄へのプラスミノ－ゲンの蓄積を促進する効果、
    ３）ＳＭＡ被験者の損傷組織へのプラスミノ－ゲンの蓄積を促進する効果、
    ４）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるプラスミノ－ゲンのレベルを増加させる効果、
    ５）ＳＭＡ被験者の損傷組織の局所におけるプラスミノ－ゲンのレベルを増加させる効果、
    ６）ＳＭＡ被験者の損傷組織への損傷を軽減する効果、
    ７）ＳＭＡ患者の損傷組織の炎症修復を促進する効果、
    ８）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮΔ７の転写を促進する効果、
    ９）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＳＭＮタンパク質のレベルを増加させる効果、
    １０）ＳＭＡ被験者の脳及び脊髄におけるＮＧＦの発現を促進する効果、ならびに
    １１）ＳＭＡ被験者の成長と発達を促進する効果
    からなる群より選択される１つ以上の効果を有する、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が、１つまたは複数の他の薬剤または治療方法と組み合わせて使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）または筋肉内によって投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記プラスミノ－ゲン経路活性化剤がプラスミノ－ゲン活性化経路の成分である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記プラスミノ－ゲン活性化経路の成分がプラスミノ－ゲンである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記プラスミノ－ゲンがヒト全長プラスミノ－ゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記プラスミノ－ゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノ－ゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記プラスミノ－ゲンが、配列１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノ－ゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記プラスミノ－ゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノ－ゲン、Ｌｙｓ－プラスミノ－ゲン、ミニプラスミノ－ゲン、マイクロプラスミノ－ゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノ－ゲン、またはそれらの、プラスミノ－ゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記プラスミノ－ゲンが、配列２、６、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、請求項１０に記載の方法。


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