JP2023525007A - 転位に基づく療法 - Google Patents

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Abstract

標的転位のために新規のトランスポザーゼ及び/またはキメラトランスポザーゼを利用する、遺伝子療法組成物及び方法が提供される。【選択図】図17A

Description

本発明は、部分的には、ヒトゲノムセーフハーバー部位(GSHS)を標的とするための、転位可能な酵素(例えば、操作されたトランスポザーゼ及び/またはキメラトランスポザーゼ)ならびにトランスポゾンを使用する二重系に関する。
優先権
本出願は、2020年5月4日に出願された米国仮特許出願第63/019,709号、2020年5月20日に出願された米国仮特許出願第63/027,561号、2020年7月29日に出願された米国仮特許出願第63/058,200号、及び2021年4月15日に出願された米国仮特許出願第63/175,345号の優先権及び利益を主張し、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、EFS-Webを介して本明細書とともに電子的に提出されるASCIIフォーマットの配列表を含む。2021年5月3日に作成されたASCIIコピーは、SAL-003PC_ST25.txtという名前で182,990バイトのサイズである。この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒト遺伝子療法は、遺伝性及び後天性疾患を含む様々な疾患及び状態を治療及び緩和するための遺伝子を提供する、有望なアプローチである。遺伝子療法は、(疾患を引き起こす)変異遺伝子を遺伝子の健全なコピーで置換もしくは補完すること、不適切に機能している変異遺伝子(もしくは任意の他の遺伝子)を不活性化もしくはサイレンシングすること、または染色体に新しい遺伝子を導入することを含む。遺伝子を宿主ゲノムに安全かつ効率的に組み込む能力は、ヒトにおける遺伝子療法の成功に不可欠である。
現在、遺伝子療法試験における遺伝子の永続的または一過性の導入のために最も一般的に使用されるベクターは、ウイルスベースである。ウイルスベクターを使用して高効率で安定したゲノムの組み込みを達成することは可能であるが、複数の研究が深刻な欠点及び安全性の懸念を示している。したがって、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス(AAV)は、投与または再投与を制限する宿主ヒト応答を誘発することが示されており、一方でレトロウイルス/レンチウイルスは、優先的にユークロマチンに導入遺伝子を組み込み、それによって挿入変異誘発または発がんのリスクを増加させる。ウイルス系はまた、カーゴサイズが制限され、導入遺伝子及びそれらの調節エレメントのサイズ及び数が制限される。ウイルスベクター-宿主相互作用は、免疫原性を含み得、宿主ゲノム内のウイルスベクターDNAの組み込みは、遺伝毒性効果を有し得る。また、AAVゲノムは、主に感染細胞の核内にエピソーム形態で存在するため、細胞増殖(例えば、肝臓成長または他の臓器成長など)の条件では失われ、治療有効性が制限される可能性がある。したがって、病原性、高価な生成、及び全身の不安定性などのウイルスベクターの制限は、ウイルスベースの系の使用に対する主要な障害であることが証明されている。実際、ウイルスベースのベクターの再投与は、生命を脅かす全身効果をもたらし得る免疫応答を促進し、遺伝子導入の有効性を制限し得る。Kay et al.Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:4686-91、Hernandez et al.,J Virol 1999;73:8549-58を参照されたい。
非ウイルスベクター(すなわち、脂質ベース、ポリマーベース、脂質-ポリマーベース、及びポリ-リジン)は、トランスジェニックDNAまたはRNAを、細胞標的に到達するまでカプセル化するための合成ツールである。ウイルスベクターと比較して、非ウイルスベクターは、一般に、調製が安全であり、病原性及び免疫学的合併症のリスクが低減される。非ウイルスベクターは、標的療法のために非ウイルスベクターの表面を修飾することによって設計されている。例えば、Lestini et al.,J Control Release 2002;78:235-47を参照されたい。
ヌクレアーゼはまた、非ウイルス性ヒト遺伝子療法における使用についても評価されている。クラスター化され、規則的な間隔の空いた短い回文配列の反復(CRISPR)/CRISPR関連(Cas9)及び転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼ(TALEN)系は、二本鎖DNA切断(DSB)を誘発する。DSBは、特定の配列で導入遺伝子を挿入するために相同組換えを強化するが、未知の遠隔部位でのオフターゲットDNA切断は、検出のために複雑な遺伝毒性スクリーニングを必要とする不用意な変異を引き起こす。CRISPR系は、ユーザ定義のガイドRNA(gRNA)と複合体を形成したCas9を使用して、相補的配列を認識し、切断する。TALEN及びCRISPRはともに、宿主相同性指向修復を使用して、所望の配列に同時送達ドナーテンプレートを導入する。TALEN及びCRISPRアプローチは、効率的な遺伝子導入を示すが、それらの細胞毒性及び遺伝毒性効果に関する懸念は、依然として臨床用途にとって重大な障害である。さらに、相同性指向修復を使用した遺伝子付加には複製が必要であるため、ヌクレアーゼ技術は分裂組織に限定される(すなわち、中枢神経系などの非分裂組織においては効果的ではない)。プライム編集及び塩基対編集などの他の遺伝子編集技法は、塩基対または小さなヌクレオチド伸長を補正することに限定される。これらの特徴は、この技術のインビボ及びエクスビボの適用を、単一の一般の病原性ヌクレオチドバリアントを有する疾患に制限する。しかしながら、ほとんどの遺伝的障害は、1つ以上の遺伝子に数百またはさらには数千の病原性ヌクレオチドバリアントを有する。
リコンビナーゼは、トランスポゾンの末端で特定の配列を認識して結合し、末端間のシナプス相互作用を媒介してそれらを一緒にし、標的DNAと相互作用し、DNA破断及び組換えの基礎となる接合反応を行なう。インテグラーゼは、(例えば、ウイルスの)DNAを別のDNA片、通常は宿主染色体に組み込むことができるリコンビナーゼ酵素である。
DNAトランスポゾンは、「カット・アンド・ペースト」機序を使用する可動エレメントである。DNAは、ドナー分子からの二本鎖切断によって切除され、アクセプター分子に組み込まれる。トランスポゾンは、トランスポゾンの末端に結合し、宿主内の特定のゲノム位置へのその移動を触媒する酵素であるトランスポザーゼの存在下で、DNA上の1つの位置からDNA上の第2の位置へと移動する。
トランスポザーゼに基づく遺伝子療法における主な懸念は、ほとんどが既知の配列(例えば、TTAA(配列番号1)配列)、がん遺伝子を活性化するか、腫瘍抑制遺伝子を中断するか、または正常遺伝子の転写を妨害する遺伝子座の近くまたは内部での、ランダムな組み込みによる挿入突然変異誘発である。したがって、非ウイルス、トランスポゾン遺伝子療法アプローチは、遺伝的障害を有する個体を治療するための大きな可能性を有するが、課題は、ランダム挿入のリスクを低減することである。
したがって、挿入変異誘発及び発がんのリスクを低減するために、例えば、トランスポザーゼなどの転位が可能な酵素の安全性を向上させる臨床的必要性がある。
したがって、本発明は、部分的に、療法において特に使用されるが、既存のトランスポザーゼの制限を回避する新規のトランスポザーゼ組成物を提供する。
態様では、遺伝子両方での使用に好適な哺乳類トランスポザーゼ、及び有利には耐久性のある大きなペイロード(例えば、トランスポゾン)を用いた遺伝子療法が提供される。態様では、哺乳類トランスポザーゼは、N末端アミノ酸置換及びC末端アミノ酸欠失を有するように設計されたMyotis lucifugusトランスポザーゼ(MLTトランスポザーゼ)の操作されたバージョンである。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、例えば、配列番号2のS8、C13、及び/またはN125位に対応する位置における活性を改善するためのアミノ酸置換を有するようにさらに操作される。
態様では、トランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)またはトランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む組成物が提供され、トランスポザーゼ酵素は、配列番号2に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、トランスポザーゼ酵素は、配列番号2のS2位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
本発明は、図1A~Dまたは図2に示されるような、転写活性化因子様エフェクタータンパク質(TALE)DBDまたはガイドRNA(gRNA)によってプログラムされる不活性体(dCas9)(dCas9/gRNA複合体と称される)などの、転位によるゲノム組み込みが可能なモノマーまたはヘッド・トゥ・テール(head-to-tail)型二量体酵素及びDNA結合ドメイン(DBD)を含む遺伝子導入系または構築物を提供する。転位が可能な酵素(例えば、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼ)に融合されたDBDを有するこれらのキメラ系は、トランスポザーゼがランダムな認識部位に結合するのを防止するように、トランスポザーゼ認識部位の近くの特定の配列[例えば、TALE反復可変二残基(RVD)またはgRNA]への酵素の結合を指向する。いくつかの実施形態では、遺伝子導入系の酵素(例えば、トランスポザーゼ)は、ヒトゲノムセーフハーバー部位(GSHS)に結合する。本明細書に記載のTALEは、酵素をGSHSに物理的に隔離し、RVD TALEヌクレオチド配列に近接した近傍のTTAA(配列番号1)配列への転位を促進することができる。オープンクロマチン部位におけるGSHSは、トランスポザーゼがオープンクロマチンに挿入する傾向に基づいて特異的に標的とされる。加えて、dCas9(すなわち、ヌクレアーゼ活性が欠損している)は、GSHS内の所望のDNA配列で結合するように指向されるgRNAでプログラムされる。
いくつかの態様では、(a)TALE DBDまたはdCas9/gRNA DBD、(b)転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素、核酸分子におけるGSHS配列中のTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な酵素、及び(c)TALEまたはCas/gRNA DBDと酵素とを接続するリンカーを含む、転位可能な酵素を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、酵素、例えば、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ酵素は、二量体形態(例えば、ヘッド・トゥ・テール型二量体)である。いくつかの実施形態では、酵素は、四量体形態または別の多量体形態である。いくつかの実施形態では、酵素は、単量体形態である。
いくつかの実施形態では、組成物は、生体細胞と接触したときにGSHS内のトランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である。TALE DBDまたはdCas/gRNA複合体は、トランスポザーゼ酵素をGSHS配列に指向するのに好適であり得る。実施形態では、組成物は、dCas/gRNA複合体を含む。
いくつかの実施形態では、(a)dCas9/gRNA複合体、(b)転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素(当該酵素は、核酸分子内のGSHS配列内のTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能である)、及び(c)dCas/gRNA複合体と酵素とを接続するリンカーを含む、転位が可能な酵素を含む組成物が提供される。
実施形態では、GSHSは、染色体におけるオープンクロマチン位置にある。いくつかの実施形態では、GSHSは、アデノ関連ウイルス部位1(AAVS1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体、及びヒトRosa26遺伝子座から選択される。いくつかの実施形態では、GSHSは、ヒト染色体2、4、6、10、11、または17上に位置する。
いくつかの実施形態では、GSHSは、図3及び図4に列挙される部位またはそれらのバリアント(例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を有する)から選択される。いくつかの実施形態では、TALE DBDは、図3の配列またはそのバリアント(例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を有する)を含む。いくつかの実施形態では、dCas/gRNA DBDは、図4の配列またはそのバリアント(例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を有する)を含む。
いくつかの実施形態では、GSHSは、TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位の約25、または約50、または約100、または約150、または約200、または約300、または約500ヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態では、GSHSは、TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位から500ヌクレオチド超である。
実施形態では、TALE DBDは、1つ以上の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、TALE DBDまたは反復可変二残基(RVD)は、約14、または約15、または約16、または約17、または約18、または約18.5個のアミノ酸反復配列を含む。いくつかの実施形態では、RVDは、33または34アミノ酸を含むTALEアミノ酸反復配列内に含まれる。
いくつかの実施形態では、TALE DBD反復配列のうちの1つ以上は、33または34アミノ酸の残基12または13にRVDを含む。RVDは、標的DNAのある特定の塩基対(複数可)または残基(複数可)を認識することができる。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の1つの塩基対を認識する。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「C」残基を認識し、かつRVDは、HD、N(ギャップ)、HA、ND、及びHIから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「G」残基を認識し、かつRVDは、NN、NH、NK、HN、及びNAから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「A」残基を認識し、かつRVDは、NI及びNSから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「T」残基を認識し、かつRVDは、NG、HG、H(ギャップ)、及びIGから選択される。実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素)は、TAジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、TTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸は、インテインを含む。実施形態では、核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切除時に、第1及び第2の部分が機能的酵素に融合されるように、第1の部分と第2の部分との間にインテインがコードされている第1及び第2の部分の形態で酵素をコードする。
実施形態では、酵素は、リコンビナーゼまたはインテグラーゼである。実施形態では、リコンビナーゼは、インテグラーゼである。実施形態では、インテグラーゼは、トランスポザーゼであるか、またはリコンビナーゼは、トランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、超活性を付与する1つ以上の変異を有する。実施形態では、トランスポザーゼは、任意選択でヘルパーRNAによってコードされる、哺乳動物由来トランスポザーゼである。
実施形態では、酵素は、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、またはMyotis lucifugusに由来する。実施形態では、酵素は、単量体、二量体、四量体(もしくは別の多量体)、超活性体であるか、またはBombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、またはMyotis lucifugusに由来する非TTAA(配列番号1)認識部位(Int-)との相互作用が低減している酵素を含むが、これに限定されない操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Myotis lucifugusランスポザーゼ(本明細書においてMLTまたはMLTトランスポザーゼと称される)であり、野生型、単量体、二量体、四量体(もしくは別の多量体)、超活性体、Int-変異体、または任意の他のバリアントのいずれかであり得る。
実施形態では、MLTトランスポザーゼの超活性形態またはInt-形態は、L573X、E574X、及びS2Xから選択される1つ以上の変異を有し、Xは任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でXは、A、G、または欠失であり、任意選択で変異は、L573del、E574del、及びS2Aである。
実施形態では、補正され、操作されたMLTトランスポザーゼと本明細書において称されるMLTトランスポザーゼは、L573del、E574del、及びS2A変異を有する。そのようなMLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントを含む。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントによってコードされる。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号4のアミノ酸、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号5のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
実施形態では、超活性体、Int-、または他の形態のMLTトランスポザーゼは、図5A及び5Bからの変異、例えば、限定されないが、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を含む。実施形態では、トランスポザーゼは、図5A及び5Bに示される変異のうちのいずれか、またはそれらの同等物を含むことができる。
実施形態では、本開示の実施形態によるMLTトランスポザーゼは、MLTトランスポザーゼに超活性を付与する1つ以上の超活性変異を含む。実施形態では、超活性変異体は、S8、C13、及びN125に1つ以上の置換を含む。実施形態では、超活性変異は、S8P、C13R、及びN125K変異のうちの1つ以上を含む。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、S8P、C13R、及びN125K変異のうちの少なくとも1つに対応する位置に超活性変異を有するアミノ酸配列を有する。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、超活性N125K変異に対応する位置に変異を有する、配列番号7のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、超活性S8P及びC13R変異に対応する位置に変異を含む、配列番号9のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、S8P、C13R、及びN125K変異のうちの少なくとも1つに対応する位置に超活性変異を有するアミノ酸配列を有する。配列番号2のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼは、N125K変異を有しない2つの超活性変異(S8P及びC13R)を有し得るか、または配列番号2のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼは、任意の他の変異(複数可)(例えば、図5A及び5Bにおける変異のうちのいずれか1つ以上)を有し得ることを理解されたい。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、S8P、C13R、及びN125K変異に対応する位置に超活性変異を含む、配列番号340のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスに由来する。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、Pan troglodytes、またはPteropus vampyrusのうちのいずれかに由来する(図7を参照されたい)。トランスポザーゼは、図5A及び5Bから選択される1つ以上の超活性及び/または組み込み欠損変異、またはそれらの同等物を有することができる。当業者は、図7を参照して、そのような変異体をTrichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、またはPteropus vampyrusのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。また、当業者は、そのような変異体をBombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスからのトランスポザーゼに対応させることができる。
いくつかの実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ)は、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、及びMolossus molossusのうちのいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約93%、または少なくとも約95%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、及びMolossus molossusのうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約93%、または少なくとも約95%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ)は、操作されたバージョンであり、単量体、二量体、四量体、超活性体であるか、またはBombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、Pan troglodytes、Molossus molossus、及びホモ・サピエンスのうちのいずれかに由来する、非TTAA(配列番号1)認識部位(Int-)との相互作用が低減されているトランスポザーゼ酵素を含むが、これに限定されない。トランスポザーゼ酵素は、野生型、単量体、二量体、四量体、または別の多量体、超活性体、またはInt-変異体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、TALE DBDと、転位によって標的ゲノム組み込みが可能な酵素とを接続するリンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、可撓性リンカーは、実質的に、グリシン及びセリン残基を含み、任意選択で、可撓性リンカーは、(GlySer)を含み、nは、約1~約12である。可撓性リンカーは、約20、または約30、または約40、または約50、または約60アミノ酸残基であり得る。
本開示の実施形態による転位が可能な酵素を含む組成物は、1つ以上の非ウイルスベクターを含むことができる。また、酵素(例えば、キメラトランスポザーゼ)は、導入遺伝子を有するトランスポゾンと同じベクター(シス)または異なるベクター(トランス)上に配置することができる。したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子を包含するキメラトランスポザーゼ及びトランスポゾンは、それらが同じベクターに含まれるようにシス構成である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を包含するキメラトランスポザーゼ及びトランスポゾンは、それらが異なるベクターに含まれるようなトランス構成である。ベクターは、本開示による任意の非ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素(例えば、キメラトランスポザーゼ)をコードする核酸が提供される。核酸は、DNAまたはRNAであり得る。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸は、DNAである。いくつかの実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素(例えば、キメラトランスポザーゼ)をコードする核酸は、例えば、ヘルパーRNAなどのRNAである。実施形態では、キメラトランスポザーゼは、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
実施形態では、トランスポゾンをコードする核酸は、「ドナーDNA」と称されるDNAである。実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素(例えば、キメラトランスポザーゼ)をコードする核酸は、ヘルパーRNAである。実施形態では、ドナーDNAは、プラスミドに組み込まれる。実施形態では、ドナーDNAは、プラスミドである。いくつかの態様では、本開示の実施形態による核酸を含む、宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物または核酸が提供され、組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)の形態である。
実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じ脂質ナノ粒子(LNP)内に含まれる。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じLNPに組み込まれるか、またはそれと会合する混合物である。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じLNPに組み込まれるか、またはそれと会合する共製剤の形態である。
実施形態では、LNPは、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、ジメチルアミノエタン-カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体(DC-Chol)、ホスファチジルコリン(PC)、トリオレイン(グリセリルトリオレエート)、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000(DMG-PEG 2K)、及び1,2-ジステアロール-sn-グリセロール-3ホスホコリン(DSPC)から選択され、及び/またはポリエチレンイミン(PEI)及びポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、及びN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)から選択される1つ以上の分子を含む。
いくつかの実施形態では、LNPは、例えば、Patel et al.,J Control Release 2019;303:91-100に記載される通りであり得る。LNPは、構造脂質(例えば、DSPC)、PEGコンジュゲート脂質(CDM-PEG)、カチオン性脂質(MC3)、コレステロール、及び標的リガンド(例えば、GalNAc)のうちの1つ以上を含むことができる。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、細胞を酵素(例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ)と接触させることを含む、細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法が提供される。この方法は、インビボまたはエクスビボ方法であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、酵素をコードする核酸(例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ)と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするRNA、及び/または例えば、HS4及びD4Z4などの隣接絶縁体を有するトランスポゾンを含む構築物と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするDNAと接触される。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、1つ以上の逆位末端に隣接している。トランスポゾンは、組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4遺伝子(ABC)トランスポーター遺伝子(ABCA4)、またはその機能的断片である。別の例として、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子(VLDLR)もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子(LDLR)、またはその機能的断片である。
実施形態では、酵素は、キメラトランスポザーゼなどのトランスポザーゼであり、方法は、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する。
実施形態では、方法は、遺伝性または後天性疾患を治療することを必要とする患者においてそれを行うために使用される。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、遺伝性黄斑変性(IMD)(黄斑ジストロフィー(MD)とも称される)のクラス(Stargardt疾患(STGD)、Best病、X連鎖網膜剥離症、パターンジストロフィー、Sorsby眼底ジストロフィー、及び常染色体優性ドルーゼンを含む)を治療及び/または軽減するために使用される。STGDは、STGD1型(STGD1)であり得る。いくつかの実施形態では、STGDは、STGD3型(STGD3)またはSTGD4型(STGD4)疾患であり得る。IMDは、ABCA4、ELOVL4、PROM1、BEST1、及びPRPH2のうちの1つ以上における1つ以上の変異を特徴とし得る。遺伝子療法は、本開示によるキメラトランスポザーゼによる補助を用いて、トランスポゾンベースのベクター系を使用して実施することができ、これらは、導入される遺伝子と同じベクター(シス)上に提供されるか、または異なるベクター(トランス)上に提供されるか、またはRNAとして提供される。トランスポゾンは、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4(ABCA4)、またはその機能的断片を含むことができ、トランスポゾンベースのベクター系は、網膜特異的プロモーターの制御下で作動することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ホモ接合性FH(HoFH)もしくはヘテロ接合性FH(HeFH)などの家族性高コレステロール血症(FH)、または低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)の上昇したレベルに関連する障害を治療及び/または軽減するために使用される。遺伝子療法は、本開示による酵素(例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ)による補助を用いて、トランスポゾンベースのベクター系を使用して実施することができ、これらは、導入される遺伝子と同じベクター(シス)上に提供されるか、または異なるベクター(トランス、例えば、ドナーDNA/ヘルパーRNA系)上に提供される。トランスポゾンは、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子(VLDLR)もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子(LDLR)、またはその機能的断片を含み得る。トランスポゾンベースのベクター系は、肝臓特異的プロモーターの制御下で作動することができる。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、LP1プロモーターである。LP1プロモーターは、例えば、Nathwani et al.Blood vol.107(7)(2006):2653-61に記載されるように構築することができる、ヒトLP1プロモーターであり得る。
本開示による方法を使用して、任意の他の遺伝性または後天性疾患を治療及び/または軽減することができることを理解されたい。
本発明の詳細を以下の添付の説明に記載する。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、例示的な方法及び材料がここで説明される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。TALEは、転写活性化因子として機能するために核局在化シグナル(NLS)及び活性化ドメイン(AD)を含む。DNA結合ドメインは、12~13位に残留可変二残基(RVD)を有する33~34アミノ酸のおよそ16.5個の反復を有する。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。1つまたは複数のヌクレオチドに対する特異性を有するRVDが示されている。DNAリーディング鎖の塩基のみが示される。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。23アミノ酸長を超えるリンカーによって融合されたTALE DNA結合タンパク質を含むキメラトランスポザーゼ構築物(上)、及び1つ以上のガイドRNAに連結されたdCas9を含むキメラトランスポザーゼ構築物(下)である。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。キメラトランスポザーゼがオープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、TALEまたはdCas9/gRNAによって標的とされるDNA結合領域の近くのTTAA(配列番号1)認識部位にドナーDNAを挿入することを示す概略図である。TALEまたはdCas9/gRNAのGSHSへの結合は、モノマーまたは二量体としてのトランスポザーゼを同じ位置に物理的に隔離し、反復可変二残基(RVD)ヌクレオチド配列の近くの近傍のTTAA(配列番号1)配列(図3及び図4)への転位を促進する。全てのRVDには、図1Aに示されるNTRに結合するチミン(T)が先行する。 転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸(例えば、ヘルパーRNA)と、トランスポザーゼ(ドナーDNA)をコードする核酸とを含む、本開示の実施形態による系の非限定的な表現である。ヘルパーRNAは、特異的末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーDNAをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素(例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ)に翻訳される。酵素は、オープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、dCas9/gRNAまたはTALEによって標的とされるDNA結合領域の近くのTTAA(配列番号1)認識部位にドナーDNAを挿入することができる。dCas9/gRNAのTALE GSHSへの結合は、酵素を同じ位置に物理的に隔離し、近傍のTTAA(配列番号1)配列への転位を促進する(図3及び図4を参照されたい)。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 超活性MLT変異体を示す。 切除陽性及び組み込み欠損(Int-)MLT変異体を示す。 DNA結合ドメインを示す100%の信頼度を有する三次元MLTタンパク質構造を示す。 配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号4のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼの二次構造予測を示す。 配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号4のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼの二次構造予測を示す。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 構築物テンプレートの非限定的な例を示す。5’-m7Gキャップ1及びプソイドウリジン置換で後に処理されるトランスポザーゼRNAを転写するプラスミド構築物テンプレートを示す。 構築物テンプレートの非限定的な例を示す。任意の導入遺伝子とともに使用するための一般的なMLTドナーDNA構築物テンプレートを示す。 Yusa et al.(2010)の配列を使用した、超活性piggyBacトランスポザーゼ対超活性MLTバリアント(S8P/C13R二重変異体;L573del E574del)の組み込み効率を示す棒グラフである。 Yusa et al.(2010)の配列を使用した、超活性piggyBacと比較した、操作されたMLT(S8P/C13R二重変異体;L573del E574del、S2A)の組み込み効率を示す棒グラフである。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT及びWO2010085699からの配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性73.68%、ギャップ1.16%)。 MLT及びWO2010085699からの配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性73.68%、ギャップ1.16%)。 MLT(S8P、C13R、及びN125K変異を有する、L573del/E574del/S2A)及びMitra et al.による公開された配列のアラインメントを示す(MitraはC末端に2つの余剰アミノ酸を含んでいた)。 操作されたMLTのアミノ酸(S8P及びC13R変異を有する、L573del/E574del/S2A、「MLT」)と、WO2010085699からの配列との比較を示す。 MLTの左末端と、公開された配列(Ray et al.,piggyBac1_ML)との比較を示す。 MLTの右末端と、公開された配列(Ray et al.piggyBac1_ML)との比較を示す。 組み込みアッセイのために、Myotis lucifugusトランスポザーゼ(MLT)またはpiggyBac(PB)トランスポザーゼのいずれかとともに使用されるDNAドナー構築物テンプレートを示す。DNAドナー構築物テンプレートは、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を駆動するサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを有する。 HeLa細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。哺乳類トランスポゾン(Ts)バリアントS8P、C13R、N125K、及びS8P/C13Rが、ネイティブ酵素よりも高い切除頻度を有することを示す。 HeLa細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。ドナーネオマイシン導入遺伝子、1:20の連続希釈物でトランスフェクトしたHeLa細胞における機能的導入遺伝子発現を示す。哺乳類MLTトランスポザーゼバリアントS8P/C13Rは、HeLa細胞における昆虫piggyBacと同等の相対的組み込みを示した。 MLTなし、MLT、N125K変異体、及びS8P/C13R変異体について、HEK293細胞におけるMLTトランスポザーゼ超活性変異体の組み込み効率のパーセント(%)を示す棒グラフである。二重変異体S8P/C13Rは、HEK293細胞において最高の組み込み効率が観察されたことを示す。MLTトランスポザーゼは、配列番号4のアミノ酸配列を含み、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされるMLTトランスポザーゼである。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。アミロース-樹脂カラムによる精製MBP-MLTトランスポザーゼ融合タンパク質の分析を示す。アミロース樹脂のカラム上で超音波処理された細菌の上清から発現されたタンパク質(MBP-MLTトランスポザーゼ)を精製した後、100+kDaの主要なタンパク質バンドを、SDS-PAGEによって同定した。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。TEVプロテアーゼ及びヘパリン溶出によるMBPタグの一晩の切断後に、67.5kDaのMLTトランスポザーゼ特異的バンドが示されたを示す。 マルトース結合タンパク質(MBP)-MLTトランスポザーゼ融合タンパク質のSuperdexサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 MLTトランスポゾンを含むドナープラスミドの一例を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-dCas9、MLT-dCas12j、超活性piggyBac-dCas12j、超活性piggyBac-dCas9、超活性piggyBac、及びMLTについての組み込み活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の切除活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の組み込み活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-dCas12j、MLT-dCas9、MLT-Intein-N末端dCas9、MLT-Intein-N末端、MLT-Intein-N末端TALE、MLT-TALE10、及びMLTの切除活性の%を示す。hROSA29におけるTTAA(配列番号1)部位から27bp及び49bpのMLT-TALE10。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本発明の実施形態による、piggyBacトランスポザーゼDNA結合ドメインDBDの破壊による特異性の改善のためのモデルの非限定的な概略図である。 例えば、NpuN(Intein-N)(配列番号423)及びNpuC(インテイン-C)(配列番号424)インテインタンパク質スプライシングを使用することによって、dCasに付着したMLTトランスポザーゼを示す。他のdCasを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。 TALE DNAバインダーに付着したキメラMLTトランスポザーゼ構築物を示す。他のTALE及びトランスポザーゼは、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。 本開示において同定される、超活性piggyBacトランスポザーゼドナー及びCas9/gRNAを有するヘルパーを使用して、ヒトROSA26への標的挿入を含有する陽性クローン株を示す。 Cas9、及びTTAA(配列番号1)標的部位からそれぞれ61bp及び62bpであった2つの異なるgRNAのセット(セット1:AATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号425)、TGCCCTGCAGGGGAGTGAGC(配列番号426);セット2:GAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号427)、CCTGCAGGGGAGTGAGCAGC(配列番号428))を有するMLTヘルパーを使用した、ヒトROSA26遺伝子座内の特異的TTAA(配列番号1)部位におけるドナーMLTの挿入を検出するネステッドPCR戦略を示す。 本開示で同定された、Cas9/gRNAを有するMLTヘルパーでのトランスフェクション後、hROSA26においてMLTドナーが挿入されるときに予想されるネステッドPCR断片を示す1.0%アガロースゲルを示す。 本開示において同定された、Cas9/gRNAを有するMLTヘルパーでのトランスフェクション後、hROSA26においてMLTドナーが挿入されるときの正しいジャンクションDNA配列を示すDNA配列決定クロマトグラムを示す。 異なる条件下でトランスフェクトして、Huh7がGFPを発現することを示す初期Huh7細胞株を示す。行は(上から)、未処理細胞、模擬細胞、MLTで処理した細胞、及びpmaxGFPで処理した細胞を示し、列は、1日目(D1)、3日目(D3)、及び7日目(D7)の対照を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの24時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの72時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの1週間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 トランスフェクションの14日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のHEK293細胞の生存率を示す。トランスフェクションの14日後の96ウェルプレートにおける細胞生存率は、わずかに良好である。未処理細胞と処理細胞との間の細胞生存率に顕著な差はない。 トランスフェクションの21日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のHEK293細胞の生存率を示す。トランスフェクションの21日後の96ウェルプレートにおける細胞生存率は、わずかに良好である。未処理細胞と処理細胞との間の細胞生存率に顕著な差はない。 トランスフェクションの14日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のGFP/mCherry陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。FACsゲーティング戦略を各実験内のサンプルに適用した。GFP陽性及びmCherry陽性細胞集団の選択を得た。mCherry RNA発現は、14日目に検出不可能であった。最も高いGFP陽性細胞%が、リポフェクタミンT25フォーマットで観察された。組み込み効率は、14日目に35%であった。 トランスフェクションの21日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のGFP/mCherry陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。FACsゲーティング戦略を各実験内のサンプルに適用した。GFP陽性及びmCherry陽性細胞集団の選択を得た。最も高いGFP陽性細胞%が、リポフェクタミンT25フォーマットで観察された。組み込み効率は、21日目に37%であった。 T25フラスコにおけるヌクレオフェクションリポフェクション後のGFP陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。GFP陽性細胞%は、CMV-GFP MLTドナー単独では、CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAと比較して同じであった。CMV-GFP MLTドナー単独でトランスフェクトしたHEK293細胞において、GFP陽性率%は急速に低下し、21日目に5%に達した。CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAでトランスフェクトしたHEK293細胞において安定化したGFP陽性率%は、21日目に42%に達した。組み込み効率は、37%と算出された。上の曲線は、「CMV-GFPドナー」である。 RNAもDNAもHEK293細胞の生存率に影響を与えず(図29A及び29B)、RNA発現は、トランスフェクション後に急速に減少し、14日目までに検出不可能となり(図29C及び29D)、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系が、高い組み込み効率を有する(図29E)と判断した、FACSゲーティング戦略を示す。Aは全ての細胞を示す。Bは単一の細胞を示す。Cは生細胞を示す。DはGFP単一陽性細胞、mCherry単一陽性細胞、二重陽性細胞、及び二重陰性細胞を示す。 RNAもDNAもHEK293細胞の生存率に影響を与えず(図29A及び29B)、RNA発現は、トランスフェクション後に急速に減少し、14日目までに検出不可能となり(図29C及び29D)、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系が、高い組み込み効率を有する(図29E)と判断した、FACSゲーティング戦略を示す。Aは全ての細胞を示す。Bは単一の細胞を示す。Cは生細胞を示す。DはGFP単一陽性細胞、mCherry単一陽性細胞、二重陽性細胞、及び二重陰性細胞を示す。 HT1080細胞のトランスフェクションの24時間後のCMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーDNAのトランスフェクションを示す。24時間での結果は、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系と同様である。 HT1080細胞のトランスフェクションの2週間後のCMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーDNAのトランスフェクションを示す。結果は、DNA MLTドナー/MLT DNAヘルパー系(約20% GFP+細胞)が、DNA MLTドナー/MLT DNAヘルパー系と比較して、より低い組み込み効率を有することを示唆する。
本発明は、部分的に、例えば、療法における使用を見出す遺伝子挿入が可能な操作されたトランスポザーゼ酵素の発見に基づいている。態様では、操作されたMLT酵素(時折、「操作された」、「補正された」、「本発明のMLT」、「MLT1」、または「MLT2」と称される)が提供される。
本発明は、部分的に、単量体または二量体としての転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素(例えば、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、もしくはトランスポザーゼ酵素)が、転写活性化因子様エフェクタータンパク質(TALE)DNA結合ドメイン(DBD)またはdCas9/gRNAと融合され、それによって部位または遺伝子座特異的転位が可能なキメラ酵素を作製することができるという発見に基づいている。酵素(例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ)は、宿主ゲノム内のある特定の部位に対するTALE DBDの特異性を利用し、これにより、DBDを使用してゲノム内の任意の所望の位置を標的とすることが可能になる。このようにして、本開示によるキメラトランスポザーゼは、導入遺伝子の標的組み込みを達成することを可能にする。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、リコンビナーゼまたはインテグラーゼである。実施形態では、リコンビナーゼは、インテグラーゼである。実施形態では、インテグラーゼは、トランスポザーゼであるか、またはリコンビナーゼは、トランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、超活性を付与する1つ以上の変異を有する。実施形態では、トランスポザーゼは、哺乳動物由来トランスポザーゼ、任意選択でヘルパーRNAトランスポザーゼである。したがって、遺伝子導入のための本組成物及び方法は、二重トランスポゾン/トランスポザーゼ系を利用する。転位性エレメントは、自然界に普遍的に見出される非ウイルス遺伝子送達ビヒクルである。トランスポゾンベースのベクターは、細胞における導入遺伝子構築物の安定したゲノム組み込み及び長期的な発現の能力を有する。一般に、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系は、目的の導入遺伝子(複数可)を含むトランスポゾンDNAが、反復配列部位におけるトランスポザーゼ酵素によって染色体DNAに組み込まれるカット・アンド・ペースト機序を介して作用する。二重トランスポゾン/トランスポザーゼ(または「ドナー/ヘルパー」)プラスミド系は、ヒトゲノムにDNAフットプリントを残すことなく、TTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位などの逆位末端(「末端」)に隣接する導入遺伝子を挿入する。トランスポザーゼ酵素は、(トランスポゾンをコードするベクターと同じまたは異なるベクター上で)一過性に発現され、ドナープラスミドから宿主ゲノムへの挿入イベントを触媒する。ゲノム挿入は、主にイントロンを標的とするが、他のTTAA(配列番号1)部位を標的とし、ヒト遺伝子のおよそ50%に組み込まれ得る。
遺伝子療法のためのトランスポゾン系の選択は、系の組み込み部位の好みに依存する。例えば、piggyBac(PB)トランスポゾンは、主にイントロンを標的とする挿入で、転写単位を選好する。いくつかのトランスポザーゼは、DNA酵素複合体が宿主DNAの近傍にもたらされても、触媒活性のために宿主DNA内のある特定の部位を必要とする。例えば、Tcl/マリナートランスポゾンは、TAジヌクレオチドに組み込まれ(Fischer et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:6759-64)、かつpiggyBac(PB)トランスポゾンは、TTAA(配列番号1)テトラヌクレオチドに組み込まれる(Mitra et al.,EMBO J 2008;27:1097-109)。ヌクレアーゼベースの技法よりもトランスポザーゼベースのゲノム標的を使用する利点は、トランスポゾン挿入のコピー数をアッセイすること(例えば、(nr)LAM-PCR)によって、カット・アンド・ペースト機序を介した組み込みが容易に識別されることである。したがって、単一の挿入クローンが、追加のDNA修飾を有すると予想されない。比較すると、標的可能なヌクレアーゼは、識別可能な挿入物を導入することなくゲノムを変異させることが可能である。したがって、修飾細胞のDNA完全性を確認することは困難であり得る。オフターゲットヌクレアーゼ変異を識別するためのゲノムスクリーニングは複雑であり、配列包括度が制限される。
上述のように、ウイルス(例えば、AAV、レンチウイルスなど)及びヌクレアーゼベースの(例えば、CRISPR/Cas、プライム編集塩基編集)遺伝子療法は、典型的には、変異誘発リスクによって制限され、また、免疫原性、製造コスト、カーゴサイズ、及び可逆性などの欠点を有する。トランスポゾンは、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスよりもプロトがん遺伝子を活性化する可能性が低いが、導入遺伝子が意図した位置以外の宿主ゲノムの1つ以上の位置に挿入されると、挿入変異誘発を引き起こす。特に、TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位などのトランスポザーゼによって認識されるゲノム部位は、導入遺伝子がゲノム内の意図しない位置に挿入され、宿主に破壊的、しばしば重度の影響を与えることができるような、ゲノム内の複数の位置に見出すことができる。例えば、挿入変異誘発は、代謝遺伝子の機能に影響を及ぼし得る。したがって、安全かつ効率的な遺伝子療法ツールとしての二重トランスポゾン/トランスポザーゼ系の機能を改善するために、トランスポザーゼの結合及び挿入の特異性を増加させ、制御することが所望される。
したがって、いくつかの態様では、(a)TALE DBDまたはdCas9/gRNA複合体、(b)転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素であって、核酸分子におけるGSHS中のTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な酵素、及び(c)TALE DBDまたはdCas9/gRNA複合体と酵素とを接続するリンカーを含む、転位が可能な酵素を含む組成物が提供される。実施形態では、酵素(例えば、トランスポザーゼ酵素)は、ヘッド・トゥ・テール二量体である。いくつかの実施形態では、酵素は、四量体である。いくつかの実施形態では、酵素は、モノマーである。
実施形態では、TALEまたはdCas9/gRNA DBDは、転位が可能な酵素(例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ)を、ヒトGSHSに特異的に結合させる。実施形態では、TALEまたはdCas9/gRNA DBDは、トランスポザーゼをGSHSに隔離し、反復可変二残基(RVD)TALEまたはgRNAヌクレオチド配列に近接して位置し得る、近傍のTAジヌクレオチドまたはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位への転位を促進する。GSHS領域は、トランスポザーゼ活性の影響を受けやすいオープンクロマチン部位に位置する。したがって、トランスポザーゼは、TAまたはTTAA(配列番号1)部位を認識するその能力に基づいて作動するだけでなく、TALEまたはdCas9/gRNA DBDに近接する特定の位置に(導入遺伝子を有する)トランスポゾンを指向する。本開示の実施形態によるキメラトランスポザーゼは、遺伝毒性のリスクが極めて低く、既存の遺伝子療法と比較して優れた特徴を示す。
実施形態では、例えば、dCas9と会合するgRNAは、AATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号425)及び/またはTGCCCTGCAGGGGAGTGAGC(配列番号426)である。実施形態では、例えば、dCas9と会合するgRNAは、GAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号427)及び/またはCCTGCAGGGGAGTGAGCAGC(配列番号428)である。
いくつかの実施形態では、キメラトランスポザーゼは、オフターゲット配列の結合が低減または阻害されることを特徴とし、その結果、転位のために、TALEまたはdCas9/gRNA DBDなど、それに融合したDBDに依存するように変異される。
記載される組成物及び方法は、変異原性リスクを増加させるランダムなベクター及び導入遺伝子の挿入を低減させることを可能にする。記載される組成物及び方法は、ウイルス及びヌクレアーゼ媒介遺伝子療法と比較して遺伝毒性を低減するトランスポゾーム系を利用する。二重系は、活性トランスポザーゼの持続を回避し、著しい細胞毒性を伴わずにヒト細胞株を効率的にトランスフェクトするように設計されている。
いくつかの実施形態では、組成物は、GSHSを含む細胞と接触したときにGSHS中のトランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である。
いくつかの実施形態では、TALEまたはdCas9/gRNA DBDは、トランスポザーゼ酵素をGSHS配列に指向するのに好適であり得る。
実施形態では、TALEまたはdCas9/gRNA DBDは、カスタマイズ可能であり、TALEまたはdCas9/gRNA DBDなどは、特定のゲノム位置を標的とするために選択することができる。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位に近接している。
実施形態では、CRISPR(クラスター化され、規則的な間隔の空いた短い回文配列の反復)関連タンパク質9(Cas9)またはそのバリアントが、酵素を目的の遺伝子座に標的する。Cas9は、一般ヌクレアーゼであり、ガイドRNA(gRNA)が、目的のゲノム領域に同一の相補配列を担持することによって、Cas9に配列特異性を付与する。Jinek et al.(2012)Science 337:816-821。CRISPR/Cas9ツールは、DNA切断のためのCas9ヌクレアーゼ、及び標的特異性のための単一ガイドRNA(sgRNA)のみを必要とする。Jinek et al.(2012)、Chylinski et al.(2014)Nucleic Acids Res 42,6091-6105を参照されたい。ヌクレアーゼ欠損(または不活性、もしくは「触媒的に死んだ」)Cas9であるCas9の不活性化形態は、典型的には、「dCas9」として示され、実質的なヌクレアーゼ活性を有しない。Qi,L.S.et al.(2013).Cell 152,1173-1183。CRISPR/dCas9は、ガイドRNA(gRNA)配列の標的を介して、特定のゲノム配列に正確に結合する。Dominguez et al.,Nat Rev Mol Cell Biol.2016;17:5-15、Wang et al.,Annu Rev Biochem.2016;85:227-64を参照されたい。dCas9は、ゲノム中の所望の部位及び/または遺伝子座の転写結合部位に適用されるときに、遺伝子発現を編集するために利用される。dCas9タンパク質がガイドRNA(gRNA)にカップリングしてdCas9ガイドRNA複合体を作製すると、dCas9は、生物のゲノムに有害であり得る反復コドン及びDNA配列の増殖を防止する。本質的に、複数の反復コドンが産生されるとき、それは応答を引き出すか、またはそれらのコドンの過剰産生に対抗し、転写のシャットダウンをもたらすために豊富なdCas9を動員する。したがって、dCas9はgRNAと相乗的に作用し、転写を継続することからDNAポリメラーゼIIに直接影響を与える。
実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレアーゼ欠損Cas酵素ガイドRNA複合体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレアーゼ欠損(または不活性、または「触媒的に死んだ」Cas9、典型的には「dCas9」として示される)ガイドRNA複合体を含む。
実施形態では、dCas9/gRNA複合体は、GTTTAGCTCACCCGTGAGCC(配列番号91)、CCCAATATTATTGTTCTCTG(配列番号92)、GGGGTGGGATAGGGGATACG(配列番号93)、GGATCCCCCTCTACATTTAA(配列番号94)、GTGATCTTGTACAAATCATT(配列番号95)、CTACACAGAATCTGTTAGAA(配列番号96)、TAAGCTAGAGAATAGATCTC(配列番号97)、及びTCAATACACTTAATGATTTA(配列番号98)から選択されるガイドRNAを含み、当該ガイドRNAは、酵素をケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子に指向する。
実施形態では、dCas9/gRNA複合体は、
CACCGGGAGCCACGAAAACAGATCC(配列番号99)、CACCGCGAAAACAGATCCAGGGACA(配列番号100)、CACCGAGATCCAGGGACACGGTGCT(配列番号101)、CACCGGACACGGTGCTAGGACAGTG(配列番号102)、CACCGGAAAATGACCCAACAGCCTC(配列番号103)、CACCGGCCTGGCCGGCCTGACCACT(配列番号104)、CACCGCTGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号105)、CACCGTGGTTTCCACTGAGCACTGA(配列番号106)、CACCGGATAGCCAGGAGTCCTTTCG(配列番号107)、CACCGGCGCTTCCAGTGCTCAGACT(配列番号108)、CACCGCAGTGCTCAGACTAGGGAAG(配列番号109)、CACCGGCCCCTCCTCCTTCAGAGCC(配列番号110)、CACCGTCCTTCAGAGCCAGGAGTCC(配列番号111)、CACCGTGGTTTCCGAGCTTGACCCT(配列番号112)、CACCGCTGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号113)、CACCGCGTTCCTGCAGAGTATCTGC(配列番号114)、AAACGGATCTGTTTTCGTGGCTCCC(配列番号115)、AAACTGTCCCTGGATCTGTTTTCGC(配列番号116)、AAACAGCACCGTGTCCCTGGATCTC(配列番号117)、AAACCACTGTCCTAGCACCGTGTCC(配列番号118)、AAACGAGGCTGTTGGGTCATTTTCC(配列番号119)、AAACAGTGGTCAGGCCGGCCAGGCC(配列番号120)、AAACGCCAGGCCTTCAGTGCTCAGC(配列番号121)、AAACTCAGTGCTCAGTGGAAACCAC(配列番号122)、AAACCGAAAGGACTCCTGGCTATCC(配列番号123)、AAACAGTCTGAGCACTGGAAGCGCC(配列番号124)、AAACCTTCCCTAGTCTGAGCACTGC(配列番号125)、AAACGGCTCTGAAGGAGGAGGGGCC(配列番号126)、AAACGGACTCCTGGCTCTGAAGGAC(配列番号127)、AAACAGGGTCAAGCTCGGAAACCAC(配列番号128)、AAACCCCCAGCAGATACTCTGCAGC(配列番号129)、AAACGCAGATACTCTGCAGGAACGC(配列番号130)、TCCCCTCCCAGAAAGACCTG(配列番号131)、TGGGCTCCAAGCAATCCTGG(配列番号132)、GTGGCTCAGGAGGTACCTGG(配列番号133)、GAGCCACGAAAACAGATCCA(配列番号134)、AAGTGAACGGGGAAGGGAGG(配列番号135)、GACAAAAGCCGAAGTCCAGG(配列番号136)、GTGGTTGATAAACCCACGTG(配列番号137)、TGGGAACAGCCACAGCAGGG(配列番号138)、GCAGGGGAACGGGGATGCAG(配列番号139)、GAGATGGTGGACGAGGAAGG(配列番号140)、GAGATGGCTCCAGGAAATGG(配列番号141)、TAAGGAATCTGCCTAACAGG(配列番号142)、TCAGGAGACTAGGAAGGAGG(配列番号143)、TATAAGGTGGTCCCAGCTCG(配列番号144)、CTGGAAGATGCCATGACAGG(配列番号145)、GCACAGACTAGAGAGGTAAG(配列番号146)、ACAGACTAGAGAGGTAAGGG(配列番号147)、GAGAGGTGACCCGAATCCAC(配列番号148)、GCACAGGCCCCAGAAGGAGA(配列番号149)、CCGGAGAGGACCCAGACACG(配列番号150)、GAGAGGACCCAGACACGGGG(配列番号151)、GCAACACAGCAGAGAGCAAG(配列番号152)、GAAGAGGGAGTGGAGGAAGA(配列番号153)、AAGACGGAACCTGAAGGAGG(配列番号154)、AGAAAGCGGCACAGGCCCAG(配列番号155)、GGGAAACAGTGGGCCAGAGG(配列番号156)、GTCCGGACTCAGGAGAGAGA(配列番号157)、GGCACAGCAAGGGCACTCGG(配列番号158)、GAAGAGGGGAAGTCGAGGGA(配列番号159)、GGGAATGGTAAGGAGGCCTG(配列番号160)、GCAGAGTGGTCAGCACAGAG(配列番号161)、GCACAGAGTGGCTAAGCCCA(配列番号162)、GACGGGGTGTCAGCATAGGG(配列番号163)、GCCCAGGGCCAGGAACGACG(配列番号164)、GGTGGAGTCCAGCACGGCGC(配列番号165)、ACAGGCCGCCAGGAACTCGG(配列番号166)、ACTAGGAAGTGTGTAGCACC(配列番号167)、ATGAATAGCAGACTGCCCCG(配列番号168)、ACACCCCTAAAAGCACAGTG(配列番号169)、CAAGGAGTTCCAGCAGGTGG(配列番号170)、AAGGAGTTCCAGCAGGTGGG(配列番号171)、TGGAAAGAGGAGGGAAGAGG(配列番号172)、TCGAATTCCTAACTGCCCCG(配列番号173)、GACCTGCCCAGCACACCCTG(配列番号174)、GGAGCAGCTGCGGCAGTGGG(配列番号175)、GGGAGGGAGAGCTTGGCAGG(配列番号176)、GTTACGTGGCCAAGAAGCAG(配列番号177)、GCTGAACAGAGAAGAGCTGG(配列番号178)、TCTGAGGGTGGAGGGACTGG(配列番号179)、GGAGAGGTGAGGGACTTGGG(配列番号180)、GTGAACCAGGCAGACAACGA(配列番号181)、CAGGTACCTCCTGAGCCACG(配列番号182)、GGGGGAGTAGGGGCATGCAG(配列番号183)、GCAAATGGCCAGCAAGGGTG(配列番号184)、CAAATGGCCAGCAAGGGTGG(配列番号309)、GCAGAACCTGAGGATATGGA(配列番号310)、AATACACAGAATGAAAATAG(配列番号311)、CTGGTGACTAGAATAGGCAG(配列番号312)、TGGTGACTAGAATAGGCAGT(配列番号313)、TAAAAGAATGTGAAAAGATG(配列番号314)、TCAGGAGTTCAAGACCACCC(配列番号315)、TGTAGTCCCAGTTATGCAGG(配列番号316)、GGGTTCACACCACAAATGCA(配列番号317)、GGCAAATGGCCAGCAAGGGT(配列番号318)、AGAAACCAATCCCAAAGCAA(配列番号319)、GCCAAGGACACCAAAACCCA(配列番号320)、AGTGGTGATAAGGCAACAGT(配列番号321)、CCTGAGACAGAAGTATTAAG(配列番号322)、AAGGTCACACAATGAATAGG(配列番号323)、CACCATACTAGGGAAGAAGA(配列番号324)、CAATACCCTGCCCTTAGTGG(配列番号327)、AATACCCTGCCCTTAGTGGG(配列番号325)、TTAGTGGGGGGTGGAGTGGG(配列番号326)、GTGGGGGGTGGAGTGGGGGG(配列番号328)、GGGGGGTGGAGTGGGGGGTG(配列番号329)、GGGGTGGAGTGGGGGGTGGG(配列番号330)、GGGTGGAGTGGGGGGTGGGG(配列番号331)、GGGGGTGGGGAAAGACATCG(配列番号332)、GCAGCTGTGAATTCTGATAG(配列番号333)、GAGATCAGAGAAACCAGATG(配列番号334)、TCTATACTGATTGCAGCCAG(配列番号335)、CACCGAATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号185)、CACCGGTCCCTGGGCGTTGCCCTGC(配列番号186)、CACCGCCCTGGGCGTTGCCCTGCAG(配列番号187)、CACCGCCGTGGGAAGATAAACTAAT(配列番号188)、CACCGTCCCCTGCAGGGCAACGCCC(配列番号189)、CACCGGTCGAGTCGCTTCTCGATTA(配列番号190)、CACCGCTGCTGCCTCCCGTCTTGTA(配列番号191)、CACCGGAGTGCCGCAATACCTTTAT(配列番号192)、CACCGACACTTTGGTGGTGCAGCAA(配列番号193)、CACCGTCTCAAATGGTATAAAACTC(配列番号194)、CACCGAATCCCGCCCATAATCGAGA(配列番号195)、CACCGTCCCGCCCATAATCGAGAAG(配列番号196)、CACCGCCCATAATCGAGAAGCGACT(配列番号197)、CACCGGAGAAGCGACTCGACATGGA(配列番号198)、CACCGGAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号199)、CACCGGCGACTCGACATGGAGGCGA(配列番号200)、AAACTGTCGAGTCGCTTCTCGATTC(配列番号201)、AAACGCAGGGCAACGCCCAGGGACC(配列番号202)、AAACCTGCAGGGCAACGCCCAGGGC(配列番号203)、AAACATTAGTTTATCTTCCCACGGC(配列番号204)、AAACGGGCGTTGCCCTGCAGGGGAC(配列番号205)、AAACTAATCGAGAAGCGACTCGACC(配列番号206)、AAACTACAAGACGGGAGGCAGCAGC(配列番号207)、AAACATAAAGGTATTGCGGCACTCC(配列番号208)、AAACTTGCTGCACCACCAAAGTGTC(配列番号209)、AAACGAGTTTTATACCATTTGAGAC(配列番号210)、AAACTCTCGATTATGGGCGGGATTC(配列番号211)、AAACCTTCTCGATTATGGGCGGGAC(配列番号212)、AAACAGTCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号213)、AAACTCCATGTCGAGTCGCTTCTCC(配列番号214)、AAACCCTCCATGTCGAGTCGCTTCC(配列番号215)、AAACTCGCCTCCATGTCGAGTCGCC(配列番号216)、CACCGACAGGGTTAATGTGAAGTCC(配列番号217)、CACCGTCCCCCTCTACATTTAAAGT(配列番号218)、CACCGCATTTAAAGTTGGTTTAAGT(配列番号219)、CACCGTTAGAAAATATAAAGAATAA(配列番号220)、CACCGTAAATGCTTACTGGTTTGAA(配列番号221)、CACCGTCCTGGGTCCAGAAAAAGAT(配列番号222)、CACCGTTGGGTGGTGAGCATCTGTG(配列番号223)、CACCGCGGGGAGAGTGGAGAAAAAG(配列番号224)、CACCGGTTAAAACTCTTTAGACAAC(配列番号225)、CACCGGAAAATCCCCACTAAGATCC(配列番号226)、AAACGGACTTCACATTAACCCTGTC(配列番号227)、AAACACTTTAAATGTAGAGGGGGAC(配列番号228)、AAACACTTAAACCAACTTTAAATGC(配列番号22
9)、AAACTTATTCTTTATATTTTCTAAC(配列番号230)、AAACTTCAAACCAGTAAGCATTTAC(配列番号231)、AAACATCTTTTTCTGGACCCAGGAC(配列番号232)、AAACCACAGATGCTCACCACCCAAC(配列番号233)、AAACCTTTTTCTCCACTCTCCCCGC(配列番号234)、AAACGTTGTCTAAAGAGTTTTAACC(配列番号235)、AAACGGATCTTAGTGGGGATTTTCC(配列番号236)、AGTAGCAGTAATGAAGCTGG(配列番号237)、ATACCCAGACGAGAAAGCTG(配列番号238)、TACCCAGACGAGAAAGCTGA(配列番号239)、GGTGGTGAGCATCTGTGTGG(配列番号240)、AAATGAGAAGAAGAGGCACA(配列番号241)、CTTGTGGCCTGGGAGAGCTG(配列番号242)、GCTGTAGAAGGAGACAGAGC(配列番号243)、GAGCTGGTTGGGAAGACATG(配列番号244)、CTGGTTGGGAAGACATGGGG(配列番号245)、CGTGAGGATGGGAAGGAGGG(配列番号246)、ATGCAGAGTCAGCAGAACTG(配列番号247)、AAGACATCAAGCACAGAAGG(配列番号248)、TCAAGCACAGAAGGAGGAGG(配列番号249)、AACCGTCAATAGGCAAAGGG(配列番号250)、CCGTATTTCAGACTGAATGG(配列番号251)、GAGAGGACAGGTGCTACAGG(配列番号252)、AACCAAGGAAGGGCAGGAGG(配列番号253)、GACCTCTGGGTGGAGACAGA(配列番号254)、CAGATGACCATGACAAGCAG(配列番号255)、AACACCAGTGAGTAGAGCGG(配列番号256)、AGGACCTTGAAGCACAGAGA(配列番号257)、TACAGAGGCAGACTAACCCA(配列番号258)、ACAGAGGCAGACTAACCCAG(配列番号259)、TAAATGACGTGCTAGACCTG(配列番号260)、AGTAACCACTCAGGACAGGG(配列番号261)、ACCACAAAACAGAAACACCA(配列番号262)、GTTTGAAGACAAGCCTGAGG(配列番号263)、GCTGAACCCCAAAAGACAGG(配列番号264)、GCAGCTGAGACACACACCAG(配列番号265)、AGGACACCCCAAAGAAGCTG(配列番号266)、GGACACCCCAAAGAAGCTGA(配列番号267)、CCAGTGCAATGGACAGAAGA(配列番号268)、AGAAGAGGGAGCCTGCAAGT(配列番号269)、GTGTTTGGGCCCTAGAGCGA(配列番号270)、CATGTGCCTGGTGCAATGCA(配列番号271)、TACAAAGAGGAAGATAAGTG(配列番号272)、GTCACAGAATACACCACTAG(配列番号273)、GGGTTACCCTGGACATGGAA(配列番号274)、CATGGAAGGGTATTCACTCG(配列番号275)、AGAGTGGCCTAGACAGGCTG(配列番号276)、CATGCTGGACAGCTCGGCAG(配列番号277)、AGTGAAAGAAGAGAAAATTC(配列番号278)、TGGTAAGTCTAAGAAACCTA(配列番号279)、CCCACAGCCTAACCACCCTA(配列番号280)、AATATTTCAAAGCCCTAGGG(配列番号281)、GCACTCGGAACAGGGTCTGG(配列番号282)、AGATAGGAGCTCCAACAGTG(配列番号283)、AAGTTAGAGCAGCCAGGAAA(配列番号284)、TAGAGCAGCCAGGAAAGGGA(配列番号285)、TGAATACCCTTCCATGTCCA(配列番号286)、CCTGCATTGCACCAGGCACA(配列番号287)、TCTAGGGCCCAAACACACCT(配列番号288)、TCCCTCCATCTATCAAAAGG(配列番号289)、AGCCCTGAGACAGAAGCAGG(配列番号290)、GCCCTGAGACAGAAGCAGGT(配列番号291)、AGGAGATGCAGTGATACGCA(配列番号292)、ACAATACCAAGGGTATCCGG(配列番号293)、TGATAAAGAAAACAAAGTGA(配列番号294)、AAAGAAAACAAAGTGAGGGA(配列番号295)、GTGGCAAGTGGAGAAATTGA(配列番号296)、CAAGTGGAGAAATTGAGGGA(配列番号297)、GTGGTGATGATTGCAGCTGG(配列番号298)、CTATGTGCCTGACACACAGG(配列番号299)、GGGTTGGACCAGGAAAGAGG(配列番号300)、GATGCCTGGAAAAGGAAAGA(配列番号301)、TAGTATGCACCTGCAAGAGG(配列番号302)、TATGCACCTGCAAGAGGCGG(配列番号303)、AGGGGAAGAAGAGAAGCAGA(配列番号304)、GCTGAATCAAGAGACAAGCG(配列番号305)、AAGCAAATAAATCTCCTGGG(配列番号306)、AGATGAGTGCTAGAGACTGG(配列番号307)、及びCTGATGGTTGAGCACAGCAG(配列番号308)から選択されるガイドRNAを含む。図4を参照されたい。
本開示の実施形態は、宿主ゲノム内の特定の部位を標的とするTALEまたはdCas9/gRNA DBDの能力を利用する。TALEまたはdCas9/gRNA DBDのDNA標的能力は、隣接するDNA配列を認識するために一緒に連結されるTALE反復配列(例えば、モジュラーアレイ)またはgRNAによって提供される。各TALEまたはgRNAは、ある特定の塩基対(複数可)または残基(複数可)を認識することができる。
TALEヌクレアーゼ(TALEN)は、ゲノム編集及び標的二本鎖切断の導入のための既知のツールである。TALENは、カスタマイズ可能なDBDに融合したFokIヌクレアーゼドメインなどのエンドヌクレアーゼを含む。このDBDは、宿主植物細胞内の遺伝子の転写を変化させるためにキサントモナス細菌によって分泌されるタンパク質である、TALEに由来する高度に保存された反復から構成される。DBDは、発散した12番目及び13番目のアミノ酸を有する反復された高度に保存された33~34アミノ酸配列を含む。RVDと称されるこれらの2つの位置は、高度に可変であり、特定の塩基対またはヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とDNA認識との間のこの簡単明瞭な関係は、適切なRVDを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特定のDBDの操作を可能にした。Boch et al.Nature Biotechnology.2011;29(2):135-6。
したがって、TALENは、モジュラーDNA結合TALE反復ドメインを標的結合部位内の個々の塩基に関連付ける「タンパク質-DNAコード」を使用して容易に設計することができる。Joung et al.Nat Rev Mol Cell Biol.2013;14(1):49-55.doi:10.1038/nrm3486を参照されたい。図3は、例えば、そのようなコードを示す。
TALENを使用して、本質的にヒト細胞内の目的の任意のDNA配列を標的とすることができることが実証されている。Miller et al.Nat Biotechnol.2011;29:143-148。潜在的な標的部位の選択及びG塩基の認識のための特定のTALE反復ドメイン(超可変位置にNH残基を保有する)の使用のためのガイドラインが提案されている。Streubel et al.Nat Biotechnol.2012;30:593-595を参照されたい。
したがって、いくつかの実施形態では、TALE DBDは、1つ以上の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、TALE DBDは、約15、または約16、または約17、または約18、または約18.5個の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、TALE DBD反復配列は、33または34アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、TALE DBD反復配列のうちの1つ以上は、33または34アミノ酸の残基12または13にRVDを含む。RVDは、ある特定の塩基対(複数可)または残基(複数可)を認識することができる。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の1つの塩基対を認識する。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「C」残基を認識し、かつHD、N(ギャップ)、HA、ND、及びHIから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「G」残基を認識し、かつNN、NH、NK、HN、及びNAから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「A」残基を認識し、かつNI及びNSから選択される。いくつかの実施形態では、RVDは、核酸分子内の「T」残基を認識し、かつNG、HG、H(ギャップ)、及びIGから選択される。
実施形態では、GSHSは、染色体におけるオープンクロマチン位置にある。いくつかの実施形態では、GSHSは、アデノ関連ウイルス部位1(AAVS1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体、及びヒトRosa26遺伝子座から選択される。いくつかの実施形態では、GSHSは、ヒト染色体2、4、6、10、11、または17上に位置する。
いくつかの実施形態では、GSHSは、TALC1、TALC2、TALC3、TALC4、TALC5、TALC7、TALC8、AVS1、AVS2、AVS3、ROSA1、ROSA2、TALER1、TALER2、TALER3、TALER4、TALER5、SHCHR2-1、SHCHR2-2、SHCHR2-3、SHCHR2-4、SHCHR4-1、SHCHR4-2、SHCHR4-3、SHCHR6-1、SHCHR6-2、SHCHR6-3、SHCHR6-4、SHCHR10-1、SHCHR10-2、SHCHR10-3、SHCHR10-4、SHCHR10-5、SHCHR11-1、SHCHR11-2、SHCHR11-3、SHCHR17-1、SHCHR17-2、SHCHR17-3、及びSHCHR17-4から選択される。
いくつかの実施形態では、GSHSは、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、TALE DBDは、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つに結合する。
いくつかの実施形態では、TALE DBDは、
NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
NH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
NI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
HD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
HD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
HD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
HD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
NH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
HD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
HD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
NH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
HD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
NH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
NH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
HD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
NI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
HD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
HD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
NN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
NI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
NN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
NN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
NN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
NN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
NI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
HD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
NH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
NI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
NH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
NH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
NH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
NI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
NH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
NH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
NH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
NN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
NN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
NN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
NI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
HD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
HD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
NH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
NI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
HD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
NI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、
HD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)、及び
NI NG NG NG HD HD NI NN NG NN HD NI HD NI(配列番号422)のうちの1つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、GSHSは、図3に列挙される部位から選択され、TALE DBDは、図3の配列を含む。
いくつかの実施形態では、TALE DBDは、図3の配列のうちの1つ以上、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、GSHS及びTALE DBD配列は、
TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)及びNH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)及びNH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)及びNH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)及びHD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)及びNH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)及びNH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)及びNI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)及びHD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)及びHD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)及びHD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)及びHD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)及びHD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)及びHD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)及びNH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)及びNH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)及びHD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)及びNH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)及びHD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)及びHD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)及びNH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)及びHD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)及びHD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)及びHD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)及びNI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)及びNH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)及びHD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)及びNH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)及びHD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)及びHD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)及びNH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)及びHD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)及びHD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)及びHD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)及びNH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)及びNH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
CTGTGATCATGCCA(配列番号58)及びHD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)及びNI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)及びHD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)及びHD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)及びNN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)及びNI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
GCTGCATCAACCCC(配列番号64)及びNN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)及びNN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)及びNN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)及びNN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)及びNI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)及びHD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)及びNH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)及びNI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
GAAACTATGCCTGC(配列番号72)及びNH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
GCACCATTGCTCCC(配列番号73)及びNH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
GACATGCAACTCAG(配列番号74)及びNH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
ACACCACTAGGGGT(配列番号75)及びNI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)及びNH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)及びNH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)及びNH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)及びNN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
GTGCTCTGACAATA(配列番号80)及びNN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)及びNN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)及びNI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)及びHD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)及びHD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
GAAAAACTATGTAT(配列番号85)及びNH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)及びNI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
CAATACAACCACGC(配列番号87)及びHD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
ATGACGGACTCAACT(配列番号88)及びNI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、ならびに
CACAACATTTGTAA(配列番号89)及びHD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)から選択される。
いくつかの実施形態では、GSHSは、TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位の約25、または約50、または約100、または約150、または約200、または約300、または約500ヌクレオチド内にある。
いくつかの実施形態では、オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用してヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするためのガイドRNA(gRNA)は、図4に示される通りである。
実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素)は、TAジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。いくつかの実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素)は、TTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。
実施形態では、組成物は、酵素及びトランスポゾンをそれぞれコードする核酸を有する系を含む。図1A~1Dは、本開示の実施形態による系の例を示す。例えば、図2に示されるように、いくつかの実施形態では、この系は、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸(例えば、ヘルパーRNA)と、トランスポザーゼ(例えば、ドナーDNA)をコードする核酸と、を含む。ヘルパーRNAは、特異的末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーDNAをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素(例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ)に翻訳される。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、第1の核酸によってコードされ、トランスポゾンは、第2の非ウイルス核酸によってコードされる。トランスポゾンは、導入遺伝子を含み、酵素によって認識される末端に隣接しており、酵素は、ある特定のゲノム遺伝子座及び/または部位(例えば、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位(GSHS)内のTAジヌクレオチド部位もしくはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位)に導入遺伝子を挿入させる。いくつかの実施形態では、第1の核酸は、RNA、例えば、ヘルパーRNAであり、第2の非ウイルス核酸は、DNAである。実施形態では、インテイン(スプライシングドメインとも称される)を使用して、ドナー導入遺伝子の組み込みのためにヒトゲノム内の特定の部位を標的とする所望の内部DNA二重結合ドメイン(DNAバインダー)を含む組換え酵素(例えば、限定されないが、MLT融合タンパク質)を合成する。
インテイン(INTervening protEINS(介在タンパク質))は、タンパク質スプライシングのプロセスを実行する能力を有する、自然界に見出されるタンパク質ドメインである移動型遺伝要素である。Sarmiento & Camarero(2019)Current protein & peptide science,20(5),408-424(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。タンパク質スプライシングは、インテインに隣接する前駆体ポリペプチドセグメント間のペプチド結合の切断及び形成をもたらす、翻訳後の生化学的修飾である(同上)。インテインは、タンパク質スプライシングを介して前駆体タンパク質から翻訳後に自身を切除するための標準的な酵素戦略を適用する。Nanda et al.,Microorganisms vol.8,12 2004.16 Dec.2020,doi:10.3390/microorganisms8122004。インテインは、その隣接するN末端及びC末端ドメインをスプライシングして、成熟タンパク質となり、配列から自身を切除することができる。例えば、分割されたインテインは、トランスジェニック生物への異種遺伝子の送達を制御するために使用されている。Wood & Camarero(2014)J Biol Chem.289(21):14512-14519を参照されたい。このアプローチは、標的タンパク質を2つのセグメントに分割することに依存し、次いで、これらは、タンパク質トランススプライシング(PTS)によってインビボで翻訳後に再構築される。Aboye & Camarero(2012)J.Biol.Chem.287,27026-27032を参照されたい。より最近では、Cas9を細胞に組み込み、ヌクレアーゼ活性を効率的に再構築するためのインテイン媒介性スプリットCas9系が開発されている。Truong et al.,Nucleic Acids Res.2015,43(13),6450-6458。タンパク質スプライシングは、前駆体タンパク質の内部領域を切除し、次いで、N-エクステイン及びC-エクステイン断片のライゲーションを行い、2つのポリペプチド(切除されたインテイン、及びC-エクステインとN-エクステインとを接合することによって産生される新しいポリペプチド)をもたらす。Sarmiento & Camarero(2019)。
実施形態では、限定されないが、dCas9、dCas12j、またはTALEなどのDNAバインダーのインテイン媒介性の組み込みは、2つのより小さな断片からの完全長MLTトランスポザーゼの再構築を可能にするスプリットMLTトランスポザーゼ系の作製を可能にする。これにより、MLTトランスポザーゼのN末端またはC末端にDNAバインダーを発現する必要性を回避することが可能になる。このアプローチでは、MLTトランスポザーゼの2つの部分をインテインに融合させ、共発現後、インテインは、翻訳後修飾による完全長MLTトランスポザーゼの産生を可能にする。したがって、実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸は、インテインを含む。実施形態では、核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切断時に、第1及び第2の部分が機能的酵素に融合されるように、第1の部分と第2の部分との間にインテインがコードされている第1及び第2の部分の形態で酵素をコードする。
実施形態では、インテインは、好適なリガンド依存性インテイン、例えば、米国特許第9,200,045号、Mootz et al.,J.Am.Chem.Soc.2002;124,9044-9045、Mootz et al.,J.Am.Chem.Soc.2003;125,10561-10569、Buskirk et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2004;101,10505-10510、Skretas & Wood.Protein Sci.2005;14,523-532、Schwartz,et al.,Nat.Chem.Biol.2007;3,50-54、Peck et al.,Chem.Biol.2011;18(5),619-630(これらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものから選択されるインテインであり得る。
実施形態では、インテインは、NpuN(Intein-N)(配列番号423)及び/またはNpuC(Intein-C)(配列番号424)、またはそのバリアント、例えば、それに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列である。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、限定されないが、トランスポザーゼ酵素である。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、またはTrichoplusia niに由来する。実施形態では、酵素(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素)は、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、またはTrichoplusia niに由来する単量体、二量体、四量体、超活性体、またはInt形態を含むが、これらに限定されない操作されたバージョンのトランスポザーゼ酵素である。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、単量体、二量体、四量体、超活性体であるか、またはBombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Myotis lucifugus、Pipistrellus kuhlii、Pteropus vampyrus、及びMolossus molossus Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、もしくはMyotis lucifugusのうちのいずれかに由来する、非TTAA(配列番号1)認識部位(Int-)との相互作用が低減しているトランスポザーゼ酵素を含むが、これらに限定されない操作されたバージョンである。トランスポザーゼ酵素は、野生型、単量体、二量体、四量体、超活性体、またはInt-変異体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、TALE DBDまたはdCas9/gRNAとトランスポザーゼ酵素とを接続するリンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、可撓性リンカーは、実質的に、グリシン及びセリン残基を含み、任意選択で、可撓性リンカーは、(GlySer)を含み、nは、約1~約12である。可撓性リンカーは、約20、または約30、または約40、または約50、または約60アミノ酸残基であり得る。
いくつかの態様では、本開示の実施形態によるキメラトランスポザーゼをコードする核酸が提供される。核酸は、DNAまたはRNAであり得る。いくつかの実施形態では、キメラトランスポザーゼは、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による核酸を含む、宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物または核酸が提供され、組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)の形態である。組成物は、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、ジメチルアミノエタン-カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体(DC-Chol)、ホスファチジルコリン(PC)、トリオレイン(グリセリルトリオレエート)、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000(DMG-PEG 2K)、及び1,2-ジステアロール-sn-グリセロール-3ホスホコリン(DSPC)から選択される1つ以上の脂質を含み、及び/またはポリエチレンイミン(PEI)及びポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、及びN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)から選択される1つ以上の分子を含み得る。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、細胞をキメラトランスポザーゼと接触させることを含む、細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法が提供される。この方法は、インビボ方法またはエクスビボ方法であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、本開示の実施形態に従って、キメラトランスポザーゼをコードする核酸と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするRNAと接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスポゾンを含む構築物と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするDNAと接触される。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有する本MLTトランスポザーゼ、もしくはそのバリアント(及び任意選択で1つ以上の超活性変異)、またはその記載されるキメラを、約0.5:1の比、または約1:1の比、または約2:1の比、または約1:0.5の比、または約1:2の比で利用し、その比は、トランスポゾン(もしくはペイロード/導入遺伝子)の量と、MLTトランスポザーゼの量またはその記載されるキメラの量との比(例えば、重量:重量、濃度:濃度)である。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、不死化細胞株を利用する。実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、ヒト対象に由来する細胞を利用する(例えば、この方法は、エクスビボまたはインビトロで実施される)。実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、腎細胞、または卵巣細胞、または免疫細胞、例えば、T細胞を利用する。
実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、挿入された遺伝子の発現を可能にする。実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、挿入された遺伝子の発現を少なくとも7日間、または少なくとも8日間、または少なくとも9日間、または少なくとも10日間、または少なくとも14日間、または少なくとも21日間、または少なくとも約7~21日間、または少なくとも約7~14日間、または少なくとも約7~10日間、または少なくとも約10~14日間提供する。
実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、レシピエント細胞の生存率に実質的に影響を及ぼさない(例えば、細胞の少なくとも約95%、または少なくとも約90%、または少なくとも約85%、または少なくとも約80%、または少なくとも約75%、または少なくとも約50%は、挿入後も生存可能である)。
当技術分野において認識されるように、トランスポゾンは、多くの場合、トランスポゾンの中央の導入遺伝子及びトランスポゾンの5’及び3’末端の末端反復配列をコードするオープンリーディングフレームを含む。翻訳されたトランスポザーゼは、トランスポゾンの5’及び3’配列に結合し、転位機能を実行する。
実施形態では、トランスポゾンは、転位性エレメントと互換的に使用され、転位性エレメントは、それら自体のコピーを他のポリヌクレオチドに挿入することができるポリヌクレオチドを指すために使用される。トランスポゾンという用語は、当業者に周知であり、配列の編成、例えば、各末端の逆位末端配列、及び/または末端の直接反復される長い末端反復(LTR)に基づいて区別することができるトランスポゾンのクラスを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスポゾンは、piggyBac様エレメント、例えば、TTAA(配列番号1)配列を認識し、トランスポゾンの除去後に挿入部位における配列を元のTTAA(配列番号1)配列に戻す、そのトレースレス切除を特徴とするトランスポゾンエレメントとして記載され得る。
実施形態では、トランスポゾンは、MLTトランスポザーゼを含む。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼ、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスポザーゼである。実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号4のアミノ酸、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、MLT左末端、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列に作用することができ、MLT左末端(5’~3’)のヌクレオチド配列は、以下の通りである:
TTAACACTTGGATTGCGGGAAACGAGTTAAGTCGGCTCGCGTGAATTGCGCGTACTCCGCGGGAGCCGTCTTAACTCGGTTCATATAGATTTGCGGTGGAGTGCGGGAAACGTGTAAACTCGGGCCGATTGTAACTGCGTATTACCAAATATTTGTT(配列番号21)。
実施形態では、トランスポザーゼは、MLT右末端、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列に作用することができ、MLT右末端(5’~3’)のヌクレオチド配列は、以下の通りである:
AATTATTTATGTACTGAATAGATAAAAAAATGTCTGTGATTGAATAAATTTTCATTTTTTACACAAGAAACCGAAAATTTCATTTCAATCGAACCCATACTTCAAAAGATATAGGCATTTTAAACTAACTCTGATTTTGCGCGGGAAACCTAAATAATTGCCCGCGCCATCTTATATTTTGGCGGGAAATTCACCCGACACCGTAGTGTTAA(配列番号22)。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、1つ以上の末端に隣接している。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、競合ポリペプチドをコードする遺伝子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、疾患状態において欠陥があるか、または実質的に存在しない遺伝子であるか、またはそれを含む。
実施形態では、トランスポゾンは、様々な遺伝子をコードすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4遺伝子(ABC)トランスポーター遺伝子(ABCA4)、またはその機能的断片である。別の例として、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、非常に低密度のリポタンパク質受容体遺伝子(VLDLR)もしくは低密度のリポタンパク質受容体遺伝子(LDLR)、またはその機能的断片である。
いくつかの実施形態では、治療遺伝子は、宿主ゲノム内のGSHS位置に挿入される。これらの部位内の組み込みは、原がん遺伝子の活性化、腫瘍抑制因子の不活性化、または挿入変異誘発などの有害作用と関連付けられないため、GSHSは、遺伝子導入に適した遺伝子座として定義することができる。GSHSは、以下の基準によって定義することができる:1)任意の遺伝子の5’末端から少なくとも50kbの距離、(2)任意のがん関連遺伝子から少なくとも300kbの距離、(3)任意のマイクロRNA(miRNA)から少なくとも300kbの距離、(4)転写単位の外側の位置、及び(5)ヒトゲノムの超保存領域(UCR)の外側の位置。Papapetrou et al.Nat Biotechnol 2011;29:73-8、Bejerano et al.Science 2004;304:1321-5を参照されたい。
さらに、GSHS位置の使用は、複数の細胞型にわたる安定な導入遺伝子発現を可能にすることができる。そのような部位の1つであるケモカインC-Cモチーフ受容体5(CCR5)が同定されており、組み込み遺伝子導入に使用されている。CCR5は、βケモカイン受容体ファミリーのメンバーであり、一次感染に関与するR5トロピックウイルス株の侵入に必要である。CCR5遺伝子におけるホモ接合32bpの欠失により、ヒトにおけるHIV-1ウイルス感染に対する耐性が付与される。白人集団の約1%において自然に生じるCCR5発現の妨害は、免疫の低減をもたらすとは思われない。Lobritz at al.,Viruses 2010;2:1069-105。臨床試験は、標的可能なヌクレアーゼを介してCCR5を破壊する安全性及び有効性を実証している。Tebas at al.,HIV.N Engl J Med 2014;370:901-10。
トランスポゾンは、組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。組織特異的プロモーターは、例えば、肝臓特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、いくつかの実施形態では、ヒトLP1プロモーターである、LP1プロモーターである。LP1プロモーターは、例えば、Nathwani et al.Blood vol.2006;107(7):2653-61に記載されており、Nathawani et al.に記載されるように構築することができる。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、網膜特異的プロモーター、例えば、RPE65、IRBP、またはVMD2プロモーターであり得る網膜色素上皮(RPE)プロモーターなどである。RPE65、IRBP、及びVMD2プロモーターは、例えば、Aguirre.Invest Ophthalmol Vis Sci.2017;58(12):5399-5411.doi:10.1167/iovs.17-22978に記載されている。いくつかの実施形態では、網膜特異的プロモーターは、任意選択でβ-ホスホジエステラーゼ(PDE)(例えば、Di Polo et al.,Nucleic Acids Res.1997;25(19):3863-3867)、ロドプシンキナーゼ(GRK1)(例えば、Khani et al.,2007、McDougald et al.Mol Ther Methods Clin Dev.2019;13:380-389.2019年3月28日公開)、CAR(錐体アレスチン)(例えば、McDougald et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.2019;13:380-389.2019年3月28日公開)、網膜色素変性1(RP1)、及びL-オプシン(例えば、Kan et al.,Molecular Therapy,vol.15,Suppl.1,S258,May 01,2007、Lee et al.,Vision Res.2008 Feb;48(3):332-8を参照されたい)から選択される、光受容体プロモーターである。
しかしながら、他の組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーターなどを含む、種々のプロモーターを使用することができることを理解されたい。
キメラトランスポザーゼは、非ウイルスベクターなどのベクターに組み込むことができる。キメラトランスポザーゼは、トランスポゾンをコードするベクターと同じベクター上にコードすることができるか、または別個のベクタープラスミドもしくはRNA上にコードすることができる。
さらに、様々なトランスポザーゼ酵素を使用して、キメラトランスポザーゼを構築することができる。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Tcl/マリナートランスポゾン系に由来する。例えば、Plasterk et al.Trends in Genetics.1999;15(8):326-32を参照されたい。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチン(CAG)プロモーターに融合したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーである。Alexopoulou et al.,BMC Cell Biol.2008;9:2(2008年1月11日オンラインで公開)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Sleeping Beautyトランスポゾン系(例えば、Cell.1997;91:501-510を参照されたい)、例えば、Sleeping Beautyの超活性形態(hypSB)、例えば、SB100X(Gene Therapy volume 18,pages 849-856(2011)を参照されたい)、またはpiggyBac(PB)トランスポゾン系(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Trends Biotechnol.2015 Sep;33(9):525-33を参照されたい)、例えば、mPB上に7つのアミノ酸置換(例えば、I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N570S、N538K)または非mPBにおける機能的同等物を有するPBトランスポザーゼ(hypPB)の超活性形態(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Mol Ther Nucleic Acids.2012 Oct;1(10):e50を参照されたい)に由来する(また、Yusa et al.,PNAS January 25,2011 108(4)1531-1536、Voigt et al.,Nature Communications volume 7,Article number:11126(2016)も参照されたい)。
piggyBacトランスポザーゼは、IS4トランスポザーゼファミリーに属する。De Palmenaer et al.,BMC Evolutionary Biology.2008;8:18.doi:10.1186/1471-2148-8-18。piggyBacファミリーは、非常に多様なトランスポゾンを含み、これらのトランスポゾンのうちのいずれも、本開示の実施形態で使用することができる。例えば、Bouallegue et al.,Genome Biol Evol.2017;9(2):323-339を参照されたい。piggyBac(スーパー)ファミリーの創設メンバーである昆虫piggyBacは、もともとキャベツルーパー蛾(Trichoplusiani ni)において同定され、インビボ及びインビトロの両方で研究された。昆虫piggyBacは、多くのリコンビナーゼによって共有されるRNase Hフォールドに似た触媒部位を有するエレメントコードされたトランスポザーゼによって促進される典型的なカット・アンド・ペースト機序によって転位することが知られている。昆虫piggyBacトランスポゾン系は、ショウジョウバエ及びマウスを含む広範囲の動物において高度に活性であることが示されており、遺伝子タグ付け及びゲノム操作のための強力なツールとして開発されている。他のpiggyBacスーパーファミリーに属する他のトランスポゾンは、Xenopus及びBombyxを含む節足動物及び脊椎動物において一般的である。本開示の実施形態で使用することができる超活性哺乳類piggyBacバリアントを含む哺乳類piggyBacトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第WO2010085699号に記載されている。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、小型の茶色コウモリ(Myotis lucifugus)または他のコウモリトランスポザーゼ、例えば、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pipistrellus kuhlii、及びMolossus molossusから得られるカット・アンド・ペーストMLTエレメントに基づくMLTトランスポゾン系に由来する。Mitra et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9、Jebb et al.,Nature,volume 583,pages 578-584(2020)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。いくつかの実施形態では、コウモリトランスポザーゼの超活性形態が使用される。MLTトランスポザーゼは、コウモリ細胞、ヒト細胞、及び酵母細胞内での転位が可能であることが示されている。MLTトランスポザーゼの超活性形態は、転位プロセスを増強する。加えて、キメラMLTトランスポザーゼは、ゲノム組み込みなしで部位特異的切除が可能である。
さらに、実施形態では、操作された及び/または補正されたMLTトランスポザーゼは、野生型MLTトランスポザーゼと比較してある特定の変異を有するものが使用される。実施形態では、補正されたMLTトランスポザーゼの超活性形態が使用される。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Myotis lucifugus、Pipistrellus kuhlii、Pteropus vampyrus、及びMolossus molossusのうちのいずれかに由来する。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、またはPteropus vampyrusのうちのいずれかに由来する(図7を参照されたい)。トランスポザーゼは、図5A及び5Bから選択される1つ以上の超活性及び/または組み込み欠損変異、またはそれらの同等物を有することができる。当業者は、図7を参照して、そのような変異体をTrichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、またはPteropus vampyrusのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。
図7のアラインメントに示されるアミノ酸配列は、以下の通りである(括弧内の表記は、異なる種類の配列を区別するためのものに過ぎない):
Figure 2023525007000002

Figure 2023525007000003


Figure 2023525007000004

Figure 2023525007000005

Figure 2023525007000006


Figure 2023525007000007

Figure 2023525007000008
実施形態では、当業者は、そのような変異体を、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Myotis lucifugus、Pipistrellus kuhlii、Pteropus vampyrus、及びMolossus molossusのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Myotis lucifugus、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、Pan troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスのうちのいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約93%、または少なくとも約95%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有することができる。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Myotis lucifugus、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、Pan troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスのうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約93%、または少なくとも約95%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。Jebb,et al.(2020)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、野生型MLTトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列:
ATGTCGCAGCATTCAGACTATTCTCATGATGAGTTTTGTGCAGACAAGTTGTCCAATTATTCTTGTGATAGCGATCTTGAAAATGCGAGTACAAGTGATGAAGATTCTAGTGATGATGAAGTAATGGTGCGTCCCAGGACATTGAGGCGACGAAGAATTTCGAGCTCCAGCTCTGACTCAGAGTCAGATATAGAAGGCGGGAGAGAAGAATGGTCGCATGTTGATAATCCACCGGTCTTAGAAGATTTTTTAGGGCATCAAGGATTAAACACAGATGCTGTTATAAATAATATAGAAGATGCCGTGAAATTATTTATCGGAGATGATTTTTTTGAATTTCTTGTAGAGGAGTCAAACAGGTATTATAATCAAAATAGGAATAATTTCAAACTTTCAAAAAAAAGCCTAAAGTGGAAAGATATAACCCCTCAAGAGATGAAGAAGTTTTTAGGGTTAATTGTTCTCATGGGACAGGTGCGCAAAGATAGAAGAGATGACTATTGGACCACGGAGCCATGGACGGAGACGCCATATTTTGGTAAAACGATGACGAGAGACAGGTTCCGACAGATATGGAAAGCTTGGCACTTCAATAATAATGCGGATATCGTAAATGAATCAGATAGACTTTGCAAAGTGAGACCAGTACTAGATTATTTTGTGCCTAAATTTATAAATATTTACAAACCTCATCAGCAATTATCACTAGATGAAGGGATCGTACCTTGGAGGGGAAGATTATTCTTTAGGGTATATAATGCTGGCAAGATCGTTAAATATGGAATATTGGTTCGTTTGTTGTGCGAAAGTGATACAGGATATATCTGTAACATGGAAATTTATTGCGGCGAAGGAAAGCGATTATTGGAAACGATACAAACAGTAGTGTCTCCATACACTGATTCGTGGTACCATATATATATGGACAATTATTATAATAGCGTCGCAAATTGTGAAGCACTTATGAAAAACAAATTCAGAATATGTGGAACAATCCGGAAAAATCGAGGTATACCTAAAGATTTTCAAACAATTTCTTTGAAAAAAGGTGAAACAAAATTTATAAGGAAAAATGATATATTGTTACAAGTGTGGCAATCAAAAAAGCCTGTATACCTGATTTCTTCGATTCATTCTGCGGAGATGGAAGAAAGTCAGAATATTGACAGAACATCAAAAAAGAAAATTGTCAAACCGAATGCACTCATTGACTACAATAAACATATGAAAGGTGTTGACCGGGCCGACCAATACCTTTCATATTATTCGATATTGCGGAGGACGGTCAAATGGACAAAAAGGTTGGCAATGTATATGATAAATTGCGCATTATTTAATTCTTATGCAGTTTACAAATCAGTGAGGCAAAGAAAAATGGGTTTTAAAATGTTTTTGAAACAAACAGCTATCCACTGGTTGACGGATGATATTCCAGAGGACATGGACATTGTTCCAGACCTTCAACCAGTACCGTCTACTTCTGGAATGCGGGCTAAACCACCTACATCTGATCCACCATGCAGGCTATCGATGGACATGAGAAAGCATACGTTACAGGCAATTGTCGGAAGTGGAAAAAAGAAAAACATTTTGAGAAGGTGTCGCGTATGTTCCGTTCATAAATTGCGCAGTGAGACACGCTACATGTGCAAATTTTGCAATATACCTCTACATAAAGGGGCGTGTTTTGAAAAATATCATACGCTAAAAAACTAT(配列番号5)、
またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、配列番号5(上記)のヌクレオチド配列によってコードされる野生型MLTトランスポザーゼは、以下のアミノ酸配列:
MSQHSDYSDDEFCADKLSNYSCDSDLENASTSDEDSSDDEVMVRPRTLRRRRISSSSSDSESDIEGGREEWSHVDNPPVLEDFLGHQGLNTDAVINNIEDAVKLFIGDDFFEFLVEESNRYYNQNRNNFKLSKKSLKWKDITPQEMKKFLGLIVLMGQVRKDRRDDYWTTEPWTETPYFGKTMTRDRFRQIWKAWHFNNNADIVNESDRLCKVRPVLDYFVPKFINIYKPHQQLSLDEGIVPWRGRLFFRVYNAGKIVKYGILVRLLCESDTGYICNMEIYCGEGKRLLETIQTWSPYTDSWYHIYMDNYYNSVANCEALMKNKFRICGTIRKNRGIPKDFQTISLKKGETKFIRKNDILLQVWQSKKPVYLISS1HSAEMEESQNIDRTSKKKIVKPNALIDYNKHMKGVDRADQYLSYYSILRRWKWTKRLAMYMINCALFNSYAVYKSVRQRKMGFKMFLKQTA1HWLTDDIPEDMDIVPDLQPVPSTSGMRAKPPTSDPPCRLSMDMRKHTLQAIVGSGKKKNILRRCRVCSVHKLRSETRYMCKFCNIPLHKGACFEKYHTLKNY(配列番号4)、
またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、MLTトランスポザーゼは、すぐ上のアミノ酸配列(配列番号4)を有し、図5Aまたは図5Bから選択される超活性変異を含む。例えば、MLTトランスポザーゼは、図5Aもしくは図5B、またはそれらの組み合わせから選択される約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの超活性変異を含み得る。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、L573X、E574X、及びS2Xから選択される1つ以上の変異を含み、Xは任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でXは、A、G、または欠失であり、任意選択で変異は、L573del、E574del、及びS2Aである。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、L573del、E574del、及びS2A変異を含み、配列番号2のアミノ酸配列:
MAQHSDYSDDEFCADKLSNYSCDSDLENASTSDEDSSDDEVMVRPRTLRRRRISSSSSDSESDIEGGREEWSHVDNPPVLEDFLGHQGLNTDAVINNIEDAVKLFIGDDFFEFLVEESNRYYNQNRNNFKLSKKSLKWKDITPQEMKKFLGLIVLMGQVRKDRRDDYWTTEPWTETPYFGKTMTRDRFRQIWKAWHFNNNADIVNESDRLCKVRPVLDYFVPKFINIYKPHQQLSLDEGIVPWRGRLFFRVYNAGKIVKYGILVRLLCESDTGYICNMEIYCGEGKRLLETIQTVVSPYTDSWYHIYMDNYYNSVANCEALMKNKFRICGTIRKNRGIPKDFQTISLKKGETKFIRKNDILLQVWQSKKPVYLISSIHSAEMEESQNIDRTSKKKIVKPNALIDYNKHMKGVDRADQYLSYYSILRRTVKWTKRLAMYMINCALFNSYAVYKSVRQRKMGFKMFLKQTAIHWLTDDIPEDMDIVPDLQPVPSTSGMRAKPPTSDPPCRLSMDMRKHTLQAIVGSGKKKNILRRCRVCSVHKLRSETRYMCKFCNIPLHKGACFEKYHTLKNY(配列番号2)、
またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼ、またはそのバリアントを操作して、Mitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)及びWO2010085699(いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる)に記載の酵素を改良した。配列番号2のアミノ酸配列またはそのバリアント(変異L573del、E574del、及びS2Aを伴う)を含むMLTトランスポザーゼは、本明細書では、「操作された」及び/または「補正された」MLTトランスポザーゼと称される。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列:
ATGGCCCAGCACAGCGACTACAGCGACGACGAGTTCTGTGCCGATAAGCTGAGTAACTACAGCTGCGACAGCGACCTGGAAAACGCCAGCACATCCGACGAGGACAGCTCTGACGACGAGGTGATGGTGCGGCCCAGAACCCTGAGACGGAGAAGAATCAGCAGCTCTAGCAGCGACTCTGAATCCGACATCGAGGGCGGCCGGGAAGAGTGGAGCCACGTGGACAACCCTCCTGTTCTGGAAGATTTTCTGGGCCATCAGGGCCTGAACACCGACGCCGTGATCAACAACATCGAGGATGCCGTGAAGCTGTTCATAGGAGATGATTTCTTTGAGTTCCTGGTCGAGGAATCCAACCGCTATTACAACCAGAATAGAAACAACTTCAAGCTGAGCAAGAAAAGCCTGAAGTGGAAGGACATCACCCCTCAGGAGATGAAAAAGTTCCTGGGACTGATCGTTCTGATGGGACAGGTGCGGAAGGACAGAAGGGATGATTACTGGACAACCGAACCTTGGACCGAGACCCCTTACTTTGGCAAGACCATGACCAGAGACAGATTCAGACAGATCTGGAAAGCCTGGCACTTCAACAACAATGCTGATATCGTGAACGAGTCTGATAGACTGTGTAAAGTGCGGCCAGTGTTGGATTACTTCGTGCCTAAGTTCATCAACATCTATAAGCCTCACCAGCAGCTGAGCCTGGATGAAGGCATCGTGCCCTGGCGGGGCAGACTGTTCTTCAGAGTGTACAATGCTGGCAAGATCGTCAAATACGGCATCCTGGTGCGCCTTCTGTGCGAGAGCGATACAGGCTACATCTGTAATATGGAAATCTACTGCGGCGAGGGCAAAAGACTGCTGGAAACCATCCAGACCGTCGTTTCCCCTTATACCGACAGCTGGTACCACATCTACATGGACAACTACTACAATTCTGTGGCCAACTGCGAGGCCCTGATGAAGAACAAGTTTAGAATCTGCGGCACAATCAGAAAAAACAGAGGCATCCCTAAGGACTTCCAGACCATCTCTCTGAAGAAGGGCGAAACCAAGTTCATCAGAAAGAACGACATCCTGCTCCAAGTGTGGCAGTCCAAGAAACCCGTGTACCTGATCAGCAGCATCCATAGCGCCGAGATGGAAGAAAGCCAGAACATCGACAGAACAAGCAAGAAGAAGATCGTGAAGCCCAATGCTCTGATCGACTACAACAAGCACATGAAAGGCGTGGACCGGGCCGACCAGTACCTGTCTTATTACTCTATCCTGAGAAGAACAGTGAAATGGACCAAGAGACTGGCCATGTACATGATCAATTGCGCCCTGTTCAACAGCTACGCCGTGTACAAGTCCGTGCGACAAAGAAAAATGGGATTCAAGATGTTCCTGAAGCAGACAGCCATCCACTGGCTGACAGACGACATTCCTGAGGACATGGACATTGTGCCAGATCTGCAACCTGTGCCCAGCACCTCTGGTATGAGAGCTAAGCCTCCCACCAGCGATCCTCCATGTAGACTGAGCATGGACATGCGGAAGCACACCCTGCAGGCCATCGTCGGCAGCGGCAAGAAGAAGAACATCCTTAGACGGTGCAGGGTGTGCAGCGTGCACAAGCTGCGGAGCGAGACTCGGTACATGTGCAAGTTTTGCAACATTCCCCTGCACAAGGGAGCCTGCTTCGAGAAGTACCACACCCTGAAGAATTACTAG(配列番号3)、
またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、図5Aまたは図5Bから選択される1つ以上の超活性変異を含む。例えば、MLTトランスポザーゼは、図5Aもしくは図5B、またはそれらの組み合わせから選択される約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの超活性変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、S5、S8、D9、D10、E11、C13、A14、S36、S54、N125、K130、G239、T294、T300、I345、R427、D475、M481、P491、A520、及びA561位のうちの1つ以上における置換または欠失から選択される1つ以上の超活性変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、S5P、S8P、S8P/C13R、D9G、D10G、E11G、C13R、A14V、S36G、S54N、N125K、K130T、G239S、T294A、T300A、I345V、R427H、D475G、M481V、P491Q、A520T、及びA561Tから選択される1つ以上の超活性変異を含む。
実施形態では、MLTトランスポザーゼは、S8X、C13X、及び/またはN125Xから選択される超活性変異体のうちの1つ以上(例えば、S8X、C13X、及びN125Xの全て、S8X及びC13X、S8X及びN125X、ならびにC13X及びN125X)を含み、X、X、及びXは、各々独立して、任意のアミノ酸配列であるか、またはXは、G、A、V、L、I、及びPから選択される非極性脂肪族アミノ酸であり、Xは、K、R、及びHから選択される正に荷電したアミノ酸であり、及び/またはXは、K、R、及びHから選択される正に荷電したアミノ酸である。実施形態では、XはPであり、XはR、であり、及び/またはXはKである。
いくつかの実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列またはその機能的同等物と比較して、N125K変異を有するアミノ酸(配列番号7)に対応するヌクレオチド配列(配列番号6):
Figure 2023525007000009

またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列(N125K変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される)によってコードされる。


Figure 2023525007000010

またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列(N125K変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される)。
いくつかの実施形態では、配列番号7のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号7のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼは、MLTトランスポザーゼ1(またはMLT1)と称される。
いくつかの実施形態では、MLTトランスポザーゼは、配列番号2のアミノ酸配列もしくはその機能的同等物と比較して、S8P及びC13R変異を有するアミノ酸(配列番号9)に対応するヌクレオチド配列(配列番号8):


Figure 2023525007000011

またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列(S8P及びC13R変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される)によってコードされる。
Figure 2023525007000012

またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列(S8P及びC13R変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される)。
いくつかの実施形態では、配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼは、MLTトランスポザーゼ2(またはMLT2)と称される。
態様では、配列番号2のアミノ酸配列及びS2位における置換を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントを含む、組成物が提供される。実施形態では、置換は、非極性脂肪族アミノ酸、任意選択でG、A、V、L、I、及びPのうちの1つ、任意選択でS2Aである。実施形態では、酵素は、C末端に追加の残基を有しない。実施形態では、酵素は、例えば、S8X、C13X、及び/またはN125Xから選択される、超活性を付与する1つ以上の変異を有し、Xは、G、A、V、L、I、及びPから選択され、Xは、K、R、及びHから選択され、Xは、K、R、及びHから選択され、例えば、XはPであり、XはRであり、及び/またはXはKである。実施形態では、例えば、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約98%の同一性を有する、本明細書に記載のトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)をコードする核酸を含む、組成物が提供される。実施形態では、トランスポザーゼまたは核酸は、脂質ナノ粒子(LNP)の形態である。実施形態では、酵素は、トランスポゾン、例えば、同じ脂質ナノ粒子(LNP)をコードする核酸と共製剤化される。実施形態では、共製剤は、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸を含む。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための方法であって、細胞を、配列番号2のアミノ酸配列及びS2位での置換を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアント、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約98%の同一性を有するバリアントと接触させることを含む、方法が提供される。実施形態では、置換は、非極性脂肪族アミノ酸、任意選択でG、A、V、L、I、及びPのうちの1つ、任意選択でS2Aである。実施形態では、酵素は、C末端に追加の残基を有しない。実施形態では、酵素は、例えば、S8X、C13X、及び/またはN125Xから選択される、超活性を付与する1つ以上の変異を有し、例えば、Xは、G、A、V、L、I、及びPから選択され、Xは、K、R、及びHから選択され、Xは、K、R、及びHから選択され、例えば、XはPであり、XはRであり、及び/またはXはKである。実施形態では、方法は、細胞を、トランスポゾンを含む構築物と接触させることをさらに含み、及び/または酵素が、トランスポゾンをコードする核酸(例えば、LNP中)と共製剤化される。実施形態では、共製剤は、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、S8P及び/またはC13R、ならびにR164N、W168V、M278A、K286A、R287A、R333A、K334A、N335A、K349A、K350A、K368A、K369A、及びD416Nのうちの1つから選択される1つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、S8P及び/またはC13R、ならびにR164N、W168V、M278A、K286A、R287A、R333A、K334A、N335A、K349A、K350A、K368A、K369A、及びD416Nのうちの1つ、及び/またはE284A、K286A、R287A、N310A、R333A、K334A、R336A、K349A、K350A、K368A、及びK369Aのうちの1つ以上から選択される1つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼは、S8P及び/またはC13R、ならびにR164N、W168V、M278A、K286A、R287A、R333A、K334A、N335A、K349A、K350A、K368A、K369A、及びD416Nのうちの1つ、及び/またはE284A、K286A、R287A、N310A、R333A、K334A、R336A、K349A、K350A、K368A、及びK369Aのうちの1つ以上、及び/または1つのR336Aから選択される1つ以上の変異を含む。
実施形態では、疾患または障害をエクスビボで治療するための方法であって、細胞を、配列番号2のアミノ酸配列及びS2位での置換を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントを含むか、あるいは配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約98%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)を含む組成物と接触させることを含む、方法が提供される。
実施形態では、疾患または障害をインビボで治療するための方法であって、配列番号2のアミノ酸配列及びS2位での置換を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントを含むか、あるいは配列番号3のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約98%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、または配列番号2のアミノ酸配列及びS2位での置換を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)、またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するバリアントを含む組成物を含む細胞を含むか、あるいは配列番号2のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約98%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素(例えば、MLTトランスポザーゼ)を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。
実施形態では、本MLTトランスポザーゼ(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有する)またはそのバリアント(及び任意選択で、1つ以上の超活性変異)は、piggyBacと比較して改善された組み込み効率を示す。実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列、ならびにS8P、C13R、及び/またはN125Kの本MLTトランスポザーゼは、piggyBacと比較して改善された組み込み効率を示す。
実施形態では、本MLTトランスポザーゼ(例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有する)、またはそのバリアント(及び任意選択で、1つ以上の超活性変異)は、RNAまたはDNAの形態であり得、タンパク質をより効率的に核内にシャトルするための1つまたは2つのN末端核局在化シグナル(NLS)を有し得る。例えば、実施形態では、本MLTトランスポザーゼは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のNLSをさらに含む。NLSの例は、Kosugi et al.(J.Biol.Chem.(2009)284:478-485、参照により本明細書に組み込まれる)において提供される。特定の実施形態では、NLSは、コンセンサス配列K(K/R)X(K/R)(配列番号348)を含む。一実施形態では、NLSは、コンセンサス配列(K/R)(K/R)X10-12(K/R)3/5(配列番号349)を含み、(K/R)3/5は、5つのアミノ酸のうちの少なくとも3つが、リジンまたはアルギニンのいずれかであることを表す。一実施形態では、NLSは、c-myc NLSを含む。特定の実施形態では、c-myc NLSは、配列PAAKRVKLD(配列番号350)を含む。特定の実施形態では、NLSは、ヌクレオプラスミンNLSである。特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンNLSは、配列KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号351)を含む。特定の実施形態では、NLSは、SV40ラージT抗原NLSを含む。特定の実施形態では、SV40ラージT-抗原NLSは、配列PKKKRKV(配列番号352)を含む。特定の実施形態では、NLSは、3つのSV40ラージT抗原NLS(例えば、DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV(配列番号353)を含む。様々な実施形態では、NLSは、それらが1つ以上の置換、付加、または欠失(例えば、約1、または約2、または約3、または約4、または約5、または約10の置換、付加、または欠失)を含有するように、上記の配列に変異/変形を含み得る。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、LEAP-IN1型またはLEAP-INトランスポゾン系に由来する(Biotechnol J.2018 Oct;13(10):e1700748.doi:10.1002/biot.201700748.Epub 2018 Jun 11)。
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、LEAP-IN1型のLEAPINトランスポザーゼ(ATUM,Newark,CA)を含む。LEAPINトランスポザーゼ系は、トランスポザーゼ(例えば、トランスポザーゼmRNA)、及びトランスポゾン同族逆位末端及び転位認識モチーフ(TTAT)に隣接する、1つ以上の目的の遺伝子(トランスポゾン)、選択マーカー、調節エレメント、絶縁体などを含有するベクターを含む。ベクターDNA及びトランスポザーゼmRNAのコトランスフェクション時に、一過性に発現された酵素は、宿主細胞のゲノムにわたる1つ以上の部位におけるトランスポゾンカセットの単一コピー(末端間の全ての配列)の高効率かつ正確な組み込みを触媒する。Hottentot et al.In Genotyping:Methods and Protocols.White SJ,Cantsilieris S,eds:185-196.(New York,NY:Springer):2017.pp.185-196。LEAPINトランスポザーゼは、複数のゲノム遺伝子座における、主にオープンクロマチンセグメントにおける単一コピーの組み込み;ペイロード制限なし、したがって複数の独立した転写単位が単一の構築物から発現され得ること;組み込まれた導入遺伝子がそれらの構造的かつ機能的完全性を維持すること;及び導入遺伝子の完全性の維持が、全ての組換え細胞における所望の鎖比を確保することを含む、様々な有利な特徴を有する安定な導入遺伝子組み込み物を生成する。
さらに、LEAPINトランスポザーゼは、自己不活性化機序を有する。トランスポザーゼ構築物のイントロン内に位置する3’-TREは、プロモーター領域を空間的に分離する。したがって、TTAA(配列番号1)部位間に位置するトランスポゾンを、転位中のプラスミドから酵素的に切除すると、プロモーターがLEAPINトランスポザーゼ構築物の5’末端から分離される。残りのプラスミド骨格中に存在するプロモーターレスとなったトランスポザーゼは、ゲノム中に非転位的に挿入されると不活性化され、それによって宿主細胞中の遺伝毒性効果を低減する。これにより、誤って合成され得るmRNA構築物からの任意のタンパク質合成を停止させることができる。Urschitz et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:8117-22。
いくつかの実施形態では、本発明の二重系は、導入遺伝子をコードするDNAプラスミドと、トランスポザーゼ(例えば、LEAPINトランスポザーゼ)をコードするRNAとを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼをコードするmRNAの使用は、トランスポザーゼをコードするDNA分子の送達よりも多くの利点を有することができる。例えば、Wilber et al.Mol Ther 2006;13:625-30を参照されたい。利点は、トランスポザーゼ発現の持続時間に関する制御の改善、組織内の持続性の最小化、及び初期の転位イベント後の導入遺伝子の再動員及び再挿入の可能性を含む。さらに、トランスポザーゼをコードするRNA配列は、宿主ゲノムに組み込むことができない可能性が高く、それによって、目的の遺伝子に対する長期的なトランスポザーゼ発現及び不安定化効果に関する懸念を排除する。さらに、いくつかの実施形態では、二重プラスミドDNAトランスポゾン/RNAトランスポザーゼ系は、細胞外RNA分解から保護するために、脂質ナノ粒子(LNP)の形態であり、これはインビボでの使用を改善する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子との構築物の安定した発現を確実にするために選択される様々な調節エレメントと会合することができる。したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、近傍遺伝子の活性化または不活性化を防止または軽減する1つ以上の絶縁体配列を含むことができる非ウイルスベクター(例えば、DNAプラスミド)によってコードされ得る。絶縁体は、トランスポゾン(導入遺伝子カセット)に隣接して、転写サイレンシングを低減し、染色体配列によって付与される位置効果を低減する。追加の効果として、絶縁体は、導入遺伝子エンハンサー及びプロモーター配列と隣接する染色体配列との機能的相互作用を排除することができる。いくつかの実施形態では、1つ以上の絶縁体配列は、HS4絶縁体(1.2kb 5′-HS4ニワトリβ-グロビン(cHS4)絶縁体エレメント)及びD4Z4絶縁体(Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy(FSHD)に連結されたタンデムマクロサテライト反復)を含む。いくつかの実施形態では、HS4絶縁体及びD4Z4絶縁体の配列は、Rival-Gervier et al.Mol Ther.2013 Aug;21(8):1536-50(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される通りである。
記載の方法は、転位(例えば、限定されないが、トランスポザーゼ)による標的ゲノム組み込みが可能な酵素を、それらをDNA結合TALEまたはdCas9/gRNAに融合させて、GSHSへの組み込みを標的とすることによって増強し、これは、オープンクロマチンを有する領域内にあり得る。実施形態では、酵素(例えば、DNA)をコードする核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切除時に、第1及び第2の部分が機能的酵素に融合されるように、第1の部分と第2の部分との間にインテインがコードされている第1及び第2の部分の形態で酵素をコードする。記載の方法は、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する。また、いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝性または後天性の疾患を、それを必要とする患者において治療するために使用される。
実施形態では、本開示の方法によって形質転換された細胞を含み得るトランスジェニック生物が提供される。実施形態では、生物は、哺乳動物または昆虫であってもよい。生物が哺乳動物である場合、生物には、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギなどが含まれ得るが、これらに限定されない。生物が昆虫である場合、生物には、ミバエ、蚊、ボールワーム(bollworm)などが含まれ得るが、これらに限定されない。
組成物は、容器、キット、パック、またはディスペンサーに、投与のための説明書とともに含まれ得る。
また本明細書では、i)本発明の前述の遺伝子導入構築物のうちのいずれか、及び/または前述の本発明の細胞のうちのいずれか、ならびにii)容器を含むキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、その使用のための説明書をさらに含む。ある特定の実施形態では、前述のキットのうちのいずれも、トランスポザーゼをコードする核酸配列を含む組換えDNA構築物をさらに含むことができる。
実施形態では、本開示の実施形態による組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、薬学的組成物の形態である。「薬学的に許容される担体」(「賦形剤」または「担体」とも称される)は、1つ以上の治療用化合物を対象(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳動物)に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、安定化剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであり、これは、用いられる投与量及び濃度で、それに曝露されている細胞または対象に対して無毒である。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、所与の薬学的組成物の1つ以上の治療用化合物及び任意の他の成分と組み合わされたときに、所望の嵩、粘度、及び他の適切な輸送及び化学的特性を提供するように、念頭に計画された投与の様式で選択され得る。アミノ酸と有害に反応しない典型的な薬学的に許容される担体としては、例として、水、生理食塩水、結合剤(例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、ラクトース及び他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム)、滑沢剤(例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム)、崩壊剤(例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)、及び湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体にはまた、pH緩衝水溶液またはリポソーム(薬物の哺乳動物への送達に有用である、様々な種類の脂質、リン脂質、及び/または界面活性剤で構成される小胞)も含まれる。薬学的に許容される担体のさらなる例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び/またはTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商標)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
薬学的組成物は、1つ以上の活性剤と、1つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、及び/またはアジュバント、ならびに任意選択で、通常、改善された導入、送達、忍容性などをもたらすために製剤に組み込まれる他の薬剤とを混合することによって製剤化され得る。薬学的組成物は、例えば、凍結乾燥製剤、水溶液、分散液、または固体調製物、例えば、錠剤、糖衣錠、またはカプセル中で製剤化することができる。多くの適切な製剤は、全ての製薬化学者に知られている処方集:Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed,Mack Publishing Company,Easton,PA(1990))、特にその中のBlock,Lawrenceによる第87章に見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクルを含有する脂質(カチオン性またはアニオン性)(LIPOFECTIN(商標)など)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。前述の混合物のうちのいずれも、製剤中の活性薬剤が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路と生理学的に適合し、許容可能であることを条件として、本明細書に記載の治療及び療法において適切であり得る。また、製薬化学者に周知の製剤、賦形剤、及び担体に関する追加情報については、Baldrick,Regul Toxicol Pharmacol 32:210-218,2000、Wang,Int J Pharm 203:1-60,2000、Charman J Pharm Sci 89:967-978,2000、及びPowell et al.PDA J Pharm Sci Technol 52:238-311,1998)、及びそれらの引用も参照されたい。
薬学的組成物には、限定されないが、溶液、乳剤、水性懸濁液、及びリポソーム含有製剤が含まれる。これらの組成物は、例えば、予め形成された液体、自己乳化固体、及び自己乳化半固体を含む種々の成分から生成することができる。エマルションは、しばしば、互いに密接に混合及び分散した2つの不混和液相を含む二相系であり、一般に、エマルションは、油中水(w/o)または水中油(o/w)のいずれかの種類である。エマルション製剤は、それらの製剤化の容易さ及び可溶化、吸収、及びバイオアベイラビリティの有効性により、治療薬の経口送達に広く使用されている。
組成物及び製剤は、滅菌水溶液を含み得、これは、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加剤(例えば、浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容される担体)も含み得る。組成物は、薬学的組成物に従来見出される他の補助成分を追加的に含有することができる。したがって、組成物はまた、例えば、痒み止め剤、収縮剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤などの適合性の薬学的活性材料、または染料、香味剤、保存剤、抗酸化剤、不透明剤、増粘剤、及び安定剤などの、本明細書で提供される組成物の様々な剤形の物理的製剤化に有用な追加の材料を含むことができる。さらに、組成物は、補助剤、例えば、滑沢剤剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香料、及び芳香族物質と混合することができる。しかしながら、添加されるとき、そのような材料は、本明細書で提供される組成物内のポリペプチド成分の生物活性を不当に妨げてはならない。製剤は、所望される場合、滅菌することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物を含む薬学的組成物は、少なくとも部分的に、注射用懸濁液を作製するために、希釈剤を伴うまたは伴わない溶液または粉末の形態であってもよい。組成物は、限定されないが、例えば、生理食塩水、水、乳酸、マンニトール、またはそれらの組み合わせなどの薬学的に許容されるビヒクルを含む追加の成分を含み得る。
任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の組成物を哺乳動物に投与することができる。投与は、例えば、非経口(例えば、皮下、くも膜下腔内、脳室内、筋肉内、もしくは腹腔内注射によって、または静脈内点滴によって)であり得る。投与は、迅速(例えば、注射による)であり得るか、またはある期間にわたって(例えば、ゆっくりとした注入もしくはゆっくりとした放出製剤の投与によって)行われ得る。いくつかの実施形態では、投与は、局所(例えば、経皮的、舌下的、眼科的、もしくは鼻腔内)、肺(例えば、粉末もしくはエアゾルの吸入もしくは吹送による)、または経口であり得る。加えて、本明細書に記載の組成物を含有する組成物は、腫瘍の外科的切除の前、後、またはその代わりに投与され得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例1-ヒトゲノムセーフハーバー部位(GSHS)を標的とする、転写活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメイン(DBD)またはdCas9/gRNAを用いたキメラトランスポザーゼの設計
この実施例では、ヒトGSHS TALEまたはdCas9/gRNA DBDを使用して、キメラトランスポザーゼを設計した。図1A~1D及び図2は、ヒトGSHS TALEまたはdCas9/gRNA DBDを使用して設計されたキメラトランスポザーゼの表現を示す。図1A.TALEは、転写活性化因子として機能するために核局在化シグナル(NLS)及び活性化ドメイン(AD)を含む。中央タンデム反復ドメインが、特異的なDNA結合及び宿主特異性を付与する。DNA結合の開始及び5’-Tの認識に必要な転移シグナル(TD)及び4つの暗号反復が、N末端に位置する(チェック模様の長方形)。CRD内の各34アミノ酸(aa)長の反復は、主に13位のaaによって決定される特異性を有する1つのヌクレオチドに結合する。1つのサンプル反復を、タンパク質スキームの下に示す。数字12/13は、反復内のaa位置を指す。Jankele et al.,Brief Funct Genomics 2014;13:409-19を参照されたい。図1B.1つまたは複数のヌクレオチドに対する特異性を有する反復型が示されている。DNAリーディング鎖の塩基のみが示される。図1C.23アミノ酸長を超えるリンカーによってそれに融合したTALE DNA結合タンパク質を有するキメラトランスポザーゼ(上)。Hew et al.,Synth Biol(Oxf)2019;4:ysz018を参照されたい。図1D.TALEのGSHSへの結合は、トランスポザーゼを同じ位置に物理的に隔離し、反復可変二残基(RVD)ヌクレオチド配列の近くの近傍TTAA(配列番号1)配列への転位を促進する。全てのRVDには、図1Aに示されるNTRに結合するチミン(T)が先行する。これらのGSHS領域は全てオープンクロマチンであり、トランスポザーゼ活性の影響を受けやすい)。
図2は、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸(例えば、ヘルパーRNA)と、トランスポザーゼ(ドナーDNA)をコードする核酸とを含む、本開示の実施形態による系の非限定的な表現である。ヘルパーRNAは、特定の末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーDNAをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素(例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ)に翻訳される。酵素は、オープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、dCas9/gRNAまたはTALEによって標的とされるDNA結合領域の近くのTTAA(配列番号1)認識部位にドナーDNAを挿入することができる。dCas9/gRNAのTALE GSHSへの結合は、酵素を同じ位置に物理的に隔離し、近傍のTTAA(配列番号1)配列への転位を促進する(図3及び図4を参照されたい)。
図1Cはまた、1つ以上のガイドRNAに連結されたdCas9を含むキメラトランスポザーゼ構築物を示す(下)。操作されたキメラトランスポザーゼは、ガイドRNA(gRNA)及び不活性化Casタンパク質を含み得る。gRNAは、Cas結合に必要な足場配列、及び修飾されるゲノム標的を定義するユーザ定義の約20ヌクレオチドスペーサーで構成される短い合成RNAである。したがって、Casタンパク質のゲノム標的は、gRNAに存在する配列に基づく。図4は、トランスポザーゼをGSHSに物理的に隔離し、近傍のTTAA(配列番号1)配列への転位を促進するgRNA配列を示す。
図8A~8Dは、構築物テンプレートの例を示す。図8Aは、5’-m7Gキャップ1及びプソイドウリジン置換で後に処理されるトランスポザーゼRNAを転写するプラスミド構築物テンプレートを示す。他のトランスポザーゼを置換することができる。図8Bは、任意の導入遺伝子の導入に使用することができる(一般的な)MLTドナーDNA構築物テンプレートを示す。他のdCas9/gRNA及びトランスポザーゼを置換することができる。
実施例2-M.lucifugus MLTトランスポザーゼ及びその超活性形態の転位活性を特性評価する
この研究は、部分的には、単量体、二量体、四量体、超活性体、及びInt-形態のM.lucifugus(MLT)トランスポザーゼを含む、MLTトランスポザーゼの転位活性を機能的に特性評価することを目的とする。本開示において発見された、L573del、E574del、及びS2A変異を有するMLTトランスポザーゼタンパク質は、本開示に従って操作され、補正されたMLTトランスポザーゼと称され得る。
図5A及び5Bは、MLTトランスポザーゼDNA及びMLTトランスポザーゼタンパク質から超活性、切除陽性、及び組み込み欠損(Int-)MLT変異体を示す。各変異体について、図5Aは、配列番号4のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる、非変異野生型MLTトランスポザーゼに対するヌクレオチド変化及び対応するアミノ酸変化を示す。図5Bは、MLTトランスポザーゼ骨格における変異及び様々なMLT変異体(1、2、及び3)を示す。
図6Aは、DNA結合ドメイン(赤色)を示す100%の信頼度を有する三次元MLTタンパク質構造を示す。三次元MLTタンパク質構造は、Phyre(Protein Homology/AnalogY Recognition Engine)、Kelley LA et al.Nature Protocols 10,845-858(2015)を使用して生成される。図6Bは、Phyreを使用したMLTの二次構造予測を示す。
図7は、piggyBac(「Trichoplusia ni」)トランスポザーゼの、MLT(「Myotis lucifugus」)トランスポザーゼ(2つの異なる配列)、ならびにコウモリトランスポザーゼMyotis myotis(4つの異なる配列)及びPteropus vampyrusに対するアミノ酸配列アラインメントを示す。配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Jebb,et al.,Nature,volume 583,pages 578-584(2020)から得られた。図7において、(GSL Biotechからの)SnapGene(登録商標)ソフトウェアを使用して生成されたアラインメントは、コンセンサス配列に対するものである。参照(コンセンサス)に一致するアミノ酸、すなわち、高度に保存された哺乳類トランスポザーゼ配列は、黄色の強調表示でマークされる。コンセンサスしきい値は、50%を超える。
この実施例では、図3、4、及び7に示される配列、または任意の他の配列を、部位特異的TALEまたはdCas9/gRNAを有するゲノムセーフハーバー部位を標的とするための候補を同定するために、MLT変異体の様々な組み合わせを試験する際に使用する。超活性、切除陽性、またはInt-MLT変異体が、本明細書に記載のMLTトランスポザーゼ、例えば、ヌクレオチド及びアミノ酸配列において、図5A及び5Bの変異を置換することによって、合成DNA合成によって生成され得る。
この実施例では、例えば、国際出願第WO2010085699号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)の実施例8に記載される遺伝子アッセイを使用して、Ura+復帰変異の頻度の増加についてスクリーニングすることができる。遺伝子アッセイは、酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるMLTの切除のために、修飾バージョンの酵母URA3遺伝子をトランスポゾンドナーとして使用する。
実施例3-本開示のpiggyBac、野生型MLTトランスポザーゼ、及び操作されたMLTトランスポザーゼの組み込み効率を特性評価する
この研究の目標は、公開されたソースからのものを含む、既知の超活性piggyBacトランスポザーゼの組み込み効率、及び本開示に従って操作されたMLTトランスポザーゼの組み込み効率を評価することであった。野生型Myotis Lucifugusトランスポザーゼ(MLT)配列は、(PCT/US2010/021871の)WO2010/085699公開及びMitra et al.,PNAS 2013;110:234に記載された。Mitra et al.(2013)のトランスポザーゼのヌクレオチド配列は、配列番号3のヌクレオチド配列を有する本開示のMLTトランスポザーゼ(「MLT」と称される)に対して77%の配列同一性を有する。超活性MLT(RNAについてヒトコドン最適化された)及びMitra et al.(2013)から公開された配列(同一性77.67%、ギャップ1.44%)のヌクレオチド配列アラインメントを示す、図10を参照されたい。MLTのヌクレオチド配列及びWO2010085699からのヌクレオチド配列は、それらのアラインメントを含有する図11に示されるように、73.68%の同一性(ギャップ1.16%)を有する。
さらに、本開示の操作されたMLTトランスポザーゼの末端配列は、Mitra et al.(2013)によって参照されるものとは異なる(Ray et al.Genome Res,2008;18:717を参照されたい)。図14及び図15は、Ray et al.,2018からの公開された配列の左端及び右端と比較した、操作されたMLTトランスポザーゼの左端及び右端を示す。
図12は、操作された超活性MLTトランスポザーゼ(S8P、C13R、及びN125K変異を有する、L573del/E574del/S2A、「MLT」)とMitra et al.によって公開された配列とのアミノ酸アラインメントを示す(アミノ酸配列間の差異は、下線を付けて太字で示される)。図12に示されるように、Mitra et al.からのアミノ酸配列は、本開示のMLTトランスポザーゼと比較して、2つの余分なC末端アミノ酸を含有していた。
図13は、操作された超活性MLTトランスポザーゼ(S8P及びC13R変異を有する、L573del/E574del/S2A、「MLT」)とWO2010085699からの公開された配列とのアミノ酸アラインメントを示す(アミノ酸配列間の差異は、下線を付けて太字で示される)。WO2010085699公開からの配列は、本開示のMLTトランスポザーゼのアミノ酸配列と比較して、複数のアミノ酸残基変化を有していた。WO2010085699は、図13に示されるような配列におけるアミノ酸変化、A14V、D475G、P491Q、A561T、T546T、T300A、T294A、A520T、G239S、S5P、S8F、S54N、D9N、D9G、I345V、M481V、E11G、K130T、G9G、R427H、S8P、S36G、D10G、S36G、及びサイレントから選択されるアミノ酸変化を含む、超活性トランスポザーゼ酵素について記載した。
図9A及び9Bは、本開示の操作されたMLTトランスポザーゼ及び他の(既知の)トランスポザーゼの組み込み効率の評価の結果を示す棒グラフである。図9Aは、MLTドナー(CMV-GFP、DNAドナー構築物テンプレートの例を示す図16を参照されたい)とともに使用された本開示の操作されたMLTトランスポザーゼ(S8P/C13R/S2A/L573del/E574del MLT)に対して、piggyBacドナー(CMV-GFP、図15を参照されたい)とともに使用されたYusa et al.PNAS 2010;108:1531-1536からの超活性piggyBacトランスポザーゼの組み込み効率(図16A、16B、16C、及び16Dを参照されたい)を示す。
図9A及び図9B(Yusa et al.(2010)から、I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、及びN571S変異を有し、太字及び下線を付けて示される)に示される研究で使用される超活性piggyBacアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure 2023525007000013
図9A及び図9Bに示される研究で使用した超活性piggyBacヌクレオチド配列(変異したコドンは、下線を付けて太字で示される)は、以下の通りである。
Figure 2023525007000014
図9A及び図9Bに示される研究で使用した超活性piggyBacの左ITRヌクレオチド配列(205bp)は、以下の通りである。
Figure 2023525007000015
図9A及び図9Bに示される研究で使用した超活性piggyBac右ITRヌクレオチド配列(310bp)は、以下の通りである。

Figure 2023525007000016
図9Aに示されるように、本開示のMLTトランスポザーゼは、Yusa et al.(2010)からのトランスポザーゼよりも優れた組み込み効率を有していた。本発明者らは、最後の2つのアミノ酸(L573del、E574del)を含まないトランスポザーゼ配列が、それらの末端アミノ酸が存在するトランスポザーゼよりも高い効率を有することを発見した。
図9Bは、piggyBac変異体の組み込み効率と比較した、本開示の操作されたMLTの組み込み効率を示す。図9Bは、a)超活性piggyBac(Yusa et al.(2010)から、配列番号17、18、19、及び20を参照されたい)+piggyBacドナー(図16を参照されたい)、b)超活性piggyBacドナーのみ(図16を参照されたい)、c)MLTドナーのみ(図16を参照されたい)、d)野生型MLT+MLTドナー、e)MLT N125K+MLTドナー、f)MLT S8P/C13R+MLTドナー、g)本開示の操作されたMLT(MLT S8P/C13R/ L573del/E574del)+MLTドナー、ならびにh)超活性piggyBac二量体+piggyBacドナーについての組み込み効率のパーセントを示す。超活性piggyBacドナー(b)及びMLTドナー(c)を対照として使用した。図9A及び図9Bに示されるように、本開示の操作されたMLTは、超活性piggyBac+piggyBacドナー系に匹敵する組み込み効率を有する。
実施例4-HeLa及びHEK293細胞における超活性MLTトランスポザーゼバリアントのインビトロ分析
この研究は、本開示による哺乳類トランスポザーゼ(MLTトランスポザーゼ)における新規の変異の発見を示し、超活性変異体を、それらの相対的組み込み効率について評価することによって、その切除能(Exc+)を向上させる。この研究では、HeLa及びHEK293細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の解析について詳述する。
哺乳類細胞組み込みアッセイのためのDNA。
GFP遺伝子及びブラスチジン耐性(BsdR)カセットを担持するトランスポゾンを含むドナープラスミド、ならびに転位を測定するためにサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下でトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドを使用した、2つのプラスミド転位アッセイ。昆虫piggyBacドナープラスミドは、ZeoCassette(商標)ベクター(pCMV/Zeo)(Thermo Fisher Scientific)骨格内の末端配列に隣接する、CMVプロモーターによって駆動されるGFP及びBsdRカセットを含有していた。昆虫piggyBacヘルパープラスミドは、pcDNA3.1 myc His A-His(Invitrogen)にクローニングされたpiggyBac ORFを含有していた。MLTドナープラスミドについて、昆虫piggyBac哺乳類ドナーpCMV/miniPB-GFP-BsdからのGFP-Bsdカセットを、特異的プライマーを使用してPCR増幅させた。断片を消化し、MLTドナープラスミドにクローニングした。MLT哺乳類ヘルパープラスミドでは、酵素をHAタグでタグ付けした。MLT ORFを、遺伝子の5’末端からのプライマー及び遺伝子の3’末端からのプライマーを用いて、プラスミドからPCR増幅させた。PCR生成物を消化し、プラスミドにクローニングした。推定触媒ドメインにおける様々な変異を合成し、評価した。
哺乳類細胞組み込みアッセイ。
HeLa細胞を、DMEM+10% FBS+ペニシリン-ストレプトマイシン中で増殖させた。HeLa細胞(2×10)を、製造業者のプロトコルに従って、OPTI-MEM培地(Life Technologies)中のFuGENE-HD(Roche)とともに、ドナー(294nM)及びヘルパー(42nM)プラスミドでトランスフェクトした。ドナープラスミド及び空のpCDNA3.1/myc-His Aでトランスフェクトした細胞は、非トランスポザーゼ対照であった。トランスフェクションの46時間後、細胞をトリプシン処理し、上記のような適切なDMEM+ブラスチジン(3.5μg/mL)中で段階希釈した。抗生物質を含む新鮮な培地を24時間ごとに投与し、21日間継続した。21日後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.2%メチレンブルーで染色し、青色コロニーをカウントした。
結果
図17A及び17Bは、HeLa細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。図17Aは、哺乳類トランスポザーゼ(Ts)バリアントS8P、C13R、N125K、及びS8P/C13Rが、ネイティブ酵素よりも高い切除及び組み込み頻度を有することを示す。図17Bは、ドナーネオマイシン導入遺伝子、1:20の連続希釈物でトランスフェクトしたHeLa細胞における機能的導入遺伝子発現を示す。哺乳類MLTトランスポザーゼバリアントS8P/C13Rは、HeLa細胞における昆虫piggyBacと同等の相対的組み込みを示した。
図18は、HEK293細胞におけるMLTトランスポザーゼ超活性変異体の相対的組み込み頻度を示す。二重変異体A/Cは、HEK293細胞において最も高い組み込み効率が観察されたことを示す。
MLTトランスポザーゼは、ヒト培養HeLa及びHEK293において正常に転位した。ドナープラスミドが抗生物質耐性マーカー及びトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドを含むトランスポゾンを担持し、トランスポゾン抗生物質マーカーのトランスポザーゼ依存性染色体組み込みを測定する、2プラスミドコトランスフェクションアッセイを使用した。超活性MLTトランスポザーゼを使用した組み込みの相対頻度は、HeLa細胞(図17A及び17B)における昆虫野生型及び超活性piggyBacに匹敵したが、HEK293細胞(図18)では約50%であったことが分かった。
本研究では、哺乳類MLTトランスポザーゼ超活性バリアントD及びA/Cの相対的組み込み効率は、HeLa細胞における昆虫piggyBacに匹敵した。これらのバリアントはまた、HEK293細胞において組み込み超活性を示した。
実施例5-MLTトランスポザーゼタンパク質の単離及び精製
この研究の目標は、MLTトランスポザーゼタンパク質を単離することであった。
タンパク質の発現及び精製
本開示の完全長MLTトランスポザーゼの遺伝子を、哺乳類発現についてコドン最適化し、N末端マルトース結合タンパク質(MBP)タグの下流の、TEVプロテアーゼ切断部位が続くBamHI制限部位とKpnI制限部位との間のpD2610発現ベクターにクローニングした。プラスミドpD2610-MPB-MLTトランスポザーゼは、標準的なPEIトランスフェクションプロトコルを使用して、一過性のタンパク質発現のために、500mLのEXPI293F細胞(Thermo Fisher Scientific)にトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞に、1LのExpi293発現培地を24時間後に供給した。細胞を、トランスフェクションの3日後に300×gで採取し、-80℃で保存した。MBPタグ付きMLTトランスポザーゼを発現する細胞を、25mMのTris-Cl、pH7.5、500mMのNaCl、1mMのTCEP、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含有する溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を、3サイクルの超音波処理によって溶解した。細胞溶解物を約95,000×gで30分間、4℃で遠心分離した(Beckman Coulter Optima L-100XP超遠心分離器、タイプ45Tiローター)。上清を濾過し、溶解緩衝液で平衡化した10mLのアミロース樹脂(New England BioLabs)と混合した。1時間の連続回転後、混合物を重力流カラムに充填し、100mLの溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を50mLの溶出緩衝液(25mMのTris-Cl、pH7.5、500mMのNaCl、10mMのマルトース、1mMのTCEP、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)で溶出した。溶出液をTEVプロテアーゼとともにインキュベートし、透析緩衝液(50mMのTris-Cl、pH7.5、500mMのNaCl、及び1mMのTCEP)に対して4℃で16~20時間透析した。切断されたMBPタグ及びMLTトランスポザーゼをヘパリン溶出から分離した。オートサンプラーを装備し、UNICORNシステム制御ソフトウェアとともにインストールされたAKTAシステムに接続されたSuperdex 200カラム上のサンプル体積。溶出したタンパク質を、260nm及び280nmで監視した。データ分析には、QtiPlotソフトウェアを使用した。精製したMLTトランスポザーゼを-80℃で保存した。収率は、2.2mg/mLまたは約1mg/Lの細胞培養で0.45mLであった。
結果
図19A及び19Bは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。図19Aは、アミロース樹脂カラムによる精製されたMBP-MLTトランスポザーゼ融合タンパク質の分析を示す。アミロース樹脂のカラム上で超音波処理された細菌の上清から発現されたタンパク質(MBP-MLTトランスポザーゼ)を精製した後、100+kDaの主要なタンパク質バンドを、SDS-PAGEによって同定した。図19Bでは、TEVプロテアーゼ及びヘパリン溶出によるMBPタグの一晩の切断後に、67.5kDaのMLTトランスポザーゼ特異的バンドが示された。
MBP MLTトランスポザーゼ融合タンパク質の親和性クロマトグラフィーを、アミロースアガロース樹脂、続いてステップ溶出で実施した。装填したサンプル、フロースルー、洗浄、及び溶出したタンパク質をSDS-PAGEによって分析して、MBP-MLTトランスポザーゼ精製タンパク質を含有するプールピーク画分を示した(図19A)。MLTトランスポザーゼを、SDS PAGEによって、66~68kDのサイズを有するヘパリン溶出によりMBPタグから分離した(図19B)。
図20は、Superdexサイズ排除クロマトグラフィーを示す。精製されたMLTトランスポザーゼの試料体積を、Superdex 200カラムに装填した。260nm及び280nmでの溶出されたタンパク質ピークは、二量体形成を示唆する。したがって、クロマトグラフィープロファイルは、MLTトランスポザーゼが二量体として存在することを示す(図20)。
この研究は、DNA結合タンパク質が、融合タンパク質として産生され、より特異的な精製を可能にし得るが、DNAと結合するそれらの能力はまた、ヘパリンをリガンドとして使用して親和性精製を可能にすることを実証した。この研究はまた、本開示のMLTトランスポザーゼが、二量体として存在するおよそ67.5kDの分子量を有するDNA結合タンパク質であることを示した。
実施例6-MLTトランスポザーゼとPiggyBacトランスポザーゼとの間の組み込みプロファイルの差異を評価する
この研究の目的は、本開示の昆虫由来のPiggyBac(PB)トランスポザーゼと非特異的な哺乳動物由来のMLTトランスポザーゼとの間の組み込みパターンの差異を評価することであった。比較には、分子サイズ、タンパク質長、認識末端、RefSeq遺伝子内の組み込み、±5kb転写開始部位、CpGアイランドから±5kb、及び免疫原性の比較が含まれた。DNA MLTヘルパー構築物の例を図21に示す。
一般に、DNAとして送達されたときのMLTトランスポザーゼ及びPiggyBacトランスポザーゼは、表1に示されるように、組み込み及び分子特性において類似している。


Figure 2023525007000017
本明細書で行われた比較は、DNAとして送達されたときのMLT及びpiggyBacが類似の特徴を有することを示した。表1の比較はまた、MLTトランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼよりも安全であり、したがって、組み込み中に望ましくない遺伝子の破壊または活性化を引き起こす可能性が低いことを示す。
実施例7-超活性MLTトランスポザーゼと超活性piggyBacの組み込み効率の比較
この研究の目的は、本開示に従って、昆虫由来のPiggyBac(PB)(I30V/G165S、S103P、M282V、S509G/N570S、N538K)及び超活性非特異的哺乳類由来トランスポザーゼ、MLTトランスポザーゼ(S8P/C13R変異を伴う)の最も超活性な形態の組み込み効率差を評価することであった。
超活性piggyBac(hypPB)トランスポザーゼ酵素[I30V/G165S、S103P、M282V、S509G/N570S、N538K-(7pB)の7つの変異を含有する]が、インビトロでのヒト細胞における遺伝子導入及びインビボでのマウスにおける体細胞への遺伝子導入に使用される。ネイティブPBと同様のタンパク質レベルの発現にもかかわらず、HEK293及びHeLa培養ヒト細胞の両方において、hypPBは、ネオマイシン耐性カセットトランスポゾンの遺伝子導入効率を著しく増加させた。Sleeping Beautyトランスポゾン系の最も活性なトランスポザーゼであるネイティブPB及びSB100Xは、培養ヒト細胞株において同様の転位効率を示した。初代ヒトT細胞にエクスビボで送達されると、hypPBは、piggyBac及びSB100Xと比較して、遺伝子送達を2~3倍増加させた。hypPBを、ルシフェラーゼレポータートランスポゾンと組み合わせた限られた用量のトランスポザーゼDNAの流体力学的尾静脈注射を使用して、マウスにおいて、ネイティブPB及びSB100Xとインビボで比較した。導入遺伝子発現を最大6ヶ月間監視し、ネイティブPBまたはSB100Xを注射したマウスと比較して、hypPBを注射したマウスでおよそ10倍の長期遺伝子発現を観察した。
方法
・HEK293細胞を、トランスフェクションの前日に12ウェルサイズのプレートに配置した。
・トランスフェクションの日に、トランスフェクションを実施する1時間30分前に培地を交換した。
・X-tremeGENE(商標)9 DNAトランスフェクション試薬を、製造業者のプロトコル(Sigma-Aldrich)に従って使用した。
・二重に、GFPを含有するドナープラスミド及びヘルパープラスミド(各々600ng)を共トランスフェクトした。ドナーDNAを、各重複トランスフェクションごとに混合し、1200ngのヘルパーRNA(トランスポザーゼ)を1200ngのドナーDNAと混合して合計2400ngにした。3:1比のX-tremeGENE(商標)9 DNAトランスフェクション試薬を使用したため、各複製物は2400ngのDNAを有し、7.2ulのX-tremeGENE(商標)9 DNAトランスフェクション試薬を使用した。
・2つの異なるドナープラスミド(1つはhypPB用、1つはhypMLT用)を使用した。全てのPBトランスポザーゼをPBドナーと混合したが、MLTドナーとは混合しなかった。
・トランスフェクションの48時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、GFP発現細胞のパーセント(%)をカウントして、一過性トランスフェクション効率を測定した。細胞を破片と区別するためにゲーティングし、各々2万個の細胞をカウントした。GFPゲーティングは、GFP-dim細胞であってもGFP陽性(GFP+)細胞としてカウントされるように、自由度が高かった。
・細胞を、抗生物質なしで15~20日間培養した。細胞を1週間当たり2/3回継代した。
・フローサイトメトリーを使用して、GFP発現細胞のパーセント(%)を測定し、2週間での組み込み効率を測定した(80,000個の細胞をカウントした)。ゲーティングは保守的であったため、明らかな明るい集団の周りにゲートが描き、非常に薄暗い細胞を除外した。
・最終組み込み効率は、2週間のGFP細胞%を48時間で割ることによって算出した。
結果
図22Aは、MLTなし、MLT-dCas9、MLT-dCas12j、超活性piggyBac-dCas12j、超活性piggyBac-dCas9、超活性piggyBac、及びMLTについての組み込み活性の%を示す。図22Bは、MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の切除活性の%を示す。図22Cは、MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の組み込み活性の%を示す。図22Dは、MLTなし、MLT-Cas12j、MLT-Cas9、MLT-Intein-N末端Cas9、MLT-Intein-N末端、MLT-Intein-N末端TALE、MLT-TALE10、及びMLTの切除活性の%を示す。
図22Aは、MLTトランスポザーゼ(MLT2)と比較した、超活性形態のpiggyBac(hypPB)の組み込み効率を示す。超活性MLTトランスポザーゼの組み込み効率(約28%)は、典型的に細胞及び遺伝子療法に使用される超活性形態のpiggyBac組み込み効率(約24%)よりも大きかった。死Cas(dCas)バインダーの付加によって、組み込み効率を低減した。の付加は、切除活性を30%から18%に低減した(図22D)。MLTへのdCasの付加は、切除活性を8%に低減した(図22D)。
実施例8-ヒトROSA26ゲノムセーフハーバー部位標的化のインビトロ分析
この研究の目的は、トランスポザーゼをヒトセーフハーバー部位であるROSA26に指向するためのRNA誘導性転位の有効性を評価することであった。
本研究では、ネイティブpiggyBac DBDにおいて変異を含有するRNA誘導性トランスポザーゼベクターのパネルを、ヒトROSA26セーフハーバー部位を標的とする能力について研究した。
プラスミド開発
piggyBacプラスミドを標的とする表現を、図23A、23B、23C、23D、及び23Eに示す。図23Aは、可撓性リンカーを介してトランスポザーゼ(piggyBac)に融合され、ガイドRNAを有するCAGプロモーターの制御下に置かれた、dCas9-PB-4ガイドヘルパー-触媒不活性dCas9を示す。図23Bは、ガイドRNAを欠いているdCas9-PB-4ガイドヘルパーを示す。図23Cは、dCas9 DNA結合タンパク質を欠いている対照PB(piggyBac)ヘルパーを示す。図23Dは、トランスポザーゼ(DPB)を欠いている非挿入性対照ヘルパー(CAGプロモーターの制御下のdCas9)を示す。図23Eは、CMVプロモーター下にあり、トランスポゾン末端反復エレメント(TRE)に隣接するTurboGFP内部リボソーム侵入部位(IRES)ネオマイシン導入遺伝子を含むドナープラスミドを示す。
図23Fは、piggyBacトランスポザーゼDNA結合ドメインDBDの破壊による特異性の改善のためのモデルの非限定的な概略図である。ネイティブPBトランスポザーゼは、完全なDNA結合能力を保持し、dCas9標的に続いて組み込まれる(オンターゲット)か、またはdCas9標的なしでオフターゲット配列への結合に続いて組み込まれる(オフターゲット)かのいずれかであり得る。PBと同様に、H2及びH3変異体トランスポザーゼ組み込み欠損バリアント(Int -)は、dCas9標的に続いて組み込まれ得る(オンターゲット)。しかしながら、トランスポザーゼのオフターゲット結合は、DNA結合ドメインにおける変異により阻害される。図23Fは、Int-トランスポザーゼ変異体を使用するための理論的根拠を示す。
図23Hは、TALE DNAバインダーに付着したキメラMLTトランスポザーゼ構築物を示す。他のTALE及びトランスポザーゼを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。
図23Gは、NpuN:
ggcggatctggcggtagtgctgagtattgtctgagttacgaaacggaaatactcacggttgagtatgggcttcttccaattggcaaaatcgttgaaaagcgcatagagtgtacggtgtattccgtcgataacaacggtaatatctacacccagccggtagctcagtggcacgaccgaggcgaacaggaagtgttcgagtattgcttggaagatggctcccttatccgcgccactaaagaccataagtttatgacggttgacgggcagatgctgcctatagacgaaatatttgagagagagctggacttgatgagagtcgataatctgccaaat(配列番号423)
及びNpuC:
ggcggatctggcggtagtgggggttccggatccataaagatagctactaggaaatatcttggcaaacaaaacgtctatgacataggagttgagcgagatcacaattttgctttgaagaatgggttcatcgcgtctaattgcttcaacgctagcggcgggtcaggaggctctggtggaagc(配列番号424)
インテインタンパク質スプライシングを使用することによってdCasに付着したMLTトランスポザーゼを示す。他のdCasを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。
SpCas9-HF1遺伝子をD10A及びH840A残基で変異させて、触媒ドメインを不活性化し、dCas9を生成した。dCas9-PBヘルパープラスミドは、前述の可撓性リンカーを使用して、トランスポザーゼ遺伝子(PB)をdCas9 DNA結合タンパク質に融合することによって、Gibsonアセンブリを使用して生成した。融合タンパク質を、CAG(サイトメガロウイルス(CMV)即時早期エンハンサー、ニワトリb-アクチンプロモーター、及びb-グロビンイントロン)プロモーターの下に配置した。DBD中にコドン変化を含有する2つの変異体トランスポザーゼヘルパープラスミドを、Gibsonアセンブリを使用して生成した。最初に、トランスポザーゼをヒトコドン最適化し、Genscriptによって合成した。次に、変異R372A及びD450Nを導入して,dCas9-H2ヘルパープラスミドを生成し、第3のK375A変異を導入して、dCas9-H3ヘルパープラスミドを生成した。Golden Gateを使用して、4つのgRNAをヘルパープラスミド骨格に付加した。簡潔に述べると、ガイド配列を含有する一本鎖オリゴをアニーリングし、hU6、mU6、H1、または7SKプロモーターのいずれかを含有するBbsI直鎖状発現プラスミドにライゲーションした。得られた4つのガイド発現プラスミドの各々のうちの1つを、最初にBsmBIで消化し、次いで単一のステップで単一のBsmBI直鎖状ヘルパープラスミドに組み立てた。8つのガイドを必要とする実験では、各々が4つのガイドを含有する2つのプラスミドを等量でコトランスフェクトした。陰性対照ヘルパープラスミドは、gRNAを欠いていた。PB、H2、またはH3トランスポザーゼのいずれかを含有したがDBDを欠く対照ヘルパープラスミドもまた、Gibsonアセンブリを使用して生成した。非組み込みDPB対照を生成するために、Gibsonアセンブリを使用して、piggyBacコード配列全体をdCas9-PBヘルパープラスミドから除去した。ドナープラスミドを生成するために、Gatewayクローニング(Thermo Fisher)を使用して、CMVプロモーター駆動TurboGFP、内部リボソーム侵入部位(IRES)、及びネオマイシン(GIN)遺伝子を特徴とするpENTRプラスミドを、導入遺伝子に隣接するpDONRプラスミドを含有するpiggyBac末端反復エレメント(TRE)と再結合させた。
細胞トランスフェクション
ヒト胚性腎臓(HEK293)細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清を補充した不完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持した。トランスフェクションの前に、ウェル当たり4×10細胞を6ウェルプレートに播種した。X-tremeGENE9(Sigma-Aldrich)を使用して、約80%のコンフルエンシーでの細胞を2ugのプラスミドDNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を再懸濁し、細胞の10%をフローサイトメトリー解析のために除去してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクションの48時間後、細胞の90%をT75フラスコに移し、200mg/mLのG418下で3週間培養し、その時点で、細胞を溶解及びゲノムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析のためにペレット化した。6ウェルディッシュ内の残りの10%の細胞を抗生物質なしで3週間培養し、フローサイトメトリーによって分析して、安定な挿入効率を測定した。単一細胞単離のために、2つのdCas9-H2-8ガイドトランスフェクションを反復した。G418選択されたポリクローナル集団を、各々96ウェルポリ-D-リジンコーティングプレート(BD Biosciences)に配置し、ウェル当たり平均50コロニーを得た。ウェルが40%コンフルエントより大きくなった後、培地を吸引し、細胞を30mLのリン酸緩衝生理食塩水中に手作業で再懸濁した。20mLの体積の再懸濁液を除去し、分析のために30mLのDirectPCR溶解試薬(Viagen Biotech)と混合した。残りの細胞をさらに培養した。ゲノムPCRによって標的クローンを含有することが特定された2つのウェルを増殖させ、段階希釈を使用して単一細胞を選別した。157個の単一細胞の増殖が得られるまで、ウェルを目視監視した。その後、クローン的に増殖した細胞を、手動ピペッティングによって再懸濁し、解析のために溶解した。ヒトROSA26(図24A)への標的挿入を含有する陽性クローン株をフローサイトメトリー分析のために増殖させて、導入遺伝子の潜在的なサイレンシングを検出した。
フローサイトメトリー
ROSA26標的単一細胞増殖からの20,000個の生細胞の緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を、dCas9-H2-8ガイドでのトランスフェクションに続いて、13週間の培養後にFACSAria III細胞計(BD Biosciences)を使用して分析した。
コロニー数アッセイ
ヒトROSA26標的単一クローンに存在するトランスポゾンの数を決定するために、コピー数アッセイをTaqMan定量的PCRによって実施して、ゲノムに存在するネオマイシン遺伝子の数を推定した。ヒトRNase P遺伝子を使用して、試料当たりの全ゲノムを正規化した。テンプレートには、クローン株由来のゲノムDNA、陰性対照のトランスフェクトされていないヒトゲノムDNA、及び単一ネオマイシン遺伝子挿入によるクローン細胞株由来の参照対照ゲノムDNAが含められた。QuantStudio 12Kフレックスサーモサイクラー(Applied Biosystems)を使用する定量的PCRを、TaqPath ProAmpマスターミックス試薬(Thermo Fisher)を製造業者の指示に従って使用して実施した。プライマー及びプローブを、ヒトRNase PのTaqManコピー数参照アッセイ及びTaqMan NeoRアッセイID:Mr00299300_ cn(Thermo Fisher)に含めた。CopyCallerソフトウェアv2.1を使用して、各試料の挿入数を予測した。
T7エンドヌクレアーゼIアッセイ
12ウェルプレートにおいて、10%熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したDMEM中80%コンフルエンシーのHEK293細胞を、X-tremeGENE9(Sigma-Aldrich)を使用して、500ngのSpCas9-HF1発現プラスミド、及び500ngの8つのROSA26指向性gRNAまたは陰性対照gRNA発現プラスミドのうちの1つでコトランスフェクトした。72時間後、細胞をペレット化し、DirectPCR細胞溶解緩衝液(Viagen Biotech)を使用して溶解した。8つ全てのガイド結合部位に隣接するように設計されたプライマーを使用して、KOD Xtreme Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen)を使用するゲノムPCRを実施した。生成物をPureLink PCRマイクロキット(Invitrogen)で精製し、溶融し、再アニールしてヘテロ二重鎖を形成した。各サンプルについて、T7エンドヌクレアーゼI(T7E1)(New England Biolabs)を用いてまたは用いずに同一のインキュベーションを実施して、ミスマッチ配列を含有するDNAを切断した。生成物を、ゲルイメージングのために2%ゲル上で分離した。2100 Bioanalyzer(Agilent)を使用して、T7E1アッセイによって得られた生成物の濃度を測定した。切断生成物の画分を、2つの予想される切断生成物の総pg/llを、2つの予想される切断生成物及び未切断生成物の総pg/llで除すことによって算出した。インデルの発生率を算出した。
ネステッドPCR
HEK293細胞を、トランスフェクションの前日に12ウェルサイズのプレートに配置した。トランスフェクションの当日、トランスフェクションを実施する1.5時間前に培地を交換する。本実験は、X-tremeGENE(商標)9 DNAトランスフェクション試薬及び製造業者のプロトコル(Sigma-Aldrich)を使用した。
三重トランスフェクションでは、GFP及びネオマイシンを含有するドナープラスミド、pBまたはMLTトランスポザーゼのいずれかに融合されたDBDを有するヘルパープラスミド、ならびにガイドRNA発現プラスミドまたはプラスミドの組み合わせをコトランスフェクトした。DNAを三重トランスフェクションごとに混合し、すなわち、1500ngのヘルパープラスミドを、1500ngのドナープラスミド及び600ngのガイドRNAと混合して合計を3600ngとした。3:1比のXtremeGene9試薬を使用したため、各三重トランスフェクションが3600ngのDNAを有し、10.8ulの試薬を使用した。トランスフェクションの48時間後、細胞を再懸濁し、T75フラスコ内に配置する。トランスフェクションの72時間後、培地を通常の培地からG418含有培地に変更した。G418含有培地中の細胞を3週間培養し、次いで、細胞をペレット化した。
次いで、細胞溶解及びプロテイナーゼK処理を実施して(DirectPCR溶解試薬、Viagen Biotech)、PCRのテンプレートのためのゲノムDNAを調製した。
一次PCRを、ゲノムから伸長するプライマーの半分及びトランスポゾン挿入物から伸長するプライマーの半分を使用して実施した(図24B)。図24Bは、Cas9、及びTTAA(配列番号1)標的部位からそれぞれ61bp及び62bpであった2つの異なるgRNAのセット(セット1:AATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号425)、TGCCCTGCAGGGGAGTGAGC(配列番号426);セット2:GAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号427)、CCTGCAGGGGAGTGAGCAGC(配列番号428))を有するMLTヘルパーを使用した、ヒトROSA26遺伝子座内の特異的TTAA(配列番号1)部位におけるドナーMLTの挿入を検出するネステッドPCR戦略を示す。
KOD Oneポリメラーゼを使用した:10ul反応、及び1ul直接溶解をテンプレートとして使用した。一次PCR生成物を水中で1:50に希釈した。次いで、1ulの1:50希釈を、一次生成物内にネストされるプライマーを使用して、ネステッドPCRのためのテンプレートとして使用した。PrimeStar GXLポリメラーゼを使用した(20ul反応物)。ネステッドPCR生成物を、1%アガロースゲル上に流し(図24C)、予想されるサイズのバンドを配列決定した。配列をアラインメントし、陽性挿入(TTAA(配列番号1)挿入部位及びトランスポゾン挿入物の縁部を有するゲノム配列を含むもの)を識別した(図24D)。
標的ゲノム組み込み部位の回復
HEK293細胞の安定したトランスフェクションからのペレットを、DirectPCR細胞溶解緩衝液(Viagen Biotech)を使用して溶解し、ネステッドPCRのためのテンプレートとして使用して標的トランスポゾン挿入を識別した。PCRを最適化するために、溶解物テンプレートを、1:1、1:4、及び1:8の3つの希釈で使用した。フォワードプライマーは、トランスポゾンから外向きに伸長するように設計したが、リバースプライマーは、ROSA26標的配列から伸長するように設計した(図24B)。10uLの一次PCRを、HO中1:50で希釈し、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼ(Clontech)を使用して20uLのネステッドPCRのためのテンプレートとして使用したKOD Xtreme Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen)を使用して実施した。増幅生成物を、Zymoclean Gel DNA回復キット(Zymo Research)でゲル精製し、直接配列決定したか、または配列決定のためにpJet1.2(Thermo Fisher)にクローニングした。BLASTを使用してトランスポゾン配列に対して、及びBLATを使用してヒト参照ゲノム(hg38)に対して配列をアラインメントして、挿入部位の位置を識別した。
ゲノムへのRNA誘導性転位
ヒトROSA26セーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を送達するdCas9-piggyBac融合構築物の能力を試験した。ドナープラスミドを、dCas9-PB、dCas9-H2、またはdCas9 H3で、各々0、4、または8個のガイドと二重にコトランスフェクトした。3週間の抗生物質選択に続いて、ゲノムPCRのテンプレートとして使用するために培養物を溶解した。挿入を回復する機会を向上させるために、溶解物テンプレートの3つの希釈液を使用した。トランスポゾンの各側面から伸長するように一次PCRプライマーを設計した。4つの追加の一次PCRプライマーを、ROSA26の標的部位(各側に2つ)に向かって伸長するように設計した。個々のPCR反応を、全ての対合プライマーの組み合わせ(合計8)を使用して実施した。一次PCR反応から生じる生成物を、ネステッドPCRのテンプレートとして使用した。配列決定された生成物には、トランスポゾンの隣接TRE、接合部におけるカノニカルTTAA(配列番号1)配列、及び挿入部位に隣接するゲノム配列が含まれた。
結果
本研究において、合計22個の挿入接合部を回復し、これらを図24Aに示す。本研究は、ヒト細胞におけるROSA26へのRNA誘導性転位を実証し、遺伝子療法使用のために、ヒトROSA26への組み込み欠損(Int-)PBトランスポザーゼ変異体を指向するための概念の証明を提供した。
本研究はまた、本発明者らが、インテインスプライシング及びgRNAによってdCas9に融合されたMLTを使用して、ROSA26における1つの特異的TTAA(配列番号1)部位を標的とすることができたことを実証する。
特異的TTAA(配列番号1)部位(図24B、図24C、及び図24D)におけるヘルパーMLT-TALE及びMLT-Cas9/gRNAトランスポザーゼ発現標的hROSA26が、ヒトROSA26に対する標的挿入を回復するためにゲノムPCRを使用したことが観察された。ゲノム全体にわたって挿入に利用可能な数百万の潜在的TTAA(配列番号1)配列にもかかわらず、gRNA標的配列に隣接したいくつかの挿入されたトランスポゾンが発見された。gRNAを用いない対照トランスフェクションは、いかなる標的挿入ももたらさなかった。図24B、図24C、及び図24Dに示される結果は、導入遺伝子が(DNA配列決定によって示されるように)フットプリントなしで、ゲノムセーフハーバー部位であるhROSA26に正常に組み込まれたことを実証する。これは、任意の遺伝子が、そのTTAA(配列番号1)位置に配置され得ることを示す。
実施例9-MLTトランスポザーゼ(RNAヘルパー)を使用した様々な細胞株(FACs)における組み込みの研究
この研究の目的は、本開示のMLTトランスポザーゼ及びCMV-GFPを使用して、4つの異なる細胞株(HEK293、Huh7、CHO-K1、及びT細胞)に組み込んで、様々な細胞株の組み込みの効率を比較することであった。さらなる目的は、CMV-GFPのみを組み込んで、MLTトランスポザーゼが細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。これを、FACsを使用することによって定量化して、一度組み込まれた各細胞株におけるGFP発現を測定した。
以下のプロトコルを使用した。
・CHO-K1、HEK293、HUH7、及びT細胞を3つの異なる細胞密度で播種した。
・3つの細胞株ヌクレオフェクション効率を、細胞株4D-Nucleofector(商標)キット及びプログラム(Lonza Bioscience)を使用し、0.4μgのpmaxGFP(商標)ベクターを(各特定の細胞株についてのプロバイダーの推奨に従って)陽性対照として使用して試験した。
・GFP発現の測定を、2つの時点(24時間及び72時間)で、ハイコンテント分析(視覚的)及びフローサイトメトリー(定量的)を使用して評価した。核を染色し、Hoechst33342生体染色色素で定量化した。GFP陽性細胞のパーセンテージを算出した。T細胞は懸濁細胞であるため、フローサイトメトリーの読み出しのみを実施した。
結果
研究した細胞株(CHO-K1、HEK293、HUH7、及びT細胞)は全て、80%を超えるヌクレオフェクトを受けた。全ての細胞株は、図25~28に示されるように、3日間のヌクレオフェクション後のMLTトランスポザーゼの存在または非存在において85~95%のGFP発現を示した。
図25は、異なる条件下でトランスフェクトされて、Huh7がGFPを発現することを示す初期Huh7細胞株を示す。行は、(上から)非処理細胞、模擬トランスフェクション(核酸を含まない)、MLTで処理した細胞、及びpmaxGFPで処理した細胞を示し、列は、1日目(D1)、3日目(D3)、及び7日目(D7)の対照を示す。
図26は、CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの24時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。
図27は、CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの72時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。
図28は、CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの1週間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。
図29Aは、CMV-GFP MLT DNAドナー及びMLT RNAヘルパーを使用して、トランスフェクション後14日目及び21日目のHEK293細胞の生存率を示す。リポフェクタミン、DNA、またはRNAによる明らかな毒性はなかった。14日後及び21日後に細胞の40%超において堅牢なGFPの発現が見出された(図29B)。組み込み効率をFACs分析し、37%の細胞が、MLTドナーDNAが安定に組み込まれたことを示した(図29C及び図29D)。図29Eは、T25フラスコにおけるヌクレオフェクションリポフェクション後のGFP陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。GFP陽性細胞%は、CMV-GFP MLTドナー単独では、CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAと比較して同じであった。CMV-GFP MLTドナー単独でトランスフェクトしたHEK293細胞において、GFP陽性率%は急速に低下し、21日目に5%に達した。CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAでトランスフェクトしたHEK293細胞において安定化したGFP陽性率%は、21日目に42%に達した。組み込み効率は、37%と算出された。ゲーティングFACsは、RNA発現(mCherry)の効果を評価するために、GFP陽性細胞集団及びmnCherry陽性細胞集団を選択することができた(図30A~D)。
実施例10-CMV-GFP/MLTトランスポザーゼを使用したHT1080細胞の転位
この研究の目的は、HT1080細胞をCMV-GFP MLT DNAドナー及びMLT DNAヘルパートランスポザーゼ1またはMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2でトランスフェクトし、それらのGFP発現を比較することによってそれらの転位効率を定量化することであった。HT1080は、ヒト線維肉腫細胞株である。
図31は、HT1080細胞のトランスフェクションから24時間後のCMV-GFP MLT DNAドナー発現を示し、図32は、HT1080細胞のトランスフェクションから2週間後のCMV-GFP MLT DNAドナー発現を示す。
図31に示されるように、MLT DNAヘルパートランスポザーゼ1及びMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2の両方は、CMV-GFP MLTドナーDNAと組み合わせたときに、HT1080細胞を効果的にトランスフェクトした。これらのトランスポザーゼの両方は、非常に類似したレベルのGFPを発現し、一方、ドナーDNAのみ(CMV-GFPのみ)は、GFPがこれらの細胞において発現できることを実証した。トランスフェクトされていない細胞株は、この細胞株には存在しないため、GFP発現を有していなかった。
2週間後、図32に示されるように、MLT DNAヘルパートランスポザーゼ1及びMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2からより少ないGFP発現が観察され、一方、MLT DNAヘルパートランスポザーゼ2は、MLT DNAヘルパートランスポザーゼ1と比較して、GFPをわずかに強く発現した。CMV-GFPのみ(ドナーDNAのみ)及びトランスフェクトされていない細胞は、ドナーDNAが細胞株に組み込まれない一方で、トランスフェクトされていない細胞がGFPを最初に発現することがなかったため、GFP発現を有していなかった。
この研究では、HT1080細胞におけるMLT DNAヘルパートランスポザーゼ1及びMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2のトランスフェクション効率を比較したとき、CMV-GFP MLT DNAドナーを有するMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2は、HT1080細胞をより効果的にトランスフェクトすることが示された(図32、トランスフェクションの2週間後)。組み込み効率は、MLT RNAヘルパートランスポザーゼ2とMLT DNAヘルパートランスポザーゼ2とで同等であるが、MLT DNAヘルパートランスポザーゼ2は、エクスビボ実験を含む細胞株のトランスフェクションにより好適である。
定義
以下の定義は、本明細書に開示される発明に関連して使用される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
「インビボ」という用語は、対象の身体内で起こる事象を指す。
「エクスビボ」という用語は、対象の身体から取り出された細胞、組織、及び/または臓器を治療すること、または処置を実施することを伴うイベントを指す。適切には、治療または手術の方法において、細胞、組織、及び/または臓器を対象の体内に戻すことができる。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、ある特定の位置での1つ以上の置換、欠失、及び/または付加によって参照の核酸またはアミノ酸配列とは異なる核酸またはアミノ酸配列を含む核酸またはタンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、1つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電されたまたは非荷電のアミノ酸の置換を伴ってもよい。
本明細書で使用される「担体」または「ビヒクル」は、薬物投与に好適な担体材料を指す。本明細書で有用な担体及びビヒクルには、当該技術分野で既知の任意のそのような材料、例えば、無毒であり、有害な様式で組成物の他の成分と相互作用しない任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、脂質などが含まれる。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または妥当な利益/リスク比に見合った他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適である、化合物、材料、組成物、及び/または剤形を指す。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むことが意図される。活性薬学的成分に対するそのような薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が、活性な薬学的成分と適合しないということを除いて、本発明の治療的組成物において、その使用が企図される。また、他の薬物などの追加の活性な薬学的成分を、記載の組成物及び方法に組み込むこともできる。
本明細書で使用される場合、「a」、「an」、または「the」は、1つまたは複数を意味することができる。
さらに、「約」という用語は、参照される数値表示に関連して使用されるとき、参照される数値表示にその参照される数値表示の最大10%を加減することを意味する。例えば、「約50」という言語は、45~55の範囲を網羅する。
本明細書で使用される場合、「include(含む)」という単語及びその変形は、リスト内のアイテムの列挙が、本技術の組成物及び方法においても有用であり得る他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることが意図される。同様に、「することができる(can)」及び「してもよい(may)」という用語、ならびにそれらの変形例は、非限定的であることが意図され、実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる、または含んでもよいという列挙は、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しない。
「含む(comprising)」というオープンエンドの用語は、含む(including)、含有する(containing)、または有する(having)などの用語の同義語として、本明細書では、本発明を記載し、特許請求するために使用されるが、本発明またはその実施形態は、代替的に、「からなる(consisting of)」または「から本質的になる(consisting essentially of)」などの代替用語を使用して記載されてもよい。
本明細書で使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、1つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、他の実施形態を本技術の範囲から除外することを意図するものではない。
同等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、概して、本発明の原理に従う本発明の任意の変形例、使用、または適応を網羅することが意図され、本発明が関連する当該技術分野内の既知のまたは慣習的な実践内にあり、本明細書に記載される本質的な特徴に適用され得、かつ添付の特許請求の範囲において以下に記載されるような本開示からのそのような逸脱を含むことが理解されるであろう。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態と同等のものを認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に構成のためのものであり、いかなる方法でも本開示を制限することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、全てのセクションに同等に適用可能であり得る。
TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。TALEは、転写活性化因子として機能するために核局在化シグナル(NLS)及び活性化ドメイン(AD)を含む。DNA結合ドメインは、12~13位に残留可変二残基(RVD)を有する33~34アミノ酸のおよそ16.5個の反復を有する。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。1つまたは複数のヌクレオチドに対する特異性を有するRVDが示されている。DNAリーディング鎖の塩基のみが示される。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。23アミノ酸長を超えるリンカーによって融合されたTALE DNA結合タンパク質を含むキメラトランスポザーゼ構築物(上)、及び1つ以上のガイドRNAに連結されたdCas9を含むキメラトランスポザーゼ構築物(下)である。 TALE及びCas9/ガイドRNA DNAバインダーを使用してヒトGSHSを標的とするように設計されたキメラ、モノマー、またはヘッド・トゥ・テール二量体トランスポザーゼの非限定的な表現を示す。キメラトランスポザーゼがオープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、TALEまたはdCas9/gRNAによって標的とされるDNA結合領域の近くのTTAA(配列番号1)認識部位にドナーDNAを挿入することを示す概略図である。TALEまたはdCas9/gRNAのGSHSへの結合は、モノマーまたは二量体としてのトランスポザーゼを同じ位置に物理的に隔離し、反復可変二残基(RVD)ヌクレオチド配列の近くの近傍のTTAA(配列番号1)配列(図3及び図4)への転位を促進する。全てのRVDには、図1Aに示されるNTRに結合するチミン(T)が先行する。 転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸(例えば、ヘルパーRNA)と、トランスポザーゼ(ドナーDNA)をコードする核酸とを含む、本開示の実施形態による系の非限定的な表現である。ヘルパーRNAは、特異的末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーDNAをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素(例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ)に翻訳される。酵素は、オープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、dCas9/gRNAまたはTALEによって標的とされるDNA結合領域の近くのTTAA(配列番号1)認識部位にドナーDNAを挿入することができる。dCas9/gRNAのTALE GSHSへの結合は、酵素を同じ位置に物理的に隔離し、近傍のTTAA(配列番号1)配列への転位を促進する(図3及び図4を参照されたい)。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のDNA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のD NA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のD NA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のD NA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるヒトゲノムセーフハーバー部位のD NA結合コードを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセー フハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセー フハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセ ーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 オープンクロマチンの領域におけるdCasを使用するヒトゲノムセ ーフハーバー部位を標的とするガイドRNAを示す。染色体2、4、6、及び11のゲノム位置は、Pellenz et al.(Hum Gene Ther 2019;30:814-28)から適合されたものであり、染色体10及び17のゲノム位置は、Papapetrou et al.(Nat Biotechnol 2011;29:73-8)から適合されたものである。配列を、hg18またはhg19を使用してUCSCゲノムブラウザからダウンロードし、TALE DBDを設計及び評価するためのソフトウェアツールであるE-TALEN、及びガイドRNAを設計するためのソフトウェアツールであるWU-CRISPRで評価した。 超活性MLT変異体を示す。 切除陽性及び組み込み欠損(Int-)MLT変異体を示す。 切除陽性及び組み込み欠損(Int-)MLT変異体を示す。 DNA結合ドメインを示す100%の信頼度を有する三次元MLTタンパク質構造を示す。 配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号4のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼの二次構造予測を示す。 配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号4のアミノ酸配列を含むMLTトランスポザーゼの二次構造予測を示す。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポ ザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 MLT(「コウモリ」)トランスポザーゼ及び他のコウモリトランスポ ザーゼ(Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis myotis、及びPteropus vampyrus)に対するpiggyBac(「Tni」)トランスポザーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。MLT及び他の哺乳類トランスポザーゼ(配列番号14(Myotis lucifugus)、配列番号12(Myotis myotis 2a)、配列番号13(Myotis myotis 1)、配列番号11(Pteropus vampyrus)、配列番号14(Myotis lucifugus 2)、配列番号15(Myotis myotis 2)、及び配列番号16(Myotis myotis 2b))に対するpiggyBac(配列番号10)のアミノ酸配列アラインメントは、「コンセンサス」の下に列挙される順序で現れる。 構築物テンプレートの非限定的な例を示す。5’-m7Gキャップ1及びプソイドウリジン置換で後に処理されるトランスポザーゼRNAを転写するプラスミド構築物テンプレートを示す。 構築物テンプレートの非限定的な例を示す。任意の導入遺伝子とともに使用するための一般的なMLTドナーDNA構築物テンプレートを示す。 Yusa et al.(2010)の配列を使用した、超活性piggyBacトランスポザーゼ対超活性MLTバリアント(S8P/C13R二重変異体;L573del E574del)の組み込み効率を示す棒グラフである。 Yusa et al.(2010)の配列を使用した、超活性piggyBacと比較した、操作されたMLT(S8P/C13R二重変異体;L573del E574del、S2A)の組み込み効率を示す棒グラフである。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT(RNAについてヒトコドン最適化)及びMitra et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2;110(1):234-9)による公開された配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性77.67%、ギャップ1.44%)。 MLT及びWO2010085699からの配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性73.68%、ギャップ1.16%)。 MLT及びWO2010085699からの配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す(同一性73.68%、ギャップ1.16%)。 MLT及びWO2010085699からの配列のヌクレオチド配列 アラインメントを示す(同一性73.68%、ギャップ1.16%)。 MLT(S8P、C13R、及びN125K変異を有する、L573del/E574del/S2A)及びMitra et al.による公開された配列のアラインメントを示す(MitraはC末端に2つの余剰アミノ酸を含んでいた)。 MLT(S8P、C13R、及びN125K変異を有する、L573 del/E574del/S2A)及びMitra et al.による公開された配列のアラインメントを示す(MitraはC末端に2つの余剰アミノ酸を含んでいた)。 操作されたMLTのアミノ酸(S8P及びC13R変異を有する、L573del/E574del/S2A、「MLT」)と、WO2010085699からの配列との比較を示す。 操作されたMLTのアミノ酸(S8P及びC13R変異を有する、L 573del/E574del/S2A、「MLT」)と、WO2010085699からの配列との比較を示す。 操作されたMLTのアミノ酸(S8P及びC13R変異を有する、L 573del/E574del/S2A、「MLT」)と、WO2010085699からの配列との比較を示す。 MLTの左末端と、公開された配列(Ray et al.,piggyBac1_ML)との比較を示す。 MLTの右末端と、公開された配列(Ray et al.piggyBac1_ML)との比較を示す。 組み込みアッセイのために、Myotis lucifugusトランスポザーゼ(MLT)またはpiggyBac(PB)トランスポザーゼのいずれかとともに使用されるDNAドナー構築物テンプレートを示す。DNAドナー構築物テンプレートは、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を駆動するサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを有する。 HeLa細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。哺乳類トランスポゾン(Ts)バリアントS8P、C13R、N125K、及びS8P/C13Rが、ネイティブ酵素よりも高い切除頻度を有することを示す。 HeLa細胞における超活性MLTトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。ドナーネオマイシン導入遺伝子、1:20の連続希釈物でトランスフェクトしたHeLa細胞における機能的導入遺伝子発現を示す。哺乳類MLTトランスポザーゼバリアントS8P/C13Rは、HeLa細胞における昆虫piggyBacと同等の相対的組み込みを示した。 MLTなし、MLT、N125K変異体、及びS8P/C13R変異体について、HEK293細胞におけるMLTトランスポザーゼ超活性変異体の組み込み効率のパーセント(%)を示す棒グラフである。二重変異体S8P/C13Rは、HEK293細胞において最高の組み込み効率が観察されたことを示す。MLTトランスポザーゼは、配列番号4のアミノ酸配列を含み、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされるMLTトランスポザーゼである。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。アミロース-樹脂カラムによる精製MBP-MLTトランスポザーゼ融合タンパク質の分析を示す。アミロース樹脂のカラム上で超音波処理された細菌の上清から発現されたタンパク質(MBP-MLTトランスポザーゼ)を精製した後、100+kDaの主要なタンパク質バンドを、SDS-PAGEによって同定した。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。TEVプロテアーゼ及びヘパリン溶出によるMBPタグの一晩の切断後に、67.5kDaのMLTトランスポザーゼ特異的バンドが示されたを示す。 マルトース結合タンパク質(MBP)-MLTトランスポザーゼ融合タンパク質のSuperdexサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 MLTトランスポゾンを含むドナープラスミドの一例を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-dCas9、MLT-dCas12j、超活性piggyBac-dCas12j、超活性piggyBac-dCas9、超活性piggyBac、及びMLTについての組み込み活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の切除活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-Intein-N末端、MLT1、及びMLT2の組み込み活性の%を示す。 L573del/E574del/S2Aを含み、かつS8P/C13R変異(配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9のアミノ酸配列を有するMLTトランスポザーゼ)を有する超活性MLTトランスポザーゼ(hypMLT)と比較した、piggyBac(hypPB)の超活性形態のバリアントの組み込み効率及び切除活性を示す棒グラフである。MLTなし、MLT-dCas12j、MLT-dCas9、MLT-Intein-N末端dCas9、MLT-Intein-N末端、MLT-Intein-N末端TALE、MLT-TALE10、及びMLTの切除活性の%を示す。hROSA29におけるTTAA(配列番号1)部位から27bp及び49bpのMLT-TALE10。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本研究で使用されるpiggyBacプラスミドを標的とする構造の例を示す。 本発明の実施形態による、piggyBacトランスポザーゼDNA結合ドメインDBDの破壊による特異性の改善のためのモデルの非限定的な概略図である。 例えば、NpuN(Intein-N)(配列番号423)及びNpuC(インテイン-C)(配列番号424)インテインタンパク質スプライシングを使用することによって、dCasに付着したMLTトランスポザーゼを示す。他のdCasを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。 TALE DNAバインダーに付着したキメラMLTトランスポザーゼ構築物を示す。他のTALE及びトランスポザーゼは、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。 本開示において同定される、超活性piggyBacトランスポザーゼドナー及びCas9/gRNAを有するヘルパーを使用して、ヒトROSA26への標的挿入を含有する陽性クローン株を示す。 Cas9、及びTTAA(配列番号1)標的部位からそれぞれ61bp及び62bpであった2つの異なるgRNAのセット(セット1:AATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号425)、TGCCCTGCAGGGGAGTGAGC(配列番号426);セット2:GAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号427)、CCTGCAGGGGAGTGAGCAGC(配列番号428))を有するMLTヘルパーを使用した、ヒトROSA26遺伝子座内の特異的TTAA(配列番号1)部位におけるドナーMLTの挿入を検出するネステッドPCR戦略を示す。 本開示で同定された、Cas9/gRNAを有するMLTヘルパーでのトランスフェクション後、hROSA26においてMLTドナーが挿入されるときに予想されるネステッドPCR断片を示す1.0%アガロースゲルを示す。 本開示において同定された、Cas9/gRNAを有するMLTヘルパーでのトランスフェクション後、hROSA26においてMLTドナーが挿入されるときの正しいジャンクションDNA配列を示すDNA配列決定クロマトグラムを示す。 異なる条件下でトランスフェクトして、Huh7がGFPを発現することを示す初期Huh7細胞株を示す。行は(上から)、未処理細胞、模擬細胞、MLTで処理した細胞、及びpmaxGFPで処理した細胞を示し、列は、1日目(D1)、3日目(D3)、及び7日目(D7)の対照を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの24時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの72時間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 CMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの1週間後の異なる比率での、CMV-GFP+MLTでトランスフェクトしたHuh7細胞を示す。上の行は、2:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(2μg)を示す。中央の行は、1:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(1μg)を示す。下の行は、0.5:1μgのCMV-GFP:MLT比でトランスフェクトした細胞、及びCMV-GFPのみでトランスフェクトした細胞(0.5μg)を示す。 トランスフェクションの14日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のHEK293細胞の生存率を示す。トランスフェクションの14日後の96ウェルプレートにおける細胞生存率は、わずかに良好である。未処理細胞と処理細胞との間の細胞生存率に顕著な差はない。 トランスフェクションの21日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のHEK293細胞の生存率を示す。トランスフェクションの21日後の96ウェルプレートにおける細胞生存率は、わずかに良好である。未処理細胞と処理細胞との間の細胞生存率に顕著な差はない。 トランスフェクションの14日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のGFP/mCherry陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。FACsゲーティング戦略を各実験内のサンプルに適用した。GFP陽性及びmCherry陽性細胞集団の選択を得た。mCherry RNA発現は、14日目に検出不可能であった。最も高いGFP陽性細胞%が、リポフェクタミンT25フォーマットで観察された。組み込み効率は、14日目に35%であった。 トランスフェクションの21日後の、96ウェルプレートにおけるヌクレオフェクション、T25フラスコにおけるリポフェクション、及び96ウェルプレートにおけるリポフェクション後のGFP/mCherry陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。FACsゲーティング戦略を各実験内のサンプルに適用した。GFP陽性及びmCherry陽性細胞集団の選択を得た。最も高いGFP陽性細胞%が、リポフェクタミンT25フォーマットで観察された。組み込み効率は、21日目に37%であった。 T25フラスコにおけるヌクレオフェクションリポフェクション後のGFP陽性HEK293細胞のパーセンテージを示す。GFP陽性細胞%は、CMV-GFP MLTドナー単独では、CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAと比較して同じであった。CMV-GFP MLTドナー単独でトランスフェクトしたHEK293細胞において、GFP陽性率%は急速に低下し、21日目に5%に達した。CMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーRNAでトランスフェクトしたHEK293細胞において安定化したGFP陽性率%は、21日目に42%に達した。組み込み効率は、37%と算出された。上の曲線は、「CMV-GFPドナー」である。 RNAもDNAもHEK293細胞の生存率に影響を与えず(図29A及び29B)、RNA発現は、トランスフェクション後に急速に減少し、14日目までに検出不可能となり(図29C及び29D)、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系が、高い組み込み効率を有する(図29E)と判断した、FACSゲーティング戦略を示す。Aは全ての細胞を示す。Bは単一の細胞を示す。Cは生細胞を示す。DはGFP単一陽性細胞、mCherry単一陽性細胞、二重陽性細胞、及び二重陰性細胞を示す。 RNAもDNAもHEK293細胞の生存率に影響を与えず(図29A及び29B)、RNA発現は、トランスフェクション後に急速に減少し、14日目までに検出不可能となり(図29C及び29D)、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系が、高い組み込み効率を有する(図29E)と判断した、FACSゲーティング戦略を示す。Aは全ての細胞を示す。Bは単一の細胞を示す。Cは生細胞を示す。DはGFP単一陽性細胞、mCherry単一陽性細胞、二重陽性細胞、及び二重陰性細胞を示す。 HT1080細胞のトランスフェクションの24時間後のCMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーDNAのトランスフェクションを示す。24時間での結果は、DNA MLTドナー/MLT RNAヘルパー系と同様である。 HT1080細胞のトランスフェクションの2週間後のCMV-GFP MLTドナー+MLTヘルパーDNAのトランスフェクションを示す。結果は、DNA MLTドナー/MLT DNAヘルパー系(約20% GFP+細胞)が、DNA MLTドナー/MLT DNAヘルパー系と比較して、より低い組み込み効率を有することを示唆する。

Claims (151)

  1. トランスポザーゼ酵素または前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む組成物であって、前記トランスポザーゼ酵素が、配列番号2に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記トランスポザーゼ酵素が、配列番号2のS2位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、前記組成物。
  2. 前記酵素が、配列番号2に対して少なくとも約90%の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記酵素が、配列番号2に対して少なくとも約93%の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
  4. 前記酵素が、配列番号2に対して少なくとも約95%の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
  5. 前記酵素が、配列番号2に対して少なくとも約98%の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
  6. 前記置換が、非極性脂肪族アミノ酸である、請求項1に記載の組成物。
  7. 前記置換が、非極性脂肪族アミノ酸である、請求項2~5のいずれか1項に記載の組成物。
  8. 前記置換が、G、A、V、L、I、及びPから選択される、請求項6に記載の組成物。
  9. 前記置換が、S2Aである、請求項8に記載の組成物。
  10. 前記酵素が、配列番号2に対して、C末端に追加の残基を有しない、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。
  11. 前記酵素が、超活性を付与する1つ以上の変異を有する、請求項1~10のいずれか1項に記載の組成物。
  12. 前記酵素が、S8X、C13X、及び/またはN125Xから選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記酵素が、S8X、C13X、及びN125X置換を有する、請求項12に記載の組成物。
  14. 前記酵素が、S8X及びC13X置換を有する、請求項12に記載の組成物。
  15. 前記酵素が、S8X及びN125X置換を有する、請求項12に記載の組成物。
  16. 前記酵素が、C13X及びN125X置換を有する、請求項12に記載の組成物。
  17. が、G、A、V、L、I、及びPから選択され、Xが、K、R、及びHから選択され、Xが、K、R、及びHから選択される、請求項12~16のいずれか1項に記載の組成物。
  18. がPであり、XがRであり、及び/またはXがKである、請求項17に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、前記トランスポザーゼ酵素を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の組成物。
  20. 転写活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメイン(DBD)、またはヌクレアーゼ欠損Cas9(dCas9)/gRNAをさらに含み、
    前記酵素が、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位(GSHS)内のTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができ、
    前記TALE DBDまたはdCas9/gRNA複合体が、前記キメラ酵素を前記GSHS配列に指向するのに好適である、請求項19に記載の組成物。
  21. 前記酵素が、哺乳動物細胞における核酸分子のゲノムセーフハーバー部位(GSHS)におけるTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項20に記載の組成物。
  22. 前記TALE DBDが、1つ以上の反復配列を含む、請求項19に記載の組成物。
  23. 前記TALE DBDが、約14、または約15、または約16、または約17、または約18、または約18.5個の反復配列を含む、請求項22に記載の組成物。
  24. 前記TALE DBD反復配列が、33または34アミノ酸を含む、請求項22または23に記載の組成物。
  25. 前記TALE DBD反復配列のうちの1つ以上が、前記33または34アミノ酸の残基12及び/または13に反復可変二残基(RVD)を含む、請求項24に記載の組成物。
  26. 前記RVDが、前記核酸分子内の1つの塩基対を認識する、請求項25に記載の組成物。
  27. 前記RVDが、前記核酸分子内のC残基を認識し、かつHD、N(ギャップ)、HA、ND、及びHIから選択される、請求項25に記載の組成物。
  28. 前記RVDが、前記核酸分子内のG残基を認識し、かつNN、NH、NK、HN、及びNAから選択される、請求項25に記載の組成物。
  29. 前記RVDが、前記核酸分子内のA残基を認識し、かつNI及びNSから選択される、請求項25に記載の組成物。
  30. 前記RVDが、前記核酸分子内のT残基を認識し、かつNG、HG、H(ギャップ)、及びIGから選択される、請求項25に記載の組成物。
  31. 前記GSHSが、染色体中のオープンクロマチン位置にある、請求項20~30のいずれか1項に記載の組成物。
  32. 前記GSHSが、アデノ関連ウイルス部位1(AAVS1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体、及びヒトRosa26遺伝子座から選択される、請求項20~31のいずれか1項に記載の組成物。
  33. 前記GSHSが、ヒト染色体2、4、6、10、11、または17上に位置する、請求項20~32のいずれか1項に記載の組成物。
  34. 前記GSHSが、TALC1、TALC2、TALC3、TALC4、TALC5、TALC7、TALC8、AVS1、AVS2、AVS3、ROSA1、ROSA2、TALER1、TALER2、TALER3、TALER4、TALER5、SHCHR2-1、SHCHR2-2、SHCHR2-3、SHCHR2-4、SHCHR4-1、SHCHR4-2、SHCHR4-3、SHCHR6-1、SHCHR6-2、SHCHR6-3、SHCHR6-4、SHCHR10-1、SHCHR10-2、SHCHR10-3、SHCHR10-4、SHCHR10-5、SHCHR11-1、SHCHR11-2、SHCHR11-3、SHCHR17-1、SHCHR17-2、SHCHR17-3、及びSHCHR17-4から選択される、請求項32または33に記載の組成物。
  35. 前記GSHSが、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つ以上を含む、請求項19~34のいずれか1項に記載の組成物。
  36. 前記TALE DBDが、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つに結合する、請求項35に記載の組成物。
  37. 前記TALE DBDが、
    NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
    NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
    NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
    HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
    NH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
    NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
    NI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
    HD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
    HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
    HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
    HD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
    HD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
    HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
    NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
    NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
    HD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
    NH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
    HD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
    HD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
    NH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
    HD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
    HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
    HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
    NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
    NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
    HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
    NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
    HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
    HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
    NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
    HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
    HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
    HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
    NH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
    NH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
    HD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
    NI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
    HD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
    HD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
    NN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
    NI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
    NN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
    NN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
    NN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
    NN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
    NI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
    HD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
    NH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
    NI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
    NH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
    NH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
    NH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
    NI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
    NH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
    NH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
    NH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
    NN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
    NN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
    NN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
    NI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
    HD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
    HD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
    NH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
    NI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
    HD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
    NI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、
    HD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)、及び
    NI NG NG NG HD HD NI NN NG NN HD NI HD NI(配列番号422)のうちの1つ以上を含む、請求項20~36のいずれか1項に記載の組成物。
  38. 前記dCas9/gRNA複合体が、GTTTAGCTCACCCGTGAGCC(配列番号91)、CCCAATATTATTGTTCTCTG(配列番号92)、GGGGTGGGATAGGGGATACG(配列番号93)、GGATCCCCCTCTACATTTAA(配列番号94)、GTGATCTTGTACAAATCATT(配列番号95)、CTACACAGAATCTGTTAGAA(配列番号96)、TAAGCTAGAGAATAGATCTC(配列番号97)、及びTCAATACACTTAATGATTTA(配列番号98)から選択されるガイドRNAを含み、前記ガイドRNAが、前記酵素をケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子に指向する、請求項20に記載の組成物。
  39. 前記dCas9/gRNA複合体が、
    CACCGGGAGCCACGAAAACAGATCC(配列番号99)、CACCGCGAAAACAGATCCAGGGACA(配列番号100)、CACCGAGATCCAGGGACACGGTGCT(配列番号101)、CACCGGACACGGTGCTAGGACAGTG(配列番号102)、CACCGGAAAATGACCCAACAGCCTC(配列番号103)、CACCGGCCTGGCCGGCCTGACCACT(配列番号104)、CACCGCTGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号105)、CACCGTGGTTTCCACTGAGCACTGA(配列番号106)、CACCGGATAGCCAGGAGTCCTTTCG(配列番号107)、CACCGGCGCTTCCAGTGCTCAGACT(配列番号108)、CACCGCAGTGCTCAGACTAGGGAAG(配列番号109)、CACCGGCCCCTCCTCCTTCAGAGCC(配列番号110)、CACCGTCCTTCAGAGCCAGGAGTCC(配列番号111)、CACCGTGGTTTCCGAGCTTGACCCT(配列番号112)、CACCGCTGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号113)、CACCGCGTTCCTGCAGAGTATCTGC(配列番号114)、AAACGGATCTGTTTTCGTGGCTCCC(配列番号115)、AAACTGTCCCTGGATCTGTTTTCGC(配列番号116)、AAACAGCACCGTGTCCCTGGATCTC(配列番号117)、AAACCACTGTCCTAGCACCGTGTCC(配列番号118)、AAACGAGGCTGTTGGGTCATTTTCC(配列番号119)、AAACAGTGGTCAGGCCGGCCAGGCC(配列番号120)、AAACGCCAGGCCTTCAGTGCTCAGC(配列番号121)、AAACTCAGTGCTCAGTGGAAACCAC(配列番号122)、AAACCGAAAGGACTCCTGGCTATCC(配列番号123)、AAACAGTCTGAGCACTGGAAGCGCC(配列番号124)、AAACCTTCCCTAGTCTGAGCACTGC(配列番号125)、AAACGGCTCTGAAGGAGGAGGGGCC(配列番号126)、AAACGGACTCCTGGCTCTGAAGGAC(配列番号127)、AAACAGGGTCAAGCTCGGAAACCAC(配列番号128)、AAACCCCCAGCAGATACTCTGCAGC(配列番号129)、AAACGCAGATACTCTGCAGGAACGC(配列番号130)、TCCCCTCCCAGAAAGACCTG(配列番号131)、TGGGCTCCAAGCAATCCTGG(配列番号132)、GTGGCTCAGGAGGTACCTGG(配列番号133)、GAGCCACGAAAACAGATCCA(配列番号134)、AAGTGAACGGGGAAGGGAGG(配列番号135)、GACAAAAGCCGAAGTCCAGG(配列番号136)、GTGGTTGATAAACCCACGTG(配列番号137)、TGGGAACAGCCACAGCAGGG(配列番号138)、GCAGGGGAACGGGGATGCAG(配列番号139)、GAGATGGTGGACGAGGAAGG(配列番号140)、GAGATGGCTCCAGGAAATGG(配列番号141)、TAAGGAATCTGCCTAACAGG(配列番号142)、TCAGGAGACTAGGAAGGAGG(配列番号143)、TATAAGGTGGTCCCAGCTCG(配列番号144)、CTGGAAGATGCCATGACAGG(配列番号145)、GCACAGACTAGAGAGGTAAG(配列番号146)、ACAGACTAGAGAGGTAAGGG(配列番号147)、GAGAGGTGACCCGAATCCAC(配列番号148)、GCACAGGCCCCAGAAGGAGA(配列番号149)、CCGGAGAGGACCCAGACACG(配列番号150)、GAGAGGACCCAGACACGGGG(配列番号151)、GCAACACAGCAGAGAGCAAG(配列番号152)、GAAGAGGGAGTGGAGGAAGA(配列番号153)、AAGACGGAACCTGAAGGAGG(配列番号154)、AGAAAGCGGCACAGGCCCAG(配列番号155)、GGGAAACAGTGGGCCAGAGG(配列番号156)、GTCCGGACTCAGGAGAGAGA(配列番号157)、GGCACAGCAAGGGCACTCGG(配列番号158)、GAAGAGGGGAAGTCGAGGGA(配列番号159)、GGGAATGGTAAGGAGGCCTG(配列番号160)、GCAGAGTGGTCAGCACAGAG(配列番号161)、GCACAGAGTGGCTAAGCCCA(配列番号162)、GACGGGGTGTCAGCATAGGG(配列番号163)、GCCCAGGGCCAGGAACGACG(配列番号164)、GGTGGAGTCCAGCACGGCGC(配列番号165)、ACAGGCCGCCAGGAACTCGG(配列番号166)、ACTAGGAAGTGTGTAGCACC(配列番号167)、ATGAATAGCAGACTGCCCCG(配列番号168)、ACACCCCTAAAAGCACAGTG(配列番号169)、CAAGGAGTTCCAGCAGGTGG(配列番号170)、AAGGAGTTCCAGCAGGTGGG(配列番号171)、TGGAAAGAGGAGGGAAGAGG(配列番号172)、TCGAATTCCTAACTGCCCCG(配列番号173)、GACCTGCCCAGCACACCCTG(配列番号174)、GGAGCAGCTGCGGCAGTGGG(配列番号175)、GGGAGGGAGAGCTTGGCAGG(配列番号176)、GTTACGTGGCCAAGAAGCAG(配列番号177)、GCTGAACAGAGAAGAGCTGG(配列番号178)、TCTGAGGGTGGAGGGACTGG(配列番号179)、GGAGAGGTGAGGGACTTGGG(配列番号180)、GTGAACCAGGCAGACAACGA(配列番号181)、CAGGTACCTCCTGAGCCACG(配列番号182)、GGGGGAGTAGGGGCATGCAG(配列番号183)、GCAAATGGCCAGCAAGGGTG(配列番号184)、CAAATGGCCAGCAAGGGTGG(配列番号309)、GCAGAACCTGAGGATATGGA(配列番号310)、AATACACAGAATGAAAATAG(配列番号311)、CTGGTGACTAGAATAGGCAG(配列番号312)、TGGTGACTAGAATAGGCAGT(配列番号313)、TAAAAGAATGTGAAAAGATG(配列番号314)、TCAGGAGTTCAAGACCACCC(配列番号315)、TGTAGTCCCAGTTATGCAGG(配列番号316)、GGGTTCACACCACAAATGCA(配列番号317)、GGCAAATGGCCAGCAAGGGT(配列番号318)、AGAAACCAATCCCAAAGCAA(配列番号319)、GCCAAGGACACCAAAACCCA(配列番号320)、AGTGGTGATAAGGCAACAGT(配列番号321)、CCTGAGACAGAAGTATTAAG(配列番号322)、AAGGTCACACAATGAATAGG(配列番号323)、CACCATACTAGGGAAGAAGA(配列番号324)、CAATACCCTGCCCTTAGTGG(配列番号327)、AATACCCTGCCCTTAGTGGG(配列番号325)、TTAGTGGGGGGTGGAGTGGG(配列番号326)、GTGGGGGGTGGAGTGGGGGG(配列番号328)、GGGGGGTGGAGTGGGGGGTG(配列番号329)、GGGGTGGAGTGGGGGGTGGG(配列番号330)、GGGTGGAGTGGGGGGTGGGG(配列番号331)、GGGGGTGGGGAAAGACATCG(配列番号332)、GCAGCTGTGAATTCTGATAG(配列番号333)、GAGATCAGAGAAACCAGATG(配列番号334)、TCTATACTGATTGCAGCCAG(配列番号335)、CACCGAATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号185)、CACCGGTCCCTGGGCGTTGCCCTGC(配列番号186)、CACCGCCCTGGGCGTTGCCCTGCAG(配列番号187)、CACCGCCGTGGGAAGATAAACTAAT(配列番号188)、CACCGTCCCCTGCAGGGCAACGCCC(配列番号189)、CACCGGTCGAGTCGCTTCTCGATTA(配列番号190)、CACCGCTGCTGCCTCCCGTCTTGTA(配列番号191)、CACCGGAGTGCCGCAATACCTTTAT(配列番号192)、CACCGACACTTTGGTGGTGCAGCAA(配列番号193)、CACCGTCTCAAATGGTATAAAACTC(配列番号194)、CACCGAATCCCGCCCATAATCGAGA(配列番号195)、CACCGTCCCGCCCATAATCGAGAAG(配列番号196)、CACCGCCCATAATCGAGAAGCGACT(配列番号197)、CACCGGAGAAGCGACTCGACATGGA(配列番号198)、CACCGGAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号199)、CACCGGCGACTCGACATGGAGGCGA(配列番号200)、AAACTGTCGAGTCGCTTCTCGATTC(配列番号201)、AAACGCAGGGCAACGCCCAGGGACC(配列番号202)、AAACCTGCAGGGCAACGCCCAGGGC(配列番号203)、AAACATTAGTTTATCTTCCCACGGC(配列番号204)、AAACGGGCGTTGCCCTGCAGGGGAC(配列番号205)、AAACTAATCGAGAAGCGACTCGACC(配列番号206)、AAACTACAAGACGGGAGGCAGCAGC(配列番号207)、AAACATAAAGGTATTGCGGCACTCC(配列番号208)、AAACTTGCTGCACCACCAAAGTGTC(配列番号209)、AAACGAGTTTTATACCATTTGAGAC(配列番号210)、AAACTCTCGATTATGGGCGGGATTC(配列番号211)、AAACCTTCTCGATTATGGGCGGGAC(配列番号212)、AAACAGTCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号213)、AAACTCCATGTCGAGTCGCTTCTCC(配列番号214)、AAACCCTCCATGTCGAGTCGCTTCC(配列番号215)、AAACTCGCCTCCATGTCGAGTCGCC(配列番号216)、CACCGACAGGGTTAATGTGAAGTCC(配列番号217)、CACCGTCCCCCTCTACATTTAAAGT(配列番号218)、CACCGCATTTAAAGTTGGTTTAAGT(配列番号219)、CACCGTTAGAAAATATAAAGAATAA(配列番号220)、CACCGTAAATGCTTACTGGTTTGAA(配列番号221)、CACCGTCCTGGGTCCAGAAAAAGAT(配列番号222)、CACCGTTGGGTGGTGAGCATCTGTG(配列番号223)、CACCGCGGGGAGAGTGGAGAAAAAG(配列番号224)、CACCGGTTAAAACTCTTTAGACAAC(配列番号225)、CACCGGAAAATCCCCACTAAGATCC(配列番号226)、AAACGGACTTCACATTAACCCTGTC(配列番号227)、AAACACTTTAAATGTAGAGGGGGAC(配列番号228)、AAACACTTAAACCAACTTTAAATGC(配列番号22
    9)、AAACTTATTCTTTATATTTTCTAAC(配列番号230)、AAACTTCAAACCAGTAAGCATTTAC(配列番号231)、AAACATCTTTTTCTGGACCCAGGAC(配列番号232)、AAACCACAGATGCTCACCACCCAAC(配列番号233)、AAACCTTTTTCTCCACTCTCCCCGC(配列番号234)、AAACGTTGTCTAAAGAGTTTTAACC(配列番号235)、AAACGGATCTTAGTGGGGATTTTCC(配列番号236)、AGTAGCAGTAATGAAGCTGG(配列番号237)、ATACCCAGACGAGAAAGCTG(配列番号238)、TACCCAGACGAGAAAGCTGA(配列番号239)、GGTGGTGAGCATCTGTGTGG(配列番号240)、AAATGAGAAGAAGAGGCACA(配列番号241)、CTTGTGGCCTGGGAGAGCTG(配列番号242)、GCTGTAGAAGGAGACAGAGC(配列番号243)、GAGCTGGTTGGGAAGACATG(配列番号244)、CTGGTTGGGAAGACATGGGG(配列番号245)、CGTGAGGATGGGAAGGAGGG(配列番号246)、ATGCAGAGTCAGCAGAACTG(配列番号247)、AAGACATCAAGCACAGAAGG(配列番号248)、TCAAGCACAGAAGGAGGAGG(配列番号249)、AACCGTCAATAGGCAAAGGG(配列番号250)、CCGTATTTCAGACTGAATGG(配列番号251)、GAGAGGACAGGTGCTACAGG(配列番号252)、AACCAAGGAAGGGCAGGAGG(配列番号253)、GACCTCTGGGTGGAGACAGA(配列番号254)、CAGATGACCATGACAAGCAG(配列番号255)、AACACCAGTGAGTAGAGCGG(配列番号256)、AGGACCTTGAAGCACAGAGA(配列番号257)、TACAGAGGCAGACTAACCCA(配列番号258)、ACAGAGGCAGACTAACCCAG(配列番号259)、TAAATGACGTGCTAGACCTG(配列番号260)、AGTAACCACTCAGGACAGGG(配列番号261)、ACCACAAAACAGAAACACCA(配列番号262)、GTTTGAAGACAAGCCTGAGG(配列番号263)、GCTGAACCCCAAAAGACAGG(配列番号264)、GCAGCTGAGACACACACCAG(配列番号265)、AGGACACCCCAAAGAAGCTG(配列番号266)、GGACACCCCAAAGAAGCTGA(配列番号267)、CCAGTGCAATGGACAGAAGA(配列番号268)、AGAAGAGGGAGCCTGCAAGT(配列番号269)、GTGTTTGGGCCCTAGAGCGA(配列番号270)、CATGTGCCTGGTGCAATGCA(配列番号271)、TACAAAGAGGAAGATAAGTG(配列番号272)、GTCACAGAATACACCACTAG(配列番号273)、GGGTTACCCTGGACATGGAA(配列番号274)、CATGGAAGGGTATTCACTCG(配列番号275)、AGAGTGGCCTAGACAGGCTG(配列番号276)、CATGCTGGACAGCTCGGCAG(配列番号277)、AGTGAAAGAAGAGAAAATTC(配列番号278)、TGGTAAGTCTAAGAAACCTA(配列番号279)、CCCACAGCCTAACCACCCTA(配列番号280)、AATATTTCAAAGCCCTAGGG(配列番号281)、GCACTCGGAACAGGGTCTGG(配列番号282)、AGATAGGAGCTCCAACAGTG(配列番号283)、AAGTTAGAGCAGCCAGGAAA(配列番号284)、TAGAGCAGCCAGGAAAGGGA(配列番号285)、TGAATACCCTTCCATGTCCA(配列番号286)、CCTGCATTGCACCAGGCACA(配列番号287)、TCTAGGGCCCAAACACACCT(配列番号288)、TCCCTCCATCTATCAAAAGG(配列番号289)、AGCCCTGAGACAGAAGCAGG(配列番号290)、GCCCTGAGACAGAAGCAGGT(配列番号291)、AGGAGATGCAGTGATACGCA(配列番号292)、ACAATACCAAGGGTATCCGG(配列番号293)、TGATAAAGAAAACAAAGTGA(配列番号294)、AAAGAAAACAAAGTGAGGGA(配列番号295)、GTGGCAAGTGGAGAAATTGA(配列番号296)、CAAGTGGAGAAATTGAGGGA(配列番号297)、GTGGTGATGATTGCAGCTGG(配列番号298)、CTATGTGCCTGACACACAGG(配列番号299)、GGGTTGGACCAGGAAAGAGG(配列番号300)、GATGCCTGGAAAAGGAAAGA(配列番号301)、TAGTATGCACCTGCAAGAGG(配列番号302)、TATGCACCTGCAAGAGGCGG(配列番号303)、AGGGGAAGAAGAGAAGCAGA(配列番号304)、GCTGAATCAAGAGACAAGCG(配列番号305)、AAGCAAATAAATCTCCTGGG(配列番号306)、AGATGAGTGCTAGAGACTGG(配列番号307)、及びCTGATGGTTGAGCACAGCAG(配列番号308)から選択されるガイドRNAを含む、請求項20に記載の組成物。
  40. 前記GSHSが、図3から選択され、前記TALE DBDが、図3の配列、またはそのバリアント(例えば、任意選択で挿入、置換、または欠失である、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を有する)を含む、請求項20~39のいずれか1項に記載の組成物。
  41. 前記GSHS及び前記TALE DBD配列が、
    TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)及びNH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
    TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)及びNH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
    TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)及びNH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
    TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)及びHD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
    TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)及びNH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
    TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)及びNH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
    TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)及びNI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
    TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)及びHD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
    TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)及びHD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
    TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)及びHD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
    TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)及びHD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
    TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)及びHD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
    TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)及びHD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
    TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)及びNH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
    TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)及びNH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
    TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)及びHD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
    TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)及びNH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
    CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)及びHD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
    CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)及びHD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
    GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)及びNH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
    TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)及びHD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
    TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)及びHD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
    TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)及びHD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
    TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)及びNI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
    TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)及びNH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
    TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)及びHD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
    TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)及びNH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
    TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)及びHD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
    TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)及びHD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
    TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)及びNH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
    TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)及びHD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
    TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)及びHD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
    TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)及びHD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
    TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)及びNH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
    GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)及びNH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
    CTGTGATCATGCCA(配列番号58)及びHD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
    ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)及びNI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
    CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)及びHD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
    CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)及びHD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
    GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)及びNN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
    ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)及びNI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
    GCTGCATCAACCCC(配列番号64)及びNN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
    GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)及びNN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
    GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)及びNN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
    GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)及びNN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
    AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)及びNI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
    CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)及びHD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
    GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)及びNH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
    ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)及びNI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
    GAAACTATGCCTGC(配列番号72)及びNH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
    GCACCATTGCTCCC(配列番号73)及びNH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
    GACATGCAACTCAG(配列番号74)及びNH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
    ACACCACTAGGGGT(配列番号75)及びNI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
    GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)及びNH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
    GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)及びNH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
    GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)及びNH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
    GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)及びNN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
    GTGCTCTGACAATA(配列番号80)及びNN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
    GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)及びNN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
    ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)及びNI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
    GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)及びHD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
    CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)及びHD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
    GAAAAACTATGTAT(配列番号85)及びNH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
    AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)及びNI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
    CAATACAACCACGC(配列番号87)及びHD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
    ATGACGGACTCAACT(配列番号88)及びNI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、ならびにCACAACATTTGTAA(配列番号89)及びHD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)から選択される、請求項20~40のいずれか1項に記載の組成物。
  42. 前記GSHSが、前記TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位の約25、または約50、または約100、または約150、または約200、または約300、または約500ヌクレオチド内にある、請求項20~41のいずれか1項に記載の組成物。
  43. 前記酵素が、超活性を付与する1つ以上の変異を有する、請求項1~42のいずれか1項に記載の組成物。
  44. 配列番号2のアミノ酸配列に対してS8P、C13R、及びN125K変異のうちの少なくとも1つに対応する位置に変異を有する、請求項43に記載の組成物。
  45. 前記組成物が、前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の組成物。
  46. 前記核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の組成物。
  47. 前記核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の組成物。
  48. 前記核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約93%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の組成物。
  49. 前記核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の組成物。
  50. 前記核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約98%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の組成物。
  51. 前記核酸が、ヒト細胞における発現のための、配列番号2のコドン最適化バージョンを含む、請求項45に記載の組成物。
  52. 前記核酸が、ベクターに組み込まれている、請求項45~51のいずれか1項に記載の組成物。
  53. 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項52に記載の組成物。
  54. 請求項45~53のいずれか1項に記載の核酸を含む宿主細胞を含む、組成物。
  55. 前記組成物が、脂質ナノ粒子(LNP)の形態である、請求項1~54のいずれか1項に記載の組成物。
  56. 前記LNPが、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、ジメチルアミノエタン-カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体(DC-Chol)、ホスファチジルコリン(PC)、トリオレイン(グリセリルトリオレエート)、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000(DMG-PEG 2K)、及び1,2-ジステアロール-sn-グリセロール-3ホスホコリン(DSPC)から選択される1つ以上の脂質を含み、及び/またはポリエチレンイミン(PEI)及びポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、及びN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)から選択される1つ以上の分子を含む、請求項55に記載の組成物。
  57. 前記トランスポザーゼ酵素または前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸が、トランスポゾンをコードする核酸と共製剤化される、請求項55または56に記載の組成物。
  58. 前記共製剤が、前記酵素または前記酵素をコードする核酸、及び前記トランスポゾンをコードする核酸の両方を封入する脂質ナノ粒子(LNP)の形態である、請求項57に記載の組成物。
  59. 前記共製剤が、前記酵素をコードする前記核酸及び前記トランスポゾンをコードする前記核酸を含む、請求項58に記載の組成物。
  60. 前記酵素が、単量体または二量体形態である、請求項1~18のいずれか1項に記載の組成物。
  61. 前記酵素が、
    (a)遺伝子切断(Exc+)活性、及び/または
    (b)遺伝子組み込み(Int+)、もしくは組み込みの欠如(Int-)活性を有する、請求項1~18のいずれか1項に記載の組成物。
  62. 細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法であって、細胞を、請求項1~61のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
  63. 前記細胞を、トランスポゾンをコードする核酸と接触させることをさらに含む、請求項62に記載の方法。
  64. 前記酵素が、前記トランスポゾンをコードする前記核酸と共製剤化される、請求項62に記載の方法。
  65. 前記共製剤が、同じ脂質ナノ粒子(LNP)の形態である、請求項62に記載の方法。
  66. 前記共製剤が、前記酵素をコードする前記核酸と、前記トランスポゾンをコードする前記核酸と、を含む、請求項65に記載の方法。
  67. 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号21及び22から選択される、1つ以上の逆位末端、またはそれらに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列に隣接している、請求項63~66のいずれか1項に記載の方法。
  68. 前記トランスポゾンが、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項63~67のいずれか1項に記載の方法。
  69. 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項63~68のいずれか1項に記載の方法。
  70. 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子を含む、請求項63~69のいずれか1項に記載の方法。
  71. 疾患または障害をエクスビボで治療するための方法であって、細胞を、請求項1~61のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
  72. 疾患または障害をインビボで治療するための方法であって、請求項1~61のいずれか1項に記載の組成物、または請求項1~61のいずれか1項に記載の組成物を含む細胞を投与することを含む、前記方法。
  73. 転位可能なキメラ酵素を含む組成物であって、
    (a)転写活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメイン(DBD)、またはヌクレアーゼ欠損Cas9(dCas9)/gRNA複合体と、
    (b)転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素であって、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位(GSHS)にTAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な前記酵素と、
    (c)(a)及び(b)を接続するリンカーと、を含む、前記組成物。
  74. 前記組成物が、生体細胞と接触したときに前記GSHS内の前記トランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である、請求項73に記載の組成物。
  75. 前記TALE DBDまたはdCas9/gRNA複合体が、前記キメラ酵素を前記GSHS配列に指向するのに好適である、請求項73に記載の組成物。
  76. 前記TALE DBDが、1つ以上の反復配列を含む、請求項73に記載の組成物。
  77. 前記TALE DBDが、約14、または約15、または約16、または約17、または約18、または約18.5個の反復配列を含む、請求項76に記載の組成物。
  78. 前記TALE DBD反復配列が、33または34アミノ酸を含む、請求項76または77に記載の組成物。
  79. 前記TALE DBD反復配列のうちの1つ以上が、前記33または34アミノ酸の残基12及び/または13に反復可変二残基(RVD)を含む、請求項78に記載の組成物。
  80. 前記RVDが、前記核酸分子内の1つの塩基対を認識する、請求項79に記載の組成物。
  81. 前記RVDが、前記核酸分子内のC残基を認識し、かつHD、N(ギャップ)、HA、ND、及びHIから選択される、請求項79に記載の組成物。
  82. 前記RVDが、前記核酸分子内のG残基を認識し、かつNN、NH、NK、HN、及びNAから選択される、請求項79に記載の組成物。
  83. 前記RVDが、前記核酸分子内のA残基を認識し、かつNI及びNSから選択される、請求項79に記載の組成物。
  84. 前記RVDが、前記核酸分子内のT残基を認識し、かつNG、HG、H(ギャップ)、及びIGから選択される、請求項79に記載の組成物。
  85. 前記GSHSが、染色体中のオープンクロマチン位置にある、請求項73~84のいずれか1項に記載の組成物。
  86. 前記GSHSが、アデノ関連ウイルス部位1(AAVS1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体、及びヒトRosa26遺伝子座から選択される、請求項73~85のいずれか1項に記載の組成物。
  87. 前記GSHSが、ヒト染色体2、4、6、10、11、または17上に位置する、請求項73~86のいずれか1項に記載の組成物。
  88. 前記GSHSが、TALC1、TALC2、TALC3、TALC4、TALC5、TALC7、TALC8、AVS1、AVS2、AVS3、ROSA1、ROSA2、TALER1、TALER2、TALER3、TALER4、TALER5、SHCHR2-1、SHCHR2-2、SHCHR2-3、SHCHR2-4、SHCHR4-1、SHCHR4-2、SHCHR4-3、SHCHR6-1、SHCHR6-2、SHCHR6-3、SHCHR6-4、SHCHR10-1、SHCHR10-2、SHCHR10-3、SHCHR10-4、SHCHR10-5、SHCHR11-1、SHCHR11-2、SHCHR11-3、SHCHR17-1、SHCHR17-2、SHCHR17-3、及びSHCHR17-4から選択される、請求項86または87に記載の組成物。
  89. 前記GSHSが、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つ以上を含む、請求項73~88のいずれか1項に記載の組成物。
  90. 前記TALE DBDが、TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)、TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)、TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)、TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)、TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)、TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)、TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)、TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)、TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)、TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)、TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)、TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)、TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)、TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)、TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)、TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)、TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)、CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)、CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)、GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)、TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)、TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)、TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)、TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)、TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)、TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)、TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)、TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)、TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)、TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)、TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)、TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)、TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)、TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)、GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)、CTGTGATCATGCCA(配列番号58)、ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)、CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)、CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)、GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)、ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)、GCTGCATCAACCCC(配列番号64)、GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)、GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)、GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)、AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)、CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)、GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)、ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)、GAAACTATGCCTGC(配列番号72)、GCACCATTGCTCCC(配列番号73)、GACATGCAACTCAG(配列番号74)、ACACCACTAGGGGT(配列番号75)、GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)、GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)、GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)、GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)、GTGCTCTGACAATA(配列番号80)、GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)、ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)、GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)、CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)、GAAAAACTATGTAT(配列番号85)、AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)、CAATACAACCACGC(配列番号87)、ATGACGGACTCAACT(配列番号88)、CACAACATTTGTAA(配列番号89)、及びATTTCCAGTGCACA(配列番号90)のうちの1つに結合する、請求項89に記載の組成物。
  91. 前記TALE DBDが、
    NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
    NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
    NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
    HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
    NH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
    NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
    NI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
    HD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
    HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
    HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
    HD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
    HD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
    HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
    NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
    NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
    HD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
    NH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
    HD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
    HD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
    NH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
    HD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
    HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
    HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
    NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
    NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
    HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
    NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
    HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
    HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
    NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
    HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
    HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
    HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
    NH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
    NH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
    HD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
    NI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
    HD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
    HD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
    NN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
    NI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
    NN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
    NN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
    NN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
    NN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
    NI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
    HD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
    NH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
    NI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
    NH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
    NH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
    NH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
    NI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
    NH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
    NH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
    NH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
    NN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
    NN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
    NN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
    NI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
    HD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
    HD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
    NH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
    NI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
    HD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
    NI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、
    HD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)、及び
    NI NG NG NG HD HD NI NN NG NN HD NI HD NI(配列番号422)のうちの1つ以上を含む、請求項73~90のいずれか1項に記載の組成物。
  92. 前記dCas9/gRNA複合体が、GTTTAGCTCACCCGTGAGCC(配列番号91)、CCCAATATTATTGTTCTCTG(配列番号92)、GGGGTGGGATAGGGGATACG(配列番号93)、GGATCCCCCTCTACATTTAA(配列番号94)、GTGATCTTGTACAAATCATT(配列番号95)、CTACACAGAATCTGTTAGAA(配列番号96)、TAAGCTAGAGAATAGATCTC(配列番号97)、及びTCAATACACTTAATGATTTA(配列番号98)から選択されるガイドRNAを含み、前記ガイドRNAが、前記酵素をケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子に指向する、請求項73に記載の組成物。
  93. 前記dCas9/gRNA複合体が、
    CACCGGGAGCCACGAAAACAGATCC(配列番号99)、CACCGCGAAAACAGATCCAGGGACA(配列番号100)、CACCGAGATCCAGGGACACGGTGCT(配列番号101)、CACCGGACACGGTGCTAGGACAGTG(配列番号102)、CACCGGAAAATGACCCAACAGCCTC(配列番号103)、CACCGGCCTGGCCGGCCTGACCACT(配列番号104)、CACCGCTGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号105)、CACCGTGGTTTCCACTGAGCACTGA(配列番号106)、CACCGGATAGCCAGGAGTCCTTTCG(配列番号107)、CACCGGCGCTTCCAGTGCTCAGACT(配列番号108)、CACCGCAGTGCTCAGACTAGGGAAG(配列番号109)、CACCGGCCCCTCCTCCTTCAGAGCC(配列番号110)、CACCGTCCTTCAGAGCCAGGAGTCC(配列番号111)、CACCGTGGTTTCCGAGCTTGACCCT(配列番号112)、CACCGCTGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号113)、CACCGCGTTCCTGCAGAGTATCTGC(配列番号114)、AAACGGATCTGTTTTCGTGGCTCCC(配列番号115)、AAACTGTCCCTGGATCTGTTTTCGC(配列番号116)、AAACAGCACCGTGTCCCTGGATCTC(配列番号117)、AAACCACTGTCCTAGCACCGTGTCC(配列番号118)、AAACGAGGCTGTTGGGTCATTTTCC(配列番号119)、AAACAGTGGTCAGGCCGGCCAGGCC(配列番号120)、AAACGCCAGGCCTTCAGTGCTCAGC(配列番号121)、AAACTCAGTGCTCAGTGGAAACCAC(配列番号122)、AAACCGAAAGGACTCCTGGCTATCC(配列番号123)、AAACAGTCTGAGCACTGGAAGCGCC(配列番号124)、AAACCTTCCCTAGTCTGAGCACTGC(配列番号125)、AAACGGCTCTGAAGGAGGAGGGGCC(配列番号126)、AAACGGACTCCTGGCTCTGAAGGAC(配列番号127)、AAACAGGGTCAAGCTCGGAAACCAC(配列番号128)、AAACCCCCAGCAGATACTCTGCAGC(配列番号129)、AAACGCAGATACTCTGCAGGAACGC(配列番号130)、TCCCCTCCCAGAAAGACCTG(配列番号131)、TGGGCTCCAAGCAATCCTGG(配列番号132)、GTGGCTCAGGAGGTACCTGG(配列番号133)、GAGCCACGAAAACAGATCCA(配列番号134)、AAGTGAACGGGGAAGGGAGG(配列番号135)、GACAAAAGCCGAAGTCCAGG(配列番号136)、GTGGTTGATAAACCCACGTG(配列番号137)、TGGGAACAGCCACAGCAGGG(配列番号138)、GCAGGGGAACGGGGATGCAG(配列番号139)、GAGATGGTGGACGAGGAAGG(配列番号140)、GAGATGGCTCCAGGAAATGG(配列番号141)、TAAGGAATCTGCCTAACAGG(配列番号142)、TCAGGAGACTAGGAAGGAGG(配列番号143)、TATAAGGTGGTCCCAGCTCG(配列番号144)、CTGGAAGATGCCATGACAGG(配列番号145)、GCACAGACTAGAGAGGTAAG(配列番号146)、ACAGACTAGAGAGGTAAGGG(配列番号147)、GAGAGGTGACCCGAATCCAC(配列番号148)、GCACAGGCCCCAGAAGGAGA(配列番号149)、CCGGAGAGGACCCAGACACG(配列番号150)、GAGAGGACCCAGACACGGGG(配列番号151)、GCAACACAGCAGAGAGCAAG(配列番号152)、GAAGAGGGAGTGGAGGAAGA(配列番号153)、AAGACGGAACCTGAAGGAGG(配列番号154)、AGAAAGCGGCACAGGCCCAG(配列番号155)、GGGAAACAGTGGGCCAGAGG(配列番号156)、GTCCGGACTCAGGAGAGAGA(配列番号157)、GGCACAGCAAGGGCACTCGG(配列番号158)、GAAGAGGGGAAGTCGAGGGA(配列番号159)、GGGAATGGTAAGGAGGCCTG(配列番号160)、GCAGAGTGGTCAGCACAGAG(配列番号161)、GCACAGAGTGGCTAAGCCCA(配列番号162)、GACGGGGTGTCAGCATAGGG(配列番号163)、GCCCAGGGCCAGGAACGACG(配列番号164)、GGTGGAGTCCAGCACGGCGC(配列番号165)、ACAGGCCGCCAGGAACTCGG(配列番号166)、ACTAGGAAGTGTGTAGCACC(配列番号167)、ATGAATAGCAGACTGCCCCG(配列番号168)、ACACCCCTAAAAGCACAGTG(配列番号169)、CAAGGAGTTCCAGCAGGTGG(配列番号170)、AAGGAGTTCCAGCAGGTGGG(配列番号171)、TGGAAAGAGGAGGGAAGAGG(配列番号172)、TCGAATTCCTAACTGCCCCG(配列番号173)、GACCTGCCCAGCACACCCTG(配列番号174)、GGAGCAGCTGCGGCAGTGGG(配列番号175)、GGGAGGGAGAGCTTGGCAGG(配列番号176)、GTTACGTGGCCAAGAAGCAG(配列番号177)、GCTGAACAGAGAAGAGCTGG(配列番号178)、TCTGAGGGTGGAGGGACTGG(配列番号179)、GGAGAGGTGAGGGACTTGGG(配列番号180)、GTGAACCAGGCAGACAACGA(配列番号181)、CAGGTACCTCCTGAGCCACG(配列番号182)、GGGGGAGTAGGGGCATGCAG(配列番号183)、GCAAATGGCCAGCAAGGGTG(配列番号184)、CAAATGGCCAGCAAGGGTGG(配列番号309)、GCAGAACCTGAGGATATGGA(配列番号310)、AATACACAGAATGAAAATAG(配列番号311)、CTGGTGACTAGAATAGGCAG(配列番号312)、TGGTGACTAGAATAGGCAGT(配列番号313)、TAAAAGAATGTGAAAAGATG(配列番号314)、TCAGGAGTTCAAGACCACCC(配列番号315)、TGTAGTCCCAGTTATGCAGG(配列番号316)、GGGTTCACACCACAAATGCA(配列番号317)、GGCAAATGGCCAGCAAGGGT(配列番号318)、AGAAACCAATCCCAAAGCAA(配列番号319)、GCCAAGGACACCAAAACCCA(配列番号320)、AGTGGTGATAAGGCAACAGT(配列番号321)、CCTGAGACAGAAGTATTAAG(配列番号322)、AAGGTCACACAATGAATAGG(配列番号323)、CACCATACTAGGGAAGAAGA(配列番号324)、CAATACCCTGCCCTTAGTGG(配列番号327)、AATACCCTGCCCTTAGTGGG(配列番号325)、TTAGTGGGGGGTGGAGTGGG(配列番号326)、GTGGGGGGTGGAGTGGGGGG(配列番号328)、GGGGGGTGGAGTGGGGGGTG(配列番号329)、GGGGTGGAGTGGGGGGTGGG(配列番号330)、GGGTGGAGTGGGGGGTGGGG(配列番号331)、GGGGGTGGGGAAAGACATCG(配列番号332)、GCAGCTGTGAATTCTGATAG(配列番号333)、GAGATCAGAGAAACCAGATG(配列番号334)、TCTATACTGATTGCAGCCAG(配列番号335)、CACCGAATCGAGAAGCGACTCGACA(配列番号185)、CACCGGTCCCTGGGCGTTGCCCTGC(配列番号186)、CACCGCCCTGGGCGTTGCCCTGCAG(配列番号187)、CACCGCCGTGGGAAGATAAACTAAT(配列番号188)、CACCGTCCCCTGCAGGGCAACGCCC(配列番号189)、CACCGGTCGAGTCGCTTCTCGATTA(配列番号190)、CACCGCTGCTGCCTCCCGTCTTGTA(配列番号191)、CACCGGAGTGCCGCAATACCTTTAT(配列番号192)、CACCGACACTTTGGTGGTGCAGCAA(配列番号193)、CACCGTCTCAAATGGTATAAAACTC(配列番号194)、CACCGAATCCCGCCCATAATCGAGA(配列番号195)、CACCGTCCCGCCCATAATCGAGAAG(配列番号196)、CACCGCCCATAATCGAGAAGCGACT(配列番号197)、CACCGGAGAAGCGACTCGACATGGA(配列番号198)、CACCGGAAGCGACTCGACATGGAGG(配列番号199)、CACCGGCGACTCGACATGGAGGCGA(配列番号200)、AAACTGTCGAGTCGCTTCTCGATTC(配列番号201)、AAACGCAGGGCAACGCCCAGGGACC(配列番号202)、AAACCTGCAGGGCAACGCCCAGGGC(配列番号203)、AAACATTAGTTTATCTTCCCACGGC(配列番号204)、AAACGGGCGTTGCCCTGCAGGGGAC(配列番号205)、AAACTAATCGAGAAGCGACTCGACC(配列番号206)、AAACTACAAGACGGGAGGCAGCAGC(配列番号207)、AAACATAAAGGTATTGCGGCACTCC(配列番号208)、AAACTTGCTGCACCACCAAAGTGTC(配列番号209)、AAACGAGTTTTATACCATTTGAGAC(配列番号210)、AAACTCTCGATTATGGGCGGGATTC(配列番号211)、AAACCTTCTCGATTATGGGCGGGAC(配列番号212)、AAACAGTCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号213)、AAACTCCATGTCGAGTCGCTTCTCC(配列番号214)、AAACCCTCCATGTCGAGTCGCTTCC(配列番号215)、AAACTCGCCTCCATGTCGAGTCGCC(配列番号216)、CACCGACAGGGTTAATGTGAAGTCC(配列番号217)、CACCGTCCCCCTCTACATTTAAAGT(配列番号218)、CACCGCATTTAAAGTTGGTTTAAGT(配列番号219)、CACCGTTAGAAAATATAAAGAATAA(配列番号220)、CACCGTAAATGCTTACTGGTTTGAA(配列番号221)、CACCGTCCTGGGTCCAGAAAAAGAT(配列番号222)、CACCGTTGGGTGGTGAGCATCTGTG(配列番号223)、CACCGCGGGGAGAGTGGAGAAAAAG(配列番号224)、CACCGGTTAAAACTCTTTAGACAAC(配列番号225)、CACCGGAAAATCCCCACTAAGATCC(配列番号226)、AAACGGACTTCACATTAACCCTGTC(配列番号227)、AAACACTTTAAATGTAGAGGGGGAC(配列番号228)、AAACACTTAAACCAACTTTAAATGC(配列番号22
    9)、AAACTTATTCTTTATATTTTCTAAC(配列番号230)、AAACTTCAAACCAGTAAGCATTTAC(配列番号231)、AAACATCTTTTTCTGGACCCAGGAC(配列番号232)、AAACCACAGATGCTCACCACCCAAC(配列番号233)、AAACCTTTTTCTCCACTCTCCCCGC(配列番号234)、AAACGTTGTCTAAAGAGTTTTAACC(配列番号235)、AAACGGATCTTAGTGGGGATTTTCC(配列番号236)、AGTAGCAGTAATGAAGCTGG(配列番号237)、ATACCCAGACGAGAAAGCTG(配列番号238)、TACCCAGACGAGAAAGCTGA(配列番号239)、GGTGGTGAGCATCTGTGTGG(配列番号240)、AAATGAGAAGAAGAGGCACA(配列番号241)、CTTGTGGCCTGGGAGAGCTG(配列番号242)、GCTGTAGAAGGAGACAGAGC(配列番号243)、GAGCTGGTTGGGAAGACATG(配列番号244)、CTGGTTGGGAAGACATGGGG(配列番号245)、CGTGAGGATGGGAAGGAGGG(配列番号246)、ATGCAGAGTCAGCAGAACTG(配列番号247)、AAGACATCAAGCACAGAAGG(配列番号248)、TCAAGCACAGAAGGAGGAGG(配列番号249)、AACCGTCAATAGGCAAAGGG(配列番号250)、CCGTATTTCAGACTGAATGG(配列番号251)、GAGAGGACAGGTGCTACAGG(配列番号252)、AACCAAGGAAGGGCAGGAGG(配列番号253)、GACCTCTGGGTGGAGACAGA(配列番号254)、CAGATGACCATGACAAGCAG(配列番号255)、AACACCAGTGAGTAGAGCGG(配列番号256)、AGGACCTTGAAGCACAGAGA(配列番号257)、TACAGAGGCAGACTAACCCA(配列番号258)、ACAGAGGCAGACTAACCCAG(配列番号259)、TAAATGACGTGCTAGACCTG(配列番号260)、AGTAACCACTCAGGACAGGG(配列番号261)、ACCACAAAACAGAAACACCA(配列番号262)、GTTTGAAGACAAGCCTGAGG(配列番号263)、GCTGAACCCCAAAAGACAGG(配列番号264)、GCAGCTGAGACACACACCAG(配列番号265)、AGGACACCCCAAAGAAGCTG(配列番号266)、GGACACCCCAAAGAAGCTGA(配列番号267)、CCAGTGCAATGGACAGAAGA(配列番号268)、AGAAGAGGGAGCCTGCAAGT(配列番号269)、GTGTTTGGGCCCTAGAGCGA(配列番号270)、CATGTGCCTGGTGCAATGCA(配列番号271)、TACAAAGAGGAAGATAAGTG(配列番号272)、GTCACAGAATACACCACTAG(配列番号273)、GGGTTACCCTGGACATGGAA(配列番号274)、CATGGAAGGGTATTCACTCG(配列番号275)、AGAGTGGCCTAGACAGGCTG(配列番号276)、CATGCTGGACAGCTCGGCAG(配列番号277)、AGTGAAAGAAGAGAAAATTC(配列番号278)、TGGTAAGTCTAAGAAACCTA(配列番号279)、CCCACAGCCTAACCACCCTA(配列番号280)、AATATTTCAAAGCCCTAGGG(配列番号281)、GCACTCGGAACAGGGTCTGG(配列番号282)、AGATAGGAGCTCCAACAGTG(配列番号283)、AAGTTAGAGCAGCCAGGAAA(配列番号284)、TAGAGCAGCCAGGAAAGGGA(配列番号285)、TGAATACCCTTCCATGTCCA(配列番号286)、CCTGCATTGCACCAGGCACA(配列番号287)、TCTAGGGCCCAAACACACCT(配列番号288)、TCCCTCCATCTATCAAAAGG(配列番号289)、AGCCCTGAGACAGAAGCAGG(配列番号290)、GCCCTGAGACAGAAGCAGGT(配列番号291)、AGGAGATGCAGTGATACGCA(配列番号292)、ACAATACCAAGGGTATCCGG(配列番号293)、TGATAAAGAAAACAAAGTGA(配列番号294)、AAAGAAAACAAAGTGAGGGA(配列番号295)、GTGGCAAGTGGAGAAATTGA(配列番号296)、CAAGTGGAGAAATTGAGGGA(配列番号297)、GTGGTGATGATTGCAGCTGG(配列番号298)、CTATGTGCCTGACACACAGG(配列番号299)、GGGTTGGACCAGGAAAGAGG(配列番号300)、GATGCCTGGAAAAGGAAAGA(配列番号301)、TAGTATGCACCTGCAAGAGG(配列番号302)、TATGCACCTGCAAGAGGCGG(配列番号303)、AGGGGAAGAAGAGAAGCAGA(配列番号304)、GCTGAATCAAGAGACAAGCG(配列番号305)、AAGCAAATAAATCTCCTGGG(配列番号306)、AGATGAGTGCTAGAGACTGG(配列番号307)、及びCTGATGGTTGAGCACAGCAG(配列番号308)から選択されるガイドRNAを含む、請求項73に記載の組成物。
  94. 前記GSHSが、図3から選択され、前記TALE DBDが、図3の配列、またはそのバリアント(例えば、任意選択で挿入、置換、または欠失である約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つの変異を有する)を含む、請求項73~92のいずれか1項に記載の組成物。
  95. 前記GSHS及び前記TALE DBD配列が、
    TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)及びNH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
    TGGCCGGCCTGACCACTGG(配列番号23)及びNH NH HD HD NH NH HD HD NG NH NI HD HD NI HD NG NH NH(配列番号355)、
    TGAAGGCCTGGCCGGCCTG(配列番号24)及びNH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD HD NH NH HD HD NG NH(配列番号356)、
    TGAGCACTGAAGGCCTGGC(配列番号25)及びNH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD HD NG NH NH HD(配列番号357)、
    TCCACTGAGCACTGAAGGC(配列番号26)及びHD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH NI NI NH NH HD(配列番号358)、
    TGGTTTCCACTGAGCACTG(配列番号27)及びNH NH NG NG NG HD HD NI HD NG NH NI NH HD NI HD NG NH(配列番号359)、
    TGGGGAAAATGACCCAACA(配列番号28)及びNH NH NH NH NI NI NI NI NG NH NI HD HD HD NI NI HD NI(配列番号360)、
    TAGGACAGTGGGGAAAATG(配列番号29)及びNI NH NH NI HD NI NH NG NH NH NH NH NI NI NI NI NG NH(配列番号361)、
    TCCAGGGACACGGTGCTAG(配列番号30)及びHD HD NI NH NH NH NI HD NI HD NH NH NG NH HD NG NI NH(配列番号362)、
    TCAGAGCCAGGAGTCCTGG(配列番号31)及びHD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD HD NG NH NH(配列番号363)、
    TCCTTCAGAGCCAGGAGTC(配列番号32)及びHD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI NH NG HD(配列番号364)、
    TCCTCCTTCAGAGCCAGGA(配列番号33)及びHD HD NG HD HD NG NG HD NI NH NI NH HD HD NI NH NH NI(配列番号365)、
    TCCAGCCCCTCCTCCTTCA(配列番号34)及びHD HD NI NH HD HD HD HD NG HD HD NG HD HD NG NG HD NI(配列番号366)、
    TCCGAGCTTGACCCTTGGA(配列番号35)及びHD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD NG NG NH NH NI(配列番号367)、
    TGGTTTCCGAGCTTGACCC(配列番号36)及びNH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG NH NI HD HD HD(配列番号368)、
    TGGGGTGGTTTCCGAGCTT(配列番号37)及びNH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH NI NH HD NG NG(配列番号369)、
    TCTGCTGGGGTGGTTTCCG(配列番号38)及びHD NG NH HD NG NH NH NH NH NG NH NH NG NG NG HD HD NH(配列番号370)、
    TGCAGAGTATCTGCTGGGG(配列番号39)及びNH HD NI NH NI NH NG NI NG HD NG NH HD NG NH NH NH NH(配列番号371)、
    CCAATCCCCTCAGT(配列番号40)及びHD HD NI NI NG HD HD HD HD NG HD NI NH NG(配列番号372)、
    CAGTGCTCAGTGGAA(配列番号41)及びHD NI NH NG NH HD NG HD NI NH NG NH NH NI NI(配列番号373)、
    GAAACATCCGGCGACTCA(配列番号42)及びNH NI NI NI HD NI NG HD HD NH NH HD NH NI HD NG HD NI(配列番号374)、
    TCGCCCCTCAAATCTTACA(配列番号43)及びHD NH HD HD HD HD NG HD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI(配列番号375)、
    TCAAATCTTACAGCTGCTC(配列番号44)及びHD NI NI NI NG HD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD(配列番号376)、
    TCTTACAGCTGCTCACTCC(配列番号45)及びHD NG NG NI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD(配列番号377)、
    TACAGCTGCTCACTCCCCT(配列番号46)及びNI HD NI NH HD NG NH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG(配列番号378)、
    TGCTCACTCCCCTGCAGGG(配列番号47)及びNH HD NG HD NI HD NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH(配列番号379)、
    TCCCCTGCAGGGCAACGCC(配列番号48)及びHD HD HD HD NG NH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD(配列番号380)、
    TGCAGGGCAACGCCCAGGG(配列番号49)及びNH HD NI NH NH NH HD NI NI HD NH HD HD HD NI NH NH NH(配列番号381)、
    TCTCGATTATGGGCGGGAT(配列番号50)及びHD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD NH NH NH NI NG(配列番号382)、
    TCGCTTCTCGATTATGGGC(配列番号51)及びHD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG NG NI NG NH NH NH HD(配列番号383)、
    TGTCGAGTCGCTTCTCGAT(配列番号52)及びNH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG HD NH NI NG(配列番号384)、
    TCCATGTCGAGTCGCTTCT(配列番号53)及びHD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH HD NG NG HD NG(配列番号385)、
    TCGCCTCCATGTCGAGTCG(配列番号54)及びHD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD NH NI NH NG HD NH(配列番号386)、
    TCGTCATCGCCTCCATGTC(配列番号55)及びHD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD NI NG NH NG HD(配列番号387)、
    TGATCTCGTCATCGCCTCC(配列番号56)及びNH NI NG HD NG HD NH NG HD NI NG HD NH HD HD NG HD HD(配列番号388)、
    GCTTCAGCTTCCTA(配列番号57)及びNH HD NG NG HD NI NH HD NG NG HD HD NG NI(配列番号389)、
    CTGTGATCATGCCA(配列番号58)及びHD NG NK NG NH NI NG HD NI NG NH HD HD NI(配列番号390)、
    ACAGTGGTACACACCT(配列番号59)及びNI HD NI NN NG NN NN NG NI HD NI HD NI HD HD NG(配列番号391)、
    CCACCCCCCACTAAG(配列番号60)及びHD HD NI HD HD HD HD HD HD NI HD NG NI NI NN(配列番号392)、
    CATTGGCCGGGCAC(配列番号61)及びHD NI NG NG NN NN HD HD NN NN NN HD NI HD(配列番号393)、
    GCTTGAACCCAGGAGA(配列番号62)及びNN HD NG NG NN NI NI HD HD HD NI NN NN NI NN NI(配列番号394)、
    ACACCCGATCCACTGGG(配列番号63)及びNI HD NI HD HD HD NN NI NG HD HD NI HD NG NN NN NN(配列番号395)、
    GCTGCATCAACCCC(配列番号64)及びNN HD NG NN HD NI NG HD NI NI HD HD HD HD(配列番号396)、
    GCCACAAACAGAAATA(配列番号65)及びNN NN HD NI HD NN NI NI NI HD NI HD HD HD NG HD HD(配列番号397)、
    GGTGGCTCATGCCTG(配列番号66)及びNN NN NG NN NN HD NG HD NI NG NN HD HD NG NN(配列番号398)、
    GATTTGCACAGCTCAT(配列番号67)及びNN NI NG NG NG NN HD NI HD NI NN HD NG HD NI NG(配列番号399)、
    AAGCTCTGAGGAGCA(配列番号68)及びNI NI NH HD NG HD NG NH NI NH NH NI NH HD(配列番号400)、
    CCCTAGCTGTCCC(配列番号69)及びHD HD HD NG NI NK HD NG NH NG HD HD HD HD(配列番号401)、
    GCCTAGCATGCTAG(配列番号70)及びNH HD HD NG NI NH HD NI NG NH HD NG NI NH(配列番号402)、
    ATGGGCTTCACGGAT(配列番号71)及びNI NG NH NH NH HD NG NG HD NI HD NH NH NI NG(配列番号403)、
    GAAACTATGCCTGC(配列番号72)及びNH NI NI NI HD NG NI NG NH HD HD NG NH HD(配列番号404)、
    GCACCATTGCTCCC(配列番号73)及びNH HD NI HD HD NI NG NG NH HD NG HD HD HD(配列番号405)、
    GACATGCAACTCAG(配列番号74)及びNH NI HD NI NG NH HD NI NI HD NG HD NI NH(配列番号406)、
    ACACCACTAGGGGT(配列番号75)及びNI HD NI HD HD NI HD NG NI NH NH NH NH NG(配列番号407)、
    GTCTGCTAGACAGG(配列番号76)及びNH NG HD NG NH HD NG NI NH NI HD NI NH NH(配列番号408)、
    GGCCTAGACAGGCTG(配列番号77)及びNH NH HD HD NG NI NH NI HD NI NH NH HD NG NH(配列番号409)、
    GAGGCATTCTTATCG(配列番号78)及びNH NI NH NH HD NI NG NG HD NG NG NI NG HD NH(配列番号410)、
    GCCTGGAAACGTTCC(配列番号79)及びNN HD HD NG NN NN NI NI NI HD NN NG NG HD HD(配列番号411)、
    GTGCTCTGACAATA(配列番号80)及びNN NG NN HD NG HD NG NN NI HD NI NI NG NI(配列番号412)、
    GTTTTGCAGCCTCC(配列番号81)及びNN NG NG NG NG NN HD NI NN HD HD NG HD HD(配列番号413)、
    ACAGCTGTGGAACGT(配列番号82)及びNI HD NI NN HD NG NN NG NN NN NI NI HD NN NG(配列番号414)、
    GGCTCTCTTCCTCCT(配列番号83)及びHD NI NI NN NI HD HD NN NI NN HD NI HD NG NN HD NG NN(配列番号415)、
    CTATCCCAAAACTCT(配列番号84)及びHD NG NI NG HD HD HD NI NI NI NI HD NG HD NG(配列番号416)、
    GAAAAACTATGTAT(配列番号85)及びNH NI NI NI NI NI HD NG NI NG NH NG NI NG(配列番号417)、
    AGGCAGGCTGGTTGA(配列番号86)及びNI NH NH HD NI NH NH HD NG NH NH NG NG NH NI(配列番号418)、
    CAATACAACCACGC(配列番号87)及びHD NI NI NG NI HD NI NI HD HD NI HD NN HD(配列番号419)、
    ATGACGGACTCAACT(配列番号88)及びNI NG NN NI HD NN NN NI HD NG HD NI NI HD NG(配列番号420)、ならびに
    CACAACATTTGTAA(配列番号89)及びHD NI HD NI NI HD NI NG NG NG NN NG NI NI(配列番号421)から選択される、請求項73~94のいずれか1項に記載の組成物。
  96. 前記GSHSが、前記TAジヌクレオチド部位またはTTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位の約25、または約50、または約100、または約150、または約200、または約300、または約500ヌクレオチド内にある、請求項73~94のいずれか1項に記載の組成物。
  97. 前記酵素が、TAジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項73~96のいずれか1項に記載の組成物。
  98. 前記酵素が、TTAA(配列番号1)テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項73~96のいずれか1項に記載の組成物。
  99. 前記転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸が、インテイン、任意選択でNpuN(Intein-N)(配列番号423)及び/またはNpuC(Intein-C)(配列番号424)、またはそのバリアントを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
  100. 前記核酸が、前記酵素を、第1及び第2の部分の形態で、前記インテインが前記第1及び第2の部分の間でコードされるようにコードし、前記酵素からの前記インテインの翻訳後切除時に前記第1及び第2の部分が機能的酵素に融合されるようになる、請求項99に記載の組成物。
  101. 前記酵素が、リコンビナーゼである、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
  102. 前記リコンビナーゼが、インテグラーゼまたはトランスポザーゼである、請求項101に記載の組成物。
  103. 前記インテグラーゼが、トランスポザーゼである、請求項102に記載の組成物。
  104. 前記トランスポザーゼが、超活性を付与する1つ以上の変異を有する、請求項103に記載の組成物。
  105. 前記トランスポザーゼが、哺乳類由来のトランスポザーゼ、任意選択でヘルパーRNAトランスポザーゼである、請求項104に記載の組成物。
  106. 前記トランスポザーゼが、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスに由来する、請求項102~105のいずれか1項に記載の組成物。
  107. 前記トランスポザーゼが、Bombyx mori、Xenopus tropicalis、Trichoplusia ni、Myotis lucifugus、Rhinolophus ferrumequinum、Rousettus aegyptiacus、Phyllostomus discolor、Myotis myotis、Pteropus vampyrus、Pipistrellus kuhlii、Pan troglodytes、Molossus molossus、またはホモ・サピエンスに由来するトランスポザーゼ酵素の超活性形態を含むがこれらに限定されない、操作されたバージョンである、請求項101~106のいずれか1項に記載の組成物。
  108. 前記酵素が、単量体または二量体形態である、請求項73~107のいずれか1項に記載の組成物。
  109. 前記酵素が、遺伝子切断(Exc+)及び/または遺伝子組み込み(Int+)、または組み込みの欠如(Int-)活性を有する、請求項73~108のいずれか1項に記載の組成物。
  110. 前記トランスポザーゼ酵素が、Myotis lucifugus(MLT)トランスポザーゼである、請求項101~109のいずれか1項に記載の組成物。
  111. 野生型MLTトランスポザーゼが、
    ATGTCGCAACACTCAGATTACTCCGACGATGAATTTTGTGCTGACAAACTGTCCAATTATTCATGCGATAGCGACCTCGAAAACGCTTCCACGTCTGATGAAGATAGCAGCGATGATGAAGTAATGGTGAGGCCTCGCACCCTCCGCCGTCGCCGCATCAGCTCTTCGAGCTCTGATTCTGAATCCGATATTGAGGGTGGCCGCGAGGAGTGGTCCCACGTAGACAATCCGCCGGTGCTGGAGGACTTCCTAGGCCACCAAGGTCTGAACACTGACGCAGTAATCAACAATATCGAAGATGCAGTTAAACTGTTTATCGGTGACGATTTCTTCGAGTTTCTGGTGGAGGAATCTAACCGGTACTATAACCAGAATCGTAATAACTTCAAGCTCTCTAAAAAGTCTCTGAAGTGGAAGGACATCACCCCTCAGGAGATGAAAAAGTTCCTCGGTCTGATCGTTCTGATGGGCCAAGTTCGCAAGGATCGTCGTGACGACTATTGGACTACCGAACCGTGGACGGAAACTCCATACTTTGGCAAGACCATGACTCGTGACCGTTTCCGTCAGATCTGGAAGGCCTGGCACTTCAATAACAACGCTGACATTGTCAACGAGTCTGATCGTCTGTGTAAGGTTCGCCCTGTGCTGGATTACTTCGTTCCAAAATTCATTAACATTTACAAACCACATCAGCAGCTGTCCCTGGATGAGGGCATCGTGCCGTGGCGCGGCCGCCTGTTCTTCCGTGTCTATAATGCTGGCAAGATTGTGAAGTACGGTATCCTGGTTCGCCTGCTGTGCGAAAGCGACACTGGCTACATCTGTAACATGGAGATCTACTGCGGCGAGGGCAAACGTCTCCTCGAAACTATCCAGACCGTCGTGTCTCCATACACGGATTCCTGGTATCATATTTACATGGATAACTATTATAACAGCGTGGCTAACTGTGAAGCTCTGATGAAAAATAAGTTCCGTATTTGCGGTACTATCCGTAAGAATCGTGGAATTCCGAAAGATTTCCAGACCATCTCCCTGAAAAAGGGTGAAACTAAGTTCATTCGCAAAAACGACATCCTCCTGCAAGTCTGGCAGTCTAAAAAGCCTGTATATCTGATCTCATCTATTCACAGCGCTGAAATGGAAGAATCTCAGAACATTGATCGCACCTCCAAGAAAAAGATCGTCAAACCGAATGCATTGATTGATTACAACAAGCACATGAAGGGCGTTGATCGTGCTGACCAGTACCTGTCTTATTACTCTATCCTGCGCCGTACTGTGAAGTGGACTAAACGTCTCGCTATGTACATGATTAATTGTGCGCTGTTCAATTCTTACGCTGTGTATAAAAGCGTGCGTCAGCGCAAAATGGGCTTTAAAATGTTCCTGAAGCAGACGGCTATTCACTGGCTGACCGACGATATTCCGGAAGATATGGACATTGTCCCGGATCTCCAGCCGGTACCGAGCACCAGCGGTATGCGTGCTAAACCTCCGACTAGTGATCCGCCTTGCCGTCTGTCTATGGATATGCGTAAGCATACCCTGCAGGCAATTGTGGGCTCTGGCAAAAAGAAAAATATCCTGCGTCGTTGCCGCGTATGCTCTGTACACAAACTGCGTTCTGAGACTCGTTATATGTGTAAATTTTGCAATATTCCACTCCACAAGGGTGCGTGCTTCGAGAAGTACCATACGCTGAAGAACTAT(配列番号5)のヌクレオチド配列、
    またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項110に記載の組成物。
  112. 前記野生型MLTトランスポザーゼが、
    MSQHSDYSDDEFCADKLSNYSCDSDLENASTSDEDSSDDEVMVRPRTLRRRRISSSSSDSESDIEGGREEWSHVDNPPVLEDFLGHQGLNTDAVINNIEDAVKLFIGDDFFEFLVEESNRYYNQNRNNFKLSKKSLKWKDITPQEMKKFLGLIVLMGQVRKDRRDDYWTTEPWTETPYFGKTMTRDRFRQIWKAWHFNNNADIVNESDRLCKVRPVLDYFVPKFINIYKPHQQLSLDEGIVPWRGRLFFRVYNAGKIVKYGILVRLLCESDTGYICNMEIYCGEGKRLLETIQTVVSPYTDSWYHIYMDNYYNSVANCEALMKNKFRICGTIRKNRGIPKDFQTISLKKGETKFIRKNDILLQVWQSKKPVYLISSIHSAEMEESQNIDRTSKKKIVKPNALIDYNKHMKGVDRADQYLSYYSILRRTVKWTKRLAMYMINCALFNSYAVYKSVRQRKMGFKMFLKQTAIHWLTDDIPEDMDIVPDLQPVPSTSGMRAKPPTSDPPCRLSMDMRKHTLQAIVGSGKKKNILRRCRVCSVHKLRSETRYMCKFCNIPLHKGACFEKYHTLKNY(配列番号4)のアミノ酸配列、
    またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項111に記載の組成物。
  113. 前記MLTトランスポザーゼが、
    ATGGCCCAGCACAGCGACTACAGCGACGACGAGTTCTGTGCCGATAAGCTGAGTAACTACAGCTGCGACAGCGACCTGGAAAACGCCAGCACATCCGACGAGGACAGCTCTGACGACGAGGTGATGGTGCGGCCCAGAACCCTGAGACGGAGAAGAATCAGCAGCTCTAGCAGCGACTCTGAATCCGACATCGAGGGCGGCCGGGAAGAGTGGAGCCACGTGGACAACCCTCCTGTTCTGGAAGATTTTCTGGGCCATCAGGGCCTGAACACCGACGCCGTGATCAACAACATCGAGGATGCCGTGAAGCTGTTCATAGGAGATGATTTCTTTGAGTTCCTGGTCGAGGAATCCAACCGCTATTACAACCAGAATAGAAACAACTTCAAGCTGAGCAAGAAAAGCCTGAAGTGGAAGGACATCACCCCTCAGGAGATGAAAAAGTTCCTGGGACTGATCGTTCTGATGGGACAGGTGCGGAAGGACAGAAGGGATGATTACTGGACAACCGAACCTTGGACCGAGACCCCTTACTTTGGCAAGACCATGACCAGAGACAGATTCAGACAGATCTGGAAAGCCTGGCACTTCAACAACAATGCTGATATCGTGAACGAGTCTGATAGACTGTGTAAAGTGCGGCCAGTGTTGGATTACTTCGTGCCTAAGTTCATCAACATCTATAAGCCTCACCAGCAGCTGAGCCTGGATGAAGGCATCGTGCCCTGGCGGGGCAGACTGTTCTTCAGAGTGTACAATGCTGGCAAGATCGTCAAATACGGCATCCTGGTGCGCCTTCTGTGCGAGAGCGATACAGGCTACATCTGTAATATGGAAATCTACTGCGGCGAGGGCAAAAGACTGCTGGAAACCATCCAGACCGTCGTTTCCCCTTATACCGACAGCTGGTACCACATCTACATGGACAACTACTACAATTCTGTGGCCAACTGCGAGGCCCTGATGAAGAACAAGTTTAGAATCTGCGGCACAATCAGAAAAAACAGAGGCATCCCTAAGGACTTCCAGACCATCTCTCTGAAGAAGGGCGAAACCAAGTTCATCAGAAAGAACGACATCCTGCTCCAAGTGTGGCAGTCCAAGAAACCCGTGTACCTGATCAGCAGCATCCATAGCGCCGAGATGGAAGAAAGCCAGAACATCGACAGAACAAGCAAGAAGAAGATCGTGAAGCCCAATGCTCTGATCGACTACAACAAGCACATGAAAGGCGTGGACCGGGCCGACCAGTACCTGTCTTATTACTCTATCCTGAGAAGAACAGTGAAATGGACCAAGAGACTGGCCATGTACATGATCAATTGCGCCCTGTTCAACAGCTACGCCGTGTACAAGTCCGTGCGACAAAGAAAAATGGGATTCAAGATGTTCCTGAAGCAGACAGCCATCCACTGGCTGACAGACGACATTCCTGAGGACATGGACATTGTGCCAGATCTGCAACCTGTGCCCAGCACCTCTGGTATGAGAGCTAAGCCTCCCACCAGCGATCCTCCATGTAGACTGAGCATGGACATGCGGAAGCACACCCTGCAGGCCATCGTCGGCAGCGGCAAGAAGAAGAACATCCTTAGACGGTGCAGGGTGTGCAGCGTGCACAAGCTGCGGAGCGAGACTCGGTACATGTGCAAGTTTTGCAACATTCCCCTGCACAAGGGAGCCTGCTTCGAGAAGTACCACACCCTGAAGAATTACTAG(配列番号3)のヌクレオチド配列、
    またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項110に記載の組成物。
  114. 前記MLTトランスポザーゼが、
    MAQHSDYSDDEFCADKLSNYSCDSDLENASTSDEDSSDDEVMVRPRTLRRRRISSSSSDSESDIEGGREEWSHVDNPPVLEDFLGHQGLNTDAVINNIEDAVKLFIGDDFFEFLVEESNRYYNQNRNNFKLSKKSLKWKDITPQEMKKFLGLIVLMGQVRKDRRDDYWTTEPWTETPYFGKTMTRDRFRQIWKAWHFNNNADIVNESDRLCKVRPVLDYFVPKFINIYKPHQQLSLDEGIVPWRGRLFFRVYNAGKIVKYGILVRLLCESDTGYICNMEIYCGEGKRLLETIQTVVSPYTDSWYHIYMDNYYNSVANCEALMKNKFRICGTIRKNRGIPKDFQTISLKKGETKFIRKNDILLQVWQSKKPVYLISSIHSAEMEESQNIDRTSKKKIVKPNALIDYNKHMKGVDRADQYLSYYSILRRTVKWTKRLAMYMINCALFNSYAVYKSVRQRKMGFKMFLKQTAIHWLTDDIPEDMDIVPDLQPVPSTSGMRAKPPTSDPPCRLSMDMRKHTLQAIVGSGKKKNILRRCRVCSVHKLRSETRYMCKFCNIPLHKGACFEKYHTLKNY(配列番号2)のアミノ酸配列、
    またはそれに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項113に記載の組成物。
  115. 前記MLTトランスポザーゼが、超活性を付与する1つ以上の変異を有する、請求項110~114のいずれか1項に記載の組成物。
  116. 前記MLTトランスポザーゼが、配列番号2の前記アミノ酸配列に対してS8P、C13R、及びN125K変異のうちの少なくとも1つに対応する位置に変異を有するアミノ酸配列を有する、請求項115に記載の組成物。
  117. 前記MLTトランスポザーゼが、配列番号2の前記アミノ酸配列に対してN125K変異に対応する位置に変異を有する配列番号7のアミノ酸配列を有するか、または前記MLTトランスポザーゼが、配列番号2の前記アミノ酸配列に対してS8P及びC13R変異に対応する位置に変異を有する配列番号9のアミノ酸配列を有する、請求項115に記載の組成物。
  118. 前記MLTトランスポザーゼが、
    配列番号2のS2位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記置換が、任意選択でG、A、V、L、I、任意選択でS2Aから選択される非極性脂肪族アミノ酸であり、及び/または前記酵素が、前記C末端に追加の残基を有しないか、もしくは
    L573X、E574X、及びS2Xに対応する位置に1つ以上の変異を有し、Xが、任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でXが、A、G、または欠失であり、任意選択で前記変異が、L573del、E574del、及びS2Aである、請求項110または114に記載の組成物。
  119. 前記トランスポザーゼ酵素がTrichoplusia ni、Myotis lucifugus、Myotis、またはPteropus vampyrusに由来し、任意選択で図7の配列を有する、請求項101~103のいずれか1項に記載の組成物。
  120. 前記MLTトランスポザーゼが、図5Aもしくは図5Bから選択される超活性変異、例えば、図5Aもしくは図5Bから選択される約1つ、もしくは約2つ、もしくは約3つ、もしくは約4つ、もしくは約5つの超活性変異、またはそれらの組み合わせを含む、請求項110~119のいずれか1項に記載の組成物。
  121. 前記リンカーが、可撓性リンカーである、請求項73~120のいずれか1項に記載の組成物。
  122. 前記可撓性リンカーが、実質的に、グリシン及びセリン残基からなり、任意選択で前記可撓性リンカーが、(GlySer)を含み、nが、約1~約12である、請求項121に記載の組成物。
  123. 前記可撓性リンカーが、約20、または約30、または約40、または約50、または約60アミノ酸残基である、請求項121に記載の組成物。
  124. 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項73~123のいずれか1項に記載の組成物。
  125. 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子を含む、請求項73~123のいずれか1項に記載の組成物。
  126. 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号21及び22から選択される、1つ以上の逆位末端もしくは末端配列、またはそれらに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列に隣接している、請求項73~125のいずれか1項に記載の組成物。
  127. 請求項73~126のいずれか1項に記載のキメラ酵素をコードする、核酸。
  128. 前記核酸が、DNAである、請求項127に記載の核酸。
  129. 前記核酸が、RNAである、請求項127に記載の核酸。
  130. 前記キメラ酵素が、ベクターに組み込まれている、請求項127~129のいずれか1項に記載の核酸。
  131. 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項130に記載の核酸。
  132. 請求項127~131のいずれか1項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  133. 前記組成物が、脂質ナノ粒子(LNP)の形態である、請求項73~126のいずれか1項に記載の組成物、または請求項81~85のいずれか1項に記載の核酸。
  134. 前記酵素をコードする核酸及び前記トランスポゾンをコードする核酸が、同じ脂質ナノ粒子(LNP)の形態であり、任意選択で、前記酵素をコードする前記核酸及び前記トランスポゾンをコードする前記核酸を含む混合物の形態である、請求項73~133のいずれか1項に記載の組成物。
  135. 前記LNPが、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、ジメチルアミノエタン-カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体(DC-Chol)、ホスファチジルコリン(PC)、トリオレイン(グリセリルトリオレエート)、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000(DMG-PEG 2K)、及び1,2-ジステアロール-sn-グリセロール-3ホスホコリン(DSPC)から選択される1つ以上の脂質を含み、及び/またはポリエチレンイミン(PEI)及びポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、及びN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)から選択される1つ以上の分子を含む、請求項133または134に記載の組成物または核酸。
  136. 細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法であって、細胞を、請求項73~135のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
  137. 前記細胞が、請求項73~135のいずれか1項に記載のキメラ酵素をコードする核酸と接触される、請求項89に記載の方法。
  138. 前記細胞が、請求項73~135のいずれか1項に記載のキメラ酵素をコードするRNAと接触される、請求項90に記載の方法。
  139. 前記細胞を、トランスポゾンを含む構築物と接触させることをさらに含む、請求項138に記載の方法。
  140. 前記細胞が、請求項73~131のいずれか1項に記載のキメラトランスポザーゼをコードする核酸と接触される、請求項114に記載の方法。
  141. 前記細胞が、請求項73~131のいずれか1項に記載のキメラ酵素をコードするDNAと接触される、請求項136に記載の方法。
  142. 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号21及び22から選択される、1つ以上の逆位末端もしくは末端配列、またはそれらに対して少なくとも約90%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列に隣接している、請求項136~141のいずれか1項に記載の方法。
  143. 前記トランスポゾンが、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項136~142のいずれか1項に記載の方法。
  144. 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項136~143のいずれか1項に記載の方法。
  145. 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子である、請求項136~143のいずれか1項に記載の方法。
  146. 前記トランスポゾンが、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4遺伝子(ABC)トランスポーター遺伝子(ABCA4)、またはその機能的断片である、請求項136~145のいずれか1項に記載の方法。
  147. 前記トランスポゾンが、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子(VLDLR)もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子(LDLR)またはその機能的断片である、請求項136~145のいずれか1項に記載の方法。
  148. 前記方法が、インビボである、請求項136~147のいずれか1項に記載の方法。
  149. 前記方法が、エクスビボである、請求項136~147のいずれか1項に記載の方法。
  150. 前記方法が、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する、請求項136~149のいずれか1項に記載の方法。
  151. 前記方法が、遺伝性または後天性疾患の治療を必要とする患者においてそれを行うために使用される、請求項136~149のいずれか1項に記載の方法。
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