JP2023525007A - 転位に基づく療法 - Google Patents
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Abstract
標的転位のために新規のトランスポザーゼ及び／またはキメラトランスポザーゼを利用する、遺伝子療法組成物及び方法が提供される。【選択図】図１７Ａ
Description
本発明は、部分的には、ヒトゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）を標的とするための、転位可能な酵素（例えば、操作されたトランスポザーゼ及び／またはキメラトランスポザーゼ）ならびにトランスポゾンを使用する二重系に関する。
優先権
本出願は、２０２０年５月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１９，７０９号、２０２０年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０２７，５６１号、２０２０年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０５８，２００号、及び２０２１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１７５，３４５号の優先権及び利益を主張し、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１９，７０９号、２０２０年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０２７，５６１号、２０２０年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０５８，２００号、及び２０２１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１７５，３４５号の優先権及び利益を主張し、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書とともに電子的に提出されるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表を含む。２０２１年５月３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で１８２，９９０バイトのサイズである。この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書とともに電子的に提出されるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表を含む。２０２１年５月３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＡＬ－００３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で１８２，９９０バイトのサイズである。この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒト遺伝子療法は、遺伝性及び後天性疾患を含む様々な疾患及び状態を治療及び緩和するための遺伝子を提供する、有望なアプローチである。遺伝子療法は、（疾患を引き起こす）変異遺伝子を遺伝子の健全なコピーで置換もしくは補完すること、不適切に機能している変異遺伝子（もしくは任意の他の遺伝子）を不活性化もしくはサイレンシングすること、または染色体に新しい遺伝子を導入することを含む。遺伝子を宿主ゲノムに安全かつ効率的に組み込む能力は、ヒトにおける遺伝子療法の成功に不可欠である。
現在、遺伝子療法試験における遺伝子の永続的または一過性の導入のために最も一般的に使用されるベクターは、ウイルスベースである。ウイルスベクターを使用して高効率で安定したゲノムの組み込みを達成することは可能であるが、複数の研究が深刻な欠点及び安全性の懸念を示している。したがって、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、投与または再投与を制限する宿主ヒト応答を誘発することが示されており、一方でレトロウイルス／レンチウイルスは、優先的にユークロマチンに導入遺伝子を組み込み、それによって挿入変異誘発または発がんのリスクを増加させる。ウイルス系はまた、カーゴサイズが制限され、導入遺伝子及びそれらの調節エレメントのサイズ及び数が制限される。ウイルスベクター－宿主相互作用は、免疫原性を含み得、宿主ゲノム内のウイルスベクターＤＮＡの組み込みは、遺伝毒性効果を有し得る。また、ＡＡＶゲノムは、主に感染細胞の核内にエピソーム形態で存在するため、細胞増殖（例えば、肝臓成長または他の臓器成長など）の条件では失われ、治療有効性が制限される可能性がある。したがって、病原性、高価な生成、及び全身の不安定性などのウイルスベクターの制限は、ウイルスベースの系の使用に対する主要な障害であることが証明されている。実際、ウイルスベースのベクターの再投与は、生命を脅かす全身効果をもたらし得る免疫応答を促進し、遺伝子導入の有効性を制限し得る。Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４：４６８６－９１、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９９；７３：８５４９－５８を参照されたい。
非ウイルスベクター（すなわち、脂質ベース、ポリマーベース、脂質－ポリマーベース、及びポリ－リジン）は、トランスジェニックＤＮＡまたはＲＮＡを、細胞標的に到達するまでカプセル化するための合成ツールである。ウイルスベクターと比較して、非ウイルスベクターは、一般に、調製が安全であり、病原性及び免疫学的合併症のリスクが低減される。非ウイルスベクターは、標的療法のために非ウイルスベクターの表面を修飾することによって設計されている。例えば、Ｌｅｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００２；７８：２３５－４７を参照されたい。
ヌクレアーゼはまた、非ウイルス性ヒト遺伝子療法における使用についても評価されている。クラスター化され、規則的な間隔の空いた短い回文配列の反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘発する。ＤＳＢは、特定の配列で導入遺伝子を挿入するために相同組換えを強化するが、未知の遠隔部位でのオフターゲットＤＮＡ切断は、検出のために複雑な遺伝毒性スクリーニングを必要とする不用意な変異を引き起こす。ＣＲＩＳＰＲ系は、ユーザ定義のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成したＣａｓ９を使用して、相補的配列を認識し、切断する。ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲはともに、宿主相同性指向修復を使用して、所望の配列に同時送達ドナーテンプレートを導入する。ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲアプローチは、効率的な遺伝子導入を示すが、それらの細胞毒性及び遺伝毒性効果に関する懸念は、依然として臨床用途にとって重大な障害である。さらに、相同性指向修復を使用した遺伝子付加には複製が必要であるため、ヌクレアーゼ技術は分裂組織に限定される（すなわち、中枢神経系などの非分裂組織においては効果的ではない）。プライム編集及び塩基対編集などの他の遺伝子編集技法は、塩基対または小さなヌクレオチド伸長を補正することに限定される。これらの特徴は、この技術のインビボ及びエクスビボの適用を、単一の一般の病原性ヌクレオチドバリアントを有する疾患に制限する。しかしながら、ほとんどの遺伝的障害は、１つ以上の遺伝子に数百またはさらには数千の病原性ヌクレオチドバリアントを有する。
リコンビナーゼは、トランスポゾンの末端で特定の配列を認識して結合し、末端間のシナプス相互作用を媒介してそれらを一緒にし、標的ＤＮＡと相互作用し、ＤＮＡ破断及び組換えの基礎となる接合反応を行なう。インテグラーゼは、（例えば、ウイルスの）ＤＮＡを別のＤＮＡ片、通常は宿主染色体に組み込むことができるリコンビナーゼ酵素である。
ＤＮＡトランスポゾンは、「カット・アンド・ペースト」機序を使用する可動エレメントである。ＤＮＡは、ドナー分子からの二本鎖切断によって切除され、アクセプター分子に組み込まれる。トランスポゾンは、トランスポゾンの末端に結合し、宿主内の特定のゲノム位置へのその移動を触媒する酵素であるトランスポザーゼの存在下で、ＤＮＡ上の１つの位置からＤＮＡ上の第２の位置へと移動する。
トランスポザーゼに基づく遺伝子療法における主な懸念は、ほとんどが既知の配列（例えば、ＴＴＡＡ（配列番号１）配列）、がん遺伝子を活性化するか、腫瘍抑制遺伝子を中断するか、または正常遺伝子の転写を妨害する遺伝子座の近くまたは内部での、ランダムな組み込みによる挿入突然変異誘発である。したがって、非ウイルス、トランスポゾン遺伝子療法アプローチは、遺伝的障害を有する個体を治療するための大きな可能性を有するが、課題は、ランダム挿入のリスクを低減することである。
したがって、挿入変異誘発及び発がんのリスクを低減するために、例えば、トランスポザーゼなどの転位が可能な酵素の安全性を向上させる臨床的必要性がある。
したがって、本発明は、部分的に、療法において特に使用されるが、既存のトランスポザーゼの制限を回避する新規のトランスポザーゼ組成物を提供する。
態様では、遺伝子両方での使用に好適な哺乳類トランスポザーゼ、及び有利には耐久性のある大きなペイロード（例えば、トランスポゾン）を用いた遺伝子療法が提供される。態様では、哺乳類トランスポザーゼは、Ｎ末端アミノ酸置換及びＣ末端アミノ酸欠失を有するように設計されたＭｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴトランスポザーゼ）の操作されたバージョンである。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、例えば、配列番号２のＳ８、Ｃ１３、及び／またはＮ１２５位に対応する位置における活性を改善するためのアミノ酸置換を有するようにさらに操作される。
態様では、トランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）またはトランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む組成物が提供され、トランスポザーゼ酵素は、配列番号２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、トランスポザーゼ酵素は、配列番号２のＳ２位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
本発明は、図１Ａ～Ｄまたは図２に示されるような、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）ＤＢＤまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってプログラムされる不活性体（ｄＣａｓ９）（ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体と称される）などの、転位によるゲノム組み込みが可能なモノマーまたはヘッド・トゥ・テール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）型二量体酵素及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む遺伝子導入系または構築物を提供する。転位が可能な酵素（例えば、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼ）に融合されたＤＢＤを有するこれらのキメラ系は、トランスポザーゼがランダムな認識部位に結合するのを防止するように、トランスポザーゼ認識部位の近くの特定の配列［例えば、ＴＡＬＥ反復可変二残基（ＲＶＤ）またはｇＲＮＡ］への酵素の結合を指向する。いくつかの実施形態では、遺伝子導入系の酵素（例えば、トランスポザーゼ）は、ヒトゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）に結合する。本明細書に記載のＴＡＬＥは、酵素をＧＳＨＳに物理的に隔離し、ＲＶＤ ＴＡＬＥヌクレオチド配列に近接した近傍のＴＴＡＡ（配列番号１）配列への転位を促進することができる。オープンクロマチン部位におけるＧＳＨＳは、トランスポザーゼがオープンクロマチンに挿入する傾向に基づいて特異的に標的とされる。加えて、ｄＣａｓ９（すなわち、ヌクレアーゼ活性が欠損している）は、ＧＳＨＳ内の所望のＤＮＡ配列で結合するように指向されるｇＲＮＡでプログラムされる。
いくつかの態様では、（ａ）ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤ、（ｂ）転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素、核酸分子におけるＧＳＨＳ配列中のＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な酵素、及び（ｃ）ＴＡＬＥまたはＣａｓ／ｇＲＮＡ ＤＢＤと酵素とを接続するリンカーを含む、転位可能な酵素を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、酵素、例えば、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ酵素は、二量体形態（例えば、ヘッド・トゥ・テール型二量体）である。いくつかの実施形態では、酵素は、四量体形態または別の多量体形態である。いくつかの実施形態では、酵素は、単量体形態である。
いくつかの実施形態では、組成物は、生体細胞と接触したときにＧＳＨＳ内のトランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である。ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、トランスポザーゼ酵素をＧＳＨＳ配列に指向するのに好適であり得る。実施形態では、組成物は、ｄＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体、（ｂ）転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素（当該酵素は、核酸分子内のＧＳＨＳ配列内のＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能である）、及び（ｃ）ｄＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体と酵素とを接続するリンカーを含む、転位が可能な酵素を含む組成物が提供される。
実施形態では、ＧＳＨＳは、染色体におけるオープンクロマチン位置にある。いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、アデノ関連ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体、及びヒトＲｏｓａ２６遺伝子座から選択される。いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ヒト染色体２、４、６、１０、１１、または１７上に位置する。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、図３及び図４に列挙される部位またはそれらのバリアント（例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を有する）から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、図３の配列またはそのバリアント（例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を有する）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ／ｇＲＮＡ ＤＢＤは、図４の配列またはそのバリアント（例えば、独立して、挿入、置換、または欠失から選択される、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を有する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位の約２５、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約３００、または約５００ヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位から５００ヌクレオチド超である。
実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、１つ以上の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤまたは反復可変二残基（ＲＶＤ）は、約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１８．５個のアミノ酸反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、３３または３４アミノ酸を含むＴＡＬＥアミノ酸反復配列内に含まれる。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列のうちの１つ以上は、３３または３４アミノ酸の残基１２または１３にＲＶＤを含む。ＲＶＤは、標的ＤＮＡのある特定の塩基対（複数可）または残基（複数可）を認識することができる。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の１つの塩基対を認識する。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｃ」残基を認識し、かつＲＶＤは、ＨＤ、Ｎ（ギャップ）、ＨＡ、ＮＤ、及びＨＩから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｇ」残基を認識し、かつＲＶＤは、ＮＮ、ＮＨ、ＮＫ、ＨＮ、及びＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ａ」残基を認識し、かつＲＶＤは、ＮＩ及びＮＳから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｔ」残基を認識し、かつＲＶＤは、ＮＧ、ＨＧ、Ｈ（ギャップ）、及びＩＧから選択される。実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素）は、ＴＡジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、ＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸は、インテインを含む。実施形態では、核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切除時に、第１及び第２の部分が機能的酵素に融合されるように、第１の部分と第２の部分との間にインテインがコードされている第１及び第２の部分の形態で酵素をコードする。
実施形態では、酵素は、リコンビナーゼまたはインテグラーゼである。実施形態では、リコンビナーゼは、インテグラーゼである。実施形態では、インテグラーゼは、トランスポザーゼであるか、またはリコンビナーゼは、トランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、超活性を付与する１つ以上の変異を有する。実施形態では、トランスポザーゼは、任意選択でヘルパーＲＮＡによってコードされる、哺乳動物由来トランスポザーゼである。
実施形態では、酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、またはＭｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓに由来する。実施形態では、酵素は、単量体、二量体、四量体（もしくは別の多量体）、超活性体であるか、またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、またはＭｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓに由来する非ＴＴＡＡ（配列番号１）認識部位（Ｉｎｔ－）との相互作用が低減している酵素を含むが、これに限定されない操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓランスポザーゼ（本明細書においてＭＬＴまたはＭＬＴトランスポザーゼと称される）であり、野生型、単量体、二量体、四量体（もしくは別の多量体）、超活性体、Ｉｎｔ－変異体、または任意の他のバリアントのいずれかであり得る。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼの超活性形態またはＩｎｔ－形態は、Ｌ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘから選択される１つ以上の変異を有し、Ｘは任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でＸは、Ａ、Ｇ、または欠失であり、任意選択で変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
実施形態では、補正され、操作されたＭＬＴトランスポザーゼと本明細書において称されるＭＬＴトランスポザーゼは、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ変異を有する。そのようなＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントによってコードされる。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号４のアミノ酸、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
実施形態では、超活性体、Ｉｎｔ－、または他の形態のＭＬＴトランスポザーゼは、図５Ａ及び５Ｂからの変異、例えば、限定されないが、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を含む。実施形態では、トランスポザーゼは、図５Ａ及び５Ｂに示される変異のうちのいずれか、またはそれらの同等物を含むことができる。
実施形態では、本開示の実施形態によるＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼに超活性を付与する１つ以上の超活性変異を含む。実施形態では、超活性変異体は、Ｓ８、Ｃ１３、及びＮ１２５に１つ以上の置換を含む。実施形態では、超活性変異は、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異のうちの１つ以上を含む。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異のうちの少なくとも１つに対応する位置に超活性変異を有するアミノ酸配列を有する。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、超活性Ｎ１２５Ｋ変異に対応する位置に変異を有する、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、超活性Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応する位置に変異を含む、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異のうちの少なくとも１つに対応する位置に超活性変異を有するアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、Ｎ１２５Ｋ変異を有しない２つの超活性変異（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ）を有し得るか、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、任意の他の変異（複数可）（例えば、図５Ａ及び５Ｂにおける変異のうちのいずれか１つ以上）を有し得ることを理解されたい。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異に対応する位置に超活性変異を含む、配列番号３４０のアミノ酸配列を有する。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスに由来する。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、またはＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓのうちのいずれかに由来する（図７を参照されたい）。トランスポザーゼは、図５Ａ及び５Ｂから選択される１つ以上の超活性及び／または組み込み欠損変異、またはそれらの同等物を有することができる。当業者は、図７を参照して、そのような変異体をＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、またはＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。また、当業者は、そのような変異体をＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスからのトランスポザーゼに対応させることができる。
いくつかの実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ）は、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓのうちのいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓのうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ）は、操作されたバージョンであり、単量体、二量体、四量体、超活性体であるか、またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、及びホモ・サピエンスのうちのいずれかに由来する、非ＴＴＡＡ（配列番号１）認識部位（Ｉｎｔ－）との相互作用が低減されているトランスポザーゼ酵素を含むが、これに限定されない。トランスポザーゼ酵素は、野生型、単量体、二量体、四量体、または別の多量体、超活性体、またはＩｎｔ－変異体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤと、転位によって標的ゲノム組み込みが可能な酵素とを接続するリンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、可撓性リンカーは、実質的に、グリシン及びセリン残基を含み、任意選択で、可撓性リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは、約１～約１２である。可撓性リンカーは、約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０アミノ酸残基であり得る。
本開示の実施形態による転位が可能な酵素を含む組成物は、１つ以上の非ウイルスベクターを含むことができる。また、酵素（例えば、キメラトランスポザーゼ）は、導入遺伝子を有するトランスポゾンと同じベクター（シス）または異なるベクター（トランス）上に配置することができる。したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子を包含するキメラトランスポザーゼ及びトランスポゾンは、それらが同じベクターに含まれるようにシス構成である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を包含するキメラトランスポザーゼ及びトランスポゾンは、それらが異なるベクターに含まれるようなトランス構成である。ベクターは、本開示による任意の非ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素（例えば、キメラトランスポザーゼ）をコードする核酸が提供される。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素（例えば、キメラトランスポザーゼ）をコードする核酸は、例えば、ヘルパーＲＮＡなどのＲＮＡである。実施形態では、キメラトランスポザーゼは、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
実施形態では、トランスポゾンをコードする核酸は、「ドナーＤＮＡ」と称されるＤＮＡである。実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素（例えば、キメラトランスポザーゼ）をコードする核酸は、ヘルパーＲＮＡである。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドに組み込まれる。実施形態では、ドナーＤＮＡは、プラスミドである。いくつかの態様では、本開示の実施形態による核酸を含む、宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物または核酸が提供され、組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である。
実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に含まれる。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じＬＮＰに組み込まれるか、またはそれと会合する混合物である。いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸は、同じＬＮＰに組み込まれるか、またはそれと会合する共製剤の形態である。
実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（グリセリルトリオレエート）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択され、及び／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、例えば、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１９；３０３：９１－１００に記載される通りであり得る。ＬＮＰは、構造脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、ＰＥＧコンジュゲート脂質（ＣＤＭ－ＰＥＧ）、カチオン性脂質（ＭＣ３）、コレステロール、及び標的リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、細胞を酵素（例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ）と接触させることを含む、細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法が提供される。この方法は、インビボまたはエクスビボ方法であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、酵素をコードする核酸（例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ）と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするＲＮＡ、及び／または例えば、ＨＳ４及びＤ４Ｚ４などの隣接絶縁体を有するトランスポゾンを含む構築物と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするＤＮＡと接触される。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上の逆位末端に隣接している。トランスポゾンは、組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４遺伝子（ＡＢＣ）トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＡ４）、またはその機能的断片である。別の例として、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片である。
実施形態では、酵素は、キメラトランスポザーゼなどのトランスポザーゼであり、方法は、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する。
実施形態では、方法は、遺伝性または後天性疾患を治療することを必要とする患者においてそれを行うために使用される。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、遺伝性黄斑変性（ＩＭＤ）（黄斑ジストロフィー（ＭＤ）とも称される）のクラス（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患（ＳＴＧＤ）、Ｂｅｓｔ病、Ｘ連鎖網膜剥離症、パターンジストロフィー、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー、及び常染色体優性ドルーゼンを含む）を治療及び／または軽減するために使用される。ＳＴＧＤは、ＳＴＧＤ１型（ＳＴＧＤ１）であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＧＤは、ＳＴＧＤ３型（ＳＴＧＤ３）またはＳＴＧＤ４型（ＳＴＧＤ４）疾患であり得る。ＩＭＤは、ＡＢＣＡ４、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１、ＢＥＳＴ１、及びＰＲＰＨ２のうちの１つ以上における１つ以上の変異を特徴とし得る。遺伝子療法は、本開示によるキメラトランスポザーゼによる補助を用いて、トランスポゾンベースのベクター系を使用して実施することができ、これらは、導入される遺伝子と同じベクター（シス）上に提供されるか、または異なるベクター（トランス）上に提供されるか、またはＲＮＡとして提供される。トランスポゾンは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）、またはその機能的断片を含むことができ、トランスポゾンベースのベクター系は、網膜特異的プロモーターの制御下で作動することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ホモ接合性ＦＨ（ＨｏＦＨ）もしくはヘテロ接合性ＦＨ（ＨｅＦＨ）などの家族性高コレステロール血症（ＦＨ）、または低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の上昇したレベルに関連する障害を治療及び／または軽減するために使用される。遺伝子療法は、本開示による酵素（例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ）による補助を用いて、トランスポゾンベースのベクター系を使用して実施することができ、これらは、導入される遺伝子と同じベクター（シス）上に提供されるか、または異なるベクター（トランス、例えば、ドナーＤＮＡ／ヘルパーＲＮＡ系）上に提供される。トランスポゾンは、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片を含み得る。トランスポゾンベースのベクター系は、肝臓特異的プロモーターの制御下で作動することができる。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＬＰ１プロモーターである。ＬＰ１プロモーターは、例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．１０７（７）（２００６）：２６５３－６１に記載されるように構築することができる、ヒトＬＰ１プロモーターであり得る。
本開示による方法を使用して、任意の他の遺伝性または後天性疾患を治療及び／または軽減することができることを理解されたい。
本発明の詳細を以下の添付の説明に記載する。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、例示的な方法及び材料がここで説明される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明は、部分的に、例えば、療法における使用を見出す遺伝子挿入が可能な操作されたトランスポザーゼ酵素の発見に基づいている。態様では、操作されたＭＬＴ酵素（時折、「操作された」、「補正された」、「本発明のＭＬＴ」、「ＭＬＴ１」、または「ＭＬＴ２」と称される）が提供される。
本発明は、部分的に、単量体または二量体としての転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素（例えば、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、もしくはトランスポザーゼ酵素）が、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡと融合され、それによって部位または遺伝子座特異的転位が可能なキメラ酵素を作製することができるという発見に基づいている。酵素（例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ）は、宿主ゲノム内のある特定の部位に対するＴＡＬＥ ＤＢＤの特異性を利用し、これにより、ＤＢＤを使用してゲノム内の任意の所望の位置を標的とすることが可能になる。このようにして、本開示によるキメラトランスポザーゼは、導入遺伝子の標的組み込みを達成することを可能にする。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、リコンビナーゼまたはインテグラーゼである。実施形態では、リコンビナーゼは、インテグラーゼである。実施形態では、インテグラーゼは、トランスポザーゼであるか、またはリコンビナーゼは、トランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、超活性を付与する１つ以上の変異を有する。実施形態では、トランスポザーゼは、哺乳動物由来トランスポザーゼ、任意選択でヘルパーＲＮＡトランスポザーゼである。したがって、遺伝子導入のための本組成物及び方法は、二重トランスポゾン／トランスポザーゼ系を利用する。転位性エレメントは、自然界に普遍的に見出される非ウイルス遺伝子送達ビヒクルである。トランスポゾンベースのベクターは、細胞における導入遺伝子構築物の安定したゲノム組み込み及び長期的な発現の能力を有する。一般に、二重トランスポゾン及びトランスポザーゼ系は、目的の導入遺伝子（複数可）を含むトランスポゾンＤＮＡが、反復配列部位におけるトランスポザーゼ酵素によって染色体ＤＮＡに組み込まれるカット・アンド・ペースト機序を介して作用する。二重トランスポゾン／トランスポザーゼ（または「ドナー／ヘルパー」）プラスミド系は、ヒトゲノムにＤＮＡフットプリントを残すことなく、ＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位などの逆位末端（「末端」）に隣接する導入遺伝子を挿入する。トランスポザーゼ酵素は、（トランスポゾンをコードするベクターと同じまたは異なるベクター上で）一過性に発現され、ドナープラスミドから宿主ゲノムへの挿入イベントを触媒する。ゲノム挿入は、主にイントロンを標的とするが、他のＴＴＡＡ（配列番号１）部位を標的とし、ヒト遺伝子のおよそ５０％に組み込まれ得る。
遺伝子療法のためのトランスポゾン系の選択は、系の組み込み部位の好みに依存する。例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、主にイントロンを標的とする挿入で、転写単位を選好する。いくつかのトランスポザーゼは、ＤＮＡ酵素複合体が宿主ＤＮＡの近傍にもたらされても、触媒活性のために宿主ＤＮＡ内のある特定の部位を必要とする。例えば、Ｔｃｌ／マリナートランスポゾンは、ＴＡジヌクレオチドに組み込まれ（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１；９８：６７５９－６４）、かつｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、ＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチドに組み込まれる（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ２００８；２７：１０９７－１０９）。ヌクレアーゼベースの技法よりもトランスポザーゼベースのゲノム標的を使用する利点は、トランスポゾン挿入のコピー数をアッセイすること（例えば、（ｎｒ）ＬＡＭ－ＰＣＲ）によって、カット・アンド・ペースト機序を介した組み込みが容易に識別されることである。したがって、単一の挿入クローンが、追加のＤＮＡ修飾を有すると予想されない。比較すると、標的可能なヌクレアーゼは、識別可能な挿入物を導入することなくゲノムを変異させることが可能である。したがって、修飾細胞のＤＮＡ完全性を確認することは困難であり得る。オフターゲットヌクレアーゼ変異を識別するためのゲノムスクリーニングは複雑であり、配列包括度が制限される。
上述のように、ウイルス（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルスなど）及びヌクレアーゼベースの（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、プライム編集塩基編集）遺伝子療法は、典型的には、変異誘発リスクによって制限され、また、免疫原性、製造コスト、カーゴサイズ、及び可逆性などの欠点を有する。トランスポゾンは、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスよりもプロトがん遺伝子を活性化する可能性が低いが、導入遺伝子が意図した位置以外の宿主ゲノムの１つ以上の位置に挿入されると、挿入変異誘発を引き起こす。特に、ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位などのトランスポザーゼによって認識されるゲノム部位は、導入遺伝子がゲノム内の意図しない位置に挿入され、宿主に破壊的、しばしば重度の影響を与えることができるような、ゲノム内の複数の位置に見出すことができる。例えば、挿入変異誘発は、代謝遺伝子の機能に影響を及ぼし得る。したがって、安全かつ効率的な遺伝子療法ツールとしての二重トランスポゾン／トランスポザーゼ系の機能を改善するために、トランスポザーゼの結合及び挿入の特異性を増加させ、制御することが所望される。
したがって、いくつかの態様では、（ａ）ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体、（ｂ）転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素であって、核酸分子におけるＧＳＨＳ中のＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な酵素、及び（ｃ）ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体と酵素とを接続するリンカーを含む、転位が可能な酵素を含む組成物が提供される。実施形態では、酵素（例えば、トランスポザーゼ酵素）は、ヘッド・トゥ・テール二量体である。いくつかの実施形態では、酵素は、四量体である。いくつかの実施形態では、酵素は、モノマーである。
実施形態では、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤは、転位が可能な酵素（例えば、限定されないが、キメラトランスポザーゼ）を、ヒトＧＳＨＳに特異的に結合させる。実施形態では、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤは、トランスポザーゼをＧＳＨＳに隔離し、反復可変二残基（ＲＶＤ）ＴＡＬＥまたはｇＲＮＡヌクレオチド配列に近接して位置し得る、近傍のＴＡジヌクレオチドまたはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位への転位を促進する。ＧＳＨＳ領域は、トランスポザーゼ活性の影響を受けやすいオープンクロマチン部位に位置する。したがって、トランスポザーゼは、ＴＡまたはＴＴＡＡ（配列番号１）部位を認識するその能力に基づいて作動するだけでなく、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤに近接する特定の位置に（導入遺伝子を有する）トランスポゾンを指向する。本開示の実施形態によるキメラトランスポザーゼは、遺伝毒性のリスクが極めて低く、既存の遺伝子療法と比較して優れた特徴を示す。
実施形態では、例えば、ｄＣａｓ９と会合するｇＲＮＡは、ＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号４２５）及び／またはＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣ（配列番号４２６）である。実施形態では、例えば、ｄＣａｓ９と会合するｇＲＮＡは、ＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号４２７）及び／またはＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号４２８）である。
いくつかの実施形態では、キメラトランスポザーゼは、オフターゲット配列の結合が低減または阻害されることを特徴とし、その結果、転位のために、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤなど、それに融合したＤＢＤに依存するように変異される。
記載される組成物及び方法は、変異原性リスクを増加させるランダムなベクター及び導入遺伝子の挿入を低減させることを可能にする。記載される組成物及び方法は、ウイルス及びヌクレアーゼ媒介遺伝子療法と比較して遺伝毒性を低減するトランスポゾーム系を利用する。二重系は、活性トランスポザーゼの持続を回避し、著しい細胞毒性を伴わずにヒト細胞株を効率的にトランスフェクトするように設計されている。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＧＳＨＳを含む細胞と接触したときにＧＳＨＳ中のトランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤは、トランスポザーゼ酵素をＧＳＨＳ配列に指向するのに好適であり得る。
実施形態では、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤは、カスタマイズ可能であり、ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤなどは、特定のゲノム位置を標的とするために選択することができる。いくつかの実施形態では、ゲノム位置は、ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位に近接している。
実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的な間隔の空いた短い回文配列の反復）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）またはそのバリアントが、酵素を目的の遺伝子座に標的する。Ｃａｓ９は、一般ヌクレアーゼであり、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、目的のゲノム領域に同一の相補配列を担持することによって、Ｃａｓ９に配列特異性を付与する。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツールは、ＤＮＡ切断のためのＣａｓ９ヌクレアーゼ、及び標的特異性のための単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のみを必要とする。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，６０９１－６１０５を参照されたい。ヌクレアーゼ欠損（または不活性、もしくは「触媒的に死んだ」）Ｃａｓ９であるＣａｓ９の不活性化形態は、典型的には、「ｄＣａｓ９」として示され、実質的なヌクレアーゼ活性を有しない。Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３－１１８３。ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列の標的を介して、特定のゲノム配列に正確に結合する。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１７：５－１５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１６；８５：２２７－６４を参照されたい。ｄＣａｓ９は、ゲノム中の所望の部位及び／または遺伝子座の転写結合部位に適用されるときに、遺伝子発現を編集するために利用される。ｄＣａｓ９タンパク質がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）にカップリングしてｄＣａｓ９ガイドＲＮＡ複合体を作製すると、ｄＣａｓ９は、生物のゲノムに有害であり得る反復コドン及びＤＮＡ配列の増殖を防止する。本質的に、複数の反復コドンが産生されるとき、それは応答を引き出すか、またはそれらのコドンの過剰産生に対抗し、転写のシャットダウンをもたらすために豊富なｄＣａｓ９を動員する。したがって、ｄＣａｓ９はｇＲＮＡと相乗的に作用し、転写を継続することからＤＮＡポリメラーゼＩＩに直接影響を与える。
実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ酵素ガイドＲＮＡ複合体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ヌクレアーゼ欠損（または不活性、または「触媒的に死んだ」Ｃａｓ９、典型的には「ｄＣａｓ９」として示される）ガイドＲＮＡ複合体を含む。
実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ＧＴＴＴＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣ（配列番号９１）、ＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧ（配列番号９３）、ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡ（配列番号９４）、ＧＴＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴ（配列番号９５）、ＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡ（配列番号９６）、ＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号９７）、及びＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＡ（配列番号９８）から選択されるガイドＲＮＡを含み、当該ガイドＲＮＡは、酵素をケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に指向する。
実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、
ＣＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号９９）、ＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号１００）、ＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号１０１）、ＣＡＣＣＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧ（配列番号１０２）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号１０３）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴ（配列番号１０４）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号１０５）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡ（配列番号１０６）、ＣＡＣＣＧＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１０７）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴ（配列番号１０８）、ＣＡＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１０９）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ（配列番号１１０）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣ（配列番号１１１）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴ（配列番号１１２）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号１１３）、ＣＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣ（配列番号１１４）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号１１５）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号１１６）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣ（配列番号１１７）、ＡＡＡＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣ（配列番号１１８）、ＡＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号１１９）、ＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣ（配列番号１２０）、ＡＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣ（配列番号１２１）、ＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２２）、ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣ（配列番号１２３）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＣ（配列番号１２４）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣ（配列番号１２５）、ＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣ（配列番号１２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣ（配列番号１２７）、ＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２８）、ＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣ（配列番号１２９）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣ（配列番号１３０）、ＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号１３１）、ＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧ（配列番号１３２）、ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号１３３）、ＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号１３４）、ＡＡＧＴＧＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３５）、ＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧ（配列番号１３６）、ＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧ（配列番号１３７）、ＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１３８）、ＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧ（配列番号１３９）、ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧ（配列番号１４０）、ＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧ（配列番号１４１）、ＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＧＧ（配列番号１４２）、ＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１４３）、ＴＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧ（配列番号１４４）、ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１４５）、ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号１４６）、ＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧ（配列番号１４７）、ＧＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＡＣ（配列番号１４８）、ＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡ（配列番号１４９）、ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１５０）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧ（配列番号１５１）、ＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号１５２）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡ（配列番号１５３）、ＡＡＧＡＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１５４）、ＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧ（配列番号１５５）、ＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号１５６）、ＧＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１５７）、ＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＣＴＣＧＧ（配列番号１５８）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡ（配列番号１５９）、ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号１６０）、ＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧ（配列番号１６１）、ＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＣＣＣＡ（配列番号１６２）、ＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＧＧＧ（配列番号１６３）、ＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＧ（配列番号１６４）、ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣ（配列番号１６５）、ＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧ（配列番号１６６）、ＡＣＴＡＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＡＧＣＡＣＣ（配列番号１６７）、ＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１６８）、ＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号１６９）、ＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号１７０）、ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧ（配列番号１７１）、ＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１７２）、ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１７３）、ＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧ（配列番号１７４）、ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号１７５）、ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧ（配列番号１７６）、ＧＴＴＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号１７７）、ＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧ（配列番号１７８）、ＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧ（配列番号１７９）、ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＧ（配列番号１８０）、ＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１８１）、ＣＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧ（配列番号１８２）、ＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧ（配列番号１８３）、ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧ（配列番号１８４）、ＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＧ（配列番号３０９）、ＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡ（配列番号３１０）、ＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号３１１）、ＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号３１２）、ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴ（配列番号３１３）、ＴＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号３１４）、ＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣ（配列番号３１５）、ＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＧ（配列番号３１６）、ＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡ（配列番号３１７）、ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴ（配列番号３１８）、ＡＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＡ（配列番号３１９）、ＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号３２０）、ＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴ（配列番号３２１）、ＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧ（配列番号３２２）、ＡＡＧＧＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧ（配列番号３２３）、ＣＡＣＣＡＴＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２４）、ＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧ（配列番号３２７）、ＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２５）、ＴＴＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２６）、ＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２８）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧ（配列番号３２９）、ＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧ（配列番号３３０）、ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ（配列番号３３１）、ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号３３２）、ＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号３３３）、ＧＡＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧ（配列番号３３４）、ＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧ（配列番号３３５）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号１８５）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号１８６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号１８７）、ＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴ（配列番号１８８）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣ（配列番号１８９）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡ（配列番号１９０）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＧＴＡ（配列番号１９１）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＣＴＴＴＡＴ（配列番号１９２）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡ（配列番号１９３）、ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣ（配列番号１９４）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡ（配列番号１９５）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧ（配列番号１９６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴ（配列番号１９７）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡ（配列番号１９８）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号１９９）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡ（配列番号２００）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号２０１）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣ（配列番号２０２）、ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号２０３）、ＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号２０４）、ＡＡＡＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号２０５）、ＡＡＡＣＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣ（配列番号２０６）、ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号２０７）、ＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号２０８）、ＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣ（配列番号２０９）、ＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣ（配列番号２１０）、ＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１１）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣ（配列番号２１２）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号２１３）、ＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号２１４）、ＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＣ（配列番号２１５）、ＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＣ（配列番号２１６）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号２１７）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴ（配列番号２１８）、ＣＡＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴ（配列番号２１９）、ＣＡＣＣＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡ（配列番号２２０）、ＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡＡ（配列番号２２１）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴ（配列番号２２２）、ＣＡＣＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧ（配列番号２２３）、ＣＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号２２４）、ＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣ（配列番号２２５）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡ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９）、ＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣ（配列番号２３０）、ＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣ（配列番号２３１）、ＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣ（配列番号２３２）、ＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号２３３）、ＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号２３４）、ＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号２３５）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号２３６）、ＡＧＴＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号２３７）、ＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号２３８）、ＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２３９）、ＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号２４０）、ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２４１）、ＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号２４２）、ＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣ（配列番号２４３）、ＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号２４４）、ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧ（配列番号２４５）、ＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４６）、ＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧ（配列番号２４７）、ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号２４８）、ＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号２４９）、ＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧ（配列番号２５０）、ＣＣＧＴＡＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号２５１）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＧ（配列番号２５２）、ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ（配列番号２５３）、ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡ（配列番号２５４）、ＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号２５５）、ＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣＧＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２５７）、ＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡ（配列番号２５８）、ＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号２５９）、ＴＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号２６０）、ＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号２６２）、ＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧ（配列番号２６３）、ＧＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号２６４）、ＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号２６５）、ＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号２６６）、ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２６７）、ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号２６８）、ＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号２６９）、ＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号２７０）、ＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号２７１）、ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号２７２）、ＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号２７５）、ＡＧＡＧＴＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号２７６）、ＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号２７７）、ＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣ（配列番号２７８）、ＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡ（配列番号２７９）、ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＡ（配列番号２８０）、ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧＧＧ（配列番号２８１）、ＧＣＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧ（配列番号２８２）、ＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号２８３）、ＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号２８４）、ＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２８５）、ＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡ（配列番号２８６）、ＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２８７）、ＴＣＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号２８８）、ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＧ（配列番号２８９）、ＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号２９０）、ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号２９１）、ＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＧＣＡ（配列番号２９２）、ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣＧＧ（配列番号２９３）、ＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号２９４）、ＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９５）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡ（配列番号２９６）、ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９７）、ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号２９８）、ＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号２９９）、ＧＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号３００）、ＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号３０１）、ＴＡＧＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧ（配列番号３０２）、ＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧ（配列番号３０３）、ＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡ（配列番号３０４）、ＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＧ（配列番号３０５）、ＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧ（配列番号３０６）、ＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ（配列番号３０７）、及びＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０８）から選択されるガイドＲＮＡを含む。図４を参照されたい。
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ＣＴＡＡＧＡＴＣＣ（配列番号２２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣ（配列番号２２７）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣ（配列番号２２８）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣ（配列番号２２
９）、ＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣ（配列番号２３０）、ＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣ（配列番号２３１）、ＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣ（配列番号２３２）、ＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号２３３）、ＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号２３４）、ＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号２３５）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号２３６）、ＡＧＴＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号２３７）、ＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号２３８）、ＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２３９）、ＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号２４０）、ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２４１）、ＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号２４２）、ＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣ（配列番号２４３）、ＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号２４４）、ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧ（配列番号２４５）、ＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４６）、ＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧ（配列番号２４７）、ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号２４８）、ＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号２４９）、ＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧ（配列番号２５０）、ＣＣＧＴＡＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号２５１）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＧ（配列番号２５２）、ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ（配列番号２５３）、ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡ（配列番号２５４）、ＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号２５５）、ＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣＧＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２５７）、ＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡ（配列番号２５８）、ＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号２５９）、ＴＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号２６０）、ＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号２６２）、ＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧ（配列番号２６３）、ＧＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号２６４）、ＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号２６５）、ＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号２６６）、ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２６７）、ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号２６８）、ＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号２６９）、ＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号２７０）、ＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号２７１）、ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号２７２）、ＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号２７５）、ＡＧＡＧＴＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号２７６）、ＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号２７７）、ＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣ（配列番号２７８）、ＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡ（配列番号２７９）、ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＡ（配列番号２８０）、ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧＧＧ（配列番号２８１）、ＧＣＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧ（配列番号２８２）、ＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号２８３）、ＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号２８４）、ＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２８５）、ＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡ（配列番号２８６）、ＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２８７）、ＴＣＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号２８８）、ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＧ（配列番号２８９）、ＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号２９０）、ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号２９１）、ＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＧＣＡ（配列番号２９２）、ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣＧＧ（配列番号２９３）、ＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号２９４）、ＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９５）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡ（配列番号２９６）、ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９７）、ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号２９８）、ＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号２９９）、ＧＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号３００）、ＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号３０１）、ＴＡＧＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧ（配列番号３０２）、ＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧ（配列番号３０３）、ＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡ（配列番号３０４）、ＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＧ（配列番号３０５）、ＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧ（配列番号３０６）、ＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ（配列番号３０７）、及びＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０８）から選択されるガイドＲＮＡを含む。図４を参照されたい。
本開示の実施形態は、宿主ゲノム内の特定の部位を標的とするＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤの能力を利用する。ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤのＤＮＡ標的能力は、隣接するＤＮＡ配列を認識するために一緒に連結されるＴＡＬＥ反復配列（例えば、モジュラーアレイ）またはｇＲＮＡによって提供される。各ＴＡＬＥまたはｇＲＮＡは、ある特定の塩基対（複数可）または残基（複数可）を認識することができる。
ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノム編集及び標的二本鎖切断の導入のための既知のツールである。ＴＡＬＥＮは、カスタマイズ可能なＤＢＤに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメインなどのエンドヌクレアーゼを含む。このＤＢＤは、宿主植物細胞内の遺伝子の転写を変化させるためにキサントモナス細菌によって分泌されるタンパク質である、ＴＡＬＥに由来する高度に保存された反復から構成される。ＤＢＤは、発散した１２番目及び１３番目のアミノ酸を有する反復された高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含む。ＲＶＤと称されるこれらの２つの位置は、高度に可変であり、特定の塩基対またはヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの簡単明瞭な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特定のＤＢＤの操作を可能にした。Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１；２９（２）：１３５－６。
したがって、ＴＡＬＥＮは、モジュラーＤＮＡ結合ＴＡＬＥ反復ドメインを標的結合部位内の個々の塩基に関連付ける「タンパク質－ＤＮＡコード」を使用して容易に設計することができる。Ｊｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１４（１）：４９－５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３４８６を参照されたい。図３は、例えば、そのようなコードを示す。
ＴＡＬＥＮを使用して、本質的にヒト細胞内の目的の任意のＤＮＡ配列を標的とすることができることが実証されている。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：１４３－１４８。潜在的な標的部位の選択及びＧ塩基の認識のための特定のＴＡＬＥ反復ドメイン（超可変位置にＮＨ残基を保有する）の使用のためのガイドラインが提案されている。Ｓｔｒｅｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；３０：５９３－５９５を参照されたい。
したがって、いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、１つ以上の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１８．５個の反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列は、３３または３４アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列のうちの１つ以上は、３３または３４アミノ酸の残基１２または１３にＲＶＤを含む。ＲＶＤは、ある特定の塩基対（複数可）または残基（複数可）を認識することができる。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の１つの塩基対を認識する。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｃ」残基を認識し、かつＨＤ、Ｎ（ギャップ）、ＨＡ、ＮＤ、及びＨＩから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｇ」残基を認識し、かつＮＮ、ＮＨ、ＮＫ、ＨＮ、及びＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ａ」残基を認識し、かつＮＩ及びＮＳから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子内の「Ｔ」残基を認識し、かつＮＧ、ＨＧ、Ｈ（ギャップ）、及びＩＧから選択される。
実施形態では、ＧＳＨＳは、染色体におけるオープンクロマチン位置にある。いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、アデノ関連ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体、及びヒトＲｏｓａ２６遺伝子座から選択される。いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ヒト染色体２、４、６、１０、１１、または１７上に位置する。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ＴＡＬＣ１、ＴＡＬＣ２、ＴＡＬＣ３、ＴＡＬＣ４、ＴＡＬＣ５、ＴＡＬＣ７、ＴＡＬＣ８、ＡＶＳ１、ＡＶＳ２、ＡＶＳ３、ＲＯＳＡ１、ＲＯＳＡ２、ＴＡＬＥＲ１、ＴＡＬＥＲ２、ＴＡＬＥＲ３、ＴＡＬＥＲ４、ＴＡＬＥＲ５、ＳＨＣＨＲ２－１、ＳＨＣＨＲ２－２、ＳＨＣＨＲ２－３、ＳＨＣＨＲ２－４、ＳＨＣＨＲ４－１、ＳＨＣＨＲ４－２、ＳＨＣＨＲ４－３、ＳＨＣＨＲ６－１、ＳＨＣＨＲ６－２、ＳＨＣＨＲ６－３、ＳＨＣＨＲ６－４、ＳＨＣＨＲ１０－１、ＳＨＣＨＲ１０－２、ＳＨＣＨＲ１０－３、ＳＨＣＨＲ１０－４、ＳＨＣＨＲ１０－５、ＳＨＣＨＲ１１－１、ＳＨＣＨＲ１１－２、ＳＨＣＨＲ１１－３、ＳＨＣＨＲ１７－１、ＳＨＣＨＲ１７－２、ＳＨＣＨＲ１７－３、及びＳＨＣＨＲ１７－４から選択される。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つに結合する。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、
ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）、及び
ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号４２２）のうちの１つ以上を含む。
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、
ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）、及び
ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号４２２）のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、図３に列挙される部位から選択され、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、図３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、図３の配列のうちの１つ以上、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳ及びＴＡＬＥ ＤＢＤ配列は、
ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）及びＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）及びＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）及びＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）及びＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）及びＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）及びＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）及びＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）及びＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）及びＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）及びＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）及びＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）及びＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）及びＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）及びＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）及びＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）及びＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）及びＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）及びＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）及びＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）及びＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、ならびに
ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）及びＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）から選択される。
ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）及びＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）及びＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）及びＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）及びＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）及びＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）及びＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）及びＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）及びＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）及びＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）及びＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）及びＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）及びＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）及びＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）及びＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）及びＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）及びＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）及びＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）及びＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）及びＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）及びＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、ならびに
ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）及びＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）から選択される。
いくつかの実施形態では、ＧＳＨＳは、ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位の約２５、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約３００、または約５００ヌクレオチド内にある。
いくつかの実施形態では、オープンクロマチンの領域におけるｄＣａｓを使用してヒトゲノムセーフハーバー部位を標的とするためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、図４に示される通りである。
実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素）は、ＴＡジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。いくつかの実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素）は、ＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる。
実施形態では、組成物は、酵素及びトランスポゾンをそれぞれコードする核酸を有する系を含む。図１Ａ～１Ｄは、本開示の実施形態による系の例を示す。例えば、図２に示されるように、いくつかの実施形態では、この系は、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸（例えば、ヘルパーＲＮＡ）と、トランスポザーゼ（例えば、ドナーＤＮＡ）をコードする核酸と、を含む。ヘルパーＲＮＡは、特異的末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーＤＮＡをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素（例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ）に翻訳される。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、第１の核酸によってコードされ、トランスポゾンは、第２の非ウイルス核酸によってコードされる。トランスポゾンは、導入遺伝子を含み、酵素によって認識される末端に隣接しており、酵素は、ある特定のゲノム遺伝子座及び／または部位（例えば、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）内のＴＡジヌクレオチド部位もしくはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位）に導入遺伝子を挿入させる。いくつかの実施形態では、第１の核酸は、ＲＮＡ、例えば、ヘルパーＲＮＡであり、第２の非ウイルス核酸は、ＤＮＡである。実施形態では、インテイン（スプライシングドメインとも称される）を使用して、ドナー導入遺伝子の組み込みのためにヒトゲノム内の特定の部位を標的とする所望の内部ＤＮＡ二重結合ドメイン（ＤＮＡバインダー）を含む組換え酵素（例えば、限定されないが、ＭＬＴ融合タンパク質）を合成する。
インテイン（ＩＮＴｅｒｖｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔＥＩＮＳ（介在タンパク質））は、タンパク質スプライシングのプロセスを実行する能力を有する、自然界に見出されるタンパク質ドメインである移動型遺伝要素である。Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ ＆ Ｃａｍａｒｅｒｏ（２０１９）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃｉｅｎｃｅ，２０（５），４０８－４２４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。タンパク質スプライシングは、インテインに隣接する前駆体ポリペプチドセグメント間のペプチド結合の切断及び形成をもたらす、翻訳後の生化学的修飾である（同上）。インテインは、タンパク質スプライシングを介して前駆体タンパク質から翻訳後に自身を切除するための標準的な酵素戦略を適用する。Ｎａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｖｏｌ．８，１２ ２００４．１６ Ｄｅｃ．２０２０，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ８１２２００４。インテインは、その隣接するＮ末端及びＣ末端ドメインをスプライシングして、成熟タンパク質となり、配列から自身を切除することができる。例えば、分割されたインテインは、トランスジェニック生物への異種遺伝子の送達を制御するために使用されている。Ｗｏｏｄ ＆ Ｃａｍａｒｅｒｏ（２０１４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８９（２１）：１４５１２－１４５１９を参照されたい。このアプローチは、標的タンパク質を２つのセグメントに分割することに依存し、次いで、これらは、タンパク質トランススプライシング（ＰＴＳ）によってインビボで翻訳後に再構築される。Ａｂｏｙｅ ＆ Ｃａｍａｒｅｒｏ（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，２７０２６－２７０３２を参照されたい。より最近では、Ｃａｓ９を細胞に組み込み、ヌクレアーゼ活性を効率的に再構築するためのインテイン媒介性スプリットＣａｓ９系が開発されている。Ｔｒｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５，４３（１３），６４５０－６４５８。タンパク質スプライシングは、前駆体タンパク質の内部領域を切除し、次いで、Ｎ－エクステイン及びＣ－エクステイン断片のライゲーションを行い、２つのポリペプチド（切除されたインテイン、及びＣ－エクステインとＮ－エクステインとを接合することによって産生される新しいポリペプチド）をもたらす。Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ ＆ Ｃａｍａｒｅｒｏ（２０１９）。
実施形態では、限定されないが、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１２ｊ、またはＴＡＬＥなどのＤＮＡバインダーのインテイン媒介性の組み込みは、２つのより小さな断片からの完全長ＭＬＴトランスポザーゼの再構築を可能にするスプリットＭＬＴトランスポザーゼ系の作製を可能にする。これにより、ＭＬＴトランスポザーゼのＮ末端またはＣ末端にＤＮＡバインダーを発現する必要性を回避することが可能になる。このアプローチでは、ＭＬＴトランスポザーゼの２つの部分をインテインに融合させ、共発現後、インテインは、翻訳後修飾による完全長ＭＬＴトランスポザーゼの産生を可能にする。したがって、実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸は、インテインを含む。実施形態では、核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切断時に、第１及び第２の部分が機能的酵素に融合されるように、第１の部分と第２の部分との間にインテインがコードされている第１及び第２の部分の形態で酵素をコードする。
実施形態では、インテインは、好適なリガンド依存性インテイン、例えば、米国特許第９，２００，０４５号、Ｍｏｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２；１２４，９０４４－９０４５、Ｍｏｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３；１２５，１０５６１－１０５６９、Ｂｕｓｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００４；１０１，１０５０５－１０５１０、Ｓｋｒｅｔａｓ ＆ Ｗｏｏｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５；１４，５２３－５３２、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００７；３，５０－５４、Ｐｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１；１８（５），６１９－６３０（これらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものから選択されるインテインであり得る。
実施形態では、インテインは、ＮｐｕＮ（Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ）（配列番号４２３）及び／またはＮｐｕＣ（Ｉｎｔｅｉｎ－Ｃ）（配列番号４２４）、またはそのバリアント、例えば、それに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列である。
実施形態では、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素は、限定されないが、トランスポザーゼ酵素である。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来する。実施形態では、酵素（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ酵素）は、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉに由来する単量体、二量体、四量体、超活性体、またはＩｎｔ形態を含むが、これらに限定されない操作されたバージョンのトランスポザーゼ酵素である。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、単量体、二量体、四量体、超活性体であるか、またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、もしくはＭｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓのうちのいずれかに由来する、非ＴＴＡＡ（配列番号１）認識部位（Ｉｎｔ－）との相互作用が低減しているトランスポザーゼ酵素を含むが、これらに限定されない操作されたバージョンである。トランスポザーゼ酵素は、野生型、単量体、二量体、四量体、超活性体、またはＩｎｔ－変異体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡとトランスポザーゼ酵素とを接続するリンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、可撓性リンカーは、実質的に、グリシン及びセリン残基を含み、任意選択で、可撓性リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは、約１～約１２である。可撓性リンカーは、約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０アミノ酸残基であり得る。
いくつかの態様では、本開示の実施形態によるキメラトランスポザーゼをコードする核酸が提供される。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、キメラトランスポザーゼは、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による核酸を含む、宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の実施形態による組成物または核酸が提供され、組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である。組成物は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（グリセリルトリオレエート）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含み、及び／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含み得る。
いくつかの態様では、本開示の実施形態による、細胞をキメラトランスポザーゼと接触させることを含む、細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法が提供される。この方法は、インビボ方法またはエクスビボ方法であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、本開示の実施形態に従って、キメラトランスポザーゼをコードする核酸と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするＲＮＡと接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスポゾンを含む構築物と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラトランスポザーゼをコードするＤＮＡと接触される。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有する本ＭＬＴトランスポザーゼ、もしくはそのバリアント（及び任意選択で１つ以上の超活性変異）、またはその記載されるキメラを、約０．５：１の比、または約１：１の比、または約２：１の比、または約１：０．５の比、または約１：２の比で利用し、その比は、トランスポゾン（もしくはペイロード／導入遺伝子）の量と、ＭＬＴトランスポザーゼの量またはその記載されるキメラの量との比（例えば、重量：重量、濃度：濃度）である。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、不死化細胞株を利用する。実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、ヒト対象に由来する細胞を利用する（例えば、この方法は、エクスビボまたはインビトロで実施される）。実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための本方法は、腎細胞、または卵巣細胞、または免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を利用する。
実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、挿入された遺伝子の発現を可能にする。実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、挿入された遺伝子の発現を少なくとも７日間、または少なくとも８日間、または少なくとも９日間、または少なくとも１０日間、または少なくとも１４日間、または少なくとも２１日間、または少なくとも約７～２１日間、または少なくとも約７～１４日間、または少なくとも約７～１０日間、または少なくとも約１０～１４日間提供する。
実施形態では、遺伝子をゲノムに挿入するための本方法は、レシピエント細胞の生存率に実質的に影響を及ぼさない（例えば、細胞の少なくとも約９５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約５０％は、挿入後も生存可能である）。
当技術分野において認識されるように、トランスポゾンは、多くの場合、トランスポゾンの中央の導入遺伝子及びトランスポゾンの５’及び３’末端の末端反復配列をコードするオープンリーディングフレームを含む。翻訳されたトランスポザーゼは、トランスポゾンの５’及び３’配列に結合し、転位機能を実行する。
実施形態では、トランスポゾンは、転位性エレメントと互換的に使用され、転位性エレメントは、それら自体のコピーを他のポリヌクレオチドに挿入することができるポリヌクレオチドを指すために使用される。トランスポゾンという用語は、当業者に周知であり、配列の編成、例えば、各末端の逆位末端配列、及び／または末端の直接反復される長い末端反復（ＬＴＲ）に基づいて区別することができるトランスポゾンのクラスを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様エレメント、例えば、ＴＴＡＡ（配列番号１）配列を認識し、トランスポゾンの除去後に挿入部位における配列を元のＴＴＡＡ（配列番号１）配列に戻す、そのトレースレス切除を特徴とするトランスポゾンエレメントとして記載され得る。
実施形態では、トランスポゾンは、ＭＬＴトランスポザーゼを含む。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼ、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスポザーゼである。実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号４のアミノ酸、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスポザーゼである。
実施形態では、トランスポザーゼは、ＭＬＴ左末端、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列に作用することができ、ＭＬＴ左末端（５’～３’）のヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＴＴＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＧＴＴＡＡＧＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＡＡＡＣＴＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴ（配列番号２１）。
ＴＴＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＧＴＴＡＡＧＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＡＡＡＣＴＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＧＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴ（配列番号２１）。
実施形態では、トランスポザーゼは、ＭＬＴ右末端、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列に作用することができ、ＭＬＴ右末端（５’～３’）のヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＣＧＣＧＣＣＡＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡ（配列番号２２）。
ＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＣＧＣＧＣＣＡＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡ（配列番号２２）。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、１つ以上の末端に隣接している。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、競合ポリペプチドをコードする遺伝子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、疾患状態において欠陥があるか、または実質的に存在しない遺伝子であるか、またはそれを含む。
実施形態では、トランスポゾンは、様々な遺伝子をコードすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４遺伝子（ＡＢＣ）トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＡ４）、またはその機能的断片である。別の例として、いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、非常に低密度のリポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度のリポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）、またはその機能的断片である。
いくつかの実施形態では、治療遺伝子は、宿主ゲノム内のＧＳＨＳ位置に挿入される。これらの部位内の組み込みは、原がん遺伝子の活性化、腫瘍抑制因子の不活性化、または挿入変異誘発などの有害作用と関連付けられないため、ＧＳＨＳは、遺伝子導入に適した遺伝子座として定義することができる。ＧＳＨＳは、以下の基準によって定義することができる：１）任意の遺伝子の５’末端から少なくとも５０ｋｂの距離、（２）任意のがん関連遺伝子から少なくとも３００ｋｂの距離、（３）任意のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から少なくとも３００ｋｂの距離、（４）転写単位の外側の位置、及び（５）ヒトゲノムの超保存領域（ＵＣＲ）の外側の位置。Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１１；２９：７３－８、Ｂｅｊｅｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４；３０４：１３２１－５を参照されたい。
さらに、ＧＳＨＳ位置の使用は、複数の細胞型にわたる安定な導入遺伝子発現を可能にすることができる。そのような部位の１つであるケモカインＣ－Ｃモチーフ受容体５（ＣＣＲ５）が同定されており、組み込み遺伝子導入に使用されている。ＣＣＲ５は、βケモカイン受容体ファミリーのメンバーであり、一次感染に関与するＲ５トロピックウイルス株の侵入に必要である。ＣＣＲ５遺伝子におけるホモ接合３２ｂｐの欠失により、ヒトにおけるＨＩＶ－１ウイルス感染に対する耐性が付与される。白人集団の約１％において自然に生じるＣＣＲ５発現の妨害は、免疫の低減をもたらすとは思われない。Ｌｏｂｒｉｔｚ ａｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１０；２：１０６９－１０５。臨床試験は、標的可能なヌクレアーゼを介してＣＣＲ５を破壊する安全性及び有効性を実証している。Ｔｅｂａｓ ａｔ ａｌ．，ＨＩＶ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７０：９０１－１０。
トランスポゾンは、組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。組織特異的プロモーターは、例えば、肝臓特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、いくつかの実施形態では、ヒトＬＰ１プロモーターである、ＬＰ１プロモーターである。ＬＰ１プロモーターは、例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．２００６；１０７（７）：２６５３－６１に記載されており、Ｎａｔｈａｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．に記載されるように構築することができる。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、網膜特異的プロモーター、例えば、ＲＰＥ６５、ＩＲＢＰ、またはＶＭＤ２プロモーターであり得る網膜色素上皮（ＲＰＥ）プロモーターなどである。ＲＰＥ６５、ＩＲＢＰ、及びＶＭＤ２プロモーターは、例えば、Ａｇｕｉｒｒｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１７；５８（１２）：５３９９－５４１１．ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１７－２２９７８に記載されている。いくつかの実施形態では、網膜特異的プロモーターは、任意選択でβ－ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）（例えば、Ｄｉ Ｐｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５（１９）：３８６３－３８６７）、ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）（例えば、Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７、ＭｃＤｏｕｇａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９；１３：３８０－３８９．２０１９年３月２８日公開）、ＣＡＲ（錐体アレスチン）（例えば、ＭｃＤｏｕｇａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９；１３：３８０－３８９．２０１９年３月２８日公開）、網膜色素変性１（ＲＰ１）、及びＬ－オプシン（例えば、Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１５，Ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ２５８，Ｍａｙ ０１，２００７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．２００８ Ｆｅｂ；４８（３）：３３２－８を参照されたい）から選択される、光受容体プロモーターである。
しかしながら、他の組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーターなどを含む、種々のプロモーターを使用することができることを理解されたい。
キメラトランスポザーゼは、非ウイルスベクターなどのベクターに組み込むことができる。キメラトランスポザーゼは、トランスポゾンをコードするベクターと同じベクター上にコードすることができるか、または別個のベクタープラスミドもしくはＲＮＡ上にコードすることができる。
さらに、様々なトランスポザーゼ酵素を使用して、キメラトランスポザーゼを構築することができる。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｃｌ／マリナートランスポゾン系に由来する。例えば、Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９；１５（８）：３２６－３２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターに融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００８；９：２（２００８年１月１１日オンラインで公開）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（例えば、Ｃｅｌｌ．１９９７；９１：５０１－５１０を参照されたい）、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙの超活性形態（ｈｙｐＳＢ）、例えば、ＳＢ１００Ｘ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌｕｍｅ １８，ｐａｇｅｓ ８４９－８５６（２０１１）を参照されたい）、またはｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン系（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｓｅｐ；３３（９）：５２５－３３を参照されたい）、例えば、ｍＰＢ上に７つのアミノ酸置換（例えば、Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５７０Ｓ、Ｎ５３８Ｋ）または非ｍＰＢにおける機能的同等物を有するＰＢトランスポザーゼ（ｈｙｐＰＢ）の超活性形態（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２ Ｏｃｔ；１（１０）：ｅ５０を参照されたい）に由来する（また、Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ ２５，２０１１ １０８（４）１５３１－１５３６、Ｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１１１２６（２０１６）も参照されたい）。
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、ＩＳ４トランスポザーゼファミリーに属する。Ｄｅ Ｐａｌｍｅｎａｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００８；８：１８．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１４８－８－１８。ｐｉｇｇｙＢａｃファミリーは、非常に多様なトランスポゾンを含み、これらのトランスポゾンのうちのいずれも、本開示の実施形態で使用することができる。例えば、Ｂｏｕａｌｌｅｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２０１７；９（２）：３２３－３３９を参照されたい。ｐｉｇｇｙＢａｃ（スーパー）ファミリーの創設メンバーである昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃは、もともとキャベツルーパー蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ ｎｉ）において同定され、インビボ及びインビトロの両方で研究された。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃは、多くのリコンビナーゼによって共有されるＲＮａｓｅ Ｈフォールドに似た触媒部位を有するエレメントコードされたトランスポザーゼによって促進される典型的なカット・アンド・ペースト機序によって転位することが知られている。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系は、ショウジョウバエ及びマウスを含む広範囲の動物において高度に活性であることが示されており、遺伝子タグ付け及びゲノム操作のための強力なツールとして開発されている。他のｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリーに属する他のトランスポゾンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ及びＢｏｍｂｙｘを含む節足動物及び脊椎動物において一般的である。本開示の実施形態で使用することができる超活性哺乳類ｐｉｇｇｙＢａｃバリアントを含む哺乳類ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１００８５６９９号に記載されている。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、小型の茶色コウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）または他のコウモリトランスポザーゼ、例えば、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓから得られるカット・アンド・ペーストＭＬＴエレメントに基づくＭＬＴトランスポゾン系に由来する。Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｊａｎ ２；１１０（１）：２３４－９、Ｊｅｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌｕｍｅ ５８３，ｐａｇｅｓ ５７８－５８４（２０２０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、コウモリトランスポザーゼの超活性形態が使用される。ＭＬＴトランスポザーゼは、コウモリ細胞、ヒト細胞、及び酵母細胞内での転位が可能であることが示されている。ＭＬＴトランスポザーゼの超活性形態は、転位プロセスを増強する。加えて、キメラＭＬＴトランスポザーゼは、ゲノム組み込みなしで部位特異的切除が可能である。
さらに、実施形態では、操作された及び／または補正されたＭＬＴトランスポザーゼは、野生型ＭＬＴトランスポザーゼと比較してある特定の変異を有するものが使用される。実施形態では、補正されたＭＬＴトランスポザーゼの超活性形態が使用される。
実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓのうちのいずれかに由来する。実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、またはＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓのうちのいずれかに由来する（図７を参照されたい）。トランスポザーゼは、図５Ａ及び５Ｂから選択される１つ以上の超活性及び／または組み込み欠損変異、またはそれらの同等物を有することができる。当業者は、図７を参照して、そのような変異体をＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、またはＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。
図７のアラインメントに示されるアミノ酸配列は、以下の通りである（括弧内の表記は、異なる種類の配列を区別するためのものに過ぎない）：
実施形態では、当業者は、そのような変異体を、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、及びＭｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓのうちのいずれかからのトランスポザーゼに対応させることができる。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスのうちのいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有することができる。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスのうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。Ｊｅｂｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、野生型ＭＬＴトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列：
ＡＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＧＣＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＴＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴＣＧＡＴＡＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＧＴＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴ（配列番号５）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＧＣＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＴＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴＣＧＡＴＡＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＧＴＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＡＣＧＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴ（配列番号５）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、配列番号５（上記）のヌクレオチド配列によってコードされる野生型ＭＬＴトランスポザーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＳＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＷＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳ１ＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＷＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡ１ＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号４）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
ＭＳＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＷＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳ１ＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＷＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡ１ＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号４）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、すぐ上のアミノ酸配列（配列番号４）を有し、図５Ａまたは図５Ｂから選択される超活性変異を含む。例えば、ＭＬＴトランスポザーゼは、図５Ａもしくは図５Ｂ、またはそれらの組み合わせから選択される約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの超活性変異を含み得る。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｌ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘから選択される１つ以上の変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でＸは、Ａ、Ｇ、または欠失であり、任意選択で変異は、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ変異を含み、配列番号２のアミノ酸配列：
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号２）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号２）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼ、またはそのバリアントを操作して、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｊａｎ ２；１１０（１）：２３４－９）及びＷＯ２０１００８５６９９（いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載の酵素を改良した。配列番号２のアミノ酸配列またはそのバリアント（変異Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａを伴う）を含むＭＬＴトランスポザーゼは、本明細書では、「操作された」及び／または「補正された」ＭＬＴトランスポザーゼと称される。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、以下のヌクレオチド配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＡＴＡＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＡＧ（配列番号３）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＡＴＡＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＡＧ（配列番号３）、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、図５Ａまたは図５Ｂから選択される１つ以上の超活性変異を含む。例えば、ＭＬＴトランスポザーゼは、図５Ａもしくは図５Ｂ、またはそれらの組み合わせから選択される約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの超活性変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ５、Ｓ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｅ１１、Ｃ１３、Ａ１４、Ｓ３６、Ｓ５４、Ｎ１２５、Ｋ１３０、Ｇ２３９、Ｔ２９４、Ｔ３００、Ｉ３４５、Ｒ４２７、Ｄ４７５、Ｍ４８１、Ｐ４９１、Ａ５２０、及びＡ５６１位のうちの１つ以上における置換または欠失から選択される１つ以上の超活性変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ５Ｐ、Ｓ８Ｐ、Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ、Ｄ９Ｇ、Ｄ１０Ｇ、Ｅ１１Ｇ、Ｃ１３Ｒ、Ａ１４Ｖ、Ｓ３６Ｇ、Ｓ５４Ｎ、Ｎ１２５Ｋ、Ｋ１３０Ｔ、Ｇ２３９Ｓ、Ｔ２９４Ａ、Ｔ３００Ａ、Ｉ３４５Ｖ、Ｒ４２７Ｈ、Ｄ４７５Ｇ、Ｍ４８１Ｖ、Ｐ４９１Ｑ、Ａ５２０Ｔ、及びＡ５６１Ｔから選択される１つ以上の超活性変異を含む。
実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及び／またはＮ１２５Ｘ３から選択される超活性変異体のうちの１つ以上（例えば、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及びＮ１２５Ｘ３の全て、Ｓ８Ｘ１及びＣ１３Ｘ２、Ｓ８Ｘ１及びＮ１２５Ｘ３、ならびにＣ１３Ｘ２及びＮ１２５Ｘ３）を含み、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、各々独立して、任意のアミノ酸配列であるか、またはＸ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰから選択される非極性脂肪族アミノ酸であり、Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択される正に荷電したアミノ酸であり、及び／またはＸ３は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択される正に荷電したアミノ酸である。実施形態では、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＲ、であり、及び／またはＸ３はＫである。
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的同等物と比較して、Ｎ１２５Ｋ変異を有するアミノ酸（配列番号７）に対応するヌクレオチド配列（配列番号６）：
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される）によってコードされる。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される）。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される）によってコードされる。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｎ１２５Ｋ変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される）。
いくつかの実施形態では、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号７のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ１（またはＭＬＴ１）と称される。
いくつかの実施形態では、ＭＬＴトランスポザーゼは、配列番号２のアミノ酸配列もしくはその機能的同等物と比較して、Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有するアミノ酸（配列番号９）に対応するヌクレオチド配列（配列番号８）：
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される）によってコードされる。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される）。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するコドンは、下線を引いて太字で示される）によってコードされる。
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応するアミノ酸は、下線を引いて太字で示される）。
いくつかの実施形態では、配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号９のアミノ酸配列を有するＭＬＴトランスポザーゼは、ＭＬＴトランスポザーゼ２（またはＭＬＴ２）と称される。
態様では、配列番号２のアミノ酸配列及びＳ２位における置換を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む、組成物が提供される。実施形態では、置換は、非極性脂肪族アミノ酸、任意選択でＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰのうちの１つ、任意選択でＳ２Ａである。実施形態では、酵素は、Ｃ末端に追加の残基を有しない。実施形態では、酵素は、例えば、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及び／またはＮ１２５Ｘ３から選択される、超活性を付与する１つ以上の変異を有し、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰから選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、Ｘ３は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、例えば、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＲであり、及び／またはＸ３はＫである。実施形態では、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有する、本明細書に記載のトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）をコードする核酸を含む、組成物が提供される。実施形態では、トランスポザーゼまたは核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である。実施形態では、酵素は、トランスポゾン、例えば、同じ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をコードする核酸と共製剤化される。実施形態では、共製剤は、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸を含む。
実施形態では、遺伝子を細胞のゲノムに挿入するための方法であって、細胞を、配列番号２のアミノ酸配列及びＳ２位での置換を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアント、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するバリアントと接触させることを含む、方法が提供される。実施形態では、置換は、非極性脂肪族アミノ酸、任意選択でＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰのうちの１つ、任意選択でＳ２Ａである。実施形態では、酵素は、Ｃ末端に追加の残基を有しない。実施形態では、酵素は、例えば、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及び／またはＮ１２５Ｘ３から選択される、超活性を付与する１つ以上の変異を有し、例えば、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰから選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、Ｘ３は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、例えば、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＲであり、及び／またはＸ３はＫである。実施形態では、方法は、細胞を、トランスポゾンを含む構築物と接触させることをさらに含み、及び／または酵素が、トランスポゾンをコードする核酸（例えば、ＬＮＰ中）と共製剤化される。実施形態では、共製剤は、酵素をコードする核酸及びトランスポゾンをコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及び／またはＣ１３Ｒ、ならびにＲ１６４Ｎ、Ｗ１６８Ｖ、Ｍ２７８Ａ、Ｋ２８６Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｎ３３５Ａ、Ｋ３４９Ａ、Ｋ３５０Ａ、Ｋ３６８Ａ、Ｋ３６９Ａ、及びＤ４１６Ｎのうちの１つから選択される１つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及び／またはＣ１３Ｒ、ならびにＲ１６４Ｎ、Ｗ１６８Ｖ、Ｍ２７８Ａ、Ｋ２８６Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｎ３３５Ａ、Ｋ３４９Ａ、Ｋ３５０Ａ、Ｋ３６８Ａ、Ｋ３６９Ａ、及びＤ４１６Ｎのうちの１つ、及び／またはＥ２８４Ａ、Ｋ２８６Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｎ３１０Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｒ３３６Ａ、Ｋ３４９Ａ、Ｋ３５０Ａ、Ｋ３６８Ａ、及びＫ３６９Ａのうちの１つ以上から選択される１つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＴトランスポザーゼは、Ｓ８Ｐ及び／またはＣ１３Ｒ、ならびにＲ１６４Ｎ、Ｗ１６８Ｖ、Ｍ２７８Ａ、Ｋ２８６Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｎ３３５Ａ、Ｋ３４９Ａ、Ｋ３５０Ａ、Ｋ３６８Ａ、Ｋ３６９Ａ、及びＤ４１６Ｎのうちの１つ、及び／またはＥ２８４Ａ、Ｋ２８６Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｎ３１０Ａ、Ｒ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｒ３３６Ａ、Ｋ３４９Ａ、Ｋ３５０Ａ、Ｋ３６８Ａ、及びＫ３６９Ａのうちの１つ以上、及び／または１つのＲ３３６Ａから選択される１つ以上の変異を含む。
実施形態では、疾患または障害をエクスビボで治療するための方法であって、細胞を、配列番号２のアミノ酸配列及びＳ２位での置換を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含むか、あるいは配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）を含む組成物と接触させることを含む、方法が提供される。
実施形態では、疾患または障害をインビボで治療するための方法であって、配列番号２のアミノ酸配列及びＳ２位での置換を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含むか、あるいは配列番号３のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、または配列番号２のアミノ酸配列及びＳ２位での置換を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）、またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含む組成物を含む細胞を含むか、あるいは配列番号２のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するトランスポザーゼ酵素（例えば、ＭＬＴトランスポザーゼ）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。
実施形態では、本ＭＬＴトランスポザーゼ（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有する）またはそのバリアント（及び任意選択で、１つ以上の超活性変異）は、ｐｉｇｇｙＢａｃと比較して改善された組み込み効率を示す。実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列、ならびにＳ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及び／またはＮ１２５Ｋの本ＭＬＴトランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃと比較して改善された組み込み効率を示す。
実施形態では、本ＭＬＴトランスポザーゼ（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有する）、またはそのバリアント（及び任意選択で、１つ以上の超活性変異）は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得、タンパク質をより効率的に核内にシャトルするための１つまたは２つのＮ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有し得る。例えば、実施形態では、本ＭＬＴトランスポザーゼは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＮＬＳをさらに含む。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８－４８５、参照により本明細書に組み込まれる）において提供される。特定の実施形態では、ＮＬＳは、コンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号３４８）を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、コンセンサス配列（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０－１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号３４９）を含み、（Ｋ／Ｒ）３／５は、５つのアミノ酸のうちの少なくとも３つが、リジンまたはアルギニンのいずれかであることを表す。一実施形態では、ＮＬＳは、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５０）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンＮＬＳである。特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５１）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０ラージＴ－抗原ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳは、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５３）を含む。様々な実施形態では、ＮＬＳは、それらが１つ以上の置換、付加、または欠失（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０の置換、付加、または欠失）を含有するように、上記の配列に変異／変形を含み得る。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型またはＬＥＡＰ－ＩＮトランスポゾン系に由来する（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１８ Ｏｃｔ；１３（１０）：ｅ１７００７４８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７００７４８．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊｕｎ １１）。
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ＬＥＡＰ－ＩＮ１型のＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を含む。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ系は、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼｍＲＮＡ）、及びトランスポゾン同族逆位末端及び転位認識モチーフ（ＴＴＡＴ）に隣接する、１つ以上の目的の遺伝子（トランスポゾン）、選択マーカー、調節エレメント、絶縁体などを含有するベクターを含む。ベクターＤＮＡ及びトランスポザーゼｍＲＮＡのコトランスフェクション時に、一過性に発現された酵素は、宿主細胞のゲノムにわたる１つ以上の部位におけるトランスポゾンカセットの単一コピー（末端間の全ての配列）の高効率かつ正確な組み込みを触媒する。Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｗｈｉｔｅ ＳＪ，Ｃａｎｔｓｉｌｉｅｒｉｓ Ｓ，ｅｄｓ：１８５－１９６．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０１７．ｐｐ．１８５－１９６。ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼは、複数のゲノム遺伝子座における、主にオープンクロマチンセグメントにおける単一コピーの組み込み；ペイロード制限なし、したがって複数の独立した転写単位が単一の構築物から発現され得ること；組み込まれた導入遺伝子がそれらの構造的かつ機能的完全性を維持すること；及び導入遺伝子の完全性の維持が、全ての組換え細胞における所望の鎖比を確保することを含む、様々な有利な特徴を有する安定な導入遺伝子組み込み物を生成する。
さらに、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼは、自己不活性化機序を有する。トランスポザーゼ構築物のイントロン内に位置する３’－ＴＲＥは、プロモーター領域を空間的に分離する。したがって、ＴＴＡＡ（配列番号１）部位間に位置するトランスポゾンを、転位中のプラスミドから酵素的に切除すると、プロモーターがＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ構築物の５’末端から分離される。残りのプラスミド骨格中に存在するプロモーターレスとなったトランスポザーゼは、ゲノム中に非転位的に挿入されると不活性化され、それによって宿主細胞中の遺伝毒性効果を低減する。これにより、誤って合成され得るｍＲＮＡ構築物からの任意のタンパク質合成を停止させることができる。Ｕｒｓｃｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０；１０７：８１１７－２２。
いくつかの実施形態では、本発明の二重系は、導入遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドと、トランスポザーゼ（例えば、ＬＥＡＰＩＮトランスポザーゼ）をコードするＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡの使用は、トランスポザーゼをコードするＤＮＡ分子の送達よりも多くの利点を有することができる。例えば、Ｗｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６；１３：６２５－３０を参照されたい。利点は、トランスポザーゼ発現の持続時間に関する制御の改善、組織内の持続性の最小化、及び初期の転位イベント後の導入遺伝子の再動員及び再挿入の可能性を含む。さらに、トランスポザーゼをコードするＲＮＡ配列は、宿主ゲノムに組み込むことができない可能性が高く、それによって、目的の遺伝子に対する長期的なトランスポザーゼ発現及び不安定化効果に関する懸念を排除する。さらに、いくつかの実施形態では、二重プラスミドＤＮＡトランスポゾン／ＲＮＡトランスポザーゼ系は、細胞外ＲＮＡ分解から保護するために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態であり、これはインビボでの使用を改善する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子との構築物の安定した発現を確実にするために選択される様々な調節エレメントと会合することができる。したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、近傍遺伝子の活性化または不活性化を防止または軽減する１つ以上の絶縁体配列を含むことができる非ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡプラスミド）によってコードされ得る。絶縁体は、トランスポゾン（導入遺伝子カセット）に隣接して、転写サイレンシングを低減し、染色体配列によって付与される位置効果を低減する。追加の効果として、絶縁体は、導入遺伝子エンハンサー及びプロモーター配列と隣接する染色体配列との機能的相互作用を排除することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の絶縁体配列は、ＨＳ４絶縁体（１．２ｋｂ ５′－ＨＳ４ニワトリβ－グロビン（ｃＨＳ４）絶縁体エレメント）及びＤ４Ｚ４絶縁体（Ｆａｃｉｏ－Ｓｃａｐｕｌｏ－Ｈｕｍｅｒａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＦＳＨＤ）に連結されたタンデムマクロサテライト反復）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳ４絶縁体及びＤ４Ｚ４絶縁体の配列は、Ｒｉｖａｌ－Ｇｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ａｕｇ；２１（８）：１５３６－５０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される通りである。
記載の方法は、転位（例えば、限定されないが、トランスポザーゼ）による標的ゲノム組み込みが可能な酵素を、それらをＤＮＡ結合ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡに融合させて、ＧＳＨＳへの組み込みを標的とすることによって増強し、これは、オープンクロマチンを有する領域内にあり得る。実施形態では、酵素（例えば、ＤＮＡ）をコードする核酸は、酵素からのインテインの翻訳後切除時に、第１及び第２の部分が機能的酵素に融合されるように、第１の部分と第２の部分との間にインテインがコードされている第１及び第２の部分の形態で酵素をコードする。記載の方法は、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する。また、いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝性または後天性の疾患を、それを必要とする患者において治療するために使用される。
実施形態では、本開示の方法によって形質転換された細胞を含み得るトランスジェニック生物が提供される。実施形態では、生物は、哺乳動物または昆虫であってもよい。生物が哺乳動物である場合、生物には、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギなどが含まれ得るが、これらに限定されない。生物が昆虫である場合、生物には、ミバエ、蚊、ボールワーム（ｂｏｌｌｗｏｒｍ）などが含まれ得るが、これらに限定されない。
組成物は、容器、キット、パック、またはディスペンサーに、投与のための説明書とともに含まれ得る。
また本明細書では、ｉ）本発明の前述の遺伝子導入構築物のうちのいずれか、及び／または前述の本発明の細胞のうちのいずれか、ならびにｉｉ）容器を含むキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、その使用のための説明書をさらに含む。ある特定の実施形態では、前述のキットのうちのいずれも、トランスポザーゼをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物をさらに含むことができる。
実施形態では、本開示の実施形態による組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、薬学的組成物の形態である。「薬学的に許容される担体」（「賦形剤」または「担体」とも称される）は、１つ以上の治療用化合物を対象（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳動物）に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、安定化剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであり、これは、用いられる投与量及び濃度で、それに曝露されている細胞または対象に対して無毒である。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、所与の薬学的組成物の１つ以上の治療用化合物及び任意の他の成分と組み合わされたときに、所望の嵩、粘度、及び他の適切な輸送及び化学的特性を提供するように、念頭に計画された投与の様式で選択され得る。アミノ酸と有害に反応しない典型的な薬学的に許容される担体としては、例として、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体にはまた、ｐＨ緩衝水溶液またはリポソーム（薬物の哺乳動物への送達に有用である、様々な種類の脂質、リン脂質、及び／または界面活性剤で構成される小胞）も含まれる。薬学的に許容される担体のさらなる例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
薬学的組成物は、１つ以上の活性剤と、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、及び／またはアジュバント、ならびに任意選択で、通常、改善された導入、送達、忍容性などをもたらすために製剤に組み込まれる他の薬剤とを混合することによって製剤化され得る。薬学的組成物は、例えば、凍結乾燥製剤、水溶液、分散液、または固体調製物、例えば、錠剤、糖衣錠、またはカプセル中で製剤化することができる。多くの適切な製剤は、全ての製薬化学者に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））、特にその中のＢｌｏｃｋ，Ｌａｗｒｅｎｃｅによる第８７章に見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクルを含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。前述の混合物のうちのいずれも、製剤中の活性薬剤が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路と生理学的に適合し、許容可能であることを条件として、本明細書に記載の治療及び療法において適切であり得る。また、製薬化学者に周知の製剤、賦形剤、及び担体に関する追加情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ，Ｒｅｇｕｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３２：２１０－２１８，２０００、Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０３：１－６０，２０００、Ｃｈａｒｍａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８９：９６７－９７８，２０００、及びＰｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１，１９９８）、及びそれらの引用も参照されたい。
薬学的組成物には、限定されないが、溶液、乳剤、水性懸濁液、及びリポソーム含有製剤が含まれる。これらの組成物は、例えば、予め形成された液体、自己乳化固体、及び自己乳化半固体を含む種々の成分から生成することができる。エマルションは、しばしば、互いに密接に混合及び分散した２つの不混和液相を含む二相系であり、一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）のいずれかの種類である。エマルション製剤は、それらの製剤化の容易さ及び可溶化、吸収、及びバイオアベイラビリティの有効性により、治療薬の経口送達に広く使用されている。
組成物及び製剤は、滅菌水溶液を含み得、これは、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容される担体）も含み得る。組成物は、薬学的組成物に従来見出される他の補助成分を追加的に含有することができる。したがって、組成物はまた、例えば、痒み止め剤、収縮剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤などの適合性の薬学的活性材料、または染料、香味剤、保存剤、抗酸化剤、不透明剤、増粘剤、及び安定剤などの、本明細書で提供される組成物の様々な剤形の物理的製剤化に有用な追加の材料を含むことができる。さらに、組成物は、補助剤、例えば、滑沢剤剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香料、及び芳香族物質と混合することができる。しかしながら、添加されるとき、そのような材料は、本明細書で提供される組成物内のポリペプチド成分の生物活性を不当に妨げてはならない。製剤は、所望される場合、滅菌することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物を含む薬学的組成物は、少なくとも部分的に、注射用懸濁液を作製するために、希釈剤を伴うまたは伴わない溶液または粉末の形態であってもよい。組成物は、限定されないが、例えば、生理食塩水、水、乳酸、マンニトール、またはそれらの組み合わせなどの薬学的に許容されるビヒクルを含む追加の成分を含み得る。
任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の組成物を哺乳動物に投与することができる。投与は、例えば、非経口（例えば、皮下、くも膜下腔内、脳室内、筋肉内、もしくは腹腔内注射によって、または静脈内点滴によって）であり得る。投与は、迅速（例えば、注射による）であり得るか、またはある期間にわたって（例えば、ゆっくりとした注入もしくはゆっくりとした放出製剤の投与によって）行われ得る。いくつかの実施形態では、投与は、局所（例えば、経皮的、舌下的、眼科的、もしくは鼻腔内）、肺（例えば、粉末もしくはエアゾルの吸入もしくは吹送による）、または経口であり得る。加えて、本明細書に記載の組成物を含有する組成物は、腫瘍の外科的切除の前、後、またはその代わりに投与され得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例１－ヒトゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）を標的とする、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを用いたキメラトランスポザーゼの設計
この実施例では、ヒトＧＳＨＳ ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤを使用して、キメラトランスポザーゼを設計した。図１Ａ～１Ｄ及び図２は、ヒトＧＳＨＳ ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤを使用して設計されたキメラトランスポザーゼの表現を示す。図１Ａ．ＴＡＬＥは、転写活性化因子として機能するために核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。中央タンデム反復ドメインが、特異的なＤＮＡ結合及び宿主特異性を付与する。ＤＮＡ結合の開始及び５’－Ｔ０の認識に必要な転移シグナル（ＴＤ）及び４つの暗号反復が、Ｎ末端に位置する（チェック模様の長方形）。ＣＲＤ内の各３４アミノ酸（ａａ）長の反復は、主に１３位のａａによって決定される特異性を有する１つのヌクレオチドに結合する。１つのサンプル反復を、タンパク質スキームの下に示す。数字１２／１３は、反復内のａａ位置を指す。Ｊａｎｋｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１４；１３：４０９－１９を参照されたい。図１Ｂ．１つまたは複数のヌクレオチドに対する特異性を有する反復型が示されている。ＤＮＡリーディング鎖の塩基のみが示される。図１Ｃ．２３アミノ酸長を超えるリンカーによってそれに融合したＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質を有するキメラトランスポザーゼ（上）。Ｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ（Ｏｘｆ）２０１９；４：ｙｓｚ０１８を参照されたい。図１Ｄ．ＴＡＬＥのＧＳＨＳへの結合は、トランスポザーゼを同じ位置に物理的に隔離し、反復可変二残基（ＲＶＤ）ヌクレオチド配列の近くの近傍ＴＴＡＡ（配列番号１）配列への転位を促進する。全てのＲＶＤには、図１Ａに示されるＮＴＲに結合するチミン（Ｔ）が先行する。これらのＧＳＨＳ領域は全てオープンクロマチンであり、トランスポザーゼ活性の影響を受けやすい）。
この実施例では、ヒトＧＳＨＳ ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤを使用して、キメラトランスポザーゼを設計した。図１Ａ～１Ｄ及び図２は、ヒトＧＳＨＳ ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＢＤを使用して設計されたキメラトランスポザーゼの表現を示す。図１Ａ．ＴＡＬＥは、転写活性化因子として機能するために核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。中央タンデム反復ドメインが、特異的なＤＮＡ結合及び宿主特異性を付与する。ＤＮＡ結合の開始及び５’－Ｔ０の認識に必要な転移シグナル（ＴＤ）及び４つの暗号反復が、Ｎ末端に位置する（チェック模様の長方形）。ＣＲＤ内の各３４アミノ酸（ａａ）長の反復は、主に１３位のａａによって決定される特異性を有する１つのヌクレオチドに結合する。１つのサンプル反復を、タンパク質スキームの下に示す。数字１２／１３は、反復内のａａ位置を指す。Ｊａｎｋｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１４；１３：４０９－１９を参照されたい。図１Ｂ．１つまたは複数のヌクレオチドに対する特異性を有する反復型が示されている。ＤＮＡリーディング鎖の塩基のみが示される。図１Ｃ．２３アミノ酸長を超えるリンカーによってそれに融合したＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質を有するキメラトランスポザーゼ（上）。Ｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ（Ｏｘｆ）２０１９；４：ｙｓｚ０１８を参照されたい。図１Ｄ．ＴＡＬＥのＧＳＨＳへの結合は、トランスポザーゼを同じ位置に物理的に隔離し、反復可変二残基（ＲＶＤ）ヌクレオチド配列の近くの近傍ＴＴＡＡ（配列番号１）配列への転位を促進する。全てのＲＶＤには、図１Ａに示されるＮＴＲに結合するチミン（Ｔ）が先行する。これらのＧＳＨＳ領域は全てオープンクロマチンであり、トランスポザーゼ活性の影響を受けやすい）。
図２は、転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸（例えば、ヘルパーＲＮＡ）と、トランスポザーゼ（ドナーＤＮＡ）をコードする核酸とを含む、本開示の実施形態による系の非限定的な表現である。ヘルパーＲＮＡは、特定の末端を認識し、フットプリントを伴わない部位特異的な方法でドナーＤＮＡをヒトゲノムにシームレスに挿入する、生物工学的酵素（例えば、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼ）に翻訳される。酵素は、オープンクロマチンで二量体または四量体を形成して、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡまたはＴＡＬＥによって標的とされるＤＮＡ結合領域の近くのＴＴＡＡ（配列番号１）認識部位にドナーＤＮＡを挿入することができる。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡのＴＡＬＥ ＧＳＨＳへの結合は、酵素を同じ位置に物理的に隔離し、近傍のＴＴＡＡ（配列番号１）配列への転位を促進する（図３及び図４を参照されたい）。
図１Ｃはまた、１つ以上のガイドＲＮＡに連結されたｄＣａｓ９を含むキメラトランスポザーゼ構築物を示す（下）。操作されたキメラトランスポザーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化Ｃａｓタンパク質を含み得る。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合に必要な足場配列、及び修飾されるゲノム標的を定義するユーザ定義の約２０ヌクレオチドスペーサーで構成される短い合成ＲＮＡである。したがって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的は、ｇＲＮＡに存在する配列に基づく。図４は、トランスポザーゼをＧＳＨＳに物理的に隔離し、近傍のＴＴＡＡ（配列番号１）配列への転位を促進するｇＲＮＡ配列を示す。
図８Ａ～８Ｄは、構築物テンプレートの例を示す。図８Ａは、５’－ｍ７Ｇキャップ１及びプソイドウリジン置換で後に処理されるトランスポザーゼＲＮＡを転写するプラスミド構築物テンプレートを示す。他のトランスポザーゼを置換することができる。図８Ｂは、任意の導入遺伝子の導入に使用することができる（一般的な）ＭＬＴドナーＤＮＡ構築物テンプレートを示す。他のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ及びトランスポザーゼを置換することができる。
実施例２－Ｍ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ ＭＬＴトランスポザーゼ及びその超活性形態の転位活性を特性評価する
この研究は、部分的には、単量体、二量体、四量体、超活性体、及びＩｎｔ－形態のＭ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ（ＭＬＴ）トランスポザーゼを含む、ＭＬＴトランスポザーゼの転位活性を機能的に特性評価することを目的とする。本開示において発見された、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ変異を有するＭＬＴトランスポザーゼタンパク質は、本開示に従って操作され、補正されたＭＬＴトランスポザーゼと称され得る。
この研究は、部分的には、単量体、二量体、四量体、超活性体、及びＩｎｔ－形態のＭ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ（ＭＬＴ）トランスポザーゼを含む、ＭＬＴトランスポザーゼの転位活性を機能的に特性評価することを目的とする。本開示において発見された、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａ変異を有するＭＬＴトランスポザーゼタンパク質は、本開示に従って操作され、補正されたＭＬＴトランスポザーゼと称され得る。
図５Ａ及び５Ｂは、ＭＬＴトランスポザーゼＤＮＡ及びＭＬＴトランスポザーゼタンパク質から超活性、切除陽性、及び組み込み欠損（Ｉｎｔ－）ＭＬＴ変異体を示す。各変異体について、図５Ａは、配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされる、非変異野生型ＭＬＴトランスポザーゼに対するヌクレオチド変化及び対応するアミノ酸変化を示す。図５Ｂは、ＭＬＴトランスポザーゼ骨格における変異及び様々なＭＬＴ変異体（１、２、及び３）を示す。
図６Ａは、ＤＮＡ結合ドメイン（赤色）を示す１００％の信頼度を有する三次元ＭＬＴタンパク質構造を示す。三次元ＭＬＴタンパク質構造は、Ｐｈｙｒｅ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ＡｎａｌｏｇＹ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅ）、Ｋｅｌｌｅｙ ＬＡ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １０，８４５－８５８（２０１５）を使用して生成される。図６Ｂは、Ｐｈｙｒｅ２を使用したＭＬＴの二次構造予測を示す。
図７は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ」）トランスポザーゼの、ＭＬＴ（「Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ」）トランスポザーゼ（２つの異なる配列）、ならびにコウモリトランスポザーゼＭｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ（４つの異なる配列）及びＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓに対するアミノ酸配列アラインメントを示す。配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｅｂｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌｕｍｅ ５８３，ｐａｇｅｓ ５７８－５８４（２０２０）から得られた。図７において、（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈからの）ＳｎａｐＧｅｎｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して生成されたアラインメントは、コンセンサス配列に対するものである。参照（コンセンサス）に一致するアミノ酸、すなわち、高度に保存された哺乳類トランスポザーゼ配列は、黄色の強調表示でマークされる。コンセンサスしきい値は、５０％を超える。
この実施例では、図３、４、及び７に示される配列、または任意の他の配列を、部位特異的ＴＡＬＥまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを有するゲノムセーフハーバー部位を標的とするための候補を同定するために、ＭＬＴ変異体の様々な組み合わせを試験する際に使用する。超活性、切除陽性、またはＩｎｔ－ＭＬＴ変異体が、本明細書に記載のＭＬＴトランスポザーゼ、例えば、ヌクレオチド及びアミノ酸配列において、図５Ａ及び５Ｂの変異を置換することによって、合成ＤＮＡ合成によって生成され得る。
この実施例では、例えば、国際出願第ＷＯ２０１００８５６９９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の実施例８に記載される遺伝子アッセイを使用して、Ｕｒａ＋復帰変異の頻度の増加についてスクリーニングすることができる。遺伝子アッセイは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＭＬＴの切除のために、修飾バージョンの酵母ＵＲＡ３遺伝子をトランスポゾンドナーとして使用する。
実施例３－本開示のｐｉｇｇｙＢａｃ、野生型ＭＬＴトランスポザーゼ、及び操作されたＭＬＴトランスポザーゼの組み込み効率を特性評価する
この研究の目標は、公開されたソースからのものを含む、既知の超活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの組み込み効率、及び本開示に従って操作されたＭＬＴトランスポザーゼの組み込み効率を評価することであった。野生型Ｍｙｏｔｉｓ Ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ）配列は、（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１８７１の）ＷＯ２０１０／０８５６９９公開及びＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３；１１０：２３４に記載された。Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）のトランスポザーゼのヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を有する本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（「ＭＬＴ」と称される）に対して７７％の配列同一性を有する。超活性ＭＬＴ（ＲＮＡについてヒトコドン最適化された）及びＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）から公開された配列（同一性７７．６７％、ギャップ１．４４％）のヌクレオチド配列アラインメントを示す、図１０を参照されたい。ＭＬＴのヌクレオチド配列及びＷＯ２０１００８５６９９からのヌクレオチド配列は、それらのアラインメントを含有する図１１に示されるように、７３．６８％の同一性（ギャップ１．１６％）を有する。
この研究の目標は、公開されたソースからのものを含む、既知の超活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの組み込み効率、及び本開示に従って操作されたＭＬＴトランスポザーゼの組み込み効率を評価することであった。野生型Ｍｙｏｔｉｓ Ｌｕｃｉｆｕｇｕｓトランスポザーゼ（ＭＬＴ）配列は、（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１８７１の）ＷＯ２０１０／０８５６９９公開及びＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３；１１０：２３４に記載された。Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）のトランスポザーゼのヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を有する本開示のＭＬＴトランスポザーゼ（「ＭＬＴ」と称される）に対して７７％の配列同一性を有する。超活性ＭＬＴ（ＲＮＡについてヒトコドン最適化された）及びＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）から公開された配列（同一性７７．６７％、ギャップ１．４４％）のヌクレオチド配列アラインメントを示す、図１０を参照されたい。ＭＬＴのヌクレオチド配列及びＷＯ２０１００８５６９９からのヌクレオチド配列は、それらのアラインメントを含有する図１１に示されるように、７３．６８％の同一性（ギャップ１．１６％）を有する。
さらに、本開示の操作されたＭＬＴトランスポザーゼの末端配列は、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって参照されるものとは異なる（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８；１８：７１７を参照されたい）。図１４及び図１５は、Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８からの公開された配列の左端及び右端と比較した、操作されたＭＬＴトランスポザーゼの左端及び右端を示す。
図１２は、操作された超活性ＭＬＴトランスポザーゼ（Ｓ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異を有する、Ｌ５７３ｄｅｌ／Ｅ５７４ｄｅｌ／Ｓ２Ａ、「ＭＬＴ」）とＭｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．によって公開された配列とのアミノ酸アラインメントを示す（アミノ酸配列間の差異は、下線を付けて太字で示される）。図１２に示されるように、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．からのアミノ酸配列は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼと比較して、２つの余分なＣ末端アミノ酸を含有していた。
図１３は、操作された超活性ＭＬＴトランスポザーゼ（Ｓ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異を有する、Ｌ５７３ｄｅｌ／Ｅ５７４ｄｅｌ／Ｓ２Ａ、「ＭＬＴ」）とＷＯ２０１００８５６９９からの公開された配列とのアミノ酸アラインメントを示す（アミノ酸配列間の差異は、下線を付けて太字で示される）。ＷＯ２０１００８５６９９公開からの配列は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼのアミノ酸配列と比較して、複数のアミノ酸残基変化を有していた。ＷＯ２０１００８５６９９は、図１３に示されるような配列におけるアミノ酸変化、Ａ１４Ｖ、Ｄ４７５Ｇ、Ｐ４９１Ｑ、Ａ５６１Ｔ、Ｔ５４６Ｔ、Ｔ３００Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ａ５２０Ｔ、Ｇ２３９Ｓ、Ｓ５Ｐ、Ｓ８Ｆ、Ｓ５４Ｎ、Ｄ９Ｎ、Ｄ９Ｇ、Ｉ３４５Ｖ、Ｍ４８１Ｖ、Ｅ１１Ｇ、Ｋ１３０Ｔ、Ｇ９Ｇ、Ｒ４２７Ｈ、Ｓ８Ｐ、Ｓ３６Ｇ、Ｄ１０Ｇ、Ｓ３６Ｇ、及びサイレントから選択されるアミノ酸変化を含む、超活性トランスポザーゼ酵素について記載した。
図９Ａ及び９Ｂは、本開示の操作されたＭＬＴトランスポザーゼ及び他の（既知の）トランスポザーゼの組み込み効率の評価の結果を示す棒グラフである。図９Ａは、ＭＬＴドナー（ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＤＮＡドナー構築物テンプレートの例を示す図１６を参照されたい）とともに使用された本開示の操作されたＭＬＴトランスポザーゼ（Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ／Ｓ２Ａ／Ｌ５７３ｄｅｌ／Ｅ５７４ｄｅｌ ＭＬＴ）に対して、ｐｉｇｇｙＢａｃドナー（ＣＭＶ－ＧＦＰ、図１５を参照されたい）とともに使用されたＹｕｓａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１０；１０８：１５３１－１５３６からの超活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの組み込み効率（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６Ｄを参照されたい）を示す。
図９Ａ及び図９Ｂ（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）から、Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５３８Ｋ、及びＮ５７１Ｓ変異を有し、太字及び下線を付けて示される）に示される研究で使用される超活性ｐｉｇｇｙＢａｃアミノ酸配列は、以下の通りである。
図９Ａ及び図９Ｂに示される研究で使用した超活性ｐｉｇｇｙＢａｃヌクレオチド配列（変異したコドンは、下線を付けて太字で示される）は、以下の通りである。
図９Ａ及び図９Ｂに示される研究で使用した超活性ｐｉｇｇｙＢａｃの左ＩＴＲヌクレオチド配列（２０５ｂｐ）は、以下の通りである。
図９Ａ及び図９Ｂに示される研究で使用した超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ右ＩＴＲヌクレオチド配列（３１０ｂｐ）は、以下の通りである。
図９Ａに示されるように、本開示のＭＬＴトランスポザーゼは、Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）からのトランスポザーゼよりも優れた組み込み効率を有していた。本発明者らは、最後の２つのアミノ酸（Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ）を含まないトランスポザーゼ配列が、それらの末端アミノ酸が存在するトランスポザーゼよりも高い効率を有することを発見した。
図９Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃ変異体の組み込み効率と比較した、本開示の操作されたＭＬＴの組み込み効率を示す。図９Ｂは、ａ）超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）から、配列番号１７、１８、１９、及び２０を参照されたい）＋ｐｉｇｇｙＢａｃドナー（図１６を参照されたい）、ｂ）超活性ｐｉｇｇｙＢａｃドナーのみ（図１６を参照されたい）、ｃ）ＭＬＴドナーのみ（図１６を参照されたい）、ｄ）野生型ＭＬＴ＋ＭＬＴドナー、ｅ）ＭＬＴ Ｎ１２５Ｋ＋ＭＬＴドナー、ｆ）ＭＬＴ Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ＋ＭＬＴドナー、ｇ）本開示の操作されたＭＬＴ（ＭＬＴ Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ／ Ｌ５７３ｄｅｌ／Ｅ５７４ｄｅｌ）＋ＭＬＴドナー、ならびにｈ）超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ二量体＋ｐｉｇｇｙＢａｃドナーについての組み込み効率のパーセントを示す。超活性ｐｉｇｇｙＢａｃドナー（ｂ）及びＭＬＴドナー（ｃ）を対照として使用した。図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、本開示の操作されたＭＬＴは、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ＋ｐｉｇｇｙＢａｃドナー系に匹敵する組み込み効率を有する。
実施例４－ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞における超活性ＭＬＴトランスポザーゼバリアントのインビトロ分析
この研究は、本開示による哺乳類トランスポザーゼ（ＭＬＴトランスポザーゼ）における新規の変異の発見を示し、超活性変異体を、それらの相対的組み込み効率について評価することによって、その切除能（Ｅｘｃ＋）を向上させる。この研究では、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞における超活性ＭＬＴトランスポザーゼ変異体の解析について詳述する。
この研究は、本開示による哺乳類トランスポザーゼ（ＭＬＴトランスポザーゼ）における新規の変異の発見を示し、超活性変異体を、それらの相対的組み込み効率について評価することによって、その切除能（Ｅｘｃ＋）を向上させる。この研究では、ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３細胞における超活性ＭＬＴトランスポザーゼ変異体の解析について詳述する。
哺乳類細胞組み込みアッセイのためのＤＮＡ。
ＧＦＰ遺伝子及びブラスチジン耐性（ＢｓｄＲ）カセットを担持するトランスポゾンを含むドナープラスミド、ならびに転位を測定するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下でトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドを使用した、２つのプラスミド転位アッセイ。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃドナープラスミドは、ＺｅｏＣａｓｓｅｔｔｅ（商標）ベクター（ｐＣＭＶ／Ｚｅｏ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）骨格内の末端配列に隣接する、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ及びＢｓｄＲカセットを含有していた。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃヘルパープラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ Ｈｉｓ Ａ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたｐｉｇｇｙＢａｃ ＯＲＦを含有していた。ＭＬＴドナープラスミドについて、昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃ哺乳類ドナーｐＣＭＶ／ｍｉｎｉＰＢ－ＧＦＰ－ＢｓｄからのＧＦＰ－Ｂｓｄカセットを、特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅させた。断片を消化し、ＭＬＴドナープラスミドにクローニングした。ＭＬＴ哺乳類ヘルパープラスミドでは、酵素をＨＡタグでタグ付けした。ＭＬＴ ＯＲＦを、遺伝子の５’末端からのプライマー及び遺伝子の３’末端からのプライマーを用いて、プラスミドからＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ生成物を消化し、プラスミドにクローニングした。推定触媒ドメインにおける様々な変異を合成し、評価した。
ＧＦＰ遺伝子及びブラスチジン耐性（ＢｓｄＲ）カセットを担持するトランスポゾンを含むドナープラスミド、ならびに転位を測定するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下でトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドを使用した、２つのプラスミド転位アッセイ。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃドナープラスミドは、ＺｅｏＣａｓｓｅｔｔｅ（商標）ベクター（ｐＣＭＶ／Ｚｅｏ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）骨格内の末端配列に隣接する、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ及びＢｓｄＲカセットを含有していた。昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃヘルパープラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ Ｈｉｓ Ａ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたｐｉｇｇｙＢａｃ ＯＲＦを含有していた。ＭＬＴドナープラスミドについて、昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃ哺乳類ドナーｐＣＭＶ／ｍｉｎｉＰＢ－ＧＦＰ－ＢｓｄからのＧＦＰ－Ｂｓｄカセットを、特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅させた。断片を消化し、ＭＬＴドナープラスミドにクローニングした。ＭＬＴ哺乳類ヘルパープラスミドでは、酵素をＨＡタグでタグ付けした。ＭＬＴ ＯＲＦを、遺伝子の５’末端からのプライマー及び遺伝子の３’末端からのプライマーを用いて、プラスミドからＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ生成物を消化し、プラスミドにクローニングした。推定触媒ドメインにおける様々な変異を合成し、評価した。
哺乳類細胞組み込みアッセイ。
ＨｅＬａ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋ペニシリン－ストレプトマイシン中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞（２×１０５）を、製造業者のプロトコルに従って、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＦｕＧＥＮＥ－ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）とともに、ドナー（２９４ｎＭ）及びヘルパー（４２ｎＭ）プラスミドでトランスフェクトした。ドナープラスミド及び空のｐＣＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ Ａでトランスフェクトした細胞は、非トランスポザーゼ対照であった。トランスフェクションの４６時間後、細胞をトリプシン処理し、上記のような適切なＤＭＥＭ＋ブラスチジン（３．５μｇ／ｍＬ）中で段階希釈した。抗生物質を含む新鮮な培地を２４時間ごとに投与し、２１日間継続した。２１日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％メチレンブルーで染色し、青色コロニーをカウントした。
ＨｅＬａ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋ペニシリン－ストレプトマイシン中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞（２×１０５）を、製造業者のプロトコルに従って、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＦｕＧＥＮＥ－ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）とともに、ドナー（２９４ｎＭ）及びヘルパー（４２ｎＭ）プラスミドでトランスフェクトした。ドナープラスミド及び空のｐＣＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ Ａでトランスフェクトした細胞は、非トランスポザーゼ対照であった。トランスフェクションの４６時間後、細胞をトリプシン処理し、上記のような適切なＤＭＥＭ＋ブラスチジン（３．５μｇ／ｍＬ）中で段階希釈した。抗生物質を含む新鮮な培地を２４時間ごとに投与し、２１日間継続した。２１日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％メチレンブルーで染色し、青色コロニーをカウントした。
結果
図１７Ａ及び１７Ｂは、ＨｅＬａ細胞における超活性ＭＬＴトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。図１７Ａは、哺乳類トランスポザーゼ（Ｔｓ）バリアントＳ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、Ｎ１２５Ｋ、及びＳ８Ｐ／Ｃ１３Ｒが、ネイティブ酵素よりも高い切除及び組み込み頻度を有することを示す。図１７Ｂは、ドナーネオマイシン導入遺伝子、１：２０の連続希釈物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における機能的導入遺伝子発現を示す。哺乳類ＭＬＴトランスポザーゼバリアントＳ８Ｐ／Ｃ１３Ｒは、ＨｅＬａ細胞における昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃと同等の相対的組み込みを示した。
図１７Ａ及び１７Ｂは、ＨｅＬａ細胞における超活性ＭＬＴトランスポザーゼ変異体の機能評価の結果を示す。図１７Ａは、哺乳類トランスポザーゼ（Ｔｓ）バリアントＳ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、Ｎ１２５Ｋ、及びＳ８Ｐ／Ｃ１３Ｒが、ネイティブ酵素よりも高い切除及び組み込み頻度を有することを示す。図１７Ｂは、ドナーネオマイシン導入遺伝子、１：２０の連続希釈物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における機能的導入遺伝子発現を示す。哺乳類ＭＬＴトランスポザーゼバリアントＳ８Ｐ／Ｃ１３Ｒは、ＨｅＬａ細胞における昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃと同等の相対的組み込みを示した。
図１８は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＭＬＴトランスポザーゼ超活性変異体の相対的組み込み頻度を示す。二重変異体Ａ／Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞において最も高い組み込み効率が観察されたことを示す。
ＭＬＴトランスポザーゼは、ヒト培養ＨｅＬａ及びＨＥＫ２９３において正常に転位した。ドナープラスミドが抗生物質耐性マーカー及びトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドを含むトランスポゾンを担持し、トランスポゾン抗生物質マーカーのトランスポザーゼ依存性染色体組み込みを測定する、２プラスミドコトランスフェクションアッセイを使用した。超活性ＭＬＴトランスポザーゼを使用した組み込みの相対頻度は、ＨｅＬａ細胞（図１７Ａ及び１７Ｂ）における昆虫野生型及び超活性ｐｉｇｇｙＢａｃに匹敵したが、ＨＥＫ２９３細胞（図１８）では約５０％であったことが分かった。
本研究では、哺乳類ＭＬＴトランスポザーゼ超活性バリアントＤ及びＡ／Ｃの相対的組み込み効率は、ＨｅＬａ細胞における昆虫ｐｉｇｇｙＢａｃに匹敵した。これらのバリアントはまた、ＨＥＫ２９３細胞において組み込み超活性を示した。
実施例５－ＭＬＴトランスポザーゼタンパク質の単離及び精製
この研究の目標は、ＭＬＴトランスポザーゼタンパク質を単離することであった。
この研究の目標は、ＭＬＴトランスポザーゼタンパク質を単離することであった。
タンパク質の発現及び精製
本開示の完全長ＭＬＴトランスポザーゼの遺伝子を、哺乳類発現についてコドン最適化し、Ｎ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグの下流の、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が続くＢａｍＨＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間のｐＤ２６１０発現ベクターにクローニングした。プラスミドｐＤ２６１０－ＭＰＢ－ＭＬＴトランスポザーゼは、標準的なＰＥＩトランスフェクションプロトコルを使用して、一過性のタンパク質発現のために、５００ｍＬのＥＸＰＩ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞に、１ＬのＥｘｐｉ２９３発現培地を２４時間後に供給した。細胞を、トランスフェクションの３日後に３００×ｇで採取し、－８０℃で保存した。ＭＢＰタグ付きＭＬＴトランスポザーゼを発現する細胞を、２５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を、３サイクルの超音波処理によって溶解した。細胞溶解物を約９５，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心分離器、タイプ４５Ｔｉローター）。上清を濾過し、溶解緩衝液で平衡化した１０ｍＬのアミロース樹脂（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と混合した。１時間の連続回転後、混合物を重力流カラムに充填し、１００ｍＬの溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を５０ｍＬの溶出緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのマルトース、１ｍＭのＴＣＥＰ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶出した。溶出液をＴＥＶプロテアーゼとともにインキュベートし、透析緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＴＣＥＰ）に対して４℃で１６～２０時間透析した。切断されたＭＢＰタグ及びＭＬＴトランスポザーゼをヘパリン溶出から分離した。オートサンプラーを装備し、ＵＮＩＣＯＲＮシステム制御ソフトウェアとともにインストールされたＡＫＴＡシステムに接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上のサンプル体積。溶出したタンパク質を、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで監視した。データ分析には、ＱｔｉＰｌｏｔソフトウェアを使用した。精製したＭＬＴトランスポザーゼを－８０℃で保存した。収率は、２．２ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／Ｌの細胞培養で０．４５ｍＬであった。
本開示の完全長ＭＬＴトランスポザーゼの遺伝子を、哺乳類発現についてコドン最適化し、Ｎ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグの下流の、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が続くＢａｍＨＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間のｐＤ２６１０発現ベクターにクローニングした。プラスミドｐＤ２６１０－ＭＰＢ－ＭＬＴトランスポザーゼは、標準的なＰＥＩトランスフェクションプロトコルを使用して、一過性のタンパク質発現のために、５００ｍＬのＥＸＰＩ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞に、１ＬのＥｘｐｉ２９３発現培地を２４時間後に供給した。細胞を、トランスフェクションの３日後に３００×ｇで採取し、－８０℃で保存した。ＭＢＰタグ付きＭＬＴトランスポザーゼを発現する細胞を、２５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を、３サイクルの超音波処理によって溶解した。細胞溶解物を約９５，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心分離器、タイプ４５Ｔｉローター）。上清を濾過し、溶解緩衝液で平衡化した１０ｍＬのアミロース樹脂（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と混合した。１時間の連続回転後、混合物を重力流カラムに充填し、１００ｍＬの溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質を５０ｍＬの溶出緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのマルトース、１ｍＭのＴＣＥＰ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶出した。溶出液をＴＥＶプロテアーゼとともにインキュベートし、透析緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＴＣＥＰ）に対して４℃で１６～２０時間透析した。切断されたＭＢＰタグ及びＭＬＴトランスポザーゼをヘパリン溶出から分離した。オートサンプラーを装備し、ＵＮＩＣＯＲＮシステム制御ソフトウェアとともにインストールされたＡＫＴＡシステムに接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上のサンプル体積。溶出したタンパク質を、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで監視した。データ分析には、ＱｔｉＰｌｏｔソフトウェアを使用した。精製したＭＬＴトランスポザーゼを－８０℃で保存した。収率は、２．２ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／Ｌの細胞培養で０．４５ｍＬであった。
結果
図１９Ａ及び１９Ｂは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。図１９Ａは、アミロース樹脂カラムによる精製されたＭＢＰ－ＭＬＴトランスポザーゼ融合タンパク質の分析を示す。アミロース樹脂のカラム上で超音波処理された細菌の上清から発現されたタンパク質（ＭＢＰ－ＭＬＴトランスポザーゼ）を精製した後、１００＋ｋＤａの主要なタンパク質バンドを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。図１９Ｂでは、ＴＥＶプロテアーゼ及びヘパリン溶出によるＭＢＰタグの一晩の切断後に、６７．５ｋＤａのＭＬＴトランスポザーゼ特異的バンドが示された。
図１９Ａ及び１９Ｂは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の画像を示す。図１９Ａは、アミロース樹脂カラムによる精製されたＭＢＰ－ＭＬＴトランスポザーゼ融合タンパク質の分析を示す。アミロース樹脂のカラム上で超音波処理された細菌の上清から発現されたタンパク質（ＭＢＰ－ＭＬＴトランスポザーゼ）を精製した後、１００＋ｋＤａの主要なタンパク質バンドを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。図１９Ｂでは、ＴＥＶプロテアーゼ及びヘパリン溶出によるＭＢＰタグの一晩の切断後に、６７．５ｋＤａのＭＬＴトランスポザーゼ特異的バンドが示された。
ＭＢＰ ＭＬＴトランスポザーゼ融合タンパク質の親和性クロマトグラフィーを、アミロースアガロース樹脂、続いてステップ溶出で実施した。装填したサンプル、フロースルー、洗浄、及び溶出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、ＭＢＰ－ＭＬＴトランスポザーゼ精製タンパク質を含有するプールピーク画分を示した（図１９Ａ）。ＭＬＴトランスポザーゼを、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって、６６～６８ｋＤのサイズを有するヘパリン溶出によりＭＢＰタグから分離した（図１９Ｂ）。
図２０は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィーを示す。精製されたＭＬＴトランスポザーゼの試料体積を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに装填した。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの溶出されたタンパク質ピークは、二量体形成を示唆する。したがって、クロマトグラフィープロファイルは、ＭＬＴトランスポザーゼが二量体として存在することを示す（図２０）。
この研究は、ＤＮＡ結合タンパク質が、融合タンパク質として産生され、より特異的な精製を可能にし得るが、ＤＮＡと結合するそれらの能力はまた、ヘパリンをリガンドとして使用して親和性精製を可能にすることを実証した。この研究はまた、本開示のＭＬＴトランスポザーゼが、二量体として存在するおよそ６７．５ｋＤの分子量を有するＤＮＡ結合タンパク質であることを示した。
実施例６－ＭＬＴトランスポザーゼとＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼとの間の組み込みプロファイルの差異を評価する
この研究の目的は、本開示の昆虫由来のＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼと非特異的な哺乳動物由来のＭＬＴトランスポザーゼとの間の組み込みパターンの差異を評価することであった。比較には、分子サイズ、タンパク質長、認識末端、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子内の組み込み、±５ｋｂ転写開始部位、ＣｐＧアイランドから±５ｋｂ、及び免疫原性の比較が含まれた。ＤＮＡ ＭＬＴヘルパー構築物の例を図２１に示す。
この研究の目的は、本開示の昆虫由来のＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼと非特異的な哺乳動物由来のＭＬＴトランスポザーゼとの間の組み込みパターンの差異を評価することであった。比較には、分子サイズ、タンパク質長、認識末端、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子内の組み込み、±５ｋｂ転写開始部位、ＣｐＧアイランドから±５ｋｂ、及び免疫原性の比較が含まれた。ＤＮＡ ＭＬＴヘルパー構築物の例を図２１に示す。
一般に、ＤＮＡとして送達されたときのＭＬＴトランスポザーゼ及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、表１に示されるように、組み込み及び分子特性において類似している。
本明細書で行われた比較は、ＤＮＡとして送達されたときのＭＬＴ及びｐｉｇｇｙＢａｃが類似の特徴を有することを示した。表１の比較はまた、ＭＬＴトランスポザーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼよりも安全であり、したがって、組み込み中に望ましくない遺伝子の破壊または活性化を引き起こす可能性が低いことを示す。
実施例７－超活性ＭＬＴトランスポザーゼと超活性ｐｉｇｇｙＢａｃの組み込み効率の比較
この研究の目的は、本開示に従って、昆虫由来のＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）（Ｉ３０Ｖ／Ｇ１６５Ｓ、Ｓ１０３Ｐ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ／Ｎ５７０Ｓ、Ｎ５３８Ｋ）及び超活性非特異的哺乳類由来トランスポザーゼ、ＭＬＴトランスポザーゼ（Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ変異を伴う）の最も超活性な形態の組み込み効率差を評価することであった。
この研究の目的は、本開示に従って、昆虫由来のＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）（Ｉ３０Ｖ／Ｇ１６５Ｓ、Ｓ１０３Ｐ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ／Ｎ５７０Ｓ、Ｎ５３８Ｋ）及び超活性非特異的哺乳類由来トランスポザーゼ、ＭＬＴトランスポザーゼ（Ｓ８Ｐ／Ｃ１３Ｒ変異を伴う）の最も超活性な形態の組み込み効率差を評価することであった。
超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｈｙｐＰＢ）トランスポザーゼ酵素［Ｉ３０Ｖ／Ｇ１６５Ｓ、Ｓ１０３Ｐ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ／Ｎ５７０Ｓ、Ｎ５３８Ｋ－（７ｐＢ）の７つの変異を含有する］が、インビトロでのヒト細胞における遺伝子導入及びインビボでのマウスにおける体細胞への遺伝子導入に使用される。ネイティブＰＢと同様のタンパク質レベルの発現にもかかわらず、ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ培養ヒト細胞の両方において、ｈｙｐＰＢは、ネオマイシン耐性カセットトランスポゾンの遺伝子導入効率を著しく増加させた。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系の最も活性なトランスポザーゼであるネイティブＰＢ及びＳＢ１００Ｘは、培養ヒト細胞株において同様の転位効率を示した。初代ヒトＴ細胞にエクスビボで送達されると、ｈｙｐＰＢは、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳＢ１００Ｘと比較して、遺伝子送達を２～３倍増加させた。ｈｙｐＰＢを、ルシフェラーゼレポータートランスポゾンと組み合わせた限られた用量のトランスポザーゼＤＮＡの流体力学的尾静脈注射を使用して、マウスにおいて、ネイティブＰＢ及びＳＢ１００Ｘとインビボで比較した。導入遺伝子発現を最大６ヶ月間監視し、ネイティブＰＢまたはＳＢ１００Ｘを注射したマウスと比較して、ｈｙｐＰＢを注射したマウスでおよそ１０倍の長期遺伝子発現を観察した。
方法
・ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に１２ウェルサイズのプレートに配置した。
・トランスフェクションの日に、トランスフェクションを実施する１時間３０分前に培地を交換した。
・Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って使用した。
・二重に、ＧＦＰを含有するドナープラスミド及びヘルパープラスミド（各々６００ｎｇ）を共トランスフェクトした。ドナーＤＮＡを、各重複トランスフェクションごとに混合し、１２００ｎｇのヘルパーＲＮＡ（トランスポザーゼ）を１２００ｎｇのドナーＤＮＡと混合して合計２４００ｎｇにした。３：１比のＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を使用したため、各複製物は２４００ｎｇのＤＮＡを有し、７．２ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を使用した。
・２つの異なるドナープラスミド（１つはｈｙｐＰＢ用、１つはｈｙｐＭＬＴ用）を使用した。全てのＰＢトランスポザーゼをＰＢドナーと混合したが、ＭＬＴドナーとは混合しなかった。
・トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＧＦＰ発現細胞のパーセント（％）をカウントして、一過性トランスフェクション効率を測定した。細胞を破片と区別するためにゲーティングし、各々２万個の細胞をカウントした。ＧＦＰゲーティングは、ＧＦＰ－ｄｉｍ細胞であってもＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞としてカウントされるように、自由度が高かった。
・細胞を、抗生物質なしで１５～２０日間培養した。細胞を１週間当たり２／３回継代した。
・フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ発現細胞のパーセント（％）を測定し、２週間での組み込み効率を測定した（８０，０００個の細胞をカウントした）。ゲーティングは保守的であったため、明らかな明るい集団の周りにゲートが描き、非常に薄暗い細胞を除外した。
・最終組み込み効率は、２週間のＧＦＰ細胞％を４８時間で割ることによって算出した。
・ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に１２ウェルサイズのプレートに配置した。
・トランスフェクションの日に、トランスフェクションを実施する１時間３０分前に培地を交換した。
・Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って使用した。
・二重に、ＧＦＰを含有するドナープラスミド及びヘルパープラスミド（各々６００ｎｇ）を共トランスフェクトした。ドナーＤＮＡを、各重複トランスフェクションごとに混合し、１２００ｎｇのヘルパーＲＮＡ（トランスポザーゼ）を１２００ｎｇのドナーＤＮＡと混合して合計２４００ｎｇにした。３：１比のＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を使用したため、各複製物は２４００ｎｇのＤＮＡを有し、７．２ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬を使用した。
・２つの異なるドナープラスミド（１つはｈｙｐＰＢ用、１つはｈｙｐＭＬＴ用）を使用した。全てのＰＢトランスポザーゼをＰＢドナーと混合したが、ＭＬＴドナーとは混合しなかった。
・トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＧＦＰ発現細胞のパーセント（％）をカウントして、一過性トランスフェクション効率を測定した。細胞を破片と区別するためにゲーティングし、各々２万個の細胞をカウントした。ＧＦＰゲーティングは、ＧＦＰ－ｄｉｍ細胞であってもＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞としてカウントされるように、自由度が高かった。
・細胞を、抗生物質なしで１５～２０日間培養した。細胞を１週間当たり２／３回継代した。
・フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ発現細胞のパーセント（％）を測定し、２週間での組み込み効率を測定した（８０，０００個の細胞をカウントした）。ゲーティングは保守的であったため、明らかな明るい集団の周りにゲートが描き、非常に薄暗い細胞を除外した。
・最終組み込み効率は、２週間のＧＦＰ細胞％を４８時間で割ることによって算出した。
結果
図２２Ａは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－ｄＣａｓ９、ＭＬＴ－ｄＣａｓ１２ｊ、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ－ｄＣａｓ１２ｊ、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ－ｄＣａｓ９、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ、及びＭＬＴについての組み込み活性の％を示す。図２２Ｂは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ１、及びＭＬＴ２の切除活性の％を示す。図２２Ｃは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ１、及びＭＬＴ２の組み込み活性の％を示す。図２２Ｄは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｃａｓ１２ｊ、ＭＬＴ－Ｃａｓ９、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端Ｃａｓ９、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端ＴＡＬＥ、ＭＬＴ－ＴＡＬＥ１０、及びＭＬＴの切除活性の％を示す。
図２２Ａは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－ｄＣａｓ９、ＭＬＴ－ｄＣａｓ１２ｊ、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ－ｄＣａｓ１２ｊ、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ－ｄＣａｓ９、超活性ｐｉｇｇｙＢａｃ、及びＭＬＴについての組み込み活性の％を示す。図２２Ｂは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ１、及びＭＬＴ２の切除活性の％を示す。図２２Ｃは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ１、及びＭＬＴ２の組み込み活性の％を示す。図２２Ｄは、ＭＬＴなし、ＭＬＴ－Ｃａｓ１２ｊ、ＭＬＴ－Ｃａｓ９、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端Ｃａｓ９、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端、ＭＬＴ－Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ末端ＴＡＬＥ、ＭＬＴ－ＴＡＬＥ１０、及びＭＬＴの切除活性の％を示す。
図２２Ａは、ＭＬＴトランスポザーゼ（ＭＬＴ２）と比較した、超活性形態のｐｉｇｇｙＢａｃ（ｈｙｐＰＢ）の組み込み効率を示す。超活性ＭＬＴトランスポザーゼの組み込み効率（約２８％）は、典型的に細胞及び遺伝子療法に使用される超活性形態のｐｉｇｇｙＢａｃ組み込み効率（約２４％）よりも大きかった。死Ｃａｓ（ｄＣａｓ）バインダーの付加によって、組み込み効率を低減した。の付加は、切除活性を３０％から１８％に低減した（図２２Ｄ）。ＭＬＴへのｄＣａｓの付加は、切除活性を８％に低減した（図２２Ｄ）。
実施例８－ヒトＲＯＳＡ２６ゲノムセーフハーバー部位標的化のインビトロ分析
この研究の目的は、トランスポザーゼをヒトセーフハーバー部位であるＲＯＳＡ２６に指向するためのＲＮＡ誘導性転位の有効性を評価することであった。
この研究の目的は、トランスポザーゼをヒトセーフハーバー部位であるＲＯＳＡ２６に指向するためのＲＮＡ誘導性転位の有効性を評価することであった。
本研究では、ネイティブｐｉｇｇｙＢａｃ ＤＢＤにおいて変異を含有するＲＮＡ誘導性トランスポザーゼベクターのパネルを、ヒトＲＯＳＡ２６セーフハーバー部位を標的とする能力について研究した。
プラスミド開発
ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドを標的とする表現を、図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄ、及び２３Ｅに示す。図２３Ａは、可撓性リンカーを介してトランスポザーゼ（ｐｉｇｇｙＢａｃ）に融合され、ガイドＲＮＡを有するＣＡＧプロモーターの制御下に置かれた、ｄＣａｓ９－ＰＢ－４ガイドヘルパー－触媒不活性ｄＣａｓ９を示す。図２３Ｂは、ガイドＲＮＡを欠いているｄＣａｓ９－ＰＢ－４ガイドヘルパーを示す。図２３Ｃは、ｄＣａｓ９ ＤＮＡ結合タンパク質を欠いている対照ＰＢ（ｐｉｇｇｙＢａｃ）ヘルパーを示す。図２３Ｄは、トランスポザーゼ（ＤＰＢ）を欠いている非挿入性対照ヘルパー（ＣＡＧプロモーターの制御下のｄＣａｓ９）を示す。図２３Ｅは、ＣＭＶプロモーター下にあり、トランスポゾン末端反復エレメント（ＴＲＥ）に隣接するＴｕｒｂｏＧＦＰ内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）ネオマイシン導入遺伝子を含むドナープラスミドを示す。
ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドを標的とする表現を、図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄ、及び２３Ｅに示す。図２３Ａは、可撓性リンカーを介してトランスポザーゼ（ｐｉｇｇｙＢａｃ）に融合され、ガイドＲＮＡを有するＣＡＧプロモーターの制御下に置かれた、ｄＣａｓ９－ＰＢ－４ガイドヘルパー－触媒不活性ｄＣａｓ９を示す。図２３Ｂは、ガイドＲＮＡを欠いているｄＣａｓ９－ＰＢ－４ガイドヘルパーを示す。図２３Ｃは、ｄＣａｓ９ ＤＮＡ結合タンパク質を欠いている対照ＰＢ（ｐｉｇｇｙＢａｃ）ヘルパーを示す。図２３Ｄは、トランスポザーゼ（ＤＰＢ）を欠いている非挿入性対照ヘルパー（ＣＡＧプロモーターの制御下のｄＣａｓ９）を示す。図２３Ｅは、ＣＭＶプロモーター下にあり、トランスポゾン末端反復エレメント（ＴＲＥ）に隣接するＴｕｒｂｏＧＦＰ内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）ネオマイシン導入遺伝子を含むドナープラスミドを示す。
図２３Ｆは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインＤＢＤの破壊による特異性の改善のためのモデルの非限定的な概略図である。ネイティブＰＢトランスポザーゼは、完全なＤＮＡ結合能力を保持し、ｄＣａｓ９標的に続いて組み込まれる（オンターゲット）か、またはｄＣａｓ９標的なしでオフターゲット配列への結合に続いて組み込まれる（オフターゲット）かのいずれかであり得る。ＰＢと同様に、Ｈ２及びＨ３変異体トランスポザーゼ組み込み欠損バリアント（Ｉｎｔ －）は、ｄＣａｓ９標的に続いて組み込まれ得る（オンターゲット）。しかしながら、トランスポザーゼのオフターゲット結合は、ＤＮＡ結合ドメインにおける変異により阻害される。図２３Ｆは、Ｉｎｔ－トランスポザーゼ変異体を使用するための理論的根拠を示す。
図２３Ｈは、ＴＡＬＥ ＤＮＡバインダーに付着したキメラＭＬＴトランスポザーゼ構築物を示す。他のＴＡＬＥ及びトランスポザーゼを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。
図２３Ｇは、ＮｐｕＮ：
ｇｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｔａｇｔｇｃｔｇａｇｔａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔｔａｃｇａａａｃｇｇａａａｔａｃｔｃａｃｇｇｔｔｇａｇｔａｔｇｇｇｃｔｔｃｔｔｃｃａａｔｔｇｇｃａａａａｔｃｇｔｔｇａａａａｇｃｇｃａｔａｇａｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｔａｔｔｃｃｇｔｃｇａｔａａｃａａｃｇｇｔａａｔａｔｃｔａｃａｃｃｃａｇｃｃｇｇｔａｇｃｔｃａｇｔｇｇｃａｃｇａｃｃｇａｇｇｃｇａａｃａｇｇａａｇｔｇｔｔｃｇａｇｔａｔｔｇｃｔｔｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｃｃｃｔｔａｔｃｃｇｃｇｃｃａｃｔａａａｇａｃｃａｔａａｇｔｔｔａｔｇａｃｇｇｔｔｇａｃｇｇｇｃａｇａｔｇｃｔｇｃｃｔａｔａｇａｃｇａａａｔａｔｔｔｇａｇａｇａｇａｇｃｔｇｇａｃｔｔｇａｔｇａｇａｇｔｃｇａｔａａｔｃｔｇｃｃａａａｔ（配列番号４２３）
及びＮｐｕＣ：
ｇｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇｔｔｃｃｇｇａｔｃｃａｔａａａｇａｔａｇｃｔａｃｔａｇｇａａａｔａｔｃｔｔｇｇｃａａａｃａａａａｃｇｔｃｔａｔｇａｃａｔａｇｇａｇｔｔｇａｇｃｇａｇａｔｃａｃａａｔｔｔｔｇｃｔｔｔｇａａｇａａｔｇｇｇｔｔｃａｔｃｇｃｇｔｃｔａａｔｔｇｃｔｔｃａａｃｇｃｔａｇｃｇｇｃｇｇｇｔｃａｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃ（配列番号４２４）
インテインタンパク質スプライシングを使用することによってｄＣａｓに付着したＭＬＴトランスポザーゼを示す。他のｄＣａｓを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。
ｇｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｔａｇｔｇｃｔｇａｇｔａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔｔａｃｇａａａｃｇｇａａａｔａｃｔｃａｃｇｇｔｔｇａｇｔａｔｇｇｇｃｔｔｃｔｔｃｃａａｔｔｇｇｃａａａａｔｃｇｔｔｇａａａａｇｃｇｃａｔａｇａｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｔａｔｔｃｃｇｔｃｇａｔａａｃａａｃｇｇｔａａｔａｔｃｔａｃａｃｃｃａｇｃｃｇｇｔａｇｃｔｃａｇｔｇｇｃａｃｇａｃｃｇａｇｇｃｇａａｃａｇｇａａｇｔｇｔｔｃｇａｇｔａｔｔｇｃｔｔｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｃｃｃｔｔａｔｃｃｇｃｇｃｃａｃｔａａａｇａｃｃａｔａａｇｔｔｔａｔｇａｃｇｇｔｔｇａｃｇｇｇｃａｇａｔｇｃｔｇｃｃｔａｔａｇａｃｇａａａｔａｔｔｔｇａｇａｇａｇａｇｃｔｇｇａｃｔｔｇａｔｇａｇａｇｔｃｇａｔａａｔｃｔｇｃｃａａａｔ（配列番号４２３）
及びＮｐｕＣ：
ｇｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｇｇｇｔｔｃｃｇｇａｔｃｃａｔａａａｇａｔａｇｃｔａｃｔａｇｇａａａｔａｔｃｔｔｇｇｃａａａｃａａａａｃｇｔｃｔａｔｇａｃａｔａｇｇａｇｔｔｇａｇｃｇａｇａｔｃａｃａａｔｔｔｔｇｃｔｔｔｇａａｇａａｔｇｇｇｔｔｃａｔｃｇｃｇｔｃｔａａｔｔｇｃｔｔｃａａｃｇｃｔａｇｃｇｇｃｇｇｇｔｃａｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃ（配列番号４２４）
インテインタンパク質スプライシングを使用することによってｄＣａｓに付着したＭＬＴトランスポザーゼを示す。他のｄＣａｓを、特定のゲノム部位を標的とするために置換することができる。
ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１遺伝子をＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ残基で変異させて、触媒ドメインを不活性化し、ｄＣａｓ９を生成した。ｄＣａｓ９－ＰＢヘルパープラスミドは、前述の可撓性リンカーを使用して、トランスポザーゼ遺伝子（ＰＢ）をｄＣａｓ９ ＤＮＡ結合タンパク質に融合することによって、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して生成した。融合タンパク質を、ＣＡＧ（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー、ニワトリｂ－アクチンプロモーター、及びｂ－グロビンイントロン）プロモーターの下に配置した。ＤＢＤ中にコドン変化を含有する２つの変異体トランスポザーゼヘルパープラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して生成した。最初に、トランスポザーゼをヒトコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。次に、変異Ｒ３７２Ａ及びＤ４５０Ｎを導入して，ｄＣａｓ９－Ｈ２ヘルパープラスミドを生成し、第３のＫ３７５Ａ変異を導入して、ｄＣａｓ９－Ｈ３ヘルパープラスミドを生成した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅを使用して、４つのｇＲＮＡをヘルパープラスミド骨格に付加した。簡潔に述べると、ガイド配列を含有する一本鎖オリゴをアニーリングし、ｈＵ６、ｍＵ６、Ｈ１、または７ＳＫプロモーターのいずれかを含有するＢｂｓＩ直鎖状発現プラスミドにライゲーションした。得られた４つのガイド発現プラスミドの各々のうちの１つを、最初にＢｓｍＢＩで消化し、次いで単一のステップで単一のＢｓｍＢＩ直鎖状ヘルパープラスミドに組み立てた。８つのガイドを必要とする実験では、各々が４つのガイドを含有する２つのプラスミドを等量でコトランスフェクトした。陰性対照ヘルパープラスミドは、ｇＲＮＡを欠いていた。ＰＢ、Ｈ２、またはＨ３トランスポザーゼのいずれかを含有したがＤＢＤを欠く対照ヘルパープラスミドもまた、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して生成した。非組み込みＤＰＢ対照を生成するために、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、ｐｉｇｇｙＢａｃコード配列全体をｄＣａｓ９－ＰＢヘルパープラスミドから除去した。ドナープラスミドを生成するために、Ｇａｔｅｗａｙクローニング（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＣＭＶプロモーター駆動ＴｕｒｂｏＧＦＰ、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及びネオマイシン（ＧＩＮ）遺伝子を特徴とするｐＥＮＴＲプラスミドを、導入遺伝子に隣接するｐＤＯＮＲプラスミドを含有するｐｉｇｇｙＢａｃ末端反復エレメント（ＴＲＥ）と再結合させた。
細胞トランスフェクション
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充した不完全なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。トランスフェクションの前に、ウェル当たり４×１０５細胞を６ウェルプレートに播種した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、約８０％のコンフルエンシーでの細胞を２ｕｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を再懸濁し、細胞の１０％をフローサイトメトリー解析のために除去してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクションの４８時間後、細胞の９０％をＴ７５フラスコに移し、２００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８下で３週間培養し、その時点で、細胞を溶解及びゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析のためにペレット化した。６ウェルディッシュ内の残りの１０％の細胞を抗生物質なしで３週間培養し、フローサイトメトリーによって分析して、安定な挿入効率を測定した。単一細胞単離のために、２つのｄＣａｓ９－Ｈ２－８ガイドトランスフェクションを反復した。Ｇ４１８選択されたポリクローナル集団を、各々９６ウェルポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に配置し、ウェル当たり平均５０コロニーを得た。ウェルが４０％コンフルエントより大きくなった後、培地を吸引し、細胞を３０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に手作業で再懸濁した。２０ｍＬの体積の再懸濁液を除去し、分析のために３０ｍＬのＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と混合した。残りの細胞をさらに培養した。ゲノムＰＣＲによって標的クローンを含有することが特定された２つのウェルを増殖させ、段階希釈を使用して単一細胞を選別した。１５７個の単一細胞の増殖が得られるまで、ウェルを目視監視した。その後、クローン的に増殖した細胞を、手動ピペッティングによって再懸濁し、解析のために溶解した。ヒトＲＯＳＡ２６（図２４Ａ）への標的挿入を含有する陽性クローン株をフローサイトメトリー分析のために増殖させて、導入遺伝子の潜在的なサイレンシングを検出した。
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充した不完全なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。トランスフェクションの前に、ウェル当たり４×１０５細胞を６ウェルプレートに播種した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、約８０％のコンフルエンシーでの細胞を２ｕｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を再懸濁し、細胞の１０％をフローサイトメトリー解析のために除去してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクションの４８時間後、細胞の９０％をＴ７５フラスコに移し、２００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８下で３週間培養し、その時点で、細胞を溶解及びゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析のためにペレット化した。６ウェルディッシュ内の残りの１０％の細胞を抗生物質なしで３週間培養し、フローサイトメトリーによって分析して、安定な挿入効率を測定した。単一細胞単離のために、２つのｄＣａｓ９－Ｈ２－８ガイドトランスフェクションを反復した。Ｇ４１８選択されたポリクローナル集団を、各々９６ウェルポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に配置し、ウェル当たり平均５０コロニーを得た。ウェルが４０％コンフルエントより大きくなった後、培地を吸引し、細胞を３０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に手作業で再懸濁した。２０ｍＬの体積の再懸濁液を除去し、分析のために３０ｍＬのＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と混合した。残りの細胞をさらに培養した。ゲノムＰＣＲによって標的クローンを含有することが特定された２つのウェルを増殖させ、段階希釈を使用して単一細胞を選別した。１５７個の単一細胞の増殖が得られるまで、ウェルを目視監視した。その後、クローン的に増殖した細胞を、手動ピペッティングによって再懸濁し、解析のために溶解した。ヒトＲＯＳＡ２６（図２４Ａ）への標的挿入を含有する陽性クローン株をフローサイトメトリー分析のために増殖させて、導入遺伝子の潜在的なサイレンシングを検出した。
フローサイトメトリー
ＲＯＳＡ２６標的単一細胞増殖からの２０，０００個の生細胞の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を、ｄＣａｓ９－Ｈ２－８ガイドでのトランスフェクションに続いて、１３週間の培養後にＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ細胞計（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
ＲＯＳＡ２６標的単一細胞増殖からの２０，０００個の生細胞の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を、ｄＣａｓ９－Ｈ２－８ガイドでのトランスフェクションに続いて、１３週間の培養後にＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ細胞計（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
コロニー数アッセイ
ヒトＲＯＳＡ２６標的単一クローンに存在するトランスポゾンの数を決定するために、コピー数アッセイをＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによって実施して、ゲノムに存在するネオマイシン遺伝子の数を推定した。ヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を使用して、試料当たりの全ゲノムを正規化した。テンプレートには、クローン株由来のゲノムＤＮＡ、陰性対照のトランスフェクトされていないヒトゲノムＤＮＡ、及び単一ネオマイシン遺伝子挿入によるクローン細胞株由来の参照対照ゲノムＤＮＡが含められた。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋフレックスサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量的ＰＣＲを、ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックス試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。プライマー及びプローブを、ヒトＲＮａｓｅ ＰのＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ及びＴａｑＭａｎ ＮｅｏＲアッセイＩＤ：Ｍｒ００２９９３００＿ ｃｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に含めた。ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒソフトウェアｖ２．１を使用して、各試料の挿入数を予測した。
ヒトＲＯＳＡ２６標的単一クローンに存在するトランスポゾンの数を決定するために、コピー数アッセイをＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによって実施して、ゲノムに存在するネオマイシン遺伝子の数を推定した。ヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を使用して、試料当たりの全ゲノムを正規化した。テンプレートには、クローン株由来のゲノムＤＮＡ、陰性対照のトランスフェクトされていないヒトゲノムＤＮＡ、及び単一ネオマイシン遺伝子挿入によるクローン細胞株由来の参照対照ゲノムＤＮＡが含められた。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋフレックスサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量的ＰＣＲを、ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックス試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。プライマー及びプローブを、ヒトＲＮａｓｅ ＰのＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ及びＴａｑＭａｎ ＮｅｏＲアッセイＩＤ：Ｍｒ００２９９３００＿ ｃｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に含めた。ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒソフトウェアｖ２．１を使用して、各試料の挿入数を予測した。
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ
１２ウェルプレートにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中８０％コンフルエンシーのＨＥＫ２９３細胞を、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、５００ｎｇのＳｐＣａｓ９－ＨＦ１発現プラスミド、及び５００ｎｇの８つのＲＯＳＡ２６指向性ｇＲＮＡまたは陰性対照ｇＲＮＡ発現プラスミドのうちの１つでコトランスフェクトした。７２時間後、細胞をペレット化し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ細胞溶解緩衝液（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して溶解した。８つ全てのガイド結合部位に隣接するように設計されたプライマーを使用して、ＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するゲノムＰＣＲを実施した。生成物をＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲマイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製し、溶融し、再アニールしてヘテロ二重鎖を形成した。各サンプルについて、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてまたは用いずに同一のインキュベーションを実施して、ミスマッチ配列を含有するＤＮＡを切断した。生成物を、ゲルイメージングのために２％ゲル上で分離した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイによって得られた生成物の濃度を測定した。切断生成物の画分を、２つの予想される切断生成物の総ｐｇ／ｌｌを、２つの予想される切断生成物及び未切断生成物の総ｐｇ／ｌｌで除すことによって算出した。インデルの発生率を算出した。
１２ウェルプレートにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中８０％コンフルエンシーのＨＥＫ２９３細胞を、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、５００ｎｇのＳｐＣａｓ９－ＨＦ１発現プラスミド、及び５００ｎｇの８つのＲＯＳＡ２６指向性ｇＲＮＡまたは陰性対照ｇＲＮＡ発現プラスミドのうちの１つでコトランスフェクトした。７２時間後、細胞をペレット化し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ細胞溶解緩衝液（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して溶解した。８つ全てのガイド結合部位に隣接するように設計されたプライマーを使用して、ＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するゲノムＰＣＲを実施した。生成物をＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲマイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製し、溶融し、再アニールしてヘテロ二重鎖を形成した。各サンプルについて、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてまたは用いずに同一のインキュベーションを実施して、ミスマッチ配列を含有するＤＮＡを切断した。生成物を、ゲルイメージングのために２％ゲル上で分離した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイによって得られた生成物の濃度を測定した。切断生成物の画分を、２つの予想される切断生成物の総ｐｇ／ｌｌを、２つの予想される切断生成物及び未切断生成物の総ｐｇ／ｌｌで除すことによって算出した。インデルの発生率を算出した。
ネステッドＰＣＲ
ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に１２ウェルサイズのプレートに配置した。トランスフェクションの当日、トランスフェクションを実施する１．５時間前に培地を交換する。本実験は、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬及び製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に１２ウェルサイズのプレートに配置した。トランスフェクションの当日、トランスフェクションを実施する１．５時間前に培地を交換する。本実験は、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ ＤＮＡトランスフェクション試薬及び製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
三重トランスフェクションでは、ＧＦＰ及びネオマイシンを含有するドナープラスミド、ｐＢまたはＭＬＴトランスポザーゼのいずれかに融合されたＤＢＤを有するヘルパープラスミド、ならびにガイドＲＮＡ発現プラスミドまたはプラスミドの組み合わせをコトランスフェクトした。ＤＮＡを三重トランスフェクションごとに混合し、すなわち、１５００ｎｇのヘルパープラスミドを、１５００ｎｇのドナープラスミド及び６００ｎｇのガイドＲＮＡと混合して合計を３６００ｎｇとした。３：１比のＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ９試薬を使用したため、各三重トランスフェクションが３６００ｎｇのＤＮＡを有し、１０．８ｕｌの試薬を使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を再懸濁し、Ｔ７５フラスコ内に配置する。トランスフェクションの７２時間後、培地を通常の培地からＧ４１８含有培地に変更した。Ｇ４１８含有培地中の細胞を３週間培養し、次いで、細胞をペレット化した。
次いで、細胞溶解及びプロテイナーゼＫ処理を実施して（ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬、Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＣＲのテンプレートのためのゲノムＤＮＡを調製した。
一次ＰＣＲを、ゲノムから伸長するプライマーの半分及びトランスポゾン挿入物から伸長するプライマーの半分を使用して実施した（図２４Ｂ）。図２４Ｂは、Ｃａｓ９、及びＴＴＡＡ（配列番号１）標的部位からそれぞれ６１ｂｐ及び６２ｂｐであった２つの異なるｇＲＮＡのセット（セット１：ＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号４２５）、ＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣ（配列番号４２６）；セット２：ＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号４２７）、ＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号４２８））を有するＭＬＴヘルパーを使用した、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座内の特異的ＴＴＡＡ（配列番号１）部位におけるドナーＭＬＴの挿入を検出するネステッドＰＣＲ戦略を示す。
ＫＯＤ Ｏｎｅポリメラーゼを使用した：１０ｕｌ反応、及び１ｕｌ直接溶解をテンプレートとして使用した。一次ＰＣＲ生成物を水中で１：５０に希釈した。次いで、１ｕｌの１：５０希釈を、一次生成物内にネストされるプライマーを使用して、ネステッドＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼを使用した（２０ｕｌ反応物）。ネステッドＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上に流し（図２４Ｃ）、予想されるサイズのバンドを配列決定した。配列をアラインメントし、陽性挿入（ＴＴＡＡ（配列番号１）挿入部位及びトランスポゾン挿入物の縁部を有するゲノム配列を含むもの）を識別した（図２４Ｄ）。
標的ゲノム組み込み部位の回復
ＨＥＫ２９３細胞の安定したトランスフェクションからのペレットを、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ細胞溶解緩衝液（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して溶解し、ネステッドＰＣＲのためのテンプレートとして使用して標的トランスポゾン挿入を識別した。ＰＣＲを最適化するために、溶解物テンプレートを、１：１、１：４、及び１：８の３つの希釈で使用した。フォワードプライマーは、トランスポゾンから外向きに伸長するように設計したが、リバースプライマーは、ＲＯＳＡ２６標的配列から伸長するように設計した（図２４Ｂ）。１０ｕＬの一次ＰＣＲを、Ｈ２Ｏ中１：５０で希釈し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して２０ｕＬのネステッドＰＣＲのためのテンプレートとして使用したＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して実施した。増幅生成物を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回復キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でゲル精製し、直接配列決定したか、または配列決定のためにｐＪｅｔ１．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にクローニングした。ＢＬＡＳＴを使用してトランスポゾン配列に対して、及びＢＬＡＴを使用してヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）に対して配列をアラインメントして、挿入部位の位置を識別した。
ＨＥＫ２９３細胞の安定したトランスフェクションからのペレットを、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ細胞溶解緩衝液（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して溶解し、ネステッドＰＣＲのためのテンプレートとして使用して標的トランスポゾン挿入を識別した。ＰＣＲを最適化するために、溶解物テンプレートを、１：１、１：４、及び１：８の３つの希釈で使用した。フォワードプライマーは、トランスポゾンから外向きに伸長するように設計したが、リバースプライマーは、ＲＯＳＡ２６標的配列から伸長するように設計した（図２４Ｂ）。１０ｕＬの一次ＰＣＲを、Ｈ２Ｏ中１：５０で希釈し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して２０ｕＬのネステッドＰＣＲのためのテンプレートとして使用したＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して実施した。増幅生成物を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回復キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でゲル精製し、直接配列決定したか、または配列決定のためにｐＪｅｔ１．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にクローニングした。ＢＬＡＳＴを使用してトランスポゾン配列に対して、及びＢＬＡＴを使用してヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）に対して配列をアラインメントして、挿入部位の位置を識別した。
ゲノムへのＲＮＡ誘導性転位
ヒトＲＯＳＡ２６セーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を送達するｄＣａｓ９－ｐｉｇｇｙＢａｃ融合構築物の能力を試験した。ドナープラスミドを、ｄＣａｓ９－ＰＢ、ｄＣａｓ９－Ｈ２、またはｄＣａｓ９ Ｈ３で、各々０、４、または８個のガイドと二重にコトランスフェクトした。３週間の抗生物質選択に続いて、ゲノムＰＣＲのテンプレートとして使用するために培養物を溶解した。挿入を回復する機会を向上させるために、溶解物テンプレートの３つの希釈液を使用した。トランスポゾンの各側面から伸長するように一次ＰＣＲプライマーを設計した。４つの追加の一次ＰＣＲプライマーを、ＲＯＳＡ２６の標的部位（各側に２つ）に向かって伸長するように設計した。個々のＰＣＲ反応を、全ての対合プライマーの組み合わせ（合計８）を使用して実施した。一次ＰＣＲ反応から生じる生成物を、ネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。配列決定された生成物には、トランスポゾンの隣接ＴＲＥ、接合部におけるカノニカルＴＴＡＡ（配列番号１）配列、及び挿入部位に隣接するゲノム配列が含まれた。
ヒトＲＯＳＡ２６セーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を送達するｄＣａｓ９－ｐｉｇｇｙＢａｃ融合構築物の能力を試験した。ドナープラスミドを、ｄＣａｓ９－ＰＢ、ｄＣａｓ９－Ｈ２、またはｄＣａｓ９ Ｈ３で、各々０、４、または８個のガイドと二重にコトランスフェクトした。３週間の抗生物質選択に続いて、ゲノムＰＣＲのテンプレートとして使用するために培養物を溶解した。挿入を回復する機会を向上させるために、溶解物テンプレートの３つの希釈液を使用した。トランスポゾンの各側面から伸長するように一次ＰＣＲプライマーを設計した。４つの追加の一次ＰＣＲプライマーを、ＲＯＳＡ２６の標的部位（各側に２つ）に向かって伸長するように設計した。個々のＰＣＲ反応を、全ての対合プライマーの組み合わせ（合計８）を使用して実施した。一次ＰＣＲ反応から生じる生成物を、ネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。配列決定された生成物には、トランスポゾンの隣接ＴＲＥ、接合部におけるカノニカルＴＴＡＡ（配列番号１）配列、及び挿入部位に隣接するゲノム配列が含まれた。
結果
本研究において、合計２２個の挿入接合部を回復し、これらを図２４Ａに示す。本研究は、ヒト細胞におけるＲＯＳＡ２６へのＲＮＡ誘導性転位を実証し、遺伝子療法使用のために、ヒトＲＯＳＡ２６への組み込み欠損（Ｉｎｔ－）ＰＢトランスポザーゼ変異体を指向するための概念の証明を提供した。
本研究において、合計２２個の挿入接合部を回復し、これらを図２４Ａに示す。本研究は、ヒト細胞におけるＲＯＳＡ２６へのＲＮＡ誘導性転位を実証し、遺伝子療法使用のために、ヒトＲＯＳＡ２６への組み込み欠損（Ｉｎｔ－）ＰＢトランスポザーゼ変異体を指向するための概念の証明を提供した。
本研究はまた、本発明者らが、インテインスプライシング及びｇＲＮＡによってｄＣａｓ９に融合されたＭＬＴを使用して、ＲＯＳＡ２６における１つの特異的ＴＴＡＡ（配列番号１）部位を標的とすることができたことを実証する。
特異的ＴＴＡＡ（配列番号１）部位（図２４Ｂ、図２４Ｃ、及び図２４Ｄ）におけるヘルパーＭＬＴ－ＴＡＬＥ及びＭＬＴ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスポザーゼ発現標的ｈＲＯＳＡ２６が、ヒトＲＯＳＡ２６に対する標的挿入を回復するためにゲノムＰＣＲを使用したことが観察された。ゲノム全体にわたって挿入に利用可能な数百万の潜在的ＴＴＡＡ（配列番号１）配列にもかかわらず、ｇＲＮＡ標的配列に隣接したいくつかの挿入されたトランスポゾンが発見された。ｇＲＮＡを用いない対照トランスフェクションは、いかなる標的挿入ももたらさなかった。図２４Ｂ、図２４Ｃ、及び図２４Ｄに示される結果は、導入遺伝子が（ＤＮＡ配列決定によって示されるように）フットプリントなしで、ゲノムセーフハーバー部位であるｈＲＯＳＡ２６に正常に組み込まれたことを実証する。これは、任意の遺伝子が、そのＴＴＡＡ（配列番号１）位置に配置され得ることを示す。
実施例９－ＭＬＴトランスポザーゼ（ＲＮＡヘルパー）を使用した様々な細胞株（ＦＡＣｓ）における組み込みの研究
この研究の目的は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ及びＣＭＶ－ＧＦＰを使用して、４つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ７、ＣＨＯ－Ｋ１、及びＴ細胞）に組み込んで、様々な細胞株の組み込みの効率を比較することであった。さらなる目的は、ＣＭＶ－ＧＦＰのみを組み込んで、ＭＬＴトランスポザーゼが細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。これを、ＦＡＣｓを使用することによって定量化して、一度組み込まれた各細胞株におけるＧＦＰ発現を測定した。
この研究の目的は、本開示のＭＬＴトランスポザーゼ及びＣＭＶ－ＧＦＰを使用して、４つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ７、ＣＨＯ－Ｋ１、及びＴ細胞）に組み込んで、様々な細胞株の組み込みの効率を比較することであった。さらなる目的は、ＣＭＶ－ＧＦＰのみを組み込んで、ＭＬＴトランスポザーゼが細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。これを、ＦＡＣｓを使用することによって定量化して、一度組み込まれた各細胞株におけるＧＦＰ発現を測定した。
以下のプロトコルを使用した。
・ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＨＵＨ７、及びＴ細胞を３つの異なる細胞密度で播種した。
・３つの細胞株ヌクレオフェクション効率を、細胞株４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット及びプログラム（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、０．４μｇのｐｍａｘＧＦＰ（商標）ベクターを（各特定の細胞株についてのプロバイダーの推奨に従って）陽性対照として使用して試験した。
・ＧＦＰ発現の測定を、２つの時点（２４時間及び７２時間）で、ハイコンテント分析（視覚的）及びフローサイトメトリー（定量的）を使用して評価した。核を染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２生体染色色素で定量化した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを算出した。Ｔ細胞は懸濁細胞であるため、フローサイトメトリーの読み出しのみを実施した。
・ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＨＵＨ７、及びＴ細胞を３つの異なる細胞密度で播種した。
・３つの細胞株ヌクレオフェクション効率を、細胞株４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット及びプログラム（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、０．４μｇのｐｍａｘＧＦＰ（商標）ベクターを（各特定の細胞株についてのプロバイダーの推奨に従って）陽性対照として使用して試験した。
・ＧＦＰ発現の測定を、２つの時点（２４時間及び７２時間）で、ハイコンテント分析（視覚的）及びフローサイトメトリー（定量的）を使用して評価した。核を染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２生体染色色素で定量化した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを算出した。Ｔ細胞は懸濁細胞であるため、フローサイトメトリーの読み出しのみを実施した。
結果
研究した細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＨＵＨ７、及びＴ細胞）は全て、８０％を超えるヌクレオフェクトを受けた。全ての細胞株は、図２５～２８に示されるように、３日間のヌクレオフェクション後のＭＬＴトランスポザーゼの存在または非存在において８５～９５％のＧＦＰ発現を示した。
研究した細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＨＵＨ７、及びＴ細胞）は全て、８０％を超えるヌクレオフェクトを受けた。全ての細胞株は、図２５～２８に示されるように、３日間のヌクレオフェクション後のＭＬＴトランスポザーゼの存在または非存在において８５～９５％のＧＦＰ発現を示した。
図２５は、異なる条件下でトランスフェクトされて、Ｈｕｈ７がＧＦＰを発現することを示す初期Ｈｕｈ７細胞株を示す。行は、（上から）非処理細胞、模擬トランスフェクション（核酸を含まない）、ＭＬＴで処理した細胞、及びｐｍａｘＧＦＰで処理した細胞を示し、列は、１日目（Ｄ１）、３日目（Ｄ３）、及び７日目（Ｄ７）の対照を示す。
図２６は、ＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの２４時間後の異なる比率での、ＣＭＶ－ＧＦＰ＋ＭＬＴでトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞を示す。上の行は、２：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（２μｇ）を示す。中央の行は、１：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（１μｇ）を示す。下の行は、０．５：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（０．５μｇ）を示す。
図２７は、ＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの７２時間後の異なる比率での、ＣＭＶ－ＧＦＰ＋ＭＬＴでトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞を示す。上の行は、２：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（２μｇ）を示す。中央の行は、１：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（１μｇ）を示す。下の行は、０．５：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（０．５μｇ）を示す。
図２８は、ＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞と比較した、トランスフェクトの１週間後の異なる比率での、ＣＭＶ－ＧＦＰ＋ＭＬＴでトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞を示す。上の行は、２：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（２μｇ）を示す。中央の行は、１：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（１μｇ）を示す。下の行は、０．５：１μｇのＣＭＶ－ＧＦＰ：ＭＬＴ比でトランスフェクトした細胞、及びＣＭＶ－ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞（０．５μｇ）を示す。
図２９Ａは、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナー及びＭＬＴ ＲＮＡヘルパーを使用して、トランスフェクション後１４日目及び２１日目のＨＥＫ２９３細胞の生存率を示す。リポフェクタミン、ＤＮＡ、またはＲＮＡによる明らかな毒性はなかった。１４日後及び２１日後に細胞の４０％超において堅牢なＧＦＰの発現が見出された（図２９Ｂ）。組み込み効率をＦＡＣｓ分析し、３７％の細胞が、ＭＬＴドナーＤＮＡが安定に組み込まれたことを示した（図２９Ｃ及び図２９Ｄ）。図２９Ｅは、Ｔ２５フラスコにおけるヌクレオフェクションリポフェクション後のＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３細胞のパーセンテージを示す。ＧＦＰ陽性細胞％は、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴドナー単独では、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴドナー＋ＭＬＴヘルパーＲＮＡと比較して同じであった。ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴドナー単独でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ＧＦＰ陽性率％は急速に低下し、２１日目に５％に達した。ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴドナー＋ＭＬＴヘルパーＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において安定化したＧＦＰ陽性率％は、２１日目に４２％に達した。組み込み効率は、３７％と算出された。ゲーティングＦＡＣｓは、ＲＮＡ発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）の効果を評価するために、ＧＦＰ陽性細胞集団及びｍｎＣｈｅｒｒｙ陽性細胞集団を選択することができた（図３０Ａ～Ｄ）。
実施例１０－ＣＭＶ－ＧＦＰ／ＭＬＴトランスポザーゼを使用したＨＴ１０８０細胞の転位
この研究の目的は、ＨＴ１０８０細胞をＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナー及びＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１またはＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２でトランスフェクトし、それらのＧＦＰ発現を比較することによってそれらの転位効率を定量化することであった。ＨＴ１０８０は、ヒト線維肉腫細胞株である。
この研究の目的は、ＨＴ１０８０細胞をＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナー及びＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１またはＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２でトランスフェクトし、それらのＧＦＰ発現を比較することによってそれらの転位効率を定量化することであった。ＨＴ１０８０は、ヒト線維肉腫細胞株である。
図３１は、ＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションから２４時間後のＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナー発現を示し、図３２は、ＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションから２週間後のＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナー発現を示す。
図３１に示されるように、ＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１及びＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２の両方は、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴドナーＤＮＡと組み合わせたときに、ＨＴ１０８０細胞を効果的にトランスフェクトした。これらのトランスポザーゼの両方は、非常に類似したレベルのＧＦＰを発現し、一方、ドナーＤＮＡのみ（ＣＭＶ－ＧＦＰのみ）は、ＧＦＰがこれらの細胞において発現できることを実証した。トランスフェクトされていない細胞株は、この細胞株には存在しないため、ＧＦＰ発現を有していなかった。
２週間後、図３２に示されるように、ＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１及びＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２からより少ないＧＦＰ発現が観察され、一方、ＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２は、ＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１と比較して、ＧＦＰをわずかに強く発現した。ＣＭＶ－ＧＦＰのみ（ドナーＤＮＡのみ）及びトランスフェクトされていない細胞は、ドナーＤＮＡが細胞株に組み込まれない一方で、トランスフェクトされていない細胞がＧＦＰを最初に発現することがなかったため、ＧＦＰ発現を有していなかった。
この研究では、ＨＴ１０８０細胞におけるＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ１及びＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２のトランスフェクション効率を比較したとき、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＬＴ ＤＮＡドナーを有するＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２は、ＨＴ１０８０細胞をより効果的にトランスフェクトすることが示された（図３２、トランスフェクションの２週間後）。組み込み効率は、ＭＬＴ ＲＮＡヘルパートランスポザーゼ２とＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２とで同等であるが、ＭＬＴ ＤＮＡヘルパートランスポザーゼ２は、エクスビボ実験を含む細胞株のトランスフェクションにより好適である。
定義
以下の定義は、本明細書に開示される発明に関連して使用される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下の定義は、本明細書に開示される発明に関連して使用される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
「インビボ」という用語は、対象の身体内で起こる事象を指す。
「エクスビボ」という用語は、対象の身体から取り出された細胞、組織、及び／または臓器を治療すること、または処置を実施することを伴うイベントを指す。適切には、治療または手術の方法において、細胞、組織、及び／または臓器を対象の体内に戻すことができる。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、ある特定の位置での１つ以上の置換、欠失、及び／または付加によって参照の核酸またはアミノ酸配列とは異なる核酸またはアミノ酸配列を含む核酸またはタンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電されたまたは非荷電のアミノ酸の置換を伴ってもよい。
本明細書で使用される「担体」または「ビヒクル」は、薬物投与に好適な担体材料を指す。本明細書で有用な担体及びビヒクルには、当該技術分野で既知の任意のそのような材料、例えば、無毒であり、有害な様式で組成物の他の成分と相互作用しない任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、脂質などが含まれる。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または妥当な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適である、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むことが意図される。活性薬学的成分に対するそのような薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が、活性な薬学的成分と適合しないということを除いて、本発明の治療的組成物において、その使用が企図される。また、他の薬物などの追加の活性な薬学的成分を、記載の組成物及び方法に組み込むこともできる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味することができる。
さらに、「約」という用語は、参照される数値表示に関連して使用されるとき、参照される数値表示にその参照される数値表示の最大１０％を加減することを意味する。例えば、「約５０」という言語は、４５～５５の範囲を網羅する。
本明細書で使用される場合、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」という単語及びその変形は、リスト内のアイテムの列挙が、本技術の組成物及び方法においても有用であり得る他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることが意図される。同様に、「することができる（ｃａｎ）」及び「してもよい（ｍａｙ）」という用語、ならびにそれらの変形例は、非限定的であることが意図され、実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる、または含んでもよいという列挙は、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しない。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）などの用語の同義語として、本明細書では、本発明を記載し、特許請求するために使用されるが、本発明またはその実施形態は、代替的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの代替用語を使用して記載されてもよい。
本明細書で使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、他の実施形態を本技術の範囲から除外することを意図するものではない。
同等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、概して、本発明の原理に従う本発明の任意の変形例、使用、または適応を網羅することが意図され、本発明が関連する当該技術分野内の既知のまたは慣習的な実践内にあり、本明細書に記載される本質的な特徴に適用され得、かつ添付の特許請求の範囲において以下に記載されるような本開示からのそのような逸脱を含むことが理解されるであろう。
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、概して、本発明の原理に従う本発明の任意の変形例、使用、または適応を網羅することが意図され、本発明が関連する当該技術分野内の既知のまたは慣習的な実践内にあり、本明細書に記載される本質的な特徴に適用され得、かつ添付の特許請求の範囲において以下に記載されるような本開示からのそのような逸脱を含むことが理解されるであろう。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態と同等のものを認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に構成のためのものであり、いかなる方法でも本開示を制限することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、全てのセクションに同等に適用可能であり得る。
Claims (151)
- トランスポザーゼ酵素または前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む組成物であって、前記トランスポザーゼ酵素が、配列番号２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記トランスポザーゼ酵素が、配列番号２のＳ２位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、前記組成物。
- 前記酵素が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記酵素が、配列番号２に対して少なくとも約９３％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記酵素が、配列番号２に対して少なくとも約９５％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記酵素が、配列番号２に対して少なくとも約９８％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記置換が、非極性脂肪族アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
- 前記置換が、非極性脂肪族アミノ酸である、請求項２～５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記置換が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰから選択される、請求項６に記載の組成物。
- 前記置換が、Ｓ２Ａである、請求項８に記載の組成物。
- 前記酵素が、配列番号２に対して、Ｃ末端に追加の残基を有しない、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、超活性を付与する１つ以上の変異を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及び／またはＮ１２５Ｘ３から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１１に記載の組成物。
- 前記酵素が、Ｓ８Ｘ１、Ｃ１３Ｘ２、及びＮ１２５Ｘ３置換を有する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記酵素が、Ｓ８Ｘ１及びＣ１３Ｘ２置換を有する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記酵素が、Ｓ８Ｘ１及びＮ１２５Ｘ３置換を有する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記酵素が、Ｃ１３Ｘ２及びＮ１２５Ｘ３置換を有する、請求項１２に記載の組成物。
- Ｘ１が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＰから選択され、Ｘ２が、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、Ｘ３が、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択される、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の組成物。
- Ｘ１がＰであり、Ｘ２がＲであり、及び／またはＸ３がＫである、請求項１７に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記トランスポザーゼ酵素を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）／ｇＲＮＡをさらに含み、
前記酵素が、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）内のＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができ、
前記ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、前記キメラ酵素を前記ＧＳＨＳ配列に指向するのに好適である、請求項１９に記載の組成物。 - 前記酵素が、哺乳動物細胞における核酸分子のゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）におけるＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項２０に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、１つ以上の反復配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１８．５個の反復配列を含む、請求項２２に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列が、３３または３４アミノ酸を含む、請求項２２または２３に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列のうちの１つ以上が、前記３３または３４アミノ酸の残基１２及び／または１３に反復可変二残基（ＲＶＤ）を含む、請求項２４に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内の１つの塩基対を認識する、請求項２５に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＣ残基を認識し、かつＨＤ、Ｎ（ギャップ）、ＨＡ、ＮＤ、及びＨＩから選択される、請求項２５に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＧ残基を認識し、かつＮＮ、ＮＨ、ＮＫ、ＨＮ、及びＮＡから選択される、請求項２５に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＡ残基を認識し、かつＮＩ及びＮＳから選択される、請求項２５に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＴ残基を認識し、かつＮＧ、ＨＧ、Ｈ（ギャップ）、及びＩＧから選択される、請求項２５に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、染色体中のオープンクロマチン位置にある、請求項２０～３０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、アデノ関連ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体、及びヒトＲｏｓａ２６遺伝子座から選択される、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ヒト染色体２、４、６、１０、１１、または１７上に位置する、請求項２０～３２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ＴＡＬＣ１、ＴＡＬＣ２、ＴＡＬＣ３、ＴＡＬＣ４、ＴＡＬＣ５、ＴＡＬＣ７、ＴＡＬＣ８、ＡＶＳ１、ＡＶＳ２、ＡＶＳ３、ＲＯＳＡ１、ＲＯＳＡ２、ＴＡＬＥＲ１、ＴＡＬＥＲ２、ＴＡＬＥＲ３、ＴＡＬＥＲ４、ＴＡＬＥＲ５、ＳＨＣＨＲ２－１、ＳＨＣＨＲ２－２、ＳＨＣＨＲ２－３、ＳＨＣＨＲ２－４、ＳＨＣＨＲ４－１、ＳＨＣＨＲ４－２、ＳＨＣＨＲ４－３、ＳＨＣＨＲ６－１、ＳＨＣＨＲ６－２、ＳＨＣＨＲ６－３、ＳＨＣＨＲ６－４、ＳＨＣＨＲ１０－１、ＳＨＣＨＲ１０－２、ＳＨＣＨＲ１０－３、ＳＨＣＨＲ１０－４、ＳＨＣＨＲ１０－５、ＳＨＣＨＲ１１－１、ＳＨＣＨＲ１１－２、ＳＨＣＨＲ１１－３、ＳＨＣＨＲ１７－１、ＳＨＣＨＲ１７－２、ＳＨＣＨＲ１７－３、及びＳＨＣＨＲ１７－４から選択される、請求項３２または３３に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む、請求項１９～３４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つに結合する、請求項３５に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、
ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）、及び
ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号４２２）のうちの１つ以上を含む、請求項２０～３６のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、ＧＴＴＴＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣ（配列番号９１）、ＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧ（配列番号９３）、ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡ（配列番号９４）、ＧＴＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴ（配列番号９５）、ＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡ（配列番号９６）、ＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号９７）、及びＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＡ（配列番号９８）から選択されるガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡが、前記酵素をケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に指向する、請求項２０に記載の組成物。
- 前記ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、
ＣＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号９９）、ＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号１００）、ＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号１０１）、ＣＡＣＣＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧ（配列番号１０２）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号１０３）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴ（配列番号１０４）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号１０５）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡ（配列番号１０６）、ＣＡＣＣＧＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１０７）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴ（配列番号１０８）、ＣＡＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１０９）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ（配列番号１１０）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣ（配列番号１１１）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴ（配列番号１１２）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号１１３）、ＣＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣ（配列番号１１４）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号１１５）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号１１６）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣ（配列番号１１７）、ＡＡＡＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣ（配列番号１１８）、ＡＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号１１９）、ＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣ（配列番号１２０）、ＡＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣ（配列番号１２１）、ＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２２）、ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣ（配列番号１２３）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＣ（配列番号１２４）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣ（配列番号１２５）、ＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣ（配列番号１２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣ（配列番号１２７）、ＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２８）、ＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣ（配列番号１２９）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣ（配列番号１３０）、ＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号１３１）、ＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧ（配列番号１３２）、ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号１３３）、ＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号１３４）、ＡＡＧＴＧＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３５）、ＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧ（配列番号１３６）、ＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧ（配列番号１３７）、ＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１３８）、ＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧ（配列番号１３９）、ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧ（配列番号１４０）、ＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧ（配列番号１４１）、ＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＧＧ（配列番号１４２）、ＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１４３）、ＴＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧ（配列番号１４４）、ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１４５）、ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号１４６）、ＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧ（配列番号１４７）、ＧＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＡＣ（配列番号１４８）、ＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡ（配列番号１４９）、ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１５０）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧ（配列番号１５１）、ＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号１５２）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡ（配列番号１５３）、ＡＡＧＡＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１５４）、ＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧ（配列番号１５５）、ＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号１５６）、ＧＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１５７）、ＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＣＴＣＧＧ（配列番号１５８）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡ（配列番号１５９）、ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号１６０）、ＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧ（配列番号１６１）、ＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＣＣＣＡ（配列番号１６２）、ＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＧＧＧ（配列番号１６３）、ＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＧ（配列番号１６４）、ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣ（配列番号１６５）、ＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧ（配列番号１６６）、ＡＣＴＡＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＡＧＣＡＣＣ（配列番号１６７）、ＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１６８）、ＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号１６９）、ＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号１７０）、ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧ（配列番号１７１）、ＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１７２）、ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１７３）、ＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧ（配列番号１７４）、ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号１７５）、ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧ（配列番号１７６）、ＧＴＴＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号１７７）、ＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧ（配列番号１７８）、ＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧ（配列番号１７９）、ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＧ（配列番号１８０）、ＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１８１）、ＣＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧ（配列番号１８２）、ＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧ（配列番号１８３）、ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧ（配列番号１８４）、ＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＧ（配列番号３０９）、ＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡ（配列番号３１０）、ＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号３１１）、ＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号３１２）、ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴ（配列番号３１３）、ＴＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号３１４）、ＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣ（配列番号３１５）、ＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＧ（配列番号３１６）、ＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡ（配列番号３１７）、ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴ（配列番号３１８）、ＡＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＡ（配列番号３１９）、ＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号３２０）、ＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴ（配列番号３２１）、ＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧ（配列番号３２２）、ＡＡＧＧＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧ（配列番号３２３）、ＣＡＣＣＡＴＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２４）、ＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧ（配列番号３２７）、ＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２５）、ＴＴＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２６）、ＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２８）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧ（配列番号３２９）、ＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧ（配列番号３３０）、ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ（配列番号３３１）、ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号３３２）、ＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号３３３）、ＧＡＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧ（配列番号３３４）、ＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧ（配列番号３３５）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号１８５）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号１８６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号１８７）、ＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴ（配列番号１８８）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣ（配列番号１８９）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡ（配列番号１９０）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＧＴＡ（配列番号１９１）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＣＴＴＴＡＴ（配列番号１９２）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡ（配列番号１９３）、ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣ（配列番号１９４）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡ（配列番号１９５）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧ（配列番号１９６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴ（配列番号１９７）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡ（配列番号１９８）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号１９９）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡ（配列番号２００）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号２０１）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣ（配列番号２０２）、ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号２０３）、ＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号２０４）、ＡＡＡＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号２０５）、ＡＡＡＣＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣ（配列番号２０６）、ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号２０７）、ＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号２０８）、ＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣ（配列番号２０９）、ＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣ（配列番号２１０）、ＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１１）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣ（配列番号２１２）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号２１３）、ＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号２１４）、ＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＣ（配列番号２１５）、ＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＣ（配列番号２１６）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号２１７）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴ（配列番号２１８）、ＣＡＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴ（配列番号２１９）、ＣＡＣＣＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡ（配列番号２２０）、ＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡＡ（配列番号２２１）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴ（配列番号２２２）、ＣＡＣＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧ（配列番号２２３）、ＣＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号２２４）、ＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣ（配列番号２２５）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧＡＴＣＣ（配列番号２２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣ（配列番号２２７）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣ（配列番号２２８）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣ（配列番号２２
９）、ＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣ（配列番号２３０）、ＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣ（配列番号２３１）、ＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣ（配列番号２３２）、ＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号２３３）、ＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号２３４）、ＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号２３５）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号２３６）、ＡＧＴＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号２３７）、ＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号２３８）、ＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２３９）、ＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号２４０）、ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２４１）、ＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号２４２）、ＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣ（配列番号２４３）、ＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号２４４）、ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧ（配列番号２４５）、ＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４６）、ＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧ（配列番号２４７）、ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号２４８）、ＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号２４９）、ＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧ（配列番号２５０）、ＣＣＧＴＡＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号２５１）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＧ（配列番号２５２）、ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ（配列番号２５３）、ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡ（配列番号２５４）、ＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号２５５）、ＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣＧＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２５７）、ＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡ（配列番号２５８）、ＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号２５９）、ＴＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号２６０）、ＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号２６２）、ＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧ（配列番号２６３）、ＧＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号２６４）、ＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号２６５）、ＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号２６６）、ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２６７）、ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号２６８）、ＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号２６９）、ＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号２７０）、ＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号２７１）、ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号２７２）、ＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号２７５）、ＡＧＡＧＴＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号２７６）、ＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号２７７）、ＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣ（配列番号２７８）、ＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡ（配列番号２７９）、ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＡ（配列番号２８０）、ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧＧＧ（配列番号２８１）、ＧＣＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧ（配列番号２８２）、ＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号２８３）、ＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号２８４）、ＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２８５）、ＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡ（配列番号２８６）、ＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２８７）、ＴＣＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号２８８）、ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＧ（配列番号２８９）、ＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号２９０）、ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号２９１）、ＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＧＣＡ（配列番号２９２）、ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣＧＧ（配列番号２９３）、ＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号２９４）、ＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９５）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡ（配列番号２９６）、ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９７）、ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号２９８）、ＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号２９９）、ＧＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号３００）、ＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号３０１）、ＴＡＧＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧ（配列番号３０２）、ＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧ（配列番号３０３）、ＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡ（配列番号３０４）、ＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＧ（配列番号３０５）、ＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧ（配列番号３０６）、ＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ（配列番号３０７）、及びＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０８）から選択されるガイドＲＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。 - 前記ＧＳＨＳが、図３から選択され、前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、図３の配列、またはそのバリアント（例えば、任意選択で挿入、置換、または欠失である、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を有する）を含む、請求項２０～３９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳ及び前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ配列が、
ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）及びＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）及びＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）及びＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）及びＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）及びＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）及びＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）及びＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）及びＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）及びＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）及びＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）及びＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）及びＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）及びＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）及びＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）及びＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）及びＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）及びＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）及びＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）及びＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）及びＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、ならびにＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）及びＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）から選択される、請求項２０～４０のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ＧＳＨＳが、前記ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位の約２５、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約３００、または約５００ヌクレオチド内にある、請求項２０～４１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、超活性を付与する１つ以上の変異を有する、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物。
- 配列番号２のアミノ酸配列に対してＳ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異のうちの少なくとも１つに対応する位置に変異を有する、請求項４３に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９３％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも約９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、ヒト細胞における発現のための、配列番号２のコドン最適化バージョンを含む、請求項４５に記載の組成物。
- 前記核酸が、ベクターに組み込まれている、請求項４５～５１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項５２に記載の組成物。
- 請求項４５～５３のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞を含む、組成物。
- 前記組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である、請求項１～５４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＬＮＰが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（グリセリルトリオレエート）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含み、及び／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む、請求項５５に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼ酵素または前記トランスポザーゼ酵素をコードする核酸が、トランスポゾンをコードする核酸と共製剤化される、請求項５５または５６に記載の組成物。
- 前記共製剤が、前記酵素または前記酵素をコードする核酸、及び前記トランスポゾンをコードする核酸の両方を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である、請求項５７に記載の組成物。
- 前記共製剤が、前記酵素をコードする前記核酸及び前記トランスポゾンをコードする前記核酸を含む、請求項５８に記載の組成物。
- 前記酵素が、単量体または二量体形態である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、
（ａ）遺伝子切断（Ｅｘｃ＋）活性、及び／または
（ｂ）遺伝子組み込み（Ｉｎｔ＋）、もしくは組み込みの欠如（Ｉｎｔ－）活性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。 - 細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法であって、細胞を、請求項１～６１のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
- 前記細胞を、トランスポゾンをコードする核酸と接触させることをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
- 前記酵素が、前記トランスポゾンをコードする前記核酸と共製剤化される、請求項６２に記載の方法。
- 前記共製剤が、同じ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である、請求項６２に記載の方法。
- 前記共製剤が、前記酵素をコードする前記核酸と、前記トランスポゾンをコードする前記核酸と、を含む、請求項６５に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号２１及び２２から選択される、１つ以上の逆位末端、またはそれらに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列に隣接している、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項６３～６７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項６３～６８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子を含む、請求項６３～６９のいずれか１項に記載の方法。
- 疾患または障害をエクスビボで治療するための方法であって、細胞を、請求項１～６１のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
- 疾患または障害をインビボで治療するための方法であって、請求項１～６１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１～６１のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞を投与することを含む、前記方法。
- 転位可能なキメラ酵素を含む組成物であって、
（ａ）転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）／ｇＲＮＡ複合体と、
（ｂ）転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素であって、核酸分子のゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨＳ）にＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することが可能な前記酵素と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）を接続するリンカーと、を含む、前記組成物。 - 前記組成物が、生体細胞と接触したときに前記ＧＳＨＳ内の前記トランスポゾンの挿入を引き起こすのに好適である、請求項７３に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤまたはｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、前記キメラ酵素を前記ＧＳＨＳ配列に指向するのに好適である、請求項７３に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、１つ以上の反復配列を含む、請求項７３に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１８．５個の反復配列を含む、請求項７６に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列が、３３または３４アミノ酸を含む、請求項７６または７７に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ反復配列のうちの１つ以上が、前記３３または３４アミノ酸の残基１２及び／または１３に反復可変二残基（ＲＶＤ）を含む、請求項７８に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内の１つの塩基対を認識する、請求項７９に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＣ残基を認識し、かつＨＤ、Ｎ（ギャップ）、ＨＡ、ＮＤ、及びＨＩから選択される、請求項７９に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＧ残基を認識し、かつＮＮ、ＮＨ、ＮＫ、ＨＮ、及びＮＡから選択される、請求項７９に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＡ残基を認識し、かつＮＩ及びＮＳから選択される、請求項７９に記載の組成物。
- 前記ＲＶＤが、前記核酸分子内のＴ残基を認識し、かつＮＧ、ＨＧ、Ｈ（ギャップ）、及びＩＧから選択される、請求項７９に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、染色体中のオープンクロマチン位置にある、請求項７３～８４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、アデノ関連ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体、及びヒトＲｏｓａ２６遺伝子座から選択される、請求項７３～８５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ヒト染色体２、４、６、１０、１１、または１７上に位置する、請求項７３～８６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ＴＡＬＣ１、ＴＡＬＣ２、ＴＡＬＣ３、ＴＡＬＣ４、ＴＡＬＣ５、ＴＡＬＣ７、ＴＡＬＣ８、ＡＶＳ１、ＡＶＳ２、ＡＶＳ３、ＲＯＳＡ１、ＲＯＳＡ２、ＴＡＬＥＲ１、ＴＡＬＥＲ２、ＴＡＬＥＲ３、ＴＡＬＥＲ４、ＴＡＬＥＲ５、ＳＨＣＨＲ２－１、ＳＨＣＨＲ２－２、ＳＨＣＨＲ２－３、ＳＨＣＨＲ２－４、ＳＨＣＨＲ４－１、ＳＨＣＨＲ４－２、ＳＨＣＨＲ４－３、ＳＨＣＨＲ６－１、ＳＨＣＨＲ６－２、ＳＨＣＨＲ６－３、ＳＨＣＨＲ６－４、ＳＨＣＨＲ１０－１、ＳＨＣＨＲ１０－２、ＳＨＣＨＲ１０－３、ＳＨＣＨＲ１０－４、ＳＨＣＨＲ１０－５、ＳＨＣＨＲ１１－１、ＳＨＣＨＲ１１－２、ＳＨＣＨＲ１１－３、ＳＨＣＨＲ１７－１、ＳＨＣＨＲ１７－２、ＳＨＣＨＲ１７－３、及びＳＨＣＨＲ１７－４から選択される、請求項８６または８７に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳが、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む、請求項７３～８８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）、ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）、ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）、ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）、ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）、ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）、ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）、ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）、ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）、ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）、ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）、ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）、ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）、ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）、ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）、ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）、ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）、ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）、ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）、ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）、ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）、ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）、ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）、ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）、ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）、ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）、ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）、ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）、ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）、ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）、ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）、ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）、ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）、ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）、ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）、ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）、ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）、ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）、ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）、ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）、ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）、ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）、ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）、ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）、ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）、ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）、ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）、ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）、ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）、ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）、ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）、ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）、ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）、ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）、ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）、ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）、ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）、ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）、及びＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号９０）のうちの１つに結合する、請求項８９に記載の組成物。
- 前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、
ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）、及び
ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号４２２）のうちの１つ以上を含む、請求項７３～９０のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、ＧＴＴＴＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣ（配列番号９１）、ＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＴＡＣＧ（配列番号９３）、ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡ（配列番号９４）、ＧＴＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴ（配列番号９５）、ＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡ（配列番号９６）、ＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号９７）、及びＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＡ（配列番号９８）から選択されるガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡが、前記酵素をケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に指向する、請求項７３に記載の組成物。
- 前記ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、
ＣＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号９９）、ＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号１００）、ＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号１０１）、ＣＡＣＣＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧ（配列番号１０２）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号１０３）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴ（配列番号１０４）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号１０５）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡ（配列番号１０６）、ＣＡＣＣＧＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１０７）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴ（配列番号１０８）、ＣＡＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１０９）、ＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ（配列番号１１０）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣ（配列番号１１１）、ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴ（配列番号１１２）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号１１３）、ＣＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣ（配列番号１１４）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号１１５）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号１１６）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣ（配列番号１１７）、ＡＡＡＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣ（配列番号１１８）、ＡＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号１１９）、ＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣ（配列番号１２０）、ＡＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣ（配列番号１２１）、ＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２２）、ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣ（配列番号１２３）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＣ（配列番号１２４）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣ（配列番号１２５）、ＡＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣ（配列番号１２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣ（配列番号１２７）、ＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＣ（配列番号１２８）、ＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣ（配列番号１２９）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣ（配列番号１３０）、ＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号１３１）、ＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧ（配列番号１３２）、ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号１３３）、ＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号１３４）、ＡＡＧＴＧＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１３５）、ＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧ（配列番号１３６）、ＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧ（配列番号１３７）、ＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１３８）、ＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧ（配列番号１３９）、ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧ（配列番号１４０）、ＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧ（配列番号１４１）、ＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＧＧ（配列番号１４２）、ＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１４３）、ＴＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧ（配列番号１４４）、ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１４５）、ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号１４６）、ＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧ（配列番号１４７）、ＧＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＡＣ（配列番号１４８）、ＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡ（配列番号１４９）、ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１５０）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧ（配列番号１５１）、ＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号１５２）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡ（配列番号１５３）、ＡＡＧＡＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１５４）、ＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧ（配列番号１５５）、ＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号１５６）、ＧＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号１５７）、ＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＣＴＣＧＧ（配列番号１５８）、ＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡ（配列番号１５９）、ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号１６０）、ＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧ（配列番号１６１）、ＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＣＣＣＡ（配列番号１６２）、ＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＧＧＧ（配列番号１６３）、ＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＧ（配列番号１６４）、ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣ（配列番号１６５）、ＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧ（配列番号１６６）、ＡＣＴＡＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＡＧＣＡＣＣ（配列番号１６７）、ＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１６８）、ＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号１６９）、ＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号１７０）、ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧ（配列番号１７１）、ＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１７２）、ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＧ（配列番号１７３）、ＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧ（配列番号１７４）、ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号１７５）、ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧ（配列番号１７６）、ＧＴＴＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号１７７）、ＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧ（配列番号１７８）、ＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧ（配列番号１７９）、ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＧ（配列番号１８０）、ＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１８１）、ＣＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧ（配列番号１８２）、ＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧ（配列番号１８３）、ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧ（配列番号１８４）、ＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＧ（配列番号３０９）、ＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡ（配列番号３１０）、ＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号３１１）、ＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号３１２）、ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴ（配列番号３１３）、ＴＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号３１４）、ＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣ（配列番号３１５）、ＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＧ（配列番号３１６）、ＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡ（配列番号３１７）、ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴ（配列番号３１８）、ＡＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＡ（配列番号３１９）、ＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号３２０）、ＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴ（配列番号３２１）、ＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧ（配列番号３２２）、ＡＡＧＧＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧ（配列番号３２３）、ＣＡＣＣＡＴＡＣＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号３２４）、ＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧ（配列番号３２７）、ＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２５）、ＴＴＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ（配列番号３２６）、ＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２８）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧ（配列番号３２９）、ＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧ（配列番号３３０）、ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ（配列番号３３１）、ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号３３２）、ＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号３３３）、ＧＡＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧ（配列番号３３４）、ＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧ（配列番号３３５）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号１８５）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号１８６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号１８７）、ＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴ（配列番号１８８）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣ（配列番号１８９）、ＣＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡ（配列番号１９０）、ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＴＴＧＴＡ（配列番号１９１）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＣＴＴＴＡＴ（配列番号１９２）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡ（配列番号１９３）、ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣ（配列番号１９４）、ＣＡＣＣＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡ（配列番号１９５）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧ（配列番号１９６）、ＣＡＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴ（配列番号１９７）、ＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡ（配列番号１９８）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号１９９）、ＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡ（配列番号２００）、ＡＡＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号２０１）、ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣ（配列番号２０２）、ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号２０３）、ＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号２０４）、ＡＡＡＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号２０５）、ＡＡＡＣＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣ（配列番号２０６）、ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号２０７）、ＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号２０８）、ＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣ（配列番号２０９）、ＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣ（配列番号２１０）、ＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＣ（配列番号２１１）、ＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣ（配列番号２１２）、ＡＡＡＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号２１３）、ＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号２１４）、ＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＣ（配列番号２１５）、ＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＣ（配列番号２１６）、ＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号２１７）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴ（配列番号２１８）、ＣＡＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴ（配列番号２１９）、ＣＡＣＣＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡ（配列番号２２０）、ＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡＡ（配列番号２２１）、ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴ（配列番号２２２）、ＣＡＣＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧ（配列番号２２３）、ＣＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号２２４）、ＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣ（配列番号２２５）、ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧＡＴＣＣ（配列番号２２６）、ＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣ（配列番号２２７）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣ（配列番号２２８）、ＡＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣ（配列番号２２
９）、ＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣ（配列番号２３０）、ＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣ（配列番号２３１）、ＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣ（配列番号２３２）、ＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号２３３）、ＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号２３４）、ＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号２３５）、ＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号２３６）、ＡＧＴＡＧＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号２３７）、ＡＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号２３８）、ＴＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２３９）、ＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号２４０）、ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２４１）、ＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号２４２）、ＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣ（配列番号２４３）、ＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号２４４）、ＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧ（配列番号２４５）、ＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４６）、ＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧ（配列番号２４７）、ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号２４８）、ＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号２４９）、ＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧ（配列番号２５０）、ＣＣＧＴＡＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号２５１）、ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＧ（配列番号２５２）、ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ（配列番号２５３）、ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡ（配列番号２５４）、ＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧ（配列番号２５５）、ＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＣＧＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡ（配列番号２５７）、ＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡ（配列番号２５８）、ＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号２５９）、ＴＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧ（配列番号２６０）、ＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡ（配列番号２６２）、ＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧ（配列番号２６３）、ＧＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号２６４）、ＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号２６５）、ＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号２６６）、ＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号２６７）、ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号２６８）、ＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号２６９）、ＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号２７０）、ＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号２７１）、ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号２７２）、ＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号２７５）、ＡＧＡＧＴＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号２７６）、ＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号２７７）、ＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣ（配列番号２７８）、ＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡ（配列番号２７９）、ＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＡ（配列番号２８０）、ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧＧＧ（配列番号２８１）、ＧＣＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧ（配列番号２８２）、ＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号２８３）、ＡＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号２８４）、ＴＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２８５）、ＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡ（配列番号２８６）、ＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号２８７）、ＴＣＴＡＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号２８８）、ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＧ（配列番号２８９）、ＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号２９０）、ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号２９１）、ＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＧＣＡ（配列番号２９２）、ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣＧＧ（配列番号２９３）、ＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号２９４）、ＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９５）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡ（配列番号２９６）、ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号２９７）、ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号２９８）、ＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号２９９）、ＧＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号３００）、ＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号３０１）、ＴＡＧＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧ（配列番号３０２）、ＴＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧ（配列番号３０３）、ＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡ（配列番号３０４）、ＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＧ（配列番号３０５）、ＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧ（配列番号３０６）、ＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ（配列番号３０７）、及びＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０８）から選択されるガイドＲＮＡを含む、請求項７３に記載の組成物。 - 前記ＧＳＨＳが、図３から選択され、前記ＴＡＬＥ ＤＢＤが、図３の配列、またはそのバリアント（例えば、任意選択で挿入、置換、または欠失である約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つの変異を有する）を含む、請求項７３～９２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＧＳＨＳ及び前記ＴＡＬＥ ＤＢＤ配列が、
ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号２３）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３５５）、
ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号２４）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５６）、
ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号２５）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５７）、
ＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２６）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３５８）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２７）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号３５９）、
ＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号２８）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６０）、
ＴＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ（配列番号２９）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＨ（配列番号３６１）、
ＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＧ（配列番号３０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号３６２）、
ＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号３１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ（配列番号３６３）、
ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号３２）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３６４）、
ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡ（配列番号３３）及びＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６５）、
ＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡ（配列番号３４）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３６６）、
ＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡ（配列番号３５）及びＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ（配列番号３６７）、
ＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣ（配列番号３６）及びＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３６８）、
ＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号３７）及びＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ（配列番号３６９）、
ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号３８）及びＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ（配列番号３７０）、
ＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ（配列番号３９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７１）、
ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号４０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ（配列番号３７２）、
ＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号４１）及びＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＩ（配列番号３７３）、
ＧＡＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡ（配列番号４２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７４）、
ＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号４３）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ（配列番号３７５）、
ＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号４４）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号３７６）、
ＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ（配列番号４５）及びＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３７７）、
ＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴ（配列番号４６）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３７８）、
ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号４７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３７９）、
ＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号４８）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８０）、
ＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号４９）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ（配列番号３８１）、
ＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴ（配列番号５０）及びＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８２）、
ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣ（配列番号５１）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ（配列番号３８３）、
ＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号５２）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号３８４）、
ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号３８５）、
ＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＧ（配列番号５４）及びＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号３８６）、
ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ（配列番号５５）及びＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ（配列番号３８７）、
ＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号５６）及びＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３８８）、
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号５７）及びＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ（配列番号３８９）、
ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＣＡ（配列番号５８）及びＨＤ ＮＧ ＮＫ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＩ（配列番号３９０）、
ＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴ（配列番号５９）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号３９１）、
ＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号６０）及びＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号３９２）、
ＣＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６１）及びＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ（配列番号３９３）、
ＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号６２）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号３９４）、
ＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ（配列番号６３）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ（配列番号３９５）、
ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号６４）及びＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９６）、
ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号６５）及びＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号３９７）、
ＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号６６）及びＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号３９８）、
ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６７）及びＮＮ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ（配列番号３９９）、
ＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号６８）及びＮＩ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＨ ＨＤ（配列番号４００）、
ＣＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号６９）及びＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＫ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０１）、
ＧＣＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号７０）及びＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０２）、
ＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴ（配列番号７１）及びＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＨ ＮＨ ＮＩ ＮＧ（配列番号４０３）、
ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣ（配列番号７２）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ（配列番号４０４）、
ＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣ（配列番号７３）及びＮＨ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号４０５）、
ＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧ（配列番号７４）及びＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＨ（配列番号４０６）、
ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴ（配列番号７５）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＨ ＮＧ（配列番号４０７）、
ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号７６）及びＮＨ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ（配列番号４０８）、
ＧＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号７７）及びＮＨ ＮＨ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＨ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ（配列番号４０９）、
ＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号７８）及びＮＨ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＨ（配列番号４１０）、
ＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣ（配列番号７９）及びＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１１）、
ＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡ（配列番号８０）及びＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ（配列番号４１２）、
ＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号８１）及びＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ（配列番号４１３）、
ＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴ（配列番号８２）及びＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号４１４）、
ＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号８３）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号４１５）、
ＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号８４）及びＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ（配列番号４１６）、
ＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴ（配列番号８５）及びＮＨ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＨ ＮＧ ＮＩ ＮＧ（配列番号４１７）、
ＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡ（配列番号８６）及びＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＩ ＮＨ ＮＨ ＨＤ ＮＧ ＮＨ ＮＨ ＮＧ ＮＧ ＮＨ ＮＩ（配列番号４１８）、
ＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８７）及びＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＨＤ（配列番号４１９）、
ＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＡＣＴ（配列番号８８）及びＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ（配列番号４２０）、ならびに
ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡ（配列番号８９）及びＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号４２１）から選択される、請求項７３～９４のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ＧＳＨＳが、前記ＴＡジヌクレオチド部位またはＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位の約２５、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約３００、または約５００ヌクレオチド内にある、請求項７３～９４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、ＴＡジヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項７３～９６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、ＴＴＡＡ（配列番号１）テトラヌクレオチド部位にトランスポゾンを挿入することができる、請求項７３～９６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記転位による標的ゲノム組み込みが可能な酵素をコードする核酸が、インテイン、任意選択でＮｐｕＮ（Ｉｎｔｅｉｎ－Ｎ）（配列番号４２３）及び／またはＮｐｕＣ（Ｉｎｔｅｉｎ－Ｃ）（配列番号４２４）、またはそのバリアントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記核酸が、前記酵素を、第１及び第２の部分の形態で、前記インテインが前記第１及び第２の部分の間でコードされるようにコードし、前記酵素からの前記インテインの翻訳後切除時に前記第１及び第２の部分が機能的酵素に融合されるようになる、請求項９９に記載の組成物。
- 前記酵素が、リコンビナーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記リコンビナーゼが、インテグラーゼまたはトランスポザーゼである、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記インテグラーゼが、トランスポザーゼである、請求項１０２に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼが、超活性を付与する１つ以上の変異を有する、請求項１０３に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼが、哺乳類由来のトランスポザーゼ、任意選択でヘルパーＲＮＡトランスポザーゼである、請求項１０４に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼが、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスに由来する、請求項１０２～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼが、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ、Ｒｏｕｓｅｔｔｕｓ ａｅｇｙｐｔｉａｃｕｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｏｍｕｓ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｍｙｏｔｉｓ ｍｙｏｔｉｓ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓ、Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓ ｋｕｈｌｉｉ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍｏｌｏｓｓｕｓ ｍｏｌｏｓｓｕｓ、またはホモ・サピエンスに由来するトランスポザーゼ酵素の超活性形態を含むがこれらに限定されない、操作されたバージョンである、請求項１０１～１０６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、単量体または二量体形態である、請求項７３～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記酵素が、遺伝子切断（Ｅｘｃ＋）及び／または遺伝子組み込み（Ｉｎｔ＋）、または組み込みの欠如（Ｉｎｔ－）活性を有する、請求項７３～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼ酵素が、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ（ＭＬＴ）トランスポザーゼである、請求項１０１～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
- 野生型ＭＬＴトランスポザーゼが、
ＡＴＧＴＣＧＣＡＡＣＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡＣＴＣＣＧＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＡＡＡＡＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＧＣＡＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＴＣＧＧＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＣＧＧＴＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣＴＣＣＡＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＴＡＡＧＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＣＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣＴＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＣＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＣＴＡＡＡＣＧＴＣＴＣＧＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧＡＴＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＧＴＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＧＴＴＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴ（配列番号５）のヌクレオチド配列、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１１０に記載の組成物。 - 前記野生型ＭＬＴトランスポザーゼが、
ＭＳＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号４）のアミノ酸配列、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１１に記載の組成物。 - 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＡＴＡＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＡＧ（配列番号３）のヌクレオチド配列、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１１０に記載の組成物。 - 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、
ＭＡＱＨＳＤＹＳＤＤＥＦＣＡＤＫＬＳＮＹＳＣＤＳＤＬＥＮＡＳＴＳＤＥＤＳＳＤＤＥＶＭＶＲＰＲＴＬＲＲＲＲＩＳＳＳＳＳＤＳＥＳＤＩＥＧＧＲＥＥＷＳＨＶＤＮＰＰＶＬＥＤＦＬＧＨＱＧＬＮＴＤＡＶＩＮＮＩＥＤＡＶＫＬＦＩＧＤＤＦＦＥＦＬＶＥＥＳＮＲＹＹＮＱＮＲＮＮＦＫＬＳＫＫＳＬＫＷＫＤＩＴＰＱＥＭＫＫＦＬＧＬＩＶＬＭＧＱＶＲＫＤＲＲＤＤＹＷＴＴＥＰＷＴＥＴＰＹＦＧＫＴＭＴＲＤＲＦＲＱＩＷＫＡＷＨＦＮＮＮＡＤＩＶＮＥＳＤＲＬＣＫＶＲＰＶＬＤＹＦＶＰＫＦＩＮＩＹＫＰＨＱＱＬＳＬＤＥＧＩＶＰＷＲＧＲＬＦＦＲＶＹＮＡＧＫＩＶＫＹＧＩＬＶＲＬＬＣＥＳＤＴＧＹＩＣＮＭＥＩＹＣＧＥＧＫＲＬＬＥＴＩＱＴＶＶＳＰＹＴＤＳＷＹＨＩＹＭＤＮＹＹＮＳＶＡＮＣＥＡＬＭＫＮＫＦＲＩＣＧＴＩＲＫＮＲＧＩＰＫＤＦＱＴＩＳＬＫＫＧＥＴＫＦＩＲＫＮＤＩＬＬＱＶＷＱＳＫＫＰＶＹＬＩＳＳＩＨＳＡＥＭＥＥＳＱＮＩＤＲＴＳＫＫＫＩＶＫＰＮＡＬＩＤＹＮＫＨＭＫＧＶＤＲＡＤＱＹＬＳＹＹＳＩＬＲＲＴＶＫＷＴＫＲＬＡＭＹＭＩＮＣＡＬＦＮＳＹＡＶＹＫＳＶＲＱＲＫＭＧＦＫＭＦＬＫＱＴＡＩＨＷＬＴＤＤＩＰＥＤＭＤＩＶＰＤＬＱＰＶＰＳＴＳＧＭＲＡＫＰＰＴＳＤＰＰＣＲＬＳＭＤＭＲＫＨＴＬＱＡＩＶＧＳＧＫＫＫＮＩＬＲＲＣＲＶＣＳＶＨＫＬＲＳＥＴＲＹＭＣＫＦＣＮＩＰＬＨＫＧＡＣＦＥＫＹＨＴＬＫＮＹ（配列番号２）のアミノ酸配列、
またはそれに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１３に記載の組成物。 - 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、超活性を付与する１つ以上の変異を有する、請求項１１０～１１４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、配列番号２の前記アミノ酸配列に対してＳ８Ｐ、Ｃ１３Ｒ、及びＮ１２５Ｋ変異のうちの少なくとも１つに対応する位置に変異を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１５に記載の組成物。
- 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、配列番号２の前記アミノ酸配列に対してＮ１２５Ｋ変異に対応する位置に変異を有する配列番号７のアミノ酸配列を有するか、または前記ＭＬＴトランスポザーゼが、配列番号２の前記アミノ酸配列に対してＳ８Ｐ及びＣ１３Ｒ変異に対応する位置に変異を有する配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１１５に記載の組成物。
- 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、
配列番号２のＳ２位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記置換が、任意選択でＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、任意選択でＳ２Ａから選択される非極性脂肪族アミノ酸であり、及び／または前記酵素が、前記Ｃ末端に追加の残基を有しないか、もしくは
Ｌ５７３Ｘ、Ｅ５７４Ｘ、及びＳ２Ｘに対応する位置に１つ以上の変異を有し、Ｘが、任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸なしであり、任意選択でＸが、Ａ、Ｇ、または欠失であり、任意選択で前記変異が、Ｌ５７３ｄｅｌ、Ｅ５７４ｄｅｌ、及びＳ２Ａである、請求項１１０または１１４に記載の組成物。 - 前記トランスポザーゼ酵素がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、Ｍｙｏｔｉｓ、またはＰｔｅｒｏｐｕｓ ｖａｍｐｙｒｕｓに由来し、任意選択で図７の配列を有する、請求項１０１～１０３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＬＴトランスポザーゼが、図５Ａもしくは図５Ｂから選択される超活性変異、例えば、図５Ａもしくは図５Ｂから選択される約１つ、もしくは約２つ、もしくは約３つ、もしくは約４つ、もしくは約５つの超活性変異、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１０～１１９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記リンカーが、可撓性リンカーである、請求項７３～１２０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記可撓性リンカーが、実質的に、グリシン及びセリン残基からなり、任意選択で前記可撓性リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎが、約１～約１２である、請求項１２１に記載の組成物。
- 前記可撓性リンカーが、約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０アミノ酸残基である、請求項１２１に記載の組成物。
- 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項７３～１２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子を含む、請求項７３～１２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号２１及び２２から選択される、１つ以上の逆位末端もしくは末端配列、またはそれらに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列に隣接している、請求項７３～１２５のいずれか１項に記載の組成物。
- 請求項７３～１２６のいずれか１項に記載のキメラ酵素をコードする、核酸。
- 前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１２７に記載の核酸。
- 前記核酸が、ＲＮＡである、請求項１２７に記載の核酸。
- 前記キメラ酵素が、ベクターに組み込まれている、請求項１２７～１２９のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１３０に記載の核酸。
- 請求項１２７～１３１のいずれか１項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 前記組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である、請求項７３～１２６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項８１～８５のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記酵素をコードする核酸及び前記トランスポゾンをコードする核酸が、同じ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態であり、任意選択で、前記酵素をコードする前記核酸及び前記トランスポゾンをコードする前記核酸を含む混合物の形態である、請求項７３～１３３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＬＮＰが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルアミノエタン－カルバモイルと混合されたカチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリオレイン（グリセリルトリオレエート）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ ２Ｋ）、及び１，２－ジステアロール－ｓｎ－グリセロール－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から選択される１つ以上の脂質を含み、及び／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から選択される１つ以上の分子を含む、請求項１３３または１３４に記載の組成物または核酸。
- 細胞のゲノムに遺伝子を挿入するための方法であって、細胞を、請求項７３～１３５のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
- 前記細胞が、請求項７３～１３５のいずれか１項に記載のキメラ酵素をコードする核酸と接触される、請求項８９に記載の方法。
- 前記細胞が、請求項７３～１３５のいずれか１項に記載のキメラ酵素をコードするＲＮＡと接触される、請求項９０に記載の方法。
- 前記細胞を、トランスポゾンを含む構築物と接触させることをさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
- 前記細胞が、請求項７３～１３１のいずれか１項に記載のキメラトランスポザーゼをコードする核酸と接触される、請求項１１４に記載の方法。
- 前記細胞が、請求項７３～１３１のいずれか１項に記載のキメラ酵素をコードするＤＮＡと接触される、請求項１３６に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、任意選択で配列番号２１及び２２から選択される、１つ以上の逆位末端もしくは末端配列、またはそれらに対して少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列に隣接している、請求項１３６～１４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項１３６～１４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、競合ポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項１３６～１４３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、疾患状態で欠損しているか、または実質的に存在しない遺伝子である、請求項１３６～１４３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４遺伝子（ＡＢＣ）トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＡ４）、またはその機能的断片である、請求項１３６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬＲ）もしくは低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）またはその機能的断片である、請求項１３６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、インビボである、請求項１３６～１４７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、エクスビボである、請求項１３６～１４７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、非キメラトランスポザーゼを用いた方法と比較して、低減された挿入変異誘発または発がんを提供する、請求項１３６～１４９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、遺伝性または後天性疾患の治療を必要とする患者においてそれを行うために使用される、請求項１３６～１４９のいずれか１項に記載の方法。
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