JP2023524995A - イヌｐｄ－１結合性ポリペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書では、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨ含有ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１に結合して拮抗するＶＨＨ含有ポリペプチドが提供される。ＶＨＨ含有ポリペプチドの使用も提供される。

Description

本発明は、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチド、及びイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを使用してイヌＰＤ－１の生物学的活性を調節する方法に関する。そのような方法には、限定されるものではないが、癌を治療する方法が含まれる。幾つかの実施の形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、多価イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドである。

腫瘍浸潤リンパ球は、しばしば、免疫チェックポイントによって抑制される腫瘍反応性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含んでいる。ＣＤ２７９としても知られるプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、活性化されたＴ細胞上に発現される。ＰＤ－１は、腫瘍微小環境内の隣接細胞上のＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）又はＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３）と結合するとＴ細胞受容体シグナル伝達、Ｔ細胞増殖、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗腫瘍活性を阻害する。ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を減少させる及び／又は遮断する抗体は、多様な種類の癌において臨床的便益を示している。

したがって、イヌＰＤ－１に結合するより強力な抗体が治療上必要とされている。

本明細書では、イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドが提供される。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、イヌＦｃ領域を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列のイヌ化型を含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインはイヌ化されている。

幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、配列番号９～配列番号１３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。

幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、２つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、３つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインはイヌＰＤ－１に結合する。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むか、又は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むか、又は配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むか、又は配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、配列番号９～配列番号１３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３のアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、若しくは配列番号５のアミノ酸配列のイヌ化型を含む。幾つかの実施の形態において、各ＶＨＨドメインはイヌ化されている。

幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。幾つかの実施の形態において、Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域である。幾つかの実施の形態において、Ｆｃ領域は、配列番号１９又は配列番号２０のアミノ酸配列を含む。幾つかのそのような実施の形態において、本明細書では、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、イヌＰＤ－１に結合するポリペプチドが提供される。幾つかの実施の形態において、本明細書では、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８のアミノ酸配列からなる、イヌＰＤ－１に結合するポリペプチドが提供される。

様々な実施の形態において、本明細書で提供されるポリペプチドは、生理学的条件下で二量体を形成する。幾つかのそのような実施の形態において、ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。

幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで減少させる又は遮断する。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少させる。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断する。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＩＣ_５０にて遮断する。

幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、イヌＦｃ受容体成分ＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４への結合の低下を伴う。幾つかの実施の形態において、イヌＣＤ１６、ＣＤ３２、及び／又はＣＤ６４へのポリペプチドの結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで野生型ＩｇＧＢ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによる結合と比較して減少している。幾つかの実施の形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ１６へのポリペプチドの結合は、少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍低下している。幾つかの実施の形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ３２又はＣＤ６４へのポリペプチドの結合は、少なくとも１００００倍低下している。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧＢ Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの補体活性化及び／又は炎症の低下を示す。

様々な実施の形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドは、イヌＰＤ－１の生物活性のアンタゴニストである。幾つかの実施の形態において、ポリペプチドは、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でイヌＰＤ－１に結合する。

幾つかの実施の形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が提供される。

幾つかの実施の形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。幾つかの実施の形態において、核酸を含むベクターが提供される。幾つかの実施の形態において、核酸又はベクターを含む宿主細胞が提供される。幾つかの実施の形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。幾つかの実施の形態において、イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法が提供される。幾つかの実施の形態において、上記方法は、ポリペプチドを単離することを更に含む。

幾つかの実施の形態において、癌を伴う被験体に、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを薬学的有効量、投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。幾つかの実施の形態において、癌は、リンパ腫、血管肉腫、肥満細胞癌、黒色腫、骨肉腫、又は乳癌である。幾つかの実施の形態において、癌は、高悪性度リンパ腫、組織球肉腫、悪性組織球症、尿路上皮癌、又は口腔扁平上皮癌である。幾つかの実施の形態において、癌は、腎細胞癌、非小細胞肺癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳癌及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される。

幾つかの実施の形態において、癌を治療する方法は、追加の療法剤を投与することを更に含む。幾つかの実施の形態において、追加の療法剤は、抗癌剤である。幾つかの実施の形態において、抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される。幾つかの実施の形態において、追加の療法剤は、抗癌生物製剤である。幾つかの実施の形態において、抗癌生物製剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１を阻害する作用物質である。幾つかの実施の形態において、抗癌生物製剤は、ＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴを阻害する作用物質である。幾つかの実施の形態において、抗癌生物製剤は、抗体である。幾つかの実施の形態において、抗癌生物製剤は、サイトカインである。幾つかの実施の形態において、抗癌剤は、ＣＡＲ－Ｔ療法薬である。幾つかの実施の形態において、抗癌剤は、腫瘍溶解性ウイルスである。幾つかの実施の形態において、本明細書で提供される癌を治療する方法は、腫瘍切除及び／又は放射線療法を更に含む。

図１Ａ及び図１Ｂは、イヌＰＤ－１を発現する２９３ＦＳ細胞へのＶＨＨドメインを含む抗体の結合を示す図である。 図２Ａ及び図２Ｂは、漸増濃度のイヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインを含む抗体の存在下での、イヌＰＤ－１を発現する２９３ＦＳ細胞へのイヌＰＤ－Ｌ１の結合を示す図である。 図３Ａ～図３Ｃは、Ｆｃ受容体成分のＣＤ１６（図３Ａ）、ＣＤ３２（図３Ｂ）、又はＣＤ６４（図３Ｃ）への野生型又は突然変異型のイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域を含む抗体の結合を示す図である。 図４Ａ及び図４Ｂは、漸増濃度のイヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインと、突然変異型イヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域とを含む抗体の存在下での、ＣＤ４Ｔ細胞（図４Ａ）及びＣＤ８Ｔ細胞（図４Ｂ）の活性化を示す図である。 図５Ａ～図５Ｃは、イヌへのｓｄＡｂの１回目及び２回目の静脈内注入後の抗ＰＤ－１ ｓｄＡｂの平均血漿濃度を示す図である。エラーバーは、各群における３匹のイヌについての平均からの標準偏差を示している。

本明細書に示される実施形態は、イヌＰＤ－１の活性を調節するイヌＰＤ－１結合性ポリペプチド、及び癌を治療する様々な方法におけるそれらの使用に関する。

定義及び様々な実施形態
本明細書に使用されるセクションの見出しは編成のみを目的とし、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

特許出願、特許公報、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすと具体的かつ個別に示されているかのように、引用することにより本明細書の一部をなす。引用することにより本明細書の一部をなす資料と、本明細書で提供される明示的に記載された内容との間に何らかの矛盾又は対立がある場合には、明示的に記載された内容が優先される。

本明細書に記載又は参照される技術及び手順は、一般に十分に理解されており、通常、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)、PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994）、Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)並びにそれらの最新版に記載される広く利用されている方法論等の当業者による慣例的な方法論を用いて使用される。

別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段の要求がない限り、又は明白に特段の指示がない限り、単数名辞は複数を含み、複数名辞は単数を含むものとする。様々な出典又は参考文献の間での定義の矛盾については、本明細書に示される定義が優先される。

一般に、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)でのようなＥＵインデックスの番号付けである。

本明細書に記載される本発明の実施形態は、「からなる（consisting）」実施形態及び／又は「から本質的になる（consisting essentially of）」実施形態を含むと理解される。本明細書で使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、特段の指示がない限り複数の参照を含む。本明細書での「又は」という用語の使用は、選択肢が互いに排他的であることを意味すると解釈されない。

本出願では、「又は」の使用は、明白に特段の指定がない限り又は当業者によって理解されない限り、「及び／又は」を意味する。多項従属請求項の文脈では、「又は」の使用は、２項以上の先行する独立請求項又は従属請求項を引用する。

「参照試料」、「参照細胞」、又は「参照組織」という語句は、少なくとも１つの未知の特徴を有する試料との比較として使用され得る少なくとも１つの既知の特徴を有する試料を示す。幾つかの実施形態において、参照試料は、陽性又は陰性の指標として使用され得る。参照試料を使用することで、未知の特徴を有する試料中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルに対して、例えば、健康な組織中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを確立することができる。幾つかの実施形態において、参照試料は、同じ被験体に由来するが、試験される部分とは異なる被験体の部分に由来する試料である。幾つかの実施形態において、参照試料は、癌を取り囲む又は癌に隣接する組織領域に由来する試料である。幾つかの実施形態において、参照試料は、試験される被験体に由来するものではなく、対象の障害（例えば、特定の癌又はＰＤ－１関連障害）を有する又は有しないことが既知の被験体に由来する試料である。幾つかの実施形態において、参照試料は、同じ被験体に由来するものであるが、被験体が癌を発症する前の時点での試料である。幾つかの実施形態において、参照試料は、同じ被験体又は異なる被験体からの良性癌試料に由来する試料である。比較のために陰性参照試料が使用される場合に、陰性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、該分子が存在しない及び／又は低いレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。比較のために陽性参照試料が使用される場合に、陽性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、或るレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。

療法剤の投与から恩恵を受ける又は療法剤の投与に応答するという文脈において本明細書で使用される「便益」、「臨床的便益」、「応答性」、及び「治療的応答性」という用語は、様々なエンドポイント、例えば、減速及び完全な停止を含む疾患進行の或る程度の抑止、疾患エピソード及び／又は症状の数の減少、病変サイズの縮小、隣接する末梢器官及び／又は末梢組織内への疾患細胞浸潤の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、病気蔓延の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、障害に関連する１つ以上の症状の或る程度の軽減、治療後の無病提示、例えば無増悪生存期間の長さの増加、全生存期間の延長、より高い奏効率、及び／又は治療後の所与の時点での死亡率の低下を評価することによって推し量ることができる。「非応答性」又は「応答しない」被験体又は癌は、「応答する」という上記の条件を満たさないものである。

被験体に関する「イヌ」としては、限定されるものではないが、飼い犬が挙げられる。

「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し得る。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然及び／又は非天然のヌクレオチドを含み、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含み得る。「核酸配列」は、核酸分子又はポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの線状配列を指す。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、及び多量体を含み得る。この定義には、完全長タンパク質及びその断片の両方が含まれる。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本開示の目的で、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換等の修飾（一般に性質について保存的）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであり得る、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅によるエラーによるような偶発的なものであり得る。

本明細書で使用される「ＰＤ－１」は、細胞内でのＰＤ－１前駆体のプロセシングから生ずるあらゆる天然の成熟ＰＤ－１を指す。この用語は、特段の指示がない限り、イヌ及びネコ等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのＰＤ－１を含む。この用語はまた、スプライス変異体又はアレル変異体等のＰＤ－１の天然に存在する変異体を含む。非限定的な例示的なイヌＰＤ－１アミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＯ７４１７１．１に示されている。配列番号１を参照。

抗原又はエピトープに「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当該技術分野で十分に知られている。別の細胞又は物質と反応又は会合するよりも特定の細胞又は物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合に、分子は「特異的な結合」又は「優先的な結合」を示すと言及される。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合に、標的に「特異的に結合」又は「優先的に結合」する。例えば、ＰＤ－１エピトープに特異的に又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他のＰＤ－１エピトープ又は非ＰＤ－１エピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこのエピトープと結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドである。また、この定義を解釈することにより、例えば、第１の標的に特異的又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドが、第２の標的に特異的又は優先的に結合し得る又は結合し得ないことも理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るものの）必ずしも必要としない。一般に、必ずしもそうとは限らないが、結合への言及は優先的な結合を意味する。「特異性」は、結合性タンパク質が抗原に選択的に結合する能力を指す。

本明細書で使用される場合に、ＰＤ－１の活性に関する「調節する」という用語は、ＰＤ－１の活性の変化を指す。幾つかの実施形態において、「調節する」とは、調節物質の不存在下でのＰＤ－１と比較したＰＤ－１活性の減少を指す。

本明細書で使用される場合に、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質等の抗原）上の部位を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸、ポリペプチド、又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面編成物を含み、特定の三次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。エピトープは、標的分子の連続残基及び／又は並置された非連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、通常、変性溶剤への曝露で保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶剤による処理で失われる。エピトープは、限定されるものではないが、少なくとも３個、少なくとも５個、又は８個～１０個の残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態において、エピトープは、２０残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）未満、１５残基未満、又は１２残基未満の長さである。２つの抗体は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合に、抗原内の同じエピトープに結合し得る。幾つかの実施形態において、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基との或る特定の最小距離によって特定され得る。幾つかの実施形態において、エピトープは、上記距離によって特定され得て、抗原結合分子の残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与するそれらの残基に更に限定され得る。エピトープは、様々なスキャンによっても同様に特定され得る。例えば、アラニンスキャン又はアルギニンスキャンは、抗原結合分子が相互作用し得る１つ以上の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基のセットは、特定の抗原結合分子に対するエピトープの一部であることから他の残基を除外するものではない。むしろ、そのようなセットの存在は、最小のエピトープの列（又は種類のセット）を示す。したがって、幾つかの実施形態において、エピトープとして特定された残基のセットは、抗原上のエピトープについての残基の排他的リストではなく、抗原に関連する最小のエピトープを示す。

「非線状エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の非連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの残基がエピトープの他の示された残基と非連続的であるが、１つ以上の残基が他の残基と連続的である場合もある。

「線状エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態において、線状エピトープ内の残基の全てが、抗原結合分子によって直接的に結合される（又は結合に関与する）必要があるわけではないことに留意されたい。幾つかの実施形態において、線状エピトープは、事実上線状エピトープの配列からなるペプチドによる免疫化に由来し得る、又はタンパク質の残部から相対的に分離されたタンパク質の構造区間に由来し得る（こうして、抗原結合分子は、少なくとも主として、まさにその配列区間と相互作用し得る）。

「抗体」及び「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で区別なく使用され、限定されるものではないが、慣例的な抗体（典型的には、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、典型的には重鎖に類似している１つだけの鎖を含む）、ＶＨＨ含有ポリペプチド（少なくとも１つの重鎖のみの抗体可変ドメイン、すなわちＶＨＨを含むポリペプチド）、及び所望の抗原結合活性を示す限り上述のいずれかのフラグメントを含む抗体様抗原結合ドメインを含む様々なポリペプチドを包含する。幾つかの実施形態において、抗体は二量体化ドメインを含む。そのような二量体化ドメインには、限定されるものではないが、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＣＨ１は典型的には、軽鎖定常ドメインＣＬと対をなす一方で、ヒンジは二量体化を介在する）及びＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ヒンジは二量体化を介在する）が含まれる。

抗体という用語には、限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、イヌ化抗体、ネコ化抗体、及びラクダ（ラマを含む）、サメ、マウス、ヒト、カニクイザル等の様々な種の抗体も含まれる。

「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、軽鎖を有しない重鎖の可変ドメイン（又はＶＨＨ）のペア等のドメインを有する抗体を指すために、本明細書では区別なく使用される。

本明細書で使用される「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨドメイン」又は「ＶＨＨ抗原結合ドメイン」という用語は、ラクダ抗体又はサメ抗体等のシングルドメイン抗体の抗原結合部分を指す。幾つかの実施形態において、ＶＨＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と表される３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域とを含む。幾つかの実施形態において、ＶＨＨは、ＶＨＨが実質的に抗原結合及び特異性を維持する限り、部分的なＦＲ１及び／又はＦＲ４のみを含むように又はそれらのフレームワーク領域の一方若しくは両方を欠くように、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよい。

「ＶＨＨ含有ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態において、ＶＨＨポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つ以上のＶＨＨドメインを含み、ここで、各ＶＨＨドメインは、同じ又は異なっていてもよい。幾つかの実施形態において、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。幾つかのそのような実施形態において、ＶＨＨポリペプチドは、二量体を形成し得る。ＶＨＨ含有ポリペプチドの非限定的な構造には、ＶＨＨ_１－Ｆｃ、ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ、及びＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが含まれ、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３は、同じ又は異なっていてもよい。そのような構造の幾つかの実施形態において、或るＶＨＨは、リンカーによって別のＶＨＨに連結され得る、又は或るＶＨＨは、リンカーによってＦｃに連結され得る。幾つかのそのような実施形態において、リンカーは、１個～２０個のアミノ酸、好ましくは、主にグリシン及び任意にセリンから構成される１個～２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨＨ含有ポリペプチドがＦｃを含む場合に、それは二量体を形成する。したがって、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、四価であるとみなされる（すなわち、二量体は４つのＶＨＨドメインを有する）。同様に、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、六価であるとみなされる（すなわち、二量体は６つのＶＨＨドメインを有する）。

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団の抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを含む）を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、モノクローナル抗体の試料は、抗原上の同じエピトープに結合することができる。「モノクローナル」という修飾成句は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離され得る。

「ＣＤＲ」という用語は、少なくとも１つの当業者に対する特定様式によって定義される相補性決定領域を示す。幾つかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組み合わせ、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義（contact definition）のいずれかに従って定義され得る。ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲを含む。

本明細書で使用される「重鎖定常領域」という用語は、少なくとも３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む領域を指す。或る特定の重鎖定常領域はまた、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジ、及び／又はＣＨ４ドメインを含む。当然ながら、ドメイン内の機能を変えない欠失及び改変は、特段の指定がない限り、「重鎖定常領域」という用語の範囲内に包含される。或る特定のイヌのアイソタイプは、更にサブクラスに細分され得る。例えば、イヌＩｇＧ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＧＡ抗体、ＩｇＧＢ抗体、ＩｇＧＣ抗体、及びＩｇＧＤ抗体が挙げられる。

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖定常領域の一部を指す。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。様々な実施形態において、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合に、ヒンジは、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を介在する。Ｆｃ領域は、本明細書で論じられる任意の抗体重鎖定常領域アイソタイプのものであり得る。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、又はイヌＩｇＧＤ Ｆｃである。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＢである。

本明細書で使用される「アクセプターイヌフレームワーク」は、本明細書で論じられるように、イヌ免疫グロブリンフレームワークに由来する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。イヌ免疫グロブリンフレームワーク又はイヌコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターイヌフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができる、又はアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施形態において、アミノ酸の変化の数は、ＶＨＨ等の単一の抗原結合ドメイン内の全てのイヌフレームワークにわたって１０個未満、又は９個未満、又は８個未満、又は７個未満、又は６個未満、又は５個未満、又は４個未満、又は３個未満である。

「親和性」は、分子（例えば、抗体又はＶＨＨ含有ポリペプチド）の単一の結合部位及びその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の合計の強さを指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性又は見かけの親和性は、一般に、それぞれ解離定数（Ｋ_Ｄ）又は見かけのＫ_Ｄによって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されている方法を含む、当該技術分野で既知の通常の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ、ＫｉｎＥｘＡ、フローサイトメトリー、及び／又は表面プラズモン共鳴デバイス等）によって測定され得る。このような方法には、限定されるものではないが、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｏｃｔｅｔ（商標）、又はフローサイトメトリーを要する方法が含まれる。

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、抗原結合分子／抗原相互作用の平衡解離定数を指す。本明細書で「Ｋ_Ｄ」という用語が使用される場合に、それには、Ｋ_Ｄ及び見かけのＫ_Ｄが含まれる。本明細書で使用される見かけのＫ_Ｄは、抗原結合分子又は抗原の５０％がそれぞれ抗原又は抗原結合分子に結合する抗原結合分子又は抗原の濃度である。

幾つかの実施形態において、抗原結合分子のＫ_Ｄは、フローサイトメトリーによって、抗原発現細胞系統を使用し、各抗体濃度で測定された平均蛍光を非線形１サイト結合方程式（graphpad社のＰｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にフィッティングして測定される。幾つかのそのような実施形態において、Ｋ_Ｄは見かけのＫ_Ｄである。

「生物学的活性」という用語は、分子の任意の１つ以上の生物学的特性（ｉｎ ｖｉｖｏで見られるように天然に存在するか、又は組換え手段によって提供される若しくは可能となるかどうか）を指す。生物学的特性には、限定されるものではないが、リガンドの結合、細胞増殖（Ｔ細胞増殖等）の誘導又は増加、及びサイトカインの発現の誘導又は増加が含まれる。

本明細書で使用される「ＰＤ－１活性」又はＰＤ－１の「生物学的活性」という用語には、ＰＤ－１タンパク質の任意の生物学的作用又は生物学的関連機能の少なくとも１つが含まれる。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１活性には、ＰＤ－１がＰＤ－１リガンド（ＰＤ－１Ｌ）又はＰＤ－２リガンド（ＰＤ－２Ｌ）と相互作用又は結合する能力が含まれる。追加の非限定的な例示的なＰＤ－１活性としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の減少、ＣＤ４^＋及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の減少、Ｔ細胞におけるＣＫ２発現及び／又は活性の減少、並びにＴ細胞におけるＣＢＬファミリーのＥ３ユビキチンリガーゼの発現の増加が挙げられる。

「アゴニスト」抗体又は「活性化」抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド等）は、標的抗原の生物学的活性を増加及び／又は活性化する抗体である。幾つかの実施形態において、アゴニスト抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上増加させる。

「アンタゴニスト」抗体、「ブロッキング」抗体、又は「中和」抗体は、標的抗原の生物学的活性を低下及び／又は不活性化する抗体である。幾つかの実施形態において、中和抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上低下させる。

「親和性成熟」ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原に対する親和性に改善をもたらす改変を有しない親ＶＨＨ含有ポリペプチドと比較して１つ以上のＣＤＲに１つ以上のそのような改変を有するＶＨＨ含有ポリペプチドを指す。

本明細書で使用される「イヌ化ＶＨＨ」は、１つ以上のフレームワーク領域が実質的にイヌフレームワーク領域で置き換えられたＶＨＨを指す。幾つかの場合には、イヌ免疫グロブリンの或る特定のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非イヌ残基によって置き換えられる。さらに、イヌ化ＶＨＨは、当初のＶＨＨにもイヌフレームワーク配列にも見られないが、ＶＨＨ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの性能を更に改良及び最適化するために含まれる残基を含み得る。幾つかの実施形態において、イヌ化ＶＨＨ含有ポリペプチドは、イヌＦｃ領域又はイヌ重鎖定常領域を含む。理解されるように、イヌ化配列は、その一次配列によって特定され得て、必ずしも抗体が作製された過程を示すわけではない。

「エフェクター陽性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、並びにＢ細胞活性化等が含まれる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを要し、様々なアッセイを使用して評価することができる。

「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のイヌＦｃ領域には、天然配列のイヌＩｇＧＡ Ｆｃ領域、天然配列のイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域、天然配列のイヌＩｇＧＣ Ｆｃ領域、及び天然配列のイヌＩｇＧＤ Ｆｃ領域、並びにそれらの天然に存在する変異体が含まれる。

「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、天然配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、約１個～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１個～約５個のアミノ酸置換を有する。幾つかの実施形態において、本明細書の変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、それらと少なくとも約９０％の配列同一性、それらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。幾つかの実施形態において、ＦｃγＲは、天然のイヌＦｃＲである。幾つかの実施形態において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体であって、これらの受容体のアレル変異体及び選択的スプライシングされた形態を含む受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有するが、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)、Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)、及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)でレビューされている。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語によって包含される。例えば、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、胎児性受容体ＦｃＲｎを含み、これは、母体のＩｇＧの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）及び免疫グロブリンの恒常性の調節の役割を担う。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)、Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)、国際公開第２００４／９２２１９号（Hintonら）を参照）。

本明細書で使用される「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、当業者が２つ以上の値の間の差を、上記値によって測定される生物学的特徴の文脈内で生物学的意義及び／又は統計学的有意性が殆どない又は全くないとみなすような、２つ以上の数値の間の十分に高度な類似性を示す。幾つかの実施形態において、２つ以上の実質的に同様の値は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％のいずれか１つの概数以下だけ異なる。

ポリペプチド「変異体」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、天然配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されているポリペプチドが含まれる。幾つかの実施形態において、変異体は、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、変異体は、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

本明細書で使用される場合に、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は抗体配列に関する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」及び「ホモロジー」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、特定のペプチド配列又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントのアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（DNASTAR社）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技能の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

アミノ酸置換には、限定されるものではないが、ポリペプチド中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置き換えることが含まれ得る。例示的な置換を表１に示す。アミノ酸置換を対象の抗体に導入し、産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

共通の側鎖特性に従ってアミノ酸をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。

「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得る、クローニングされたポリヌクレオチド（単数又は複数）を含むように操作することができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、以下のエレメントのうちの１つ以上を含み得る：複製起点、対象のポリペプチドの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等）、及び／又は１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及び比色アッセイで使用することができる遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ等）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において対象のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを指す。

「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得る又はレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例示的な真核細胞には、霊長類動物細胞又は非霊長類動物細胞等の哺乳動物細胞、酵母等の真菌細胞、植物細胞、及び昆虫細胞が含まれる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞には、限定されるものではないが、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びに２９３細胞、例えば２９３ＦＳ、及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの追加の派生物、例えば２９３－６Ｅ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、及びＣＨＯ－ＤＳ細胞が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれるが、自然突然変異、偶発突然変異、又は意図的突然変異のため、子孫は必ずしも当初の親細胞と完全に同一（形態又はゲノムＤＮＡ相補において）であるとは限らない。宿主細胞としては、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（複数の場合もある）によりｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「単離された」という用語は、典型的に天然に一緒に見出される又は一緒に産生される成分の少なくとも幾つかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合に、ポリペプチドを含む上清を、それを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的に天然に見られるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合に、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合に、又は例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合に、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。

「被験体」という用語は、動物、例えば哺乳動物を指すために本明細書では使用される。幾つかの実施形態において、限定されるものではないが、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物競技用動物（sport animals）、及び哺乳動物ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。幾つかの例では、「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする。幾つかの実施形態において、治療を受ける被験体は、被験体が治療に関連する障害を有する又は障害を患う十分なリスクがあると特定されている。

本明細書で使用される「疾患」又は「障害」は、治療が必要とされる及び／又は所望される状態を指す。

「腫瘍細胞」、「癌細胞」、「癌」、「腫瘍」、及び／又は「新生物」という用語は、特段の指定がない限り、本明細書では区別なく使用され、身体器官及び系の正常な機能を妨げる制御不能な増殖及び／又は異常な細胞生存の増加及び／又はアポトーシスの阻害を示す細胞（又は複数の細胞）を指す。この定義には、良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに潜伏腫瘍又は微小転移が含まれる。

「癌」及び「腫瘍」という用語は、固形癌及び血液癌／リンパ腺癌を包含するとともに、異形成等の悪性腫瘍、前悪性腫瘍、及び良性腫瘍も包含する。例示的な癌としては、限定されるものではないが、リンパ腫、血管肉腫、肥満細胞癌、黒色腫、骨肉腫、乳癌、腎細胞癌、及び非小細胞肺癌、高悪性度リンパ腫、組織球肉腫、悪性組織球症、尿路上皮癌、口腔扁平上皮癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳癌及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、並びにその他の癌腫及び肉腫、並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫等）及びメイグス症候に関連する異常血管増殖が挙げられる。

本明細書で使用される「非腫瘍細胞」という用語は、正常な細胞又は組織を指す。例示的な非腫瘍細胞には、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、間質性腎臓細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、骨芽細胞、及び乳房、骨格筋、膵臓、胃、卵巣、小腸、胎盤、子宮、精巣、腎臓、肺、心臓、脳、肝臓、前立腺、結腸、リンパ器官、骨に位置する細胞、及び骨由来の間葉系幹細胞が含まれる。本明細書で使用される「末梢に位置する細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞の近く及び／又は腫瘍微小環境内に位置しない非腫瘍細胞を指す。

本明細書で使用される「腫瘍微小環境内の細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞を取り囲む及び／又は腫瘍細胞に栄養を与える細胞、分子、細胞外マトリックス及び／又は血管を指す。例示的な腫瘍微小環境内の細胞又は組織には、限定されるものではないが、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、マクロファージ、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞が含まれる。腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境内に位置する細胞／組織を特定する方法は、本明細書で以下に記載されるように当該技術分野で十分に知られている。

幾つかの実施形態において、「増加」又は「減少」は、それぞれ、統計学的に有意な増加又は減少を指す。当業者に明らかであるように、「調節」はまた、試験作用物質が存在しないことを除き同じ条件と比較した、標的又は抗原のそのリガンド、結合相手、ホモ多量体形若しくはヘテロ多量体形へと会合する相手又は基質の１つ以上に対する親和性、アビディティー、特異性及び／又は選択性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、標的又は抗原が存在する培地又は環境における１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、及び／又は細胞増殖若しくはサイトカイン産生を含み得る。これは、関与する標的に応じて、それ自体が既知の又は本明細書に記載される任意の適切な方法で及び／又は任意の適切なアッセイを使用して決定され得る。

本明細書で使用される場合に、「免疫応答」は、疾患（例えば、癌又は癌転移）の発症を抑止若しくは防止する又はその症状を改善するのに十分である細胞性免疫応答及び／又は体液性免疫応答を包含することが意図される。「免疫応答」は、自然免疫系及び獲得免疫系の両方の側面を包含し得る。

本明細書で使用される場合に、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における疾患用の療法薬の任意の投与又は適用を対象とする。本開示の目的では、有益な又は所望の臨床結果には、限定されるものではないが、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の進展（例えば、転移、例えば肺又はリンパ節への転移）の防止又は遅延、疾患の再発の防止又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患又は疾患の進行の抑止、疾患又はその進行の抑止又は減速、その発達の阻止、及び寛解（部分的でも全体的でも）のいずれか１つ以上が含まれる。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果の軽減も含まれる。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図している。上記に従って、治療という用語は、障害の全ての側面を１００パーセント除去する必要はない。

「改善する」とは、療法剤を投与しない場合と比べて、１つ以上の症状が軽減又は向上することを意味する。「改善」には、症状の持続期間が短縮又は減少することも含まれる。

「抗癌剤」という用語は、本明細書では、その最も広い意味で、１つ以上の癌の治療に使用される作用物質を指すために使用される。そのような作用物質の例示的なクラスには、限定されるものではないが、化学療法剤、抗癌生物製剤（サイトカイン、受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物、及び抗体等）、放射線療法、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ等）、及び腫瘍溶解性ウイルスが含まれる。

「生体試料」という用語は、生きている生き物又はかつて生きていた生き物からの或る量の物質を意味する。そのような物質には、限定されるものではないが、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、及び脾臓が含まれる。

「コントロール」又は「参照」という用語は、分析物を含まないことが既知の組成物（「ネガティブコントロール」）又は分析物を含むことが既知の組成物（「ポジティブコントロール」）を指す。ポジティブコントロールは、既知の濃度の分析物を含み得る。

「抑止」又は「抑止する」という用語は、任意の表現型特徴の減少若しくは停止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低減する」又は「抑止する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる、低減する、又は停止することである。幾つかの実施形態において、「低減する」又は「抑止する」とは、１０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態において、「低減する」又は「抑止する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態において、「低減する」又は「抑止する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態において、上記の量は、或る期間にわたって、同じ期間にわたるコントロールに対して抑止又は減少される。

本明細書で使用される場合に、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患（癌等）の発症を遅らせる、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化させる、抑制する、及び／又は引き延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／又は治療される被験体に応じて、様々な長さの時間となり得る。当業者に明らかであるように、十分な又は大幅な遅延は、事実上、被験体が疾患を発症しないという点で防止を包含し得る。例えば、転移の発生等の末期癌を遅延させることができる。

本明細書で使用される「防止」は、疾患の素因を有し得るが、まだ疾患と診断されていない被験体における疾患の発生又は再発に対する予防をもたらすことを含む。特段の指示がない限り、「低減する」、「抑止する」、又は「防止する」という用語は、全期間にわたる完全な防止を示すのではなく又は必要とするのではなく、測定される期間だけにわたる防止を示す又は必要とする。

物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、被験体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが被験体において所望の応答を誘発する能力等の要因によって変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な作用が物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の有毒作用又は有害作用を上回る量である。治療有効量は、１回以上の投与で送達され得る。治療有効量は、必要な投与量で必要な時間にわたって、所望の治療的結果及び／又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、有効成分（複数の場合もある）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤を投与する被験体に対して許容不可能なほど有毒な追加の成分を含まない調剤を指す。そのような製剤は滅菌され得る。

「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に投与するための「医薬組成物」を一緒に含む療法剤とともに使用される当該技術分野において慣用の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容可能な担体は、使用される製剤にとって適切である。

１つ以上の更なる療法剤と「組み合わせて」の投与には、同時（併用）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。

「同時に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、又は１つの療法剤の投与が他の療法剤の投与に対して短い期間に含まれる、又は両方の療法剤の治療効果が少なくとも或る期間にわたり重複する、投与を指すために使用される。

「連続的に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、時間的に重複しない、又は療法剤の治療効果が重複しない、投与を指すために使用される。

本明細書で使用される場合に、「～と組み合わせて」は、或る治療法の施与に別の治療法を加えることを指す。したがって、「～と組み合わせて」は、或る治療法を、被験体に他の治療法を施す前、その間、又はその後に施すことを指す。

「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれる使用説明書であって、そのような治療製品の使用に関する指示、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、使用説明書を指すために使用される。

「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患若しくは障害（例えば、癌）の治療用の医薬、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）又はキットである。幾つかの実施形態において、製造物又はキットは、本明細書に記載される方法を実施する単位として宣伝、配送、又は販売される。

「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、例えば、抗体又は抗原に結合されて、特異的結合ペアのメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能にする部分を意味する。特異的結合ペアの標識されたメンバーは、「検出可能に標識された」と称される。したがって、「標識された結合性タンパク質」という用語は、結合性タンパク質の特定をもたらす標識が組み込まれたタンパク質を指す。幾つかの実施形態において、標識は、視覚的に又は機器的手段により検出可能なシグナルを生成し得る検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み又はマーキングされたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光学的方法若しくは比色法により検出され得る酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部のポリペプチドへの結合である。ポリペプチドの標識の例には、限定されるものではないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、又は^１５３Ｓｍ）、色素原、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、及びガドリニウムキレート等の磁性剤が含まれる。イムノアッセイに通常使用される標識の代表的な例には、光を発する部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を発する部分、例えば、フルオレセインが含まれる。この点について、その部分自体は検出可能に標識されていない場合もあるが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。

例示的なＰＤ－１結合性ポリペプチド
本明細書では、アンタゴニストのイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドが提供される。様々な実施形態において、アンタゴニストのＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるアンタゴニストのＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１に結合する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるアンタゴニストのイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。そのようなイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１以外の１つ以上の標的タンパク質に結合する１つ以上の追加のＶＨＨドメインを含み得る。

幾つかの実施形態において、アンタゴニストのイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、（ｉ）イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、（ｉｉ）Ｆｃ領域とを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるアンタゴニストのイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、（ｉ）イヌＰＤ－１に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインと、（ｉｉ）Ｆｃ領域とを含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、生理学的条件でイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドの二量体化を介在し、こうして二量体が形成されることにより、イヌＰＤ－１結合部位の数が２倍となる。例えば、Ｆｃ領域とイヌＰＤ－１に結合する３つのＶＨＨドメインとを含むイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、単量体としては三価であるが、生理学的条件では、Ｆｃ領域が二量体化を介在することができ、こうしてイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、そのような条件下で六価の二量体として存在する。

様々な実施形態において、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨＨドメインはイヌ化されている。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインはイヌ化され得る。イヌ化抗体（ＶＨＨ含有ポリペプチド等）は、治療分子として有用である。それというのも、イヌ化抗体は、抗体療法薬に対する免疫応答をもたらして療法薬の有効性を低下させ得る非イヌ抗体に対するイヌ免疫応答を低減又は排除するからである。一般に、イヌ化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非イヌ抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がイヌ抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。イヌ化抗体はまた、任意に、イヌ定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、イヌ化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非イヌ抗体（例えば、ＣＤＲ残基の元となる抗体）からの対応する残基で置換される。

イヌ化に使用され得るイヌフレームワーク領域には、限定されるものではないが、「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296を参照）、重鎖可変領域の特定のサブグループのイヌ抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285、及びPresta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623を参照）、イヌ成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はイヌ生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633を参照）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684、及びRosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271 :22611-22618を参照）が含まれる。典型的には、ＶＨＨのＦＲ領域をイヌＦＲ領域と置き換えることで、イヌ化ＶＨＨが作製される。幾つかの実施形態において、イヌＦＲの或る特定のＦＲ残基を置き換えることで、イヌ化ＶＨＨの１つ以上の特性が改善される。そのような置き換えられた残基を有するＶＨＨドメインも、本明細書では更に「イヌ化」と称される。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１結合性ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の個別に選択されるアミノ酸配列を含む１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１に結合する２つ又は３つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域とを含む。幾つかのそのような実施形態において、各ＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。幾つかの実施形態において、各ＶＨＨドメインは独立して、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

様々な実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、イヌＦｃ領域である、又はイヌＦｃ領域に由来する。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、イヌＦｃ領域に由来し、ＫａｂａｔによりナンバリングされたＩｇＧＢ Ｅ２３３、Ｍ２３４、及びＬ２３５に対応する３つのアミノ酸欠失を下部ヒンジに含み、本明細書で「ｘＥＭＬ」と称される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、イヌＦｃ領域に由来し、Ｋａｂａｔによりナンバリングされた２つの置換Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａを含み、本明細書で「ＤＡＮＡ」と称される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、イヌＦｃ領域に由来し、ｘＥＭＬの３つのアミノ酸の欠失及びＤＡＮＡ置換の両方を含み、本明細書で「ｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ」と称される。Ｆｃ ｘＥＭＬ－ＤＡＮＡポリペプチドはＦｃγＲと結合しないため、「エフェクターサイレント」又は「エフェクターヌル」と称されるが、幾つかの実施形態において、ｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するため、そのような実施形態は、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域を含まないポリペプチドと比較してＦｃＲｎ媒介性リサイクリング（FcRn mediated recycling）と関連したトランスサイトーシス及び半減期の延長を伴う。

イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドで使用され得る非限定的な例示的なＦｃ領域には、配列番号１９及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＦｃ領域が含まれる。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、１つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域とを含み、ここで、ＶＨＨドメインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつＦｃ領域は、ＶＨＨドメインのＣ末端に融合されている。幾つかの実施形態において、１つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域とを含むイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、又はそれらからなる。

ＰＤ－１結合性ポリペプチドの例示的な活性
様々な実施形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－１活性のアンタゴニストである。アンタゴニスト活性は、幾つかの実施形態において、本明細書の実施例において提供される方法を使用して、例えばイヌＰＤ－１を発現する２９３細胞、２９３ＦＳ細胞、又はＣＨＯ細胞を使用して決定され得る。

幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでイヌＰＤ－Ｌ１のイヌＰＤ－１への結合を減少させる及び／又は遮断する。幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでイヌＰＤ－Ｌ１のイヌＰＤ－１への結合を減少させる。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１結合性ポリペプチドは、イヌＰＤ－Ｌ１のイヌＰＤ－１への結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％減少させる。イヌＰＤ－Ｌ１のイヌＰＤ－１への結合の減少は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。本明細書で記載される非限定的な例示的なアッセイは、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを、３ｎＭ～４ｎＭのイヌＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃ融合物（Sino Biological社）及びトランスフェクションされていない２９３ＦＳ細胞又は全長イヌＰＤ－１（配列番号１）を発現するトランスフェクションされた２９３ＦＳ細胞とともにＰＢＳバッファー中で室温にて１時間インキュベートすることを含む。蛍光性抗Ｆｃ特異的二次抗体を使用して、Intellicyt社のｉＱｕｅアナライザーを使用したフローサイトメトリーにより、ＰＤ－１に結合したイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを検出する。試験されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドの各濃度について平均蛍光強度をプロットする。

ポリペプチドの発現及び産生
イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。したがって、様々な実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインをコードする核酸分子が提供される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの、例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。様々な実施形態において、核酸分子は、配列番号１９又は配列番号２０のＦｃ領域等のＦｃ領域を更にコードする。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域とを含み、ＶＨＨドメインが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつＦｃ領域が、ＶＨＨドメインのＣ末端に融合されている、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、又はそれらからなる、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、核酸分子はまた、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドの分泌を指示するリーダー配列もコードすることができ、そのリーダー配列は、典型的には、これが分泌されたポリペプチド中に存在しないように切断される。リーダー配列は、天然の重鎖（又はＶＨＨ）リーダー配列であり得る、又は別の異種リーダー配列であり得る。

核酸分子は、当該技術分野で慣用の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。幾つかの実施形態において、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。

本明細書に記載されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。そのようなベクターには、限定されるものではないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が含まれる。幾つかの実施形態において、２９３細胞、２９３ＦＳ細胞、又はＣＨＯ細胞若しくはＣＨＯ由来細胞等の所望の細胞型、又はＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、細菌細胞等の原核細胞において、又は真菌細胞（酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞等の真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当該技術分野で既知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドの発現に使用され得る例示的な真核細胞には、限定されるものではないが、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３ＦＳ細胞及び２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びにＮＳＯ細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１結合性ポリペプチドは、酵母において発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照。幾つかの実施形態において、特定の真核宿主細胞は、ポリペプチドに対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、幾つかの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高レベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。

所望の宿主細胞への１つ以上の核酸（ベクター等）の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を含むあらゆる方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過的又は安定的にトランスフェクションされ得る。

本明細書に記載される核酸又はベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞で発現されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、任意の適切な方法によって精製され得る。そのような方法には、限定されるものではないが、親和性マトリックス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が含まれる。適切なアフィニティーリガンドには、ＲＯＲ１ ＥＣＤ及びＦｃ領域に結合する作用物質が含まれる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティーカラムを使用して、Ｆｃ領域に結合することで、Ｆｃ領域を含むＰＤ－１結合性ポリペプチドを精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルカラム又はフェニルカラムもまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換等）も、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、無細胞系において産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)、Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)、Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。

幾つかの実施形態において、上記の方法によって作製されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、宿主細胞において作製される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、無細胞系において作製される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは精製される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む細胞培養培地が提供される。

幾つかの実施形態において、上記の方法によって作製された抗体を含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、該組成物は、宿主細胞において作製されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、該組成物は、無細胞系において作製されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、該組成物は、精製されたイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む。

ＰＤ－１結合性ポリペプチドを使用して疾患を治療する例示的な方法
幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを投与することを含む、被験体における疾患を治療する方法が提供される。そのような疾患としては、Ｔ細胞におけるＰＤ－１活性の減少及び／又はＴ細胞活性の増加により利益を得るあらゆる疾患が挙げられる。幾つかの実施形態において、被験体における癌を治療する方法が提供される。該方法は、本明細書で提供される有効量のイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを被験体に投与することを含む。そのような治療方法は、イヌを含む哺乳動物における治療方法であり得る。本明細書で提供されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを用いて治療することができる非限定的な例示的な癌としては、リンパ腫、血管肉腫、肥満細胞癌、黒色腫、骨肉腫、乳癌、腎細胞癌、及び非小細胞肺癌、高悪性度リンパ腫、組織球肉腫、悪性組織球症、尿路上皮癌、口腔扁平上皮癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳癌及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、並びに外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。

イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、必要に応じて被験体に投与され得る。投与の頻度の決定は、治療される病態、治療される被験体の年齢、治療される病態の重症度、治療される被験体の全般的健康状態等の考慮に基づいて、獣医等の当業者によって行われ得る。幾つかの実施形態において、有効用量のイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドが被験体に１回以上投与される。幾つかの実施形態において、有効用量のイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドが、被験体に毎日、週に２回、毎週、２週間ごとに、月に１回等で投与される。有効用量のイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドが被験体に少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドの有効用量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年間にわたる複数回を含む複数回で投与され得る。

幾つかの実施形態において、医薬組成物は、癌を治療（癌の予防を含む）するのに有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被験体の体重、その被験体の身体的状態若しくは健康状態、治療される病態の広範さ、又は治療される被験体の年齢に依存する。一般に、抗体は、用量あたり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ（体重）～約５ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、用量あたり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態において、抗体は、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、例えば、４ｍｇ／ｋｇ未満、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、又は１ｍｇ／ｋｇ未満の範囲の抗体の量で投与され得る。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、又は皮下を含む様々な経路によってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。意図される用途に応じて、適切な製剤及び投与経路を選択することができる。

幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを使用する療法処置は、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることによって達成される。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化の増加は、癌の成長を抑止する。

医薬組成物
幾つかの実施形態において、イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む組成物は、多種多様な薬学的に許容可能な担体を含む製剤で提供される（例えば、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)、Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)を参照）。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容可能な担体が利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤等の様々な薬学的に許容可能な補助物質も利用可能である。非限定的な例示的な担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれる。

幾つかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、又は２５０ｍｇ／ｍＬの濃度でイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを含む。

併用療法
イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、単独で又は他の抗癌剤等の他の治療方式と組み合わせて投与され得る。イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドは、他の治療方式の前、実質的にそれと同時に、又はその後に供給され得る（すなわち、同時に又は連続的に）。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される治療方法は、放射線療法、化学療法、ワクチン接種、標的腫瘍療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌免疫療法、サイトカイン療法、外科的切除、クロマチン修飾、切除、冷却療法、腫瘍標的に対するアンチセンス剤、腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡ剤、腫瘍標的に対するマイクロＲＮＡ剤若しくは抗癌剤／抗腫瘍剤、又は抗体、サイトカイン若しくは受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物等の生物製剤を施すことを更に含み得る。

診断及び治療の非限定的な例示的な方法
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、被験体及び／又は被験体（例えば、癌を伴う被験体）からの検体を評価するのに有用である。幾つかの実施形態において、評価は、診断、予後診断、及び／又は治療への奏効のうちの１つ以上である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、タンパク質の存在、不存在、又はレベルを評価することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、核酸の存在、不存在、又は発現のレベルを評価することを含む。これらの測定に本明細書に記載される組成物を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、腫瘍の検体又は腫瘍から培養された細胞を、本明細書に記載される療法剤と接触させることを含む。

幾つかの実施形態において、評価により、治療（本明細書に記載される抗体による治療を含む）が指示され得る。幾つかの実施形態において、評価により、切除後の補助療法を使用する又は差し控えることが指示され得る。補助治療とも呼ばれる補助療法は、一次治療、主治療、又は初回治療に加えてなされる治療である。非限定的な例として、補助療法は、全ての検出可能な疾患が取り除かれたが、潜在疾患のため再燃の統計的リスクが残っている場合に、通常は手術後になされる追加の治療であり得る。幾つかの実施形態において、上記抗体は、癌の治療における補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態において、上記抗体は、癌の治療における単独補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体は、癌の治療における補助療法薬としては差し控えられる。例えば、被験体が本明細書に記載される抗体に応答する可能性が低い又は最小限の応答しか有しない場合に、生活の質のために、及び無効な化学療法による不必要な毒性を避けるために、治療を施さないこともできる。このような場合に、緩和ケアが使用される場合がある。

幾つかの実施形態において、切除前に術前補助療法薬として上記分子が投与される。幾つかの実施形態において、術前補助療法薬は、任意の手術の前に腫瘍を縮小及び／又はダウングレードする療法薬を指す。幾つかの実施形態において、術前補助療法薬は、手術前に癌を伴う被験体に投与される化学療法薬を意味する。幾つかの実施形態において、術前補助療法薬は、手術前に癌を伴う被験体に投与される抗体を意味する。術前補助化学療法薬が通常考慮される癌型には、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、及び肺癌が含まれる。幾つかの実施形態において、上記抗体は、癌の治療における術前補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態において、その使用は切除前である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法で企図される腫瘍微小環境は、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１つ以上である。

キット
本明細書に記載されるイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドのいずれか及び適切な包装を含む製造品及びキットも提供される。幾つかの実施形態において、本発明は、（ｉ）イヌＰＤ－１結合性ポリペプチドと、（ｉｉ）該キットを使用してイヌＰＤ－１結合性ポリペプチドを被験体に投与するための使用説明書とを含むキットを含む。

本明細書に記載される組成物に適切な包装は、当該技術分野で知られており、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、フレキシブルな包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が含まれる。これらの製造品は、更に滅菌及び／又は密封され得る。本明細書に記載される組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、単回又は多回単位剤形で適切な包装内で保存され得て、更に滅菌及び密封もされ得る。本発明のキットに提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた指示であるが、機械可読の指示（例えば、磁気記憶ディスク又は光学記憶ディスクに保持された指示）も許容可能である。抗体の使用に関する使用説明書は一般に、意図された治療又は工業的使用のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。キットは、被験体の適切な治療を選択することの説明を更に含み得る。

容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多回用量包装）又はサブユニット用量であり得る。例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月以上のいずれかの概数の期間等の長期間にわたって被験体に効果的な治療をもたらすのに十分な用量の本明細書に開示される分子を含むキットも提供され得る。キットはまた、多回単位用量の分子及び使用説明書を含むことができ、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局での保存及び使用に十分な量で包装され得る。幾つかの実施形態において、キットは、再構成、再懸濁、又は再水和することで、一般的に抗体の安定な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を含む。

以下で論じられる実施例は、本発明を純粋に例示することが意図され、決して本発明を限定するとみなされるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が、実施された全て又は唯一の実験であることを表すとは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。特段の指示が無い限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか又は近大気圧である。

実施例１：シングルドメイン抗体のイヌＰＤ－１への結合
配列番号２～配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含むシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインを含むｓｄＡｂを開発した。それぞれ配列番号９～配列番号１３のアミノ酸配列を有する、ＰＤ１－１４のＶＨＨドメインの５つのイヌ化型を作製した。ＰＤ１－５、ＰＤ１－８、ＰＤ１－１３、若しくはＰＤ１－１４のＶＨＨドメイン、又はＰＤ１－１４のＶＨＨドメインのイヌ化型と、ｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ突然変異を含むイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域（配列番号２０）とを含む、表２に列記されたｓｄＡｂを、イヌＰＤ－１への結合について試験した。

イヌＰＤ－１へのｓｄＡｂの結合を以下のように決定した。全長イヌＰＤ－１を発現する一過的にトランスフェクションされた２９３ＦＳ細胞及びトランスフェクションされていない２９３ＦＳ細胞を、別々のウェルにおいて５００００個の細胞／ウェルで播種した。抗体を４００ｎＭから開始して１：３で段階希釈して力価測定し、抗イヌＦｃ６４７二次抗体で検出した。Intellicyt社のｉＱｕｅアナライザーにおいてフローサイトメトリー分析を行い、蛍光を中央蛍光強度としてプロットした。図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、試験された７つの抗体はイヌＰＤ－１に特異的に結合した。イヌＰＤ－１に対するｓｄＡｂの親和性（Ｋ_Ｄ）を以下の表２に列記する。

実施例２：イヌＰＤ－１に結合するシングルドメイン抗体は、イヌＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断する
実施例１に記載されるｓｄＡｂの存在下でのイヌＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を、以下のように決定した。各ｓｄＡｂを、３ｎＭ又は４ｎＭのイヌＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃ融合物（Sino Biological社）及びトランスフェクションされていない２９３ＦＳ細胞又は全長イヌＰＤ－１（配列番号１）を発現するトランスフェクションされた２９３ＦＳ細胞とともにＰＢＳバッファー中で室温にて１時間インキュベートした。蛍光性抗Ｆｃ特異的二次抗体を使用して、Intellicyt社のｉＱｕｅアナライザーを使用したフローサイトメトリーにより、ＰＤ－１に結合したｓｄＡｂを検出した。試験されたｓｄＡｂの各濃度について平均蛍光強度をプロットした。

図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＰＤ１－８を除いて、試験された全ての抗体が、３ｎＭ又は４ｎＭのＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃへのイヌＰＤ－１の結合を同等の効力で用量依存的に遮断した。

実施例３：シングルドメイン抗体のイヌＦｃ受容体成分への結合
ｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ Ｆｃ領域を含むｓｄＡｂへのイヌＦｃ受容体成分ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４の結合を試験した。試験されたｓｄＡｂを表３に列記する。野生型イヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域（配列番号１９）を含むイヌＣＤ１９ ｓｄＡｂをポジティブコントロールとして使用した。

イヌＦｃ受容体成分へのｓｄＡｂの結合を以下のように決定した。全長イヌＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４を発現する一過的にトランスフェクションされた２９３ＦＳ細胞を、別々のウェルに５００００個の細胞／ウェルで播種した。ｓｄＡｂを２５０ｎＭから開始して１：３で段階希釈し、抗イヌＦｃ６４７二次抗体で検出した。蛍光性抗Ｆｃ特異的二次抗体を使用して、Intellicyt社のｉＱｕｅアナライザーを使用したフローサイトメトリーにより、結合したｓｄＡｂを検出した。試験された抗体の各濃度について平均蛍光強度をプロットした。

図３Ａ～図３Ｃに示されるように、Ｆｃ領域にｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ突然変異を含むｓｄＡｂは、野生型Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、Ｆｃ受容体成分ＣＤ１６（図３Ａ）及びＣＤ６４（図３Ｃ）への結合の大幅な低下を示した。さらに、Ｆｃ領域にｘＥＭＬ－ＤＡＮＡ突然変異を含むｓｄＡｂは、Ｆｃ受容体成分ＣＤ３２への結合を一切示さなかった（図３Ｂ）。

実施例４：イヌＰＤ－１に結合するｓｄＡｂによるＴ細胞活性化
イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメインと、ｘＥＭＬ及びＤＡＮＡの突然変異を含むＦｃ領域（配列番号２０）とを含むｓｄＡｂによるＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を試験した。試験されたｓｄＡｂを表４に列記する。９６ウェルのＵ底プレートにおいて１ウェル当たり０．２５×１０^６個の（事前に凍結し、解凍したばかりの）イヌＰＢＭＣを播種した。細胞をｓｄＡｂとともにＦＡＣＳバッファー（１００ｎＭ、１：５）中で４℃にて３０分間インキュベートした。次に、細胞を１回洗浄し、抗イヌＣＤ３－ＦＩＴＣ（クローンＣＡ１７．２Ａ１２ １：５０）、抗イヌＣＤ８－Ａ７００（クローン：ＹＣＡＴＥ５５．９ １：５０）、及び抗イヌＣＤ４－ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＹＫＩＸ３０２．９ １：５０）、並びにＰＩ（１：２０００）及び抗イヌＡ６４７（１：５００）を含む表面染色混合物中で室温にて２０分間インキュベートした。次に、細胞を最後に洗浄し、Sony社のＳＡ３８００アナライザーにおいて分析した。試験された抗体の各濃度について、バックグラウンド補正された平均蛍光強度をプロットし、それを使用して以下の表４に示されるＥＣ_５０値を計算した。

表４並びに図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、試験されたｓｄＡｂはＣＤ４Ｔ細胞（図４Ａ）及びＣＤ８Ｔ細胞（図４Ｂ）を用量依存的に活性化した。

実施例５：イヌＰＤ－１に結合するｓｄＡｂの薬物動態
イヌＰＤ－１に結合するＶＨＨドメイン（配列番号３）と、ｘＥＭＬ及びＤＡＮＡの突然変異を含むＦｃ領域とを含むｓｄＡｂ（Ｆｃドメイン：配列番号２０、ｓｄＡｂ：配列番号２１）の薬物動態を、９．４ｋｇ～１１．９ｋｇの体重を有する生後９ヶ月以上の雄のビーグル犬において試験した。犬を絶食させた後に、抗体（群２、群３、及び群４）又はビヒクルコントロール（群１）を、表５に示されるように、１ｍＬ／ｋｇの投与容量で０．５ｍｇ／ｋｇ／用量（群２）、１．５ｍｇ／ｋｇ／用量（群３）、又は４．５ｍｇ／ｋｇ／用量（群４）にて、それぞれの犬に静脈内注入を介して各注入間に３週間を設けて２回投与した。注入の２時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１４４時間後、３１２時間後、及び４８０時間後に橈側皮静脈から血漿試料を採取し、投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、及び４８時間後に臨床観察を行い、その後は少なくとも１日２回で臨床観察を行った。

ＰＫ分析のために、血漿試料をＥＬＩＳＡにより分析するまで－４０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡは、マウス血清中の抗ＰＤ－１ ｈ－ｍＡＢ用のAcro Biosystems社の競合ＥＬＩＳＡアッセイキット（カタログ番号：ＥＰＭ－Ｖ１）の改変版であった。改変版においては、以下の変更を加えた：１）キットが推奨する正常なマウス血清を正常なイヌ血漿のプールに置き換え、２）キットに付属のヒトＰＤ－１を代替の組換えヒトＰＤ－１に置き換え、かつ３）キットに付属のストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）試薬を市販のストレプトアビジン－ＨＲＰ試薬に置き換えた。予備実験により、改変されたキットがイヌ血漿中のイヌ抗ＰＤ－１ ｍＡｂの測定に適していることが示された。簡潔には、研究対象からのイヌ血漿をアッセイの説明書に従ってキット付属のビオチン化抗ＰＤ－１抗体と混合し、インキュベートした後に、組換えヒトＰＤ－１で事前にコーティングされ、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに加えた。適切なインキュベーションの後に、プレートを洗浄し、市販のストレプトアビジン－ＨＲＰ試薬とともにインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢベースの基質とともにインキュベートし、１ＮのＨＣｌの添加により止め、最後にプレートリーダーにおいてＯＤ４５０ｎｍで読み取った。試料ウェル（又は標準）のＯＤ値を正常なイヌ血漿のみを含むウェル（全結合活性）と比較することによって、結合パーセントを計算した。正常なイヌ血漿中で希釈された既知の濃度のイヌ抗ＰＤ－１ ｍＡｂを使用して、各ＥＬＩＳＡプレートにおける検量線を作成した。

Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ビルド８．１．０．３５３０）を使用して、投与のＩＶ注入経路と一致する非コンパートメントアプローチに従って、血漿濃度のＥＬＩＳＡ定量化に基づく薬物動態評価を終えた。

各血液試料の血漿中のｓｄＡｂの濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、見かけの終末相消失半減期（Ｔ_１／２）、用量投与の開始から最後の定量可能な濃度までの時間に対する曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）、全身クリアランス（Ｃｌ）、及び定常状態でのｓｄＡｂの分布容積（Ｖ_ｓｓ）を計算した。この評価により、抗ＰＤ－１ ｓｄＡｂの平均半減期が６７．８時間～８９．８時間であることが示された。１回目及び２回目のＩＶ注入についての抗ＰＤ－１ ｓｄＡｂの平均半減期は、それぞれ６７．８時間～７９．７時間及び７７．８時間～８９．８時間であった。クリアランス（平均１．６３ｍＬ／時間／ｋｇ～２．４７ｍＬ／時間／ｋｇ）及び分布容積（平均１２８ｍＬ／ｋｇ～２０２ｍＬ／ｋｇ）は低かった。曝露（ＡＵＣ）は用量に比例して０．５ｍｇ／ｋｇから４．５ｍｇ／ｋｇまで増加し、２回の注入後に蓄積は見られなかった。

臨床病理学、フローサイトメトリー、又はサイトカインレベルにおける被験物質関連の観察又は変化が見られないことに基づいて、抗ＰＤ－１ ｓｄＡｂは、２回の静脈内（ＩＶ）注入として投与された場合に全ての用量及び投与の時点で忍容性が良好であった。結果を以下の表５及び図５Ａ～図５Ｃにまとめる。

Claims (38)

1. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのイヌ化ＶＨＨドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、イヌＦｃ領域を含み、かつイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、
   ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
   ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
   ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は、
   ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
   を含む、ポリペプチド。
2. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、イヌＦｃ領域を含み、かつイヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２～配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
3. １つのＶＨＨドメインを含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
4. ２つのＶＨＨドメインを含み、前記２つのＶＨＨドメインは、同じ又は異なるものである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
5. ３つのＶＨＨドメインを含み、前記３つのＶＨＨドメインは、同じ又は異なるものである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
6. 各ＶＨＨドメインは、イヌＰＤ－１に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 前記イヌＦｃ領域は、イヌＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 前記イヌＦｃ領域は、イヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域である、請求項７に記載のポリペプチド。
9. Ｋａｂａｔナンバリングによって決定されるＦｃ領域のアミノ酸Ｅ２３３、Ｍ２３４、及びＬ２３５が欠失している、請求項７又は８に記載のポリペプチド。
10. 前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによって決定されるＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａの置換を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. 前記Ｆｃ領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 前記イヌＦｃ領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
14. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
15. 前記ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０又は請求項１２～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
16. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、イヌ化されている、請求項１又は請求項３～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
17. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのイヌ化ＶＨＨドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、配列番号９～配列番号１３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
18. イヌＰＤ－１に結合する少なくとも１つのイヌ化ＶＨＨドメインは、配列番号９～配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６又は１７に記載のポリペプチド。
19. 前記ポリペプチドは、配列番号１４～配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
20. 生理学的条件下で二量体を形成する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
21. 前記ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでイヌＰＤ－１のイヌＰＤ－Ｌ１への結合を減少させる、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
22. 前記ポリペプチドは、イヌＰＤ－１のイヌＰＤ－Ｌ１への結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％減少させる、請求項２１に記載のポリペプチド。
23. イヌＰＤ－１の生物学的活性のアンタゴニストである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
24. 前記ポリペプチドは、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でイヌＰＤ－１に結合する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
26. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
27. 請求項２６に記載の核酸を含むベクター。
28. 請求項２６に記載の核酸又は請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
29. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
30. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項２８又は請求項２９に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。
31. 前記ポリペプチドを単離することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
32. イヌＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はイヌＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化させる方法であって、前記Ｔ細胞を請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、方法。
33. 前記Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、請求項３２に記載の方法。
34. 前記Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで存在する、請求項３２に記載の方法。
35. イヌにおける癌を治療する方法であって、癌を伴うイヌに、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項２５に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。
36. 前記癌は、リンパ腫、血管肉腫、肥満細胞癌、黒色腫、骨肉腫、乳癌、腎細胞癌、及び非小細胞肺癌から選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 追加の抗癌療法を更に含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
38. 前記追加の抗癌療法は、癌切除、放射線療法、及び追加の抗癌剤の投与から選択される少なくとも１つの療法を含む、請求項３７に記載の方法。

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