CN110194799B - 结合犬pd-1的抗犬pd-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗犬PD‑1抗体及其制备方法，所述犬源PD‑1抗体能够结合犬PD‑1，所述抗犬PD‑1抗体包含三个轻链互补决定区(CDR1‑3)或保持其功能的保守修饰的变体和/或三个重链互补决定区(CDR1‑3)或保持其功能的保守修饰的变体。

Description

结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体
技术领域
本发明涉及结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体及其制备方法。
背景技术
目前全球公认的有超过400个犬的品种，犬种的遗传变异水平可能与人类一样广泛。由于犬的寿命延长，过去二十年来犬癌的发病率逐渐增加。在美国，每年有超过166万人(约500/100 000)和超过420万只犬(约5300/100000)被诊断患有癌症。一些纯种犬对特定的癌症具有更高的易感性，有时甚至对多种类型的癌症均易感。与人类患者相比，犬癌的早期检测具有挑战性，并且通常在癌症晚期才可明确诊断。犬与人类之间的共患癌症包括肉瘤(骨肉瘤，软组织肉瘤，组织细胞肉瘤，血管肉瘤)，血液系统恶性肿瘤(淋巴瘤，白血病)，膀胱癌，颅内肿瘤(脑膜瘤，神经胶质瘤)和黑色素瘤。
PD-1(Programmed Cell Death Protein 1，PD-1)是一种重要的免疫抑制分子。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1受体是一种抑制性T细胞受体，通过其两种已知配体PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)，主要在肿瘤微环境中起作用。
另外，抗原呈递细胞表面的PD-L1可与T细胞上的CD80结合，抑制免疫应答。在肿瘤局部微环境中，PD-1/PD-L1信号通路激活可使肿瘤特异性T细胞免疫效应降低，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长。
Duraiswamy等的研究也发现：肿瘤微环境中的TILs(肿瘤浸润性淋巴细胞)的耗竭与肿瘤细胞和髓系来源的抑制性细胞(肿瘤相关巨噬细胞、树突细胞等)所表达的PD-L1密切相关。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以增强效应性CD8T细胞的功能，同时抑制Treg细胞和髓系来源抑制细胞的功能，由此加强免疫系统的抗肿瘤效应。
犬癌症是良好的自发性癌症比较模型，犬癌症治疗通常遵循与人类医学相同的原理。
发明内容
本发明涉及针对犬PD-1的抗犬PD-1抗体，其具有对犬PD-1的高结合亲和力，并且具有功能性阻断犬PD-1与PD-L1相结合的能力。在具体的实施方案中，本发明的抗犬PD-1抗体是鼠抗犬PD-1抗体。在具体的实施方案中，本发明的抗犬PD-1抗体是鼠抗犬PD-1单克隆抗体。
本发明还涉及针对犬PD-1的抗犬PD-1抗体的功能性片段，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段具有对犬PD-1的高结合亲和力，并且具有功能性阻断犬PD-1与PD-L1相结合的能力。
本发明还涉及抗犬PD-1抗体的制备方法。
第一方面，本发明提供了能够结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体，所述抗犬PD-1抗体包含三个轻链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体和/或三个重链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体。在一个实施方案中，编码所述轻链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)；TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ IDNO：2)；和TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)；编码所述轻链互补决定区CDR2的核苷酸序列为：GACACATCC(SEQ ID NO：4)；编码所述轻链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)；CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ IDNO：6)；和CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ ID NO：7)；编码所述重链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)；和GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)；编码所述重链互补决定区CDR2的核苷酸序列选自：ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)；ATTGATCCTGC GATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)和ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)；编码所述重链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)；GCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTAC(SEQ ID NO：14)；和GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQID NO：15)。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含三个轻链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体和三个重链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体；编码所述轻链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)；TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)；和TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)；编码所述轻链互补决定区CDR2的核苷酸序列为：GACACATCC(SEQ ID NO：4)；编码所述轻链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)；CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ ID NO：6)；和CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ IDNO：7)；编码所述重链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQID NO：8)；和GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)；编码所述重链互补决定区CDR2的核苷酸序列选自：ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)；ATTGATCCTGCGATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)和ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)；编码所述重链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)；GCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTAC(SEQ ID NO：14)；和GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)的如下组合：(1)CDR1：由TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码；(2)CDR1：由TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ ID NO：6)所示的核苷酸序列编码；以及(3)CDR1：由TCAAG TATAACTTAC(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ ID NO：7)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自如下的三个重链互补决定区(CDR1-3)的如下组合：(1)CDR1：由GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码；(2)CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTAC(SEQ ID NO：14)所示的核苷酸序列编码；以及(3)CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)和三个重链互补决定区(CDR1-3)的如下组合：(1)轻链CDR1：由TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码；(2)轻链CDR1：由TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQID NO：6)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGAC ACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTAC(SEQ ID NO：14)所示的核苷酸序列编码；和(3)轻链CDR1：由TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ ID NO：7)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACAT TAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGAT TGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTGGGTTCTA TGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自由如下所示的核苷酸序列编码的轻链可变区：(1)
GCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCATATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATTAAA(SEQ ID NO：16)；(2)CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG(SEQ ID NO：17)；和(3)CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCCATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAACTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAAGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCACCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO：18)。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自由如下所示的核苷酸序列编码的重链可变区：(1)GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATCAAAGACACCTATATGCATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGATAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：19)；(2)GAGGTTCGGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTACACTGGTTGAAGGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATACTAGATATGACCCGAAGTTCCAGGTCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：20)；和(3)GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATCCTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAGGGCCACTATAACTGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：21)。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体包含选自如下的轻链可变区和重链可变区的如下组合：(1)由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码的重链可变区；(2)由SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列编码的重链可变区；以及(3)由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码的重链可变区。
所述SEQ ID NO：16对应的氨基酸序列为：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYMYWFQQKPGSSPRLWIYDTSNLVSGVPARFSGSRSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYSGHPSSFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：22)；
所述SEQ ID NO：17对应的氨基酸序列为：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMFWYQQKPGSSPRLWIYDTSNLVSGVPARFSGSRSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYSGYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：23)；
所述SEQ ID NO：18对应的氨基酸序列为：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSITYMFWYQQKPGSSPRLWIYDTSNLVSGVPARFSGSKSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCQQYSGYPSTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：24)。
所述SEQ ID NO：19对应的氨基酸序列为：
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIDNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASGFYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：25)。
所述SEQ ID NO：20对应的氨基酸序列为：
EVRLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYLHWLKERPEQGLEWIGRIDPAIGNTRYDPKFQVKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDSAVYYCARGFYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：26)。
所述SEQ ID NO：21对应的氨基酸序列为：
EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIGNPKYDPKFQGRATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASGFYAMDCWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：27)。
优选地，所述抗犬PD-1抗体为鼠抗犬PD-1抗体。优选地，所述抗犬PD-1抗体为鼠抗犬PD-1单克隆抗体。优选地，所述抗犬PD-1抗体能够阻断犬PD-1与犬PD-L1相结合。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的亲和力为1.000E-07至1.000E-12。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体阻断犬PD-1和犬PD-L1的结合，所述抗犬PD-1抗体与犬PD-1和犬PD-L1的亲和力为1.000E-07至1.000E-12。
第二方面，本发明提供了能够结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体的功能性片段，其包含三个轻链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体的组合，或者包含三个重链互补决定区(CDR1-3)或保持其功能的保守修饰的变体的组合；编码所述轻链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)；TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)；和TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)；编码所述轻链互补决定区CDR2的核苷酸序列为：GACACATCC(SEQ ID NO：4)；编码所述轻链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)；CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ IDNO：6)；和CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ ID NO：7)；编码所述重链互补决定区CDR1的核苷酸序列选自：GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)；和GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)；编码所述重链互补决定区CDR2的核苷酸序列选自：ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)；ATTGATCCTG CGATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)和ATTGATCCTGCGATTGGTAATCC T(SEQ ID NO：12)；编码所述重链互补决定区CDR3的核苷酸序列选自：GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)；GCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTAC(SEQ ID NO：14)；和GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQID NO：15)。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)的如下组合或保持其功能的保守修饰的变体：(1)CDR1：由TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码；(2)CDR1：由TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAACAGTACAGTGGTTACCCGTA CACG(SEQ ID NO：6)所示的核苷酸序列编码；以及(3)CDR1：由TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由CAGCAGTACAGTGG TTACCCATCCACG(SEQ ID NO：7)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的三个重链互补决定区(CDR1-3)的如下组合或保持其功能的保守修饰的变体：(1)CDR1：由GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码；(2)CDR1：由GGCTTCAA CATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGAT TGGTAATACT(SEQ ID NO：11)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTAGAGGGTTCTATGGTATG GACTAC(SEQ ID NO：14)所示的核苷酸序列编码；以及(3)CDR1：由GGCTTCAACATTAAA GACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)所示的核苷酸序列编码；CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)和三个重链互补决定区(CDR1-3)的如下组合或保持其功能的保守修饰的变体：(1)轻链CDR1：由TCAAGTGTAACTT AC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATCAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码；(2)轻链CDR1：由TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ IDNO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ ID NO：6)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTAGAGGGTTCTATGGTATG GACTAC(SEQ ID NO：14)所示的核苷酸序列编码；和(3)轻链CDR1：由TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTTAC CCATCCACG(SEQ ID NO：7)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGAC ACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)和三个重链互补决定区(CDR1-3)的如下组合：(1)轻链CDR1：由TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ IDNO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATCAAAGA CACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码；(2)轻链CDR1：由TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO：2)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACG(SEQ ID NO：6)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATT AAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGA TTGGTAATACT(SEQ ID NO：11)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTAGAGGGTTCTATGGTATG GACTAC(SEQ ID NO：14)所示的核苷酸序列编码；和(3)轻链CDR1：由TCAAGTATAACTTAC(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR2：由GACACATCC(SEQID NO：4)所示的核苷酸序列编码；轻链CDR3：由CAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACG(SEQ IDNO：7)所示的核苷酸序列编码；重链CDR1：由GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO：9)所示的核苷酸序列编码；重链CDR2：由ATTGATCCTGCGATTGGTAATCCT(SEQ ID NO：12)所示的核苷酸序列编码；重链CDR3：由GCTTCTG GGTTCTATGCTATGGACTGC(SEQ ID NO：15)所示的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的轻链可变区：(1)由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码的轻链可变区；(2)由SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列编码的轻链可变区；和(3)由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的重链可变区：(1)由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码的重链可变区；(2)由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列编码的重链可变区；和(3)由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码的重链可变区。
在一个实施方案中，所述抗犬PD-1抗体的功能性片段包含选自如下的轻链可变区和重链可变区的如下组合或保持其功能的保守修饰的变体：(1)由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码的重链可变区；(2)由SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列编码的重链可变区；以及(3)由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码的重链可变区。
优选地，所述功能性片段为抗原结合片段。
缩略语和关键术语定义：
PD-1(程序性细胞死亡受体1，PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个由268个氨基酸残基构成的膜蛋白。PD-1最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11中克隆出来的。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。
PD-1受体是一种抑制性T细胞受体，通过其两种已知配体PD-L1(程序性细胞死亡配体1)(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(程序性细胞死亡配体2)(也称为B7-DC或CD273)，主要在肿瘤微环境中起作用。PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到与PD-1相同的作用。PD-1和PD-L1的结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。因此，PD-1与PD-L1在机体的抗肿瘤免疫过程中起着重要的作用。
PD-1受体对癌症直接传递的免疫抑制信号选择性增加，并且PD-1在调节主要作用因子中发挥作用。在人类医学领域，来自临床前模型的最新证据强调了PD-1T细胞共受体及其配体B7-H1/PD-L1和B7-DC/PD-L2在维持免疫抑制性肿瘤微环境中的关键作用[4]。
PD-1与PD-L1/PD-L2结合后可通过免疫受体酪氨酸转化基序ITSM募集酪氨酸磷酸酶SHP-2，进而去磷酸化TCR信号通路上的多个关键分子，抑制初始T细胞的活化和效应T细胞的功能，诱导调节T细胞的产生及维持调节T细胞的抑制功能。另外，抗原呈递细胞表面的PD-L1可与T细胞上的CD80结合，抑制免疫应答。在肿瘤局部微环境中，PD-1/PD-L1信号通路激活可使肿瘤特异性T细胞免疫效应降低，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长。
具体的抗肿瘤机制可能有以下几个方面：
(1)肿瘤细胞表面的PD-L1与肿瘤特异性T细胞表面的PD-1结合后能诱导T细胞耐受、凋亡和耗竭；
(2)活化的PD-1可以通过选择性抑制RAS/MEK/ERK及PI3K/AKT信号通路，进而抑制细胞周期相关基因的转录和蛋白质表达，阻碍细胞周期，由此抑制T细胞增殖；以及
(3)抗原呈递细胞表面的PD-L1能通过下调CD4T细胞中的信号分子mTOR、AKT、S6和ERK2的磷酸化水平及上调PTEN的表达，来促进CD4T细胞向诱导性Treg(i Treg)的转化并维持其抑制功能，继而抑制效应性T细胞的活性。
另外，Duraiswamy等的研究也发现：肿瘤微环境中的TILs(肿瘤浸润性淋巴细胞)的耗竭与肿瘤细胞和髓系来源的抑制性细胞(肿瘤相关巨噬细胞、树突细胞等)所表达的PD-L1密切相关。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以增强效应性CD8T细胞的功能，同时抑制Treg细胞和髓系来源抑制细胞的功能，由此加强免疫系统的抗肿瘤效应。
PD-1抗体和PD-L1抗体通过阻断PD-1与PD-L1的结合，恢复T细胞活性，从而发挥抗肿瘤作用。
犬癌症是良好的自发性癌症比较模型[5]，犬癌症治疗通常遵循与人类医学相同的原理。有研究对犬PD-1和PD-L1进行了分子鉴定，并讨论了它们作为犬肿瘤治疗靶点的潜力。研究发现PD-L1仅在少量肿瘤细胞系的细胞表面表达，但是在几乎所有细胞系的细胞内部均有表达。且PD-L1在犬恶性黑色素瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤和血管肉瘤中高频表达。通过对犬肿瘤样本进行流式细胞术，蛋白质印迹和免疫组织化学分析，结果显示犬肥大细胞瘤，恶性黑素瘤，乳腺肿瘤和软组织肉瘤似乎是使用PD-1和PD-L1抗体治疗的良好肿瘤候选者。因此，本发明的抗犬PD-1抗体及其功能性片段可作为抗犬肿瘤的候选药物，增强犬免疫系统的抗肿瘤效应，从发挥作为治疗性抗体的效应子功能。为犬癌症的广谱治疗提供了一种非常有效的方法。
“保守修饰变体”是指用具有类似特性的氨基酸取代某个蛋白中的相应氨基酸，并且保持所述蛋白的生物活性不变。示例性的保守氨基酸取代如下表所示：
Figure GDA0003024556200000141
Figure GDA0003024556200000151
附图说明
图1显示了由Expi293F细胞表达载体质粒并经纯化获得的抗原片段的SDS-PAGE电泳图谱，以及Western Blot电泳图谱。
图2显示了所有两组六只小鼠在免疫21天后的ELISA实验结果。
图3显示了两个杂交瘤细胞库上清液对犬PD-1的免疫反应的ELISA检测结果。
图4显示了随着时间的迁移变化确定的结合
图5-9，显示了编号M1到M30的30株抗体随时间变化与PD-1His的应答。
图10显示了测量随着时间的迁移变化确定的结合。
图11-图12显示了分析物为PD1Fc的M1-M的测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
实施例：
实验材料与方法：
1.准备质粒
1)设计、优化并合成靶DNA序列；
2)将完整序列亚克隆到pcDNA3.1载体质粒中；
3)大量制备Expi293F细胞表达所需的转染质粒。
2.细胞培养和瞬时转染
1)在无血清Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞；
2)将细胞培养瓶置于37度，8％CO2的培养箱中震荡培养，转染前一天，将细胞以合适密度接种于Corning细胞培养瓶中；
3)在转染当天，将DNA和转染试剂以最佳比例混合，然后加入到培养瓶中进行细胞转染；
4)将靶蛋白的重组质粒瞬时转染到悬浮Expi293F细胞培养液中；
5)在第6天收集细胞培养上清液用于纯化。
3.纯化与分析
1)离心细胞培养液；
2)将上清缓慢加入到亲和纯化柱中；
3)用适当的缓冲液清洗并洗脱后，合并洗脱液并将缓冲液更换为最终的制剂配制缓冲液；
4)通过SDS-PAGE和Western印迹分析纯化的蛋白质，进行分子量和纯度的测量；
5)以BSA为标准，用BCA法测定蛋白浓度。
4.小鼠抗犬PD-1单克隆抗体的制备和筛选
1)小鼠快速免疫，每组3只Balb/C小鼠，共两组；
2)在第21天利用ELISA检测所有6只小鼠的血清抗原滴度；
3)小鼠快速免疫、融合、选择、杂交瘤；
4)ELISA检测杂交瘤细胞上清抗原滴度；
5)流式细胞仪对杂交瘤细胞上清进行筛选；
6)小鼠单克隆抗体培养，1cell/孔，共30个96孔平板；
7)ELISA检测小鼠单克隆抗体抗原滴度，共10个平板筛选；
8)挑选单克隆扩增及冷冻保存；
9)小鼠单克隆抗体上清液的动力学亲和力分析；
10)小鼠单克隆抗体上清液的动力学交叉阻断分析。
实施例1.制备抗原及标准品
挑选犬PD-1蛋白的第25到第168个氨基酸，去掉了前面的信号肽，并在末端加上用于纯化和检测用的His标记。将对应于该抗原片段的合成的基因片段克隆到pUC57质粒载体中保存，然后亚克隆到pcDNA 3.1质粒中，大量制备Expi293F细胞表达的转染质粒；悬浮培养Expi293F细胞，并完成质粒的瞬时转染，纯化分析蛋白并测定浓度。结果参见附图1A和1B，图1A显示了SDS-PAGE电泳图谱，M泳道为蛋白标志物，分别对应200kD,116kD,97kD,66kD,44kD,29kD,20kD,14kD和6kD；泳道1显示还原条件下的纯化蛋白；泳道2显示了非还原条件下的纯化蛋白；以及图1A显示了Western Blot电泳图谱，M泳道为蛋白标志物，分别对应120kD,80kD,60kD,50kD,42kD,32kD和18kD；泳道P显示His-tag蛋白阳性对照；泳道1显示还原条件下的纯化蛋白；泳道2显示了非还原条件下的纯化蛋白，第一抗体：小鼠抗-HismAb。
Figure GDA0003024556200000171
Figure GDA0003024556200000181
实施例2.制备鼠单克隆抗体
用实施例1制备的蛋白作为抗原快速免疫小鼠，每组3只，共两组，在第21天检测免疫小鼠血清抗原滴度，融合、选择，建立杂交瘤细胞库。检测杂交瘤细胞库上清抗原滴度并用流式细胞仪进行筛选，挑选单克隆进行培养、扩增及冷冻保存，最后进行小鼠单克隆抗体上清动力学亲和力和动力学较差阻断分析。
1.第21天小鼠血清分析参数描述：
在EIA/RIA聚苯乙烯板上涂敷抗原--->阻断--->第一抗体--->检测抗体--->底物--->停止并读数。
分析类型：固相抗原ELISA
Ag ID:PD-1His
Ab ID:PD-1A小鼠血清，D21m1-m3Ab
Ab稀释度：1/1000
Ab ID:PD-1S小鼠血清，D21m1-m3Ab
Ab稀释度：1/1000
Ab ID：正常小鼠血清Ab
Ab稀释度：1/1000
检测试剂ID：山羊抗小鼠HRP
稀释度：1/5000
第21天小鼠血清测试结果见表1。
表1：第21天小鼠血清测试结果
Figure GDA0003024556200000191
另外，参见图2，可以看出，ELISA实验结果表明所有两组六只小鼠在免疫21天后，都产生了良好的抗体反应，可以进行下一步实验。
2.杂交瘤细胞库上清液的免疫测试参数描述：
在EIA/RIA聚苯乙烯板上涂敷抗原--->阻断--->第一抗体--->检测抗体--->底物--->停止并读数。
分析类型：固相抗原ELISA
Ag ID:PD-1His
Ab ID:PD-1A小鼠血清，D21m1-m3Ab
Ab稀释度：1/1000
Ab ID:PD-1S小鼠血清，D21m1-m3Ab
Ab稀释度：1/1000
Ab ID:PD-1A杂交瘤文库
Ab稀释度：未稀释
Ab ID:PD-1S杂交瘤文库
Ab稀释度：未稀释
检测试剂ID：山羊抗小鼠HRP
稀释度：1/5000
杂交瘤细胞库上清液的免疫测试结果见表2。
表2：杂交瘤细胞库上清液的免疫测试结果
Figure GDA0003024556200000201
另外，参见图3，可以看出通过ELISA检测，我们可以发现两个杂交瘤细胞库上清液对犬PD-1的免疫反应良好。因此可以进行下一步的抗体单克隆。共克隆30盘96孔的抗体，每孔都只有单细胞。单细胞培养后进行扩增和保存。每个单细胞培养的上清液再进行ELISA测试，挑选出抗犬PD-1强的单克隆抗体。
3.单克隆抗体的筛选：
测试类型：固相抗原ELISA
Ag ID:PD-1His
Ag浓度/稀释度：100ng/mL
Ag ID：PD-1A小鼠血清，D21m1-m3
Ab浓度/稀释度：1/1000
Ab ID：PD-1A杂交瘤文库
Ab浓度/稀释度：未稀释
Ab ID：PD-1A McAb上清
检测试剂ID：山羊抗-小鼠HRP-Fc
稀释度：1/5000
在ELISA检测后，挑选了30株免疫反应很好，又很可能是不相同的抗体细胞株，重新编号M1到M30，见下表3。这30株抗体用于后面的测试和筛选。
表3：单克隆抗体的筛选结果
Figure GDA0003024556200000211
Figure GDA0003024556200000221
4.单克隆抗体的亲和力筛选：
测试步骤：
传感器检测(30s)--->负载Ab(700秒)--->负淬灭(480秒)--->基线(300秒)--->Ab结合(600s)-->解离(600秒)-->重复
与表面的结合或解离引起迁移，测量随着时间的迁移变化能够确定结合(参见图4)。
通过Octet BMIA测试PD-1A的克隆上清液对PD-1His的亲和力。在每个克隆上清中加入抗-鼠IgG Fc捕获感受因子。
以下克隆未显示出PD-1 His结合：
Figure GDA0003024556200000232
参见图5-9，显示了编号M1到M30的30株抗体(未稀释的PD-1A扩展的M cAb上清)随时间变化与PD-1His(150μg/ml的浓度)的应答。
克隆上清按与PD-1His的KD和应答的排序结果见表4。
表4：克隆上清按与PD-1His的KD和应答的排序
Figure GDA0003024556200000231
Figure GDA0003024556200000241
备注：应答是指在结合步骤期间计算的应答(nm)；
KD是指亲和常数(M＝kdis/kon)
Kon是指结合速率(1/Ms)
Kdis是指解离速率(1/s)
全R2是指曲线拟合相关系数
由此得到下表5所示的抗犬PD-1亲和力高的抗体。
表5：抗犬PD-1亲和力高的抗体
PD-1A-M3
PD-1A-M10
PD-1A-M23
PD-1A-M11
PD-1A-M30
PD-1A-M15
PD-1A-M1
PD-1A-M8
PD-1A-M27
PD-1A-M22
5.单克隆抗体的功能性阻断筛选
抗体与抗原预温育(1小时)--->平衡(30s)-->Load Lead Ab(600s)--->淬灭(300s)--->基线(300s)-->Ab+Ag结合(300s)-->重复
与表面的结合或解离引起迁移，测量随着时间的迁移变化能够确定结合(参见图10)。
将D-L1Fc(5μg/mL)加载到AHC传感器上用于交联分析。表位分析检测了加载到感受器上的抗体与用PD1-Fc预温育的组抗体的结合。将所观察到的结合(应答)的程度与相同条件下单独的抗原的结合相比较。如果总应答大于单独的抗原结合的应答，则抗体配对儿。如果应答低于单独抗原的应答的80％，抗体彼此阻断。
由最低到最高％应答分选，获得以下阻断PD1-Fc与PD-L1结合的克隆：
·PD1A-M27
·PD1A-M1
·PD1A-M22
·PD1A-M8
·PD1A-M11
·PD1A-M15
·PD1A-M3
·PD1A-M23
·PD1A-M10
·PD1A-M13
·PD1A-M21
·PD1A-M19
·PD1A-M18
·PD1A-M30
·PD1A-M24
·PD1A-M6
·PD1A-M16
·PD1A-M20
·PD1A-M7
·PD1A-M17
参见图11-图12，显示了加载Ab为PD-L1Fc，浓度(μg/ml)为5，Ab为PD1A McAb上清液，稀释度为1/2，淬灭Ab为人γ免疫球蛋白浓度(μg/ml)为150；分析物为PD1Fc，浓度(nM)为50的测试结果。
Figure GDA0003024556200000261
Figure GDA0003024556200000271
缩写：
关键词：应答 在结合步骤期间计算的应答(nm)
KD 亲和常数(M)＝kdis/kon
kon 结合速率(1/Ms)
kdis 解离速率(1/s)
全R2 曲线拟合相关系数
最终确认阻断犬PD-1和PD L-1能力强的抗体如下：
PD1A-M27
PD1A-M1
PD1A-M22
PD1A-M8
PD1A-M11
PD1A-M15
PD1A-M3
PD1A-M23
PD1A-M10
PD1A-M13
6.单克隆抗体的最终筛选
根据亲和力测试结果和功能性阻断筛选结果，选择以下10个单克隆抗体进行抗体亚型测试。
Figure GDA0003024556200000281
Figure GDA0003024556200000291
然后，从这10株抗体中选出6株进行DNA序列分析。所选择的6株抗体为：M1、M3、M10、M11、M15、M23。
实施例3.单克隆抗体序列测定，犬源化及表达
(1)鼠单克隆抗体的序列测定
1)杂交瘤细胞株离心沉淀后提取RNA
2)RT-PCR(5’RACE)逆转录并扩增杂交瘤抗体轻链和重链的可变区
3)PCR产生的DNA片段克隆到测序质粒后转录到大肠杆菌
4)各挑取6-12个菌落后提取质粒DNA
5)利用质粒中设计好的引物序列测定克隆进入的DNA片段序列
6)找出多个菌落中共同拥有的序列
7)分析并得出抗体可变区的cDNA序列
(2)小鼠抗犬PD-1单克隆抗体可变区的cDNA序列
1)所选六株抗体可变区的蛋白序列
Figure GDA0003024556200000301
所选六株抗体：M1,M3,M10,M11,M15,M23 K：轻链 H：重链
2)所选六株抗体可变区的cDNA序列
M1K:
GCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCATATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATTAAA
M3K:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG
M10K:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG
M11K:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCCATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAACTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAAGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCACCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCATCCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
M15K:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG
M23K:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG
M1H:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATCAAAGACACCTATATGCATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGATAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
M3H:
GAGGTTCGGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTACACTGGTTGAAGGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATACTAGATATGACCCGAAGTTCCAGGTCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
M10H:
GAGGTTCGGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTACACTGGTTGAAGGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATACTAGATATGACCCGAAGTTCCAGGTCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
M11H:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATCCTAAATATGACCCGAAGTT CCAGGGCAGGGCCACTATAACTGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTCTGGGTTCTATGCTATGGACTGCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
M15H:
GAGGTTCGGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTACACTGGTTGAAGGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATACTAGATATGACCCGAAGTTCCAGGTCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
M23H:
GAGGTTCGGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTACACTGGTTGAAGGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGGTAATACTAGATATGACCCGAAGTTCCAGGTCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGTTCTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
3)所选抗体测序结果分析
通过抗体测序结果，发现六株抗体中，M3、M10、M15、M23实为同一抗体。所以最终确认的抗体为M1、M3、M11。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京希诺谷生物科技有限公司
<120> 结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体
<130> RYP1910266.7
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
tcaagtgtaa cttac 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
tcaagtgtaa gttac 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
tcaagtataa cttac 15
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 4
gacacatcc 9
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
cagcagtaca gtggtcaccc atcctcg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
caacagtaca gtggttaccc gtacacg 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 7
cagcagtaca gtggttaccc atccacg 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
ggcttcaaca tcaaagacac ctat 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
ggcttcaaca ttaaagacac ctat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 10
attgatcctg cgattgataa tact 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
attgatcctg cgattggtaa tact 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 12
attgatcctg cgattggtaa tcct 24
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 13
gcttctgggt tctatactat ggactac 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 14
gctagagggt tctatggtat ggactac 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 15
gcttctgggt tctatgctat ggactgc 27
<210> 16
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 16
gcaaattgtt ctcacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac 60
catgacctgc agtgccagct caagtgtaac ttacatgtat tggttccagc agaagccagg 120
ctcctccccc agactctgga tttatgacac atccaacctg gtttctggag tccctgctcg 180
cttcagtggc agtaggtctg ggacctctta ttctctcaca atcagcatat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtac agtggtcacc catcctcgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aaattaaa 318
<210> 17
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 17
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgttct ggtaccagca gaagccaggc 120
tcctccccca gactctggat ttatgacaca tccaacctgg tttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtaggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccaacagtac agtggttacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaag 318
<210> 18
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 18
caaattgttc tcacccagtc tccagccatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtataact tacatgttct ggtaccagca gaagccaggc 120
tcctccccca gactctggat ttatgacaca tccaacctgg tttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtaagtctgg gacctcttat tctctcacaa tcaccagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtac agtggttacc catccacgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aaataaaa 318
<210> 19
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 19
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tgcattgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgattgataa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagctgaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc ttctgggttc 300
tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 20
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 20
gaggttcggc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctatt tacactggtt gaaggagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgattggtaa tactagatat 180
gacccgaagt tccaggtcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc tagagggttc 300
tatggtatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 21
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag gttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgattggtaa tcctaaatat 180
gacccgaagt tccagggcag ggccactata actgctgaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc ttctgggttc 300
tatgctatgg actgctgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly His Pro Ser Ser
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Thr Tyr Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ile Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Leu Lys Glu Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ile Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ile Gly Asn Pro Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115

Claims (8)

1.能够结合犬PD-1的抗犬PD-1抗体，所述抗犬PD-1抗体包含如下的三个轻链互补决定区(CDR1-3)和三个重链互补决定区(CDR1-3)：由TCAAGTGTAACTTAC(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列编码的轻链CDR1；由GACACATCC(SEQ ID NO：4)所示的核苷酸序列编码的轻链CDR2；由CAGCAGTACAGTGG TCACCCATCCTCG(SEQ ID NO：5)所示的核苷酸序列编码的轻链CDR3；由GGCTTCAACATCAAAG ACACCTAT(SEQ ID NO：8)所示的核苷酸序列编码的重链CDR1；由ATTGATCCTGCGATTGATAATACT(SEQ ID NO：10)所示的核苷酸序列编码的重链CDR2；和由GCTTCTGGGTTCTATACTATGG ACTAC(SEQ ID NO：13)所示的核苷酸序列编码的重链CDR3。
2.根据权利要求1的抗体，所述抗犬PD-1抗体包含由如下所示的核苷酸序列编码的轻链可变区：GCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCTCCTCCCCCAGACTCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCATATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTCACCCATCCTCGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATTAAA(SEQ ID NO：16)。
3.根据权利要求1的抗体，所述抗犬PD-1抗体包含由如下所示的核苷酸序列编码的重链可变区：GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATCAAAGACACCTATATGCATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGATTGATAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCTGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTTCTGGGTTCTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：19)。
4.根据权利要求1的抗体，所述抗犬PD-1抗体包含如下的轻链可变区和重链可变区：由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码的轻链可变区和由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码的重链可变区。
5.根据权利要求1的抗体，所述抗犬PD-1抗体为鼠抗犬PD-1抗体，所述抗犬PD-1抗体能够阻断犬PD-1与犬PD-L1相结合。
6.根据权利要求5的抗体，所述抗犬PD-1抗体为鼠抗犬PD-1单克隆抗体。
7.根据权利要求1-4任一项的抗体，所述抗犬PD-1抗体的亲和力为1.000E-07至1.000E-12。
8.权利要求1-7任一项的抗体在制备用于治疗犬癌症的药物中的应用，所述犬癌症选自犬恶性黑色素瘤、犬乳腺肿瘤、犬肥大细胞瘤、犬血管肉瘤和犬软组织肉瘤。
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