JP2023523583A

JP2023523583A - ウイルス誘発急性呼吸窮迫症候群の処置

Info

Publication number: JP2023523583A
Application number: JP2022564264A
Authority: JP
Inventors: アンソニーイー．ティン，; エリックディー．ジェンキンス，; アリスバレンティン－トーレス，
Original assignee: エービーティーホールディングカンパニー
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-06-06
Also published as: CA3176381A1; US20230181651A1; AU2021261032A1; WO2021217098A1; IL297438A; EP4138868A1; MX2022013339A; CN115666599A

Abstract

本発明は、ウイルス誘発急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する被験体に、複能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）を投与することによって、ウイルス誘発ＡＲＤＳを処置する方法であって、上記ＭＡＰＣは、広い分化潜在性および長期の複製能を有する非胚性幹・非生殖細胞である、方法に関する。ＡＲＤＳを誘発するウイルスは、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスまたは中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））であり得る。

Description

背景
現在のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックおよびその病因についてより多くの情報が明らかになってくるにつれて、悪化した制御されない免疫応答が、疾患病理において有害な役割を果たすことは明らかであるである。ＣＯＶＩＤ－１９は、ＡＲＤＳを生じる重度の肺炎症を引き起こし得る。重症ＣＯＶＩＤ－１９が引き起こしたＡＲＤＳを有する患者は、サイトカインストーム症候群に罹り得ることが提唱されている（Ｍｅｈｔａら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２９）：１０３３－１０３４）。この場合、Ｔ細胞およびマクロファージが引き起こすサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１７）は、軽度ＣＯＶＩＤ－１９症例と比較した場合に、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の血漿において上昇することが報告されている（Ｈｕａｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２３）：４９７－５０６；Ｑｉｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２０，７１（１５）：７６２－７６８；Ｃｈｅｎら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２３）：５０７－５１３）。さらに、Ｔ細胞および単球／マクロファージの動員と関わるＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ３、ケモカインはまた、増加する（Ｍｅｈｔａら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２９）：１０３３－１０３４；Ｈｕａｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２３）：４９７－５０６；Ｑｉｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２０，７１（１５）：７６２－７６８）。これらのサイトカインのうちのいくつかの増強遺伝子発現はまた、ＣＯＶＩＤ－１９患者の気管支肺胞洗浄液中で観察されている。これは、肺における炎症応答の増大を示唆する（Ｘｉｏｎｇら，Ｅｍｅｒｇ．ＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ．２０２０，９（１）：７６１－７７０；Ｌｉａｏら，ｍｅｄＲｘｉｖ２０２０，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０，２６：８４２－８４４）。

末梢血中の免疫細胞の頻度の分析は、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者が、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方のリンパ球減少症に罹っていることを示した。これらの患者のＴ細胞は、活性化マーカー（例えば、ＣＤ６９およびＣＤ３８）の発現の増加とともに、高レベルのＴ細胞疲弊マーカー（例えば、ＰＤ－１およびＴｉｍ－３）を発現する（Ｚｈｏｕら，ｂｉｏＲｘｉｖ２０２０，ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．１２．９４５５７６）。ＣＯＶＩＤ－１９ＰＢＭＣのＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、増大したアポトーシスシグナル経路を示した。これは、リンパ球アポトーシスの増加が、リンパ球減少症の原因であり得ることを示唆する（Ｘｉｏｎｇら，Ｅｍｅｒｇ．ＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ．２０２０，９（１）：７６１－７７０）。Ｔ細胞疲弊は、慢性的な抗原刺激に対する応答として生じ、それは、慢性ウイルス感染症の間で広く記載されている。ＣＯＶＩＤ－１９の間に、Ｔ細胞が、炎症促進性応答の増大および持続に起因して疲弊し、Ｔ細胞アポトーシスを導くことが提唱されている。気管支肺胞ＣＤ８Ｔ細胞が、軽度疾患を有する患者と比較して、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者においてクローン性拡大の制限とともに低減されることが観察された。これは、ＣＤ８Ｔ細胞応答の障害を示唆する。これらの患者における過剰なリンパ球減少症はまた、観察された、制御されない炎症応答に寄与する制御性Ｔ細胞の低減を生じた（Ｑｉｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２０，７１（１５）：７６２－７６８）。
血中リンパ球は、重症患者において低減される一方で、単球／マクロファージは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺において非常に富化されるようである（Ｌｉａｏら，ｍｅｄＲｘｉｖ２０２０，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０，２６：８４２－８４４）。これらの患者に由来する末梢血単球の表現型分析は、これらの細胞が拡大され、高度に活性化され、軽度ＣＯＶＩＤ－１９および健常コントロールより高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌することを示した（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２０２１，１０９（１）：１３－２２，ＭｅｄＲｘｉｖ２０２０）。中間体（ＣＤ１４^＋およびＣＤ１６^＋）および非古典的（ＣＤ１４^－ＣＤ１６^＋）単球の増加は、ＩＣＵ患者において観察された。これは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者における単球組成が変化していることを示唆する（Ｌｉａｏら，ｍｅｄＲｘｉｖ２０２０，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０，２６：８４２－８４４）。

Ｍｅｈｔａら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２９）：１０３３－１０３４Ｈｕａｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２３）：４９７－５０６Ｑｉｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２０，７１（１５）：７６２－７６８Ｃｈｅｎら，Ｌａｎｃｅｔ２０２０，３９５（１０２２３）：５０７－５１３Ｘｉｏｎｇら，Ｅｍｅｒｇ．ＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ．２０２０，９（１）：７６１－７７０Ｌｉａｏら，ｍｅｄＲｘｉｖ２０２０，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０，２６：８４２－８４４Ｚｈｏｕら，ｂｉｏＲｘｉｖ２０２０，ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．１２．９４５５７６Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２０２１，１０９（１）：１３－２２，ＭｅｄＲｘｉｖ２０２０

発明の要旨
重症ＣＯＶＩＤ－１９に罹っている患者は、Ｔ細胞および単球／マクロファージ活性化の増加によって特徴づけられる調節不全の過剰炎症応答を有し、これが疾患病理を与え、その疾患病理の原因であり得ることが明らかである。本発明者らは、複能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）が、制御されない免疫応答をモジュレートし、それによって免疫ホメオスタシスを再確立し、ウイルス誘発急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）において、具体的には、ＣＯＶＩＤ－１９誘発ＡＲＤＳにおいて組織修復を促進する能力を有するかどうかを調査した。本発明者らは、Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２００２，４１８：４１－９で開示されたＭＡＰＣに基づく市販の調製物である「ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）」と称される調製物を使用した。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞が、調節不全の長期化したＴ細胞活性化および増殖を低減することを示す証拠が存在する（Ｒｅａｄｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，１９０：４５４２－４５５２；Ｒｅａｄｉｎｇら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２０１５，２３（１１）：１７８３－１７９３；Ｙａｎｇら，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２０１７，３５：１２９０－１３０２；Ｃａｒｔｙら，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８，９：６４５（ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００６４５））。それに基づいて、本発明者らは、中程度から重症のＡＲＤＳを有する患者にＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）を投与することによって、Ｔ細胞疲弊を防止する可能性を考慮した（Ｗａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１２，９：２２８；Ｒｅａｄｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，１９０（９）：４５４２－４５５２；Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ－Ｂａｎｋｏｗｓｋｉら，ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．２００９，２５５（１－２）：５５－６０）。さらに、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞が制御性Ｔ細胞の分化を促進するという報告が存在する（Ｗａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１２，９：２２８；Ｒｅａｄｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，１９０（９）：４５４２－４５５２；Ｒｅａｄｉｎｇら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５，２３（１１）：１７８３－１７９３；Ｙａｎｇら，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２０１７，３５（５）：１２９０－１３０２）。よって、本発明者らは、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）の投与が、ＡＲＤＳを緩和し得、ＡＴ２細胞の増殖を駆動し得ると考えた（Ｍｏｃｋら，ＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌ．２０１４，７（６）：１４４０－１４５１）。さらに、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞は、炎症促進性サイトカイン生成および炎症促進性マーカーの発現を減少させることによって、単球／マクロファージ炎症促進性プロフィールを低減し（Ｗａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１２，９：２２８；ＤｅＰａｕｌら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１５，５：１６７９５；Ｂｕｓｃｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１，３１（３）：９４４－９５３）、Ｍ２抗炎症性単球／マクロファージの分化を誘導し、それによって、炎症応答を制限しながら病原体および細胞デブリを除去することによって肺組織修復を促進する（Ｗａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１２，９：２２８；ＤｅＰａｕｌら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１５，５：１６７９５；Ｂｕｓｃｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１，３１（３）：９４４－９５３）ことが報告された。従って、本発明者らは、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）免疫調節特性が、中程度から重症のＣＯＶＩＤ－１９に罹っている患者を助けて、炎症を消散させ、ホメオスタシスを回復させ、組織修復を促進することによって彼らの調節不全の免疫応答を低減するかどうかを調査した。

詳細な説明
１つの実施形態において、ウイルス誘発ＡＲＤＳを処置する方法は、ウイルス誘発ＡＲＤＳを有する被験体に、上記ＡＲＤＳを処置するために、十分な量で、十分な時間にわたって、有効な経路によってＭＡＰＣを投与するステップを包含する。

１つの実施形態において、上記ＡＲＤＳを誘発したウイルスは、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓである。

１つの実施形態において、上記ＡＲＤＳを誘発したウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスまたは中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスまたは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。

１つの実施形態において、上記被験体は、ヒトである。

１つの実施形態において、最初の投与から上記被験体において測定されるパラメーターは、以下である：２８日目および６０日目での死亡率；２８日目までの人工呼吸器非使用日数；死亡および侵襲的機械換気が不要の日数を併せた、２８日目までの生存および人工呼吸器非使用；７日目および２８日目で生存し、人工呼吸器を使っていない被験体のパーセンテージ；０日目（注入前）から３日目および７日目までの連続臓器不全評価スコア（ＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＯｒｇａｎＦａｉｌｕｒｅＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓｃｏｒｅ）の変化；０日目から６０日目までの人工呼吸器非使用日数；０日目から２８日目および６０日目までのＩＣＵ非在室日数；０日目、３日目および７日目の白血球集団；０日目、１日目、３日目および７日目の炎症性生体マーカー；ならびにベースライン（０日目）から１日目、２日目、３日目、および７日目（ならびに２用量のＭＡＰＣを受けている被験体に関しては４日目、５日目、および６日目）までの酸素化レベル（ＰａＯ２／ＦｉＯ２比）、酸素化指数、ピーク圧およびプラトー圧、ならびにＰＥＥＰ要件の変化。これらは、既知の過去の平均（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌａｖｅｒａｇｅ）に基づいて、処置されていない集団（すなわち、ＭＡＰＣ注入なし）との比較であり得る。

１つの実施形態において、投与レジメンでは、９億～１２億のＭＡＰＣ細胞が０日目に、または場合によって０日目に提供され、かつ第１の用量の７２～９６時間後に９億～１２億ＭＡＰＣ細胞の追加の用量が提供される。

１つの実施形態において、投与の経路は、静脈内である。

１つの実施形態において、上記ＭＡＰＣは、同種異系である。

１つの実施形態において、上記ＭＡＰＣは、骨髄に由来する。

１つの実施形態において、上記ＭＡＰＣは、ヒトである。

１．処置可能なウイルス - インフルエンザ、（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）を含むコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルス、ならびに直接的な内皮損傷からまたは間接的にはサイトカインストーム／敗血症症候群を通じて生じるＡＲＤＳが合併し得る重篤な全身性の疾病（ウイルス性出血熱）を引き起こし得るウイルス（例えば、フィロウイルス（例えば、エボラ、マールブルグ）、アレナウイルス（ＬＣＭＶ、ラッサ、フニン、ルジョなど）、ブニヤウイルス（リフトバレー熱ウイルスおよびクリミア－コンゴ出血熱ウイルス、ならびにハンタウイルス）、およびフラビウイルス（黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、ジカウイルスなど））。

２．急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ） - 肺における血管透過性の増大によって特徴づけられる炎症性の肺傷害の重症形態。臨床的には、ＡＲＤＳは、心不全または体液過剰によって十分には説明されない、重症低酸素血症および胸部画像化での両側性陰影の存在によって定義される。具体的には、それは、ベルリン定義（またはベルリン基準のキガリ修正案（Kigalimodification）（例えば、Ｒｉｖｉｅｌｌｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２０１６，１９３（１）：５２－５９）を参照のこと）によって定義される。

３．ＡＲＤＳのベルリン（およびキガリ修正案）定義-
ａ．タイミング－発症は、既知の臨床的傷害または新たなもしくは悪化しつつある呼吸器症状から１週間以内でなければならない。
ｂ．画像化（胸部Ｘ線写真またはコンピューター断層撮影スキャンまたは超音波（キガリ修正案））－胸部Ｘ線写真における肺浮腫と一致する両側性陰影。
ｃ．浮腫の原因－全ての利用可能なデータを使用して処置する医師が判断する場合に、心不全または体液過剰によって十分に説明されない呼吸不全
ｄ．酸素化
ｉ．軽度ＡＲＤＳ－２００ｍｍＨｇ＜ＰａＯ２／ＦＩＯ２≦３００ｍｍＨｇと、ＰＥＥＰまたはＣＰＡＰ≧５ｃｍＨ２Ｏ；またはＳｐＯ２／ＦＩＯ２≦３１５（キガリ修正案）
ｉｉ．中程度ＡＲＤＳ－１００ｍｍＨｇ＜ＰａＯ２／ＦＩＯ２≦２００ｍｍＨｇと、ＰＥＥＰ≧５ｃｍＨ２Ｏ
ｉｉｉ．重症ＡＲＤＳ－ＰａＯ２／ＦＩＯ２≦１００ｍｍＨｇと、ＰＥＥＰ≧５ｃｍＨ２Ｏ
１．略語：ＣＰＡＰ、持続的気道陽圧；ＦＩＯ２、吸気酸素濃度；ＰａＯ２、動脈血酸素分圧；ＰＥＥＰ、呼気終末陽圧。

４．１つの実施形態において、患者は、以下のとおりに選択され得る：調節不全の免疫応答－ＡＲＤＳの症例において、肺胞毛細血管関門の破壊をもたらし、低酸素血症、炎症、および非心原性肺水腫によって特徴づけられる肺傷害を生じる免疫系プロセスの分子制御の不適応変化。

５．１つの実施形態において、患者は、以下のとおりに選択され得る：増悪しつつあるＡＲＤＳ - ＰＥＥＰ≧５ｃｍＨ２ＯでＰａＯ２／ＦｉＯ２≦３００ｍｍＨｇ；およびＰａＯ２／ＦｉＯ２は、＜２００ｍｍＨｇのままであるか、またはＰａＯ２／ＦｉＯ２は、スクリーニング評価から第１の用量のＩＰ投与の６時間以内に測定されるＰａＯ２／ＦｉＯ２まで、もしくは０日目のベースラインからＩＰの第２の用量の投与の６時間以内に測定されるＰａＯ２／ＦｉＯ２まで、１００ｍｍＨｇを超えて増加していない。

他の実施形態において、他のパラメーターが、対処および／または測定され得る。出願人は、ＭＡＰＣが有益な効果を有し得る種々のエンドポイントを有する。これらのエンドポイントのいずれも、ＭＡＰＣでの処置前および／または処置後に測定され得る。従って、ＭＡＰＣは、疾患病理において有害な役割を果たす制御されない免疫応答に対して有益な効果を有し得る。以下は、種々のエンドポイントである：肺炎症を低減する；サイトカインストーム症候群を低減する；Ｔ細胞およびマクロファージが駆動するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＩＬ－７）を低減する；ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２およびＣＣＬ３（これらは、Ｔ細胞および単球／マクロファージの動員に関与するサイトカインである）を低減する；単球動員および／または活性化を低減する；肺における炎症応答を低減する；ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞のリンパ球減少症を低減する；Ｔ細胞疲弊マーカー（例えば、ＰＤ－１およびＴＩＭ－３）を低減し、その結果、Ｔ細胞疲弊自体が低減される；活性化マーカー（例えば、ＣＤ６９およびＣＤ３８）の発現を低減する；Ｔ細胞アポトーシスを低減する；アポトーシスシグナル経路に対して効果を有する；ＣＯＶＩＤ患者において、拡大され、高度に活性化され、炎症促進性サイトカインのレベルを分泌する単球に影響を及ぼす；中間（ＣＤ１４－およびＣＤ１６＋）および非古典的（ＣＤ１４－およびＣＤ１６＋）単球を減少させる、制御性Ｔ細胞を増加させる、ならびに単球の活性化およびそれら単球からの炎症促進性サイトカインの分泌を減少させる。よって、これらのエンドポイントのうちのいずれかが、ＭＡＰＣ処置の前および／または後に測定され得る。処置後に測定される場合、ＭＡＰＣは、ＡＲＤＳが現れていない患者、およびおそらくはＡＲＤＳを有するが、ＡＲＤＳがウイルス誘発でない患者において過去の平均と比較して、記載されるとおりのこれらパラメーターに影響を及ぼし得る。

細胞としては、胚性幹細胞ではなく、かつ生殖細胞ではなく、胚性幹細胞のいくつかの特徴を有するが、非胚性組織に由来し、本出願において記載される効果を提供する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記細胞は、これらの効果を自然に（すなわち、遺伝的にまたは薬学的に改変されずに）達成し得る。しかし、天然の発現は、効力を増加させるために遺伝的にまたは薬学的に改変され得る。１つの実施形態において、幹細胞は、ＨＬＡ適合していない同種異系細胞であり得る。

上記細胞は、多能性マーカー（例えば、ｏｃｔ４）を発現し得る。それらはまた、長期の複製能力と関連するマーカー（例えば、テロメラーゼ）を発現し得る。多能性の他の特徴は、１より多くの胚葉（例えば、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の胚性胚葉のうちの２または３つ）の細胞タイプへと分化する能力を含み得る。上記細胞は、形質転換されることも、腫瘍形成性であることもなく、高度に拡大され得、正常核型をも維持し得る。１つの実施形態において、上記非胚性幹・非生殖細胞は、培養において所望の数の細胞倍加を受けていてもよい。例えば、非胚性幹・非生殖細胞は、培養において少なくとも１０～４０の細胞倍加（例えば、３０～３５の細胞倍加）を受けていてもよく、ここで上記細胞は、形質転換されておらず、正常核型を有する。上記細胞は、内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統のうちの２つの各々のうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得、全３種への分化を含み得る。さらに、上記細胞は、腫瘍形成性でなくてもよい（例えば、奇形腫を生じない）。細胞が形質転換されるかまたは腫瘍形成性であり、注入のためにそれらを使用することが望ましい場合、このような細胞は、腫瘍への細胞増殖を防止する処置によるように、インビボで腫瘍を形成できないように無能にされ得る。このような処置は、当該分野で周知である。

細胞としては、以下に番号付けされる実施形態が挙げられるが、これらに限定されない：
１．単離され、拡大された非胚性幹・非生殖細胞であって、前記細胞は、培養において少なくとも１０～４０の細胞倍加を受けており、ここで前記細胞は、ｏｃｔ４を発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する非胚性幹・非生殖細胞。

２．テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くをさらに発現する、上記１の非胚性幹・非生殖細胞。

３．内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統のうちの少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記１の非胚性幹・非生殖細胞。

４．テロメラーゼ、ｒｏｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１つまたはこれより多くのものをさらに発現する、上記３の非胚性幹・非生殖細胞。

５．前記内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統の各々のうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記３の非胚性幹・非生殖細胞。

６．テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くをさらに発現する、上記５の非胚性幹・非生殖細胞。

７．非胚性非生殖組織の培養によって得られる、単離され、拡大された非胚性幹・非生殖細胞であって、前記細胞は、培養において少なくとも４０の細胞倍加を受けており、ここで前記細胞は、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹・非生殖細胞。

８．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くを発現する、上記７の非胚性幹・非生殖細胞。

９．内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統のうちの少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記７の非胚性幹・非生殖細胞。

１０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くを発現する、上記９の非胚性幹・非生殖細胞。

１１．前記内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統の各々のうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記９の非胚性幹・非生殖細胞。

１２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くを発現する、上記１１の非胚性幹・非生殖細胞。

１３．単離され、拡大された非胚性幹・非生殖細胞であって、前記細胞は、培養において少なくとも１０～４０の細胞倍加を受けており、ここで前記細胞は、テロメラーゼを発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹・非生殖細胞。

１４．ｏｃｔ４、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くをさらに発現する、上記１３の非胚性幹・非生殖細胞。

１５．内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統のうちの少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記１３の非胚性幹・非生殖細胞。

１６．ｏｃｔ４、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くをさらに発現する、上記１５の非胚性幹・非生殖細胞。

１７．前記内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統の各々のうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記１５の非胚性幹・非生殖細胞。

１８．ｏｃｔ４、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くをさらに発現する、上記１７の非胚性幹・非生殖細胞。

１９．内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統のうちの少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、単離され、拡大された非胚性幹・非生殖細胞であって、前記細胞は、培養において少なくとも１０～４０の細胞倍加を受けている、非胚性幹・非生殖細胞。

２０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くを発現する、上記１９の非胚性幹・非生殖細胞。

２１．前記内胚葉、外胚葉、および中胚葉の胚性系統の各々のうちの少なくとも１つの細胞タイプへと分化し得る、上記１９の非胚性幹・非生殖細胞。

２２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ－１、またはｓｏｘ－２のうちの１またはこれより多くを発現する、上記２１の非胚性幹・非生殖細胞。

上記細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４５、ｇｌｙＡ、およびＣＤ３４の発現を欠いている。上記細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１０、およびＣＤ２９のうちの１またはこれより多くのを発現し得る。

上記細胞は、骨髄（例えば、ヒト骨髄）に由来し得る。

幹細胞は、分泌される分子によって、本明細書で記載される効果を提供し得ることから、幹細胞の投与のための本明細書で記載される種々の実施形態は、上記分泌される分子（例えば、馴化培養培地中に存在し得る）のうちの１またはこれより多くを投与することによって行われ得る。１つの実施形態において、馴化培地は、幹細胞の代わりに使用される。上記培地の成分は、例えば、動物血清を排除するために、培養培地成分から分離され得る。

上記幹細胞は、単離および本明細書で記載される培養条件によって調製され得る。具体的実施形態において、それらは、より高血清と組み合わせてより低酸素濃度を含む、本明細書で記載される培養条件によって調製される。

本発明は、本明細書で記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されず、よって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本開示の発明の範囲を限定することは意図しない。

節の見出しは、構成目的で本明細書において使用されるに過ぎず、記載される主題を限定するとはいずれの場合であっても解釈されるべきではない。

本出願の方法および技術は、別段示されなければ、当該分野で周知の、ならびに本明細書全体を通じて引用および考察される種々の一般的およびより具体的な参考文献において記載されるとおりの従来の方法に従って概して行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと。

定義
「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書で１または１より多い；少なくとも１、を意味する。複数形が本明細書で使用される場合、それは概して単数形も包含する。

「細胞バンク（ｃｅｌｌｂａｎｋ）」は、将来的な使用のために成長および貯蔵されている細胞に関する業界用語である。細胞は、アリコートで貯蔵され得る。それらは、貯蔵から直接使用され得るか、または貯蔵後に拡大され得る。これは、投与にいつでも使える「在庫」の細胞が存在するため好都合である。上記細胞は、薬学的に受容可能な賦形剤中に既に貯蔵されていてもよいので、それらは、直接投与されてもよいし、それらが貯蔵庫から放出される場合に適切な賦形剤と混合されてもよい。細胞は、凍結するか、または別の方法で、生存性を保つ形態で貯蔵することができる。本発明の１つの実施形態において、上記細胞が本出願において記載される効果を達成するための、増強された効力に関して選択された細胞バンクが、作製される。貯蔵庫からの放出後および投与前に、上記細胞を効力に関して再度アッセイすることは好ましいことであり得る。これは、本出願において記載されるかまたは当該分野で公知の別の方法で、直接的または間接的に、上記アッセイのうちのいずれかを使用して行われ得る。次いで、所望の効力を有する細胞が、投与され得る。バンクは、自家の細胞（器官ドナーまたはレシピエントに由来する）を使用して作製され得る。あるいはバンクは、同種異系用途のための細胞を含み得る。

本発明に関連して「共投与する」とは、２またはこれより多くの薬剤を一緒に投与することを意味する。本発明の文脈内では、１つの実施形態において、上記幹細胞は、他の処置モダリティー（例えば、回復期血漿；レムデシビル、ファビピラビル、またカレトラ、ロピナビルとリトナビルとの組み合わせを含む抗ウイルス剤；高用量ビタミンＣ；またはトシリズマブ、シルツキシマブもしくはサリルマブを含むＩＬ－６阻害剤）と組み合わせて投与される。

「含むこと、包含すること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、必然的に、他の何が含まれ得るかに関するいかなる制限も排除もなしに指示物を含むことを意味するが、他の限定はない。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」とは、たとえ他の成分が組成物中に存在する可能性があろうが、ｘおよびｙを含む任意の組成物を包含する。同様に、「ｘのステップを包含する方法」とは、ｘが上記方法の中で唯一のステップであろうが、ステップの１つに過ぎなかろうが、たとえそれほど多くの他のステップが存在しようが、たとえそれらとの比較においてどれほど単純なまたは複雑なｘが存在しようが、ｘが行われる任意の方法を包含する。「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄｏｆ）」および語根「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という文言を使用する類似の語句は、「含むこと、包含すること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の類義語として本明細書で使用され、同じ意味を有する。

「から構成される」は、「含むこと、包含すること」の類義語である（上記を参照のこと）。

「有効量」とは一般に、本出願において記載される具体的な所望の効果を達成する量を意味する。例えば、有効量は、有益なまたは所望の臨床結果を果たすために十分な量である。本発明の文脈内では概して、所望の効果は、被験体において有効でないまたは病的な機能を代償する臨床的改善である。上記有効量は、一度に１回の投与で全て、またはいくつかの投与において有効量を提供する分割量で提供され得る。何が有効量と考えられるかの正確な決定は、疾患／欠陥の重篤度、患者の健康状態、年齢などを含む各被験体に対して個々の要因に基づき得る。当業者は、当該分野で慣用的なこれらの考慮事項に基づいて上記有効量を決定し得る。本明細書で使用される場合、「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）」は、「有効量」と同じことを意味する。

よって、有効量は、上記被験体の臨床症状が改善される量である。よって、非限定的な例として、幹細胞の有効量は、被験体における結果：ＭＡＰＣ細胞の第１の用量を受けて２８日間以内に抜管される；２８日目までにＰＥＥＰ＜５ｃｍＨ２ＯでＰａＯ２／ＦｉＯ２＞３００ｍｍＨｇを有する；ＭＡＰＣを受けていない被験体と比較して、死亡率が≧１０％少ない（これは、過去の平均に基づいて決定され得る）；またはＭＡＰＣを受けていない被験体と比較して、２８日目までに≧４ＶＦＤの平均増加を有する（これは、過去の平均に基づいて決定され得る）、に十分な量である。

「有効な経路」とは一般に、所望の区画、システム、または位置への薬剤の送達を提供する経路を意味する。例えば、有効な経路は、所望の作用部位において、有益なまたは所望の臨床結果を果たすために十分な薬剤の量を提供するために、上記薬剤が投与され得る経路である。

用語「外因性」とは、幹細胞に関連して使用される場合、被験体に対して外部でありかつ有効な経路による移植が意図された島に曝されている（例えば、接触している）幹細胞に概して言及する。外因性の幹細胞は、同じ被験体に由来しても、異なる被験体に由来してもよい。１つの実施形態において、外因性の幹細胞は、被験体から採取され、単離され、エキソビボで拡大されており、次いで、有効な経路による移植が意図された島に曝露されている幹細胞を含み得る。

用語「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」の使用は、限定であることは意図されない。

「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増加すること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」は、生物学的事象全体を誘導するまたはその事象の程度を増加させることを意味する。

用語「単離された」とは、１個の細胞または複数の細胞であって、１もしくはこれより多くの細胞と、あるいはインビボで上記１個の細胞または複数の細胞と会合する１もしくはこれより多くの細胞成分と、会合していない、１個の細胞または複数の細胞を指す。「富化された集団（ｅｎｒｉｃｈｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」とは、１もしくはこれより多くの他の細胞タイプと比較して、インビボでまたは初代培養において所望の細胞数の相対的な増加を意味する。

しかし、本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、本発明の細胞のみの存在を示さない。むしろ、用語「単離された」は、本発明の細胞が、それらの天然の組織環境から取り出され、通常の組織環境と比較してより高濃度で存在することを示す。よって、「単離された」細胞集団は、本発明の細胞の細胞に加えて、細胞タイプをさらに含んでいてもよく、さらなる組織成分を含んでいてもよい。これはまた、例えば、細胞倍加に関して表され得る。細胞は、１０、２０、３０、４０またはこれより多くの倍加をインビボでまたはエキソビボで受けていてもよく、その結果、それは、インビボでのまたはその本来の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯、臍帯血など）でのその元の数と比較して、富化されている。

「ＭＡＰＣ」は、「複能性成体前駆細胞」の頭字語である。それは、胚性幹細胞でも生殖細胞でもなく、これらのいくつかの特徴を有する細胞を指す。ＭＡＰＣは、多くの別の記載で特徴づけられ得、これらの各々は、それらが発見されたときの細胞に新規性を与えた。従って、それらは、それらの記載のうちの１またはこれより多くによって特徴づけられ得る。第１に、それらは、培養において長期の複製能を有し得、形質転換（腫瘍形成性）されておらず、かつ正常核型を有する。第２に、それらは、分化の際に１より多くの胚葉（例えば、２または全３つの胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞子孫を生じ得る。第３に、それらは、胚性幹細胞でも生殖細胞でもないが、これらの原始的な細胞タイプのマーカーを発現し得るので、ＭＡＰＣは、Ｏｃｔ３／４（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｏｃｔ３Ａ）のうちの１またはこれより多くを発現し得る。第４に、幹細胞と同様に、それらは、自己再生し得る、すなわち、形質転換されることのない長期の複製能を有し得る。これは、これらの細胞がテロメラーゼを発現する（すなわち、テロメラーゼ活性を有する）ことを意味する。よって、「ＭＡＰＣ」と称された細胞タイプは、その新規な特性のうちのいくつかを介して、上記細胞を説明する代替の基本的な特徴によって特徴付けられ得る。

ＭＡＰＣにおいて用語「成体（ａｄｕｌｔ）とは、非限定的である。それは、上記のとおりの非胚性体細胞を指す。ＭＡＰＣは、核型が正常であり、インビボで奇形腫を形成しない。この頭字語は、広範な複製能を有しかつ多能性マーカーを発現する、骨髄から単離された細胞を説明するために、米国特許第７，０１５，０３７号において初めて使用された。

ＭＡＰＣは、ＭＳＣより初期前駆細胞集団を表す（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｍ．，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：５０２－８（２００２），Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，Ｂ．Ｎ．，ら，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２９：５４３－５６（２００１）；Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．ａｎｄＣ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ，９３８：２３１－２３３（２００１）；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ら，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，３０８９６－９０４（２００２）；およびＪｉａｎｇ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：４１－９（２００２））。

用語「ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）」は、米国特許第７，０１５，０３７号のＭＡＰＣ（すなわち、上記で記載されるとおりの非胚性幹・非生殖細胞）に基づく細胞調製物の商品名である。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、本特許出願で開示される細胞培養法（特に、より低酸素およびより高血清）に従って調製される。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、高度に拡大可能であり、核型が正常であり、インビボで奇形腫を形成しない。それは、１より多くの胚葉の細胞系統へと分化し得、テロメラーゼを発現し得る。

「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本発明において使用される細胞および／または島のための任意の薬学的に受容可能な媒体である。このような媒体は、等張性、細胞代謝、ｐＨなどを保持し得る。それは、被験体への投与と適合性であり、従って、島および／または細胞送達ならびに処置のために使用され得る。

「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）」とは、それらの最終分化した子孫の特徴のうちのいくつか（しかし全てではない）を有する、幹細胞の分化の間に生成される細胞である。規定された前駆細胞（例えば、「心臓前駆細胞」）は、系統に関係づけられているが、特異的なまたは最終分化した細胞タイプに環系づけられているわけではない。頭字語「ＭＡＰＣ」において使用される場合の用語「前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」とは、これらの細胞を特定の系統に限定しない。前駆細胞は、上記前駆細胞より高度に分化した子孫細胞を形成し得る。

用語「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）とは、本明細書で使用される場合、防止することおよび減少させることを意味する。処置の文脈では、「低減する」ことは、欠陥を防止することまたは改善することのいずれかである。これは、最初の細胞投与後の最初の７日間にわたって測定される炎症性生体マーカー（ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１０、ＭＣＰ１、ＩＬ－１、ＩＬ－２ＲＡ、ＩＬ－７、ＲＡＧＥ、ＰＤ１、ＩＬ１－Ｒ２）の低減が挙げられるが、これらに限定されない、上記のエンドポイントパラメーターを含む。

所望のレベルの効力を有する細胞を「選択すること（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）」とは、細胞を同定し（アッセイによるとおり）、単離し、拡大することを意味し得る。これは、上記細胞が親細胞集団から単離されたその親細胞集団より高い効力を有する集団を作り出し得る。「親」細胞集団は、上記選択された細胞が親細胞から分裂したその親細胞を指す。「親」とは、実際のＰ１→Ｆ１の関係性（すなわち、子孫細胞）を指す。よって、細胞Ｘが、細胞Ｘおよび細胞Ｙの混合集団（ここでＸは、発現するもの（expressor）であり、Ｙはそうでない）から単離される場合、単なるＸの単離物は、増強された発現を有するとして分類されない。しかし、Ｘの子孫細胞がより高い発現するものである場合、その子孫細胞は、増強された発現を有するとして分類される。

所望の効果を達成する細胞を選択することは、上記細胞がその所望の効果を達成するかどうかを決定するためのアッセイと、それらの細胞を得ることの両方を含む。上記細胞は、上記効果が外因性の導入遺伝子／ＤＮＡによって達成されないという点においてその所望の効果を自然に達成することもある。しかし、有効な細胞は、上記効果を増大させる薬剤とともにインキュベートされるかまたは上記薬剤に曝されることによって、改善され得る。有効な細胞が上記細胞集団から選択されるその細胞集団は、上記アッセイを行う前に、上記効力を有することが既知でなくてもよい。上記細胞は、上記アッセイを行う前に、所望の効果を達成することが既知でなくてもよい。効果は、遺伝子発現および／または分泌に依存し得ることから、上記効果を引き起こす遺伝子のうちの１またはこれより多くに基づいて選択され得る。

選択は、組織中の細胞からであり得る。例えば、この場合には、細胞は、所望の組織から単離され、培養において拡大され、所望の効果を達成することに関して選択され、その選択された細胞はさらに拡大される。

選択はまた、エキソビボでの細胞（例えば、培養物中の細胞）からであり得る。この場合には、培養物中の細胞のうちの１またはこれより多くが、所望の効果を達成することに関してアッセイされ、その得られた、所望の効果を達成する細胞が、さらに拡大され得る。

細胞はまた、所望の効果を達成するための増強された能力に関して選択され得る。この場合には、その増強された細胞が得られてくる細胞集団は、所望の効果を既に有している。増強された効果は、細胞１個につき、親集団におけるより高い平均量を意味する。

増強された細胞が親集団から選択されるその親集団は、実質的に均質（同じ細胞タイプ）であり得る。このような増強された細胞をこの集団から得る１つの方法は、１個の細胞または細胞プールを作り出し、それらの細胞または細胞プールをアッセイして、増強された（より高い）効果を自然に有するクローンを得（その効果を誘導または増大させる調節因子で上記細胞を処理することとは対照的に）、次いで、自然に増強されたそれら細胞を拡大することである。

しかし、細胞は、上記効果を誘導または増大させる１またはこれより多くの薬剤で処理されてもよい。従って、実質的に均質な集団は、上記効果を増強するために処理されてもよい。

上記集団が、実質的に均質でない場合、処理されるべきその親細胞集団が、増強された効果が求められる所望の細胞タイプの少なくとも１００個、より好ましくは上記細胞の少なくとも１，０００個、およびさらにより好ましくは上記細胞の少なくとも１０，０００個を含むことは、好ましい。処理後に、この下位集団は、公知の細胞選択技術によって異種集団から回収され得、所望の場合には、さらに拡大される。

従って、所望の効果レベルは、所定の先行する集団におけるレベルより高いレベルであり得る。例えば、組織から初代培養に移され、拡大され、上記効果を生じるように具体的に設計されていない培養条件によって単離される細胞は、親集団を提供し得る。このような親集団は、細胞１個あたりの平均的効果を増強するために処理され得るか、または意図した処理なしにより大きな程度の効果を発現する集団内の１個の細胞または複数の細胞に関してスクリーニングされ得る。このような細胞は、次いで、より高い（所望の）発現を有する集団を提供するために拡大され得る。

幹細胞の「自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）」とは、複製娘幹細胞が幹細胞から生じるその幹細胞と同一の分化潜在性を有するその複製娘幹細胞を産生する能力をいう。この文脈において使用される類似の用語は、「増殖」である。

「被験体」とは、脊椎動物（例えば哺乳動物、例えばヒト）を意味する。哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびブタが挙げられるが、これらに限定されない。

用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物において任意の治療応答を生じることが決定された薬剤の量を指す。例えば、有効な治療剤は、患者の生存可能性を長期化し得る、および／または明白な臨床症状を阻害し得る。本明細書で使用される場合の上記用語の意味の範囲内で治療上有効である処置は、たとえその処置が疾患転帰自体を改善しないとしても、被験体のクオリティー・オブ・ライフを改善する処置を含む。このような治療上有効な量は、当業者によって容易に確認される。従って、「処置する」ことは、このような量を送達することを意味する。従って、処置することは、任意の病的な症状を防止または改善し得る。１つの局面において、処置は、ＰａＯ２によって測定される場合の肺機能を改善する、すなわち、正常な範囲に向かってまたはその範囲で改善することを意味する（この場合には、処置されていない患者と－過去の平均を介して比較され得る）。

本発明の文脈において、治療上有効な量は、臨床転帰の改善を生じる幹細胞のその量である。

用語「治療上有効な時間」とは、臨床的改善を達成するために必要な時間を指し得る。

治療上有効な時間はまた、改善された臨床状態を達成するために、被験体にとって必要とされる時間を指し得る。この場合には、細胞は、ＡＲＤＳの診断の４８時間以内に送達され得、２８日の期間にわたって評価され得る。

用語「治療上有効な経路」とは、改善された臨床転帰を達成するために有効であり得る投与の経路をいう。これは、末梢ラインまたは中心ラインのいずれかによる静脈内送達を含む。

有益な効果を達成する幹細胞の適切な量は、経験的に決定される。用量範囲は９００，０００～１，２００，０００幹細胞であり得、反復用量が第１の用量の７２～９６時間後に提供される可能性がある。従って、これらの量は、送達の方法、病気の重篤度などに基づいて、経験的に決定される必要がある。

「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明に関連して広く使用され、各々のこのような用語は、とりわけ、欠陥、機能障害、疾患、または他の有害なプロセス（治療に干渉するおよび／または治療から生じるものを含む）を防止する、改善する、阻害する、または治癒させることを包含する。

「十分な時間」および「十分な量」とは、それぞれ、「有効な時間」および「有効な量」と同じ意味を有するものとする。本出願が対象とする細胞が、十分な量で、十分な時間にわたって、かつ有効な経路によって投与されるかどうかを確認するために評価され得る臨床症状としては、以下のうちの１またはこれより多くが挙げられる：
ａ．肺炎症の低減；
ｂ．Ｔ細胞およびマクロファージが引き起こすサイトカインの低減；
ｃ．Ｔ細胞および単球／マクロファージの動員と関わるケモカインの低減；ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増加；
ｄ．リンパ球減少症の減少（Ｔ細胞疲弊マーカーのレベルの低減、Ｔ細胞活性化マーカーの発現の低減、アポトーシスシグナル経路の低減、Ｔ細胞疲弊の逆転、Ｔ細胞アポトーシスの低減、ＣＤ８Ｔ細胞計数の増加、制御性Ｔ細胞の増加、肺における単球／マクロファージの低減、末梢血単球の表現型変化、中間体および非古典的単球の減少、制御性Ｔ細胞の分化、ＡＴ２細胞の増殖、炎症促進性サイトカイン生成の減少、炎症促進性マーカーの発現の減少、Ｍ２抗炎症性単球／マクロファージの分化の増加、肺組織中の病原体および細胞デブリのクリアランスを含む）；
ｅ．患者を処置するにあたって上記細胞の有効性を決定するために測定され得る他のパラメーター（死亡率、人工呼吸器非使用日数、連続臓器不全の変化、ＩＣＵ非在室日数、酸素化レベル、酸素化指数、ピーク圧およびプラトー圧、ならびにＰＥＥＰ要件のベースラインからの変化（これらは、処置されていない集団との比較であり得る）を含む）；自己（または代理人）が報告したクオリティー・オブ・ライフ（例えば、ＥＱ－５０のような調査手段を介する）がまた、評価され得る。
ｆ．他のパラメーターとしては、肺における血管透過性の減少、低酸素血症および胸部画像化の両側性陰影の減少、非心原性肺浮腫の減少、呼吸不全の低減、気道陽圧、吸気酸素濃度、動脈血酸素分圧、および呼気終末陽圧；肺の硬化、浸潤、気管支拡張症、線維症または機能的肺容量の程度を評価する画像化スコア付けシステムが挙げられる；
ｇ．他のパラメーターとしては、サイトカインストーム症候群の低減が挙げられる。

「検証する」とは、確認することを意味する。本発明の文脈において、細胞が、被験体に有益に影響を及ぼすために所望の効力を有することが確認される。これは、有効性があるという正当な予測をして、その細胞を（処置、バンキング、薬物スクリーニングなどにおいて）使用できるようにするためである。よって、検証することは、所望の活性を有することが元々見出されている／所望の活性を有すると確立された細胞が、実際に、その活性を保持することを確認することを意味する。従って、検証は、最初の決定および追跡調査の決定を含む２つの事象のプロセスにおける確認事象である。２つめの事象は、本明細書において「検証」といわれる。

本発明は、好ましくは、脊椎動物種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼い慣らされた動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物）の幹細胞を使用して実施され得る。これらとしては、以下で記載されるそれらの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

転写因子
幹細胞の効力状態にインビボで影響を与える多くの転写因子および外因性のサイトカインが、同定されている。幹細胞の多能性に関与することが説明されるべき最初の転写因子は、Ｏｃｔ４である。Ｏｃｔ４は、転写因子のＰＯＵ（Ｐｉｔ-Ｏｃｔ-Ｕｎｃ）ファミリーに属し、プロモーターまたはエンハンサー領域内の「オクタマーモチーフ」と称される八量体配列を含む、遺伝子の転写を活性化し得るＤＮＡ結合タンパク質である。Ｏｃｔ４は、卵筒が形成されるまで、受精した接合子の卵割期の時点で発現される。Ｏｃｔ３／４の機能は、分化誘導遺伝子（すなわち、ＦｏｘａＤ３、ｈＣＧ）を抑制し、多能性を促進する遺伝子（ＦＧＦ４、Ｕｔｆ１、Ｒｅｘ１）を活性化することである。Ｓｏｘ２（高移動度群（ＨＭＧ）ボックス転写因子のメンバー）は、Ｏｃｔ４と協同して、内細胞塊において発現される遺伝子の転写を活性化する。胚性幹細胞におけるＯｃｔ３／４発現が、ある特定のレベルの間で維持されることは必須である。Ｏｃｔ４発現レベルの＞５０％の過剰発現またはダウンレギュレーションは、それぞれ、原始的な内胚葉／中胚葉または栄養外胚葉の形成に伴って、胚性幹細胞運命を変化させる。インビボでは、Ｏｃｔ４欠損胚は、胚盤胞期へと発生するが、内細胞塊の細胞は、多能性ではない。代わりに、それらは、胚外栄養膜系統に沿って分化する。Ｓａｌｌ４（哺乳動物のＳｐａｌｔ転写因子）は、Ｏｃｔ４の上流の調節因子であり、従って、発生学の早期段階の間にＯｃｔ４の適切なレベルを維持するために重要である。Ｓａｌｌ４レベルがある特定の閾値未満に低下すると、栄養外胚葉細胞は、内細胞塊へと異所性に拡大する。多能性のために必要とされる別の転写因子は、ケルト族の「ＴｉｒＮａｎＯｇ」：常若の国に因んで名付けられたＮａｎｏｇである。インビボでは、Ｎａｎｏｇは、収縮桑実胚（ｃｏｍｐａｃｔｅｄｍｏｒｕｌａ）のステージから発現され、その後、内細胞塊へと確定され、着床期までにダウンレギュレートされる。Ｎａｎｏｇのダウンレギュレーションは、多能性細胞の制御されない拡大を回避し、原腸形成の間に多系統分化を可能にするために重要であり得る。Ｎａｎｏｇヌル胚（５．５日目に単離される）は、胚外内胚葉を主に含み、識別可能な胚盤葉上層がない無秩序な胚盤胞からなる。

ＭＡＰＣの単離および成長
ＭＡＰＣ単離の方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第７，０１５，０３７号を参照のこと。そしてこれらの方法は、ＭＡＰＣの特徴付け（表現型）とともに、本明細書に参考として援用される。ＭＡＰＣは、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚が挙げられるが、これらに限定されない複数の供給源から単離され得る。従って、骨髄吸引物、脳生検物または肝生検物、および他の器官を得、これらの細胞において発現される（または発現されない）遺伝子に（例えば、上記で言及される出願（これらは、本明細書に参考として援用される）において開示されるものなどの機能的または形態的アッセイによって）依拠して、当業者に利用可能な正のまたは負の選択技術を使用して上記細胞を単離することは、可能である。

ＭＡＰＣはまた、Ｂｒｅｙｅｒら，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３４：１５９６－１６０１（２００６）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（Ｓ．Ｄｉｎｇ（ｅｄ．）），ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３６：５５－７８（２０１０）；Ｂｏｏｚｅｒら，Ｊ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ４（１）：１７－２８（２００９）；およびＶａｅｓら，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３５：４９－５８（２０１５）（これらの方法に関して参考として援用される）において記載される改変された方法によって得られている。

米国特許第７，０１５，０３７号に記載されるとおりのヒト骨髄に由来するＭＡＰＣ
ＭＡＰＣは、ＣＤ４５もグリコホリン－Ａ（Ｇｌｙ－Ａ）も発現しない。細胞の混合集団を、ＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕｅ分離に供した。次いで、上記細胞を、抗ＣＤ４５抗体および抗Ｇｌｙ－Ａ抗体を使用して、負の選択に供し、ＣＤ４５＋およびＧｌｙ－Ａ＋細胞の集団を枯渇させ、次いで、骨髄単核細胞のうちの残りのおよそ０．１％が回収された。細胞をまた、フィブロネクチンをコーティングしたウェルにプレーティングし、ＣＤ４５＋およびＧｌｙ－Ａ＋細胞の細胞を枯渇させるために２～４週間にわたって以下に記載したとおりに培養した。接着性骨髄細胞の培養において、多くの接着性間質細胞は、細胞倍加３０あたりで複製老化を受け、細胞のより均質な集団は、拡大し続け、長いテロメアを維持する。

さらなる培養方法
さらなる実験では、ＭＡＰＣを培養する密度は、約１００細胞／ｃｍ^２または約１５０細胞／ｃｍ^２～約１０，０００細胞／ｃｍ^２（約２００細胞／ｃｍ^２から約１５００細胞／ｃｍ^２～約２０００細胞／ｃｍ^２を含む）まで変動し得る。上記密度は、種の間で変動し得る。さらに、光学密度は、培養条件および細胞の供給源に依存して変動し得る。培養条件および細胞の所定のセットに関して光学密度を決定することは、当業者の技術範囲内である。

また、約１０％未満（約１～５％および特に、３～５％を含む）の有効大気中酸素濃度が、培養におけるＭＡＰＣの単離、成長および分化の間のいずれの時でも使用され得る。

細胞は、種々の血清濃度（例えば、約２～２０％）下で培養され得る。ウシ胎仔血清が使用され得る。より高い血清が、より低い酸素圧（例えば、約１５～２０％）と組み合わせて使用され得る。細胞は、培養ディッシュへの接着前に選択される必要はない。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配後に、細胞は、例えば、２５０，０００～５００，０００／ｃｍ^２で直接プレーティングされ得る。接着性コロニーが拾い上げられ得、できる限りプールされ、拡大され得る。

実施例中の実験手順において使用される１つの実施形態において、高血清（およそ１５～２０％）および低酸素（およそ３～５％）条件を、細胞培養に使用した。具体的には、コロニーからの接着性細胞をプレーティングし、１８％血清および３％酸素中（ＰＤＧＦおよびＥＧＦを有する）約１７００～２３００細胞／ｃｍ^２の密度で継代した。

ＭＡＰＣに特異的な実施形態において、補充物は、ＭＡＰＣが１より多くの胚性系統（例えば、全３つの系統）の細胞タイプへと分化する能力を保持することを可能にする、細胞因子または成分である。これは、分化していない状態の特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ３／４（Ｏｃｔ３Ａ））および／または高い拡大能力のマーカー（例えば、テロメラーゼ）の発現によって示され得る。

血清は、重大な変動の原因を提供することがある。最適な血清濃度は、血清バッチ特性に依存して変動し得る。よって、異なる血清ロットは、最適なＭＡＰＣ拡大を支持するそれらの能力に関してスクリーニングされる。適切なバッチからの大量の血清が確保され得る。理想的には、ＭＡＰＣは、２００～２，０００細胞／ｃｍ^２の間の密度で播種され、より高い密度は回避され得る。それらは、コンフルエント未満（３０～７０％）で絶えず継代される。これらの条件を使用して、ＭＡＰＣは、１５～２０継代（５０～７０集団倍加）まで慣用的に拡大され得る。

医薬製剤
ある特定の実施形態において、上記細胞集団は、送達に適合されかつ送達に適した、すなわち、生理学的に適合性の組成物内に存在する。

いくつかの実施形態において、島と共にまたは島への投与のための細胞の純度は、約１００％（実質的に均質）である。他の実施形態において、それは、９５％～１００％である。いくつかの実施形態において、それは、８５％～９５％である。特に、他の細胞との混合物の場合には、そのパーセンテージは、約１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％であり得る。あるいは単離／純度は、細胞が受けた細胞倍加の点で表され得る（例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０またはこれより多くの細胞倍加）。

投与
ヒトまたは他の哺乳動物のための用量（すなわち、細胞数）は、当業者によって本開示、本明細書で引用される文書、および当該分野の知識から、過度の実験なしに決定され得る。本発明の種々の実施形態に従って使用されるべき最適用量は、以下を含む多くの要因に依存する：処置されている疾患およびそのステージ；ドナーの種、それらの健康状態、性別、年齢、体重、および代謝速度；ドナーの免疫適格性；投与されている他の治療；ならびにドナーの履歴または遺伝子型から予測される潜在的な合併症。上記パラメーターとしてはまた、以下が挙げられる：細胞が同系であるか、自家であるか、同種異系であるか、または異種であるかどうか；それらの効力；標的化されなければならない部位および／または分布；ならびに細胞への到達可能性のような部位のこのような特性。さらなるパラメーターとしては、他の因子（例えば、成長因子およびサイトカイン）との共投与が挙げられる。所定の状況における最適用量はまた、細胞が製剤化される方法、それらが投与される方法（例えば、注入、器官内など）、および細胞が投与後に標的部位に位置する程度を考慮に入れる。

ＭＡＰＣの単離および拡大に関する詳細は、上記に見出される。

この試験のための集団は、ベルリン定義によって定義されるように、中程度から重症のＡＲＤＳの診断を有する１８～８９歳齢の男性および女性である。中程度から重症のＡＲＤＳに関する全ての診断基準は、２４時間の期間内に存在することが確認される。最後のＡＲＤＳ診断基準がいったん満たされた後に、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）またはプラシーボの注入を開始するために許された４８時間の期間が始まる。被験体は、持続性のまたは増悪しつつあるＡＲＤＳ（無作為化する６時間前以内に測定されたＰａＯ２／ＦｉＯ２によって確認）を有することが確認される。全ての被験体は、最後のＡＲＤＳ診断基準を満たしている４８時間以内に静脈内（ＩＶ）注入によって、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）治療（９億個または１２億個の細胞／用量）またはプラシーボのいずれかを受ける。

コホートは、以下のように登録した：
＊コホート１
→コホート１ａ（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品）：９億個のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞／用量を用いてオープンラベルで処置した３名の被験体。
→コホート１ｂ（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品）：１２億個のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞／用量を用いてオープンラベルで処置した３名の被験体。
→コホート１ｃ（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品）：９億個または１２億個のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞／用量を用いてオープンラベルで処置した３名の被験体。上記用量を、ＤＳＭＢによって、コホート１ａおよび１ｂからのデータの精査に基づいて選択する。
→コホート１ｄ（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品）：９億個または１２億個のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞／用量を用いてオープンラベルで処置した３名（またはより多くの）被験体。持続性のまたは増悪しつつあるＡＲＤＳの具体的基準を満たす被験体は、初期用量の７２～９６時間後に、彼らが投与前に選択基準を満たし続けるのであれば、９億個または１２億個のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）細胞／用量という同一の第２の用量を受けるために適格である。コホート１ｄは、少なくとも３名の適格な被験体が２用量のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）を受けるまで、試験被験体を補充し続ける。
＊コホート２（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品導入相（Ｒｕｎ－Ｉｎｐｈａｓｅ））：ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）治療（９億個または１２億個の細胞／用量）またはプラシーボのいずれかへと１：１で無作為化した５０名の被験体。
＊コホート３（ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）製品）：ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）治療（９億個または１２億個の細胞／用量）またはプラシーボのいずれかへと１：１で無作為化した３００～４００名の被験体。

コホート１ｄ、コホート２、およびコホート３において、持続性のまたは増悪しつつあるＡＲＤＳを有する被験体は、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）またはプラシーボの初期投与の７２～９６時間後に、彼らが投与前に選択基準を満たし続けるのであれば、投与された第１の用量（９億個または１２億個の細胞／用量または等価なプラシーボ）に同一／等しい第２の用量のＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）またはプラシーボを受けることができた；クロスオーバーは存在しない。データ収集のための具体的研究来診は、０日目（注入前および注入後）、ならびに１日目、２日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、６０日目、９０日目、１８０日目、および３６５日目を含む。第２の用量のＩＰを受ける被験体に関しては、データ収集はまた、４日目、５日目、および６日目を含む。評価されるデータは、有害事象（ＡＥ）、バイタルサイン、安全性検査パラメーター（生化学、血液学、および凝固）、ＣＯＶＩＤ－１９検査結果、呼吸器生理学的尺度および人工呼吸器設定（ＰａＯ２／ＦｉＯ２比、酸素化指数、ピーク圧およびプラトー圧、ＰＥＥＰ、ならびに被験体位置情報［すなわち、腹臥位、仰臥位、または傾斜位（ｉｎｃｌｉｎｅｄ）］）、ＱｏＬ（ＥｕｒｏＱｏＬ５次元アンケート（ＦｉｖｅＤｉｍｅｎｓｉｏｎＱｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）［ＥＱ－５Ｄ］－５Ｌ）、入院データ（人工呼吸器日数、集中治療室［ＩＣＵ］日数、入院日数）、死亡率、連続臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア、および調査生体マーカー（白血球集団および炎症生体マーカー）を含む。

Claims

ウイルス誘発急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置する方法であって、前記方法は、ウイルス誘発ＡＲＤＳを有する被験体に、前記ＡＲＤＳを処置するために、十分な量で、十分な時間にわたって、および有効な経路によって細胞（Ｉ）を投与するステップを包含し、ここで前記細胞（Ｉ）は、培養において少なくとも１０～４０の細胞倍加を受けた非胚性幹・非生殖細胞であり、前記細胞（Ｉ）は、テロメラーゼおよび／またはｏｃｔ４を発現し、形質転換されておらず、腫瘍形成性ではなく、正常核型を有する、方法。
前記細胞（Ｉ）は、テロメラーゼを発現する、請求項１に記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、内胚葉、外胚葉および中胚葉細胞タイプのうちの少なくとも２つへと分化し得る、請求項１または２に記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、ｏｃｔ４を発現する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、ヒトである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、骨髄に由来する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、培養において４０の細胞倍加を受けている、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、培養において少なくとも４０の細胞倍加を受け得る、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
前記細胞（Ｉ）は、同種異系である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
前記ＡＲＤＳを誘発した前記ウイルスは、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓである、請求項～９のいずれかに記載の方法。
前記Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスまたは中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
前記ウイルスは、インフルエンザ、（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）を含むコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、およびアデノウウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記被験体は、ヒトである、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
前記投与の前記経路は、静脈内である、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。