JP2023521853A - がんの治療における使用のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

センチリンを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、ＣＡＲＴｙｒｉｎ）、本開示のＣＡＲ及びＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするトランスポゾン、本開示のＣＡＲ及びＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するように改変された細胞、並びに養子細胞療法のためにそれらを作製する方法及び使用する方法が開示される。【選択図】図１９Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１４日に出願された米国仮出願第６３／００９，５６９号の優先権及び利益を主張する。本出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、分子生物学、より具体的には、キメラ抗原受容体、１つ以上のＣＡＲを含有するトランスポゾン、並びにそれらを作製及び使用する方法に関する。

配列表の組み込み
２０２１年４月１３日に作成され、５４．６ＫＢのサイズである「ＰＯＴＨ－０５７＿００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前のテキストファイルの内容が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

伝統的な抗体配列又はそれらの断片を使用せずに免疫細胞の特異性を導く方法について、当該技術分野では長年切実だが満たされていない必要性が存在している。本開示は、優れたキメラ抗原受容体を提供する。

本開示は、対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の集団を含み、ＣＡＲが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含む、第１の組成物と、抗ＣＤ２０剤を含む、第２の組成物と、を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのリンパ球枯渇剤を含む、第３の組成物を更に含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２０剤は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ヨウ素ｉ１３１トシツモマブ、オビヌツズマブ、又はイブリツモマブである。好ましい実施形態において、抗ＣＤ２０剤は、リツキシマブである。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、センチリン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＶＨ、又はＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、センチリンを含む。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ＶＨを含む。

本開示はまた、対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の集団を含み、ＣＡＲが抗原認識ドメインを含む、第１の組成物と、抗－ＣＤ２０剤を含む第２の組成物と、を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、２つ以上のＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む第１の組成物を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のＣＡＲにおける各ＣＡＲは、異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのリンパ球枯渇剤を含む第３の組成物を更に含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２０剤は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ヨウ素ｉ１３１トシツモマブ、オビヌツズマブ、又はイブリツモマブである。好ましい実施形態において、抗ＣＤ２０剤は、リツキシマブである。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、センチリン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＶＨ、又はＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、センチリンは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＶＨは、ＢＣＭＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、センチリンは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ムチン１（ＭＵＣ－１）に結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＭＵＣ１－Ｃに結合する。

いくつかの実施形態において、方法は、患者における第１の組成物に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答に、第１の組成物を投与されるが第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも５０％の減少を提供する。

いくつかの実施形態において、方法は、患者における第１の組成物の持続性に、第１の組成物を投与されるが第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも７５％の増加を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、患者における第１の組成物の持続性に、第１の組成物を投与されるが第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも９０％の増加を提供する。いくつかの実施形態において、持続性の測定は、血漿濃度曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）である。

いくつかの実施形態において、第１の組成物は、複数回の注入として投与され、複数回の注入は、第１の注入と第２の注入に分割される総用量を含み、ｉ）第１の注入は、総用量の約３分の１を含み、ｉｉ）第２の注入は、総用量の約３分の２を含み、第１の注入の少なくとも１０日後に投与される。

いくつかの実施形態において、第１の組成物は、複数回の注入として投与され、複数回の注入は、第１の注入及び第２の注入に分割される総用量を含み、ｉ）第１の注入は、総用量の約３分の２を含み、ｉｉ）第２の注入は、総用量の約３分の１を含み、第１の注入の少なくとも１０日後に投与される。

いくつかの実施形態において、第１の組成物は、複数回の注入として投与され、複数回の注入は、第１の注入、第２の注入、及び第３の注入に分割される総用量を含み、ｉ）第１の注入は、総用量の約３分の１を含み、ｉｉ）第２の注入は、総用量の約３分の１を含み、第１の注入の少なくとも１０日後に投与され、ｉｉｉ）第３の注入は、総用量の約３分の１を含み、第２の注入の少なくとも１０日後に投与される。

いくつかの実施形態において、第１の注入と第２の注入との間の時間、又は第２の注入と第３の注入との間の時間は、少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、又は６週である。

いくつかの実施形態において、第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物は、順次投与される。いくつかの実施形態において、第１の組成物、第２の組成物、及び／又は第３の組成物は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、第１の組成物の前に投与される。

いくつかの実施形態において、第３の組成物は、２用量以上で投与される。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、１日に１回投与され、第３の組成物の第１の用量は、第１の組成物の第１の注入の少なくとも５日前に投与される。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、第１の組成物の第１の注入の３日、４日、及び５日前に投与される。

いくつかの実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の前に投与される。いくつかの実施形態において、第２の組成物は、２用量以上で投与される。いくつかの実施形態において、第２の組成物の第１の用量は、第１の組成物の第１の注入の１２日前に投与され、第２の組成物の第２の用量は、第１の組成物の第１の注入の５日前に投与され、その後の用量は、第１の組成物の第１の注入後、少なくとも８週間、週に１回投与される。

いくつかの実施形態において、対象は、以前に抗がん剤で治療されていない。いくつかの実施形態において、対象は、ｉ）第２の組成物の第１用量の投与前の２週間以内、又はｉｉ）第２組成物の第１用量の投与前の抗がん剤の５半減期以内に、抗がん剤を受けない。

いくつかの実施形態において、対象は、第１の組成物の第１の注入の投与後に抗がん剤を受けない。いくつかの実施形態において、対象は、免疫抑制剤で以前に治療されていない。いくつかの実施形態において、対象は、ｉ）第２の組成物の第１用量の投与前の２週間以内、又はｉｉ）第２組成物の第１の用量の投与前の免疫抑制剤の５半減期以内に、免疫抑制剤を受けていない。いくつかの実施形態において、対象は、第１の組成物の第１の注入の投与後に免疫抑制剤を受けない。

いくつかの実施形態において、対象は、以前に抗炎症剤で治療されていない。いくつかの実施形態において、対象は、ｉ）第２の組成物の第１の用量の投与前の２週間以内、ｉｉ）第２の組成物の第１の用量の投与前の１週間以内、又はｉｉ）第２の組成物の第１の用量の投与前の免疫抑制剤の５半減期以内に、抗炎症剤を受けない。いくつかの実施形態において、対象は、第１の組成物の第１の注入の投与後に抗炎症剤を受けない。いくつかの実施形態において、抗炎症剤は、コルチコステロイドである。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、プレドニゾンであり、プレドニゾンは、少なくとも５ｍｇ／日の用量で全身投与される。

いくつかの実施形態において、対象は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）で以前に治療されていない。いくつかの実施形態において、対象は、ｉ）第２の組成物の第１用量の投与前の２週間以内、又はｉｉ）第２組成物の第１の用量の投与前のＧ－ＣＳＦ若しくはＧＭ－ＣＳＦの５半減期以内に、Ｇ－ＣＳＦ若しくはＧＭ－ＣＳＦを受けない。いくつかの実施形態において、対象は、第１の組成物の最後の注入の投与後、及び／又は第１の組成物の最後の注入の投与後２か月以内に、Ｇ－ＣＳＦ若しくはＧＭ－ＣＳＦを受けない。

いくつかの実施形態において、対象は以前にハーブ薬で治療されていない。いくつかの実施形態において、対象は、第２の組成物の第１の用量の投与前の２週間以内にハーブ薬を受けない。いくつかの実施形態において、対象は、第１の組成物の最後の注入の投与後、及び／又は第１の組成物の最後の注入の投与後２か月以内にハーブ薬を受けない。

いくつかの実施形態において、第３の組成物の第１のリンパ球枯渇剤及び第３の組成物の第２のリンパ球枯渇剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、第３の組成物の第１のリンパ球枯渇剤及び第３の組成物の第２のリンパ球枯渇剤は、順次投与される。いくつかの実施形態において、第１のリンパ球枯渇剤及び第２のリンパ球枯渇剤は、同じ日に投与され、第１のリンパ球枯渇剤は、３０分の期間にわたって静脈内投与され、第２のリンパ球枯渇剤は、３０分の期間にわたって静脈内投与される。

いくつかの実施形態において、第１のリンパ球枯渇剤又は第２のリンパ球枯渇剤は、シクロホスファミド又はフルダラビンである。いくつかの実施形態において、第３の組成物の用量は、ｉ）１００ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、４００ｍｇ／ｍ^２、若しくは５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド、ｉｉ）１０ｍｇ／ｍ^２、２０ｍｇ／ｍ^２、３０ｍｇ／ｍ^２、４０ｍｇ／ｍ^２、若しくは５０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、第３の組成物の用量は、３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド及び３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンを含む。

いくつかの実施形態において、第１の組成物は、少なくとも細胞０．１×１０^６、０．２×１０^６、０．２５×１０^６、０．５×１０^６、０．６×１０^６、０．７×１０^６、０．７５×１０^６、０．８×１０^６、０．９×１０^６、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１０×１０^６、１１×１０^６、１２×１０^６、１３×１０^６、１４×１０^６、１５×１０^６、１６×１０^６、１７×１０^６、１８×１０^６、１９×１０^６、又は２０×１０^６個／対象の体重ｋｇ、の総用量で投与される。いくつかの実施形態において、第１の組成物の第１の注入、第２の注入、及び／又は第３の注入は、第１の組成物を細胞約１×１０^５個／ｍＬ～約５×１０^７個／ｍＬの濃度で含む注入バッグを使用して投与される。いくつかの実施形態において、注入バッグは、第１の組成物を細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約２．４×１０^７個／ｍＬの濃度で含む。

いくつかの実施形態において、第１の注入、第２の注入、及び／又は第３の注入は、約０．５ｍＬ／分～約３０ｍＬ／分の流速で静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態において、流速は、約１ｍＬ／分～約２０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態において、第１の注入、第２の注入、及び／又は第３の注入の全持続時間は、約５分～約３０分である。

いくつかの実施形態において、第２の組成物の用量は、１００ｍｇ／ｍ^２、１２５ｍｇ／ｍ^２、１５０ｍｇ／ｍ^２、１７５ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、２２５ｍｇ／ｍ^２、２７５ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、３２５ｍｇ／ｍ^２、３７５ｍｇ／ｍ^２、４００ｍｇ／ｍ^２、４２５ｍｇ／ｍ^２、４５０ｍｇ／ｍ^２、４７５ｍｇ／ｍ^２、又は５００ｍｇ／ｍ^２のリツキシマブを含む。好ましい実施形態において、第２の組成物の用量は、３７５ｍｇ／ｍ^２のリツキシマブである。

いくつかの実施形態において、第２の組成物は、静脈内注入によって投与され、静脈内注入の流速は、約２５ｍｇ／時間～約５００ｍｇ／時間である。いくつかの実施形態において、第２の組成物の第１の用量は、５０ｍｇ／時間の流速で静脈内注入によって投与され、流速は３０分毎に最大４００ｍｇ／時間まで増加される。いくつかの実施形態において、第２の組成物の第２の用量及びその後の用量は、約１００ｍｇ／時間の流速で静脈内注入によって投与され、流速は３０分毎に最大約４００ｍｇ／時間まで増加される。

いくつかの実施形態において、アセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、及びメチルプレドニゾロンが、第２の組成物の各用量の３０分前に投与される。

いくつかの実施形態において、がんは、血液がんである。いくつかの態様において、血液がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、多発性骨髄腫は、再発性多発性骨髄腫又は難治性多発性骨髄腫である。

いくつかの実施形態において、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態において、がんは、前立腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である。いくつかの実施形態において、固形がんは、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、又は腎臓がんである。いくつかの実施形態において、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。

本開示は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む単位用量注入バッグを提供し、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む抗原認識ドメインを含み、組成物の濃度は、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～細胞約２．４×１０^７個／ｍＬである。

本開示は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む単位用量注入バッグを提供し、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合するＶＨを含む抗原認識ドメインを含み、組成物の濃度は、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～細胞約２．４×１０^７細胞／ｍＬである。

本開示は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む単位用量注入バッグを提供し、ＣＡＲは、ＰＳＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む抗原認識ドメインを含み、組成物の濃度は、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～細胞約２．４×１０^７個／ｍＬである。

本開示は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む単位用量注入バッグを提供し、ＣＡＲは、ＭＵＣ１－Ｃに特異的に結合するｓｃＦｖを含む抗原認識ドメインを含み、組成物の濃度は、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～細胞約２．４×１０^７個／ｍＬである。

ＣＡＲＴｙｒｉｎ（ＣＤ８ａシグナルペプチド、センチリン、ＣＤ８ａヒンジ配列、及び膜貫通配列、並びにＣＤ３ｚ共刺激ドメインを含む）を含むトランスポゾンを含む、７６７６塩基対の本開示のｐｉｇｇｙＢａｃ ＣＡＲＴｙｒｉｎ構築物を示す概略図である。 本開示のＰ－ＢＣＭＡ－１０１構築物のアミノ酸配列の概要図である。 本開示のＰ－ＢＣＭＡ－１０１構築物の核酸配列の概要図である。 本開示のＰ－ＢＣＭＡ－１０１構築物の核酸配列の概要図である。 本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎの構築を示す概略図、並びにセンチリン及び抗体の特徴を対比する表である。 ５μｇのＣＡＲＴｙｒｉｎ ｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーション後のＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を示す一連の細胞選別プロットである。 左パネルは、対照Ｋ５６２細胞株及びＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞株を用いた添加後のＣＡＲＴｙｒｉｎ機能を示す一連の細胞選別プロットであり、右パネルは、左パネルのプロットの定量化を示すグラフである（ＢＣＭＡ発現株Ｕ２６６を用いた添加からのデータの追加を伴う）。 Ｔ細胞のエレクトロポレーション中に使用されたｍＲＮＡの量の関数としてのＣＡＲＴｙｒｉｎ活性を示すグラフである。 マウスにおけるＡ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎを用いたインビボ腫瘍負荷試験タイムラインを示す概略図である。 Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎ処置したマウスの完全（１００％）生存率を示す一組のグラフである。腫瘍量は、Ｍタンパク質の存在によって評価された。保護された動物では検出可能なＭタンパク質はなかった。 本開示の例示的な誘導性切断カスパーゼ９ポリペプチドを示す概略図である。 生細胞の領域（ゲーティングされた右下の象限）からアポトーシス細胞によって集団化された領域（左上の象限）へ移動する細胞の量を、治療薬（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を単独、又は本開示の誘導性カスパーゼポリペプチド（ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼによって細胞に導入されたｉＣ９構築物（「安全スイッチ」としても知られる）によってコードされる）と組み合わせて発現するように改変された細胞における誘導剤（ＡＰ１９０３）の増加する投与量の関数として、ヌクレオフェクション後１２日目に示す、一連のフローサイトメトリープロットである。 生細胞の領域（ゲーティングされた右下の象限）からアポトーシス細胞によって集団化された領域（左上の象限）へ移動する細胞の量を、治療薬（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を単独、又は本開示の誘導性カスパーゼポリペプチド（ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼによって細胞に導入されたｉＣ９構築物（「安全スイッチ」としても知られる）によってコードされる）と組み合わせて発現するように改変された細胞における誘導剤（ＡＰ１９０３）の増加する投与量の関数として、ヌクレオフェクション後１９日目に示す、一連のフローサイトメトリープロットである。 図９（左のグラフ）又は図１０（右のグラフ）のいずれかに示される集計結果の定量化を表す一組のグラフである。具体的には、これらのグラフは、細胞生存率におけるｉＣ９安全スイッチの影響を、各改変細胞型においてｉＣ９スイッチの誘導剤（ＡＰ１９０３）の濃度の関数として、１２日目（図９及び左のグラフ）又は１９日目（図１０及び右のグラフ）で示す。 ＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎの安定的発現及び機能を示すグラフである。図１２Ａは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）転位後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１におけるＣＡＲＴｙｒｉｎ表面発現を示すフローサイトメトリープロットである。モックは、初代ＢＣＭＡ／Ｆｃ／ビオチンなしを表す。 図１２Ｂは、再刺激されたＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞におけるＣＡＲＴｙｒｉｎ発現の増加を示すフローサイトメトリープロットである。 図１２Ｃは、ＢＣＭＡ＋（Ｈ９２９）細胞株に対するＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞によるインビトロ死滅を示すグラフである。 図１２Ｄは、ＢＣＭＡ発現細胞株に対するＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の増殖を示すフローサイトメトリープロットである。 ＧＬＰ安全性試験においてＰ－ＢＣＭＡ－１０１で処置したＭＭ．１Ｓ－Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスのインビボでの腫瘍増殖及び生存率を示す折れ線グラフである。雌ＮＳＧマウスにＭ．１ＳＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞をＩＶ移植し、１７～１９日後に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１：４×１０^６個のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞（低用量）（ｎ＝１９）（赤）又は１２×１０^６個のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞（高用量）（緑）かビヒクル（ｎ＝１０）（黒）かのいずれかをＩＶ投与した。腫瘍なし（青）（ｎ＝２０）。２９日目に、各処置群から１０匹のマウスを安楽死させ、病理学のために提出した。図１３Ａは、生物発光イメージングデータの平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示すグラフである。 図１３Ｂは、各処置群からの各個別マウスの生物発光イメージングデータを示すグラフである。 図１３Ｃは、３つの処置群からのマウスの生存パーセントを示す生存曲線である。 図１３Ｄは、各処置群からのマウスの体重変化を示すグラフである。 Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１単回投与に関する全体試験設計の概略図である Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の臨床作製及び工程計画の概略図である コホートＡ及びコホートＣにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１サイクル投与に関する全体的な試験設計の概略図である。第１相－サイクル投与期間では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回用量が２週の２サイクルで静脈内投与される。 コホートＢにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１サイクル投与に関する全体的な試験設計の概略図である。第１相－サイクル投与期間では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回用量が、２週の３サイクルで静脈内投与される。 Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１第１相併用投与に関する全体的な試験設計の概略図である。第１相－併用投与では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は承認された療法である、レナリドマイド及びリツキシマブと組み合わせて投与される。 Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１単独で治療された多発性骨髄腫患者における経時的なＰ－ＢＣＭＡ－１０１のコピー／ｕｇＤＮＡを示すグラフである。 Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１とリツキシマブとの併用で治療された多発性骨髄腫患者における経時なＰ－ＢＣＭＡ－１０１のコピー／ｕｇＤＮＡを示すグラフである。

本開示は、対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の集団を含み、ＣＡＲが抗原認識ドメインを含む、第１の組成物と、抗－ＣＤ２０剤を含む第２の組成物と、を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、センチリン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＶＨ、又はＶＨＨを含む。

いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む。ＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンの非限定的な例は、ＰＣＴ公開第２０１８／０１４０３８号に開示されている。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合するＶＨを含む。ＢＣＭＡに特異的に結合するＶＨの非限定的な例は、ＰＣＴ公開第２０１９／１２６５７４号に開示されている。

いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む。ＰＳＭＡに特異的に結合するセンチリンの非限定的な例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１７３６３６号に開示されている。

いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ムチン１（ＭＵＣ－１）に特異的に結合する。ヒトＭＵＣ１は、ヘテロ二量体糖タンパク質であり、単一のポリペプチドとして翻訳され、小胞体でＮ－及びＣ－末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｎ及びＭＵＣ１－Ｃ）に切断される。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、ＭＵＣ１－Ｃに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。ＭＵＣ１－Ｃに特異的に結合するセンチリンの非限定的な例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６６１２１号及びＰＣＴ公開第２０１８／０１４０３９号に開示されている。

本開示のセンチリンは、抗原に特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つ以上のセンチリンを含む本開示のキメラ抗原受容体を使用して、細胞（例えば、細胞毒性免疫細胞）の特異性を特異抗原に向けることができる。

本開示のセンチリンは、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）を含むコンセンサス配列を含み得る。

本開示のキメラ抗原受容体は、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲのシグナルペプチドを含み得る。本開示のヒンジ／スペーサードメインは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、及び／又はＣＤ４のヒンジ／スペーサー／ストークを含み得る。本開示の細胞内ドメイン又はエンドドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、ヒト４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ－４０細胞内セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを更に含み得る。例示的な膜貫通ドメインには、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１」という用語は、ＢＣＭＡに結合するセンチリン、ＢＣＭＡに結合するＣＡＲＴｙｒｉｎ、ＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲ、あるいはＢＣＭＡに特異的に結合するＣＡＲＴｙｒｉｎ若しくはＣＡＲを発現するＴ細胞又はＴ細胞の集団を指す。いくつかの事例において、「Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１」は、ＢＣＭＡに結合するＣＡＲ又はＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする構築物を指す（例えば、ＤＨＦＲ及びｉＣ９などの周囲要素を含む）。

いくつかの実施形態において、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲＴｙｒｉｎは、配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８αシグナルペプチド、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む抗原認識領域、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８αヒンジ領域、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８α膜貫通領域、配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲＴｙｒｉｎは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲＴｙｒｉｎは、配列番号４４の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

本開示は、本開示のＣＡＲ及び／又はＣＡＲＴｙｒｉｎを導入することによって１つ以上の抗原について特異的にされた、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞（Ｇ－ＣＳＦ動員末梢からのＴ細胞を含む）、臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞などの遺伝子改変細胞を提供する。本開示の細胞は、本開示のＣＡＲ又はＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするトランスポゾンと、本開示のトランスポザーゼをコードする配列（好ましくは、本開示のトランスポザーゼをコードする配列はｍＲＮＡ配列である）を含むプラスミドとの、電気泳動転写によって改変され得る。ＣＡＲＴｙｒｉｎｓをコードするトランスポゾンの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２１２２４に記載されており、参照により全体が本明細書に組み込まれる。ＣＡＲをコードするトランスポゾンの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６６９３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４２４５７に記載されており、各々は全体が本明細書に組み込まれる。

本開示のトランスポゾンは、組換え／改変細胞のゲノムにエピソームによって維持されるか、又は組み込まれる。トランスポゾンは、増強された非ウイルス遺伝子導入のためにトランスポゾン及びトランスポザーゼを利用する２成分ｐｉｇｇｙＢａｃシステムの一部であり得る。この方法の特定の実施形態において、トランスポゾンは、２つのシス調節インスレーターエレメントが隣接するキメラ抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態において、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。

本開示の方法の特定の実施形態において、トランスポゾンは、２つのシス調節インスレーターエレメントが隣接する抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態において、このトランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態において、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。

本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、

と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセント同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。

本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、以下の配列：

の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のうちの１つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。

ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のうちの２つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のうちの３つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の以下３０位、１６５位、２８２位、及び５３８位の各々においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、配列番号１２の配列の３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換である。特定の実施形態において、配列番号１２の配列の１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２の配列の２８２位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２の配列の５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である。

本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、本開示のＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１２の配列のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得、３０位におけるアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換であり、１６５位におけるアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換であり、２８２位におけるアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換であり、５３８位におけるアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素は、

と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。

トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２又は配列番号２の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、及び５９１位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を更に含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、及び５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を更に含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の８２位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１１９位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１８５位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１８７位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２００位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２０７位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２０９位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２２６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２３５位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号１２の２４０位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２４１位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２４３位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２５８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からバリンへの置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３１５位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３１９位におけるアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３２７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３２８位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４２１位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４３６位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４５６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４７０位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４８５位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５５２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。

トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を更に含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、若しくはそれ超におけるアミノ酸置換を更に含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位におけるアミノ酸置換を更に含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の１９４位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３７２位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の３７５位におけるアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の４５０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５０９位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１２又は配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２又は配列番号２の配列の３７２位、３７５位、及び４５０位におけるアミノ酸置換を更に含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、及び配列番号１２の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、配列番号１２の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換、及び配列番号１２の４５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を含み得る。足場タンパク質

本開示のタンパク質足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復タンパク質、コード化又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組み合わせ、製剤、デバイス、並びにそれらを作製及び使用する方法に由来し得る。好ましい実施形態において、タンパク質足場は、ヒトテネイシンＣ（以下「テネイシン」）からの複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からなる。更に好ましい実施形態において、本発明のタンパク質足場は、１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列である。本開示のタンパク質足場は、様々な分子、例えば、細胞標的タンパク質に結合するように設計することができる。好ましい実施形態において、本開示のタンパク質足場は、抗原の野生型及び／又は変異型のエピトープに結合するように設計することができる。

本開示のタンパク質足場は、追加の分子又は部分、例えば、抗体のＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン、若しくは半減期に影響する他の部分を含み得る。更なる実施形態において、本開示のタンパク質足場は、タンパク質足場をコードし得る核酸分子に結合され得る。

本開示は、宿主細胞において、複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づく少なくとも１つのタンパク質足場を発現するための少なくとも１つの方法を提供し、本明細書に記載の宿主細胞を、少なくとも１つのタンパク質足場が検出可能及び／又は回収可能な量で発現される条件下で培養することを含む。

本開示は、（ａ）本明細書に記載されるような複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくタンパク質足場及び／又はコード核酸と、（ｂ）好適及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤と、を含む、少なくとも１つの組成物を提供する。

本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復タンパク質、好ましくは複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列、より好ましくはヒトテネイシンからの複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくタンパク質足場のライブラリーを生成する方法を提供する。ライブラリーは、足場の一部、例えば、ループ領域の特定な位置における分子中のアミノ酸又はアミノ酸の数を（変異によって）変更することによって、足場の連続発生を作成することによって形成される。ライブラリーは、単一ループのアミノ酸組成を変更するか、又は足場分子の複数のループ若しくは追加位置の同時変更によって生成することができる。変更されるループは、それに応じて長く又は短くすることができる。かかるライブラリーは、各位置における全ての可能なアミノ酸、又は設計されたアミノ酸のサブセットを含むように作成することができる。ライブラリーメンバーは、インビトロ又はＣＩＳディスプレイ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームディスプレイなど）、酵母、細菌、及びファージディスプレイなどのディスプレイによるスクリーニングのために使用することができる。

本開示のタンパク質足場は、還元条件下での安定性及び高濃度での溶解性などの増強された生物物理学的特性を提供し、それらは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物系、酵母などの真核生物系、及びウサギ網状赤血球ライセート系などのインビトロ転写／翻訳系で発現及びフォールディングされ得る。

本開示は、本発明の足場ライブラリーを標的でパニングし、バインダーを検出することによって、特定の標的に結合する足場分子を生成する方法を提供する。他の関連する態様において、本開示は、所望の活性を有する、例えば、特定の親和性で標的タンパク質に結合することができる、タンパク質足場を生成するか又は親和性成熟させるために使用され得るスクリーニング方法を含む。親和性成熟は、ファージディスプレイ又はインビトロディスプレイなどの系を使用して、変異誘発及び選択の反復ラウンドによって達成することができる。このプロセス中の変異誘発は、特定の足場残基に対する部位特異的変異誘発、エラープローンＰＣＲによるランダム変異誘発、ＤＮＡシャフリング、及び／又はこれらの技法の組み合わせの結果であり得る。

本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復タンパク質のコンセンサス配列に基づく、単離、組換え、及び／又は合成されたタンパク質足場を提供し、限定されないが、哺乳類由来の足場、並びにコンセンサスＦＮ３配列に基づくタンパク質足場をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物及びコード核酸分子が含まれる。本開示は更に、診断用及び治療用組成物、方法並びにデバイスを含む、かかる核酸及びタンパク質足場を作製及び使用する方法を含むが、これらに限定されない。

本開示のタンパク質足場は、局所的、経口的、又は血液脳関門を越えて投与する能力、複数の標的又は同じ標的の複数のエピトープに結合する二重特異的分子又はタンデム分子に操作される、哺乳動物細胞発現能力と比較してリソースの機能として増加したタンパク質の発現を可能にするＥ．Ｃｏｌｉで発現する能力、薬物、ポリマー、及びプローブとコンジュゲート化される能力、高濃度に製剤化される能力、並びに疾患組織及び腫瘍を効果的に浸透する分子の能力などの、従来の治療法を超える利点を提供する。

更に、タンパク質足場は、抗体の可変領域を模倣するそれらのフォールドに関連する抗体の多くの特性を有する。この適応は、ＦＮ３ループを抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様に露出させることができる。それらは、細胞標的に結合できるはずであり、ループは、例えば親和性成熟化を変更して、特定の結合又は関連特性を改善することができる。

本開示のタンパク質足場の６つのループのうちの３つは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１～３）、すなわち、抗原結合領域に、トポロジー的に対応するが、残りの３つのループは、抗体ＣＤＲと同様な手段で露出される。これらのループは、配列番号１３の残基１３～１６、２２～２８、３８～４３、５１～５４、６０～６４、及び７５～８１、又はそれらの近辺にまたがる。好ましくは、残基２２～２８、５１～５４、及び７５～８１、又はそれらの近辺のループ領域は、結合特異性及び親和性について変更される。これらのループ領域のうちの１つ以上は、他のループ領域及び／又はそれらの配列を骨格部分として維持する他の鎖と一緒にランダム化され、ライブラリーをもたらし、強力な結合物質を、特定のタンパク質標的に対して高い親和性を有するライブラリーから選択することができる。ループ領域のうちの１つ以上が、タンパク質との抗体ＣＤＲ相互作用と同様に、標的タンパク質と相互作用することができる。

本開示の足場は、抗体模倣物を含み得る。

「抗体模倣物」という用語は、標的配列に特異的に結合し、かつ自然発生抗体とは異なる構造を有する有機化合物を説明することを意図する。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、又は小分子を含み得る。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原であり得る。抗体模倣物は、優れた溶解性、組織浸透、熱及び酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解への耐性）、並びにより低い製造コストを含むが、これらに限定されない、抗体よりも優れた特性を提供し得る。例示的な抗体模倣物には、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、及びアビマー（アビディティマルチマーとしても既知）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、及びモノボディが含まれるが、これらに限定されない。

本開示のアフィボディ分子は、ジスルフィド架橋が全くない１つ以上のアルファヘリックスを含むか、又はそれからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含むか、又はそれからなる。例えば、本開示の抗体分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含み得る。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含み得る。

本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマＢクリスタリン又はユビキチンのいずれかの露出したアミノ酸の改変によって産生されるタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体の親和性を機能的に模倣するが、抗体を構造的には模倣しない。アフィリンを作製するために使用される任意のタンパク質足場において、適切にフォールディングされたタンパク質分子中の、溶媒又は可能性のある結合パートナーにアクセス可能であるアミノ酸は、露出したアミノ酸と考えられる。これらの露出したアミノ酸のうちのいずれか１つ以上は、標的配列又は抗原に特異的に結合するように改変され得る。

本開示のアフィマー分子は、特異的な標的配列のための高親和性結合部位をもたらすペプチドループを提示するように遺伝子操作された、高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質又はその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータシートの上に位置するアルファヘリックスを含む共通の三次構造を共有し得る。

本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来し得る。本開示のアフィチンは、抗原の全体又は一部であり得る標的配列に選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合タンパク質の結合表面上の１つ以上のアミノ酸配列をランダム化し、結果として生じたタンパク質をリボソームディスプレイ及び選択に供することによって製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム内、又はペプチド、タンパク質、ウイルス、若しくは細菌の表面上に見出され得る。本開示のある特定の実施形態において、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用され得る。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質又はその誘導体を含み得る。

本開示のアルファボディ分子は、細胞浸透性アルファボディ（ＣＰＡＢ）と称され得る。本開示のアルファボディ分子は、多様な標的配列（抗原を含む）に結合する小タンパク質（典型的には１０ｋＤａ未満の）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に達し、それに結合することができる。構造的に、本開示のアルファボディ分子は、一本鎖アルファヘリックス（自然発生コイルドコイル構造に類似）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変されている１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質足場を含み得る。分子の結合特異性にかかわらず、本開示のアルファボディ分子は、正しいフォールディング及び熱安定性を維持する。

本開示のアンチカリン分子は、タンパク質又は小分子のいずれかにおける標的配列又は部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含み得る。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体又はその断片の代わりに使用され得る。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体又はその断片よりも優れた組織透過及び熱安定性を示し得る。本開示の例示的なアンチカリン分子は、およそ２０ｋＤａの質量を有する約１８０アミノ酸を含み得る。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続し、アルファヘリックスが結合したペアワイズの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。好ましい実施形態において、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続し、アルファヘリックスが結合したペアワイズの８つの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。

本開示のアビマー分子は、標的配列（これは抗原でもあり得る）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内又は異なる標的内の複数の結合部位を認識し得る。本開示のアビマーが１つを超える標的を認識するとき、このアビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、各々、およそ３０～３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列を含み得る。これらのペプチドは、１つ以上のリンカーペプチドを介して接続されていてもよい。アビマーのペプチドのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来し得る。アビマーは、ジスルフィド結合及び／又はカルシウムを任意選択的に含み得る強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較してより高い熱安定性を示し得る。

本開示のＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対して高い特異性及び高い親和性を有する遺伝子操作されたタンパク質、組換えタンパク質、又はキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、任意選択的に、アンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位とも称される）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性のタンパク質間相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きな標的相互作用表面を含む。

本開示のＦｙｎｏｍｅｒは、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来し、抗体と等しい親和性及び等しい特異性で標的配列及び分子に結合するように遺伝子操作された、小さな結合タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。

本開示のＫｕｎｉｔｚドメインペプチドは、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質足場を含む。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的に、本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、ジスルフィドに富むアルファ＋ベータフォールドを含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤によって例示される。Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチドは、特異的なタンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼ阻害剤として働く。本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）に由来する）を含み得る。

本開示のモノボディは、サイズにおいて一本鎖抗体と同等の小タンパク質である（約９４個のアミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つ以上の明確に異なるタンパク質又は標的配列を特異的に標的とし得る。好ましい実施形態において、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣し、より好ましくは、フィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、及びそのモノボディ模倣物には、抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側面に、バレルを形成する７つのベータシート及び３つの露出したループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンのための結合部位並びに中央のジスルフィド結合を欠いている。多重特異性モノボディは、ループＢＣ及びＦＧを改変することによって最適化することができる。本開示のモノボディは、アドネクチンを含んでもよい。

そのため、方法は、少なくとも１つの足場タンパク質を含む有効量の組成物又は薬学的組成物を、症状、効果、又はメカニズムのかかる調節、治療、緩和、予防、若しくは軽減を必要とする細胞、組織、器官、動物、又は患者に投与することを含むことができる。有効量は、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは連続投与当たり約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは連続投与当たり０．０１～５０００μｇ／ｍｌ血清濃度の血清濃度を達成する量、あるいは本明細書に記載されているか、又は関連分野で知られている既知の方法を使用して行われ、決定される、任意の有効範囲若しくはその中の値を含むことができる。

足場タンパク質の産生及び生成
本開示の少なくとも１つの足場タンパク質は、当該技術分野において周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって任意選択的に産生することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４－２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）を参照されたい。

足場タンパク質からのアミノ酸は、当該技術分野において既知であるように、免疫原性を低下させるために、あるいは結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期、安定性、溶解性、又は任意の他の好適な特性を低下させる、強化する、又は改変するために、変更、追加、及び／又は削除され得る。

任意選択的に、足場タンパク質は、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持しながら操作することができる。この目標を達成するために、足場タンパク質は、任意選択的に、親配列及び操作された配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的な操作された産物の分析プロセスによって調製され得る。三次元モデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補配列の考えられる三次元立体構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能であり、潜在的な免疫原性を計測することができる（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｒｏｖｉａ，Ｃａｌｉｆ．）のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）。これらのディスプレイの検査は、候補配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補足場タンパク質がその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このように、残基は、標的抗原に対する親和性などの所望の特徴が達成されるように、親配列及び参照配列から選択及び組み合わされ得る。代替的に、又は上記の手順に加えて、他の好適な操作方法が、使用され得る。

足場タンパク質のスクリーニング
類似のタンパク質又は断片への特異的結合についてのタンパク質足場のスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡディスプレイ）又はペプチドディスプレイライブラリー、例えば、インビトロディスプレイを使用して都合よく達成することができる。この方法は、所望の機能又は構造を有する個々のメンバーに対するペプチドの大きな集合体をスクリーニングすることを伴う。ディスプレイされたヌクレオチド又はペプチド配列は、３～５０００個以上のヌクレオチド又はアミノ酸の長さ、しばしば、５～１００個のアミノ酸の長さ、及びしばしば、約８～２５個のアミノ酸の長さであり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接的な化学的合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が、記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面上のペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。かかる方法は、ＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号、及び同第９３／０８２７８号に記載されている。

ペプチドのライブラリーを生成するための他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え法の両方の態様を有する。ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号、同第９２／１４８４３号、及び同第９６／１９２５６号を参照されたい。米国特許第５，６５８，７５４号及び同第５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの供給業者から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９３９，６６６号、同第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号、同第５，５１８，８８９号、同第５，５３４，６２１号、同第５，６５６，７３０号、同第５，７６３，７３３号、同第５，７６７，２６０号、同第５８５６４５６号、Ｄｙａｘに譲渡された同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号、Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５，８８５，７９３号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５，７５０，３７３号、Ｘｏｍａ、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，上記、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記、又はＳａｍｂｒｏｏｋ，上記に譲渡された同第５，６１８，９２０号、同第５，５９５，８９８号、同第５，５７６，１９５号、同第５，６９８，４３５号、同第５，６９３，４９３号、同第５，６９８，４１７号を参照されたい。

本開示タンパク質足場は、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒト又は他の哺乳動物タンパク質に結合することができる。好ましい実施形態において、本開示の少なくとも１つのタンパク質足場は、任意選択的に、当業者によって実践されるように、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定されるように、高親和性で、例えば、０．１～９．９（又はその間の任意の範囲若しくは値）×１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、１０－１５などであるが、これらに限定されない、約１０－７Ｍ以下、又はその間のいずれかの範囲若しくは値のＫＤで、標的タンパク質に結合することができる。

抗原に対するタンパク質足場の親和性又はアビディティは、任意の好適な方法を使用して実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）、及び本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定のタンパク質足場－抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変化し得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、タンパク質足場及び抗原の標準化された溶液、並びに本明細書に記載の緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。

どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストが、本開示のタンパク質足場を有する標的タンパク質との結合について競合するか、及び／又はエピトープ領域を共有するかを判定するために、競合アッセイを本開示のタンパク質足場を用いて実施することができる。当業者に容易に知られているこれらのアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位についてのアンタゴニスト又はリガンド間の競合を評価する。タンパク質及び／又は抗体は、競合の前後に固定化又は不溶化され、標的タンパク質に結合したサンプルは、例えば、デカンテーション（タンパク質／抗体が事前に不溶化された場合）又は遠心分離（タンパク質／抗体は競合反応後に沈殿した）によって未結合サンプルから分離される。また、競合的結合は、タンパク質足場を有する標的タンパク質への結合又は結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えば、タンパク質足場分子が、例えば、標識の酵素活性を阻害又は増強するかどうかによって判定され得る。当該技術分野において周知であるように、ＥＬＩＳＡ及び他の機能アッセイを使用することができる。

核酸分子
タンパク質足場をコードする本開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、若しくは任意の他の形態などのＲＮＡの形態、又はクローニングによって得られるか、若しくは合成的に生成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定されないＤＮＡの形態、あるいはそれらの任意の組み合わせであることができる。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖、若しくは一本鎖、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であることができ、又はアンチセンス鎖とも称される非コード鎖であることもできる。

本開示の単離された核酸分子は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を含むことができ、任意選択的に、１つ以上のイントロン、例えば、限定されないが、少なくとも１つのタンパク質足場の少なくとも１つの特定された部分、標的タンパク質に結合するタンパク質足場又はループ領域のコード配列を含む核酸分子、及び上記のものとは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重のために、本明細書に記載及び／又は当該技術分野で既知であるタンパク質足場を依然としてコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を有する。もちろん、遺伝子コードは当該技術分野で周知である。したがって、本発明の特定のタンパク質足場をコードする縮重核酸バリアントを生成することは、当業者にとって日常的なことである。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，上記を参照し、かかる核酸バリアントは、本発明に含まれる。

本明細書に示されるように、タンパク質足場をコードする核酸を含む本開示の核酸分子には、タンパク質足場断片のアミノ酸配列をそれ自体でコードするもの；タンパク質足場全体又はその一部のコード配列；タンパク質足場、断片、又は一部のコード配列、並びに少なくとも１つのイントロンなどの前述の追加コード配列を伴うか若しくは伴わずに、スプライシングを含むｍＲＮＡプロセシングである転写において役割を演じる転写された非翻訳配列及びポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）などの非コード化５’及び３’配列を含むがこれらに限定されない追加の非コード化配列と一緒に、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列などの追加の配列；追加の機能性を提供するものなどの追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列、を含むことができるが、これらに限定されない。したがって、タンパク質足場をコードする配列は、タンパク質足場断片又は部分を含む融合タンパク質足場の精製を容易にするペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合することができる。

本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示は、本明細書に開示のポリヌクレオチドに選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、預託ライブラリーにおける部分的若しくは全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒト又は哺乳動物の核酸ライブラリーからｃＤＮＡに単離されたか、又はそうでなければ相補的なゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列である。

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは少なくとも８５％又は９０％の全長配列、より好ましくは少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーを正規化して、希少な配列の代表を増加させることができる。低度又は中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、排他的ではないが、典型的には、相補的配列と比較して低下した配列同一性を有する配列で用いられる。中度及び高度にストリンジェントな条件は、より高い同一性の配列について任意選択的に用いることができる。低度にストリンジェントな条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガス又はパラロガス配列を特定するために使用することができる。

任意選択的に、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質足場の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドと選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，上記を参照されたく、各々が、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当該技術分野において周知であるように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）それらの組み合わせを使用して作製することができる。

核酸は、本開示のポリヌクレオチドに加えて、配列を都合良く含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を除く本開示の核酸は、任意選択的に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。

追加の配列をそのようなクローニング及び／又は発現配列に付加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができるか、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；又はＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。

核酸を構築するための組換え法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせなどの本開示の単離された核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング方法論を使用して生物学的起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；又はＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。

核酸のスクリーニング及び単離方法
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを使用してスクリーニングすることができる。プローブを使用して、同じ又は異なる生体内の相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることができる。当業者は、アッセイ中で様々な程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであり得るということを理解するであろう。ハイブリダイゼーションのための条件が、ストリンジェントになるほど、二重鎖形成が生じるためにプローブと標的との間には更に高い程度の相補性がなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分的変性溶媒の存在のうちの１つ以上によって制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％～５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることによって都合よく変更される。検出可能な結合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーに従って変化する。相補性の程度は、最適には、１００％、又は７０～１００％、又はその間の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーを低下させることによって補償することができることを理解すべきである。

ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に提示される教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに、本開示に従って使用することができる。

ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，７９５，６９９号、及び同第４，９２１，７９４号（Ｔａｂｏｒら）、同第５，１４２，０３３号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，１２２，４６４号（Ｗｉｌｓｏｎら）、同第５，０９１，３１０号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，０６６，５８４号（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら）、同第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）、同第４，９９４，３７０号（Ｓｉｌｖｅｒら）、同第４，７６６，０６７号（Ｂｉｓｗａｓ）、同第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄ）、及び二本鎖ＤＮＡ合成のテンプレートとして標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ媒介増幅（米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）、商標ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されず、これらの参考文献の全容は参照により本明細書に組み込まれる。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；又はＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから直接的に、本開示のポリヌクレオチド及び関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化する、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、又は他の目的のためのプローブとして用いるための核酸を作製するのに有用であり得る。インビトロ増幅方法を通して当業者を導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、及びＡｕｓｕｂｅｌ、上記、並びにＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、及びＩｎｎｉｓらのＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販のキットは、当該技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。

核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸はまた、既知の方法による直接化学合成によって調製され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーション、又は一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００以上の塩基の配列に限定され得るが、より長い配列は、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを認識するであろう。

組換え発現カセット
本開示は更に、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば、本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含むであろう。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を使用して、本開示の核酸の発現を導くことができる。

いくつかの実施形態において、プロモーター、エンハンサー、又は他のエレメントとして機能する単離された核酸を、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本開示のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、及び／又は置換によってインビボ又はインビトロで変化させることができる。

ベクター及び宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び当該技術分野において周知であるように、組換え技術による少なくとも１つのタンパク質足場の産生に関する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたく、各々が、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

例えば、ＰＢ－ＥＦ１ａベクターを使用することができる。ベクターは、以下のヌクレオチド配列を含む：
ｔｇｔａｃａｔａｇａｔｔａａｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａａｔｃａｔａｔｔｇｔｇａｃｇｔａｃｇｔｔａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔａａａａｔｔｇａｃｇｃａｔｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｇｇｔｃｔｇｔａｔａｔｃｇａｇｇｔｔｔａｔｔｔａｔｔａａｔｔｔｇａａｔａｇａｔａｔｔａａｇｔｔｔｔａｔｔａｔａｔｔｔａｃａｃｔｔａｃａｔａｃｔａａｔａａｔａａａｔｔｃａａｃａａａｃａａｔｔｔａｔｔｔａｔｇｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔａａａａａａａａａｃａａａａａｃｔｃａａａａｔｔｔｃｔｔｃｔａｔａａａｇｔａａｃａａａａｃｔｔｔｔａｔｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇａｇｇｇａｃａｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃａａａｇｃｃｃｃｃａｇｇｇａｔｇｔａａｔｔａｃｇｔｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｃｔａｇｇｇｇｇｃａｇｃａｇｃｇａｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｃｔｃｃｇｇｔｃｃｇｇｃｇｃｔｃｃｃｃｃｃｇｃａｔｃｃｃｃｇａｇｃｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇａｃａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｇｇｇｇａａｇｇｔｇｇｃａｃｇｇｇａｔｃｇｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇａａｃｇｃｔｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇａｃａｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｔａｃｇｇｇｇａａａａｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｃｃｔｔｔｃｇａｔｃｇａａｃｃａｔｇｇａｃａｇｔｔａｇｃｔｔｔｇｃａａａｇａｔｇｇａｔａａａｇｔｔｔｔａａａｃａｇａｇａｇｇａａｔｃｔｔｔｇｃａｇｃｔａａｔｇｇａｃｃｔｔｃｔａｇｇｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｔｇｇｇａａｔｔｇｇｃｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｃｇｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇａａｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃｇｇｃａａｔｔｇａａｃｃｇｇｔｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｔａａａｃｔｇｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇａａｃｃｇｔａｔａｔａａｇｔｇｃａｇｔａｇｔｃｇｃｃｇｔｇａａｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｃａａｃｇｇｇｔｔｔｇｃｃｇｃｃａｇａａｃａｃａｇｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｔｃｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｔａｃｇｔｇａｔｔｃｔｔｇａｔｃｃｃｇａｇｃｔｔｃｇｇｇｔｔｇｇａａｇｔｇｇｇｔｇｇｇａｇａｇｔｔｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｇｃｃｃｃｔｔｃｇｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｇａｇｔｔｇａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇａａｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｇｃｃｔｇｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｔｔｃｇａｔａａｇｔｃｔｃｔａｇｃｃａｔｔｔａａａａｔｔｔｔｔｇａｔｇａｃｃｔｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｇｃａａｇａｔａｇｔｃｔｔｇｔａａａｔｇｃｇｇｇｃｃａａｇａｔｃｔｇｃａｃａｃｔｇｇｔａｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇｇｃｃｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｃｃｃｇｔｇｃｇｔｃｃｃａｇｃｇｃａｃａｔｇｔｔｃｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｃａｃｃｇａｇａａｔｃｇｇａｃｇｇｇｇｇｔａｇｔｃｔｃａａｇｃｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｇｇｃａａｇｇｃｔｇｇｃｃｃｇｇｔｃｇｇｃａｃｃａｇｔｔｇｃｇｔｇａｇｃｇｇａａａｇａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｇａｇｃｔｃａａａａｔｇｇａｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｇｇｇａｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇａｇｔｃａｃｃｃａｃａｃａａａｇｇａａａａｇｇｇｃｃｔｔｔｃｃｇｔｃｃｔｃａｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｃａｃｇｇａｇｔａｃｃｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃｃａｇｇｃａｃｃｔｃｇａｔｔａｇｔｔｃｔｃｇａｇｃｔｔｔｔｇｇａｇｔａｃｇｔｃｇｔｃｔｔｔａｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｇｔｔｔｃｃｃｃａｃａｃｔｇａｇｔｇｇｇｔｇｇａｇａｃｔｇａａｇｔｔａｇｇｃｃａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｔｇａｔｇｔａａｔｔｃｔｃｃｔｔｇｇａａｔｔｔｇｃｃｃｔｔｔｔｔｇａｇｔｔｔｇｇａｔｃｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｔｃａａｇｃｃｔｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｔｃａａａｇｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｔｔｃａｇｇｔｇｔｃｇｔｇａｇａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃａｔｃａｔｔｔｔｇｇｃａａａｇａｔｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｃｔｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇａｇｇｇｔｃｇａｃｇｃｃｔｃｔａｇａｃｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｃｇｇａｔｃｃａｃｇｇｇｔａｃｃｇａｔｃａｃａｔａｔｇｃｃｔｔｔａａｔｔａａａｃａｃｔａｇｔｔｃｔａｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔａａａｔｔｃｃｃｔｔｔａｇｔｇａｇｇｇｔｔａａｔｇｇｃｃｇｔａｇｇｃｃｇｃｃａｇａａｔｔｇｇｇｔｃｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａｃａｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔｇｇａｃａａａｃｃａｃａａｃｔａｇａａｔｇｃａｇｔｇａａａａａａａｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔｇａａａｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔａｔｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔａａｃｃａｔｔａｔａａｇｃｔｇｃａａｔａａａｃａａｇｔｔａａｃａａｃａａｃａａｔｔｇｃａｔｔｃａｔｔｔｔａｔｇｔｔｔｃａｇｇｔｔｃａｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｇａｃｔｃｔａｇｇａｃｃｔｇｃｇｃａｔｇｃｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｔｃｃｃｃｇｔａｔｃｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｃｔｃａａａｇａｇｃａｇｃｇａｇａａｇｃｇｔｔｃａｇａｇｇａａａｇｃｇａｔｃｃｃｇｔｇｃｃａｃｃｔｔｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｇｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃｇｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｔｇｃｇｇｇｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｇａｃｃｇｇａｇｃｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｔｃｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｇｇｇｇｇａｇｇｇａｃｇｔａａｔｔａｃａｔｃｃｃｔｇｇｇｇｇｃｔｔｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｔｇｔｃｃｃｔｃｔｃａｃｃｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｔｇｔｔｃｇａａｔｔｇｇｇｇｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｇｔａｔｃｇａｔｇａｔａｔｃｔａｔａａｃａａｇａａａａｔａｔａｔａｔａｔａａｔａａｇｔｔａｔｃａｃｇｔａａｇｔａｇａａｃａｔｇａａａｔａａｃａａｔａｔａａｔｔａｔｃｇｔａｔｇａｇｔｔａａａｔｃｔｔａａａａｇｔｃａｃｇｔａａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔｃａｔｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｃｇｇｔｃｇｔｔａｔａｇｔｔｃａａａａｔｃａｇｔｇａｃａｃｔｔａｃｃｇｃａｔｔｇａｃａａｇｃａｃｇｃｃｔｃａｃｇｇｇａｇｃｔｃｃａａｇｃｇｇｃｇａｃｔｇａｇａｔｇｔｃｃｔａａａｔｇｃａｃａｇｃｇａｃｇｇａｔｔｃｇｃｇｃｔａｔｔｔａｇａａａｇａｇａｇａｇｃａａｔａｔｔｔｃａａｇａａｔｇｃａｔｇｃｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｇｃａｇａｃｔａｔｃｔｔｔｃｔａｇｇｇｔｔａａｔｃｔａｇｃｔａｇｃｃｔｔａａｇｇｇｃｇｃｃｔａｔｔｇｃｇｔｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇｃｃｃｇｃｔｔｔｃｃａｇｔｃｇｇｇａａａｃｃｔｇｔｃｇｔｇｃｃａｇｃｔｇｃａｔｔａａｔｇａａｔｃｇｇｃｃａａｃｇｃｇｃｇｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔｔｔｇｃｇｔａｔｔｇｇｇｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔｇｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇｇｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｔａｔｃａｇｃｔｃａｃｔｃａａａｇｇｃｇｇｔａａｔａｃｇｇｔｔａｔｃｃａｃａｇａａｔｃａｇｇｇｇａｔａａｃｇｃａｇｇａａａｇａａｃａｔｇａｃｃａａａａｔｃｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｃｃｃｃｇｔａｇａａａａｇａｔｃａａａｇｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃａａａｃａａａａａａａｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇｇａｔｃａａｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇａａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃａｇａｔａｃｃａａａｔａｃｔｇｔｔｃｔｔｃｔａｇｔｇｔａｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｇｃｃａｃｃａｃｔｔｃａａｇａａｃｔｃｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔａｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｔａａｔｃｃｔｇｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｃｇａｔａａｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃａｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｇａｃｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇａｇａｔａｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｇａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｃｃｃｇａａｇｇｇａｇａａａｇｇｃｇｇａｃａｇｇｔａｔｃｃｇｇｔａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｔｃｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｇａｇｃｇｔｃｇａｔｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｃｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｃｃａｇｃａａｃｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇａｇａｔｔａｔｃａａａａａｇｇａｔｃｔｔｃａｃｃｔａｇａｔｃｃｔｔｔｔａａａｔｔａａａａａｔｇａａｇｔｔｔｔａａａｔｃａａｔｃｔａａａｇｔａｔａｔａｔｇａｇｔａａａｃｔｔｇｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇｇｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｃｇａａｔｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｇｔａａａｇｃａｃｇａｇｇａａｇｃｇｇｔｃａｇｃｃｃａｔｔｃｇｃｃｇｃｃａａｇｃｔｃｔｔｃａｇｃａａｔａｔｃａｃｇｇｇｔａｇｃｃａａｃｇｃｔａｔｇｔｃｃｔｇａｔａｇｃｇｇｔｃｃｇｃｃａｃａｃｃｃａｇｃｃｇｇｃｃａｃａｇｔｃｇａｔｇａａｔｃｃａｇａａａａｇｃｇｇｃｃａｔｔｔｔｃｃａｃｃａｔｇａｔａｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｇｇｃａｔｃｇｃｃａｔｇｇｇｔｃａｃｇａｃｇａｇａｔｃｃｔｃｇｃｃｇｔｃｇｇｇｃａｔｇｃｔｃｇｃｃｔｔｇａｇｃｃｔｇｇｃｇａａｃａｇｔｔｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｇｃｃｃｃｔｇａｔｇｃｔｃｔｔｃｇｔｃｃａｇａｔｃａｔｃｃｔｇａｔｃｇａｃａａｇａｃｃｇｇｃｔｔｃｃａｔｃｃｇａｇｔａｃｇｔｇｃｔｃｇｃｔｃｇａｔｇｃｇａｔｇｔｔｔｃｇｃｔｔｇｇｔｇｇｔｃｇａａｔｇｇｇｃａｇｇｔａｇｃｃｇｇａｔｃａａｇｃｇｔａｔｇｃａｇｃｃｇｃｃｇｃａｔｔｇｃａｔｃａｇｃｃａｔｇａｔｇｇａｔａｃｔｔｔｃｔｃｇｇｃａｇｇａｇｃａａｇｇｔｇａｇａｔｇａｃａｇｇａｇａｔｃｃｔｇｃｃｃｃｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｃｃａａｔａｇｃａｇｃｃａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｇｃｔｔｃａｇｔｇａｃａａｃｇｔｃｇａｇｃａｃａｇｃｔｇｃｇｃａａｇｇａａｃｇｃｃｃｇｔｃｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｇａｔａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃｔｔｇｃａｇｔｔｃａｔｔｃａｇｇｇｃａｃｃｇｇａｃａｇｇｔｃｇｇｔｃｔｔｇａｃａａａａａｇａａｃｃｇｇｇｃｇｃｃｃｃｔｇｃｇｃｔｇａｃａｇｃｃｇｇａａｃａｃｇｇｃｇｇｃａｔｃａｇａｇｃａｇｃｃｇａｔｔｇｔｃｔｇｔｔｇｔｇｃｃｃａｇｔｃａｔａｇｃｃｇａａｔａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃｃａａｇｃｇｇｃｃｇｇａｇａａｃｃｔｇｃｇｔｇｃａａｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｃａａｔｃａｔａａｔａｔｔａｔｔｇａａｇｃａｔｔｔａｔｃａｇｇｇｔｔｃｇｔｃｔｃｇｔｃｃｃｇｇｔｃｔｃｃｔｃｃｃａａｔｇｃａｔｇｔｃａａｔａｔｔｇｇｃｃａｔｔａｇｃｃａｔａｔｔａｔｔｃａｔｔｇｇｔｔａｔａｔａｇｃａｔａａａｔｃａａｔａｔｔｇｇｃｔａｔｔｇｇｃｃａｔｔｇｃａｔａｃｇｔｔｇｔａｔｃｔａｔａｔｃａｔａａｔａ（配列番号４０）

ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主中で増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、又は荷電した脂質との複合体に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし、その後、宿主細胞に形質導入することができる。

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含むであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始及び終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）で始まる翻訳を含み、哺乳動物又は真核生物細胞の発現では、ＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。

発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、例えば、真核細胞培養のためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸又はグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）、ブラスチシジン（ｂｓｄ遺伝子）、耐性遺伝子、並びにＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌又は原核生物での培養のためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、又はテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において既知である。好適なベクターは、当業者に容易に明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランに媒介したトランスフェクション、カチオン性脂質に媒介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の既知の方法によって達成され得る。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１～４章及び第１６～１８章、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１、９、１３、１５、１６章などの当該技術分野において記載される。

発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含む。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットと区別する、表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質の群を含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を、本開示の組成物又は方法によって改変されていない細胞と区別する。そのような細胞表面マーカーには、例えば、「表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）」、又は「分類決定基（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」タンパク質（しばしば、「ＣＤ」と略記される）、例えば、切断型又は完全長形態のＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ａｕｇ２１；１２４（８）：１２７７－８７）を更に含む。

発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むであろう。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型又は変異型のＮｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

本開示の少なくとも１つのタンパク質足場は、融合タンパク質などの改変された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、更なる異種の機能性領域も含み得る。例えば、更なるアミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸の領域を、タンパク質足場のＮ末端に付加させて、精製中又はその後の取り扱い及び保管中の宿主細胞における安定性及び存続を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示のタンパク質足場に付加させて、精製を助長することができる。そのような領域は、タンパク質足場又はその少なくとも１つの断片の最終調製の前に除去することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１７．２９～１７．４２章及び第１８．１～１８．７４章、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１６、１７、及び１８章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を熟知している。代替的に、本開示の核酸を、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞において（操作によって）オンにすることによって、宿主細胞において発現させることができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号（参照により本明細書に全体が組み込まれる）に記載されるように、当該技術分野において周知である。

タンパク質足場、それらの特定の部分、又は変異体の産生に有用な実例となる細胞培養物は、当該技術分野において既知である、細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁物又はバイオリアクターを使用することもできる。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することができる多数の好適な宿主細胞株が、当該技術分野において開発されており、それらは、ＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ－７（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１０）及びＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１８５１）である。特に好ましい実施形態において、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。

これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、後期又は早期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター、エンハンサー、及び／又はプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）、並びに転写終結配列などであるが、これらに限定されない、発現制御配列のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。本発明の核酸又はタンパク質の産生に有用な他の細胞は、既知であり、及び／又は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）、若しくは他の既知若しくは商業的供給源から入手可能である。

真核生物の宿主細胞が用いられるとき、ポリアデニル化又は転写終結配列が、通常はベクターに組み込まれる。終結配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３－７８１（１９８３））。加えて、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野において既知であるように、ベクターに組み込むことができる。

タンパク質足場の精製
タンパク質足場は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いることができる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。

本開示のタンパク質足場は、自然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、及び例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物の宿主から組換え技術によって産生された生成物を含む。組換え産生手順で用いられる宿主に応じて、本開示のタンパク質足場は、グリコシル化することができるか、又はグリコシル化することができない。かかる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ１７．３７－１７．４２、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、１０、１２、１３、１６、１８、及び２０章、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出、１２章～１４章などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されており、参照により全てが本明細書に組み込まれている。

アミノ酸コード
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸は、しばしば、短縮される。アミノ酸名は、当該技術分野において十分理解されているように、その１文字コード、その３文字コード、名称、又は３つのヌクレオチドコドンによってアミノ酸を指定することによって示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。本開示のタンパク質足場は、本明細書で特定されるように、自然又はヒトの操作のいずれかから、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含むことができる。機能に不可欠である、本開示のタンパク質足場中のアミノ酸は、当該技術分野において既知の方法、例えば、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発によって同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，Ｃｈａｐｔｅｒｓ８，１５、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１－１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子の残基ごとに単一のアラニン変異を導入する。次いで、結果として得られた変異体分子は、少なくとも１つの中和活性などであるが、これらに限定されない、生物学的活性について試験される。タンパク質足場の結合に重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、又は光親和性標識などの構造解析によって同定することができる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４（１９９２）及びｄｅ Ｖｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６－３１２（１９９２））。

当業者が理解するように、本発明は、本開示の少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質足場を含む。生物学的に活性なタンパク質足場は、天然（非合成）の、内因性の、又は関連する及び既知のタンパク質の比活性の少なくとも２０％、３０％、又は４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、又は９５％～９９％又はそれより高い、比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の尺度をアッセイ及び定量する方法は、当業者に周知である。

別の態様において、本開示は、有機部分の共有結合によって修飾される、本明細書に記載のタンパク質足場及び断片に関する。そのような修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増加したインビボ血清半減期）を有するタンパク質足場断片を生成することができる。有機部分は、直鎖状若しくは分岐親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施形態において、親水性ポリマー基は、約８００～約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。

本開示の修飾されたタンパク質足場及び断片は、抗体に直接的又は間接的に共有結合している１つ以上の有機部分を含むことができる。本開示のタンパク質足場又は断片に結合している各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で使用される場合、オクタンよりも水においてより可溶性である有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンは、オクタンよりも水においてより可溶性である。したがって、ポリリジンの共有結合によって修飾されたタンパク質足場は、本開示により包含される。本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、直鎖状若しくは分岐であることができ、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸エステル（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｔｅ）など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンを含むことができる。好ましくは、本開示のタンパク質足場を修飾する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００（下付き文字は、ダルトンでのポリマーの平均分子量である）を使用することができる。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、好適な方法を用いることによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩にカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化されたカルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化される）は、ポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。

本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和であることができるか、又は１つ以上の不飽和単位を含むことができる。本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適な脂肪酸は、例えば、ｎ－ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ－テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ－オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ－エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ－ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ－トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタノエート（Ｃ４０）、ｃｉｓ－Δ９－オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全ｃｉｓ－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などを含む。好適な脂肪酸エステルは、直鎖又は分枝鎖低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含むことができる。

修飾されたタンパク質足場及び断片は、１つ以上の修飾剤との反応によるなど、好適な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用される「修飾剤」という用語は、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第２の化学基と反応し、それによって修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することができる化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などの求電子基を含む。チオールと反応することができる活性化基は、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などを含む。アルデヒド官能基は、アミン含有分子又はヒドラジド含有分子に結合することができ、アジド基は、三価リン基と反応してホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。活性化基を分子に導入する好適な方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に、又はリンカー部分、例えば、１つ以上の炭素原子を酸素、窒素、若しくは硫黄などのヘテロ原子によって置換することができる二価Ｃ１～Ｃ１２基を通して結合することができる。好適なリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、及び－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－を含む。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）を１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させることによって生成して、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間にアミド結合を形成することができる。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた処理によって生成物から除去して、記載されるように別のカルボキシレートに結合することができる一級アミンを露出させることができるか、又は無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／１６２２１を参照し、その全教示は参照により本明細書に組み込まれる。）

本開示の修飾タンパク質足場は、タンパク質足場又は断片を修飾剤と反応させることによって生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることによって、非部位特異的手段でタンパク質足場に結合することができる。本開示のタンパク質足場の特定の部位に結合される有機部分を含む修飾されたタンパク質足場及び断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７－１５３（１９９２）、Ｗｅｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１－４１７（１９９４）、Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３－２２４１（１９９７）、Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９－６８（１９９６）、Ｃａｐｅｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６－４６３（１９９７））などの好適な方法、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載される好適な方法を使用して調製することができる。

更なる治療活性成分を含むタンパク質足場組成物
本開示のタンパク質足場化合物、組成物、又は組み合わせは、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどであるが、これらに限定されない任意の好適な助剤の少なくとも１つを更に含むことができる。薬学的に許容される助剤が好ましい。かかる無菌溶液の非限定的な例、及びその調製方法は、例えば、限定されないが、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０など、当該技術分野で周知である。薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知か、又は本明細書に記載のタンパク質足場、断片、若しくはバリアント組成物の投与様式、溶解性、及び／又は安定性に好適なものを定型的に選択することができる。

本組成物に有用な薬学的賦形剤及び添加剤には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化された糖、及び多糖類又は糖ポリマー）が含まれるが、これらに限定されず、単独又は組み合わせで存在することができ、単独又は組み合わせて重量若しくは体積で１～９９．９９％を含む。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能力でも機能し得る代表的なアミノ酸／タンパク質成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。

本発明における使用に好適な炭水化物賦形剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトール類が含まれる。本発明における使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。

タンパク質足場組成物はまた、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含むことができ、典型的には、緩衝剤は有機の酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝剤が含まれる。本組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。

加えて、本発明のタンパク質足場組成物は、ポリマー賦形剤／添加剤を含むことができ、ポリビニルピロリドン、フィコール（高分子糖）、デキストレート（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例、「ＴＷＥＥＮ２０」及び「ＴＷＥＥＮ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などが挙げられる。

本発明によるタンパク質足場、部分、又はバリアント組成物における使用に好適なこれら及び追加の既知の薬学的賦形剤及び／又は添加剤は、当該技術分野で既知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）に列挙されており、これらの開示は参照により本明細書に全体が組み込まれる。好ましい担体又は賦形剤材料は、炭水化物（例えば、糖類及びアルジトール）及び緩衝剤（例えばクエン酸塩）、又はポリマー剤である。例示的な担体分子は、関節内送達に有用であり得るムコ多糖、ヒアルロン酸である。

白血球アフェレーシス産物からのＴ細胞の分離
白血球アフェレーシス産物又は血液は、閉鎖系及び標準的な方法（例えば、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、臨床現場で対象から収集され得る。好ましくは、産物は、標準的な白血球アフェレーシス収集バッグにおいて標準的な病院又は機関の白血球アフェレーシス手順に従って採取される。例えば、本開示の方法の好ましい実施形態において、白血球アフェレーシス中に通常使用されるものに加えて更なる抗凝固剤又は血液添加物（ヘパリンなど）は含まれない。

代替的に、白血球（ＷＢＣ）／末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂｉｏｓａｆｅ Ｓｅｐａｘ２（閉鎖／自動化）を使用）又はＴ細胞（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（閉鎖／自動化）を使用）は、全血から直接単離することができる。しかしながら、特定の対象（例えば、がんと診断及び／又はがんの治療された対象）では、ＷＢＣ／ＰＢＭＣの収量は、全血から単離されたとき、白血球アフェレーシスによって単離されたときよりも著しく低くなり得る。

白血球アフェレーシス手順及び／又は直接細胞単離手順はいずれも、本開示の任意の対象に使用することができる。

白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、遮蔽された容器に充填され、臨床プロトコルでの使用が承認された標準的な病院又は機関の血液採取手順に従って、制御された室温（＋１９℃～＋２５℃）に維持されるべきである。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、冷蔵されるべきではない。

白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物及び／又はＴ細胞組成物の細胞濃度は、輸送中、１ｍＬ当たり０．２×１０^９個の細胞を超えるべきではない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の激しい混合は、避けるべきである。

白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物を、例えば、一晩保管しなければならない場合、制御された室温（上記と同じ）に維持されなければならない。保管中、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の濃度は、１ｍＬ当たり０．２×１０^９個の細胞を超えてはならない。

好ましくは、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の細胞は、自己の血漿中で保存されるべきである。ある特定の実施形態において、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の細胞濃度が、１ｍＬ当たり０．２×１０^９個の細胞よりも高い場合、産物は、自己の血漿で希釈されるべきである。

好ましくは、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、標識及び分離手順を開始するときに２４時間を過ぎてはならない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、閉鎖及び／又は自動化系（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ）を使用して細胞標識のために処理及び／又は調製することができる。

自動化系は、場合により、フィコレーション（ｆｉｃｏｌａｔｉｏｎ）、及び／又は細胞産物（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物）の洗浄によって、更なるバフィーコート単離を行うことができる。

閉鎖及び／又は自動化系を使用して、Ｔ細胞単離（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物から）のために細胞を調製及び標識することができる。

ＷＢＣ／ＰＢＭＣには、直接ヌクレオフェクトしてもよいが（容易であり、追加のステップを保存する）、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前に最初にＴ細胞を単離するステップを含んでもよい。ＰＢＭＣに直接ヌクレオフェクトする容易な戦略は、ＣＡＲシグナル伝達によって媒介されるＣＡＲ＋細胞の選択的増大を必要とし、それ自体は、Ｔ細胞を機能的に消耗させることによって産物のインビボ効率を直接低減する劣った増大方法であることがわかっている。産物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、又はそれらの任意の組み合わせを含むＣＡＲ＋細胞の不均一な組成物であり得、これは患者毎の産物の変動性を増加させ、投薬及びＣＲＳ管理をより困難にする。Ｔ細胞は、腫瘍抑制及び死滅において主要なエフェクターであると考えられるため、自己の産物の製造のためのＴ細胞単離が、他のより不均一な組成物に優る顕著な利益をもたらし得る。

Ｔ細胞は、一方向性の標識手順で標識した細胞の濃縮又は標識した細胞の枯渇によって、直接単離することができるか、又は二段階の標識手順で間接的に単離することができる。本開示の特定の濃縮戦略によれば、Ｔ細胞は、細胞収集バッグに、非標識細胞（非標的細胞）は、陰性画分バッグに採取することができる。本開示の濃縮戦略とは対照的に、非標識細胞（標的細胞）は、細胞収集バッグに採取され、標識細胞（非標的細胞）は、陰性画分バッグ又は非標的細胞バッグにそれぞれ採取される。選択試薬には、抗体でコーティングされたビーズが含まれ得るが、これに限定されない。抗体でコーティングされたビーズは、改変及び／又は増大ステップの前に除去され得るか、あるいは改変及び／又は増大ステップの前に細胞上に保持され得る。細胞マーカーの以下の非限定的な例のうちの１つ以上を、Ｔ細胞の単離に使用することができる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、及び／又はそれらの任意の組み合わせ。Ｔ細胞の単離のための方法は、Ｔ細胞の単離に使用することができる以下の細胞マーカーの非限定的な例のうちの１つ以上に特異的に結合する及び／又は検出可能に標識する１つ以上の試薬を含んでもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、及び／又はそれらの任意の組み合わせ。これらの試薬は、「適正製造基準」（「ＧＭＰ」）グレードであってもなくてもよい。試薬には、Ｔｈｅｒｍｏ ＤｙｎａＢｅａｄｓ及びＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ製品を含み得るが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞を単離する方法は、標識及び／又は単離ステップの複数回の反復を含んでもよい。本開示のＴ細胞を単離する方法の任意の時点で、望ましくない細胞及び／又は望ましくない細胞型は、望ましくない細胞及び／又は望ましくない細胞型の正又は負に選択することによって本開示のＴ細胞産物組成物から枯渇され得る。本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又は別のＴ細胞マーカーを発現し得る更なる細胞型を含有してもよい。

Ｔ細胞のヌクレオフェクションの本開示の方法は、例えば、ヌクレオフェクション後にＴＣＲシグナル伝達を介して単離ステップ又は選択的増大ステップを含むＷＢＣ／ＰＢＭＣの集団又は組成物のＴ細胞のヌクレオフェクションのプロセスにより、Ｔ細胞単離のステップを除外してもよい。

ある特定の細胞集団は、Ｔ細胞の濃縮及び／又は分類の前又は後に生又は負の選択によって枯渇され得る。細胞産物組成物から枯渇され得る細胞組成物の例は、骨髄性細胞、ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔ Ｒｅｇｓ）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球、マスト細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞）、誘導ナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離又は選択手順中に別々の収集バッグに単離することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、更に別々に処理され、又は特定の比で再構成（同じ組成への組み合わせ）した後に処理することができる。

ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を再構成され得る特定の比は、使用された増大技術の型及び有効性、細胞培地、及び／又はＴ細胞産物組成物の増大に利用される成長条件に依存し得る。可能なＣＤ４＋：ＣＤ８＋比の例は、５０％：５０％、６０％：４０％、４０％：６０％ ７５％：２５％、及び２５％：７５％を含むが、これらに限定されない。

ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞死滅に対して強力な能力を示すが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力及び機能を支持するのに必要な多くのサイトカインを提供する。正常なドナーから単離されたＴ細胞は、主にＣＤ４＋であるため、Ｔ細胞産物の組成物は、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比に関してインビトロで人工的に調整され、そうでなければ、インビボで存在するであろうＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比が改善する。最適化された比率はまた、自己Ｔ細胞産物組成物のエクスビボ増大のためにも使用され得る。Ｔ細胞産物組成物の人工的に調整されたＣＤ４＋：ＣＤ８＋比を考慮して、本開示の産物組成物が、任意の自然に存在するＴ細胞の集団と著しく異なり、著しくより大きな利点を提供することができることに注意することが重要である。

Ｔ細胞単離のための好ましい方法は、手つかずの汎Ｔ細胞を産生する負の選択戦略を含み得、結果として得られるＴ細胞組成物は、操作されておらず、かつ自然に存在するＴ細胞の種類／比を含有するＴ細胞を含むことを意味する。

正又は負の選択に使用することができる試薬には、磁性細胞分離ビーズが含まれるが、これらに限定されない。磁性細胞分離ビーズは、本開示のＴ細胞単離法の次のステップを実行する前に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択された集団、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の混合された集団から除去又は枯渇され得る。

Ｔ細胞組成物及びＴ細胞産物組成物は、凍結保存、標準的なＴ細胞培養培地での悪寒、及び／又は遺伝子改変のために調製されてもよい。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物又はそれらの任意の部分は、高い回復、生存度、表現型、及び／又は機能的能力を有するヒト細胞を保管及び回復させるのに最適化された標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。市販の凍結保存培地及び／又はプロトコルを使用することができる。本開示の凍結保存方法は、凍結関連毒性を低減するＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）を含み得る。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、培養培地中で保管され得る。本開示のＴ細胞培養培地は、細胞保管、細胞遺伝子改変、細胞表現型、及び／又は細胞増大のために最適化することができる。本開示のＴ細胞培養培地は、１つ以上の抗生物質を含むことができる。細胞培養培地内への抗生物質の包含が、トランスフェクション効率及び／又はヌクレオフェクションによる遺伝子改変後の細胞収率を下げ得るため、特定の抗生物質（又はそれらの組み合わせ）及びこれらのそれぞれの濃度は、最適なトランスフェクション効率及び／又はヌクレオフェクションによる遺伝子改変後の細胞収率のために変更することができる。

本開示のＴ細胞培養培地は、血清を含むことができ、更には、血清組成物及び濃縮物は、最適な細胞結果のために変更することができる。ヒトＡＢ血清は、本開示のＴ細胞培養培地での使用のために企図されているが、ＦＢＳ／ＦＣＳは異種タンパク質を誘導し得るため、Ｔ細胞の培養のためにＦＢＳ／ＦＣＳよりも好ましい。血清は、培養物中のＴ細胞組成物が投与のために意図される対象の血液から単離されてもよく、したがって、本開示のＴ細胞培養培地は自己の血清を含むことができる。無血清培地又は血清代替物もまた、本開示のＴ細胞培養培地で使用され得る。本開示のＴ細胞培養培地及び方法のある特定の実施形態において、無血清培地又は血清代替物は、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す、より健康な細胞を含むが、これらに限定されない、培地への異種血清の補充に優る利点を提供することができる。

Ｔ細胞培養培地は、市販の細胞増殖培地を含むことができる。例示的な市販の細胞成長培地には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増大培地、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、遺伝子改変のために調製することができる。遺伝子改変のためのＴ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はそれらの任意の部分の調製は、細胞洗浄及び／又は所望のヌクレオフェクション緩衝液への再懸濁を含むことができる。凍結保存されたＴ細胞組成物は、ヌクレオフェクションによる遺伝子改変のために解凍及び調製することができる。凍結保存された細胞は、標準的な又は既知のプロトコルに従って解凍することができる。凍結保存された細胞の解凍及び調製を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｏｌｓ Ａｌｂｕｔｅｉｎ（２５％ヒトアルブミン）を解凍及び／又は調製プロセスで使用することができる。

自己Ｔ細胞産物組成物の遺伝子改変
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、例えば、エレクトロポレーションなどのヌクレオフェクション戦略を使用して遺伝子改変することができる。ヌクレオフェクトされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の総容積、及びサンプル調製の正確なタイミングを最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。

ヌクレオフェクション及び／又はエレクトロポレーションは、例えば、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ、ＭａｘＣｙｔｅ ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ、及び／又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎを使用して達成することができる。プラスチックポリマー電極を含むが、これに限定されない、非金属電極系が、ヌクレオフェクションに好ましくあり得る。

ヌクレオフェクションによる遺伝子改変の前に、Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁されてもよい。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、市販のヌクレオフェクション緩衝液を含む。本開示のヌクレオフェクション緩衝液を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓ、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、１つ以上の補助的因子を含み、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。例示的な補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的なサイトカイン、ケモカイン、及びインターロイキンには、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、塩、無機物、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な塩、無機物、及び代謝産物には、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＰＬＵＳ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン－５、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増大培地、及びそれらの任意の組み合わせなどの培地が含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、及びそれらの組み合わせの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤には、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞送達を増強する、核送達又は輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上の核酸の分解を増強する、及び／又はＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように、１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の核酸を改変又は安定化する例示的な試薬には、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有する若しくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

トランスポゾン及びトランスポザーゼを含む転位試薬は、ヌクレオフェクション緩衝液への細胞の添加前、同時、又は後に本開示のヌクレオフェクション反応に添加することができる（任意選択的に、ヌクレオフェクション反応バイアル又はキュベット内に含有される）。本開示のトランスポゾンは、プラスミドＤＮＡ、線状化プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ＤＯＧＧＹＢＯＮＥ（商標）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ鋳型、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、タンパク質－核酸の組み合わせ、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のトランスポゾンは、１つ以上のＴＴＡＡ部位、１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、１つ以上の長い末端反復（ＬＴＲ）、１つ以上のインスレーター、１つ以上のプロモーター、１つ以上の完全長若しくは切断された遺伝子、１つ以上のポリＡシグナル、１つ以上の自己切断２Ａペプチド切断部位、１つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上のエンハンサー、１つ以上の調節因子、１つ以上の複製起点、及びそれらの任意の組み合わせをコードする、１つ以上の配列を含んでもよい。

本開示のトランスポゾンは、１つ以上の完全長又は短縮型遺伝子をコードする１つ以上の配列を含み得る。本開示のトランスポゾンによって導入される完全長及び／又は短縮型遺伝子は、シグナルペプチド、センチリン、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ－Ｔ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（センチリンを含むＣＡＲ－Ｔ）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬剤耐性遺伝子、腫瘍抗原、同種又は自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、ムテイン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上をコードし得る。

本開示のトランスポゾンは、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助的因子、又はそれらの任意の組み合わせで調製され得る。

本開示のトランスポゾンは、臨床的安全性を最適化し、及び／又は製造可能性を改善するために設計され得る。非限定的な例として、本開示のトランスポゾンは、不必要な配列又は領域を除去する及び／又は非抗生物質の選択マーカーを含むことによって、臨床的安全性を最適化及び／又は製造可能性を改善するために設計され得る。本開示のトランスポゾンは、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。

本開示のトランスポザーゼ酵素は、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質－核酸の組み合わせ、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の配列によってコードされ得る。

本開示のトランスポザーゼ酵素は、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助的因子、又はそれらの任意の組み合わせで調製され得る。本開示のトランスポザーゼ酵素、又はそれらをコード若しくは送達する配列／構築物は、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。

本開示のトランスポゾン及びトランスポザーゼ酵素は、任意の手段によって細胞に送達され得る。

本開示の組成物及び方法は、本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）による細胞への送達を含むが、送達のためのプラスミドの使用により、トランスポゾン及び／又はトランスポザーゼの細胞の染色体ＤＮＡへの組み込みが可能になり、継続的なトランスポザーゼ発現をもたらすことができる。したがって、本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼ酵素は、染色体組み込みの可能性を排除するために、ｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかとして細胞に送達され得る。

本開示のトランスポゾン及びトランスポザーゼは、トランスポゾン及び／又はトランスポザーゼをヌクレオフェクション反応に導入する前に、単独で、又は互いに組み合わせて事前にインキュベートされ得る。トランスポゾン及びトランスポザーゼの各々の絶対量、並びに相対量、例えば、トランスポゾン対トランスポザーゼの比率を最適化することができる。

任意選択的に、バイアル又はキュベット中でのヌクレオフェクション反応の調整に続いて、反応は、ヌクレオフェクター装置にロードされ、製造業者のプロトコルに従って電気パルスの送達のために活性化され得る。本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼ（又は本開示のトランスポゾン及び／若しくはトランスポザーゼをコードする配列）の細胞への送達に使用される電気パルス条件は、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞を産生するために最適化することができる。Ａｍａｘａヌクレオフェクター技術を使用するとき、Ａｍａｘａ２Ｂ又は４Ｄヌクレオフェクターの様々なヌクレオフェクションプログラムの各々が企図されている。

本開示のヌクレオフェクション反応に続いて、細胞を、細胞培地に穏やかに添加することができる。例えば、Ｔ細胞がヌクレオフェクション反応を受けるとき、Ｔ細胞を、Ｔ細胞培地に添加することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地は、任意の１つ以上の市販の培地を含み得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、より優れた生存度、より高いヌクレオフェクション効率を有し、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生するように最適化することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増大ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増大培地、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、生存度、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存度、細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を増強させるために本開示の１つ以上の補助的因子を含み得る。例示的な補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的なサイトカイン、ケモカイン、及びインターロイキンには、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、塩、無機物、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な塩、無機物、及び代謝産物には、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＰＬＵＳ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン－５、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増大培地、及びそれらの任意の組み合わせなどの培地が含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、及びそれらの組み合わせの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤には、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞送達を増強する、核送達又は輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上の核酸の分解を増強する、及び／又はＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように、１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の核酸を改変又は安定化する例示的な試薬には、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有する若しくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、室温で使用され、又は例えば、エンドポイントを含む３２℃～３７℃の間まで予熱され得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、細胞の生存度及び／又は本開示のトランスポゾン若しくはその一部の発現を維持又は増強する任意の温度まで予熱され得る。

本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、組織培養フラスコ又は皿、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ、バイオリアクター若しくは細胞培養バッグ、又は任意の他の標準的な容器中に含有され得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培養物（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物を含む）は、静置しておいてもよく、又は代替的にそれらを摂動してもよい（例えば、揺する、旋回する、又は振盪する）。

ヌクレオフェクション後の細胞培養物は、遺伝子改変された細胞を含み得る。ヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物は、遺伝子改変されたＴ細胞を含み得る。本開示の遺伝子改変された細胞は、規定した期間休止されるか、又は例えばＴ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増大を刺激されるかのいずれかであってもよい。ある特定の実施形態において、本開示の遺伝子改変された細胞は、規定した期間休止されるか、又は例えばＴ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増大を直ちに刺激されるかのいずれかであってもよい。本開示の遺伝子改変された細胞は、順応するのに十分な時間、転位が生じるのに十分な時間、及び／又は正若しくは負の選択のための十分な時間が与えられるように休止され得、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞を生じてもよい。本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又はそれより長い時間にわたって休止されてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の遺伝的に改変された細胞は、例えば、一晩休止され得る。ある特定の態様において、一晩は、約１２時間である。本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれより長い日数にわたって休止され得る。

本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応後、エキスパンダー（ｅｘｐａｎｄｅｒ）技術の追加前に選択することができる。遺伝子改変された細胞を最適な選択のために、細胞は、少なくとも２～１４日間ヌクレオフェクション後の細胞培地中で休止され、改変された細胞の同定（例えば、非改変された細胞から改変された細胞の分化）を助長することができる。

本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功した場合、ヌクレオフェクション後２４時間の早期に、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ及び本開示の選択マーカーの発現は、改変されたＴ細胞で検出可能であり得る。トランスポゾンの染色体上の発現により、選択マーカーのみの発現は、非改変Ｔ細胞（トランスポゾンの組み込みが成功しなかった細胞）から改変されたＴ細胞（トランスポゾンの組み込みが成功した細胞）を区別することができない。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる改変された細胞の検出をあいまいにするとき、ヌクレオフェクトされた細胞（改変及び非改変細胞の両方）は、一定期間（例えば２～１４日間）休止され、細胞の発現を終わらせ、又は全ての染色体上のトランスポゾン発現を喪失させることができる。この延長された休止期に続いて、改変されたＴ細胞のみが、選択マーカーの発現に対して陽性のままであるはずである。この延長された休止期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応及び選択プロセスに対して最適化され得る。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる改変された細胞の検出をあいまいにするとき、選択は、この延長された休止期なしで行われてもよいが、追加の選択ステップが後の時点で含まれ得る（例えば、増大ステージ中又は後のいずれか）。

本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、任意の手段によって実施され得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現する細胞を単離することによって実施され得る。本開示の選択マーカーは、トランスポゾン内の１つ以上の配列によってコードされ得る。本開示の選択マーカーは、成功した転位の結果として改変された細胞によって発現することができる（すなわち、トランスポゾンの１つ以上の配列によってコードされていない）。ある特定の実施形態において、本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション後の細胞培地の有害な化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含有する。有害な化合物は、例えば、改変された細胞に対して選択マーカーによって付与された耐性がなく、細胞死をもたらす抗生物質又は薬物を含み得る。例示的な選択マーカーには、遺伝子：ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、及びＮＫＸ２．２のうちの１つ以上の野生型（ＷＴ）又は変異型が含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーは、表面発現選択マーカー又は表面発現タグを含むが、これらに限定されず、それぞれ、Ａｂコーティングされた磁性ビーズ技術又はカラム選択によって標的化することができる。タンパク質精製に使用されるものなどの切断可能なタグは、効率的なカラム選択、洗浄、及び溶出のために本開示の選択マーカーに追加することができる。ある特定の実施形態において、本開示の選択マーカーは、改変された細胞（改変されたＴ細胞を含む）によって自然に発現されず、したがって、改変された細胞の物理的単離（例えば、セルソーティング技術による）において有用であり得る。本開示の例示的な選択マーカーは、ＣＤ２７１、ＣＤ１９ ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＲＱＲ８、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、及びそれらの任意の組み合わせの完全長、変異、又は短縮型を含むが、これらに限定されない、改変された細胞（改変されたＴ細胞を含む）によって自然に発現されない。

本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応後、選択的に増大させることができる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によって選択的に増大させることができる。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、標的で覆われた試薬（例えば、標的を発現する腫瘍株若しくは正常細胞株又は標的において覆われているエキスパンダービーズ）との接触によって刺激することができる。代替的に、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、照射された腫瘍細胞、照射された同種異系正常細胞、照射された自己ＰＢＭＣとの接触によって刺激することができる。刺激に使用された標的発現細胞による本開示の細胞産物組成物の混入を最小限にするために、例えば、細胞産物組成物を対象に直接投与することができるとき、刺激は、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質によってコーティングされたエキスパンダービーズを使用して実施することができる。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によるＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞の選択的増大は、改変されたＴ細胞の機能的枯渇を回避するために最適化することができる。

本開示の選択された遺伝子改変された細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、又はＣｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために刺激され得る。本開示の選択された遺伝子改変された細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、又はＣｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために直ちに刺激され得る。選択された遺伝子改変された細胞がＴ細胞であるとき、Ｔ細胞は、Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために刺激することができる。本開示の選択された遺伝子改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又はそれより長い時間にわたって休止されてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の選択された遺伝的に改変された細胞は、例えば、一晩休止され得る。ある特定の態様において、一晩は、約１２時間である。本開示の選択された遺伝子改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれより長い日数にわたって休止されてもよい。本開示の選択された遺伝子改変された細胞は、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、及び／又は増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞をもたらす任意の期間休止されてもよい。

選択された遺伝子改変された細胞（本開示の選択された遺伝子改変されたＴ細胞を含む）は、高い回復、生存度、表現型、及び／又は機能的能力を有するヒト細胞を保管及び／又は回復させるのに最適化され得る任意の標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。本開示の凍結保存方法は、市販の凍結保存培地及び／又はプロトコルを含み得る。

選択された遺伝子改変された細胞（本開示の選択された遺伝子改変されたＴ細胞を含む）の転位効率は、任意の手段によって評価され得る。例えば、エキスパンダー技術を適用する前に、選択された遺伝子改変された細胞（本開示の選択された遺伝子改変されたＴ細胞を含む）によるトランスポゾンの発現は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。選択された遺伝子改変された細胞（本開示の選択された遺伝子改変されたＴ細胞を含む）の転位効率の決定は、トランスポゾン（例えば、ＣＡＲ）を発現する選択された細胞のパーセンテージを決定することを含み得る。代替的に、又は加えて、Ｔ細胞の純度、トランスポゾン発現（例えば、ＣＡＲ発現）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒化及び／又は死滅を媒介するＣＡＲ（トランスポゾンで送達される）の能力、及び／又は選択された遺伝子改変された細胞（本開示の選択された遺伝子改変されたＴ細胞を含む）の表現型は、任意の手段によって評価され得る。

本開示の細胞産物組成物は、特定の放出基準を満たすと、対象への投与のために放出され得る。例示的な放出基準には、細胞表面上に検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、特定の割合の改変、選択、及び／又は増大されたＴ細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。

自己Ｔ細胞産物組成物の遺伝子改変
本開示の遺伝子改変された細胞（遺伝子改変されたＴ細胞を含む）は、エキスパンダー技術を使用して増大させることができる。本開示のエキスパンダー技術は、市販のエキスパンダー技術を含み得る。本開示の例示的なエキスパンダー技術は、ＴＣＲを介した本開示の遺伝子改変されたＴ細胞の刺激を含む。本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するための全ての手段が企図されているが、ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激することは、好ましい方法であり、優れたレベルの殺傷能力を有する産物をもたらす。

ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＤｙｎａＢｅａｄｓを３：１のビーズ対Ｔ細胞比で使用することができる。エキスパンダービーズが生分解性でない場合、ビーズは、エキスパンダー組成物から除去されてもよい。例えば、ビーズは、約５日後にエキスパンダー組成物から除去されてもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔ細胞活性化／増大試薬を使用してもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するために、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８又はＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞アクチベーター試薬を使用してもよい。この技術は、可溶性の四量体抗体複合体が期間後に分解され、プロセスからの除去を必要としないため、好ましくあり得る。

人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、標的抗原を共発現するように操作され、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用されてもよい。人工ＡＰＣは、腫瘍細胞株（例えば、不死化骨髄性白血病株Ｋ５６２を含む）を含む、又はそれらに由来し得、複数の共刺激分子又は技術（ＣＤ２８、４－１ＢＢＬ、ＣＤ６４、ｍｂＩＬ－２１、ｍｂＩＬ－１５、ＣＡＲ標的分子など）を共発現するように操作されてもよい。本開示の人工ＡＰＣが共刺激分子と組み合わされるとき、望ましくない表現型及び機能的能力、すなわち最終分化したエフェクターＴ細胞の発生又は出現を防ぐために条件は、最適化されてもよい。

照射されたＰＢＭＣ（自己又は同種）は、ＣＤ１９などのいくつかの標的抗原を発現し得、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。代替的に、又は加えて、照射された腫瘍細胞は、いくつかの標的抗原を発現し得、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。

プレートに結合した及び／又は可溶性の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２及び／又は抗ＣＤ２８刺激は、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。

抗原でコーティングされたビーズは、標的タンパク質を提示することができ、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。代替的に、又は加えて、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質でコーティングされたエキスパンダービーズは、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲにより本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。

増大方法は、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎにより、及び遺伝子改変されたＴ細胞上の表面発現されたＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及び／又は他のマーカーを介して、本開示の細胞又はＴ細胞の刺激を導く。

増大技術は、ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションのおよそ２４時間後まで、本開示の細胞に適用することができる。様々な細胞培地を増大手順中に使用することができるが、本開示の望ましいＴ細胞増大培地は、例えば、より優れた生存度、細胞表現型、全増大、又はインビボでの持続、生着、及び／若しくはＣＡＲを媒介した死滅のより優れた能力を有する細胞を産生することができる。本開示の細胞培地は、本開示の遺伝子改変された細胞の増大、表現型、及び機能を改善／増強するように最適化され得る。増大されたＴ細胞の好ましい表現型は、Ｔ幹細胞記憶、Ｔ中央、及びＴエフェクター記憶細胞の混合物を含み得る。Ｅｘｐａｎｄｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、主に、臨床で優れた性能をもたらし得る中央記憶Ｔ細胞を産生することができる。

本開示の例示的なＴ細胞増大培地は、部分的又は全体的に、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増大ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増大培地、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のＴ細胞増大培地は、１つ以上の補助的因子を更に含み得る。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子は、生存度、細胞表現型、全増大を増強し、又はインビボでの持続、生着、及び／若しくはＣＡＲを媒介した殺傷能力を増加させる。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、及び／又はインターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、塩、無機物、及び／又は代謝産物、例えば、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＰＬＵＳ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン－５、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、及び／又はアポトーシス経路の阻害剤、例えば、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、細胞送達を増強し、核送達若しくは輸送を増強し、核酸の核への助長された輸送を増強し、染色体上の核酸の分解を増強し、及び／又はＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように核酸を改変又は安定化する試薬、例えば、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有する若しくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本開示の遺伝子改変された細胞は、選択可能な薬物又は化合物の使用によって、増殖プロセス中に選択することができる。例えば、ある特定の実施形態において、本開示のトランスポゾンが、培養培地に添加される薬物への耐性を遺伝子改変された細胞に付与する選択マーカーをコードすることができるとき、選択は、増殖プロセス中に起こり得、選択が起こるのにおおよそ１～１４日の培養を必要とし得る。本開示のトランスポゾンによってコードされる選択マーカーとして使用することができる薬物耐性遺伝子の例には、遺伝子ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＮＫＸ２．２、又はそれらの任意の組み合わせの野生型（ＷＴ）又は変異型が含まれるが、これらに限定されない。培養培地に添加され、選択マーカーが耐性を付与することができる、対応する薬物又は化合物の例は、Ｇ４１８、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン（Ｍｅｐｈａｌａｎ）、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、ベセナム（Ｂｅｃｅｎｕｍ）（カルムスチン）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ）（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（Ｃｌａｆｅｎ）（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、Ｅｖａｃｅｔ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、イキサゾミブクエン酸エステル、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（ＬｉｐｏＤｏｘ）（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサフォル）、ネオザール（Ｎｅｏｓａｒ）（シクロホスファミド）、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸エステル）、パミドロン酸二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサフォル、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（Ｓｙｎｏｖｉｒ）（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本開示のＴ細胞増殖プロセスは、ＷＡＶＥバイオリアクター内の細胞培養バッグ、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ、又は任意の他の好適な容器及び／又はリアクター内で起こり得る。

本開示の細胞又はＴ細胞培養物は、安定に維持され、揺すられ、旋回され、又は振盪されてもよい。

本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、培養期間、細胞濃度、Ｔ細胞培地の添加／除去の予定、細胞サイズ、総細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、成長する細胞集団における遺伝子改変された細胞のパーセンテージ、サプリメントの使用及び組成、エキスパンダー技術の追加／除去、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ある特定の条件を最適化することができる。

本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる増大した細胞集団の製剤前に、予め規定されたエンドポイントまで継続することができる。例えば、本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、予め決定された時間：少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間；少なくとも１、２、３、４、５、６か月間、又は少なくとも１年間継続することができる。本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる培養物が予め決定された全体細胞密度：容積（μｌ、ｍｌ、Ｌ）当たり１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個の細胞又はその間の任意の密度に達するまで継続することができる。本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる培養物の遺伝子改変された細胞が本開示のトランスポゾンの発現の予め決定されたレベル：１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％又はその間の任意のパーセンテージの発現閾値レベル（発現の最小、最大、又は平均レベルは、結果として生じる改変された細胞が臨床的に効果的であることを示している）を示すまで継続することができる。本開示の細胞又はＴ細胞増大プロセスは、非改変細胞の割合に対する結果として生じる培養物の遺伝子改変された細胞の割合が予め決定された閾値：少なくとも１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、又はその間の任意の比に達するまで継続することができる。

放出のための遺伝子改変された自己Ｔ細胞の分析
遺伝子改変された細胞のパーセンテージは、本開示の増大プロセス中又はその後に評価することができる。本開示の遺伝子改変された細胞によるトランスポゾンの細胞発現は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。例えば、ＦＡＣＳは、本開示のＣＡＲを発現する細胞又はＴ細胞のパーセンテージを決定するために使用することができる。代替的に、又は加えて、遺伝子改変された細胞又はＴ細胞の純度、本開示の遺伝子改変された細胞又はＴ細胞によって発現されたＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒化及び／又は死滅を媒介するＣＡＲの能力、及び／又はＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型を評価することができる。

対象への投与を意図する本開示の組成物は、組成物が安全であり、薬学的製剤としての製剤及び／又は対象への投与に効果的であることを示す１つ以上の「放出基準」を満たす必要があり得る。放出基準は、本開示の組成物（例えば、本開示のＴ細胞産物）が、それらの細胞表面上に検出可能なレベルの本開示のＣＡＲを発現するＴ細胞の特定のパーセンテージを含むという必要条件を含み得る。

増大プロセスは、特定の基準が満たされるまで継続するべきである（例えば、特定の総数の細胞を達成すること、記憶細胞の特定の集団を達成すること、特定のサイズの集団を達成すること）。

ある特定の基準は、増大プロセスを終わるべき時点で信号を送る。例えば、細胞は、細胞サイズが３００ｆＬに達すると、製剤化、再活性化、又は凍結保存されるべきである（そうでなければ、この閾値を超えたサイズに達する細胞は死滅し始め得る）。細胞の集団が３００ｆＬより少ない平均細胞サイズに達してすぐの凍結保存は、細胞が凍結保存前に完全に静止した状態に達していないため、解凍及び培養時により良い細胞の回復をもたらし得る（完全な静止サイズは、おおよそ１８０ｆＬである）。増殖前に、本開示のＴ細胞は、約１８０ｆＬの細胞サイズを有し得るが、増殖後３日では、それらの細胞サイズは、４倍より大きくなり、おおよそ９００ｆＬになり得る。次の６～１２日間にわたり、Ｔ細胞の集団は、ゆっくりと細胞サイズを減少させ、１８０ｆＬで完全に静止する。

製剤のための細胞集団を調製するプロセスは、細胞集団の細胞を濃縮するステップ、細胞を洗浄するステップ、及び／又は薬物耐性若しくは特定の表面発現マーカーに対する磁性ビーズのソーティングを介する細胞の更なる選択のステップを含み得るが、これらに限定されない。製剤のための細胞集団を調製するためのプロセスは、最終産物の安全性及び純度を確実にするためのソーティングステップを更に含み得る。例えば、患者からの腫瘍細胞が、本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するために、又は製剤のために調製されている本開示の遺伝子改変されたＴ細胞を刺激するために遺伝子改変されていた場合、患者からの腫瘍細胞が最終産物に含まれないことが重要である。

細胞産物の注入及び／又は注入のための凍結保存
本開示の薬学的製剤は、注入、凍結保存、及び／又は保管のためにバッグに分配されてもよい。

本開示の薬学的製剤は、標準的なプロトコル、及び任意選択的に、注入可能な凍結保存培地を使用して凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）を使用して、凍結に関連する毒性を低減することができる。本開示の凍結保存された薬学的製剤は、後日、患者への注入のために保管することができる。有効な治療は、本開示の薬学的製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、薬学的製剤は、凍結して保管することができるが個々の用量の解凍のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。

本開示の薬学的製剤は、室温で保管してもよい。有効な治療は、本開示の薬学的製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、薬学的製剤は、一緒に保管することができるが個々の用量の投与のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。

本開示の薬学的製剤は、将来、例えば、状態の寛解及び再発後、同種異系療法の場合に投与が必要であり得る同じ患者への更なる用量の生成のための、その後の再増殖及び／又は選択のために記録することができる。

製剤
上記のように、本開示は、薬学的に許容される製剤中に少なくとも１つのタンパク質足場を含む、好ましくはリン酸緩衝液と食塩水又は選択された塩を含む安定した製剤、並びに保存剤を含有する保存溶液及び製剤、並びに薬学的又は獣医学的使用に好適な複数回使用用保存製剤を提供する。保存製剤は、少なくとも１つの既知の保存剤、又は任意選択的に、水性希釈剤中の少なくとも１つのフェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、ポリマー又はこれらの混合物からなる群より選択されるものを含有する。約０．００１５％、又は任意の範囲、値、若しくはその間の画分などの、当該技術分野において既知であるように、任意の好適な濃度又は混合物を使用することができる。非限定的な例は、保存剤なし、約０．１～２％ｍ－クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１～３％ベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、約０．００１～０．５％チメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、約０．００１～２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５～１．０％アルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを含む。

上述のように、本発明は、包装材料と、任意選択的に水性希釈剤中の、処方された緩衝剤及び／又は保存剤を有する少なくとも１つのタンパク質足場の溶液を含む少なくとも１つのバイアルと、を含む製造品であって、当該包装材料が、かかる溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間又はそれより長い期間にわたって保持することができることを示すラベルを含む、製造品を提供する。本発明は更に、包装材料、凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場を含む第１のバイアル、及び所定の緩衝剤又は防腐剤の水性希釈液を含む第２のバイアルを含む製品を含み、当該包装材料は、患者に、少なくとも１つのタンパク質足場を水性希釈液で再構成して、２４時間以上にわたって保持することができる溶液を形成するように指示するラベルを含む。

本発明に従って使用される少なくとも１つのタンパク質足場は、哺乳動物細胞又はトランスジェニック調製物から得ることを含む組換え手段によって産生することができ、又は本明細書に記載されるか又は当該技術分野で知られているように、他の生物学的資源から精製することができる。

本発明の製品における少なくとも１つのタンパク質足場の範囲は、湿式／乾式系の場合、再構成時に約１．０μｇ／ｍｌ～約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を生じる量を含むが、より低い濃度及びより高い濃度が実施可能であり、意図する送達ビヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、肺、経粘膜、若しくは浸透、又はマイクロポンプ法とは異なる。

好ましくは、水性希釈剤は、任意選択的に、薬学的に許容される保存剤を更に含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物から選択されるものが含まれる。製剤に使用される保存剤の濃度は、抗微生物効果を得るのに十分な濃度である。かかる濃度は、選択された保存剤に依存し、当業者によって容易に決定される。

他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び保存増強剤を、任意選択的に、好ましくは希釈剤に添加することができる。グリセリンなどの等張剤は、一般的に既知の濃度で使用される。生理学的に耐容される緩衝液を好ましくは添加して、改善されたｐＨ制御を提供する。製剤は、約ｐＨ４～約ｐＨ１０、約ｐＨ５～約ｐＨ９までの好ましい範囲、約６．０～約８．０の最も好ましい範囲などの広範囲のｐＨを網羅することができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８～約７．８のｐＨを有する。好ましい緩衝剤には、リン酸緩衝剤、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。

Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、又はポリソルベート２０若しくは８０又はポロクサマー１８４若しくは１８８などの非イオン性界面活性剤などの薬学的に許容される可溶化剤、他のブロックコポリマーであるＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡなどのキレート剤を、任意選択的に、製剤又は組成物に添加して凝集を低減することができる。これらの添加剤は、ポンプ又はプラスチック容器を使用して製剤を投与する場合に特に有用である。薬学的に許容される界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。

本発明の製剤は、少なくとも１つのタンパク質足場と、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物とを、水性希釈剤中に混合する工程によって調製することができる。少なくとも１つのタンパク質足場及び保存剤を水性希釈剤中に混合することは、従来の溶解及び混合手順を使用して実行される。好適な製剤を調製するために、例えば、緩衝化溶液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、緩衝化溶液中の所望の保存剤と、タンパク質及び保存剤を所望の濃度で提供するのに適した量で組み合わせる。この工程の変化は、当業者によって認識されるであろう。例えば、追加の添加剤を使用する場合に成分を加える順序、製剤を調製する温度及びｐＨは、全て、使用する濃度及び投与手段のために最適化することができる要因である。

請求される製剤は、患者に、透明な溶液として、又は水性希釈剤中に水、保存剤、及び／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸緩衝剤、及び／若しくは生理食塩水及び選択された塩を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルを含む、２バイアルとして、提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とする２バイアルは、複数回再利用でき、患者治療の単一又は複数のサイクルに十分対応することができ、そのため現在利用可能なものよりも便利な治療レジメンを提供することができる。

特許請求される製造品は、即時から２４時間以上の範囲の期間にわたる投与に有用である。したがって、特許請求される製造品は、患者に重要な利点を提供する。本発明の製剤は、任意選択的に、約２℃～約４０℃の温度で安全に保管することができ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持するため、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、又は９６時間又はそれより長い期間にわたって保持及び／又は使用することができることを示す包装表示が可能になる。保存された希釈液を使用する場合、かかるラベルは、最長１～１２か月、半年、１年半、及び／又は２年の使用を含むことができる。

本発明の少なくとも１つのタンパク質足場の溶液は、少なくとも１つのタンパク質足場を水性希釈剤中に混合することを含む工程によって調製することができる。混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実行される。好適な希釈剤を調製するために、例えば、水又は緩衝液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、タンパク質、及び任意選択的に、保存剤又は緩衝剤を所望の濃度で提供するのに適した量で組み合わせる。この工程の変化は、当業者によって認識されるであろう。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度及びｐＨは全て、使用する濃度と投与手段について最適化できる要因である。

請求される製品は、患者に、透明な溶液として、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルを含む、２バイアルとして、提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とする２バイアルは、複数回再利用でき、患者治療の単一又は複数のサイクルに十分対応することができ、そのため現在利用可能なものよりも便利な治療レジメンを提供する。

請求される製品は、透明な溶液、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルを含む２バイアルを、薬局、診療所、又は機関及び施設に提供することによって患者に間接的に提供することができる。この場合の透明な溶液は、サイズが最大１リットル又は更に大きいことがあり得、少なくとも１つのタンパク質足場溶液のより小さな部分を１回又は複数回取り出して小さなバイアルに移すことができる大きなリザーバーを提供し、薬局又は診療所によってそれらの顧客及び／又は患者に提供される。

単一バイアルシステムを含む承認されたデバイスには、溶液の送達のためのペン型注射器デバイスが含まれ、ＢＤ Ｐｅｎｓ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ－Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、及びＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ－Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ－ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ－Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔ（登録商標）、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）によって作製又は開発されたもの、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ．（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ－ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）、及び同様の好適なデバイスなどが挙げられる。２バイアルシステムを含む承認されたデバイスには、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）など、再構成された溶液の送達のためのカートリッジ内で凍結乾燥薬物を再構成するためのこれらのペン型注射器システムが含まれる。好適な他の装置の例には、プレフィルドシリンジ、自動注射器、無針注射器、及び無針ＩＶ注入セットが含まれる。

特許請求される製品には、包装材料が含まれる。包装材料は、規制当局により求められる情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。本発明の包装材料は、少なくとも１つのタンパク質足場を水性希釈剤中に再構成して溶液を形成し、湿式／乾式の２つのバイアル製品について２～２４時間以上の期間にわたって溶液を使用するよう患者に説明書を提供する。単一バイアル溶液製品では、ラベルは、かかる溶液が２～２４時間以上使用できることを示す。現在特許請求されている製品は、ヒトの医薬品使用のために有用である。

本発明の製剤は、少なくとも１つのタンパク質足場と、選択された緩衝液、好ましくは、生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸緩衝液と、を混合することを含む工程によって調製することができる。水性希釈剤中で少なくとも１つのタンパク質足場及び緩衝液を混合することは、従来の溶解及び混合手順を使用して実行される。好適な製剤を調製するために、例えば、水又は緩衝液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、タンパク質及び緩衝液を所望の濃度で提供するのに十分な量の水中の所望の緩衝剤と組み合わせる。この工程の変化は、当業者によって認識されるであろう。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度及びｐＨは全て、使用する濃度と投与手段について最適化できる要因である。

請求された安定した又は保存された製剤は、透明な溶液として、又は水性希釈剤中の保存剤若しくは緩衝液及び賦形剤を含む第２のバイアルで再構成される凍結乾燥したタンパク質足場のバイアルを含む２バイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とする２バイアルは、複数回再利用でき、患者治療の単一又は複数のサイクルに十分対応することができ、そのため現在利用可能なものよりも便利な治療レジメンを提供する。

タンパク質足場を安定化する他の製剤又は方法は、タンパク質足場を含む凍結乾燥した粉末の透明な溶液以外のものをもたらし得る。不透明溶液の中でも、微粒子懸濁液を含む製剤であり、当該微粒子は、可変次元構造のタンパク質足場を含有する組成物であり、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、又はリポソームとして様々に知られている。活性剤を含有する比較的均質で、本質的に球状の粒子製剤は、活性剤及びポリマーを含有する水性相と非水性相とを接触させ、続いて非水性相の蒸発が、米国特許第４，５８９，３３０号に教示されているように水性相から粒子の合体を引き起こすことによって形成することができる。多孔性マイクロ粒子は、連続溶媒中に分散された活性剤及びポリマーを含有する第１の相を使用し、米国特許第４，８１８，５４２号に教示されるように、凍結乾燥又は希釈－抽出－沈殿によって懸濁液から当該溶媒を除去することによって調製することができる。かかる調製物のために好ましいポリマーは、ゼラチン寒天、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド－Ｌ（－）ラクチド、ポリ（イプシロン－カプロラクトン、ポリ（イプシロン－カプロラクトン－ＣＯ－乳酸）、ポリ（イプシロン－カプロラクトン－ＣＯ－グリコール酸）、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ（アルキル－２－シアノアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ（２－ヒドロキシエチルＤＬ－アスパルタミド）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（Ｌ－フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６－ジイソシアナトヘキサン）、及びポリ（メチルメタクリレート）から選択される天然若しくは合成のコポリマー又はポリマーである。特に好ましいポリマーは、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド－Ｌ（－）ラクチド、ポリ（イプシロン－カプロラクトン、ポリ（イプシロン－カプロラクトン－ＣＯ－乳酸）、及びポリ（イプシロン－カプロラクトン－ＣＯ－グリコール酸）などのポリエステルである。ポリマー及び／又は活性物質を溶解するために有用な溶媒には、水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼン、又はヘキサフルオロアセトンセスキ水和物が含まれる。活性物質含有相を第２の相で分散させる工程は、当該第１の相を加圧してノズルの開口部に通して液滴形成に影響を及ぼすことを含み得る。

乾燥粉末製剤は、蒸発による噴霧乾燥若しくは溶媒抽出によって、又は水性若しくは非水性溶媒を除去する１つ以上のステップが続く結晶組成物の沈殿によってなど、凍結乾燥以外の工程から生じ得る。噴霧乾燥したタンパク質足場調製物の調製は、米国特許第６，０１９，９６８号に教示されている。タンパク質足場ベースの乾燥粉末組成物は、吸入可能な乾燥粉末を提供する条件下で、溶媒中のタンパク質足場及び任意選択的に賦形剤の溶液又はスラリーを噴霧乾燥することによって生成され得る。溶媒は、水及びエタノールなど、容易に乾燥され得る極性化合物を含み得る。タンパク質足場の安定性は、窒素ブランケット下などの酸素の非存在下で噴霧乾燥手順を行うことによって、又は乾燥ガスとして窒素を使用することによって増強され得る。別の比較的乾燥した製剤は、ＷＯ９９１６４１９に教示されているように、典型的にはヒドロフルオロアルカン噴射剤を含む懸濁媒体中に分散された複数の有孔微細構造の分散である。安定した分散は、計量投与吸入器を使用して患者の肺に投与され得る。噴霧乾燥した医薬品の商業的製造に有用な装置は、Ｂｕｃｈｉ Ｌｔｄ．又はＮｉｒｏ Ｃｏｒｐ．によって製造されている。

本明細書に記載の安定した又は保存された製剤又は溶液中の少なくとも１つのタンパク質足場は、ＳＣ又はＩＭ注射、経皮、肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当該技術分野において周知として当業者に理解される他の手段を含む様々な送達方法を介して、本発明に従って患者に投与することができる。

治療への応用
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場を使用して、例えば、細胞、組織、器官、動物、若しくは患者に治療有効量のタンパク質足場を投与するか、又はそれらと接触させて、当該技術分野において既知であるように、又は本明細書に記載されているように、細胞、組織、器官、動物、若しくは患者における疾患を調節又は治療するための方法を提供する。本発明はまた、悪性疾患を含むが、これに限定されない、細胞、組織、器官、動物、若しくは患者における疾患を調節又は治療するための方法も提供する。

本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、難治性多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸がん、膵臓がん、鼻咽頭がん、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性疾患に伴う高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、頸部がん、遺伝性非ポリポーシスがん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、腎細胞がん、精巣がん、腺がん、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨吸収、がん関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つのがん又は悪性疾患を調節又は治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、がんは、再発多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、がんは、難治性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態において、がんは、前立腺がんである。いくつかの実施形態において、がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である。いくつかの実施形態において、固形がんは、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、又は腎臓がんである。いくつかの実施形態において、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。

本開示は、対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の集団を含み、ＣＡＲが抗原認識ドメインを含む、第１の組成物と、抗－ＣＤ２０剤を含む第２の組成物と、を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２０剤は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ヨウ素ｉ１３１トシツモマブ、オビヌツズマブ、又はイブリツモマブである。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２０剤はリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））である。

いくつかの実施形態において、対象へのＣＡＲ－Ｔ及び抗ＣＤ２０剤の投与は、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象と比較して、対象における増加したＣＡＲ－Ｔのインビボ生存及び持続性をもたらす。いくつかの実施形態において、血液試料中のＣＡＲ－Ｔコピー／ｍＬ又はＣＡＲ－Ｔコピー／ｕｇＤＮＡは、持続性の代用として、期間にわたって決定される。いくつかの実施形態において、血漿濃度曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち、最上部の血漿濃度曲線と最下部でのｘ軸（時間）によって定義される領域）は、持続性の尺度として使用される。いくつかの実施形態において、１００日後（時間）の血漿濃度曲線のＡＵＣが、持続性の尺度として使用される。対象におけるＣＡＲ－Ｔの増加した持続性は、治療に対する改善された奏効の優れた効果を提供する。対象における増加したＡＵＣは、治療に対する改善された奏効の優れた効果を提供する。「増加した」又は「増強された」量は、通常、「統計的に有意な」量であり、ＣＡＲのみを投与された対象における応答よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％、又は３０００％（間の増加する全てのパーセント、例えば、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％を含む）大きい増加を含み得る。「増加した」又は「増強された」量には、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象の応答よりも、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、１００％～１５０％、又は１５０％～２００％大きい増加を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ及び抗ＣＤ２０剤を投与された対象におけるＣＡＲ－Ｔの持続性は、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象と比較して少なくとも７５％高い。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ及び抗ＣＤ２０剤を投与された対象におけるＣＡＲ－Ｔの持続性は、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象と比較して少なくとも９０％高い。

いくつかの実施形態において、対象へのＣＡＲ及び抗ＣＤ２０剤の投与は、ＣＡＲのみを投与された対象と比較して、対象におけるＣＡＲのインビボ持続性及び拡大の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、対象へのＣＡＲ及び抗ＣＤ２０剤の投与は、インビボ持続性の増加をもたらすが、ＣＡＲのみを投与された対象と比較して、対象におけるＣＡＲの拡大に影響を及ぼさない。

本明細書で使用される場合、「抗薬物抗体」又は「ＡＤＡ」という用語は、対象に存在する治療用タンパク質に対して対象で生成された抗体を指す。古典的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、対象への組換え治療用タンパク質の全身投与から生じると当該技術分野で理解されている。更に、ＣＡＲ－Ｔ治療薬に関して本明細書で使用される場合、ＡＤＡ応答は、ＣＡＲ－Ｔに結合する抗体（すなわち、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲ－Ｔに対して生成された抗体）を生じた、本明細書に記載の試験で観察された抗体応答を包含することが意図される。

いくつかの実施形態において、対象へのＣＡＲ－Ｔ及び抗ＣＤ２０剤の投与は、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象と比較して、対象におけるＣＡＲ－Ｔに対する減少した抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答をもたらす。いくつかの実施形態において、ＡＤＡ応答は、ｍｅｓｏ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して経時的に末梢血で測定される。対象におけるＡＤＡ応答の減少は、治療に対する改善した応答の優れた効果を提供する。「減少した」又は「低下した」量は、通常、「統計的に有意な」量であり、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象における応答よりも、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％（間の増加する全てのパーセント、例えば、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％を含む）低い減少を含み得る。「減少した」又は「低下した」量には、ＣＡＲ－Ｔ単独で投与された対象における応答よりも、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％低い減少を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ及び抗ＣＤ２０剤を投与された対象におけるＣＡＲ－Ｔに対する抗薬物抗体応答は、ＣＡＲ－Ｔのみを投与された対象と比較して少なくとも５０％低い。

本発明のいずれの方法も、少なくとも１つのタンパク質足場を含む有効量の組成物又は薬学的組成物を、かかる調節、治療、又は療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、又は患者に投与することを含むことができる。かかる方法は、任意選択的に、かかる疾患又は障害を治療するための共投与若しくは併用療法を更に含むことができ、当該少なくとも１つのタンパク質足場、その特定の部分、又はバリアントの投与は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、及び放射性医薬品のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１つの、前、同時、及び／又は後に投与することを更に含む。好適な投薬量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）、ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）、Ｎｕｒｓｉｎｇ２００１ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｃｏｒｐ．，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，Ｐａ．，２００１、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｇｕｉｄｅ２００１，ｅｄ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔａｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．を参照されたく、これらの参照の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

好ましい用量は、任意選択的に、約０．１～９９及び／若しくは１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値、若しくは分数、あるいは１回若しくは複数回の投与、又はその任意の範囲、値、若しくは分数当たり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度の血清濃度を達成することができるように含むことができる。本発明のタンパク質足場における好ましい投与量範囲は、約１ｍｇ～最大約３、約６、又は約１２ｍｇ／ｋｇ患者の体重である。

代替的に、投与される投与量は、特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその投与様式及び経路、レシピエントの年齢、健康状態、及び体重、症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果などの既知の要因に応じて変化することができる。通常、活性成分の投与量は、体重１キログラム当たり約０．１～１００ミリグラムであることができる。通常、投与当たり又は持続放出形態で体重１キログラム当たり０．１～５０、好ましくは０．１～１０ミリグラムが、所望の結果を得るために有効である。

非限定的な例として、ヒト又は動物の治療は、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場の１回又は定期的な投与量として、１日当たり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ又はその任意の範囲、値、若しくは分数を、１～４０日のうちの少なくとも１回、又は代替的若しくは追加的に、１～５２週のうちの少なくとも１回、又は代替的若しくは追加的に、１～２０年のうちの少なくとも１回、あるいはそれらの任意の組み合わせで、単回注入又は反復用量を使用して提供することができる。

内部投与に好適な投与形態（組成物）は、一般に、単位又は容器当たり約０．００１ミリグラム～約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物において、活性成分は通常、組成物の総重量に基づいて約０．５～９９．９９９重量％の量で存在する。

いくつかの実施形態において、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む第１の組成物は、少なくとも細胞０．１×１０^６、０．２×１０^６、０．２５×１０^６、０．５×１０^６、０．６×１０^６、０．７×１０^６、０．７５×１０^６、０．８×１０^６、０．９×１０^６、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１０×１０^６、１１×１０^６、１２×１０^６、１３×１０^６、１４×１０^６、１５×１０^６、１６×１０^６、１７×１０^６、１８×１０^６、１９×１０^６、又は２０×１０^６個／ｋｇ対象の体重の総用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞０．２５×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞０．７５×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞２×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞６×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞１０×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞１５×１０^６個／ｋｇ／用量の用量で投与される。

非経口投与では、タンパク質足場は、薬学的に許容される非経口ビヒクルと会合して、又は別々に提供される、溶液、懸濁液、エマルション、粒子、粉末、又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。かかるビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び約１～１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用することができる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝剤及び防腐剤）を維持する添加剤を含有することができる。製剤は、既知又は好適な技法によって滅菌される。

好適な薬学的担体は、この分野の標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記載されている。

代替的投与
薬学的に有効な量の本発明による少なくとも１つのタンパク質足場を投与するために、多くの既知及び開発された方式を本発明に従って使用することができる。肺投与が以下の説明で使用されるが、他の投与方式を本発明に従って好適な結果とともに使用することができる。本発明のタンパク質足場は、担体中で、溶液、エマルション、コロイド、若しくは懸濁液として、又は乾燥粉末として、吸入又は本明細書に記載されているか若しくは当該技術分野で知られている他の方式による投与に好適な様々なデバイス及び方法のうちのいずれかを使用して、送達することができる。

非経口製剤及び投与
非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有することができる。注射のための水性又は油性の懸濁液は、適切な乳化剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、既知の方法に従って調製することができる。注射のための薬剤は、水性溶液、無菌注射可能溶液、又は溶媒中の懸濁液など、非毒性で非経口的に投与可能な希釈剤であることができる。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル液、等張生理食塩水などが許容され、通常の溶媒又は懸濁溶媒として、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的のために、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができ、天然又は合成若しくは半合成の脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成若しくは半合成のモノ－又はジ－又はトリ－グリセリドが含まれる。非経口投与は当該技術分野で既知であり、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているガス加圧無針注射デバイス、及び米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているレーザー穿孔デバイスが含まれるが、これらに限定されず、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。

代替的送達
本発明は更に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、被膜内、軟骨内、腔内、細胞内、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻腔内、又は経皮的な手段による少なくとも１つのタンパク質足場の送達に関する。少なくとも１つのタンパク質足場組成物は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）又は任意の他の投与のために、特に溶液又は懸濁液の形態での使用；膣又は直腸投与のために、クリーム及び座薬などのこれらに限定されない特に半固体形態での使用；頬又は舌下投与のために、錠剤又はカプセルなどのこれらに限定されない形態での使用；鼻腔内による、粉末、点鼻薬若しくはエアロゾル、又は特定の薬剤などの形態のこれらに限定されない使用；経皮による、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液、又は皮膚構造を改善するか若しくは経皮パッチにおける薬物濃度を増加させるいずれかのためにジメチルスルホキシドなどの化学的増強剤を有するか（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．「Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；」Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９－９０（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９９４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、又は皮膚でのタンパク質及びペプチドを含有する製剤の適用を可能にする酸化剤を有する（ＷＯ９８／５３８４７）パッチ送達システムなどのこれらに限定されない使用、あるいはエレクトロポレーションなどの一時的な輸送経路を作成するための電場の適用、又はイオントフォレシスなどの皮膚を介した荷電薬物の移動度の増加、又はソノフォレシスなどの超音波（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）の適用のために調製することができる（上記刊行物及び特許は参照により本明細書に全体が組み込まれる）。

肺／鼻投与
肺投与では、好ましくは、少なくとも１つのタンパク質足場組成物は、肺又は副鼻腔の下気道に到達するのに有効な粒子サイズで送達される。本発明により、少なくとも１つのタンパク質足場は、吸入による治療剤の投与のための当該技術分野で知られている様々な吸入又は鼻デバイスのうちのいずれかによって送達することができる。エアロゾル化製剤を患者の洞腔又は肺胞に沈着させることができるこれらのデバイスには、計量投与吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。タンパク質足場の肺又は鼻投与を管理するために好適な他のデバイスも、当該技術分野で知られている。かかるデバイスは全て、エアロゾル中のタンパク質足場を分配するための投与に好適な製剤を使用することができる。かかるエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成することができる。

ベントリン計量投与吸入器のような計量投与吸入器は、典型的には噴射ガスを使用し、吸気の際中に作動を必要とする（例えば、ＷＯ９４／１６９７０、ＷＯ９８／３５８８８を参照）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって販売されているデバイス、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）などの乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する（米国特許第４，６６８，２１８号Ａｓｔｒａ、ＥＰ２３７５０７ Ａｓｔｒａ、ＷＯ９７／２５０８６ Ｇｌａｘｏ、ＷＯ９４／０８５５２ Ｄｕｒａ、米国特許第５，４５８，１３５号Ｉｎｈａｌｅ、ＷＯ９４／０６４９８ Ｆｉｓｏｎｓ、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＥＲｘ（商標）Ａｒａｄｉｇｍ、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、及びＡｃｏｒｎ ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５，４０４，８７１号Ａｒａｄｉｇｍ、ＷＯ９７／２２３７６）などのネブライザーは、上記参考は、参照により全体が本明細書に組み込まれており、溶液からエアロゾルを生成し、一方、計量投与吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアロゾルを生成する。市販の吸入デバイスのこれらの具体的な例は、本発明の実施に好適な具体的デバイスの代表であることが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されない。

好ましくは、少なくとも１つのタンパク質足場を含む組成物は、乾燥粉末吸入器又は噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つのタンパク質足場を投与するための吸入デバイスには、いくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入デバイスによる送達は、利点として、信頼性が高く、再現性があり、正確である。吸入デバイスは、任意選択的に、優れた呼吸可能性のために、乾燥小粒子、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１～５μｍを送達することができる。

スプレーとしてのタンパク質足場組成物の投与
タンパク質足場組成物を含むスプレーは、少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁液又は溶液を加圧下でノズルに通させることによって生成することができる。ノズルのサイズ及び構成、適用圧力、並びに液体供給速度を選択して、所望の出力及び粒子サイズを達成することができる。エレクトロスプレーは、例えば、キャピラリー又はノズルフィードに関連する電場によって生成することができる。有利には、噴霧器によって送達される少なくとも１つのタンパク質足場組成物の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍの範囲、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの粒子サイズを有する。

噴霧器を用いた使用に好適な少なくとも１つのタンパク質足場組成物の製剤は、典型的には、水溶液中にタンパク質足場組成物を、溶液１ｍｌ当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ若しくはｍｇ／ｇｍの少なくとも１つのタンパク質足場組成物の濃度で、又はその任意の範囲、値、若しくは分数で含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含むことができる。製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物などの、タンパク質足場組成物の安定化のための賦形剤又は薬剤を含むことができる。タンパク質足場組成物を製剤化するのに有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。タンパク質足場組成物を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。タンパク質足場組成物製剤はまた界面活性剤を含むことができ、エアロゾルを形成する際の溶液の霧化によって引き起こされるタンパク質足場組成物の表面誘導凝集を減少又は防止することができる。様々な従来の界面活性剤を用いることができ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどが挙げられる。量は一般に、製剤の０．００１～１４重量％の範囲である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。タンパク質足場、又は特定された部分若しくはバリアントなどのタンパク質の製剤化のために当該技術分野で知られている追加の薬剤も、製剤に含めることができる。

ネブライザーによるタンパク質足場組成物の投与
本発明のタンパク質足場組成物は、ジェットネブライザー又は超音波ネブライザーなどのネブライザーによって投与することができる。通常、ジェットネブライザーでは、圧縮空気源を使用して、開口部を通る高速エアージェットを生成する。ガスがノズルを超えて膨張すると、低圧領域が生じ、液体リザーバーに接続された毛細管を通ってタンパク質足場組成物の溶液が引き出される。毛細管からの液体流は、管を出るときに不安定なフィラメント及び液滴にせん断され、エアロゾルを生じる。様々な構成、流速、及びバッフル型を用いて、所定のジェットネブライザーから所望の性能特性を達成することができる。超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギーを使用して、通常は圧電トランスデューサーを用いて振動性機械エネルギーを生成する。このエネルギーは、直接的又は連結流体を介するいずれかでタンパク質足場組成物の製剤に伝達され、タンパク質足場組成物を含むエアロゾルを生成する。有利には、ネブライザーによって送達されるタンパク質足場組成物の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの範囲の粒子サイズを有する。

ジェット又は超音波のいずれかのネブライザーを使用するために好適な少なくとも１つのタンパク質足場の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり約０．１ｍｇから約１００ｍｇの濃度の少なくとも１つのタンパク質足場を含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含むことができる。製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物などの、少なくとも１つのタンパク質足場組成物の安定化のための賦形剤又は薬剤を含むことができる。少なくとも１つのタンパク質足場組成物を製剤化するのに有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。少なくとも１つのタンパク質足場を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。少なくとも１つのタンパク質足場製剤はまた、界面活性剤を含むことができ、エアロゾルを形成する際の溶液の霧化によって引き起こされる少なくとも１つのタンパク質足場の表面誘導凝集を減少又は防止することができる。様々な従来の界面活性剤を使用することができ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどが挙げられる。量は一般に、製剤の約０．００１～４重量％の範囲である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノ－オレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。タンパク質足場などのタンパク質の製剤化のために当該技術分野で知られている追加の薬剤も、製剤に含めることができる。

計量投与吸入器によるタンパク質足場組成物の投与
計量投与吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、少なくとも１つのタンパク質足場、及び任意の賦形剤又は他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに含有される。計量弁の作動は、混合物を、好ましくは粒子を約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍのサイズ範囲で含有するエアロゾルとして放出する。所望のエアロゾル粒子サイズは、ジェットミリング、スプレードライ、臨界点凝縮などを含む、当業者に既知の様々な方法によって生成されるタンパク質足場組成物の製剤を用いることによって得ることができる。好ましい計量投与吸入器には、３Ｍ又はＧｌａｘｏによって製造され、ヒドロフルオロカーボン噴射剤を用いるものが含まれる。計量投与吸入器デバイスを用いて使用するための少なくとも１つのタンパク質足場の製剤は、一般に、少なくとも１つのタンパク質足場を含有する微粉末を、例えば、界面活性剤の補助を有する噴射剤に懸濁された、非水性媒体中の懸濁液として含む。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又はハイドロカーボンなどのこの目的のために用いられる任意の従来の材料であることができ、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２－テトラフルオロエタン、ＨＦＡ－１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン－１３４ａ）、ＨＦＡ－２２７（ハイドロフルオロアルカン－２２７）などが含まれる。好ましくは、噴射剤は、ヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１つのタンパク質足場を噴射剤中の懸濁液として安定させるため、活性剤を化学的分解などから保護するなどのために選択することができる。好適な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが含まれる。場合によっては、溶液エアロゾルは、エタノールなどの溶媒を使用することが好ましい。タンパク質の製剤化のために当該技術分野で知られている追加の薬剤も、製剤に含めることができる。当該技術分野の当業者は、本発明の方法が、本明細書に記載されていないデバイスを介した、少なくとも１つのタンパク質足場組成物の肺投与によって達成できることを認識するであろう。

経口製剤及び投与
経口投与のための製剤は、人工的に腸壁の透過性を増加させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノール並びにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤）の同時投与、並びに酵素分解を阻害する酵素阻害剤（例えば、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＦ）、及びトラジロール）の同時投与に依存している。タンパク質及びタンパク質足場、並びに経口、頬、粘膜、鼻、肺、膣経膜、又は直腸の投与を目的とした少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせを含む親水性薬剤の送達のための製剤は、米国特許第６，３０９，６６３号に教示されている。経口投与のための固体型投与形態の活性成分化合物には、少なくとも１つの添加剤と混合することができ、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドが含まれる。これらの投与形態はまた、他のタイプの添加剤、例えば、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、パラベン、防腐剤であるソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ－トコフェロールなど、システインなどの酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などを含有することができる。

錠剤及びピルは、腸溶性コーティング調製物に更に加工することができる。経口投与のための液体調製物には、医療使用に許容されるエマルション、シロップ、エリキシル、懸濁剤、及び溶液調製物が含まれる。これらの調製物は、当該分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームはまた、インスリン及びヘパリンにおける薬物送達システムとして記載されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。最近では、混合アミノ酸の人工ポリマー（プロテイノイド）のミクロスフェアが医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。更に、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，８７１，７５３号に記載され、生物活性剤を経口送達するために使用される担体化合物は、当該技術分野で知られている。

粘膜製剤及び投与
１つ以上の生体適合性ポリマー又はコポリマー賦形剤、好ましくは生体分解性ポリマー又はコポリマーにカプセル化された生物活性剤を経口投与するための製剤は、得られるマイクロカプセルの適切なサイズに起因して、胃腸間を通過している薬剤のために効力の損失なしに、集合リンパ小節（さもなければ動物の「パイエル板」又は「ＧＡＬＴ」としても知られる）に到達して取り込まれる薬剤を生じるマイクロカプセルをもたらす。同様の集合リンパ小節は、気管支管（ＢＡＬＴ）及び大腸にも認められ得る。上記の組織は、一般に、粘膜関連リンパ細網組織（ＭＡＬＴ）と称される。粘膜表面を通る吸収のために、少なくとも１つのタンパク質足場を投与する組成物及び方法は、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性巨大分子、生物活性ペプチド、及び水性連続相を含むエマルションを含み、エマルション粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面を通る吸収を促進する（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルションの適用に好適な粘膜表面には、角膜、結膜、頬、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸の投与経路を含むことができる。膣又は直腸投与のための製剤、例えば、坐剤は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含むことができる。鼻腔内投与のための製剤は、固体であることができ、賦形剤として、例えば、ラクトースを含むか、又は点鼻薬の水性若しくは油性溶液であることができる。頬投与では、賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが含まれる（米国特許第５，８４９，６９５号）。

経皮製剤及び投与
経皮投与では、少なくとも１つのタンパク質足場は、リポソーム若しくはポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はミクロスフェア（特に明記しない限り、集合的に微粒子と称される）などの送達デバイスにカプセル化される。多くの好適なデバイスが知られており、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びそれらのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼンなどの合成ポリマー、並びにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及び他のタンパク質、アルギン酸、及び他のサッカライド、並びにそれらの組み合わせからなる微粒子が含まれる（米国特許第５，８１４，５９９号）。

延長投与及び製剤
本発明の化合物を対象に延長した期間にわたって、例えば、単回投与から１週～１年の期間送達することが望ましいことであり得る。様々な徐放、デポ、又はインプラント投与形態を利用することができる。例えば、投与形態は、体液中で低い溶解度を有する化合物の薬学的に許容される非毒性の塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ－若しくはジ－スルホン酸、ポリガラクツロン酸などのポリ塩基を有する酸付加塩、（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンを有するか、又は例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジル－エチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンを有する塩、あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩、を含むことができる。加えて、本発明の化合物、又は好ましくは、上記のような比較的不溶性の塩は、注射に好適な、例えばゴマ油を用いてモノステアリン酸アルミニウムゲルに製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。別のタイプの注射のための徐放性デポ製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどの、ゆっくりと分解し、非毒性で、非抗原性のポリマー中にカプセル化のために分散された化合物又は塩を含有する。化合物、又は好ましくは、上記などの比較的不溶性の塩はまた、特に動物で使用するために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに製剤化することができる。追加の徐放、デポ、又はインプラント製剤、例えば、気体又は液体リポソームが、文献で知られている（米国特許第５，７７０，２２２号及び“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）。

養子細胞療法としての改変された細胞の注入
本開示は、本開示の１つ以上のＣＡＲ及び／又はＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する改変された細胞であって、それを必要とする対象に投与するために選択及び／又は増大された、改変された細胞を提供する。本開示の改変された細胞は、室温及び体温を含む任意の温度で保管するために製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、凍結保存及びその後の解凍のために製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、滅菌包装からの対象への直接投与のために薬学的に許容される担体中で製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、最低レベルの細胞機能及びＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を確実にするための細胞生存度及び／又はＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現レベルの指示薬とともに薬学的に許容される担体中で製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、更なる増殖を阻害するため、及び／又は細胞死を防止するための１つ以上の試薬とともに処方された密度で薬学的に許容される担体に製剤化され得る。

誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドがはるかに免疫原性が低いため、既存の誘導性ポリペプチドよりも優れている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、したがって、非自然発生が、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを産生するために再結合される配列は、宿主ヒト免疫系が「非自己」として認識し得、その結果、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む組成物、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞を受け取る対象において免疫応答を誘導する、非ヒト配列を含まない。

本開示は、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進性ペプチドを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、その誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態において、アポトーシス促進性ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。ある特定の実施形態において、カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ９ポリペプチドである。ある特定の実施形態において、カスパーゼ９ポリペプチドは、短縮型カスパーゼ９ポリペプチドである。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非自然発生であり得る。

本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、及びカスパーゼ１４が含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、及びカスパーゼ１０を含む、アポトーシスに関連するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、及びカスパーゼ１０を含む、アポトーシスを開始するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ３、カスパーゼ６、及びカスパーゼ７を含む、アポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型アミノ酸又は核酸配列と比較して１つ以上の改変を有するアミノ酸又は核酸配列によってコードされ得る。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化され得る。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸及び／又は核酸配列に対する１つ以上の改変は、野生型アミノ酸又は核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、又は活性化を増加させ得る。代替的に、又は加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸及び／又は核酸配列に対する１つ以上の改変は、野生型アミノ酸又は核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を減少させ得る。

本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して短縮され得る。例えば、カスパーゼポリペプチドは、本開示の誘導性カスパーゼポリペプチドを含む細胞においてアポトーシスを開始することに加えて、局所的炎症応答を活性化する可能性を排除又は最小限にするために、カスパーゼ活性化及び動員ドメイン（ＣＡＲＤ）をコードする配列を排除するように短縮され得る。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの変異体アミノ酸配列を形成するようにスプライシングされ得る。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組換え及び／又はキメラ配列によってコードされ得る。本開示の組換え及び／又はキメラカスパーゼポリペプチドは、１つ以上の異なるカスパーゼポリペプチドからの配列を含み得る。代替的に、又は加えて、本開示の組換え及び／又はキメラカスパーゼポリペプチドは、１つ以上の種からの配列（例えば、ヒト配列及び非ヒト配列）を含み得る。本開示のカスパーゼポリペプチドは、非自然発生であり得る。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの本開示の第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの二量体化を促進又は促進する任意のポリペプチド配列を含み得、その二量体は、アポトーシス促進性ポリペプチドの架橋、及び細胞におけるアポトーシスの開始を活性化又は誘導する。

リガンド結合（「二量体化」）領域は、天然又は非天然リガンド（すなわち、誘導剤）、例えば、非天然合成リガンドを使用する誘導を可能にする、任意のポリペプチド又はその機能ドメインを含み得る。リガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの性質及びリガンド（すなわち、誘導剤）の選択に応じて、細胞膜より内側又は外側であり得る。受容体を含む多種多様なリガンド結合ポリペプチド及びその機能ドメインが、既知である。本開示のリガンド結合領域は、受容体からの１つ以上の配列を含み得る。特に興味深いのは、リガンド（例えば、小さな有機リガンド）が既知である、又は容易に生成され得る、リガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域又は受容体には、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体など、並びに、「非天然」受容体（抗体、特に、重鎖又は軽鎖サブユニット、それらの変異型配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などにより得られたランダムアミノ酸配列から得ることができる）が含まれ得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、及びテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群から選択される。

１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、天然ドメイン又はその短縮型活性部分のいずれかとして、少なくとも約５０個のアミノ酸、及び約３５０個未満のアミノ酸、通常、２００個未満のアミノ酸であり得る。結合領域は、例えば、二量体化のために構成され得る、小さく（ウイルスベクターにおける効率的なトランスフェクションを可能にするために、２５ｋＤａ未満）、単量体で、非免疫原性で、合成的に入手しやすく、細胞透過性で、無毒性のリガンドであり得る。

１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの設計、及び適切なリガンド（すなわち、誘導剤）の利用可能性に依存して、細胞内又は細胞外であり得る。疎水性リガンドについて、結合領域は、膜のどちらの側でもあり得るが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドについて、結合領域は、結合のために利用可能な形態でリガンドを内部移行するための輸送系が存在しない限り、通常、細胞膜の外側である。細胞内受容体について、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むトランスポゾン若しくはベクターは、受容体ドメイン配列の５’若しくは３’側にシグナルペプチド及び膜貫通ドメインをコードし得るか、又は受容体ドメイン配列の５’側に脂質付着シグナル配列を有し得る。受容体ドメインがシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合、受容体ドメインは細胞外にある。

抗体及び抗体サブユニット、例えば、重鎖又は軽鎖、具体的には断片、より具体的には、その可変領域の全部若しくは一部、又は高親和性結合を生じる重鎖と軽鎖の融合体が、本開示のリガンド結合領域として使用することができる。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般的に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）において発現していない、細胞外ドメインなどの異所性に発現したヒト産物であるものが含まれる。そのような例には、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、及び胚性表面タンパク質（すなわち、がん胎児性抗原）が含まれるが、これらに限定されない。なお更に、抗体は、生理学的に許容されるハプテン分子に対して調製することができ、その個々の抗体サブユニットを結合親和性についてスクリーニングすることができる。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、リガンドに対する適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを獲得するように、単離され、定常領域、可変領域の部分の欠失、可変領域の突然変異生成などにより改変され得る。このように、ほとんどいかなる生理学的に許容されるハプテン化合物も、リガンドとして、又はリガンドに対するエピトープを提供するために、用いることができる。抗体ユニットの代わりに、結合領域又はドメインが既知であり、結合のための有用な又は既知のリガンドが存在する、内因性受容体を用いることができる。

受容体を多量体化することについて、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインに対するリガンドは、リガンドが少なくとも２つの結合部位を有し得、その結合部位の各々がリガンド受容体領域と結合する能力がある（すなわち、第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を結合する能力がある第１の結合部位、及び第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を結合する能力がある第２の結合部位を有するリガンドであって、第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域及び第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域が、同一か異なるかのいずれかである）という意味において、多量体であり得る。したがって、本明細書で使用される場合、「多量体リガンド結合領域」という用語は、多量体リガンドに結合する本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を指す。本開示の多量体リガンドには、二量体リガンドが含まれる。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインと結合する能力がある２つの結合部位を有し得る。ある特定の実施形態において、本開示の多量体リガンドは、合成有機小分子の二量体又はより高い次数のオリゴマー、通常、約四量体以下であり、個々の分子は、典型的には、少なくとも約１５０Ｄａ、約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満である。合成リガンド及び受容体の様々な対を用いることができる。例えば、天然受容体を含む実施形態において、二量体ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２受容体とともに使用することができ、二量体化シクロスポリンＡは、シクロフィリン受容体とともに使用することができ、二量体化エストロゲンはエストロゲン受容体とともに、二量体化グルココルチコイドはグルココルチコイド受容体とともに、二量体化テトラサイクリンはテトラサイクリン受容体とともに、二量体化ビタミンＤはビタミンＤ受容体とともに、など使用することができる。代替的に、より高い次数のリガンド、例えば、三量体を使用することができる。非天然受容体、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、柔軟なリンカーによって分離された重鎖及び軽鎖可変領域からなる一本鎖抗体、又は改変された受容体、並びにそれらの変異配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のいずれかを使用することができる。本開示の多量体リガンドを含むユニットの重要な特性は、各結合部位が、受容体を高親和性で結合し得ること、及び好ましくは、それらが化学的に二量体化され得ることである。また、それらが、たいていの適用について、血清中に機能的レベルで溶解し、更に、形質膜を横断して拡散することができるように、リガンドの疎水性／親水性の平衡を保つための方法が利用可能である。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの活性化は、例えば、条件的に調節されるタンパク質又はポリペプチドを生じるように、誘導剤により媒介される化学誘導二量体化（ＣＩＤ）を通して、達成され得る。本開示のアポトーシス促進性ポリペプチドは、誘導性であるだけでなく、不安定な二量体化剤の分解又は単量体競合阻害剤の投与に起因して、これらのポリペプチドの誘導はまた可逆的でもある。

ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む。リガンド結合領域が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態において、誘導剤は、合成薬物であるＡＰ１９０３（ＣＡＳインデックス名：２－ピペリジンカルボン酸、１－［（２Ｓ）－１－オキソ－２－（３，４，５－トリメトキシフェニル）ブチル］－、１，２－エタンジイルビス［イミノ（２－オキソ－２，１－エタンジイル）オキシ－３，１－フェニレン［（１Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ－［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］－（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－６３－７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０；分子量：１４１１．６５））を含み得る。リガンド結合領域が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態において、誘導剤は、ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－８０－８及び分子式：Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０）を含み得る。ある特定の実施形態において、誘導剤は、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。本明細書で使用される場合、誘導剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３、及びＡＰ１５１０は、交換可能に使用され得る。

ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造され、ＡＰ１９０３注射用製剤は、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．によって製造される。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５（２５０ｍｇ／ｍＬ、ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化される。室温では、この製剤は、透明の淡黄色の溶液である。冷蔵により、この製剤は、可逆的相転移を起こし、乳濁した溶液を生じる。この相転移は、室温へ再び温めることにより逆転する。充填は、３ｍＬガラスバイアル中に２．３３ｍＬ（バイアル当たり合計で注射用およそ１０ｍｇのＡＰ１９０３）である。ＡＰ１９０３を投与する必要性が決定したら、患者は、例えば、非ＤＥＨＰ、非酸化エチレンで滅菌された注入セットを使用して、ＩＶ注入により２時間にわたって、注射用の単一固定用量のＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、全ての患者について個々に計算され、体重が≧１０％、変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水中の１００ｍＬに希釈される。ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相試験において、２４人の健常なボランティアが、２時間にわたってＩＶ注入される０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでの注射用単一用量のＡＰ１９０３で治療された。ＡＰ１９０３の血漿中レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲に対しておよそ１０～１２７５ｎｇ／ｍＬであった。最初の注入時間後、血中濃度は、迅速な分布相を示し、血漿中レベルは、投与後０．５ｍｇ／ｋｇ、２時間、及び１０時間において、それぞれ、最大濃度のおよそ１８％、７％、及び１％まで低下した。注射用ＡＰ１９０３は、全ての用量レベルにおいて安全で、かつ耐容性が良いことが示され、有利な薬物動態学的プロファイルが実証された。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ Ｊ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０－９，２００１。

例えば、使用される注射用のＡＰ１９０３の固定用量は、２時間にわたって静脈内注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効果的なシグナル伝達のためにインビトロで必要とされるＡＰ１９０３の量は、１０～１００ｎＭ（１６００Ｄａ ＭＷ）である。これは、１６～１６０μｇ／Ｌ又は

（１．６～１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量は、上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験において耐容性が良かった。したがって、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と組み合わせてのこの第Ｉ相試験について、ＡＰ１９０３の安全かつ有効な用量であり得る。

本開示のリガンド結合をコードするアミノ酸及び／又は核酸配列は、野生型アミノ酸又は核酸配列と比較して、１つ以上の改変の配列を含有し得る。例えば、本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸及び／又は核酸配列は、コドン最適化配列であり得る。１つ以上の改変は、野生型ポリペプチドと比較して、本開示のリガンド結合領域に対するリガンド（例えば誘導剤）の結合親和性を増加させ得る。代替的に、又は加えて、１つ以上の改変は、野生型ポリペプチドと比較して、本開示のリガンド結合領域の免疫原性を減少させ得る。本開示のリガンド結合領域及び／又は本開示の誘導剤は、非自然発生であり得る。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進性ペプチドを含み、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態において、非ヒト配列は、制限部位を含む。リンカーは、リガンド結合領域の二量体化で、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用又は活性化が細胞内でアポトーシスを開始するように、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用、架橋結合、交差活性化、又は活性化を可能にする任意の有機又は無機材料を含み得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、ポリペプチドである。ある特定の実施形態において、リンカーは、Ｇ／Ｓリッチアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ＧＳ」リンカー）である。ある特定の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むポリペプチドである。好ましい実施形態において、リンカーは、ポリペプチドであり、ポリペプチドをコードする核酸は、制限エンドヌクレアーゼの制限部位を含まない。本開示のリンカーは、非自然発生であり得る。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、細胞において、その細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始及び／又は制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得る。本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼのための最初の結合部位として働くプロモーターを指す。例えば、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始及び／又は制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得、そのプロモーターには、天然プロモーター、内因性プロモーター、外因性プロモーター、及び異種プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好ましい哺乳動物細胞には、ヒト細胞が含まれる。したがって、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ヒト細胞において、ヒト細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始及び／又は制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得、そのプロモーターには、ヒトプロモーター又はウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ヒト細胞における発現のための例示的なプロモーターには、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス長末端反復、β－アクチンプロモーター、ラットインスリンプロモーター、及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの高レベルの発現を得るために使用され得る。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を達成するための、当該技術分野において周知である他のウイルス又は哺乳動物細胞又は細菌ファージのプロモーターの使用が、発現レベルが細胞においてアポトーシスを開始するのに十分であるとの条件で、同様に企図される。周知の性質を持つプロモーターを用いることにより、トランスフェクション又は形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベル及びパターンを最適化することができる。

特定の生理的シグナル又は合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの誘導性発現を可能にすることができる。エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳類細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするように設計される。それは、導入遺伝子の基底レベルの発現が実質的にないが、２００倍を超える誘導能を可能にする厳格に制御された発現機構からなる。そのシステムは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づいており、エクジソン又はムリステロンＡなどのアナログがその受容体と結合したとき、その受容体は、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写物が獲得される。このシステムにおいて、目的の遺伝子の発現を駆動させるエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にあるが、ヘテロ二量体受容体の両方の単量体は、１つのベクターから構成的に発現する。したがって、この型のシステムを目的のベクトルへと操作することは、有用であり得る。有用であり得る別の誘導性システムは、最初、Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１，１９９２、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９，１９９５）によって開発されたＴｅｔ－Ｏｆｆ（商標）又はＴｅｔ－Ｏｎ（商標）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）である。この系もまた、高レベルの遺伝子発現が、テトラサイクリン又はドキシサイクリンなどのテトラサイクリン誘導体に応答して制御されることを可能にする。Ｔｅｔ－Ｏｎ（商標）システムにおいて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下でオンにされるが、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ（商標）システムにおいて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの不在下でオンにされる。これらのシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメント：テトラサイクリンオペレーター配列（テトラサイクリンリプレッサーが結合する）及びテトラサイクリンリプレッサータンパク質に基づく。目的の遺伝子は、テトラサイクリン応答性エレメントがプラスミドの中に存在するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子と呼ばれる調節エレメントを含有し、その調節エレメントは、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ（商標）システムでは、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６ドメイン及び野生型テトラサイクリンリプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの不在下で、転写は、構成的にオンになる。Ｔｅｔ－Ｏｎ（商標）システムにおいて、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で、転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合に、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ（商標）システムが使用され得、それにより、産生細胞は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンの存在下で成長し、潜在的に毒性の導入遺伝子の発現を阻止することができるが、そのベクターが患者に導入されるとき、遺伝子発現は、構成的にオンになり得る。

状況によっては、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。例えば、様々な活性の強度を有する異なるウイルスプロモーターが、望まれる発現レベルに依存して利用される。哺乳類細胞において、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７－４８に概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力ではない、ＣＭＶプロモーターの改変型もまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶ又はＭＭＴＶからのＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターがしばしば、使用される。所望の効果に依存して使用される他のウイルスプロモーターには、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２ ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、又はＭＬＰ領域からのようなアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ、並びにトリ肉腫ウイルスが含まれる。

他の例において、発生的に調節され、特定の分化細胞において活性であるプロモーターが、選択され得る。したがって、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞において不活性であり得るが、例えば、多能性幹細胞がより成熟した細胞へ分化する場合、そのとき、プロモーターは活性化され得る。

同様に、組織特異的プロモーターは、非標的組織への潜在的毒性又は望ましくない効果を低下させるために、特定の組織又は細胞において転写をもたらすように使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強いプロモーターと比較して発現の低下を生じ得るが、より制限された発現及び免疫原性もまた生じ得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０：１９７５－７９、Ｃａｚｅａｕｘ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２－３１）。例えば、ＰＳＡ関連プロモーターなどの組織特異的プロモーター又は前立腺特異的腺性カリクレイン又は筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。

組織特異的又は分化特異的プロモーターの例には、Ｂ２９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球性細胞）、ＣＤ４３（白血球及び血小板）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、デスミン（筋肉）、エラスターゼ－１（膵臓腺房細胞）、エンドグリン（内皮細胞）、フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）、並びにＦｌｔ－１（内皮細胞）、ＧＦＡＰ（星状細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の適応症において、遺伝子治療ベクターの投与後の特定の時点に転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモン又はサイトカインで調節可能なプロモーターなどのプロモーターを用いて行われる。使用することができるサイトカイン及び炎症性タンパク質応答性プロモーターには、Ｋ及びＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５－２３５１）、ｃ－ｆｏｓ、ＴＮＦ－アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５－３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５－１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ－１、ＩＬ－６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２－８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１－６１９１）、ＩＬ－８、アルファ－１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２－５１）、アルファ－１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４－２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７－２８９５）、フィブリノーゲン、ｃ－ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ－アルファ、ＵＶ放射、レチノイン酸、及び過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステル及びレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属及びグルココルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン－１、及びＥＧＦによって誘導可能）、アルファ－２マクログロブリン及びアルファ－１抗キモトリプシンが含まれる。他のプロモーターには、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、及びクレアチンが含まれる。

所望の作用に応じて、上記のプロモーターのいずれかを単独で、又は別のプロモーターと組み合わせて有用であり得ることが想定される。プロモーター及び他の調節エレメントは、それらが所望の細胞又は組織において機能的であるように選択される。加えて、このプロモーターのリストは、網羅的又は限定的である解釈されるべきではなく、他のプロモーターが、本明細書に開示されるプロモーター及び方法とともに使用される。

実施例１－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（Ａ／Ｋ／Ａ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎ（Ａ０８））の特性評価
本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎの発現は、ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列のＴ細胞へのｍＲＮＡエレクトロポレーション後に評価した。ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現性Ｔ細胞の機能性は、腫瘍株に対する脱顆粒化によって測定した。特性評価では、機能性との相関関係を更にアッセイした。

図４は、Ａ０８抗ＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎの構造を示す。

図５～８は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（Ａ０８抗ＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする）のインビトロ及びインビボでの特性評価を示す。

Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎのインビトロ評価は、ヒト初代Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入後の高レベルの表面発現及びＢＣＭＡ＋腫瘍細胞に対する強力な細胞傷害性機能（例えば、増殖）を示した（図５Ａ～Ｃを参照）。このインビトロでの強力な性能に続いて、Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎがインビボで機能する能力を評価した。

図６は、Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎを使用したマウスにおけるインビボ試験の処置予定を示す。この試験の結果は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする）で処置したマウスの１００％が２１日目まで生存したことを示す（図７参照）。処置した動物の２１日目でのこの完全な生存は、腫瘍量がゼロを示すことを伴った（Ｍタンパク質量によって評価し、これらの動物では２１日目に検出されなかった）（図７参照）。図８は、対照動物並びにＰ－ＢＣＭＡ－１０１で処置した動物における腫瘍量を更に示す一連の写真を提供する。Ａ０８ ＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する動物は、対照と比較して腫瘍量の減少を示す。

実施例２－ヒト汎Ｔ細胞にｉＣ９安全スイッチを組み込んだＰｉｇｇｙＢａｃの発現及び機能
ヒト汎Ｔ細胞を、Ａｍａｘａ ４Ｄヌクレオフェクターを使用して、４つのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンのうちの１つでヌクレオフェクトした。「モック」状態を受ける改変されたＴ細胞は、空のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンでヌクレオフェクトした。改変されたＴ細胞は、治療薬のみを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列）、又は組み込まれたｉＣ９配列及び治療薬（ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列）を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンのいずれかを受けた。

図８は、リガンド結合領域、リンカー、及び切断されたカスパーゼ９ポリペプチドを含む、ｉＣ９安全スイッチの概略図を提供する。具体的には、ｉＣ９ポリペプチドは、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を含むＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域を含む。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２は、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列によってコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２は、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２４）を含む核酸配列によってコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸及びＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によってコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２７）を含むアミノ酸配列によってコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、ドＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号２８）を含む核酸によってコードされる。

ｉＣ９安全スイッチを試験するために、４つの改変されたＴ細胞の各々を、０、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０００ｎＭのＡＰ１９０３（ＡＰ１９０３の誘導剤）とともに２４時間インキュベートした。生存率は、アポトーシスを受けている細胞のマーカーとして、蛍光インターカレーターである７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を使用したフローサイトメトリーによって評価した。

細胞生存率は、１２日目に評価した（図９参照）。データは、ｉＣ９構築物を含む細胞において誘導剤を増加させた濃度に伴う右下象限から左上象限への細胞集団のシフトを示すが、この効果はｉＣ９構築物（ＣＡＲＴｙｒｉｎのみを受けるもの）を欠く細胞では観察されず、細胞は誘導剤の濃度に関係なく、これら２つの領域に均等に分布している。更に、細胞生存率を１９日目に評価した（図１０参照）。データは、図９（ヌクレオフェクション後１２日目）に示されるのと同じ傾向を明らかにするが、ただし、左上象限への集団シフトは、後のこの時点（ヌクレオフェクション後１９日目）でより顕著である。

集計された結果の定量化を行い、図１１に提供され、細胞生存率におけるｉＣ９安全スイッチの有意な影響を、各改変細胞型においてｉＣ９スイッチの誘導剤（ＡＰ１９０３）の濃度の関数として、１２日目（図９及び左のグラフ）又は１９日目（図１０及び右のグラフ）で示す。ｉＣ９安全スイッチの存在は、１２日目までに大多数の細胞にアポトーシスを誘導し、その効果は１９日目までに更に劇的である。

この試験の結果は、ＡＰ１９０３が試験の最低濃度（０．１ｎＭ）でもアポトーシスを誘導するため、ｉＣ９安全スイッチが誘導剤（例えばＡＰ１９０３）との接触時に活性細胞を排除するのに極めて効果的であることを示す。更に、ｉＣ９安全スイッチは、トリシストロン性ベクターの一部として機能的に発現され得る。

実施例３：再発性／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象におけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性を評価する非盲検、多施設、第１相試験、それに続く応答及び安全性（プライム）の第２相評価
治験薬の名称：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１及びリミデュシド
ＴＣＲζ及び４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに結合した抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）センチリン（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を含むように操作された自己ＣＡＲ－Ｔ細胞。

治験薬の簡単な説明：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）ＤＮＡ改変システムと呼ばれるエレクトロポレーションベースの非ウイルス（ＤＮＡトランスポゾン）遺伝子送達システムを使用して遺伝子改変されたＴ細胞からなり、「カットアンドペースト」機構を介してＤＮＡをプラスミドから染色体に効率的に移動する。レンチウイルス又はｙ－レトロウイルスの形質導入と比較して、ＰＢは、より安全な挿入プロファイル、より高いレベルの導入遺伝子発現、安定したより長期間の導入遺伝子発現、及び高度に豊富化された好ましいＴ幹細胞記憶（Ｔｓｃｍ）表現型などの利点を提供する。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、対象から採取された自己Ｔ細胞であり、３つの主要な構成要素である抗ＢＣＭＡセンチリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性遺伝子、及び誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）ベースの安全スイッチ遺伝子を含むように改変される。

ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現カセットは、ＣＤ８ａシグナル／リーダーペプチド、ＣＤ８ａヒンジ／スペーサー、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、細胞内４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖シグナル伝達ドメインに融合した細胞外ＢＣＭＡ結合センチリンタンパク質をコードする（例えば、図４を参照）。抗体ベースの単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）からなる結合ドメインと比較して、ＣＡＲＴｙｒｉｎ結合ドメインは完全なヒトタンパク質であり、より小さく、より安定しており、免疫原性が潜在的に低いが、ＢＣＭＡ発現性ＭＭ細胞の特異的な認識及び殺傷を可能にする同様の抗原結合特性を有する。ＣＡＲＴｙｒｉｎｓはまた、Ｔ細胞枯渇を回避するように設計される。

ＤＨＦＲ選択遺伝子は、転位したＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞のエクスビボ選択のために製造中に使用され、より均質な製品を生成する。

「安全スイッチ」は、指示される場合、活性剤であり、合成小分子二量体化剤であるリミデュシドの静脈内投与によって、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の迅速な除去を可能にするように設計された、ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞には認められない追加の安全機能である（セクション１５．３を参照）。

試験製品、用量、投与経路：第１相：単回投与－単回投与として静脈内投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の用量レベル。用量レベルは、試験設計に記載される３＋３漸増設計でのコホートによって試験される。

第１相：サイクル投与－各２週間の２サイクル（コホートＡ及びコホートＣ）又は３サイクル（コホートＢ）で静脈内投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回用量。投与される総用量は、単回用量漸増中に決定される≦最大耐用量（ＭＴＤ）開始する３＋３設計に従う。コホートＡ及びＢの両方における第１のサイクルでは、総用量の１／３が投与される。コホートＡでは、総用量の最大２／３が第２のサイクルで投与される。コホートＢでは、総用量の最大１／３が第２のサイクル及び第３のサイクルの各々で投与される。コホートＣでは、総用量の最大２／３が第１のサイクルで投与され、総用量の１／３までが第２のサイクルで投与される。

第１相：併用投与－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、承認された治療法と組み合わせて投与される：レナリドマイド（コホートＲ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週間前から開始して２８日毎に２１日間、経口によって１日に１０～２５ｍｇ、及びコホートＲＰ：アフェレーシス前の１週間、その後Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週間前から開始して２８日毎に２１日間、経口によって１日に１０～２５ｍｇ）及びリツキシマブ（コホートＲＩＴ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１２及び５日前、その後８週毎に、３７５ｍｇ／ｍ^２）。投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の用量は、用量漸増中に決定される≦ＭＴＤから開始する３＋３設計に従う。

第２相：細胞６～１５×１０^６個／ｋｇの総用量として静脈内投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１。

リミデュシドは、臨床的に示される場合、０．４ｍｇ／ｋｇで静脈内投与され得る。

セクション１５．４における基準を満たす被験者は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の別の注入を受けるのに適格であり得る。

対照療法：なし

主要な目的：この試験の主要な目的は、以下である。

第１相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び最大耐用量（ＭＴＤ）を、用量制限毒性（ＤＬＴ）に基づいて決定する

第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び有効性を評価する

主要なエンドポイント：

第１相－ＭＴＤを定義する各用量レベルでＤＬＴを有する被験者の数

第２相－有害事象（ＡＥ）、検査、及び標準臨床検査に基づく安全性及び耐容性

独立した審査委員会（ＩＲＣ）によって評価される国際骨髄腫ワーキンググループ基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｋｕｍａｒ，２０１６）による全奏効率（ＯＲＲ）及び奏効期間（ＤＯＲ）

副次的目的：この試験の副次的目的は、以下を評価することである。

第１相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び実現可能性、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の抗骨髄腫効果、第２／３相試験における更なる評価のための用量選択を先導する細胞用量の効果

第２相－サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発生率及び重症度、追加の有効性エンドポイント

副次的エンドポイント：以下の副次的エンドポイントが評価される。

第１相－プロトコルで禁止されている用量のＰ－ＢＣＭＡ－１０１を生成する能力；ＡＥ、検査、及び標準臨床検査に基づく安全性及び耐容性；リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類されたＣＲＳ；国際骨髄腫ワーキンググループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（ＩＭＷＧ）統一応答基準（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１１、Ｋｕｍａｒ２０１６、Ｃａｖｏ，２０１７）に基づいた有効性；全奏効率（ＯＲＲ）；奏効までの時間（ＴＴＲ）；奏効期間（ＤＯＲ）；無増悪生存期間（ＰＦＳ）；及び全生存期間（ＯＳ）。

第２相－リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類されたＣＲＳ；ＩＬ－６拮抗薬、コルチコステロイド、及びリミデュシド使用の割合；ＯＳ、ＰＦＳ、ＴＴＲ、微小残存病変（ＭＲＤ）の陰性率

探索的目的：この試験の探索的目的は以下を行うことである。

第１相－ＭＭ形質細胞ＢＣＭＡ発現、循環可溶性ＢＣＭＡ、及び臨床応答の間の関係を評価する

第１相及び第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の拡大及び機能持続性を特徴付ける；推定的ＣＲＳマーカーと有効性又は安全性との間の関係を評価する；指示される場合、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１関連有害事象についてリミデュシドの効果を評価する

探索的エンドポイント：以下の探索的エンドポイントが、試験の過程で評価される。

第１相－骨髄中のＢＣＭＡ及び／又は他のバイオマーカー、血中の可溶性ＢＣＭＡ及び／又は他のバイオマーカーレベル

第１相及び第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞（例えば、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の血中及び骨髄中のベクターコピー／ｍＬ）；Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞サブセット組成及びクローン性；ＣＲＳマーカー：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）

被験者集団及び数：確定された再燃性／難治性ＭＭを有する成人。最大約１２０名の被験者が、第１相で計画される。約１００名の評価可能な被験者が、第２相で治療される。

研究設計
試験は、複数部分として、第１相、非盲検、単回漸増用量（ＳＡＤ）段階；第１相、複数回用量、サイクル投与段階；第１相、レナリドマイド又はリツキシマブとの併用投与段階；及び第２相、非盲検、有効性、及び安全性段階を、再燃性／難治性ＭＭを有する成人被験者で実施される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞投与で予想されるタイプの急性緊急事象を管理するリソースを有する、腫瘍学対象及び幹細胞／骨髄移植の管理に経験のある施設のみが、この試験に参加するために選択される。安全委員会は定期的に会合し、試験全体を通してデータをレビューする。

プロトコルの登録基準を満たす被験者は、試験での登録に適格であろう。被験者が登録した後、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲＴｙｒｉｎ－Ｔ細胞を生成する製造施設に送られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るために白血球アフェレーシスが行われる。その後、細胞は治験施設に戻され、標準化学療法ベースのコンディショニングレジメン後、以下に説明するように被験者に投与される。

第１相－試験の第１相は、最大約１２０名の成人被験者における、非盲検、多施設、単回漸増用量（ＳＡＤ）、複数コホート試験；複数回用量サイクル投与コホート試験；及び併用投与試験からなる。試験の第１相は、用量漸増コホートの３＋３設計に従い、各コホートについて３名の被験者がＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞を投与されるように計画される（表１）。安全委員会は、その用量レベルで観察された結果を更に評価するために、コホートに追加の被験者を登録することを勧告し得る。最初の２コホートの各々について、最初の３名の被験者の投与は交互に行われる。グレード３関連毒性、ＣＲＳ、又はＤＬＴが報告された場合、安全委員会はデータをレビューし、次の被験者に進めるか決定する。安全委員会は、各コホートの終わりにデータをレビューして、次のコホートへの進行を決定する。安全委員会の裁量で、第３のコホートで開始し、各コホートにおける第１及び第２の被験者の投与が交互に行われる。

ＤＬＴは、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の制御不能な増殖を含み、以下の例外によって最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１注入後の最初の２８日以内に発症した基礎疾患又はリンパ枯渇化学療法レジメンに帰することができない、少なくともＰ－ＢＣＭＡ－１０１に関連している可能性がある任意の米国国立がん研究所－有害事象共通用語規準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）（ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ）≧グレード３の事象として定義される。
最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入から２８日以内に解消する好中球減少熱を伴うか若しくは伴わないグレード３又は４の好中球減少症
グレード３の発熱
血小板減少症による出血の有無にかかわらず、最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入から２８日以内に解消する、グレード３又は４の血小板減少症
グレード３又は４の貧血及びリンパ球減少症
グレード３又は４の低ガンマグロブリン血症
脱毛症
医療処置に２４時間以内に応答するグレード３又は４の吐き気、嘔吐、又は下痢
標準的な抗ヒスタミン薬ベースの療法を伴う細胞投与の６時間以内にグレード２以下に可逆的である、細胞注入の２時間以内に発生する（細胞注入に関連）即時型過敏反応（発熱、発疹、気管支痙攣）
２８日以内にグレード２未満に回復するグレード３の脳症
１４日以内に解消するリー基準（Ｌｅｅ，２０１４）によるグレード３のＣＲＳ
１４日以内に≦グレード２に回復するグレード３の非血液学的検査異常
７日以内に≦グレード２に回復するグレード４の非血液学的検査異常

１．ＭＴＤ－治療した被験者の６名中１名以下がＤＬＴを示す最高用量
３＋３用量漸増は、以下のように実施され、安全委員会は各コホートの最後にデータをレビューして結果を決定する。コホート１で開始して、少なくとも３名の被験者がコホートで投与される。最終用量後２８日目までＤＬＴが最初の３名の被験者で観察されない場合、漸増は次のコホートに進め得る。最初の被験者３名のうちの１名でＤＬＴが観察された場合、少なくとも３名の追加の被験者がこの用量レベルで治療される。それ以上のＤＬＴが観察されない場合、漸増が進められ得る。被験者３名又は６名のうち２名以上でＤＬＴが観察された場合、ＭＴＤは次に低い用量レベルであると考えられ、更なる登録はより低い用量レベルで行われるか、又は中間の用量レベルが安全委員会の裁量で試験され得る。コホート１で２名以上の被験者がＤＬＴを経験した事象では、安全委員会は入手可能なデータをレビューした後、同じ３＋３拡大規則によってコホート－１で３名の被験者に投与することを選択し得る。２名以上の被験者がコホート－１でＤＬＴを経験した事象では、安全委員会は、安全性及び有効性のデータを考慮して、リスク対利益を評価し、３名の被験者を同じ３＋３拡大規則を用いてより低い用量で投与するか、又は試験を中止するかを選択し得る。

提唱された用量（細胞Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１個／ｋｇ／用量）は、
コホート－１：０．２５×１０^６
コホート１：０．７５×１０^６
コホート２：２×１０^６
コホート３：６×１０^６
コホート４：１０×１０^６
コホート５：１５×１０^６を含む

追加の被験者が、コホートからの安全性及び有効性データに基づいた安全委員会の指示でそのコホートで投薬されて、そのコホートからＰ－ＢＣＭＡ－１０１の効果を更に評価し得るが、ただし用量はＭＴＤを超えない。全体的なＭＴＤを結論付けずにコホート５が完了した場合、安全委員会は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の５～１０×１０^６個／ｋｇの増分で、更なる漸増コホートを評価することを選択し得る。

第１相－サイクル投与：試験の第１相サイクル用量投与部分では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回投与が、各々２週の２サイクル（コホートＡ及びコホートＣ）又は３サイクル（コホートＢ）で静脈内投与される。投与される総用量は、単回用量漸増中に決定される≦ＭＴＤで開始する３＋３設計に従う。コホートＡ及びＢの両方における第１のサイクルでは、総用量の１／３が投与される。コホートＡでは、総用量の最大２／３が第２のサイクルで投与される。コホートＢでは、総用量の最大１／３が第２のサイクル及び第３のサイクルの各々で投与される。コホートＣでは、総用量の最大２／３が第１のサイクルで投与され、総用量の最大１／３が第２のサイクルで投与される。単回投与に関する記載と同じ３＋３用量漸増及び／又は漸減規則を利用する。これらの手順は、セクション１５．５に詳述されている。

第１相－併用投与：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は承認された療法：レナリドマイド（コホートＲ及びコホートＲＰ）及びリツキシマブ（コホートＲＩＴ）と組み合わせて投与される。投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の用量は、用量漸増中に決定される５ＭＴＤから開始する３＋３設計に従う。単回投与に関する記載と同じ３＋３用量漸増及び／又は漸減規則を利用する。これらの手順は、セクション１５．６に詳述されている。

第２相－試験の第２相は、再燃性及び／又は難治性ＭＭを有する約１００名の成人被験者における非盲検、多施設試験である。被験者は、細胞６～１５×１０^６個／ｋｇの総用量を受ける（第１相で決定された予定に従う）。

試験来院－第１相及び第２相で治療された被験者は、安全性、耐容性、及び応答（骨髄腫の病期分類）の一連の測定を受ける。これらの測定値は、スクリーニング、登録、又はベースライン来院、及びコンディショニング化学療法期間で取得される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与期間並びに第１相及び第２相の両方のフォローアップ来院は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与後１０日目、２、３、４、６、８週目、３、４、５、６、７、８、９か月目、その後最大２４か月間３か月毎である。このプロトコルを完了又は離脱した後、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受けている同意している被験者は、長期安全性を評価するために、最後の投与後に合計１５年間の継続的なフォローアップを可能にする別のプロトコルに登録すべきである。

スクリーニング来院－同意した被験者は、スクリーニング来院を行って適格性を決定する。全ての組み入れ基準を満たし、除外基準のいずれも満たさない被験者は、登録及び白血球アフェレーシスで再来院する。

登録来院－適格な被験者は、登録のために再来院し、白血球アフェレーシスの前に収集しなければならない試料及び測定を提供する。登録評価は、白血球アフェレーシスの１４日前（±３日）に実施されるか、又は医療モニターの承認を有するべきである。

白血球アフェレーシス来院－登録する適格な被験者は、再来院して、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１製造のためのＰＢＭＣを得る白血球アフェレーシスを受ける。この来院は、スクリーニング来院の約２８日以内に生じるべきである。製品が製造されると、被験者は併用療法（該当する場合）、コンディショニング化学療法、及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞投与期間のために白血球アフェレーシス来院の約４週間後に再来院する。放出基準を満たすＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が白血球アフェレーシス試料から製造できない場合、２回目の白血球アフェレーシス及び製造が試みられ得る。２回目の試みも失敗した場合、被験者は試験から離脱し、試験治療を受けていないとみなされる。

白血球アフェレーシス来院後、コンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞投与期間の前に急速な疾患進行を経験した被験者は、治験責任医師の裁量でサルベージ療法が投与され得る。サルベージ療法は、必要でない限り使用すべきではなく、治験責任医師の裁量で、被験者の病歴によって決定される（以前に使用された薬剤が好ましく、医療モニターの承認を必要とする）。被験者がサルベージ療法を受ける場合、コンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞投与期間は、サルベージ療法の最後の治療日から少なくとも２週間又は５半減期後に予定されるべきであり、被験者は登録基準（測定可能なＭＭに関するものを含む）及び併用薬に関するセクション４及び６に記載される基準を満たすべきである。サルベージ療法に対する被験者の応答は、治験責任医師及び医療モニターによって評価され、被験者が治験薬を受けるのに適格であり続けるか決定する。

被験者は、放射線療法又は血漿交換療法を受けることが許可され、試験期間を通して緩和目的で交換される。

ベースライン来院（－１２日から－６日）－製品が製造されると、コンディショニング化学療法を開始する前の週の間に、被験者はベースライン評価のために再来院し、継続する適格性を確認する。－５日前の７２時間以内に以下の評価：簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、身体検査、バイタルサイン、電解質及びマグネシウムを含む化学パネル、Ｂ細胞数及びＴ細胞数を含む血液学、凝固、循環骨髄腫／形質細胞、並びに妊娠検査（該当する場合）が繰り返されるべきである。ベースラインの骨髄腫応答評価は、コンディショニング化学療法及び併用療法を開始する７日以内に行われなければならない。骨髄及び腫瘍のベースライン新鮮試料は、適格性を確認するために使用されず、７日の幅は被験者及び治験責任医師に融通性を提供することが意図され、新たな骨髄生検／吸引がスクリーニング中に実施され、提供された場合、これはベースライン来院中に繰り返すことを必要としない。

コンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞投与期間－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入を投与する前に、被験者は３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド及び３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンのコンディショニングリンパ球枯渇化学療法レジメンを受け、各化学療法剤は、連続した３日間（－５日から－３日まで）毎日静脈内投与される。被験者は、コンディショニング化学療法の開始時に引き続き参加基準を満たしているか、又は医療モニターの承認を得ているべきである。コホートＲ、コホートＲＰ、及びコホートＲＩＴの被験者について、併用療法は、適用可能日のコンディショニング化学療法の前に投与されるべきである。

リンパ球枯渇化学療法レジメンに続く２休息日後、被験者は約５～２０分かけて静脈内投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１が投薬される（０日目）（被験者はアセトアミノフェン及びジフェンヒドラミンを前投薬されるべきである）。ＣＡＲ－Ｔ療法で行われた前試験は、治験薬投与の３～７日以内に生じる毒性ピークを認めている。試験被験者は、注入中及び注入後、並びにその後約７日間、綿密に監視される。この観察期間には、全ての被験者におけるＣＲＳなどのＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞関連毒性の出現を含む、一連のＡＥの評価が含まれる。ＣＲＳは、リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類される。ＡＥのグレード分類及び管理に関するガイダンスは、このプロトコルのセクション８及び試験参考マニュアル（Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ）に見出され得る。重大なＰ－ＢＣＭＡ－１０１関連毒性におけるリミデュシドの使用に関するガイダンスは、セクション１５．３及び試験参考マニュアルに見出され得る。

治験責任医師が個々の患者のリスクに基づいて適切であると判断した場合、被験者はＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与のために入院が認められ得る。入院は要求されないが、被験者はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の最後の投与後約１４日間、病院の５０マイル以内に留まり、ＣＲＳの症状又は発熱などの神経毒性の場合に入院のために評価される。入院した場合、被験者は治験責任医師によって安定していると評価されるまで退院しない。被験者は、リンパ球枯渇化学療法中のＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与前、又は治験責任医師が適切と考える上記の基準が満たされた後、入院患者として維持され得る。

フォローアップ来院：１０日目、２、３、４、６、８週目、３、４、５、６、７、８、９、１２、１５、１８、２１、及び２４か月目。被験者は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の最後の用量後に定期的なフォローアップのために再来院し、イベントの予定に特定されている安全性、耐容性、及び抗骨髄腫応答の一連の評価を受ける。

反復投与：被験者の疾患が進行したときに十分なＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が製造から残存している場合、安全委員会の承認で、追加の細胞が、用量制限毒性評価を正常に完了している最高用量レベルまで投与され得る。追加のＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞注入を受けるために、被験者は新たな被験者識別番号が割り当てられ、最初の投薬のために記載された全ての適格基準を満たさなければならず、同じスクリーニング、登録、コンディショニング化学療法手順、及び白血球アフェレーシスを除くフォローアップ手順を受ける。再治療の手順は、セクション１５．４に概説されている。

安全性モニタリング：治験責任医師及び治験依頼者の臨床代表者で構成される安全委員会が設立され、全ての被験者及び各コホートについてデータを定期的にレビューして、用量の漸増及び登録を決定する。

組み入れ基準：
１．書面によるインフォームドコンセントに署名していなければならない。
２．年齢≧１８歳の男性又は女性。
３．初期診断でＩＭＷＧ基準によって定義される活動性ＭＭの確定された診断を有さなければならない（Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１４）。
４．以下の基準のうちの少なくとも１つによって定義される測定可能なＭＭを有さなければならない。
第１相：
血清Ｍタンパク質：０．５ｇ／ｄＬ（５ｇ／Ｌ）以上、
尿中Ｍタンパク質：２００ｍｇ／２４時間以上、
血清遊離軽鎖（ＦＬＣ）アッセイ：血清ＦＬＣ比が異常である場合、関与するＦＬＣレベルが１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）以上、
骨髄形質細胞：総骨髄細胞の＞３０％、又は他の測定可能な骨疾患（例、ＰＥＴ又はＣＴによって測定可能な形質細胞腫）（医療モニターの承認を伴う）
第２相：
血清Ｍタンパク質：１．０ｇ／ｄＬ（１０ｇ／Ｌ）以上、
尿中Ｍタンパク質：２００ｍｇ／２４時間以上、
血清ＦＬＣアッセイ：血清ＦＬＣ比が異常である場合、関与するＦＬＣレベルが１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）以上
５．以下で定義されるように、再燃性／難治性ＭＭを有さなければならない、
第１相：
少なくとも３つの前療法ラインを受け、プロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤（ＩＭｉＤ）が含まれていなければならないか、又は
プロテアソーム阻害剤及びＩＭｉＤに対する「二重難治性」の場合、少なくとも２つの前療法ラインを受け、これらの薬剤による治療の６０日以内に進行として定義される。
第２相：
プロテアソーム阻害剤、ＩＭｉＤ、及びＣＤ３８標的化療法を含まなければならない少なくとも３つの前療法ラインを、三重組み合わせの形態で前ラインのうちの少なくとも２つによって受け、ＰＤが最善応答でない限り、各ラインの≧２サイクルを受けており、かつ
最新の療法ラインに難治性であり、かつ
ＡＳＣＴを受けているか、又はＡＳＣＴの候補ではない。
注：導入療法、自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）、及び維持療法は、進行を妨げずに連続して投与される場合、単一ラインとみなされるべきである。
６．スクリーニング時から試験全体を通して避妊を実施する意思がなければならない（出産の可能性のある男性及び女性の両方）。
コホートＲ、ＲＰ、又はＲＩＴの女性は、治療を開始する４週前に始めて、治療中、用量中断中、並びにレナリドマイドの中止後４週間及びリツキシマブの最終用量後１２か月継続して、性交を継続的に控えるか、又は信頼性のある避妊のうちの２つの方法を使用することを約束しなければならない。
コホートＲ又はＲＰの男性は、精管切除が成功している場合でも、レナリドマイドを服用している間、及びレナリドマイドを中止した後に最大４週間、生殖能力のある女性と性的に接触する間は常にラテックス又は合成コンドームを使用しなければならない。レナリドマイドを服用している男性患者は、精子を提供してはならない。
７．スクリーニングで血清妊娠検査が陰性、及びリンパ球枯渇化学療法レジメンを開始する前の３日以内の尿検査が陰性でなければならない（出産の可能性のある女性）。
コホートＲ及びＲＰの女性被験者は、レナリドマイドを開始する前に、２回の妊娠検査が陰性でなければならない。第１の検査は、被験者がレナリドマイド療法を開始する前の１０～１４日以内に、２回目の検査は２４時間以内に実施し、そして最初の１か月間は毎週、その後は月経周期が規則的な女性では毎月、月経周期が不規則な女性では２週間毎に実施しなければならない。
８．自己幹細胞移植が行われた場合、少なくとも９０日後でなければならない。
９．以下に定義される（又は医療モニターの承認）、適切な生体器官機能を有さなければならない。
コッククロフト・ゴールト式を使用して計算され、透析に依存しない血清クレアチニン＜２．０ｍｇ／ｄＬ及び推定クレアチニンクリアランス＞３０ｍＬ／分。
絶対好中球数＞１０００／μＬ及び血小板数＞５０，０００／μＬ（骨髄形質細胞が細胞性の＞５０％である場合、＞３０，０００／μＬ）。
投与量コホートに基づいて標的細胞用量を得るために推定される適切な絶対ＣＤ３数（第２相：絶対リンパ球数＞３００／μＬ）
ヘモグロビン＞８ｇ／ｄＬ（輸血及び／又は成長因子補助は許容される）。
血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）＜３×正常の上限、及び総ビリルビン＜２．０ｍｇ／ｄＬ（分子的に記録されたギルバート症候群の病歴がない場合）。
左心室駆出率（ＬＶＥＦ）＞４５％。ＬＶＥＦ評価は、登録の４週間以内に実施されていなければならない。
１０．ＮＣＩ ＣＴＣＡＥバージョン４．０３基準又は被験者の以前のベースラインに従って、末梢神経障害を除いて、以前の治療による毒性からグレード＜２に回復していなければならない。
１１．０～１の米国東海岸がん臨床試験グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）（ＥＣＯＧ）のパフォーマンスステータスを有さなければならない。

除外基準：１．妊娠中又は授乳中である、２．不十分な静脈アクセス及び／又は白血球アフェレーシスに対する禁忌を有する、３．活動性溶血性貧血、形質細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経障害、器官肥大症、内分泌障害、モノクローナルタンパク質、及び皮膚変化）、播種性血管内凝固症候群、白血球停滞、又はアミロイドーシスを有する、４．非転移性基底細胞又は扁平上皮皮膚がんなどの低リスクの新生物を除き、ＭＭに加えて、活動的な第２の悪性腫瘍（少なくとも５年間無病ではない）を有する、５．乾癬、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチなどの活動性自己免疫疾患を有する（医療モニターが、疾患が活動性で自己免疫性であるか決定する）、６．脳卒中、てんかんなどの重大な中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の病歴を有する（医療モニターが重大か判断する）、７．活動性全身感染症を有する（例えば、発熱を生じるか、又は抗微生物治療を必要とする）、８．Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）感染症、あるいはいずれかの免疫不全症候群を有する、９．ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＹＨＡ）クラスＩＩＩ又はＩＶの心不全、不安定狭心症、又は心筋梗塞若しくは重大な不整脈（例えば、心房細動、持続性［＞３０秒］心室性頻脈など）の病歴を有する、１０．治験責任医師又は医療モニターの見解で、プロトコルへの安全な参加及び／又はその遵守を妨げる（適切な白血球アフェレーシス、コンディショニング化学療法、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞投与のために資格がないか、又はそれらを受けることができない可能性が高いことを示す病状又は検査所見を含む）であろう、いずれかの精神医学的又は医学的障害（例えば、心血管、内分泌、腎臓、胃腸、泌尿生殖器、免疫不全、又は肺障害）を有する、１１．前遺伝子療法又は遺伝子改変細胞免疫療法を受けていた（又は医療モニターの承認を受けている）。被験者は、抗骨髄腫治療に関連して、遺伝子改変していない自己Ｔ細胞又は幹細胞を受けていた可能性がある、１２．コンディショニング化学療法の開始時の２週間又は５半減期（どちらか長い方か、又は医療モニターの承認を有する）以内に抗がん薬を受けている、１３．白血球アフェレーシスの開始時の２週間以内に免疫抑制薬をうけており、かつ／又は試験中にそれらを必要とすることが予想される（医療モニターは、医薬品が免疫抑制とみなされるか決定する）。一般に、必須ではない全ての医薬品（サプリメント、ハーブ薬などを含む）は、免疫抑制効果が認められない可能性があるため、白血球アフェレーシスの２週間前からＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与の２か月後まで中止すべきである、１４．≧５ｍｇ／日のプレドニゾン又は同等の用量の別のコルチコステロイドの全身コルチコステロイド療法を、必要な白血球アフェレーシスの２週以内、又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与の１週間若しくは５半減期（いずれか短い方）以内のいずれで受けているか、あるいは試験の過程でそれが必要になると予想される。（局所及び吸入ステロイドは許可される。全身性コルチコステロイドは、試験固有のガイダンス外で、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を受けた後は禁忌である）、１５．骨髄腫のＣＮＳ転移又は症候性ＣＮＳ併発（軟髄膜がん腫症、頭蓋神経障害、又は腫瘤病変、及び脊髄圧迫を含む）を有する、１６．この試験で使用される薬剤のいずれかに対する重度の即時型過敏症反応の病歴を有する、１７．同種幹細胞移植、又は任意の他の同種若しくは異種移植を受けた病歴を有するか、９０日以内に自己移植を受けている、１８．予防的抗凝固としてアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）（３２５ｍｇ）を毎日服用できない。ＡＳＡに耐容でない患者は、ワルファリン又は低分子量ヘパリンを使用し得る（コホートＲ及びＲＰのみ）、１９．抗凝固に関係なく、過去６か月以内の血栓塞栓疾患の病歴（コホートＲ及びＲＰのみ）。

試験の持続期間：被験者は、この試験の最後の用量後に最大２年間追跡され、その後、同意した被験者は、最後の用量から合計１５年間のフォローアップのための長期安全性フォローアッププロトコルに移行する。

イベント予定：単回投与のイベント予定－コンディショニング化学療法によるスクリーニングについて表２、並びにイベント予定－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与及びフォローアップについて表３を参照されたい。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１による被験者の再治療に関するイベント予定は、表８及び表９に記載されている（セクション１５．４を参照）。リミデュシド治療について、表７のイベント予定を参照されたい。サイクル投与コホートの被験者におけるイベント予定は、表１０、表１１、表１２、及び表１３に記載されている（セクション１５．５を参照）。併用投与コホートの被験者におけるイベント予定は、表１４及び表１５に記載されている（セクション１５．６を参照）。

投与を休止するか又は試験を中止するための基準：試験で定義されたＤＬＴ又は任意の治療に関連した死亡が発生した場合、新たな被験者の投与は、安全委員会が会合し、事象をレビューし、その後の計画を決定するまで休止され、試験を中止すること、その後の用量レベルを低下させること、追加の安全手順又は試験修正を制定すること、計画されたとおりの試験又はイベントに適切な他の手段を継続することを含み得る。上記のように、２名以上の被験者が第１相中のコホートでＤＬＴを有し、発生率≧１０％の≧グレード４若しくは発生率≧３０％の≧グレード３のＣＲＳ、又は治療された＞１０名の患者で第２相における対応する用量レベル以下での神経毒性を有する場合、その用量レベルはＭＴＤを超えており、いかなる更なる投与も、より低い用量レベルで行われる。

統計的方法論：人口統計学的及びベースライン特性、安全性、並びに有効性データは、適切な記述統計量を使用して要約される。データ分析は、用量コホート毎に提供され、その上、必要に応じて全ての被験者を組み合わせて提供される。平均、中央値、標準偏差、及び範囲を含む記述統計量が、連続変数について計算され、カテゴリデータが、数値及びパーセンテージを使用して要約される。応答率エンドポイントでは、点推定及び両側二項９５％信頼区間が計算される。イベントまでの時間変数は、カプランマイヤー法を使用して要約される。

治療発生ＡＥ（ＴＥＡＥ）は、コホート毎に被験者の数及びパーセンテージを使用して、組み合わされた全ての被験者について要約される。ＴＥＡＥはまた、重症度及び関係性によって要約される。併用医薬品は、用量コホート毎に被験者の数及びパーセンテージを使用して要約される。

バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）測定、及び臨床検査結果は、コホート毎に観測された値及びベースライン値からの変化について記述統計量を使用して要約される。臨床検査結果はまた、コホート毎に正常範囲（未満、以内、又は超）と比較して要約される。

試験の第１相部分は、ＤＬＴの発生率が３３％未満になる用量を決定することを目的とした用量コホートの標準的な３＋３設計である。したがって、最大１２０名の被験者を登録して、用量漸増、サイクル投与、及び併用投与中に被験者６名の１８コホートの可能性、並びにＤＬＴの完了前に中止する者と交換して、コホートにおける結果を更に評価するために登録され得る被験者を含み得る。

試験の第２相部分では、応答率エンドポイントを試験して、最近承認された標準治療薬ダラツムマブを用いてｐ＜０．０５で得られた≦３０％の応答率を除外する。イベントまでの時間変数は、カプランマイヤー法を使用して要約される。１００名の被験者サンプルを用いて、治験の第２相部分は、９０％の検出力を有し、３０％の応答率に対して１５％パーセントポイントの改善を検出する。この検出力計算は、片側有意水準０．０５の二項比率に関する直接検定に基づいている。３５名の被験者が登録され、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受け、４か月間フォローアップされるか、又は４か月フォローアップ前に進行すると、無益性分析が行われる。この分析セットは、無益性分析セット（ＦＡＳ）と呼ばれる。無益性分析では、ＦＡＳで観察されたＢＯＲの比率に基づいて、１から条件付検出力（ＣＰ）を減じた値に等しい無益性指数（ＦＩ）を使用する。ＦＩが０．８０を超える場合（つまり、ＣＰが０．２０を下回る場合）、試験は中止され得る。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の追加注入を受ける被験者はまた、その後の全ての結果について個別のサブグループとして分析される。

実施例４－多発性骨髄腫におけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞療法
１．はじめに
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、一般に不治の致命的な疾患であり、通常は複数回の再燃及び再発の経過を生じる。現在利用可能な治療法は不十分であり、効果的で永続的なＭＭ療法における満たされていない必要性が存在し続けている。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）免疫療法が、ＭＭを含むがんの重要な潜在的治療アプローチとして明らかになってきている。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＢＣＭＡがＭＭ細胞で発現されることを考えると魅力的な標的であるが、非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡ発現は形質細胞及びＢ細胞サブセットに大きく制限されている。最近、ＭＭ患者における臨床データが２つの同様のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞生成物（ＮＣＩ／ＮＩＨ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ及びＢｌｕｅＢｉｒｄ Ｂｉｏ ｓｔｕｄｉｅｓ）を使用して公表されており、このアプローチの安全性及び有効性を実証している（Ａｌｉ，２０１６、Ｃｏｈｅｎ，２０１６、Ｂｅｒｄｅｊａ，２０１６）。インビボ及びインビトロ試験は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞がＢＣＭＡ＋腫瘍株に高い親和性及び特異性で結合し、頑強な脱顆粒化及び細胞傷害性をもたらすことを示している。利用可能な前臨床及び臨床データ、並びにこの構築物の潜在的な安全性及び有効性の利点と併せると、満たされていない医学的必要性は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を再発性又は再燃性ＭＭを有する患者で評価する根拠を提供する。以下の情報はまた、治験責任医師の小冊子に詳しく記載されている。

１．１多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、治療可能であるが、通常は不治の形質細胞悪性腫瘍であり、しばしば攻撃的で致死的な臨床的経過をたどる。２０１５年に米国で発生した約２６，８５０人のＭＭの新規症例が、約１１，２４０人の死亡とともに推定されている。診断は、人生の６０代及び７０代で最も一般的である（Ｈｏｗｌａｄｅｒ，２０１５）。

ＭＭの顕著な特徴は、血清タンパク質電気泳動で「Ｍスパイク」を生じるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の過剰な生成を伴う、骨髄における形質細胞のモノクローナル増殖である（Ｒａａｂ，２００９）。この疾患の臨床的特徴は、悪性クローンによる骨髄浸潤、高レベルの循環モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又は遊離軽鎖、抑制された免疫、並びに末端器官損傷から生じる。ＭＭの典型的な兆候及び症状には、貧血、血小板減少症による出血、白血球減少症及び低い抗体産生による頻繁な感染症、骨病変及び骨折による骨痛、並びに高レベルのＭタンパク質蓄積及び高カルシウム血症による腎障害が含まれる。

ＭＭの病態生理の理解及び新規治療薬の導入における最近の進歩は、この疾患の管理に貢献しており、生存率の劇的な改善が過去２０年間に認められた。生存期間の中央値は、１９８０年代の約２年から、今日では最大５～６年以上に増加した（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，２０１０）。治療レジメンは、２～３つの薬剤からなる傾向があり、ほとんど全ての患者は、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ）及び免疫調節剤（ＩＭｉＤ）（レナリドマイド、ポマリドミド、サリドマイド）を、それらの疾患の治療過程の初期及び後期の両方で受ける。加えて、適格な患者は、自己造血幹細胞移植及び／又は頻度は低いが、同種造血幹細胞移植を受け得る。２０１５年には、いくつかの新規治療法が米国で承認され、２つのｍＡｂ（ダラツムマブ及びエロツズマブ）、汎ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤（パナビノスタット）、及び経口プロテアソーム阻害剤（イキサゾミブ）が含まれる。これらの最近の承認の長期的な影響は引き続き決定されるべきであるが、それらは再燃性及び／又は難治性の設定では治癒を生じないと思われ、ほとんどの患者は最終的に再燃して死亡する（Ｋｕｍａｒ，２００８）。再燃する腫瘍は、再燃するたびにより攻撃的に再発する傾向がある。

治療に対する応答は持続性が低く、その後の疾患の進行は、生存期間の短縮に関連する治療難治性疾患をもたらす（Ｋｕｍａｒ，２０１２）。

１．２多発性骨髄腫におけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞療法の理論的根拠
１．２．１．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞療法
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、自己センチリンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞療法であり、ＣＡＲＴｙｒｉｎ Ｔ細胞と称される。これは、細胞表面抗原ＢＣＭＡを発現するＭＭ細胞を標的とし、標的化細胞に細胞傷害性効果を向けさせるように設計された生物学的生成物である。（Ｔａｉ，２０１５）。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の作用メカニズムは、他のＣＡＲ－Ｔアプローチと同じである（例えば、Ａｌｉ，２０１６、Ｂｅｒｄｅｊａ，２０１６）。各患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、白血球アフェレーシスによって採取され、次いでＣＡＲＴｙｒｉｎ（すなわち、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）ＤＮＡ改変システム）を有するＰＢトランスポゾンをコードするＤＮＡプラスミドと一緒にトランスポザーゼリボ核酸（ＲＮＡ）のエレクトロポレーションを介して、その個々の患者のＰＢＣＭＡ－１０１治験薬を生成し、続いて培養／増殖するために使用される。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、３つの主要な構成要素である抗ＢＣＭＡセンチリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性遺伝子、及び誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）ベースの安全スイッチ遺伝子を含むように設計される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１６）。

ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現カセットは、ＣＤ８ａシグナル／リーダーペプチド、ＣＤ８ａヒンジ／スペーサー、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、細胞内４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖シグナル伝達ドメインに融合した細胞外ＢＣＭＡ結合センチリンタンパク質をコードする。抗体ベースの単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）からなる結合ドメインと比較して、ＣＡＲＴｙｒｉｎ結合ドメインは完全なヒトタンパク質であり、より小さく、より安定しており、免疫原性が潜在的に低いが、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の認識及び殺傷を可能にする同様の抗原結合特性を有する。この構築物はまた、Ｔ細胞枯渇を回避するように設計される。

ＤＨＦＲ耐性遺伝子は、ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現性Ｔ細胞のエクスビボ選択のためにＴ細胞の製造中に使用され、効力及び安全性を高める目的で、より均質な生成物を産生する。

安全スイッチは、合成二量体化剤であるリミデュシドの静脈内投与によって、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の迅速な除去を可能にするように設計された、ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞には認められない追加の安全機能である（セクション１５．３を参照）。

２０１９年７月１４日の時点で、３６名の被験者がＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞で治療されており（第１相で３４名、第２相で２名）、そのうちの３名がＰ－ＢＣＭＡ－１０１の第２の投与を受けている。全ての第１相用量漸増コホート（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞１～５：０．７５～１５×１０^６個／ｋｇ／用量）は、最高用量レベルで報告された良好な安全性及び有効性を伴って成功裏に完了していた。ＤＬＴは報告されておらず、新規被験者の登録がコホートの拡大で続いており、追加のコホートが評価されるべきであることを示唆する。患者は多くの前治療を受けており（３～１８例の前治療）、ほとんどがＩＭｉＤ、プロテアソーム阻害剤、ダラツムマブ、及びＡＳＣＴに失敗していた。患者は、総Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞４８～１５４５×１０^６個／ｋｇで治療された。循環Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が、ＰＣＲによって患者の血液中で検出されており、増殖は２～３週でピークに達した。コホート２～３で到達した閾値レベルを超えると、応答が患者に、より広いピークで生じるように思われ、反復又は分割した投与で追加の利益があり得ることを示唆する。重要性は不明であるが、抗ＣＡＲ－Ｔ抗体の兆候がいくらかの患者で示されている。最も一般的なＴＥＡＥ（＞３０％）は、好中球減少症、ＷＢＣ減少、血小板減少症、貧血、吐き気、便秘、及び発熱性好中球減少症だった。４名の被験者のみがＣＲＳの症例を有し（被験者１名は細胞２×１０^６個／ｋｇでグレード２を有し、被験者３名は細胞１５×１０^６個／ｋｇでグレード２を有した）、ＣＲＥＳの１症例（細胞６×１０^６個／ｋｇでグレード２、一過性錯乱）が報告されていた。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の反復投与も十分に耐容された。第１相の被験者のうちの２９名が、ＩＭＷＧ基準による奏効について評価可能であり、少なくとも１つの骨髄腫奏効評価を完了しており、これまでに１７名が奏効を示した（細胞約０．７５×１０^６個／ｋｇが１／２、細胞約２×１０^６個／ｋｇが５／７、細胞約６×１０^６個／ｋｇが４／９（＋２ＭＲ）、細胞約１０×１０^６個／ｋｇが３／４（＋１ＭＲ）、及び細胞約１５×１０^６個／ｋｇが４／７）。これらの結果に基づいて、試験は第２相の部分で更に拡大し、安全性及び有効性を用量レベル３～５で更に特徴付けした。

１．２．２．ＣＡＲ－Ｔ細胞における治療標的としてのＢＣＭＡ
骨髄腫は、それを養子Ｔ細胞療法による治療に対して好適にするいくつかの特徴を有する。第一に、骨髄腫は主に骨髄の疾患であり、ＣＤ１９を標的とする養子Ｔ細胞療法は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）などの骨髄優勢疾患で特に成功してきている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，２０１３）。第二に、自己幹細胞移植は骨髄腫の標準治療であり、リンパ球枯渇は養子Ｔ細胞療法の有効性を高め得る（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，２０１１、Ｐｅｇｒａｍ，２０１２）。第三に、骨髄腫における他の全ての治療法と異なり、同種ＳＣＴは治癒の可能性があるが、移植に関連した毒性、死亡率、患者の適格性、及び好適なドナーの利用可能性によって、その適用は制限される。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、かかる抗腫瘍有効性を達成する、より安全な方法である可能性を有する（Ｍｉｌｏｎｅ，２０１５）。

標的としてのＣＤ１９の有用性は、それがＭＭの悪性形質細胞で稀にしか発現されないという事実によって制限され、したがって、腫瘍細胞によって発現されるが、正常組織によって発現されない抗原に特に注意を払って、他の抗原が探索されてきている。１つの魅力的な標的は、ＢＣＭＡである。この標的を選択する理論的根拠は、ＢＣＭＡがＭＭ細胞で検出されるが、非悪性細胞の中でも、ＢＣＭＡの発現は形質細胞及びＢ細胞のサブセットに大きく限定され、したがって標的に対するものであり、腫瘍外効果を有する可能性が低いものであり得る。

ＭＭ腫瘍細胞認識は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の表面に発現されたＢＣＭＡ特異的ＣＡＲが、ＭＭ腫瘍細胞の表面に発現されたＢＣＭＡ抗原に結合するときに発生する。シグナル伝達及び活性化は、ＣＡＲ内にコードされる細胞質内シグナル伝達ドメイン４－１ＢＢ及びＣＤ３～によって媒介される。活性化は、グランザイム及びパーフォリンのＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性放出によって標的とされるＭＭ腫瘍の直接的な細胞傷害性をもたらすことができる。腫瘍殺傷はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの放出を通した免疫系の他の構成要素の活性化によって媒介することができる。腫瘍再燃に対する長期の根絶及び予防は、即時の腫瘍切除、又は最初の腫瘍応答後に残存する長期記憶ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかによって提供され得る。したがって、Ｔ幹細胞記憶表現型（Ｔｓｃｍ）及びＴ中央記憶表現型（Ｔｃｍ）のものであるＣＡＲ－Ｔ細胞を有することは、特に利点があり得る。加えて、ＣＡＲ－Ｔ媒介性腫瘍細胞溶解中の非ＢＭＣＡ腫瘍関連抗原の放出は、「エピトープ拡大」と称される現象である操作されていない適応免疫系の操作されていない腫瘍特異的細胞のプライミング及び／又は再活性化をもたらし得、長期的な根絶及び腫瘍再燃に対する腫瘍の防止も促進し得る。

Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．によって実施された非臨床試験（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，２０１３） では、抗 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害性、及びインビボ腫瘍根絶を含む、特異的な抗ＢＣＭＡ機能を示した。重要なことに、抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、初代ＭＭ細胞を認識して殺傷した。著者らは、ＢＣＭＡはＣＡＲ発現性Ｔ細胞の好適な標的であり、抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入は、ＭＭを治療するための有望な新規戦略であると結論付けた（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，２０１３）。

再燃性／難治性ＭＭを有する対象において抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞に関する概念の最初の臨床的証明を示すデータが、国立がん研究所（ＮＣＩ）で実施された試験から公表された。患者（Ｎ＝１６）は、４用量レベルで登録され、細胞０．３×１０^６、１×１０^６、３×１０^６、及び９×１０^６個／ｋｇ体重を含んだ。奏効は用量依存的であり、部分奏効（Ｎ＝３）、非常に良好な部分奏効（Ｎ＝４）、及び厳密な完全奏効（Ｎ＝１）が含まれた。最高用量レベルで、奏効率は１００％だった。奏功期間に関するデータはまだ利用できない。耐容性は、他のＣＡＲ－Ｔ試験からの予測と一致した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞に起因する毒性は、低用量レベルで治療された患者で最小だった。その後、患者は用量レベルと相関するＣＲＳの徴候を示した。非造血器官への予期しない損傷は観察されなかった（Ａｌｉ，２０１６、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，２０１６）。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を利用した別の試験の初期結果（Ｃｏｈｅｎ，２０１６）が、最近発表されている。この試験では、６名の患者がＣＡＲ－Ｔ細胞１～５×１０８個で治療された。４名の患者が奏効を示し、最小奏効（Ｎ＝２）、非常に良好な部分奏効（Ｎ＝１）、及び微小残存病変陰性（ＭＲＤ陰性）の厳密な完全奏効（Ｎ＝１）だった。５名の患者がＣＲＳを発症し、そのうちの１名はグレード３であり、後遺症なく治療に応答した神経毒性を示した。ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖は、有効性と相関すると思われた。Ｂｅｒｄｅｊａ ｅｔ ａｌ．によって発表された第３の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ構築物の進行中の試験では、１１名の患者が３つの固定用量レベルで登録され、患者当たりＣＡＲ－Ｔ＋細胞５×１０^７個、１５×１０^７個、及び４５×１０^７個だった（患者当たりＣＡＲ－Ｔ＋細胞８０×１０^７個及び１２０×１０^７個が次回のコホートで計画される）。奏効率は印象的で用量依存的であり、部分奏効（Ｎ＝４）、非常に良好な部分奏効（Ｎ＝１）、及び厳密な完全奏効（Ｎ＝２）を含み、２名の患者がＭＲＤ陰性になった。耐容性は、他のＣＡＲ－Ｔ試験で報告されているものよりも良好だった。ＣＲＳは患者の７０～８０％で認められたが、グレード１～２に限定された。神経毒性又は他の重大若しくは予想外の毒性は、報告されなかった（Ｂｅｒｄｅｊａ，２０１６）。これらの試験における相対的に低い毒性は、最も多くの刊行物を生み出している白血病で使用される抗ＣＤ１９製品と比較して、４－１ＢＢ共刺激ドメインの使用、疾患負荷の軽減、及び／又はＴ細胞の骨髄腫細胞へのより段階的な曝露に、様々に帰されてきている。

レナリドマイド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ，２０１９）は、骨髄腫に対する顕著な活性並びに免疫系における多面的効果で知られる免疫調節イミド薬（ＩＭｉＤ）のクラスのメンバーであり、骨髄腫、骨髄異形成症候群、及びリンパ腫の治療薬として米国で承認されている（Ｍｏｒｅａｕ，２０１９、Ｆｉｎｋ，２０１５）。その直接的な抗骨髄腫特性に加えて、レナリドマイドはＰ－ＢＣＭＡ－１０１などのＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を高めることができるという仮説が立てられている。レナリドマイド治療は、ナイーブ及び幹細胞記憶Ｔ細胞の頻度を増加させ、これら２つのＴサブセットがＰ－ＢＣＭＡ－１０１製造工程に好ましい出発材料であるだけでなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞製品における改善した臨床転帰にも関連している（Ｆｏｓｔｉｅｒ，２０１８、Ｂａｒｎｅｔｔ，２０１６ａ、Ｃｏｈｅｎ，２０１９）。製造工程にレナリドマイドを直接的に含めることは、このアプローチが、生成されるＣＡＲ－Ｔ細胞の数及びエフェクター機能を増加させ得るため、提唱されていない（Ｗａｎｇ，２０１８）。したがって、アフェレーシスの前にレナリドマイド治療を含めることは、投入材料中のＴ細胞の質を改善し、続いて製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞製品を改善すると仮定されている。レナリドマイドとＣＡＲ－Ｔ細胞との同時投与は、インビトロ及びマウスモデルの両方でＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能及び全体的な抗骨髄腫活性を増強することが示されているため、提唱されている（Ｏｔａｈａｌ，２０１６、Ｗａｎｇ，２０１８、Ｗｏｒｋｓ，２０１９）。更に、レナリドマイドと抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞製品との同様の組み合わせが、少なくとも１つの他の臨床試験（ＮＣＴ０３０７０３２７）で現在探求されている。

リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，２０１９）は、ＣＤ２０＋細胞、つまりＢ細胞を枯渇させる抗ＣＤ２０抗体治療薬であり、優れた安全性及び有効性プロファイルを有し、米国で多数のリンパ腫、白血病、及び自己免疫疾患の治療のために承認されている（Ｓａｌｌｅｓ，２０１７）。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１とリツキシマブとの間には、いくつかの理由で治療上の相乗効果が期待される。ＣＤ２０発現は、おそらく多発性骨髄腫幹細胞を含む、多発性骨髄腫のサブセットにおいて十分に実証されている（Ｆｌｏｒｅｓ－Ｍｏｎｔｅｒｏ，２０１６、Ｍａｔｓｕｉ，２０１８、Ｋａｐｏｏｒ，２００８）。多発性骨髄腫幹細胞がＣＤ２０を一様に発現するかについてはいくつかの論争があるが、骨髄腫の分化は、ＢＣＭＡ－ＣＤ２０＋細胞が最終的にＢＣＭＡ＋ＣＤ２０－細胞に成熟する正常なＢ細胞の発生と並行しているという一致した意見がある（Ｊｏｈｎｓｅｎ，２０１６、Ｂｏｄｋｅｒ，２０１８）。ＣＡＲ－Ｔ細胞でＢＣＭＡ＋細胞を標的とし、リツキシマブでＣＤ２０＋細胞を標的とする組み合わせ戦略は、成熟新生物並びに再燃を引き起こし得る任意の前悪性細胞を根絶することができた。更に、リンパ球減少症はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性に寄与することが知られており、リツキシマブはこの状態を延長させることが認められている（Ｃｏｈｅｎ，２０１９、Ｙｕｔａｋａ，２０１５）。最後に、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療された多発性骨髄腫を有する患者に認められており、製品の耐久性を制限する可能性があり、内因性Ｂ細胞コンパートメントの枯渇によって臨床応答が改善され得ることを示唆する（Ｘｕ，２０１９）。

１．２．３．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１設計及び理論的根拠
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、３つの主要な構成要素である抗ＢＣＭＡセンチリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性遺伝子、及び誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）ベースの安全スイッチ遺伝子を発現するように設計される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１６）。ＭＭ腫瘍細胞の表面に発現されたＢＣＭＡ抗原のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲＴｙｒｉｎによる結合は、ＣＡＲＴｙｒｉｎがコードする細胞質内シグナル伝達ドメインによって媒介されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞内のシグナル伝達及び活性化を引き起こす。ＣＡＲＴｙｒｉｎによってコードされた固有の抗ＢＣＭＡ部分以上に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１アプローチと他のほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞との主な違いは製造工程である。

ＣＡＲ分子の発現のための自己Ｔ細胞の遺伝子改変は、一般にレンチウイルス又はγ－レトロウイルス形質導入によって行われるが、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡ改変システムと呼ばれるエレクトロポレーションベースの非ウイルス（ＤＮＡトランスポゾン）を使用して製造され（Ｎａｋａｚａｗａ，２０１３）、ＤＮＡをプラスミドから染色体に「カットアンドペースト」メカニズムを介して効率的に移動させ、ＣＡＲ－Ｔ製造を含む、ヒト遺伝子導入方法として広く使用されてきている（Ｗｏｏｄａｒｄ，２０１５、Ｆｒａｓｅｒ，１９９６、Ｓｉｎｇｈ，２０１３、Ｈｕｌｓ，２０１３）。ウイルスベースの送達と比較して、ＰＢは、より安全な挿入プロファイル（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，２０１５）、より大きな導入遺伝子容量（安全性及び有効性を高める遺伝子構成要素の送達を可能にする）、より高レベルでより安定した導入遺伝子発現（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，２０１５）、導入遺伝子発現のより長い持続期間（Ｍｏｓｓｉｎｅ，２０１３）、並びに非常に好ましいＴＳＣＭ表現型の優位性を含む、利点を提供する。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の場合、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ＳＰＢ）が使用され、これは標的ゲノムにおけるＴＴＡＡ部位へのＰＢトランスポゾンの組み込みを触媒する操作された高反応性酵素であり、より明確で安全な組み込みプロファイルを有する。レンチウイルス及びγ－レトロウイルスの遺伝子カーゴ容量は約１０～２０Ｋｂに限定されるが、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＤＮＡ改変システムは、カーゴ限度＞３００Ｋｂが実証されており、複数の有益な遺伝子の導入を可能にする。更に、レンチウイルスと比較して、ＰＢ媒介性導入は、導入遺伝子の高レベルな持続的発現を可能にする（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，２０１５）。最後に、この方法を使用したＣＡＲ－Ｔ細胞の製造は、幹細胞記憶表現型（Ｔｓｃｍ）を有する細胞の割合を増加させ、安全性及び有効性を増加させ得る。有効性は、ネズミＭＭモデル（進行性骨髄腫、並びにｄｅｌ１７ｐ及び他のＴＰ５３異常などの予後不良指標を有する患者を再現するように設計されたＭＭ．１Ｓｐ５３ノックアウト（ＫＯ）モデルを含む）における前例のない応答の持続性及び再燃腫瘍の再制御で実証されている。徐々に増殖及び分化することによって、Ｔｓｃｍ細胞は、急性有害効果の可能性を減少し得るという仮説が立てられている。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の平均で＞６０％が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１９７（ＣＣＲ７）の陽性発現を特徴とするＴｓｃｍ表現型を示したことが観察された。加えて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、抑制性受容体であるＣＤ２７９（ＰＤ－１）、Ｔｉｍ－３、及びＬａｇ－３の発現がほとんど（平均で＜１０％）陰性である（Ｂａｒｎｅｔｔ，２０１６ａ）。したがって、安全性に関する利点に加えて、ＰＢ（すなわち、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１）を使用したＣＡＲ－Ｔ細胞製造は、有効性の利点を提供し得る。

１．２．４．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１による非臨床試験のまとめ
１．２．４．１．製品候補のスクリーニング及び選択
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１における抗ＢＣＭＡ結合ＣＡＲＴｙｒｉｎは、異なるＣＡＲＴｙｒｉｎのパネルから選択された。選択は、インビトロ及びインビボの両方の前臨床試験におけるそれらの比較性能に基づいた（Ｂａｒｎｅｔｔ，２０１６ｂ）。異なるＣＡＲＴｙｒｉｎｓのパネルは、ＢＣＭＡタンパク質を特異的に認識し、様々な親和性で結合し、単量体の性質を示すことが以前に特定された異なるセンチリンを使用して構築した。これらの異なるＣＡＲＴｙｒｉｎ候補は、細胞傷害性殺傷能力の代理マーカーである脱顆粒するそれらの能力、並びに標的腫瘍細胞を直接溶解するそれらの能力を測定するインビトロ試験で、ＢＣＭＡ＋腫瘍株に対する機能的活性について評価した。これらの試験は、このプロトコルで使用されるリードＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎ分子を特定するために行われた。

１．２．４．１．１．インビトロスクリーニング
候補ＣＡＲＴｙｒｉｎを選択し、インビボ評価を支援するために、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞をＰＢ転位を使用して作製し、表現型及び機能の特性評価を行った。ＣＡＲＴｙｒｉｎは、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の表面で検出され（図１２Ａ）、再刺激で劇的に増加した（図１２Ｂ）。これらのＴ細胞の殺傷機能をインビトロで試験するために、Ｐ－ＢＭＣＡ－１０１細胞をＢＣＭＡ発現細胞と共培養し、次いで標的細胞殺傷を測定した（図１２Ｃ）。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、ＢＣＭＡ＋骨髄腫細胞株Ｈ９２９に対して強力な細胞傷害機能を示した。次に、ＢＣＭＡ＋細胞株との共培養でＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞増殖の能力を４日後に評価した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、頑強な増殖能を示し、ＣＤ４＋Ｔ細胞での増殖指数は、３．０±０．０９であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞では３．４±０．０３だった（図１２Ｃ）。これらのデータは、ＰＢ転移したＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が、細胞表面で検出可能なレベルのＣＡＲＴｙｒｉｎを発現して、ＢＣＭＡ＋標的細胞を特異的に殺傷し、ＢＣＭＡ＋細胞標的に露出されると増殖したことを示す（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１６）。

１．２．４．１．２．ＭＭ異種移植モデルにおけるインビボスクリーニング
インビボアッセイを、ＮＳＧマウスに静脈内（ＩＶ）注射したルシフェラーゼ発現性ＭＭ．１Ｓ ｐ５３ ＷＴ及びノックアウト（ＴＰ５３ＫＯ）ＭＭ細胞株を使用したＭＭ異種移植片で行い、インビボでの抗腫瘍有効性の観点から最善のＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞製品候補を決定した（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）。

ＭＭ．１Ｓ ｐ５３ ＷＴ実験では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の２用量：０．５×１０^６及び５．０×１０^６を評価した。対照動物は、Ｔ細胞を受けなかった。全てのマウスは２１日目までに有意な腫瘍量を示し、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を２２日目に注射した。いずれのＴ細胞も受けていない対照マウスは進行する腫瘍増殖を示し、ＭＭ．１Ｓ腫瘍注射後約５５～６０日に結局死亡した。これに対し、用量依存的な抗腫瘍活性が、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を注射したマウスで観察された。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞５×１０^６個／マウスの用量が最大の抗腫瘍効果を示し、マウスはＴ細胞注射後３～７日という早期に腫瘍の急速な排除を示した。生物発光イメージングによって観察された上記の結果と一致して、生存率の最大の改善もＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞で処置したマウスで観察され、５×１０^６個のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞で処置した２匹のマウスは１００日を超えて生存した。マウスの血清中Ｍタンパク質レベルも、イメージング及び生存データと一致した。実際、これらのマウスのうちの２匹では、１００日を超えてもＭタンパク質レベルは検出されなかった。腫瘍は、５９日目以降でマウスに再発したが、イメージング並びに血清Ｍタンパク質レベルの両方によって決定されるとき、最高用量レベルで処置した３匹のマウスのうちの２匹では、腫瘍は追加のＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与を伴わずにその後再度奏効した。まとめると、これらの結果は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が強い用量依存効果を、ヒトＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞株異種移植モデルで示すことを実証する。データは更に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞がマウスモデルで持続するように思われ、追加のＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与を伴わずに腫瘍再発の完全な退縮をもたらすことを示す。この独自の観察結果及び試験終了（９２日）までの奏効の全体的な持続性は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の好ましいＴｓｃｍ表現型に起因している（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１６）。

同様の結果がＭＭ．１ＳＴＰ５３ＫＯモデル（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）で観察され、このモデルは、攻撃的骨髄腫、並びにｄｅｌ１７ｐ及び他のＴＰ５３変異などの予後不良指標を有する患者を再現するためにｐ５３欠損であるように設計される。未処置群のマウスは全て５０日以内に死亡し、一方、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１処置群では、１００％のマウスが９０日目の実験終了まで生存した。多数の既存の多発性骨髄腫治療薬がこのモデルで試験され、全てがこの攻撃的腫瘍株を制御するのに失敗してきており、これは独自の結果である（私信Ｒ．Ｏｒｌｏｗｓｋｉ）。

１．２．４．２．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１前臨床毒性学
１．２．４．２．１ Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１センチリンのヒトタンパク質パネルとのインビトロ結合
インビトロでのヒトタンパク質スクリーニング技術を使用して、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１からのセンチリンの潜在的な二次標的結合を、アッセイを容易にするセンチリン－Ｆｃ融合タンパク質の形態で特定した。センチリン－Ｆｃ融合タンパク質は、４３００以上のヒトタンパク質に対する結合についてスクリーニングした。これらのヒトタンパク質の大部分は、細胞表面膜タンパク質を表し、各々がヒトＨＥＫ２９３細胞で個別に発現される。この試験は、その意図された標的であるＢＣＭＡへのセンチリン結合の高い特異性を実証した。

１．２．４．２．２．正常ヒト組織に対するＰ－ＢＣＭＡ－１０１反応性
正常ヒト組織細胞株のパネルに対するＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の潜在的な反応性を検査して、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、正常で健康なヒト組織に対していずれかの直接的な毒性を示し得るか評価した。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞を正常ヒト細胞型又はＢＣＭＡ＋ＭＭ１．Ｓ陽性対照細胞と一緒に共培養し、正常ヒト細胞型に対する潜在的なＴ細胞反応性を、発光又はフローサイトメトリーベースの読み出しを使用して評価した。９つの細胞株を試験して、ＢＣＭＡ＋ＭＭ１．Ｓ陽性対照細胞以外に反応性は観察されなかった。

１．２．４．２．３．ＭＭ１．Ｓ骨髄腫腫瘍担持ＮＳＧマウスにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の単回用量ＧＬＰ安全性及び有効性試験
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌで実施された、ＭＭ腫瘍担持雌ＮＳＧマウスにおけるＧＬＰ準拠のハイブリッド薬理学－毒物学試験の文脈において、安全性及び有効性について評価されている（図１３Ａ～Ｄ）。この試験の目的は、ヒトＭＭ．１Ｓ－Ｌｕｃ骨髄腫細胞を担持するマウスにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の抗腫瘍有効性及び安全性を単回静脈内（ＩＶ）用量後に評価し、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与後３か月まで監視することだった。雌ＮＳＧマウスをＭＭ．１ＳＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞でＩＶ移植し、１７～１９日後にＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を低用量（細胞４×１０^６個）又は高用量（細胞１．２×１０^７個）のいずれかでＩＶ投与するか、又は未処置のままにして、腫瘍量及び毒性を最大９０日間監視した。いずれのＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞も受けていないマウスは、有意な腫瘍量が発達し、予想どおり２９日目又はそれ以前に全て犠牲となり、一方、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１で処置されたマウスは、ＢＬＩ及びＭタンパク質分析によって決定されたときにそれらの腫瘍量の顕著な退行又は排除を示した。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１処置群では腫瘍がほぼ完全に消失したが、群４（高用量のＰ－ＢＣＭＡ－１０１）のマウスは、猫背の姿勢及び逆立った毛、斜視眼、脱毛、並びに変色し肥厚した皮膚／毛などを含む異種ＧＶＨＤと一致する臨床所見を示した。これらの残りの群４マウスは、７８日目又はそれ以前に犠牲となるまで生存した。対照（腫瘍のみ）マウスとは異なり、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１処置マウスは、実験の過程にわたって体重は減少しなかった。ＮＳＧマウスは、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞を欠いており、樹状細胞及びマクロファージの低下した機能を示すことが知られている。一般に、ヒトリンパ球のこの系統への移植は、ＧＶＨＤ様症候群を生じ、死をもたらす。全体として、この試験では、これらのマウスのいずれの器官においてもＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の影響に起因する可能性のある標的器官関連毒性は観察されなかった。腫瘍形成はなく、最終剖検でいかなる顕著な肉眼的又は組織病理学的所見もなかった。所見は、これらの動物のいずれかの重度の免疫無防備状態に一致するか、又はマウスへのヒトＴ細胞の投与による異種ＧＶＨＤに関連していた。予想されたように、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は投与後２９日目と９２日目にマウスで持続し、高度に未分化な記憶細胞表現型を示すように思われ、これは、この試験で観察された例外的で前例のない抗腫瘍効果も説明し得た。全体として、ＰＢＭＣＡ－１０１のＩＶ投与に起因する可能性がある、この試験で特定された他の明白な毒性又は明確な標的器官はなかった。異種ＧＶＨＤは、ヒト細胞で処置されたＮＳＧマウスで一般的に発生するため、所見は真の標的器官毒性を反映していないが、ヒト細胞によるマウスの処置に対する人工移植片対宿主応答をむしろ反映する。したがって、不耐容性用量は認められず、試験された最高用量（細胞１．２×１０^７個／マウス）が最大耐容用量であるとみなされた。ＮＯＡＥＬは、ＧＶＨＤの出現によってＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞では定義できなかったが、明確な標的器官毒性はなかった。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を用いたＦＩＨ第１相試験で提唱される開始用量は、細胞０．７５×１０^６個／ｋｇで設定される。小柄な６０ｋｇのＭＭ患者では、これは、この試験における細胞１．２×１０^７個（細胞６×１０^８個／ｋｇ）の許容可能で有効な高用量レベルよりも８００倍以上低い。

１．３．潜在的なリスク及び利益
１．３．１．利益評価
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１及び他のＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む）を用いたデータに基づいて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１が抗腫瘍効果を発揮し得ると予測することは妥当である。これは、セクション１．２のデータによって強く支持される。上記のように、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、以前の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ製品と比較して、高いＴｓｃｍ表現型の割合及びセンチリン結合ドメインなど、有効性を改善することが意図された多くの特性を有する。

１．３．２．リスク評価
この試験の参加では、被験者は遺伝子操作された自己Ｔ細胞にさらされる。リスクは、同様の製品を用いた臨床経験に基づいて許容される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１における潜在的な安全性の懸念は、事実上、他のＣＡＲ－Ｔ細胞製品と同じである。ＣＡＲ－Ｔ細胞試験で示される主要有害作用は、ＣＲＳ、及びそれらの意図した作用機序によるＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化に関連する症状である（サイトカインの有意な増加も有効性と相関することが報告されている）。これらの毒性の管理に関する説明及びガイドラインは、セクション６．３に提供される。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞ではまだ報告されていないが、ＣＡＲ－Ｔ細胞に関する他の理論的懸念には、１）骨髄腫腫瘍細胞の迅速な破壊を介した腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）として明白である、「対標的／対腫瘍」毒性、２）健康な組織（低ガンマグロブリン血症以外）におけるＢＣＭＡ＋非腫瘍細胞の破壊に関連する「対標的／対腫瘍外」毒性、３）ＢＣＭＡ結合ドメインとＢＣＭＡ陰性標的との交差反応の可能性による「対標的外」毒性、及び４）抗ＣＡＲ－Ｔ抗体の発生に副次的な免疫関連反応、が含まれる。これらの疑問の多くは、セクション１．２のデータで対処される。腫瘍原性の可能性は、これらの細胞の最終分化、遺伝子付加材料及びプロセスの挿入プロファイル及び特徴、並びに他のＣＡＲ－Ｔ細胞製品を受けている患者の長期フォローアップによる現在までの広範な臨床経験に基づいて、無視できるとみなされる（Ｔｅｙ，２０１４、Ｈａｃｋｅｔｔ，２０１３）別の仮説上のリスクである（Ｊｅｎａ，２０１０）。少なくとも１つの以前のＣＡＲ－Ｔ試験では、同様のＤＮＡトランスポゾンアプローチが使用され、第１相臨床試験において総ＣＡＲ－Ｔ細胞１．２×１０^９個を上回る用量で十分耐容されたことが認められた（Ｓｉｎｇｈ，２０１３、Ｈｕｌｓ，２０１３）。このプロトコルで利用される中度コンディショニング化学療法レジメンの潜在的なリスクは、これらの薬剤で典型的な、特に血球減少症、胃腸の影響、及び不妊症であると予想される。出血性膀胱炎、肺、心臓、及び神経への影響も報告されている。

この第１相試験における提唱された開始用量（ＣＡＲ－Ｔ細胞０．７５×１０^６個／ｋｇ）は、ＢＣＭＡを標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞の１つの臨床試験で報告されたもの（Ｃｏｈｅｎ，２０１６）よりも約３倍低く、最大１０倍の用量で毒性が軽度であると報告した他（Ａｌｉ，２０１６、Ｂｅｒｄｅｊａ，２０１６）をほぼ同じである。これは、マウスＧＬＰ毒物学試験における耐容性で有効な高用量レベルよりの控えめにみて８００倍低く、提唱されたＦＩＨ治験における大きな安全域を更に裏付ける。更に、マウスＧＬＰ毒物学試験の高用量Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１処置群で観察された唯一の注目すべき毒性はＧＶＨＤであり、患者の自己由来ヒト製品に関連することが予測されない毒性だった。

上記のように、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、高いＴｓｃｍ比率、小さく免疫原性の低いセンチリン結合ドメイン、及びＤＨＦＲ選択遺伝子など、安全性を高める多くの特性とともに設計された。

この試験は、潜在的なリスクに対処するいくつかの更なる手段を取り入れ、以下：Ｔ細胞用量の段階的漸増、被験者の交互登録、自己Ｔ細胞療法に関連する毒性の管理を経験した専門的学術センターにおける治療、毒性の管理に関するガイドライン、及び試験全体の安全性を評価する安全審査委員会、が含まれる。２０１９年７月１４日現在、第１相で最も一般的なＴＥＡＥ（＞３０％）は、好中球減少症、ＷＢＣ減少、血小板減少症、貧血、吐き気、便秘、及び発熱性好中球減少症だった。４名の被験者のみがＣＲＳの症例を有し（被験者１名は細胞２×１０^６個／ｋｇでグレード２を有し、被験者３名は細胞１５×１０^６個／ｋｇでグレード２を有した）、ＣＲＥＳの１症例（細胞６×１０^６個／ｋｇでグレード２）が報告されていた。

１．３．３．全体的な利益：リスクの結論
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞療法で予想される既知及び潜在的リスクは、致命的な悪性腫瘍である再燃性／難治性ＭＭを有する被験者にもたらされ得る潜在的な利益によって正当化されると思われる。

２．試験目的及びエンドポイント
主要な目的：この試験の主要な目的は、以下である。
第１相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び最大耐用量（ＭＴＤ）を、用量制限毒性（ＤＬＴ）に基づいて決定する
第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び有効性を評価する

主要なエンドポイント：
第１相－ＭＴＤを定義する各用量レベルでＤＬＴを有する被験者の数
第２相－有害事象（ＡＥ）、検査、及び標準臨床試験に基づく安全性及び耐容性：独立審査委員会（ＩＲＣ）によって評価された国際骨髄腫ワーキンググループ基準（Ｋｕｍａｒ，２０１６）による全奏効率（ＯＲＲ）及び奏効期間（ＤＯＲ）

副次的目的：この試験の副次的目的は、以下を評価することである。
第１相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び実現可能性、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の抗骨髄腫効果、第２／３相試験における更なる評価のための用量選択の指針となる細胞用量の効果
第２相－サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発生率及び重症度、追加の有効性エンドポイント

副次的エンドポイント：以下の副次的エンドポイントが評価される。

第１相－プロトコルで禁止されている用量のＰ－ＢＣＭＡ－１０１を生成する能力；ＡＥ、検査、及び標準臨床試験に基づく安全性及び耐容性；リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類されたＣＲＳ；国際骨髄腫ワーキンググループ（ＩＭＷＧ）統一応答基準（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１１、Ｋｕｍａｒ，２０１６、Ｃａｖｏ，２０１７）に基づいた有効性；全奏効率（ＯＲＲ）；応答までの時間（ＴＴＲ）；応答期間（ＤＯＲ）；無増悪生存期間（ＰＦＳ）；及び全生存期間（ＯＳ）。

第２相－リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類されたＣＲＳ；ＩＬ－６拮抗薬、コルチコステロイド、及びリミデュシド使用の割合；ＯＳ、ＰＦＳ、ＴＴＲ、微小残存病変（ＭＲＤ）陰性率

探索的目的：この試験の探索的目的は以下を行うことである。

第１相－ＭＭ形質細胞ＢＣＭＡ発現、循環可溶性ＢＣＭＡ、及び臨床応答の間の関係を評価する

第１相及び第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の拡大及び機能持続性を特徴付ける；推定的ＣＲＳマーカーと有効性又は安全性と間の関係を評価する；必要に応じて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１関連有害事象についてリミデュシドの効果を評価する。

探索的エンドポイント：以下の探索的エンドポイントが、試験の過程で評価される。

第１相－骨髄中のＢＣＭＡ及び／又は他のバイオマーカー、可溶性ＢＣＭＡ及び／又は血中の他のバイオマーカーレベル

第１相及び第２相－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞（例えば、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の血中及び骨髄中のベクターコピー／ｍＬ）；Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞サブセット組成及びクローン性；ＣＲＳマーカー：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）

３．治験計画
３．１．全体的な試験設計
試験は、複数部分：第１相、非盲検、ＳＡＤ段階と、第１相、複数回用量サイクル投与段階と、第１相、併用投与段階と、第２相、非盲検、有効性、及び安全性段階と、が再燃性／難治性ＭＭを有する成人被験者で実施される。単回用量投与の試験設計の概略図が図１４に示される。第１相サイクル投与コホートに関する概略図が、セクション１５．５における図１６及び図１７に示される。併用投与の試験設計の概略図が、セクション１５．６の図１８に示される。

ＣＡＲ－Ｔ細胞投与で予想されるタイプの急性緊急イベントを管理するリソースを有する、腫瘍学被験者及び幹細胞／骨髄移植の管理に経験のある施設のみが、この試験に参加するために選択される。安全委員会は定期的に会合し、試験全体を通してデータをレビューする。

プロトコル登録基準を満たす被験者は、試験における登録に適格であり、単回投与コホートについて表２に概説されている手順に従う。サイクル投与コホートに関する手順は、セクション１５．５に詳細される。第１相併用投与に関する手順は、セクション１５．６に詳細される。被験者が登録した後、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ ＣＡＲＴｙｒｉｎ－Ｔ細胞を生成する製造施設に送られるＰＢＭＣを得るために白血球アフェレーシスが行われる。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１製造に約４週間かかるため、被験者はコンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与のために、白血球アフェレーシス来院から約４週で再来院することが意図される（この期間は、治験責任医師によって必要と考えられるときに延長され得る）。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入を投与する前に、被験者は３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド及び３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンのリンパ球枯渇化学療法レジメンを受け、各薬剤は－５日から開始して３日連続して毎日投与される。被験体は、治験責任医師が適切と考えるときに、リンパ枯渇化学療法の間、入院患者として維持され得る。

リンパ球枯渇化学療法レジメンに続く２休息日後、被験者は０日目に約５～２０分かけてＩＶ投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が投薬される。他のＣＡＲ－Ｔ療法で行われた前試験は、治験薬投与の３～７日以内に生じる毒性ピークを認めている。試験被験者は、注入中及び注入後、並びにその後約７日間、綿密に監視される。この観察期間には、全ての被験者におけるＣＲＳを含むＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞関連毒性の出現を含む、一連の有害事象（ＡＥ）の評価が含まれる。ＣＲＳは、リー基準（Ｌｅｅ，２０１４）を使用してグレード分類される。

被験者は、個々の患者のリスクの治験責任医師の評価に基づいて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与のために入院が認められ得る。入院は要求されないが、被験者はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の最後の投与後約１４日間、病院の５０マイル以内に留まり、ＣＲＳの症状又は発熱などの神経毒性の場合に入院のために評価される。入院した場合、被験者は治験責任医師によって安定していると評価されるまで退院しない。被験者は、リンパ球枯渇化学療法中、又は治験責任医師が適切と考えるように上記の基準が満たされた後、入院患者として維持され得る。

被験者は、定期的なフォローアップのために再来院し、イベントの予定（表３）に特定されている安全性、耐容性、及び抗骨髄腫応答の一連の評価を受ける。第１相及び第２相の両方における治療後フォローアップ来院は、１０日目、２、３、４、６、８週目、３、４、５、６、７、８、９か月目、その後、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与後、最大２４か月間３か月毎に生じる。－サイクル投与コホートに関するフォローアップ手順は、セクション１５．５に詳細される。併用投与コホートに関するフォローアップ手順は、セクション１５．６に詳細される。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受ける被験者及び試験を完了又は離脱する全ての同意している被験者は、長期フォローアップ（ＬＴＦＵ）プロトコル（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１－００２）に登録することが奨励される。この試験とＬＴＦＵ試験との間で、被験者は最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１注入時から１５年間追跡される。このＬＴＦＵは、遺伝子治療の臨床試験に関するＦＤＡ（ＦＤＡ，２００６）要件に従って、遅延型ＡＥを観察するためのものである。被験者は、ＬＴＦＵ段階中の全生存期間について追跡され続ける。

３．２試験投薬
３．２．１．第１相における用量漸増ガイドライン
試験の第１相は、約１２０名の成人被験者における、非盲検、多施設、ＳＡＤ複数コホート試験、複数回用量サイクル投与コホート試験、及び併用投与試験である。最初に、最大６用量レベルのＰ－ＢＣＭＡ－１０１を単回投与として静脈内投与する。
提唱された用量（細胞Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１個／ｋｇ／用量）は、
コホート－１：０．２５×１０^６
コホート１：０．７５×１０^６
コホート２：２×１０^６
コホート３：６×１０^６
コホート４：１０×１０^６
コホート５：１５×１０^６を含む

試験の第１相は、用量漸増コホートの３＋３設計に従い、各コホートについて３名の被験者が最初にＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞を投与されるように計画される。追加の被験者は、それらの被験者で観察された結果に応じて、コホートで投与され得る。

ＣＡＲ－Ｔ試験における毒性のピークが投与の３～７日で生じ、大多数が２週間以内であり、２～３週間で解消するため、最初の２コホートの各々について、最初の被験者３名の投与は同時ではなく交互にし、少なくとも１４日の間隔で安全性を評価する（Ｆｒｅｙ，２０１６）。

安全委員会の裁量で、第３のコホートで開始し、各コホートにおける第１及び第２の被験者の投与が交互に行われる。用量漸増ガイドラインが表１に概説される。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の投与は、３＋３設計で漸増用量コホートにおいて実施される。コホート１で開始して、少なくとも３名の被験者がコホートで投薬される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞関連ＤＬＴが２８日目まで、最初の３名の被験者で観察されない場合、漸増は次のコホートに進め得る。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１関連ＤＬＴが最初の３名の被験者のうちの１名で観察された場合、少なくとも３名の追加の被験者がこの用量レベルで治療される。ＤＬＴが２名以上の被験者で観察された場合、ＭＴＤは次に低い用量レベルであると考えられ、更なる登録はより低い用量レベルで行われるか、又は中間の用量レベルが安全委員会の裁量で試験され得、さもなければ漸増が進められ得る（すなわち、ＭＴＤは、これを生じていない最大用量コホートで評価される）。コホート１で２名以上の被験者がＤＬＴを経験した事象では、安全委員会は全ての入手可能なデータのレビュー後、同じ３＋３拡大規則によってコホート－１で３名の被験者に投薬することを選択し得る。２名以上の被験者がコホート－１でＤＬＴを経験した事象では、安全委員会は、リスク対利益を評価する安全性及び有効性データの考慮に基づいて、３名の被験者を同じ３＋３拡大規則を用いてより低い用量で投薬するか、又は試験を中止することを選択し得る。

追加の被験者が、コホートの安全性及び有効性データに基づいて安全委員会によってそのコホートに追加され、そのコホートからＰ－ＢＣＭＡ－１０１の安全性及び抗骨髄腫効果を更に評価し得るが、ただし用量はＭＴＤを超えない。全体的なＭＴＤを結論付けずにコホート５が完了した場合、安全委員会は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の５～１０×１０^６個／ｋｇの増分で、更なる漸増コホートを評価することを選択し得る。

３．２．２．サイクル投与における投薬
第１相－サイクル投与では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回用量が、各２週間の２サイクル（コホートＡ及びコホートＣ）又は３サイクル（コホートＢ）で静脈内投与される。投与される総用量は、単回投与漸増中に決定される＜ＭＴＤで開始する３＋３設計に従う。第１のサイクルでは、総用量の１／３が投与される。コホートＡでは、総用量の最大２／３が第２のサイクルで投与される。コホートＢでは、総用量の最大１／３が第２のサイクル及び第３のサイクルの各々で投与される。コホートＣでは、総用量の最大２／３が第１のサイクルで投与され、総用量の最大１／３が第２のサイクルで投与される。手順の詳細は、セクション１５．５に提供される。各注入の前に、血清クレアチニンが≦２．０ｍｇ／ｄＬ、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）が≦３×正常の上限、及び総ビリルビンが≦２．０ｍｇ／ｄＬであるか、又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１注入を進める医療モニターの承認を有するべきである。

３．２．３．併用投与における投薬
第１相－併用投与では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は承認された療法と組み合わせて投与される。

レナリドマイド
コホートＲ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週前に開始して、２８日毎に２１日間、経口によってレナリドマイドを１日に１０ｍｇ、及び

コホートＲＰ：アフェレーシスの１週前に開始して７日間、及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週前に開始して２８日毎に２１日間、経口によってレナリドマイドを１日に１０ｍｇ。

レナリドマイドの投薬は、疾患が進行しない限り、コホートＲ及びコホートＲＰで継続する。処方情報について、レナリドマイドの添付文書を参照する（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ，２０１９）（特に、レナリドマイドは催奇形物質と推定され、妊娠の回避及びモニタリングが必要であることに注意する）。以下は、このプロトコルに特有な追加の推奨事項である。ＤＬＴが報告されておらず、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の２８日後に血小板が≧５０，０００／μＬ及び好中球が＞１０００／μＬである場合、用量は２８日毎のうち２１日間、経口によって１日に２５ｍｇに増加され得る。この用量で治療された最初の６名の患者で＜２名のＤＬＴが報告された場合、全ての患者における開始用量は、安全委員会の決定で、２８日毎に２１日間、経口によって１日に２５ｍｇに増加され得る。治療中に、好中球が＜１０００／μＬに減少した場合、≧１０００／μＬになるまでレナリドマイドを保留し、５ｍｇの低用量で再開する。治療中に、血小板が＜３０，０００／μＬに減少した場合、≧３０，０００／μＬになるまでレナリドマイドを保留し、５ｍｇの低用量で再開する。クレアチニンクリアランスが３０～６０ｍＬ／分である場合、レナリドマイドの最大用量は１日に１０ｍｇにすべきである。クレアチニンクリアランスが＜３０ｍＬ／ｍｉｎ未満である場合、レナリドマイドを保留する。レナリドマイドは、ＤＬＴの症例では中止すべきである。この試験で許容される最低用量は、１日に５ｍｇである。治験責任医師及び安全委員会は、他の安全性所見に基づいて、時にレナリドマイドを中止するように決定し得る。患者は、指示されるように併用する抗凝固療法を受けるべきである（例えば、アスピリンを経口によって１日に３２５ｍｇ）。レナリドマイドと一緒にグルココルチコイドを投与しない。

リツキシマブ
コホートＲＩＴ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１２及び５日前に、静脈内注入による３７５ｍｇ／ｍ^２、その後、疾患が進行しない限り８週毎。処方情報について、リツキシマブの添付文書を参照する（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，２０１９）。以下は、このプロトコルに特有な追加の推奨事項である。リツキシマブは、重度の注入関連反応が発生した場合に致命的であり得、それらを管理するための適切な医療サポートを備えた医療専門家によってのみ投与されるべきである。最初の注入：５０ｍｇ／時間の速度で注入を開始する。注入毒性がなければ、注入速度を３０分毎に５０ｍｇ／時間ずつ最大４００ｍｇ／時間まで増加させる。その後の注入：標準注入：１００ｍｇ／時間の速度で注入を開始する。注入毒性がなければ、速度を３０分間隔で１００ｍｇ／時間ずつ最大４００ｍｇ／時間まで増加させる。静脈内注入としてのみ投与する。静脈内プッシュ又はボーラスとして投与しない。各注入前にアセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、及び静脈内メチルプレドニゾロン１００ｍｇを前投薬し、各注入の３０分前に完了させる。リツキシマブは、注入反応又はＤＬＴの症例では中止すべきである。治験責任医師及び安全委員会は、他の安全性所見に基づいて、いつでもリツキシマブの中止を決定し得る。Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＰＣＰ）などの感染症の予防及び観察が、リツキシマブの処方情報に従って、治療中及び治療後の患者について考慮されるべきである。

投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の用量は、用量漸増中に決定される≦ＭＴＤで開始する３＋３設計に従って、漸増又は漸減させる。手順の詳細は、セクション１５．６に提供される。

３．２．４．第２相における投薬
試験の第２相は、再燃性／難治性ＭＭを有する約１００名の成人被験者における非盲検、多施設試験である。第２相における被験者は、細胞６～１５×１０^６個／ｋｇの総用量を受ける（第１相で決定された予定に従う）。

３．２．５．反復投薬
被験者の疾患が進行したときに十分なＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が製造から残存している場合、安全委員会の承認で、追加の細胞が、用量制限毒性評価を正常に完了している最高用量レベルまで投与され得る。追加のＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞注入を受けるために、被験者は新たな被験者識別番号が割り当てられ、最初の投与のために記載された全ての適格基準を満たさなければならず、同じスクリーニング、登録、コンディショニング化学療法手順、及び白血球アフェレーシスを除くフォローアップ手順を受ける。再治療手順に関する詳細は、セクション１５．４に提供される。

３．３．用量制限毒性の評価
ＤＬＴは、最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入後の最初の２８日以内に発症した基礎疾患又はリンパ除去化学療法レジメンに帰することができない、少なくともＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞療法に関連している可能性がある任意の米国国立がん研究所－有害事象共通用語規準（ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ）≧グレード３の事象として定義され、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の制御不能な増殖を含み、以下の例外を有する。
最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入から２８日以内に好中球減少熱の有無にかかわらず、グレード３又は４の好中球減少症が消失する、
グレード３の発熱、
血小板減少症による出血の有無にかかわらず、最後のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入から２８日以内に解消する、グレード３又は４の血小板減少症、
グレード３又は４の貧血及びリンパ球減少症、
グレード３又は４の低ガンマグロブリン血症、
脱毛症、
医療処置に２４時間以内に反応するグレード３又は４の吐き気、嘔吐、又は下痢
標準的な抗ヒスタミン薬を伴う細胞投与の６時間以内にグレード２以下に可逆的である、細胞注入（細胞注入に関連）の２時間以内に発生する即時型過敏反応（発熱、発疹、気管支痙攣）、
２８日以内にグレード２未満に回復するグレード３の脳症、
１４日以内に解消するリー基準（Ｌｅｅ，２０１４）によるグレード３のＣＲＳ、
１４日以内に≦グレード２に回復するグレード３の非血液学的検査異常、
７日以内に≦グレード２に回復するグレード４の非血液学的検査異常。

３．４．被験者数及び試験期間
第１相では、最大２０施設で最大１２０名の被験者が登録されるように計画される。第２相では、最大２０施設で約１００名の被験者が登録されるように計画される。登録された被験者は、安全性、耐容性、及び応答（骨髄腫の病期分類）の一連の測定を受ける。これらの測定は、スクリーニングからＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与後最大２４か月の期間に、単回投与について表２及び表３、サイクル投与コホートについてセクション１５．５、及び併用投与コホートについてセクション１５．６に記載のイベント予定に従って得られる。疾患進行を経験した被験者は、表８及び表９に記載のイベントの予定に従って、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の追加注入を受け得る。

このプロトコルを完了又は離脱した後、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受けていた同意している被験者は、長期的な安全性を評価するための最後の投薬後に合計１５年間の継続的なフォローアップを可能にする別のプロトコル（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１－００２）に登録することが推奨される。

４．試験集団、離脱、完了、及び中止基準の選択
４．１．組み入れ基準
被験者は以下の基準を満たして、この試験の参加に適格でなければならない。
１．書面によるインフォームドコンセントに署名していなければならない。
２．年齢≧１８歳の男性又は女性。
３．初期診断でＩＭＷＧ基準によって定義される活動性ＭＭの確定された診断を有さなければならない（Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１４）。
４．次の基準のうちの少なくとも１つによって定義される測定可能なＭＭを有さなければならない。
第１相：
血清Ｍタンパク質：０．５ｇ／ｄＬ（５ｇ／Ｌ）以上、
尿中Ｍタンパク質：２００ｍｇ／２４時間以上、
血清遊離軽鎖（ＦＬＣ）アッセイ：血清ＦＬＣ比が異常である場合、関与するＦＬＣレベルが１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）以上、
骨髄形質細胞が総骨髄細胞の＞３０％、又は他の測定可能な骨疾患（例、ＰＥＴ又はＣＴによって測定可能な形質細胞腫）（医療モニターの承認を伴う）
第２相：
血清Ｍタンパク質：１．０ｇ／ｄＬ（１０ｇ／Ｌ）以上、
尿中Ｍタンパク質：２００ｍｇ／２４時間以上、
血清ＦＬＣアッセイ：血清ＦＬＣ比が異常である場合、関与するＦＬＣレベルが１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）以上、
５．以下で定義されるように、再燃性／難治性ＭＭを有さなければならない、
第１相：
少なくとも３つの前治療ラインを受け、それにはプロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤（ＩＭｉＤ）が含まれていなければならないか、又は
プロテアソーム阻害剤及びＩＭｉＤに対する「二重難治性」の場合、少なくとも２つの前治療ラインを受け、これらの薬剤による治療の６０日以内に進行として定義される。
第２相：
プロテアソーム阻害剤、ＩＭｉＤ、及びＣＤ３８標的化療法を含んでいなければならない少なくとも３つの前療法ラインを、三重組み合わせの形態でラインのうちの少なくとも２つによって受け、ＰＤが最善応答でない限り、各ラインの≧２サイクルを受けており、
最新の療法ラインに難治性であり、かつ
ＡＳＣＴを受けているか、又はＡＳＣＴの候補ではない。
注：導入療法、自己幹細胞移植、及び維持療法は、進行を妨げることなく連続して投与される場合、単一ラインとみなされるべきである。
６．スクリーニング時から試験期間の間、避妊を実施する意思がなければならない（出産の可能性のある男性及び女性の両方）。
コホートＲ、ＲＰ、又はＲＩＴの女性は、治療を開始する４週前に始めて、治療中、用量中断中、並びにレナリドミドの中断後４週間及びリツキシマブの最終投与後１２か月継続して、性交を継続的に控えるか、又は信頼性のある避妊のうちの２つの方法を使用することを約束しなければならない。
コホートＲ又はＲＰの男性は、精管切除が成功している場合でも、レナリドマイドを服用している間、及びレナリドマイドを中止した後に最大４週間、生殖能力のある女性と性的に接触する間は常にラテックス又は合成コンドームを使用しなければならない。レナリドミドを服用している男性患者は、精子を提供してはならない。
７．スクリーニングで血清妊娠検査が陰性、及びリンパ球枯渇化学療法レジメンを開始する前の３日以内の尿妊娠検査が陰性でなければならない（出産の可能性のある女性）。
コホートＲ及びＲＰの女性被験者は、レナリドミドを開始する前に、２回の妊娠検査が陰性でなければならない。第１の検査は、被験者がレナリドマイド療法を開始する前の１０～１４日以内に、２回目の検査は２４時間以内に実施し、そして最初の１か月間は毎週、その後は月経周期が規則的な女性では毎月、月経周期が不規則な女性では２週間毎に実施しなければならない
８．自己幹細胞移植が行われた場合、少なくとも９０日後でなければならない。
９．以下に定義される（又は医療モニターの承認）、適切な生体器官機能を有さなければならない。
コッククロフト・ゴールト式を使用して計算され、透析に依存しない血清クレアチニン＜２．０ｍｇ／ｄＬ及び推定クレアチニンクリアランス≧３０ｍＬ／分。
絶対好中球数≧１０００／μＬ及び血小板数≧５０，０００／μＬ（骨髄形質細胞が細胞性の≧５０％である場合、≧３０，０００／μＬ）。
投与量コホートに基づいて標的細胞用量を得るために推定される適切な絶対ＣＤ３数。（第２相：絶対リンパ球数≧３００／μＬ）
ヘモグロビン＞８ｇ／ｄＬ（輸血及び／又は成長因子補助は許容される）。
血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）≦３×正常の上限、及び総ビリルビン≦２．０ｍｇ／ｄＬ（分子的に記録されたギルバート症候群の病歴がない場合）。
左心室駆出率（ＬＶＥＦ）≧４５％。ＬＶＥＦ評価は、登録の４週間以内に実施されていなければならない。
１０．ＮＣＩ ＣＴＣＡＥバージョン４．０３基準又は被験者の以前のベースラインに従って、末梢神経障害を除いて、以前の治療による毒性からグレード≦２に回復していなければならない。
１１．被験者は、０～１の米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスを有さなければならない。

４．２除外基準
１．妊娠中又は授乳中である
２．不十分な静脈アクセス及び／又は白血球アフェレーシスに対する禁忌を有する。
３．活動性溶血性貧血、形質細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経障害、器官肥大症、内分泌障害、モノクローナルタンパク質、及び皮膚変化）、播種性血管内凝固症候群、白血球停滞、又はアミロイドーシスを有する。
４．非転移性基底細胞又は扁平上皮皮膚がんなどの低リスクの新生物を除き、ＭＭに加えて、活動的な第２の悪性腫瘍（少なくとも５年間無病ではない）を有する。
５．乾癬、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチなどの活動性自己免疫疾患を有する（医療モニターが、疾患が活動性で自己免疫性であるか決定する）。
６．脳卒中、てんかんなどの重大な中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の病歴を有する（医療モニターが重大か判断する）。
７．活動性全身感染症を有する（例えば、発熱を生じるか、又は抗微生物治療を必要とする）。
８．Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）感染症、あるいはいずれかの免疫不全症候群を有する。
９．ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＹＨＡ）クラスＩＩＩ又はＩＶの心不全、不安定狭心症、又は心筋梗塞若しくは重大な不整脈（例えば、心房細動、持続性［＞３０秒］心室性頻脈など）の病歴を有する
１０．治験責任医師又は医療モニターの見解で、プロトコルへの安全な参加及び／又はその遵守を妨げる（適切な白血球アフェレーシス、コンディショニング化学療法、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞投与のために資格がないか、又はそれらを受けることができない可能性が高いことを示す病状又は検査所見を含む）であろう、いずれかの精神医学的又は医学的障害（例えば、心血管、内分泌、腎臓、胃腸、泌尿生殖器、免疫不全、又は肺障害）を有する。
１１．前遺伝子療法又は遺伝子改変細胞免疫療法を受けていた（又は医療モニターの承認を受けている）
被験者は、抗骨髄腫治療に関連して、遺伝子改変していない自己Ｔ細胞又は幹細胞を受けていた可能性がある。
１２．コンディショニング化学療法の開始時から２週間又は５半減期（どちらか長い方か、又は医療モニターの承認を有する）以内に抗がん医薬品を受けている。
１３．白血球アフェレーシスの開始時の２週間以内に免疫抑制薬をうけており、かつ／又は試験中にそれらを必要とすることが予想される（医療モニターは、医薬品が免疫抑制とみなされるか決定する）。一般に、必須ではない全ての医薬品（サプリメント、ハーブ薬などを含む）は、免疫抑制効果が認められない可能性があるため、白血球アフェレーシスの２週間前からＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与の２か月後まで中止すべきである。
１４．受けたことがある≧５ｍｇ／日のプレドニゾン又は同等の用量の別のコルチコステロイドの全身コルチコステロイド療法を、必要な白血球アフェレーシスの２週以内、又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与の１週間若しくは５半減期（いずれか短い方）以内のいずれで受けているか、あるいは試験の過程でそれが必要になると予想される。（局所及び吸入ステロイドは許可される。全身性コルチコステロイドは、試験固有のガイダンス外で、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を受けた後は禁忌である）。
１５．骨髄腫のＣＮＳ転移又は症候性ＣＮＳ併発（軟髄膜がん腫症、頭蓋神経障害、又は腫瘤病変、及び脊髄圧迫を含む）を有する。
１６．この試験で使用される薬剤のいずれかに対する重度の即時型過敏症反応の病歴を有する。
１７．同種幹細胞移植、又は任意の他の同種若しくは異種移植を受けた病歴を有するか、９０日以内に自己移植を受けている。
１８．予防的抗凝固としてアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）（３２５ｍｇ）を毎日服用できない。ＡＳＡに耐容でない患者は、ワルファリン又は低分子量ヘパリンを使用し得る（コホートＲ及びＲＰのみ）。
１９．抗凝固に関係なく、過去６か月以内の血栓塞栓疾患の病歴（コホートＲ及びＲＰのみ）。

４．３被験者離脱
登録されて、試験プロトコルを完了していない被験者は、試験を完了前に中止しているとみなされる。完了前の中止の理由（例えば、自発的離脱、毒性、死亡）は、症例報告書式に記録されなければならない。最終試験評価は中止時に完了される。被験者がこの試験を中止した場合、予定されている次の来院におけるイベントは、代替医療、放射線、又は外科的介入を開始する前に実施され（全ての安全性及び有効性評価を含む）、この試験における試験終了来院として記録されるべきである。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受けた後にプロトコルから離脱する被験者は、類似の長期フォローアッププロトコルＰ－ＢＣＭＡ－１０１－００２に登録することが推奨される。完了前の中止の潜在的な理由には、以下が含まれる：
１．被験者がフォローアップに来院しない。
２．対象が病気で続行できないという治験責任医師の判断。
３．試験療法及び／又は診療所予約に対する被験者の非遵守。
４．妊娠
５．自主的離脱：被験者は、偏見なくいつでも試験から自ら辞退し得る。被験者は、同意を撤回したいときはいつでも試験離脱することができる。
６．代替の医療、放射線、又は外科的介入を必要とする、悪性腫瘍の著しい進行。疾患マーカーが、以前の増加を確証する代わりに、進行性疾患に達した後にＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞活性に由来して減少する場合、別の全身性骨髄腫治療が指示されない限り、それらはその後、進行性疾患を考慮するとそのレベルから増加して、被験者にプロトコルを中止させるであろう。
７．Ｔ細胞遺伝子改変及び増殖手順において、全ての品質管理基準を満たす臨床細胞用量の生成を妨げる技術的な困難に遭遇する。
８．主席治験責任医師、治験依頼者、試験資金提供者、施設内審査委員会（ＩＲＢ）／独立倫理委員会（ＩＥＣ）、又は食品医薬品局（ＦＤＡ）による試験の終了。

４．４．試験終了
治験依頼者は、いかなる理由でも、いつでも試験を中断又は終了し得る。試験が中断又を終了する場合、治験依頼者は、該当施設、規制当局、及びＩＲＢ／ＩＥＣに適切に通知することを確実にする。

治験責任医師がそれらの施設で治験を中止／終了する場合、治験依頼者に通知しなければならない。治験依頼者は、規制当局及びＩＲＢ／ＩＥＣに適切に通知することを確実にする。

治験依頼者は、適切な試験終了宣言が、地域の規制に従って関連する規制当局／ＩＥＣに対してなされることを確実にする。

５．試験治療
５．１．白血球アフェレーシス
全てのスクリーニング手順を完了し、全ての適格性基準を満たす被験者は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の製造のために末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取する白血球アフェレーシスを受ける。この来院は、スクリーニング来院の約２８日以内に行うべきである。試験に登録された被験者は、登録病院で、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａシステム（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）又は同等の白血球アフェレーシス装置を使用して、標準的な白血球アフェレーシス処置を受ける。処置直後に、白血球アフェレーシスした細胞は検証済みの温度管理された条件で製造及び分析施設に出荷される。目的は、１０～１５リットル（施設方針によって定義される最小及び最大）のアフェレーシスを行い、目標の１．５～３×１０^１０（最小１．５×１０^１０及び最大５×１０^１０）個の白血球（ＷＢＣ）を採取することである（数は、総有核細胞［ＴＮＣ］としても許容される）。追加の詳細については、試験参考マニュアル（アフェレシスセンターマニュアル）を参照する。アフェレーシスの最後に達する体積、細胞数、及びその他の出力パラメーターは、患者、装置、方法、及び操作者間で異なることが認識され、これは絶対的な要件とは対照的にガイダンスとして提供される。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の製造が、図１５に図示される。収集されたアフェレーシス産物は、即座の製造のために配達業者によって製造業者に輸送される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の製造には、Ｔ細胞単離と、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＤＮＡプラスミド（抗ＢＣＭＡ ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするＰ－ＢＣＭＡ－１０１プラスミド）及びＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼｍＲＮＡ（ＳＰＢ ｍＲＮＡ）を用いたエレクトロポレーションと、ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞選択と、細胞増殖と、が含まれ、約４週間で完了する。最終製品は、バッグ中に凍結保存される。最終製剤には、最大１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。

注入のための製品出庫後、冷凍したＰ－ＢＣＭＡ－１０１製品は、登録試験センターの薬局又は適用可能な細胞療法施設に配送業者によって出荷される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、投与時までそこに≦－１３０℃で保存される。

放出基準を満たすＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が白血球アフェレーシス試料から製造できない場合、２回目の白血球アフェレーシス及び製造を試み得る。２回目の試みも失敗した場合、被験者は試験から離脱し、試験治療を受けていないとみなされる。被験者の疾患が進行したときに十分なＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が製造から残存している場合、安全委員会の承認で、追加の細胞が、用量制限毒性評価を正常に完了している最高用量レベルまで投与され得る。

製品が製造されると、被験者は、白血球アフェレーシス来院後、約４週間のコンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与期間（この期間は、治験責任医師及び医療モニターの裁量で延長され得る）のために病院に再来院する。

白血球アフェレーシス来院後、コンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与期間の許可前に急速な疾患進行を経験した被験者は、治験責任医師の裁量でサルベージ療法を投与することができる。サルベージ療法は、必要でない限り使用すべきではなく、治験責任医師の裁量で、被験者の病歴によって決定される（以前に使用された薬剤が好ましく、医療モニターの承認を必要とする）。被験者がサルベージ療法を受ける場合、コンディショニング化学療法及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与期間は、サルベージ療法の最後の治療日から少なくとも２週間又は５半減期後に予定されるべきであり、被験者は登録基準及び併用薬に関するセクション４及びセクション６に記載される基準を満たすべきである。サルベージ療法に対する被験者の応答は、治験責任医師及び医療モニターによって評価され、被験者が治験薬を受けるのに適格であり続けるか決定する。

被験者は、放射線療法又は血漿交換療法を受けることが許可され、試験期間を通して緩和目的で交換される。

５．２．コンディショニング化学療法
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入を投与する前に、被験者は３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド及び３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンのコンディショニングリンパ球枯渇化学療法レジメンを受け、各化学療法剤は３日間（－５日から－３日）連続して毎日３０分かけて連続したＩＶで投与される。被験者は、コンディショニング化学療法の開始時に引き続き登録基準を満たしているか、医療モニターの承認を得ているべきである。コホートＲ、コホートＲＰ、及びコホートＲＩＴの被験者では、併用療法は、適用可能日のコンディショニング化学療法の前に投与されるべきである。－５日前の７２時間以内に以下の評価：簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、身体検査、バイタルサイン、電解質及びマグネシウムを含む化学パネル、Ｂ細胞数及びＴ細胞数を含む血液学、凝固、循環骨髄腫／形質細胞、及び妊娠検査（該当する場合）、が繰り返されるべきである。ベースラインの骨髄腫応答評価は、コンディショニング化学療法を開始する前の７日以内に実施されなければならない。被験者は、治験責任医師の裁量で、この時点で入院間はとして認められて治療され得る。

５．３．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与
５．３．１．説明
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡ改変システムと呼ばれるエレクトロポレーションベースの非ウイルス（ＤＮＡトランスポゾン）遺伝子送達システムによって遺伝子改変された活性化Ｔ細胞からなる。ＰＢ ＤＮＡ改変システムは、「カットアンドペースト」メカニズムを介してＤＮＡをプラスミドから染色体に効率的に移動させる。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、３つの主要な構成要素：抗ＢＣＭＡセンチリンＣＡＲ（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）遺伝子、ＤＨＦＲ選択遺伝子（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，２０１６）、及びｉＣａｓｐ９ベースの安全スイッチ遺伝子（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，２００５）を含むように設計されている。これらの構成要素は、５’プロモーター及び３’ポリＡシグナルとともに、不適切な遺伝子活性化又はサイレンシングを遮断することによって導入遺伝子を安定化することができる２つの非翻訳シス調節インスレーターエレメントに隣接している（Ｍｏｓｓｉｎｅ，２０１３）。

ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現カセットは、ＣＤ８ａシグナル／リーダーペプチド、ＣＤ８ａヒンジ／スペーサー、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、細胞内４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＴＣＲζ鎖シグナル伝達ドメインに融合した細胞外ＢＣＭＡ結合センチリンタンパク質をコードする。抗体ベースの単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）からなる結合ドメインと比較して、ＣＡＲＴｙｒｉｎ結合ドメインは完全なヒトタンパク質であり、より小さく、より安定しており、免疫原性が潜在的に低いが、ＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の認識及び殺傷を可能にする同様の抗原結合特性を有する。

ＤＨＦＲ選択遺伝子は、Ｔ細胞の製造中に、ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現性Ｔ細胞のエクスビボ選択のために使用され、最終製品の効力及び有効性を増強する。

ｉＣ９安全スイッチ遺伝子は、合成小分子二量体化剤であるリミデュシドの静脈内投与によって、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の迅速な除去を可能にするように設計された、ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞には認められない追加の機能である。

５．３．２．製品表示
各製品バッグには、製品名（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１）、製品製造日、製品ロット番号、保存条件、部品番号、及び少なくとも２つの非個人的な被験者識別子（被験者のイニシャル、生年月日、及び／又は試験被験者識別番号など）が表示される。加えて、製品バッグには、警告：「自己使用のみ」、「感染性物質については評価されていない」、及び「警告：新薬－連邦法によって治験使用に限定される」と表示される。

５．３．３．保存
治験薬及びいずれの関連試験治療供給品も受領時に、目録作成が実施されなければならず、薬物受領記録を記入し、出荷品を受領した者によって署名される。指定された試験スタッフが目録を作成し、計数して、出荷品が出荷目録に記載された品目全てを含むことを検証する。所定の出荷物における損傷したか又は使用不能ないずれの治験品試験薬も、試験ファイルに記録される。治験責任医師は、治験依頼者又は被指名人に、治験責任医師の施設に供給された損傷したか又は使用不能ないずれの試験治療も通知しなければならない。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、様々な理由：１）誤った表示製品、２）注入／注射が禁じられた被験者の状態、及び３）被験者による注入／注入の拒否、を含むがこれらに限定されない理由のために、治験依頼者又は被指名人に返却する必要があり得る。全体として、未使用の製品は、治験依頼者又は被指名人に返却される。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を含有バッグは、被験者が注入できるようになるまで、施設でモニター付きの≦－１３０℃冷凍庫中で、血液バンク条件で保存される。

５．３．４．調製物
Ｔ細胞注入前に推奨される前投薬には、６５０ｍｇのアセトアミノフェン及び２５～５０ｍｇの塩酸ジフェンヒドラミンが含まれる。これらの医薬品は、必要に応じて６時間毎に投与され得る。非ステロイド性抗炎症剤は、アセトアミノフェンによって制御できない発熱のために投与され得るが、しかしながら、出血のリスク及び腎機能など、被験者の耐容性に影響を与える可能性のある要因に関して、使用が慎重に考慮されるべきである。敗血症の評価は、予測されない重症度若しくは期間の発熱、又は他の示唆的な症候学について考慮されるべきである。全身性コルチコステロイドは、Ｔ細胞ベースの治験薬の有効性に悪影響を及ぼす可能性があるため、支持療法ガイダンス（セクション６．３）に記載されているように必要でない限り、投与されるべきではない。

被験者は、投薬前（すなわち、コンディショニング化学療法を開始する前）に、肝臓及び腎臓の臨床検査登録要件を満たし続けなければならない。加えて、活動性感染症、又は重大な心臓（例えば、昇圧剤を必要とする低血圧、又は制御不能な不整脈）若しくは肺損傷（例えば、補給酸素の必要性又は胸部Ｘ線での著しい進行性浸潤）の証拠が引き続き存在しないようにしなければならない。

５．３．５．投薬及び投与
第１相では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の用量レベルは、単回用量又は複数回用量として静脈内投与される。用量レベルは、用量漸増ガイドライン（セクション３．２）に記載されている３＋３漸増設計でコホート毎に試験される。第２相では、被験者は、細胞６～１５×１０^６個／ｋｇの総用量を受ける（第１相で決定された予定に従う）。

凍結保存されたＰ－ＢＣＭＡ－１０１は、登録試験センターに輸送され、注入まで＜－１３０℃で保存される。被験者のために受け取った凍結バッグ上の表示が、内容物がコホートにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の割り当てられた用量（＋／－５％）を超えていることを示す場合、割り当てられた用量に対応する製品の体積のみが投与されるべきである。被験者のために受け取った凍結バッグ上の表示が、内容物がコホートにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の割り当てられた用量（＋／－５％）未満を示し、かつ複数の凍結バッグが被験者のために提供されている場合、割り当てられた用量に対応する製品の体積は、複数の凍結バッグから投与されるべきである（これには、異なる白血球アフェレーシス／製造からの凍結バッグが含まれ得る）。被験者のために受け取った凍結バッグ上の表示が、内容物がコホートにおけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞の割り当てられた用量（＋／－５％）未満を示し、被験者に割り当てられた用量に対応する体積を提供するのに十分な数の凍結バッグが提供されていない場合、製品は投与され得るが、しかしながら、その被験者における用量は、コホートレベル用量ではなく、受けた用量として記録され、その被験者からの全てのデータはそのよう一致させる。注入の直前に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を解凍し、以下に詳述するように注入する。注入前にＰ－ＢＣＭＡ－１０１を更に処理する必要はない。細胞は、治験薬局又は適用可能な細胞療法施設で記録されるべきである。

リンパ球枯渇化学療法レジメンに続く２休息日後、被験者はＩＶ投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が投薬される。被験者は、治験責任医師の評価に基づいて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与のために入院が認められ得る。入院は要求されないが、被験者はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の最後の用量後約１４日間、病院の５０マイル以内に留まり、ＣＲＳの症状又は発熱などの神経毒性の場合に入院のために評価される。注入の直前に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞を≦－１３０℃（気相液体窒素中）で被験者のベッドサイドに移す。細胞は、注入直前にベッドサイドで３６℃～３８℃に維持したウォーターバスを使用して解凍する（別の場所で解凍して２～８℃でベッドサイドに輸送することは、治験依頼者によって事前承認されなければならない）。細胞がまさに解凍するまで、バッグを優しく揉み解す。容器中に凍った塊を残すべきではない。バッグに損傷若しくは漏れがみられるか、又は他が損なわれている場合は、輸液すべきでなく、治験依頼者又治験依頼者の被指名人に返却すべきである。注入バッグ表示は、被験者の試験識別番号及びイニシャル又は生年月日を含む少なくとも２つの固有の識別子を有する。注入の前に、２名の個人が被験者の存在下でこの全ての情報を個別に検証し、それによって情報が参加者と正しく一致していることを確証する。注入中に被験者がアレルギー反応、又は重度の低血圧発作、又は注入に対する他の任意の反応を有する場合に、緊急医療機器（すなわち、緊急トロリー）を利用可能にする。集中治療室は、試験投与施設の妥当な距離内にあるべきである。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は、一般に、用量に応じて、約３×１０^５個／ｍＬ～２．４×１０^７個／ｍＬの範囲の濃度で、２５０ｍＬ輸液バッグに提供される。用量及び体積に応じて、３方活栓又はバタフライ針を備えたラテックスフリー１８ゲージのＹ型血液セットを通して、毎分約１ｍＬ～２０ｍＬの流速で静脈内注入によって投与されるべきである。注入の持続時間は、体積に応じて約５～２０分であるべきである。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞は解凍の２時間以内に注入され、評価された最大安定性は４時間であることが意図されている。追加の詳細については、試験参考マニュアル（薬局及び管理マニュアル）も参照されたい。

バイタルサイン（体温、呼吸数、脈拍、及び血圧）は、注入前及び注入後、その後少なくとも１時間は１５分毎に、これらのサインが十分で安定するまで測定される。

空のバッグ及び残存する細胞は、施設のバイオセーフティガイドラインに従って廃棄されなければならない。未使用又は損傷した製品／パッケージの場合、治験依頼者に連絡して処分を決定しなければならない。

他のＣＡＲ－Ｔ療法で行われた前試験は、治験薬投与の３～７日以内に生じる毒性ピークを認めている。試験被験者は、注入中及び注入後、並びにその後約７日間、綿密に監視される。この観察期間には、全ての被験者におけるＣＲＳなどのＰ－ＢＣＭＡ－１０１関連毒性の出現を含む、一連のＡＥの評価が含まれる。

入院した場合、被験者は治験責任医師によって安定していると評価されるまで退院しない。被験者は、リンパ球枯渇化学療法中、又は治験責任医師が適切と考える上記の基準が満たされた後、入院患者として維持され得る。被験者は、定期的なフォローアップのために再来院し、イベントの予定表に特定されている安全性、耐容性、及び抗骨髄腫応答の一連の評価を受ける。

６．併用薬及び治療
６．１．禁止された併用薬及び治療
試験で受けることができず、あるいはＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与後、又は白血球アフェレーシス若しくはコンディショニング化学療法の開始時の２週間若しくは５半減期（いずれか長い方か、又は医療モニターの承認を有する）以内に、抗がん／抗骨髄腫医薬品を受けていることができない。サルベージ治療は、必要でない限り使用されるべきではないが、治験責任医師が必要と考え、医療モニターによって承認された場合、白血球アフェレーシスとコンディショニング化学療法との間で投与され得る。関連する薬剤では、除外基準に記載されている間隔を満たす必要がある。

白血球アフェレーシスの開始時の２週間又は５半減期（どちらか長い方）以内に免疫抑制薬を受けていることはできず、かつ／又は試験に登録している間にそれらを必要とするか、若しくはＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与後にそれらを受けることが予想される（医療モニターは、潜在的に免疫抑制剤が許可される時期及び許可されるか決定する）。

≧５ｍｇ／日のプレドニゾン又は同等の用量の別のコルチコステロイドの全身コルチコステロイド療法を、必要な白血球アフェレーシスの２週以内、又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与の１週間若しくは５半減期（いずれか短い方）以内のいずれで受けていることはできず、あるいは試験の過程でそれが必要とすることが予想される（局所、及び吸入ステロイドは許可される）。全身性コルチコステロイドは一般に、ＡＥの管理関する試験特有のガイダンス、併用療法との指示された使用、又は医療モニターの承認を有する以外でＰ－ＢＣＭＡ－１０１を受けた後は禁忌となる。

白血球アフェレーシスの開始時の２週間以内、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の計画された投与前の５半減期以内、又は医療モニターの承認を有さないＰ－ＢＣＭＡ－１０１の投与後２か月以内に、Ｇ－ＣＳＦ又はＧＭ－ＣＳＦを受けることはできない。

一般に、必須ではない全ての医薬品（サプリメント、ハーブ薬などを含む）は、免疫抑制効果が認められない可能性があるため、白血球アフェレーシスの２週間前からＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与の２か月後まで中止すべきである。

６．２．許可されている併用薬及び治療
被験者は、放射線療法又は血漿交換療法を受けることが許可され、試験期間を通して緩和目的で交換される。治験責任医師が被験者の福祉のために必要であると考える他の診断又は治療は、治験責任医師の裁量で、医療の基準を守り、プロトコルを順守して実施され得る。

スクリーニング前の３０日の間に被験者によって摂取された全ての処方薬及び非処方薬、ビタミン、ハーブ薬、及び栄養補助食品は、スクリーニング来院時に記録される。来院毎に、併用薬が医療記録及び適切な電子症例報告書式（ｅＣＲＦ）に記録される。これらの医薬品の追加、削除、又は変更は文書化される。

６．３．支持療法ガイダンス
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入前に推奨される前医薬品には、６５０ｍｇのアセトアミノフェン及び２５～５０ｍｇの塩酸ジフェンヒドラミンが含まれる。これらの医薬品は、必要に応じて６時間毎に投与され得る。非ステロイド性抗炎症剤は、アセトアミノフェンによって制御できない発熱のために投与され得るが、しかしながら、出血のリスク及び腎機能など、被験者の耐容性に影響を与える可能性のある要因に関して、使用が慎重に考慮されるべきである。敗血症の精密検査は、予測されない重症度若しくは期間の発熱、又は他の示唆的な症候学について考慮されるべきである。全身性コルチコステロイドは、Ｔ細胞の生存に対する既知の悪影響、及びＴ細胞ベースの治験薬の結果としての有効性のため、下記の重度又は生命を脅かすＡＥによって必要とされない限り、投与されるべきでない。

治験責任医師は、ＡＥの管理において適切な医学的判断を使用しなければならず、コンディショニング化学療法の事象、並びにＣＲＳを含むＣＡＲ－Ｔ細胞療法の事象などの予測される事象が含まれる。ＣＲＳは、おそらくＣＡＲ－Ｔ細胞の投与に関連する最も一般的なＡＥであり、活性Ｔ細胞によって循環中に放出されるサイトカイン、及び複数の器官系における下流での影響を特徴とする。ＣＲＳはまた、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、全身性インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及び二重特異性ＣＤ１９－ＣＤ３ Ｔ細胞結合抗体であるブリナツモマブの注入後に認められている。ＣＲＳの発生率及び重症度は、急性リンパ芽球性白血病を有する患者における疾患負荷と相関することが報告されている。臨床的及び検査尺度は、軽度ＣＲＳ（例えば、全身症状、高熱）から重度ＣＲＳ及び／又は生命を脅かす可能性がある（例えば、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、吐き気、食欲不振、頻脈／低血圧、低酸素症、毛細血管漏出、血球減少症、心機能不全、腎障害、肝不全、播種性血管内凝固症候群）までの範囲に及ぶ。神経学的変化及び／又は脳浮腫は、重度又は致命的な転帰の可能性と関連している。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法におけるＣＲＳ管理の目標は、抗腫瘍効果の利益を維持しながら生命を脅かす状態を防ぐことであり、そのため、療法は一般に、ＣＲＳの症状及び／又はマーカーに合わせて慎重に調整される。例えば、コルチコステロイド及び他の攻撃的な免疫抑制剤は、ＣＲＳの効果的な治療であるが、ＣＡＲ－Ｔ細胞にしばしば毒性である。ＣＲＳの示唆される管理は、一般的にＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｅ，２０１４）及びＢｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｕｄｎｏ，２０１６）に従う。詳細な毒性管理推奨事項については、試験参考マニュアル（毒性参考マニュアル）を参照されたい。要約すると、グレード１のＣＲＳの対治療が示唆される。ＣＲＳは、被験者が液体若しくは１回低用量昇圧剤に応答する低血圧、又は低酸素流量（４０％ＦｉＯ２）若しくはグレード２の器官毒性に応答する軽度呼吸器症状を発症したときにグレード２として定義される。低血圧は重症度のグレード分類の主要な要因であるため、明確なベースライン血圧が療法の開始前に確立されることが不可避である。グレード２のＣＲＳを有する被験者に免疫抑制剤（トシリズマブ＋／－コルチコステロイド）を介入させる決定は、被験者がこの症候群に関連する血行動態の変化及び器官ストレスに耐えられると判断される程度よって影響される。高齢の被験者及び重大な併存症を有する被験者では、臨床的判断に応じて、グレード２のＣＲＳを有する被験者に免疫抑制で介入することが適切であり得る。輸液療法及び１回低用量昇圧剤が低血圧を戻すのに十分でない被験者は、重度又はグレード３のＣＲＳに分類される。同様に、低流量を越える酸素を必要とするか、又は凝固障害、腎機能不全、若しくは心機能不全を含むがこれらに限定されないグレード３の器官毒性の証拠を示す被験者は、グレード３とみなされるべきである。グレード３のＣＲＳを有する被験者は、おそらく１対１の看護ケアによる集中治療室で、非常に綿密に監視される必要がある。重要なことに、グレード２以上のＣＲＳを有する被験者では、心代償不全が生じ得、慎重な監視なしでは容易に明らかになり得ないため、心機能に慎重に注意が払われるべきである。心機能不全の懸念がある被験者では、頻繁な心エコーモニタリングが指示され得る。グレード３のＣＲＳを有する被験者は、進行のリスク及び不可逆的な器官機能不全の可能性があるため、グレード４への進行を防ぐ目的で、トシリズマブ及びコルチコステロイド（例えば、６時間毎に１０ｍｇのデキサメタゾンＩＶ）などの免疫抑制剤で治療されるべきである。グレード４のＣＲＳは、被験体が人工呼吸器の必要性又はグレード４の器官毒性など、直ちに生命を脅かす毒性を経験したときに生じる。グレード４のＣＲＳを有する全ての被験者は、炎症カスケードを抑制して不可逆的な器官機能不全を防ぐ試みにおいて、トシリズマブ（通常、１日に８ｍｇ／ｋｇを１～２日間）、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロンを１日に１ｇ、３日間）、リミデュシド（通常、０．４ｍｇ／ｋｇ）などの免疫抑制剤及び／若しくは細胞傷害性剤、並びに／又はシクロホスファミド（例えば１．５ｇ／ｍ^２）などの攻撃的な免疫抑制／細胞傷害剤（一般に、リミデュシドの使用が、全身毒性のある細胞傷害剤の使用よりも優先される）を用いて治療することが推奨される。これらの選択肢はまた、他の手段に非応答であるグレード３の毒性について考慮され得る。

必要に応じて、トシリズマブは通常、８ｍｇ／ｋｇの用量で１時間かけて静脈内投与され、２４～４８時間以内に臨床的改善が生じない場合は、用量を繰り返す選択肢を有する。トシリズマブに応答するＣＲＳを有する患者では、発熱及び低血圧がしばしば数時間以内に解消し、昇圧剤及び他の支持療法はその後すぐに取り止めることができる可能性がある。ただし、いくつかの症例では、症状が完全には解消され得ず、継続的な攻撃的支持が数日間必要になり得る。

被験者が制御不能なＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞増殖又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１に関連する可能性のある他の臨床的に重大なグレード３～４の毒性を発症した場合、治験責任医師は臨床シナリオ及び潜在的な交絡因子をレビューし、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロンを１日に１ｇ、３日間）、リミデュシド（一般的には、０．４ｍｇ／ｋｇ）などの免疫抑制剤及び／若しくは細胞傷害剤、並びに／又はシクロホスファミド（例えば、１．５ｇ／ｍ^２）などの攻撃的な免疫抑制剤及び／又細胞傷害剤による治療を考慮することが推奨される。

７．評価及び手順の予定
７．１．手順の予定
この試験に関する手順の予定は、単回投与における被験者と同じであり、スクリーニングからコンディショニング化学療法までの手順について表２に、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与からフォローアップまでの手順について表３に提供される。サイクル投与コホートに関する手順の予定表は、セクション１５．５に提供される。併用投与に関する手順の予定表は、セクション１５．６に提供される。同意の取得、スクリーニング、及び適格性の確認に続いて、セクション５．３に記載されているように、全ての被験者は、白血球アフェレーシス、コンディショニング化学療法、及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与を受ける。被験者は、定期的なフォローアップのために再来院し、各々がそれぞれのイベントの予定表に特定されている安全性、耐容性、及び抗骨髄腫応答の一連の評価を受ける。治療後のフォローアップ来院は、１０日目、２、３、４、６、８週目、３、４、５、６、７、８、９、１２、１５、１８、２１、及び２４か月目に生じる。

７．２．臨床評価
試験全体で行われる臨床評価及び手順は、イベントの予定表に概略される。これらの表に記載されていない評価タイミング幅は、試験参考マニュアルに見出され得る。

７．２．１．治療歴
全般的な治療歴及び人口統計は、スクリーニング時に記録され、試験でＡＥとみなされるいずれのベースライン症状又は医学的状態も記録される。組み入れ基準Ｎｏ．４に記載のように、スクリーニングの６か月前に得られたＭＭ評価の結果を含むＭＭ疾患歴も取得される。骨髄腫応答、セクション７．２．１０に記載のように収集される。

７．２．２．身体検査及び神経学的検査
神経学的検査を含む完全な身体検査がスクリーニングで、コンディショニング化学療法の開始前７２時間以内、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与前の－５日、０日目、及び投与の約１時間後、１、４、７、１０日目、２、３、４、６、及び８週目、及び３か月目から開始して２４か月間３か月毎に実施される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の投与後、神経学的検査（又は治験責任医師によって適切と考えられる他の評価）を含む身体検査が、観察されたＡＥ又は施設の基準によって臨床的に示される頻度で、しかし最小限試験来院毎に１回、繰り返されるべきである。

７．２．３．バイタルサイン
血圧、心拍数、呼吸数、Ｏ２飽和度、及び体温などのバイタルサインは、イベントの予定表に概説されているように、来院時に取得される。０日目に、バイタルサイン（体温、呼吸数、心拍数、Ｏ２飽和度、血圧）は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の前及び約１時間後、その後少なくとも１時間は１５分（＋／－５分）毎に、これらのサインが良好で安定するまで取得される。体重は、スクリーニング、登録、及び白血球アフェレーシス時に取得される。身長は、スクリーニング時にのみ記録される。

７．２．４．パフォーマンスステータス
ＥＣＯＧパフォーマンスステータスは、付録１５．１に記載のＥＣＯＧパフォーマンススケールを使用して、スクリーニング時及び－５日に評価される。

７．２．５．臨床安全性評価
被験者は、試験全体を通してＡＥについて評価される。ＡＥは、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥバージョン４．０３基準によってグレード分類される。ＡＥ及びＳＡＥの評価並びに報告の詳細は、セクション８に提供される。

７．２．６．心臓評価
１２誘導心電図（ＥＣＧ）は、スクリーニング、０日目（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の前及び投与約１時間後）、１、４、７日目、４週目、及び３か月目から開始して２４か月間３か月毎に取得される。心エコーはスクリーニング時にのみ取得される。

７．２．７．臨床検査評価
７．２．７．１．臨床化学及び血液学
臨床化学及び血液学臨床検査評価は、イベントの予定表に概略されているように実施される（化学パネル、Ｂ細胞及びＴ細胞を含む血液学、凝固）。

化学パネルには、ナトリウム、カリウム、塩化物、マグネシウム、重炭酸塩、血中尿素窒素、クレアチニン、カルシウム、アルブミン、グルコース、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、総タンパク質、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）／血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、ビリルビン（総及び直接）、及びアルカリホスファターゼが含まれる。凝固評価には、ＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）及びＰＴ（プロトロンビン時間）又は国際標準化比（ＩＮＲ）が含まれる。腫瘍溶解（尿酸及びリン酸塩）の評価は、ベースライン及び１、４、７日目、その後は臨床的に示されるときに行われる。

０日目に、化学パネル、Ｂ細胞とＴ細胞を含む血液学、及び凝固評価が、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の前及び投与の約１時間後に取得されるべきである。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の投与後、これら（又は治験責任医師によって適切と考えられる他の評価）は、観察されたＡＥによって、又は施設の基準によって臨床的に示されるような、しかし最低限１、４、７、及び１０日目に１日に１回、並びにイベントの予定表に概説される頻度で繰り返されるべきである。

血液学臨床検査評価には、全血球数、血小板、Ｂ細胞数（ＣＤ１９）及びＴ（ＣＤ３）細胞数、並びにＣＤ４及びＣＤ８（－３日と－４日以外の全ての時点）が含まれ、循環骨髄腫／形質細胞の評価（例えば、フローサイトメトリー又はマニュアル分画を用いたＣＢＣによる）が、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与前の時点で必要とされる。循環骨髄腫／形質細胞が登録及びベースライン試料で特定される場合、治験依頼者に連絡し、除外基準３及び１０に言及する。

７．２．７．２．妊娠検査
出産の可能性のある女性被験者は、スクリーニング時に血清妊娠検査が陰性でなければならず、コンディショニング化学療法を開始する前の７２時間以内に尿妊娠検査が陰性でなければならない。尿妊娠検査は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の各用量前、及びそれに続く２週目に開始する治療後来院時に実施される。

コホートＲ及びＲＰの女性被験者は、レナリドミドを開始する前に、２回の妊娠検査が陰性でなければならない。第１の検査は、被験者がレナリドマイド療法を開始する前の１０～１４日以内に、２回目の検査は２４時間以内に実施し、そして最初の１か月間は毎週、その後は月経周期が規則的な女性では毎月、月経周期が不規則な女性では２週間毎に実施しなければならない。

７．２．７．３．感染性疾患スクリーニング
臨床検査は、ＨＩＶ１及び２抗体、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎抗体、及びＨＴＬＶの存在についてのスクリーニング時に行われる。

７．２．８．サイトカイン放出症候群
ＣＲＳマーカー：ＣＲＰ、フェリチン、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γの検出のための血液試料は、イベント予定表に示されるように取得される。

７．２．９．簡易精神状態検査
簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）は、イベントの予定表に示されるように実施される。ＭＭＳＥには、全ての時点で被験者の手書きのサンプルが含まれるべきである。

７．２．１０．疾患応答評価
７．２．１０．１．ＰＥＴ－ＣＴ評価
ＰＥＴ－ＣＴスキャンによる疾患の評価は、コンディショニング化学療法を開始する前の７日以内にベースライン時に行われ、その後は臨床的に示されるときに取得される（例えば、応答評価の一部として、又は応答を確認するために画像化を必要とする軟組織形質細胞腫がベースライン時に認められた場合に８週毎）。

７．２．１０．２．応答及び応答率
骨髄腫応答の評価に関する臨床検査試料は、スクリーニング時、コンディショニング化学療法を開始する７日以内のベースライン来院、０日目（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与前）、２、３、４、６、８週目、３、４、５、６、７、８、９、１２、１５、１８、２１、及び２４か月目に採取される。

骨髄腫応答は、各被験者について、国際骨髄腫ワーキンググループ基準に従って、かつ標準的な評価に基づいて、臨床的に指示される時に（例えば、確証のための応答を示す評価後の１週間以内）評価され、血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥＰ）、尿タンパク電気泳動（ＵＰＥＰ）、血清免疫固定（ＳＩＦＥ）、尿免疫固定（ＵＩＦＥ）、血清遊離軽鎖（ＦＬＣ）、ＰＥＴ／ＣＴ（陽電子放出断層撮影法／コンピューター断層撮影法、肝臓背景）、及び／又は骨髄生検／吸引などが挙げられる。ベースラインの骨髄腫反応評価は、コンディショニング化学療法を開始する前の７日以内に行われなければならない。新鮮な骨髄生検及び吸引物は、スクリーニング時又はベースライン時（通常はコンディショニング化学療法の開始する７日以内）のいずれか、及び４週目、３、６、１２か月目、その後臨床的に示されたときに収集されるか、又は医療モニターの免除を有しなければならない。応答率は、各最善の全体的な応答カテゴリにおける被験者の数を試験集団の被験者の数によって除したものとして決定される。

７．２．１０．３．奏効までの時間
応答を有する被験者について、奏効までの時間は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の時間から最初に文書化された応答（部分奏効［ＰＲ］以上）の時間までで評価される。

７．２．１０．４．奏効期間
応答を有する被験者について、奏効期間は、最初に文書化された奏効（ＰＲ以上）の時点から、確認された疾患進行の時点までで（他の原因による死亡は削除される）評価される。

７．２．１０．５無増悪生存
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与時から確認された疾患進行又は死亡時までの無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、全ての被験者について評価される。

７．２．１０．６全生存期間
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与時から死亡時までの全生存期間（ＯＳ）は、全ての被験者について評価される。

７．２．１１長期フォローアップ
この試験におけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１で治療された全ての被験者は、この試験で最大２年間追跡される。このプロトコルを中止した後、同意している被験者は、別の長期安全性フォローアッププロトコル（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１－００２）に替えて、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の最終投薬後合計１５年間追跡される。

７．３探索的評価
７．３．１．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１Ｔ細胞の増殖及び持続性
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞（例えば、ベクターコピー／ｍＬ血液）は、イベントの予定表に記載されているＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の血液試料で定量化される。

７．３．２．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞組成物
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞（例えば、表現型、クローン性など）は、イベントの予定表に記載されているＰ－ＢＣＭＡ－１０１Ｔ細胞の血液試料を使用して、示されるように評価される。

７．３．３．免疫応答の評価
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１に対する免疫原性を評価するための試料は、イベントの予定表に示されるように収集される（免疫原性アッセイのための血液試料）。

７．３．４．可溶性ＢＣＭＡレベル
可溶性ＢＣＭＡは、イベントの予定表に示されるように、血液試料で測定される（ＢＣＭＡ及び他のバイオマーカーのための血液試料）。

７．３．５．ＭＭ細胞でのＢＣＭＡ発現
保存又は新鮮な腫瘍標本（例えば、骨髄）からの細胞は、ＢＣＭＡについてベースライン時及びイベントの予定表に示されるように評価される（中央検査室に保存した腫瘍、骨髄及び腫瘍の新鮮な試料、並びに／又はＢＣＭＡ及び他のバイオマーカーのための血液試料）。

７．３．６．ＢＣＭＡ抗原密度／発現、循環可溶性ＢＣＭＡ、及び臨床応答の間の関係
可溶性ＢＣＭＡ及びＢＣＭＡ発現の結果は、臨床応答と相関する。

７．３．７．レシピエントＢ細胞及びＴ細胞のレベル
レシピエントＢ及びＴ（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）細胞のレベルは、イベントの予定表に示されるように、血液学試料で定量化される（化学パネル、Ｂ細胞数及びＴ細胞数を含む血液学、凝固）。

８．有害事象の記録
主席治験責任医師は、ＡＥ又は重篤有害事象（ＳＡＥ）の定義を満たす事象を検出、文書化、及び報告する責任がある。個々のＡＥは治験責任医師によって評価され、ｅＣＲＦを介して治験依頼者に報告されるべきである。これには、強度、治験薬及び／又は併用療法とＡＥとの因果関係、重大性などの評価が含まれる。

８．１ ＡＥ及びＳＡＥ情報を収集する期間
全てのＡＥ及びＳＡＥは、登録から２４か月目の来院、又はプロトコルからの離脱のいずれか短い方まで収集される。

８．２有害事象の定義
医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）のとおり、ＡＥとは、医薬品を受けた対象者又は臨床治験被験者における任意の不都合な医学的発生である。事象は、ＡＥである試験治療と必ずしも因果関係を有しない。したがって、ＡＥは、治験薬に関連すると考えられるか、又は考えられないいずれでも、治験薬の使用に一時的に関連する任意の好ましくなく意図されない徴候（異常な臨床検査所見を含む）、症状、又は疾患であることができる。既存の状態は、それらが試験中に悪化する場合にのみＡＥとして報告されるべきである。試験中のがんの進行及びその症状は、治験責任医師によって薬物関連と考えられない限り、有害事象とみなされない。新たな異常な臨床検査所見は、それらが治療を必要とするか、又は治験責任医師によって臨床的に重要であると考えられる場合にのみ、ＡＥとみなされるべきである。

ＡＥは、診断又は可能性のある診断を使用してｅＣＲＦに記録し、強度、因果関係、及び重大性に関連させるべきである。診断がない場合、個々の症状又は所見が記録され、追加情報が利用可能になると、最終診断を反映するためにｅＣＲＦを更新させる。

全てのＡＥは、以下まで追跡されるべきである。
ベースラインまで解消又は改善される。
治験責任医師が、更なる改善は期待できないと確証する。
試験の完了又は中止で、ＡＥは３０日間、又は上記基準のうちの１つが満たされるまで追跡される。進行中のＡＥは、記録され続け、長期フォローアップ試験で監視される。

８．２．１．強度の評価
有害事象は、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥバージョン４．０３に従ってグレード分類される。治験責任医師は、この５段階スケール（グレード１～５）を使用して全てのＡＥの強度を評価し、ｅＣＲＦに記録する。ＮＣＩ ＣＴＣＡＥに具体的に列挙されていないＡＥは、表４に従ってグレード分類されるべきである。

８．２．２．因果関係の評価
治験責任医師は、ＡＥと治験薬（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１及び／又はリミデュシド（投与される場合））との間の因果関係を、自分の最善の臨床的判断に従って評価する。ことによると／おそらく／確実に関連するという評価は、因果関係の証拠があることを伝えることを意図しており、関係を排除できないことを意味しない。治験責任医師は、評価を行う際に、基礎疾患の自然歴、リンパ球枯渇化学療法、併用薬、及び他のリスク因子などの代替原因を考慮すべきである。次のスケールがガイダンスとして使用される。
関連なし－被験者は治験薬を受けていなかったか、治験薬の投与に対するＡＥ発症の時系列が合理的でないか、又はＡＥの可能性が高い別の原因がある。
関連しそうもない－ＡＥは、Ｔ細胞注入と時間的に合理的に相関しておらず、ＡＥは別の原因によって説明される可能性があるが、事象の発症又は重症度に対するＴ細胞注入の理論的影響は、多因子の状況では可能性が低い
ことによると関連する－治験薬への曝露の証拠があり、Ｔ細胞注入に対するＡＥ発症の時系列は妥当と思われ、治験薬がＡＥを引き起こしたという合理的な説明があり、治験薬がＡＥを引き起こした可能性が他の説明と同等である。
おそらく関連する－治験薬への曝露の証拠があるか、Ｔ細胞注入に対するＡＥ発症の時系列は妥当と思われるか、ＡＥは、治験薬の以前の知識と一致するパターンを示すか、又はＡＥは他のいずれの原因よりも治験薬によって説明される可能性が高い。
確実に関連する－治験薬への曝露の証拠があるか、Ｔ細胞注入に対するＡＥ発症の時系列は妥当と思われるか、ＡＥは、治験薬の以前の知識と一致するパターンを示すか、又はＡＥは治験薬によって説明される可能性が最も高く、他のいずれの原因も起こりそうにない。

治験責任医師は、追加情報を受け取った場合、因果関係の自分の意見を変更し、それに応じてＡＥ ｅＣＲＦを修正し得る。治験責任医師の因果関係評価は、治験依頼者がＳＡＥの規制報告要件を決定するために使用する基準のうちの１つである。

８．３重篤有害事象（ＳＡＥ）の報告
ＳＡＥは、
死亡をもたらすＡＥ（注：死亡は結果として記録され、死亡に至る開始事象が事象として記録されるべきである）、
生命を脅かすＡＥ（注：「生命を脅かす」という用語は、被験者が事象時に死の直接のリスクにあった事象を指し、それが更に重篤であると死亡を仮説上引き起こし得た事象は指さない）、
試験中の疾患を含む、悪化していない既存の状態に関連する選択的又は診断的処置（例えば、手順及び入院を特定した試験）を除いて、入院又は既存の入院の延長を必要とするＡＥ、
永続的又は重大な無能力をもたらすＡＥ、
先天異常／先天性欠損であるＡＥ。
医学的に重要であるか、又に列挙される１つ以上の結果を防ぐために介入を必要とするＡＥ、のいずれかのＡＥである。

医学的及び科学的判断は、ＡＥが上記の定義外で重篤であると分類されるのに十分な重大な医学的重要性があるか決定する際に行使されるべきである。死をもたらし得ないか、生命を脅かし得ないか、又は入院を必要とし得ない重要な医学的事象は、適切な医学的判断に基づいて、対象を危険にさらし得、上記に列挙される結果うちの１つを防ぐために医学的又は外科的介入を必要とし得る場合、重篤であるとみなされ得る。例えば、薬物の過剰摂取又は乱用、入院に至らなかった発作、又は救急部門での気管支痙攣の集中治療は、通常、重篤であるとみなされる。

この試験は、全ての地域の規制要件を遵守し、臨床安全性データ管理に関するＩＣＨガイドライン、優先報告の定義及び基準、トピックＥ２（ＩＣＨ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｄｉｔｅｄ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ，Ｔｏｐｉｃ Ｅ２）、並びにＩＮＤに関するＦＤＡ安全性報告要件（ＦＤＡ Ｓａｆｅｔｙ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＩＮＤｓ），２１ ＣＦＲ ３１２．３２の全要件に忠実である。

８．４．特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）
ＡＥＳＩは、ＣＡＲ－Ｔ細胞製品に関して特に注目すべき事象であり、したがってセクション８．５で説明されるように、独自の報告要件を有する。現在、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１に関するＡＥＳＩには以下が含まれる。
１．原因にかかわらず、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の注入から３０日以内に発生した全ての死亡。
２．グレード４以上の製品注入反応。
３．グレード４以上のサイトカイン放出症候群。
４．グレード４以上の神経毒性。
５．新たな悪性腫瘍。
６．既存の神経障害の新たな発生又は悪化。
７．以前のリウマチ性又は他の自己免疫疾患の新たな発生又は悪化。
８．血液疾患の新たな発生。

８．５．ＳＡＥ及びＡＥＳＩに関する規制報告要件
ＳＡＥ／ＡＥＳＩは、試験職員の事象発見の２４時間以内に、記入済みのＳＡＥ／ＡＥＳＩレポート書式を電子メール又はファックスによって治験依頼者又は被指名人に報告しなければならない。ＳＡＥ／ＡＥＳＩレポート書式は、安全性報告の主要なデータ源である。報告手順は試験参考マニュアルに記載されている。ＳＡＥ／ＡＥＳＩレポート書式の提出後すぐに、メディデータ内のｅＣＲＦ登録が各イベント期間について要求される。データフィールドは、ＳＡＥ／ＡＥＳＩレポート書式で報告されたものと一致しなければならない。

８．６．妊娠
参加基準に記載されているように、被験者は、スクリーニング時から試験全体を通して避妊を実施しなければならない（出産の可能性のある男性及び女性の両方）。

コホートＲ、ＲＰ、又はＲＩＴの女性は、治療を開始する４週前に始めて、治療中、用量中断中、並びにレナリドミドの中断後４週間及びリツキシマブの最終投与後１２か月継続して、性交を継続的に控えるか、又は信頼性のある避妊のうちの２つの方法を使用することを約束しなければならない。

レナリドマイドは、妊娠中の女性に投与すると胚－胎児の危害を引き起こす可能性があり、作用機序及び所見に基づいて妊娠中は禁忌である。レナリドマイドは、この薬物を受けている患者の精液に存在する。したがって、コホートＲ又はＲＰの男性は、精管切除が成功している場合でも、レナリドマイドを服用している間、及びレナリドマイドを中止した後に最大４週間、生殖能力のある女性と性的に接触する間は常にラテックス又は合成コンドームを使用しなければならない。レナリドミドを服用している男性患者は、精子を提供してはならない。

妊娠中の女性におけるＰ－ＢＣＭＡ－１０１又はリミデュシドの前臨床又は臨床試験データはないが、しかしながら、この全治療レジメンは、理論的には胚毒性を示す可能性がある。母乳への影響は不明であり、したがって、スクリーニング時から始まる試験期間中、及び治験薬（Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１又はリミデュシド、レナリドマイド、又はリツキシマブ）の最後の用量を受けた後、少なくとも１２か月間、又は被験者の血液中に持続性／遺伝子改変細胞の証拠がなくなった後の４か月のいずれか長い方で、母乳育児を中止すべきである。

妊娠（又は男性被験者のパートナーの妊娠）は、妊娠が治験薬との相互作用による避妊の失敗の結果である可能性があると信じる理由がない限り、又は胎児に有害な転帰がない場合、ＡＥ／ＳＡＥとはみなされない。しかしながら、治験責任医師は全ての妊娠を直ちに治験依頼者に報告する。試験中に妊娠し、妊娠したままの女性は、試験を中止し、ＬＴＦＵ試験に参加することになる。妊娠の結果はまた、治験依頼者に報告されなければならない。

９．安全性モニタリング
９．１．安全委員会
治験責任医師及び治験依頼者の臨床代表者で構成される安全委員会が設立され、全ての被験者及び続く各コホートについてデータを定期的にレビューして、用量の漸増を決定する。安全委員会は、コホートの拡大を推奨して安全性、及びＤＬＴが最初のコホートに観察された場合に第１相中により低い用量の探索を更に評価し得、第２相中に安全性、中止、及び一時中止の基準を管理し続ける。

９．２．投薬を休止するか、又は試験を中止するための基準
試験で定義されたＤＬＴ又は任意の治療に関連した死亡が発生した場合、新たな被験者の投薬は、安全委員会が会合し、事象をレビューし、試験を中止すること、その後の用量レベルを低下させること、追加の安全手順若しくは試験修正を制定すること、計画されたとおりに試験を継続すること、又はイベントに適切な他の手段を含み得る、その後の計画を決定するまで休止される。前述のように、６名の被験者のうち２名以上が第１相中のコホートでＤＬＴを有し、発生率＞１０％の＞グレード４若しくは発生率＞３０％の＞グレード３のＣＲＳ、又は治療された＞１０名の患者で第２相における対応する用量レベル以下での神経毒性を有する場合、その用量レベルはＭＴＤを超えており、いかなる更なる投与も、より低い用量レベルで行われる。

１０．統計及びデータ分析
この試験の第１相は、ＤＬＴの発生率が３３％未満になる用量を決定することを目的とした用量コホートの標準的な３＋３設計である。

この試験の第２相は、非盲検、単回投与、有効性及び安全性の評価である。全てのエンドポイントにおける分析の詳細は、統計分析計画（ＳＡＰ）に提供される。

１０．１．試験集団
治療意図（ＩＴＴ）集団は、試験に登録された全ての被験者を含む。

安全性集団は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与を受ける全ての被験者を含む。

プロトコル毎の集団は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１のプロトコル指示用量を受ける全ての被験者を含む（例えば、プロトコル指示用量よりも少ない量を受ける患者は、別のサブグループとして分析される）。

１０．２．サンプルサイズの計算
試験の第１相部分は、ＤＬＴの発生率が３３％未満になる用量を決定することを目的とした用量コホートの標準的な３＋３設計である。したがって、最大１２０名の被験者を登録して、用量漸増、サイクル投与、及び併用投与中に被験者６名の１８コホートの可能性、並びにＤＬＴの完了前に中止する者と交換して、コホートにおける結果を更に評価するために登録され得る被験者を含み得る。

試験の第２相部分では、応答率エンドポイントを試験して、最近承認された標準治療薬ダラツムマブを用いてｐ＜０．０５で得られた≦３０％の応答率を除外する。１００名の被験者サンプルを用いて、試験の第２相部分は、９０％の検出力を有し、３０％の応答率に対して１５％パーセントポイントの改善を検出する。この検出力計算は、片側有意水準０．０５の二項比率に関する直接検定に基づいている。

１０．３．統計的方法
人口統計学的及びベースライン特性、安全性、並びに有効性データは、適切な記述統計量を使用して要約される。データ分析は、用量コホート毎に提供され、その上、必要に応じて全ての被験者を組み合わせて提供される。平均、中央値、標準偏差、及び範囲を含む記述統計量が、連続変数について計算され、カテゴリデータが、数値及びパーセンテージを使用して要約される。応答率エンドポイントでは、点推定及び両側二項９５％信頼区間が計算される。イベントまでの時間変数は、カプランマイヤー法を使用して要約される。

治療に起因するＡＥ（ＴＥＡＥ）は、コホート毎の被験者の数及び割合を使用して、組み合わせた全ての被験者ついて要約される。ＴＥＡＥは、重症度及び関係性によっても要約される。併用医薬品は、用量コホート毎に被験者の数及びパーセンテージを使用して要約される。

バイタルサイン、ＥＣＧ測定、及び臨床検査結果は、コホート毎に観測された値及びベースライン値からの変化について記述統計量を使用して要約される。臨床検査結果はまた、コホート毎に正常範囲（未満、以内、又は超）と比較して要約される。

応答率は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与後の各被験者の最善の応答を、国際骨髄腫ワーキンググループ統一応答基準（付録１５．２）に従って対応するベースライン値と比較することによって決定される（Ｒａｊｋｕｍａｒ，２０１１、Ｋｕｍａｒ，２０１６、Ｃａｖｏ，２０１７）。全奏効率（ＯＲＲ）は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受けており、ＰＲ、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、完全奏効（ＣＲ）、又は厳密な完全奏効（ｓＣＲ）を達成している被験者から、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受けている全ての被験者にわたって決定される。各個別の応答カテゴリにおける応答率も決定される。同様に、８週間での不変疾患（ＳＤ）の割合、及び最小奏効（ＭＲ）も決定される。奏効までの時間及び奏効期間が、応答が得られた被験者について決定される。ＯＳ、及びＰＦＳも、国際骨髄腫ワーキンググループ基準に従って全ての被験者について決定される。

３５名の被験者が登録され、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を受け、４か月間フォローアップされるか、又は４か月のフォローアップ前に進行すると、無益性分析が行われる。この分析セットは、無益性分析セット（ＦＡＳ）と呼ばれる。無益性分析では、ＦＡＳで観察されたＢＯＲの比率に基づいて、１から条件付検出力（ＣＰ）を減じた値に等しい無益性指数（ＦＩ）を使用する。ＦＩが０．８０を超える場合（つまり、ＣＰが０．２０を下回る場合）、試験は中止され得る。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞の追加注入を受ける被験者は、全ての結果について個別のサブグループとして分析される。

１１．データ取り扱い及び記録保存
１１．１．秘密性
試験対象者に関する情報は機密として維持され、１９９６年の医療保険の相互運用性と説明責任に関する法律（Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ Ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ａｃｃｏｕｎｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｃｔ）（ＨＩＰＡＡ）及び他の任意の適用される法律、規制、及びガイドラインの要件にも従って管理される。これらの規制では、対象者に以下を知らせる署名された対象者承認が要求される。
この試験で被験者から収集される保護医療情報（ＰＨＩ）は何か
誰がなぜその情報にアクセスできるのか、
誰がその情報を使用又は開示するか
試験被験者が自分のＰＨＩの使用に関する承認を取り消す権利

被験者がＰＨＩの収集又は使用の承認を取り消す事象では、治験責任医師は、規則により、被験者の承認の取り消し前に収集された全ての情報を使用できる権限が維持される。ＰＨＩの収集又は使用の許可を取り消された被験者については、それらの予定された試験期間の終了時に、少なくともバイタル状態（すなわち、被験者が生存している）を収集するための許可を取得する試みを行うべきである。

１１．２．データ管理
ＥＤＣシステムを使用して、この試験に関係するデータを収集する。治験データはｅＣＲＦを通じて取り込まれる。ＥＤＣシステム内で、ｅＣＲＦデータは施設スタッフによって入力され、全てのソースドキュメントの検証及びデータクリーニングは、治験依頼者又は被指名人（例えば、医薬品開発受託機関［ＣＲＯ］）によって行われる。

ＥＤＣシステムに関する仕様は、ＥＤＣシステムが実際使用のためにリリースされる前に文書化され、承認される。ｅＣＲＦデータの検証は、データ管理計画に定義される。データがｅＣＲＦに入力されるとき、検証チェックが行われ、必要に応じて、質問が生じる。生じた全ての質問は、ＥＤＣデータベースに保持される。

ＥＤＣシステムは、ＣＦＲ２１ Ｐａｒｔ １１要件を遵守するように設計されている検証済みのソフトウェアプログラムである。全てのユーザーは、独自のユーザー名及びパスワードを介してシステムにアクセスする。システム内で行われた全てのアクションの全監査履歴が維持される。ユーザーアカウントは、各ユーザーが自分の役割に該当するタスクのみを行うことができ、自分の役割に該当するデータにのみアクセスを有することを確実にする。

標準的なコード化辞書である世界保健機関（ＷＨＯ）規制活動のための薬物及び医療辞書（Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）（ＭｅｄＤＲＡ）を使用して、医薬品、ＡＥ、及び治療歴をコード化する。

全てのデータが入力されており、全てのデータクリーニングが完了すると、データはロックされ、分析及び報告に使用可能になる。

試験が完了すると、関連する全ての質問及び監査履歴を含む全てのｅＣＲＦデータは、治験依頼者及び施設の両方に、ＣＤ又はＵＳＢドライブで利用できるようにする。

１１．３．ソースドキュメント
ソースデータは、臨床試験の再構築及び評価のために必要である、臨床試験における臨床所見、観察、又は他の活動の元の記録である全ての情報である。ソースデータは、ソースドキュメントに含まれる。これらの元の文書及びデータ記録の例には、病院の記録、臨床及び事務のカルテ、検査室ノート、メモ、被験者の日記又は評価チェックリスト、薬局の調剤記録、自動機器からの記録データ、検証後に正確で完全であることが証明されたコピー又は転記、マイクロフィッシュ、写真のネガ、マイクロフィルム又は磁気メディア、Ｘ線、被験者ファイル、臨床試験に関与する薬局、検査室、及び医療技術部門で維持されている記録などが含まれる。

治験責任医師は、ｅＣＲＦに関する情報が引き出されたソース文書を確実に利用できるようにしなければならない。

治験責任医師は、治験依頼者、それぞれの国、地方、又は外国の規制当局、ＩＲＢ／ＩＥＣ及び監査人の権限を与えられた代表者が施設を査察し、治験責任医師の施設ファイル及び本治験に関連する全てのソースドキュメントに直接アクセスすることをメディアの種類に関わらず許可しなければならない。

１１．４．症例報告書式
登録された各被験者について、記入済みのｅＣＲＦは、主席治験責任医師又は権限を与えられた代表者によってレビューされ、署名されなければならない。被験者が試験を離脱する場合、その理由がｅＣＲＦに記載されなければならない。

治験責任医師は、ｅＣＲＦ及び要求される全てのレポートで治験依頼者に報告されるデータの正確性、完全性、読み易さ、及び適時性を確実にすべきである。

１１．５．記録保持
国で販売申請が最後に承認されてから少なくとも２年間、国で保留中若しくは計画中の販売申請がなくなるまで、又は治験薬の臨床開発の正式な中止から少なくとも２年が経過するまで、試験に不可欠な文書を保持することは治験責任医師の責任である。これらの文書は、治験依頼者との合意によって必要とされる場合、より長期間保持されなければならない。かかる場合、これらの文書を保持する必要がなくなる時期について治験責任医師／機関に通知するのは治験依頼者の責任である。

１２．試験監視、監査、及び精査
１２．１．試験監視計画
この試験は、書面による監視計画に従って監視される。治験責任医師は、かかる監視活動に十分な時間を割り当てる。治験責任医師はまた、監視者又は他の遵守若しくは品質保証のレビュー担当者が、上記の全ての試験関連文書及び試験関連施設（例えば、薬局、診断検査室など）へのアクセスを与えられ、監視視察を実施する十分なスペースを有することを確実にする。

１２．２．監査及び査察
治験責任医師は、ＩＲＢ／ＩＥＣ、治験依頼者、政府規制機関、並びに大学コンプライアンス及び品質保証グループによる、治験に関連する全ての文書（例えば、ソースドキュメント、規制文書、データ収集装置、試験データなど）の試験関連監視、監査、及び査察を許可する。治験責任医師は、該当する試験関連施設（例えば、薬局、診断検査室など）の査察に対する適応能力を確実にする。この試験における治験責任医師としての参加は、政府規制当局並びに該当する大学コンプライアンス及び品質保証機関による査察の可能性の容認を意味する。

１５．付録
１５．１．ＥＣＯＧパフォーマンスステータス

１５．２．ＩＭＷＧ統一応答基準

実施例５－リミデュシド及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１併用治療
１５．３．リミデュシド
１５．３．１．はじめに
リミデュシド（別名ＡＰ１９０３）（リミデュシド治験責任医師の小冊子も参照）は、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）安全スイッチ遺伝子を導入した細胞療法のための活性化剤として、第１相ヒト試験で以前に評価されている低分子治験薬である。リミデュシドは、細胞内で操作されたタンパク質のクラスター化を誘導することによって作用する二量体化剤と呼ばれるクラスの化合物のメンバーである。リミデュシド誘導性細胞死は、フレキシブルリンカーを介してヒトデルタカスパーゼ－９に連結されたヒトＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ドメインを含むキメラタンパク質を発現することによって達成される。リミデュシドは、内因性ＦＫＢＰと最小限に相互作用するＦＫＢＰ１２の操作された高親和性型に結合する細胞透過性合成リガンドである。このキメラタンパク質は、リミデュシドの投与まで細胞内で静止しているが、ＦＫＢＰ１２ドメインと架橋結合し、改変されたカスパーゼ－９分子の二量体化を開始して、細胞アポトーシスをもたらす（Ｚｈｏｕ，２０１５ａ）。リミデュシドの単回静脈内注入は、ｉＣ９遺伝子を発現する細胞におけるアポトーシス及び最終的な細胞死を引き起こすが、形質導入されていない細胞には影響せず、それ自体には治療上の利益を有しない。リミデュシドの提唱された使用は、かかる選択的な細胞殺傷が、特定の重度又は生命を脅かす有害事象を被験者に生じる事例で臨床的に示される場合、「レスキュー療法」としてＰ－ＢＣＭＡ－１０１と併用して使用される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、ＢＣＭＡを発現する骨髄腫がん細胞を標的にして排除するように遺伝子改変されている自己Ｔ細胞からなる独占のＣＡＲ－Ｔ製品であり、これらのＴ細胞はまた、ｉＣ９ベースの安全スイッチ遺伝子を担持する。リミデュシドは、０．４ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与される。リミデュシド製剤は、溶液８ｍＬ中に４０ｍｇのリミデュシドを含有する注射用滅菌溶液（５ｍｇ／ｍＬ）として供給され、そして注入投与前に注射用に０．９％滅菌生理食塩水で更に希釈される。

リミデュシドを用いた非臨床試験は、リミデュシドベースの安全スイッチを形質導入された初代ヒトＴリンパ球が、（１）それらの機能を保持し、（２）リミデュシドへの曝露によって高い効率、効力、及び特異性で排除され得ることを実証した（Ｔｈｏｍｉｓ，２００１）。インビトロ及びインビボ試験が、リミデュシド及びｉＣ９ベースの安全スイッチ含有ＣＡＲ－Ｔ細胞製品Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１を用いて、Ｐｏｓｅｉｄａによって実施されており、同様の結果である。ラットにおけるＧＬＰ反復用量静脈内毒性試験は、最近Ｐｏｓｅｉｄａによって実施されている。結果は、反復（３回）静脈内投与後、＞１５ｍｇ／ｋｇのＮＯＡＥＬを示した。リミデュシドの顕著な毒性効果は観察されなかった。（更なる詳細について、リミデュシド治験責任医師の小冊子を参照）。

リミデュシドは、健常なボランティアを含む第１相臨床試験、及びｉＣ９ベースの安全スイッチ遺伝子を担持する他の遺伝子組換えＴ細胞製品で治療された移植患者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）について以前評価されており、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１と併用したリミデュシドの臨床使用の可能性を裏付ける。これまでに公表されたリミデュシドの臨床試験では、重大な有害事象はなく、及びバイタルサイン、ＥＣＧ、血清生化学、血液学、凝固パラメーター、又は尿検査の結果に臨床的に重大な変化はなかった。ＧＶＨＤを発症し、０．４ｍｇ／ｋｇのリミデュシドを２時間注入として受けた被験者では、改変Ｔ細胞の９０％がリミデュシド注入後３０分以内に排除され、次の２４時間で更に対数的に枯渇した。ＧＶＨＤは、これらの患者では再発することなく完全に解消した（Ｚｈｏｕ，２０１５ｂ、Ｉｕｌｉｕｃｃｉ，２００１、Ｄｉ Ｓｔａｓｉ，２０１１、Ｋａｐｏｏｒ，２０１６、Ｚｈｏｕ，２０１６）。

意図された使用におけるリミデュシドのリスクベネフィットは、高度に有利であるように思われる。リミデュシドは、有効用量範囲（０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇ）内及びそれを超えて、実質的に毒性を伴わずに、一貫した直線的な薬物動態を有するようである。これは、ｉＣ９ベースの安全スイッチ導入した同種異系Ｔ細胞によって誘発される重篤な疾患（ＧＶＨＤ）の排除を示す臨床データ、及び臨床的に示されるときに、ｉＣ９ベースの安全スイッチ遺伝子を担持する自己ＣＡＲ－Ｔ細胞の同様の排除の予想を示す臨床データと非常によく釣り合っている。

１５．３．２．治験使用
リミデュシドは、セクション６．３及び試験参考マニュアル（毒性参考マニュアル）に記載されるように、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１に重大な有害反応を経験する被験者のために使用され得る。一般に、グレード４のＣＲＳを有する被験者は、他の標準的な手段（例えば、トシリズマブ、ステロイド、及び／又は細胞傷害性／免疫抑制剤）に加えて、リミデュシドで治療され得る（一般的に、リミデュシドの使用は、全身性毒性細胞傷害性剤の使用よりも優先される）。この選択肢は、他の手段に応答しないグレード３の毒性についても考慮され得る。被験者が制御不能なＰ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞増殖又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１に関連する可能性のある他の臨床的に重大なグレード３～４の毒性を発症する場合、リミデュシドの使用も他の標準的な手段に加えて考慮される。治験責任医師は、投与前に臨床シナリオ及び潜在的な交絡因子をレビューすることが推奨される。時間が許せば、試験医療モニターに相談し、リミデュシド使用書式を記入すべきである。事前に定義された絶対的な組み入れ又は除外基準はない。

１５．３．３．試験治療
１５．３．３．１．リミデュシドの投与
１５．３．３．１．１．説明
リミデュシド製剤の投与形態は、注射用無菌溶液である。製剤は、４０ｍｇのリミデュシドを含有し、静脈内注入による投与前に、注射用無菌０．９％生理食塩水で更に希釈されることが意図される。

無菌リミデュシド溶液、５ｍｇ／ｍＬは、灰色のブチル栓及びアルミニウム製オーバーシールを備えたタイプ１ガラス１０ｍＬバイアルに８ｍｌ充填として提供される。リミデュシド注射、５ｍｇ／ｍＬの定量的組成が表５に提供される。

１５．３．３．１．２．供給及び保存
製剤は２～８℃で冷蔵保存すべきである。希釈及び投与の前に、製剤は室温に戻し、反転によって数回混合して、以下のプロトコルの指示に従って、確実に透明で均一な溶液にすべきである。

１５．３．３．１．３．調製物
１．使用すべきリミデュシド注射の投与量を、体重に基づいて、０．４ｍｇ／ｋｇの用量及び５ｍｇ／ｍＬのリミデュシド注射液の濃度を使用して計算する－体積（ｍＬ）＝０．４ｍｇ／ｋｇ×被験者体重（ｋｇ）／５ｍｇ／ｍＬ（例を表６に示す）。各バイアルには８ｍＬのリミデュシドが含まれており、そのため１本を超えるバイアルが必要とされ得る。
２．バイアルを周囲の室温にする。各バイアルは、使用前に反転によって混合し、確実に透明で均一な溶液にすべきである。いかなる目視可能な粒子又は曇りについても目視で確認する。滅菌針及び滅菌１０ｍＬ Ｂ．Ｄ．ルアーロックシリンジを使用して、バイアルから計算された量のリミデュシド注射液を無菌的に、チューブ付きの０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰを含む市販の１００ｍＬ ＥＶＡ ＤＥＨＰフリー輸液バッグに移す。反転によって混合する。
３．約５０ｍＬ／時間の注入速度で投与する。

１５．３．３．１．４．投薬及び投与
指示される場合、リミデュシドは、０．４ｍｇ／ｋｇの用量で約２時間の静脈内注入として投与されるべきである。

１５．３．４．併用薬及び治療
併用薬及びリミデュシドによる治療に制限又は要求事項はない。

１５．３．５．評価及び手順の予定
リミデュシドの使用の場合に従うべきイベント及び手順の予定が表７に示される。

セクション６．３に記載されるように特定のＡＥの発生事象では、リミデュシドの使用が考慮されるべきである。リミデュシド使用書式に記入し、時間が許せば、医療モニターによってレビュー及び承認される。リミデュシドの同意は、主試験のＩＣＦに含まれる。

Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１ Ｔ細胞のための血液試料は、リミデュシド注入前、その後１、２、４、８、２４時間後、２、４、７日目、２、３、４、週目、及びリミデュシド薬物動態のために、１、２、４、８、及び２４時間後に収集される。臨床化学、血液学、及び凝固の臨床検査評価は、１、２、４、７日目、及び２、３、４週目に行われる。来院は、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１で必要とされる試験来院と一致するように、禁止された時間枠内で調整され得、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の評価予定で実施される臨床検査評価は、リミデュシドの評価予定で重複させる必要はない。

フォローアップは、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１イベント予定（表７）に従って継続され、６、８週目、３か月目、及びその後３か月毎に来院が生じる。

１５．３．６．有害事象の記録
有害事象を記録する手順について、セクション８を参照する。有害事象は試験ＣＲＦに記録されるべきであり、適切な場合はリミデュシドに割り当てられた属性でマークされる。

１５．４．Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１による再治療
被験者の疾患が進行したときに十分なＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞が製造から残存している場合、安全委員会の承認で、追加の細胞が、用量制限毒性評価を正常に完了している最高用量レベルまで投与され得る。追加のＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞注入を受けるために、被験者は新たな被験者識別番号が割り当てられ、セクション４に概説されるように全ての適格基準を満たさなければならず、表８及び表９に概説されるように、同じスクリーニング、登録、コンディショニング化学療法手順、及び白血球アフェレーシスを除くフォローアップ手順を受ける。

１５．５．サイクル投与
第１相－サイクル投与中、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の複数回用量が、２週間の２サイクル（コホートＡ及びコホートＣ）又は３サイクル（コホートＢ）で静脈内投与される。投与される総用量は、第１相単回用量漸増中に決定される≦ＭＴＤで開始し得る。

コホートＡ及びＢの両方における第１のサイクルでは、総用量の１／３が投与される。コホートＡでは、総用量の最大２／３が第２のサイクルで投与される。コホートＢでは、総用量の最大１／３が第２のサイクル及び第３のサイクルの各々で投与される。コホートＣでは、総用量の最大２／３が第１のサイクルで投与され、総用量の最大１／３が第２のサイクルで投与される。試験設計の概略は、コホートＡ及びコホートＣについて図１６に、コホートＢについて図１７に示される。

単回投与について記載した同じ３＋３用量漸増及び／又は脱漸減規則を利用する。例えば、単回投与の現在の最大用量がＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞１５×１０^６個／ｋｇである場合、コホートＡのＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞１５×１０^６個／ｋｇは、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞５×１０^６個／ｋｇ、その後２週間で最大Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１細胞１０×１０^６個／ｋｇの注入から構成され、このコホート又はＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞２０×１０^６個／ｋｇでの単回投与コホートの結果が漸増の基準を満たしている場合、コホートＡのＰ－ＢＣＭＡ－１０１細胞２０×１０^６個／ｋｇを開始し得る。

コホートＡ、Ｂ、及びＣにおけるコンディショニング化学療法によるスクリーニングイベントの予定が表１０に示される。サイクル投薬のためのＰ－ＢＣＭＡ－１０１投与のイベント予定が、コホートＡ及びコホートＣについて表１１、コホートＢについて表１２に示される。コホートＡ、Ｂ、及びＣにおける治療後フォローアップのイベント予定が表１３に示される。

実施例６－Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１併用投与
１５．６．第１相－併用投与
第１相－併用投与では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は承認された療法と組み合わせて投与される。

レナリドマイド
コホートＲ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週前から開始して、２８日毎に２１日間、経口によってレナリドマイドを１日に１０ｍｇ、及び

コホートＲＰ：アフェレーシスの１週前から開始して７日間、及びＰ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１週前から開始して２８日毎に２１日間、経口によってレナリドマイドを１日に１０ｍｇ。

レナリドマイドの投薬は、疾患が進行しない限り、コホートＲ及びコホートＲＰで継続する。処方情報については、レナリドマイドの添付文書を参照する（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ，２０１９）（特に、レナリドマイドは催奇形物質と推定され、妊娠の回避及びモニタリングが必要であることに注意する）。以下は、このプロトコルに特有な追加の推奨事項である。ＤＬＴが報告されておらず、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与の２８日後に血小板が＞５０，０００／μＬ及び好中球が＞１０００／μＬである場合、用量は２８日毎のうち２１日間、経口によって１日に２５ｍｇに増加され得る。この用量で治療された最初の６名の患者で＜２名のＤＬＴが報告された場合、全ての患者における開始用量は、安全委員会の決定で、２８日毎に２１日間、経口によって１日に２５ｍｇに増加され得る。治療中に、好中球が＜１０００／μＬに減少した場合、＞１０００／μＬになるまでレナリドマイドを保留し、５ｍｇの低用量で再開する。治療中に、血小板が＜３０，０００／μＬに減少した場合、＞３０，０００／μＬになるまでレナリドマイドを保留し、５ｍｇの低用量で再開する。クレアチニンクリアランスが３０～６０ｍＬ／分である場合、レナリドマイドの最大用量は１日当たり１０ｍｇにすべきである。クレアチニンクリアランスが＜３０ｍＬ／ｍｉｎ未満である場合、レナリドマイドを保留する。レナリドマイドは、ＤＬＴの症例では中止すべきである。この試験で許容される最低用量は、１日に５ｍｇである。治験責任医師及び安全委員会は、他の安全性所見に基づいて、時にレナリドマイドを中止するように決定することがある。患者は、指示されるように併用する抗凝固療法を受けるべきである（例えば、アスピリンを経口によって１日に３２５ｍｇ）。レナリドマイドと一緒にグルココルチコイドを投与しない。

リツキシマブ
コホートＲＩＴ：Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１注入の１２及び５日前に、静脈内注入による３７５ｍｇ／ｍ^２、その後、疾患が進行しない限り８週毎。処方情報について、リツキシマブの添付文書を参照する（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，２０１９）。以下は、このプロトコルに特有な追加の推奨事項である。リツキシマブは、重度の注入関連反応が発生した場合に致命的であり得、それらを管理するための適切な医療サポートを備えた医療専門家によってのみ投与されるべきである。最初の注入：５０ｍｇ／時間の速度で注入を開始する。注入毒性がなければ、注入速度を３０分毎に５０ｍｇ／時間ずつ最大４００ｍｇ／時間まで増加させる。その後の注入：標準注入：１００ｍｇ／時間の速度で注入を開始する。注入毒性がなければ、速度を３０分間隔で１００ｍｇ／時間ずつ最大４００ｍｇ／時間まで増加させる。静脈内注入としてのみ投与する。静脈内プッシュ又はボーラスとして投与しない。各注入前にアセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、及び静脈内メチルプレドニゾロン１００ｍｇを前投薬し、各注入の３０分前に完了させる。リツキシマブは、注入反応又はＤＬＴの症例では中止すべきである。治験責任医師及び安全委員会は、他の安全性所見に基づいて、いつでもリツキシマブの中止を決定し得る。Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＰＣＰ）の予防は、治療中及び治療後の患者について考慮されるべきである。

投与されるＰ－ＢＣＭＡ－１０１の用量は、用量漸増中に決定される≦ＭＴＤで開始する３＋３設計に従って、漸増又は漸減させる。

併用投与におけるコンディショニング化学療法によるスクリーニングイベントの予定が表１４に示される。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１投与及び併用投与におけるフォローアップに関するイベント予定が表１５に示される。

実施例７－Ｐ－ＢＣＭＡ１０１で治療された多発性骨髄腫患者の抗薬物抗体応答及び薬物動態評価
Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は、図１８に示される予定に従って、骨髄腫を有する患者に単独で、又はリツキシマブと組み合わせて投与された。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は０日目に投与された。リツキシマブはＰ－ＢＣＭＡ－１０１の１２及び５日前に投与され、その後骨髄腫進行まで８週間毎に投与された。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１の薬物動態は、ｑＰＣＲを使用して経時的に末梢血中を循環するＰ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／μｇＤＮＡを測定することによって評価した。末梢血中のＰ－ＢＣＭＡ－１０１に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、ｍｅｓｏ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して経時的に評価した。リツキシマブを投与されない患者１０２－００６（図１９Ａ）では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１に対する抗体応答が示され、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は末梢血中に短期間持続して、骨髄腫の短い応答を伴った。リツキシマブを投与された患者１１３－００３（図１９Ｂ）では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１に対する抗体応答は示されず、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１は末梢血中に高レベルで長期間持続し、骨髄腫の長期応答を伴った（最後に評価された時点まで延長する）。Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／ｕｇＤＮＡのピークは、両方の患者（リツキシマブ有り又は無し）で約３０日であるが、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／ｕｇＤＮＡは、リツキシマブ投与なしで治療された患者では約１３０日でベースラインまで低下するが、一方、リツキシマブを投与して治療された患者では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／ｕｇＤＮＡが１９０日間持続する。更に、リツキシマブを投与されない患者では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／ｕｇＤＮＡが減少するにつれて、臨床的予後は不変疾患から最小奏効に変化し、またＡＤＡ陽性応答を有する。対照的に、リツキシマブを投与された患者では、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１コピー／ｕｇＤＮＡが持続し、臨床的予後は不変疾患から部分奏効カテゴリに変化し、ＡＤＡ陰性応答を有する。

合計９名の患者がＰ－ＢＣＭＡ－１０１とリツキシマブとの組み合わせで治療され、治療に対するそれらの応答は、以下：厳密な全奏効（ｓＣＲ）、全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、部分奏効（ＰＲ）、又は最小奏効（ＭＲ）として注釈された。

参照による組み込み
相互参照又は関連する特許若しくは出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に除外又は制限されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。文書の引用は、それが本明細書で開示若しくは請求された発明に関する先行技術であること、又はそれが単独で、若しくは他の参考文献と組み合わせて、かかる発明を教示、示唆、若しくは開示していることを認めるものではない。更に、この文書内の用語の意味又は定義が、参照により組み込まれる文書内の同じ用語の意味又は定義と矛盾する場合、本文書内のその用語に割り当てられた意味又は定義が優先される。

他の実施形態
本開示の特定の実施形態が例示し、説明されているが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲の範囲は、本開示の範囲内にある全てのそのような変更及び修正を含む。

Claims (43)

1. がんを治療する方法であって、対象に、
   キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の集団を含み、前記ＣＡＲが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含む、第１の組成物と、
   抗ＣＤ２０剤を含む第２の組成物と、を投与することを含む、方法。
2. 前記患者における前記第１の組成物に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答に、前記第１の組成物を投与されるが前記第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも５０％の減少がある、請求項１に記載の方法。
3. 前記患者における前記第１の組成物の持続性に、前記第１の組成物を投与されるが前記第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも７５％の増加がある、請求項１に記載の方法。
4. 前記患者における前記第１の組成物の持続性に、前記第１の組成物を投与されるが前記第２の組成物が投与されない患者と比較して、少なくとも９０％の増加がある、請求項１に記載の方法。
5. 持続性の尺度が、血漿濃度曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）である、請求項３又は４に記載の方法。
6. 少なくとも１つのリンパ球枯渇剤を含む第３の組成物を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. 抗ＣＤ２０剤が、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ヨウ素ｉ１３１トシツモマブ、オビヌツズマブ、又はイブリツモマブである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記抗ＣＤ２０剤が、リツキシマブである、請求項７に記載の方法。
9. 前記抗原認識ドメインが、センチリン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ＶＨ、又はＶＨＨを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 抗原結合ドメインが、センチリンを含む、請求項９に記載の方法。
11. 抗原結合ドメインが、ＶＨを含む、請求項９に記載の方法。
12. 前記第１の組成物が、複数回の注入として投与され、前記複数回の注入が、第１の注入及び第２の注入に分割される総用量を含み、
    ｉ）前記第１の注入が、前記総用量の約３分の１を含み、
    ｉｉ）前記第２の注入が、前記総用量の約３分の２を含み、前記第１の注入の少なくとも１０日後に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１の組成物が、複数回の注入として投与され、前記複数回の注入が、第１の注入、第２の注入、及び第３の注入に分割される総用量を含み、
    ｉ）前記第１の注入が、前記総用量の約３分の１を含み、
    ｉｉ）前記第２の注入が、前記総用量の約３分の１を含み、前記第１の注入の少なくとも１０日後に投与され、
    ｉｉｉ）前記第３の注入が、前記総用量の約３分の１を含み、前記第２の注入の少なくとも１０日後に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第１の注入と前記第２の注入の間の時間、又は前記第２の注入と前記第３の注入の間の時間が、少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、又は６週である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記第１の組成物、前記第２の組成物、及び／又は前記第３の組成物が、順次投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１の組成物、前記第２の組成物、及び／又は前記第２の組成物が、同時に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第３の組成物が、前記第１の組成物の前に投与される、請求項３～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第３の組成物が、２用量以上で投与される、請求項３～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記第３の組成物が、１日に１回投与され、前記第３の組成物の第１の用量が、前記第１の組成物の前記第１の注入の少なくとも５日前に投与される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第３の組成物が、前記第１の組成物の前記第１の注入の３日、４日、及び５日前に投与される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第２の組成物が、前記第１の組成物の前に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第２の組成物が、２用量以上で投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記第２の組成物の第１の用量が、前記第１の組成物の前記第１の注入の１２日前に投与され、前記第２の組成物の第２の用量が、前記第１の組成物の前記第１の注入の５日前に投与され、その後の用量が、前記第１の組成物の前記第１の注入後、少なくとも８週間、週に１回投与される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象が、以前に抗がん剤で治療されていない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記第３の組成物の第１のリンパ球枯渇剤及び前記第３の組成物の第２のリンパ球枯渇剤が、同時に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記第３の組成物の第１のリンパ球枯渇剤及び第３の組成物の第２のリンパ球枯渇剤が、順次投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記第１のリンパ球枯渇剤及び前記第２のリンパ球枯渇剤が、同じ日に投与され、前記第１のリンパ球枯渇剤が、３０分の期間にわたって静脈内投与され、前記第２のリンパ球枯渇剤が、３０分の期間にわたって静脈内投与される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記第１のリンパ球枯渇剤又は第２のリンパ球枯渇剤が、シクロホスファミド又はフルダラビンである、請求項２６又は２７に記載の方法。
29. 前記第３の組成物の用量が、
    ｉ）１００ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、４００ｍｇ／ｍ^２、若しくは５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド、
    ｉｉ）１０ｍｇ／ｍ^２、２０ｍｇ／ｍ^２、３０ｍｇ／ｍ^２、４０ｍｇ／ｍ^２、若しくは５０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記第３の組成物の前記用量が、３００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミド及び３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記第１の組成物が、少なくとも細胞０．１×１０^６、０．２×１０^６、０．２５×１０^６、０．５×１０^６、０．６×１０^６、０．７×１０^６、０．７５×１０^６、０．８×１０^６、０．９×１０^６、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１０×１０^６、１１×１０^６、１２×１０^６、１３×１０^６、１４×１０^６、１５×１０^６、１６×１０^６、１７×１０^６、１８×１０^６、１９×１０^６、又は２０×１０^６個／前記対象の体重ｋｇ、の総用量で投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記第１の組成物の前記第１の注入、前記第２の注入、及び／又は前記第３の注入が、前記第１の組成物を細胞約１×１０^５個／ｍＬ～約５×１０^７個／ｍＬの濃度で含む注入バッグを使用して投与される、請求項１２～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記注入バッグが、前記第１の組成物を細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約２．４×１０^７個／ｍＬの濃度で含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記第２の組成物の用量が、１００ｍｇ／ｍ^２、１２５ｍｇ／ｍ^２、１５０ｍｇ／ｍ^２、１７５ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、２２５ｍｇ／ｍ^２、２７５ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、３２５ｍｇ／ｍ^２、３７５ｍｇ／ｍ^２、４００ｍｇ／ｍ^２、４２５ｍｇ／ｍ^２、４５０ｍｇ／ｍ^２、４７５ｍｇ／ｍ^２、又は５００ｍｇ／ｍ^２のリツキシマブを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第２の組成物の前記用量が、３７５ｍｇ／ｍ^２のリツキシマブである、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第２の組成物が、静脈内注入によって投与され、前記静脈内注入の流速が、約２５ｍｇ／時間～約５００ｍｇ／時間である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第２の組成物の前記第１の用量が、５０ｍｇ／時間の流速で静脈内注入によって投与され、前記流速が、３０分毎に最大４００ｍｇ／時間まで増加される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記第２の組成物の前記第２の用量及び前記その後の用量が、約１００ｍｇ／時間の流速で静脈内注入によって投与され、前記流速が３０分毎に最大約４００ｍｇ／時間まで増加される、請求項３６に記載の方法。
39. 前記がんが、血液がんである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記多発性骨髄腫が、再発性多発性骨髄腫又は難治性多発性骨髄腫である、請求項４０に記載の方法。
42. ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む、単位用量注入バッグであって、
    前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的に結合するセンチリンを含む抗原認識ドメインを含み、前記組成物の濃度が、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約２．４×１０^７個／ｍＬである、単位用量注入バッグ。
43. ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を含む２５０ｍＬの組成物を含む、単位用量注入バッグであって、
    前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的に結合するＶＨを含む抗原認識ドメインを含み、前記組成物の濃度が、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約２．４×１０^７個／ｍＬである、単位用量注入バッグ。

Images