JP2023521180A - ハンチントン病の治療のためのブロモドメイン阻害剤の使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ハンチントン病を治療するためのＢＲＤ９阻害剤の使用に関する。
Description
１． 関連出願との相互参照
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，１６１号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，１６１号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
２． 背景
ハンチントン病（ＨＤ）は、優性遺伝し、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）の多型トリヌクレオチド（ＣＡＧ）トラクトを伸長する突然変異に起因する、進行性で致死的な神経変性疾患である。米国医遺伝学会／米国人類遺伝学会ハンチントン病遺伝学的検査ワーキンググループ（Am J Hum Genet. 1998; 62:1243-7）によると、ＨＴＴ遺伝子中のＣＡＧリピートが２６以下であれば「正常」、ＣＡＧリピートが２７～３５であれば変異しやすい正常な対立遺伝子、ＣＡＧリピートが３６以上であれば病気を引き起こす対立遺伝子とみなされることが示されている。ＨＴＴ遺伝子はＨＴＴタンパク質をコードしており、ＣＡＧトラクトの伸長により、タンパク質のＮ末端付近にあるポリグルタミンリピート配列の病的な増加をもたらす。これは常染色体優性遺伝疾患であり、個体はＨＴＴ遺伝子のコピーを２つ持っているが、ＨＤを生じるには１つの変異対立遺伝子で十分である。
ハンチントン病（ＨＤ）は、優性遺伝し、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）の多型トリヌクレオチド（ＣＡＧ）トラクトを伸長する突然変異に起因する、進行性で致死的な神経変性疾患である。米国医遺伝学会／米国人類遺伝学会ハンチントン病遺伝学的検査ワーキンググループ（Am J Hum Genet. 1998; 62:1243-7）によると、ＨＴＴ遺伝子中のＣＡＧリピートが２６以下であれば「正常」、ＣＡＧリピートが２７～３５であれば変異しやすい正常な対立遺伝子、ＣＡＧリピートが３６以上であれば病気を引き起こす対立遺伝子とみなされることが示されている。ＨＴＴ遺伝子はＨＴＴタンパク質をコードしており、ＣＡＧトラクトの伸長により、タンパク質のＮ末端付近にあるポリグルタミンリピート配列の病的な増加をもたらす。これは常染色体優性遺伝疾患であり、個体はＨＴＴ遺伝子のコピーを２つ持っているが、ＨＤを生じるには１つの変異対立遺伝子で十分である。
ＨＤは、運動、行動、および認知症状の三徴候を伴う。運動障害は、この疾患を決定づける特徴であり、舞踏病は最も明白な運動症状である。舞踏病は、診断には有用であるが、疾患の重症度のマーカーとしては不十分である。むしろ、障害および疾患の重症度は、言語障害、歩行、および姿勢機能障害を含む、微細運動技能、徐脈、および粗大運動協調技能の障害等の負の運動特徴と最もよく相関する（Mahant et al., 2003, Neurology 61 (8): 1085-92）。
ＨＤに関連する運動および感情の問題を改善するために多くの薬物が処方されているが、ＨＤにおける様々な薬物の有用性に関する科学的証拠は乏しい（Mestre et al., 2009, Cochrane Database Syst Rev. (3):CD006455; Mestre et al., 2009, Cochrane Database Syst Rev. (3):CD006456）。したがって、ＨＤの症状を改善するための薬剤の開発には、大きなアンメット・メディカル・ニーズがある。
３． 概要
ＢＲＤ９は、その配列のアミノ末端側にブロモドメインを、ならびにそのカルボキシ末端に機能不明ドメイン（ＤＵＦ３５１２）を有する、ブロモドメイン含有タンパク質である。ＢＲＤ９はクロマチンリモデリングＢＡＦ（ＳＷＩ／ＳＮＦとも呼ばれる）複合体の一部である（Kadoch et al, 2013, Nat. Genet. 45, 592-601; Middeljans et al., 2012, PLoS. One. 7, e33834）。ＢＲＤ９遺伝子座の再発性増幅は、卵巣癌および乳癌において観察されており（例えば、Kang et al., 2008, Cancer Genet. Cytogenet. 182:1-11; Scotto et al., 2008, Mol. Cancer 7:58）、ＢＲＤ９阻害剤は、潜在的な癌治療薬として開発されている（例えば、Martin et al., 2016, J. Med. Chem. 59(10):4462-4475を参照）。本開示は、ＢＲＤ９阻害剤が、ＨＤのヒトオルガノイドモデルにおいて疾患表現型を逆転させるのに有効であり、したがって、ＨＤに罹患している患者の治療に有用であるという発見に基づくものである。
ＢＲＤ９は、その配列のアミノ末端側にブロモドメインを、ならびにそのカルボキシ末端に機能不明ドメイン（ＤＵＦ３５１２）を有する、ブロモドメイン含有タンパク質である。ＢＲＤ９はクロマチンリモデリングＢＡＦ（ＳＷＩ／ＳＮＦとも呼ばれる）複合体の一部である（Kadoch et al, 2013, Nat. Genet. 45, 592-601; Middeljans et al., 2012, PLoS. One. 7, e33834）。ＢＲＤ９遺伝子座の再発性増幅は、卵巣癌および乳癌において観察されており（例えば、Kang et al., 2008, Cancer Genet. Cytogenet. 182:1-11; Scotto et al., 2008, Mol. Cancer 7:58）、ＢＲＤ９阻害剤は、潜在的な癌治療薬として開発されている（例えば、Martin et al., 2016, J. Med. Chem. 59(10):4462-4475を参照）。本開示は、ＢＲＤ９阻害剤が、ＨＤのヒトオルガノイドモデルにおいて疾患表現型を逆転させるのに有効であり、したがって、ＨＤに罹患している患者の治療に有用であるという発見に基づくものである。
したがって、本開示は、それを必要とする対象に有効量のＢＲＤ９阻害剤を投与することによって、ＨＤを治療する方法を提供する。本方法およびその中で使用されるＢＲＤ９阻害剤の例は、下記のセクション６および特定の実施形態１～４７に記載されている。
他の態様において、本開示は、それを必要とする対象におけるＨＤの治療に用いられるＢＲＤ９阻害剤を提供する。それを必要とする対象におけるＨＤの治療における使用のためのＢＲＤ９阻害剤の例は、下記のセクション６および特定の実施形態４８～９４に示されている。
さらに他の態様において、本開示は、ＨＤの治療のための医薬の製造におけるＢＲＤ９阻害剤の使用を提供する。ＨＤの治療のための医薬の製造におけるＢＲＤ９阻害剤の使用の例は、下記のセクション６ならびに特定の実施形態９５および９６に示されている。
４． 図面の簡単な説明
図１Ａ～１Ｂは、円盤状マイクロパターン上のニューロロイドの免疫蛍光分析を示す図である。（図１Ａ）上：上面図。下：側面図。ＤＡＰＩ、ＰＡＸ６、およびＮ－ＣＡＤで染色した。（図１Ｂ）左：神経形成段階におけるヒト胚内の外胚葉コンパートメントの模式図。右：ヒトのニューロロイドの図示。神経細胞１０２、神経堤１０４、頭蓋プラコード１０６、および表皮１０８。再構成された胚部分は、中央の神経ロゼット（ＰＡＸ６＋細胞、図１Ａ）に、神経堤（ＳＯＸ１０＋）およびプラコード運命（ＳＩＸ１＋）とともに組織化された、表皮細胞（ＴＦＡＰ２＋のみ）の層で覆われた発生中の中枢神経系を示している。受精後約２１日目のｉｎ ｖｉｔｒｏニューロロイドとｉｎ ｖｉｖｏ対応物との比較（図１Ｂ）により、高いレベルの類似性が明らかになり、ヒト遺伝子障害の研究および表現型逆転に基づく薬物の発見にとって理想的な前臨床エンドポイントになる。
図２は、ＨＤ株の表現型シグネチャーを示す図である。（左）ニューロロイドアッセイにおける異なるＨＤ同質遺伝子株のＰＡＸ６領域の代表的な画像。ＰＡＸ６染色により、ＰＡＸ６領域を可視化することができる。（右）コロニー領域で正規化したＰＡＸ６領域の関連した定量化。ＨＴＴ－／－株は最も劇的な表現型を示すことに留意されたい。これは、ＨＴＴタンパク質のポリ－Ｑ伸長が、しばしば仮説されるような毒性機能の獲得ではなく、支配的な負の機能喪失を表すことを示唆している。
図３は、ハイスループットスクリーニングキャンペーンの基礎として使用されるＨＤニューロロイドにおける表現型逆転の概念を例示する図である。
図４は、薬物スクリーニングのＡＩを介した解析のスキームを示す図である。特定のネットワークは、スクリーニング実験からの全ての画像を入力するために使用される。ネットワークは、２つの量：薬物毒性および薬物有効性を出力するために特別に訓練される。
図５は、スクリーニングキャンペーンの結果を示す図である。２０８０の化合物の効果を、効力（表現型レスキュー）および毒性の関数としてプロットしている。ＷＴ対照（ＲＵＥＳ２）およびＨＤ－５６ＣＡＧ（５６ＣＡＧ）対照は、それぞれ、右向きの三角形および左向きの三角形としてプロットされている。上向きの三角形は、各化合物の効果を表す。菱形は、ヒット化合物を表し、高い有効性と低い毒性を有する分子を強調する。
図６は、ブロモスポリンがＨＤニューロロイドの表現型をレスキューすることを示す図である。（上）一次スクリーニングからの結果。左から右：ＷＴ対照およびＨＤ対照ウェル、ならびに１０μＭブロモスポリンで処理されたＨＤウェルの例。各ウェルは約２７個のニューロロイド複製物を含有する。ニューロロイドは：ＤＡＰＩ（核）、ＰＡＸ６（神経マーカー）、およびファロイジン（フィラメント状アクチン）で染色される。（下）ブロモスポリンストックを用いた小規模実験でのヒット検証。ニューロロイドは：ＳＯＸ１０（神経堤マーカー）、ＰＡＸ６（神経マーカー）、およびＮ－ＣＡＤ（細胞間接着）で染色される。０．５μＭのブロモスポリンはＨＤ表現型をレスキューした。
図７は、ブロモスポリンの効力および毒性の定量化を示す図である。ニューロロイドＨＤ－５６ＣＡＧ表現型をレスキューする際のブロモスポリンの効力を測定する（白抜き菱形および曲線）。これは、１２０ｎＭのＥＣ５０を示す。ブロモスポリン毒性は、ＷＴ－２０ＣＡＧバックグラウンドおよびＨＤ－５６ＣＡＧバックグラウンドにおける濃度の関数として測定される。
図８は、ニューロロイドアッセイにおけるＢＲＤ阻害剤のパネルの、１０μＭの単一濃度における活性を示す図である。各分子について、ドットはその既知の分子標的を示し、レスキュー効力（斑点バー）および毒性レベル（破線バー）の両方が示される。右側の点線で表される閾値を上回るレスキュー活性を持ち、左側の点線のレベル未満の毒性を有する化合物のみがヒットとみなされる。ＢＲＤ９／７阻害剤であるＢＩ７２７３のみが、この実験ではヒットである。
図９Ａ～９Ｂは、ニューロロイドアッセイにおけるＢＲＤ９阻害剤のパネルの活性を、用量依存的に示す図である。ＢＲＤ９を阻害する５つの異なる低分子の効力（図９Ａ）および毒性（図９Ｂ）を示す。全ての化合物は、サブマイクロモルＥＣ５０で有効であり、マイクロモル範囲未満の低毒性を示す。
図１０は、ＨＤニューロロイドのレスキューにおいてサブマイクロモル効力を示すＢＲＤ阻害剤を示す図である。ブロモスポリン、ＢＩ７２７３、Ｉ－ＢＲＤ９、ｄＢＲＤ９およびＢＩ９５６４は全て、ＨＤニューロロイドをＷＴ構成にレスキューする。ブロモスポリンはブロモドメインに対する広範囲の阻害剤であり、ＢＲＤ２、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９、およびＣＥＣＲ２に対するＩＣ５０はそれぞれ０．４１μＭ、０．２９μＭ、０．１２２μＭおよび０．０１７μＭである。ＢＩ－７２７３は強力で選択的な細胞透過性のＢＲＤ９ ＢＤ阻害剤であり、αアッセイにおけるＩＣ５０はＢＲＤ９およびＢＲＤ７に対してそれぞれ１９ｎＭおよび１１７ｎＭである。Ｉ－ＢＲＤ９（ＧＳＫ６０２）は、ＢＲＤ９に対してｐＩＣ５０が７．３である強力かつ選択的な阻害剤であり、ＢＲＤ４に対するｐＩＣ５０は５．３を示す。ｄＢＲＤ９は強力かつ選択的なＢＲＤ９分解ＰＲＯＴＡＣである。ＢＩ－９５６４は、ＢＲＤ９およびＢＲＤ７ブロモドメインの選択的阻害剤であり、それぞれＩＣ５０は７５ｎＭおよび３．４μＭである。
図１１Ａ～１１Ｂは、ブロモスポリンがＨＴＴ低下活性を有することを示す図である。総ＨＴＴレベルおよび伸長ＨＴＴレベルの両方を、ＤＭＳＯ対照（濃度０）、５μＭ（濃度１）または１μＭ（濃度２）のブロモスポリン、ＢＩ７２７３、ｄＢＲＤ９またはＢＩ９５６４で処理したニューロロイドにおいて測定した。アッセイは、２つの遺伝的バックグラウンド：５６ＣＡＧ（図１１Ａ）および７２ＣＡＧ（図１１Ｂ）において行った。各グラフ上の点線は、ＤＭＳＯ処理対照におけるＨＴＴの対照レベルを指す。ＭＳＤアッセイによって測定されるシグナルの値は、使用される抗体に固有であり、したがって、これら２つの測定は異なる抗体を用いて行われるため、全ＨＴＴの伸長ＨＴＴを測定した場合には異なり、したがって、２つの測定における絶対レベルを比較することができない。
図１２Ａ～１２Ｂは、ＢＲＤ阻害剤によるＨＤガストルロイドのレスキューを示す図である。（図１２Ａ）ガストルロイドは、多能性マイクロパターン培養物上にＣＨＩＲおよびＡｃｔｉｖｉｎを２日間適用することによって作成される。ＷＴ－２０ＣＡＧ構成では、コロニー周辺にＳＯＸ１７＋環が形成される。この環はＨＤ－５６ＣＡＧバックグラウンドにおいて拡張し、ノックアウトＨＴＴ－／－バックグラウンドでは劇的にコロニー全体を占拠している。（図１２Ｂ）ＢＲＤ阻害剤で処理したガストルロイドにおけるＳＯＸ１７＋環の定量化。全ての処理で、ＷＴ－２０ＣＡＧバックグラウンドと比較して、ＳＯＸ１７＋環の領域が減少していることが示される。
図１３Ａ～１３Ｃは、ＢＲＤ９ノックダウンがＨＤ－５６ＣＡＧニューロロイドを部分的にレスキューすることを示す図である。（図１３Ａ）誘導性ＣＲＩＳＰＲ干渉構築物は、ＢＲＤ９ ｍＲＮＡレベルを５０％低下させる。（図１３Ｂ）ＷＴ－２０ＣＡＧニューロロイド（右）と比較して、ＨＤ－５６ＣＡＧ（左）は、ＰＡＸ６領域の拡張およびＳＯＸ１０＋細胞の数がより少ないことを示す。これらの特徴の両方は、ＢＲＤ９ノックダウンによって部分的にレスキューされる（中央）。
（図１３Ｃ）関連する定量化。各条件についてＮ＞４０コロニー。
５． 定義
投与する：用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、表皮または経皮投与、粘膜投与、経口、経鼻、経直腸、または経膣によって化合物または医薬組成物を対象に導入することを指す。中枢神経系の組織への化合物および医薬組成物の標的化は、髄腔内投与、脳室内投与、または脳実質内投与によるＣＳＦおよび脳への送達を伴う場合がある。担体製剤は、投与経路に応じて選択または改変することができる。一般的な参考文献として、例えば、Remington--The Science and Practice of Pharmacy, 21stedition. Gennaro et al. editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphiaを参照のこと。
投与する：用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、表皮または経皮投与、粘膜投与、経口、経鼻、経直腸、または経膣によって化合物または医薬組成物を対象に導入することを指す。中枢神経系の組織への化合物および医薬組成物の標的化は、髄腔内投与、脳室内投与、または脳実質内投与によるＣＳＦおよび脳への送達を伴う場合がある。担体製剤は、投与経路に応じて選択または改変することができる。一般的な参考文献として、例えば、Remington--The Science and Practice of Pharmacy, 21stedition. Gennaro et al. editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphiaを参照のこと。
ＢＲＤ９阻害剤：用語「ＢＲＤ９阻害剤」は、ＢＲＤ９の活性を阻害する化合物を指す。いくつかの実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＢＲＤ９に加えて１つまたは複数のブロモドメインタンパク質に対する活性を有する広範囲のブロモドメイン阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＢＲＤ９の選択的阻害剤である。例えば、ＢＲＤ９阻害剤は、限定されないが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、または前述の任意の組合せ等の１、２、または３つの他のブロモドメイン含有タンパク質に対して、ＢＲＤ９に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍大きい活性を有することができる。ＢＲＤ９とＢＲＤ７は密接に関連しているため、特定の実施形態において、ＢＲＤ９の選択的阻害剤は、ＢＲＤ９と同程度にＢＲＤ７を阻害することができるが、ただし、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３および／またはＢＲＤ４に対してより少ない阻害活性を有し得る。
ブロモドメイン：用語「ブロモドメイン」は、ヒストンのＮ末端テイル上のもの等のアセチル化リジン残基を認識するタンパク質ドメインを指す。特定の実施形態において、ブロモドメイン、例えば、ブロモドメイン含有タンパク質（例えば、ブロモおよびエキストラターミナル（ＢＥＴ）タンパク質）は、約１１０アミノ酸を含み、クロマチンと相互作用する多様なループ領域によって連結された４つのαヘリックスの左巻きバンドルを含む保存されたフォールドを共有する。特定の実施形態において、ブロモドメインは、ＡＳＨ１Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜８９２２０８１）、ＡＴＡＤ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２４４９７６１８）、ＢＡＺ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜７３０４９２３）、ＢＲＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１１３２１６４２）、ＢＲＤ２（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： ｇｉ｜４８２６８０６）、ＢＲＤ２（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜４８２６８０６）、ＢＲＤ３（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１１０６７７４９）、ＢＲＤ３（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１１０６７７４９）、ＢＲＤ４（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１９７１８７３１）、ＢＲＤ４（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１９７１８７３１）、ＢＲＤ９（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ： ｇｉ｜５７７７０３８３）、ＢＲＤＴ（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜４６３９９１９８）、ＢＲＰＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜５１１７３７２０）、ＣＥＣＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１４８６１２８８２）、ＣＲＥＢＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜４７５８０５６）、ＥＰ３００（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜５０３４５９９７）、ＦＡＬＺ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３８７８８２７４）、ＧＣＮ５Ｌ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１０８３５１０１）、ＫＩＡＡ１２４０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜５１４６０５３２）、ＬＯＣ９３３４９（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１３４１３３２７９）、ＰＢ１（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３０７９４３７２）、ＰＢ１（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３０７９４３７２）、ＰＢ１（３）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３０７９４３７２）、ＰＢ１（５）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３０７９４３７２）、ＰＢ１（６）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３０７９４３７２）、ＰＣＡＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１４０８０５８４３）、ＰＨＩＰ（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜３４９９６４８９）、ＳＭＡＲＣＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜４８２５５９００）、ＳＭＡＲＣＡ４（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２１０７１０５６）、ＳＰ１４０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜５２４８７２１９）、ＴＡＦ１（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２０３５７５８５）、ＴＡＦ１（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２０３５７５８５）、ＴＡＦ１Ｌ（１）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２４４２９５７２）、ＴＡＦ１Ｌ（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜２４４２９５７２）、ＴＩＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１４９７１４１５）、ＴＲＩＭ２８（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜５０３２１７９）、またはＷＤＲ９（２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ｇｉ｜１６４４５４３６）である。
デグロン：用語「デグロン」は、ポリペプチドの細胞内分解を指示する分解シグナルを提供するアミノ酸の配列を指す。デグロンは、プロテアソーム経路またはオートファジー－リソソーム経路のいずれかを介して、結合したポリペプチドの分解を促進することができる。例えば、Kanemaki et al., 2013, Pflugers Arch. 465(3):419-425およびErales et al., 2014, Biochim Biophys Acta 1843(1):216-221を参照されたい。
デンドリマー：本明細書で使用する用語「デンドリマー」は、内部コア、この開始剤コアに規則的に結合された繰り返し単位の内部層（または「世代」）、および最外側の世代に結合された末端基の外面を有する分子アーキテクチャを含むことを意図するが、これらに限定されない。デンドリマーの例としては、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリリジン、およびポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミンおよびヒドロキシル末端を有することができ、第１世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第７世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第８世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第９世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、または第１０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを含むが、これらに限定されない任意の世代のデンドリマーであり得る。本発明での使用に適したデンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様の化学的性質であっても、または異なる化学的性質であってもよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含んでいてもよく、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含んでいてもよい）。いくつかの実施形態において、第１または第２のデンドリマーは、追加の剤をさらに含んでいてもよい。マルチアームＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を有する少なくとも２つの分岐を有するポリエチレングリコールを含むが、本明細書に開示する実施形態はこのクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端等の他の末端基を有するＰＥＧポリマーも使用することができる。分子量１０ｋＤａ～８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。
阻害：用語「阻害」、「阻害すること」、「阻害する」または「阻害剤」は、特定のタンパク質または生物学的プロセスの活性（例えば、ブロモドメインおよび／またはブロモドメイン含有タンパク質の活性）を低減、減速、停止または防止する化合物の能力を指す。いくつかの実施形態において、活性は、細胞または組織において低減され、および／または活性は、ビヒクルと比較して低減される。
ニューロロイド：用語「ニューロロイド」は、神経前駆細胞、神経堤、感覚プラコード、および表皮を有するマイクロパターン上の自己組織化オルガノイドを指す。ニューロロイドは、Harekami et al., 2019, Nature Biotechnology 37:1198-1208によって記載されるように、胚性幹細胞、例えば、ヒト胚性幹細胞から生成することができる。
選択的阻害：本明細書で使用されるように、化合物が、１つまたは複数の他のブロモドメイン含有タンパク質と比較してＢＲＤ９の活性を「選択的に」または「特異的に」低減する能力を有する場合、化合物は、他のブロモドメインと比較してＢＲＤ９の活性を少なくとも約２倍阻害することができる。様々な実施形態において、化合物は、ＢＲＤ７以外の他のブロモドメインと比較して、ＢＲＤ９に対して少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約５０倍、より大きな阻害活性を有する。阻害活性は、セクション６に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて活性の％阻害および／またはＩＣ５０値として測定することができる。ＢＲＤ９およびＢＲＤ７は密接に関連しているため、特定の実施形態において、ＢＲＤ９の選択的な阻害剤は、ＢＲＤ９と同程度にＢＲＤ７を阻害することが可能であるが、ただし、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３および／またはＢＲＤ４等の１つまたは複数の関連が遠いブロモドメイン含有タンパク質に対する阻害活性は低い。
対象または患者：用語「対象」および「患者」は、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児科対象（例えば、乳児、子供、または思春期）または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、または高齢成人））または非ヒト動物（例えば、非ヒト霊長類等の哺乳動物、ネコまたはイヌ等の飼育動物、ウシ、ウマまたはブタ等の家畜動物）を指す。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１つのＨＴＴ対立遺伝子において、伸長されたポリグルタミンまたはポリＱのリピートを有する。伸長ポリグルタミンリピートは、グルタミンに対する一方または両方のコドン（すなわち、ＣＡＡおよび／またはＣＡＧ）を含んでよく、３６以上、好ましくは４０以上のグルタミンを有するＨＴＴタンパク質をコードする。特定の実施形態において、ポリグルタミンリピートは、４２～２６５個のグルタミン、特定の実施形態では、４５、４８、５０、５５、５６、５８、６０、６５、６７、７０、７２、７４、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０または２６５グルタミン、前述のグルタミンリピート数の２つを端点として有するその任意の誘導可能範囲、例えば４８～１８０、５０～１５０、または５６～１３０のグルタミンを有するＨＴＴタンパク質をコードする。ＨＤは常染色体優性状態であるため、対象は、１つのＨＴＴ対立遺伝子のみにおいて伸長グルタミンリピートを有することができるが、両方のＨＴＴ対立遺伝子において伸長グルタミンリピートを有する対象は、本開示の範囲内である。
治療：「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載の疾患を逆転させる、緩和する、発症を遅延させる、または進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態において、治療は、疾患の１つまたは複数の兆候または症状が発症した後、または観察された後に投与されてもよい。他の実施形態において、治療は、疾患の兆候または症状の非存在下で投与されてもよい。例えば、治療は、症状の発症前に（例えば、ＨＤの家族歴またはハンチンチン遺伝子における伸長グルタミンもしくはＣＡＧリピートの存在を考慮して）感受性の高い対象に投与してもよい。
６． 詳細な説明
ＢＲＤ９阻害剤は、当技術分野で知られており、ハンチントン病（ＨＤ）の治療に使用することができる。ＢＲＤ９阻害剤は、核酸、ポリペプチドまたは低分子を含むがこれらに限定されない、多様な性質および起源であってよい。
ＢＲＤ９阻害剤は、当技術分野で知られており、ハンチントン病（ＨＤ）の治療に使用することができる。ＢＲＤ９阻害剤は、核酸、ポリペプチドまたは低分子を含むがこれらに限定されない、多様な性質および起源であってよい。
一態様において、阻害剤は、ＢＲＤ９遺伝子の転写またはＢＲＤ９ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、ブロモドメイン含有タンパク質をコードする配列、またはそれに相補的な配列の全部または一部を含むことができる。アンチセンス配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、リボザイム等であり得る。これは、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。また、アンチセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡであってもよい。遺伝子またはｍＲＮＡの配列の一部を含むアンチセンス核酸を用いる場合、特異的なハイブリダイゼーションを確保するために、配列由来の少なくとも１０個の連続した塩基を含む部分、より好ましくは配列由来の少なくとも１５個の連続した塩基を含む部分を使用することが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、典型的には１００塩基未満を、例えば１０～５０塩基または１８～３０塩基のオーダーで含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その安定性、ヌクレアーゼ耐性、細胞侵入性等を向上させるために改変されていてもよい。アンチセンス分子の配列とＢＲＤ９遺伝子またはｍＲＮＡの配列との間の完全な相補性は必要ではないが、一般的には望ましい。
他の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ポリペプチドまたはペプチドである。それは、例えば、ブロモドメイン含有タンパク質の領域を含み、ブロモドメイン含有タンパク質の活性に拮抗することができるペプチドであり得る。ペプチドは、好都合には、ＢＲＤ９タンパク質の一次配列の連続する５～５０個、典型的には７～４０個のアミノ酸を含む。ポリペプチドはまた、ブロモドメイン含有タンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片もしくは誘導体、例えばＦａｂ断片または一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）でもあり得る。このような抗体、断片、または誘導体は、従来の技術によって産生することができる。
さらに他の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は低分子である。ＢＲＤ９阻害剤としては、Ｉ－ＢＲＤ９、ＴＰ－４７２、ＢＩ－７２７３、ＢＩ－９５６４、ｄＢＲＤ９、ＧＮＥ－３７５およびＬＰ－９９、メチルキノリノン化合物、チエノピリドンならびにRemillard et al., 2017, Angew. Chem. Int. Ed. 56:1-7およびTheodoulou et al., 2016, J. Med. Chem. 99:1425-39（全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示のＢＲＤ９阻害剤等が挙げられるが、これらに限定されない。低分子ＢＲＤ９阻害剤は、遊離塩基または生理学的に許容される塩の形態で投与することができる。
特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＢＩ－９５６４：
他の特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＢＩ－７２７３：
他の特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＬＰ－９９：
他の具体的な実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、Ｉ－ＢＲＤ９：
さらに他の特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ｄ－ＢＲＤ９：
なおさらに他の特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＴＰ－４７２：
なおさらに他の特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ＧＮＥ－３７５：
なおさらなる特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、式（Ｉ）：
ＡはフェニルまたはＮおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５または６員ヘテロアリールであり、ここでフェニルまたはヘテロアリールは、非置換であるか、または１～３個のＲ３基で置換されており、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、またはＮＨ２であり、
各Ｒ３は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、または、
Ｘ１は、ＮＲ５またはＯであり、
Ｙ１は、Ｓ（Ｏ）ａまたはＮＲ５であり、
各Ｒ４は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、ハロゲン、または－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
各Ｒ６は独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
ａは、０、１、または２であり、
ｎおよびｒは、それぞれ独立して、０、１、２、または３である。
なおさらなる特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、式（ＩＩ）：
Ｒ１は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２は、ハロゲン、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはＯＨであり、
Ｘ１はＮまたはＣＲ３であり、Ｘ２はＮまたはＣＲ４であり、ただし、Ｘ１およびＸ２が両方ともＮであることはなく、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ただし、Ｒ３およびＲ４が両方とも（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであることはなく、
あるいは、Ｒ２およびＲ３は一緒になってベンゼン環または５～６員ヘテロアレーン環を形成し、これらの環の各々は独立して非置換であるか、または独立してハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルである１つまたは複数の基で置換されていてよく、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は非置換であるか、または５～６員へテロアリールもしくはフェニルで置換されていてもよく、
Ｒ５およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ６およびＲ８は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、４～７員ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、またはＮＨＲ１３であり、
Ｒ１３は、それぞれの場合について独立して、ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員ヘテロアリールで置換されており、
あるいは、Ｒ５およびＲ６は一緒になってベンゼン環を形成し、
あるいは、Ｒ７およびＲ６、またはＲ７およびＲ８は一緒になって、非置換または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～７員ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＮＨ２、Ｙ－Ｒ１２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、
Ｙは、ＣＲ１０Ｒ１１、ＳＯ２またはＣＯであり、
Ｒ１０およびＲ１１は同一であるかもしくは異なり、独立してＨもしくは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は一緒になってＣ３－４シクロアルキルを形成し、
Ｒ１２は、ＮＨ２、ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（Ｒ１５，Ｒ１６）、ＯＲ１７、アリール、または５～６員ヘテロアリールであり、ここでアリールまたはヘテロアリールは、独立して非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲンもしくは４～７員へテロシクロアルキルで置換されており、ヘテロシクロアルキルの各々は、独立して、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルおよびＣＨ２Ｒ１４から選択される１つもしくは複数の基で置換されており、
Ｒ１４は、非置換であるか、またはＮＨ２、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、もしくはＯ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～１０員の単環または二環式アリールもしくはヘテロアリールであり、
Ｒ１５は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ１６は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｃ２～３アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｃ２～３アルキル－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
Ｒ１７は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
ここで、Ｒ７がＹＲ１２であるとき、Ｒ６およびＲ８は、同一であってもまたは異なっていてもよく、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
置換基Ｒ５～Ｒ９のうちの少なくとも１つは、水素ではない。
なおさらなる特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、ブロモスポリン：
本開示は、特定のＢＲＤ９アンタゴニストに限定されるものではない。適切なＢＲＤ９阻害剤は、ＢＲＤ９活性を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％減少させることができる。特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤の活性は、ＢＲＤ９活性を最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％減少させる。前述の値の任意の対を組み合わせた範囲（例えば、少なくとも約３０％～最大約９０％、または少なくとも約５０％～最大９０％）も、本開示の範囲内である。
ＢＲＤ９阻害活性を決定する方法は既知である。例えば、阻害活性は、Theodoulou et al., 2016, J. Med. Chem. 99: 1425-39に記載されているＴＲ－ＦＲＥＴ方法を使用して決定し得る。簡潔には、化合物は、Ｇｒｅｉｎｅｒ ３８４ウェル黒色低容積マイクロタイタープレートにおいてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７リガンド（ＧＳＫ２８３３９３０Ａ）とインキュベートし、室温で３０分間暗所でインキュベートすることができる。検出試薬として、Ｅｕ－Ｗ１０２４ 抗６ｘＨｉｓ抗体が挙げられる。プレートを読み取り、ドナーとアクセプターの数を決定することができる。これから、アクセプター／ドナーの比を計算し（λｅχ＝３３７ｎｍ、λｅｍドナー＝６１５ｎｍ、ｅｍアクセプター＝６６５ｎｍ）、データ解析に使用する。様々な実施形態において、アンタゴニストは、阻害剤の非存在下と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも１０００％以上、ＢＲＤ９活性を減少させることができる。アッセイは、ＢＲＤ９に対する選択性を評価するために、他のブロモドメイン含有タンパク質に対する所定のＢＲＤ９阻害剤の阻害効果をアッセイするように適合させることができる。選択的なＢＲＤ９阻害剤は、限定されないが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、または前述の任意の組合せ等の１、２、または３つの他のブロモドメイン含有タンパク質に対して、ＢＲＤ９に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍大きい％阻害を有することができる。２つの結合ドメイン（結合ドメイン１、またはＢＤ１、および結合ドメイン２、ＢＤ２）を有するＢＲＤ４の場合、単一の非変異ＢＤ１ブロモドメインへのＢＲＤ９阻害剤の結合を決定するために、ＢＤ２アセチルリジン結合ポケットの単一残基変異（Ｙ３９０Ａ）を導入して、変異ＢＤ２ドメインに対するフルオロリガンドの親和性を低下させることができる。
あるいは、ＢＲＤ９阻害剤の阻害活性は、以下のように評価することができる。Ｈｉｓ／Ｆｌａｇエピトープタグ付きＢＲＤ９１３４－２３９をクローニングし、発現させ、均質になるように精製する。ＢＲＤ９の結合および阻害は、ＡｌｐｈａＬｉｓａ技術（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ビオチン化Ｈ４－テトラアセチルペプチド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＥＰ２０６９－１１／１３）の標的との係合をモニタリングすることにより評価できる。具体的には、３８４ウェルＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ中で、ＢＲＤ９（最終５０ｎＭ）を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．００８％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ－３５中のペプチド（最終３ｎＭ）と、ＤＭＳＯ（最終０．８％ＤＭＳＯ）またはＤＭＳＯ中の化合物希釈系列存在下で結合させる。室温で２０分インキュベートした後、ＡｌｐｈａＬｉｓａ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ－ＡＬ１２５Ｃ）とＡｌｐｈａＬｉｓａ Ｎｉｃｋｅｌドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ ＡＳ １０ ＩＤ）をそれぞれ最終濃度１５μｇ／ｍＬになるよう添加する。暗所で９０分間平衡化した後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置でプレートを読み取り、４パラメータの非線形曲線フィットを用いてＩＣ５０を算出する。このアッセイは、ＢＲＤ９に対する選択性を評価するために、他のブロモドメイン含有タンパク質に対する所定のＢＲＤ９阻害剤の阻害効果をアッセイするために適合し得る。選択的なＢＲＤ９阻害剤は、限定されないが、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、または前述の任意の組合せ等の１、２、または３個の他のブロモドメイン含有タンパク質に対して、ＢＲＤ９に対して２分の１以下、５分の１以下、または１０分の１以下のＩＣ５０を有することができる。
ＢＲＤ９阻害剤は、ＨＤニューロロイド表現型を逆転させる能力について試験することができる。ニューロロイドは、神経形成を模倣する外胚葉起源のマイクロパターンベースの自己組織化細胞集合体である（Harekami et al., 2019, Nature Biotechnology 37:1198-1208）。これらのニューロロイドは、特に、中央で神経ロゼットに組織化された発生中の中枢神経系を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロロイドと受精後約２１日目のｉｎ ｖｉｖｏの対応物を比較すると、高いレベルの類似性が明らかになり、そのためヒト遺伝性疾患の研究、ひいては表現型逆転に基づく創薬の基盤として理想的な前臨床エンドポイントとなっている。伸長ＣＡＧリピート（例えば、４３、４８、５６、６５、７２、および１５０リピート）を有するＨＴＴ遺伝子を保有するように改変されたニューロロイドは、ＨＤを罹患する患者で観察されるようにポリＱ長の多様性を反映し、ＰＡＸ６神経ロゼットの伸長を含むＨＤ表現型により特徴付けられる（Harekami et al., 2019, Nature Biotechnology 37:1198-1208）。ＢＲＤ９阻害剤は、ニューロロイドに作用して、ＣＡＧ伸長によって誘導されるＰＡＸ６発現神経ロゼットの伸長を逆転させることができる。本開示の方法において使用するためのＢＲＤ９阻害剤は、好ましくは、１μＭ未満のＥＣ５０でＨＤニューロロイド表現型を部分的または完全に逆転させる。特定の実施形態において、本開示のＢＲＤ９阻害剤は、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、または２００ｎＭ未満のＥＣ５０でＨＤ表現型を部分的または完全に逆転させる。
いくつかの実施形態において、野生型（ＷＴ）ニューロロイドは、ＨＤ表現型逆転のＥＣ５０で影響を受けないままであり、これは、治療用量での毒性を反映し得る多面的効果の欠如を示す。特定の態様において、本開示の方法において使用するためのＢＲＤ９阻害剤は、ＷＴニューロロイドにおける多面的効果を誘導するためのＥＣ５０の５分の１以下である、ＨＤニューロロイド表現型を逆転させるためのＥＣ５０を有する。特定の実施形態において、ＨＤニューロロイド表現型を逆転させるためのＥＣ５０は、ＷＴニューロロイドにおける多面的効果を誘導するためのＥＣ５０の１０分の１以下、２０分の１以下、または５０分の１以下である。
ＢＲＤ９阻害剤は、典型的には、１つまたは複数のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤、および／または他の慣用の医薬補助剤とともに、医薬組成物の形態で投与される。製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版に記載され得る。
ＢＲＤ９阻害剤は、例えば、Pardridge et al., 2007, Drug.Discov. Today 12(1-2):54-61に記載されているように、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を横切る送達を改善するための薬剤とともに製剤化または共投与することができる。
特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、エクソソームまたはカーボンナノチューブとともに製剤化または共投与される。
特定の実施形態において、ＢＲＤ９阻害剤は、セレポート、レガデノソン、またはボルネオール等の脳透過性増強剤とともに製剤化または共投与される。セレポート等の脳透過性増強剤は、内皮細胞表面の受容体に結合し、タイトジャンクションを緩める生化学的カスケードを開始する。
ＢＲＤ９阻害剤は、アミノ酸抱合体、例えばリジン抱合体またはフェニルアラニン抱合体の形態で投与することも可能である。
ＢＢＢを横切る送達を改善する他の薬物は、ＢＢＢを破壊することなく特定の分子の送達を可能にするトランスポーターペプチドおよびタンパク質である。トランスフェリン受容体に対するようなペプチド模倣ｍＡｂは、ＢＢＢを横切って任意の付着した薬物または遺伝子をフェリーするための分子「トロイの木馬」として使用することができる。
ＢＲＤ９阻害剤は、ナノ粒子、例えば、脂質ベース、アルブミンベース、アポリポプロテインベース、ポリマーベースナノ粒子、デンドリマーベースナノ粒子、または無機ベースナノ粒子であるナノ粒子内にカプセル化することができる。
ＢＲＤ９阻害剤の投与は、ＢＢＢを介した取り込みを改善する物理的または電気的方法、例えばマイクロバブル増強超音波または経頭蓋磁気刺激を伴うことができる。
投与されるＢＲＤ９阻害剤の有効量は、予想される脳虚血エピソードを生じさせる疾患または状態の種類、患者の一般的健康、サイズ、年齢、および治療の性質、すなわち慢性治療の短期間を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。一般的に、治療は、単回投与または複数回の投与、すなわち、１日当たり１回、２回、３回またはそれ以上の投与で行われ得る。投与は、１週間または１カ月から長期間にわたる慢性的な期間にわたって行うことができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載のＢＲＤ９阻害剤は、ハンチントン病の治療のための医薬の製造に使用することができる。
７． 実施例
７．１． [実施例１]：マイクロパターンベースのニューロロイドの誘導および解析
ニューロロイド内の遺伝子発現を解析し、神経形成段階におけるｉｎ ｖｉｖｏ外胚葉コンパートメント内の同等物の発現と比較した。
７．１． [実施例１]：マイクロパターンベースのニューロロイドの誘導および解析
ニューロロイド内の遺伝子発現を解析し、神経形成段階におけるｉｎ ｖｉｖｏ外胚葉コンパートメント内の同等物の発現と比較した。
７．１．１． 材料および方法
チップ上でのマイクロパターン化された細胞培養とニューロロイド誘導：マイクロパターン化ガラスカバースリップ（ＣＹＴＯＯＣＨＩＰＳ Ａｒｅｎａ Ａ、Ａｒｅｎａ ５００Ａ、Ａｒｅｎａ ＥＭＢ Ａ）を、まずＰＢＳ＋／＋（Ｇｉｂｃｏ）で希釈した１０μｇ ｍｌ－１の組み換えラミニン－５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ、ＬＮ５２１－０３）で３７℃にて３時間コーティングした。１０ｃｍディッシュに設置したパラフィルム上にマイクロパターンを表向きに置き、８００μｌのラミニン溶液をマイクロパターンに添加した。３７℃で３時間後、コーティングされたマイクロパターンを５ｍｌのＰＢＳ＋／＋の入った３５ｍｍディッシュに移した。ＰＢＳ＋／＋で２回完全に洗浄する前に、ＰＢＳ＋／＋で６回連続希釈（希釈１：４）してラミニンを除去した。次に、コーティングされたマイクロパターンをＰＢＳ＋／＋中で３７℃に保った。細胞は以下のように播種した：培養ディッシュ上のＭＥＦ－ＣＭで増殖している細胞をＰＢＳ－／－（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄し、次にアキュターゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５分間処理した。その後、細胞をピペットで粉砕して単一細胞の懸濁液を確保し、アキュターゼを２０ｎｇ ｍｌ－１ ｂＦＧＦとＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ； Ａｂｃａｍ ａｂ１２０１２９）を添加した４×ＨＵＥＳＭ培地で希釈して除去した。細胞を同じ培地でさらに希釈し、３．０ｍｌの培地中の５×１０５（または指示通り）の細胞を３５ｍｍ組織培養ディッシュ中のマイクロパターン上に置き、３７℃でインキュベートした。３時間後、ディッシュ中のマイクロパターンをＰＢＳ＋／＋で１回洗浄した。ＳＢ＋ＬＤＮ条件の場合：ＰＢＳ＋／＋を，１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－００１０－１０）および０．２μＭ ＬＤＮ １９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－００１９）を含む３Ｎ 培地７３に置き換えた。３日目と５日目に、培地を同じ新鮮な培地に交換し、７日目まで３７℃でインキュベートした。ＳＢ＋ＢＭＰ４条件（ニューロロイド）では、ＰＢＳを、１０μＭ ＳＢ４３１５４２および０．２μＭ ＬＤＮ １９３１８９を含むＨＵＥＳＭに置き換えた。３日目に、培地を１０μＭ ＳＢ４３１５４２およびＢＭＰ４（５０ｎｇ ｍｌ－１または各実験で示した）を含むＨＵＥＳＭに交換した。５日目に、培地を同じ新鮮な培地に交換した後、７日目までインキュベートした。
チップ上でのマイクロパターン化された細胞培養とニューロロイド誘導：マイクロパターン化ガラスカバースリップ（ＣＹＴＯＯＣＨＩＰＳ Ａｒｅｎａ Ａ、Ａｒｅｎａ ５００Ａ、Ａｒｅｎａ ＥＭＢ Ａ）を、まずＰＢＳ＋／＋（Ｇｉｂｃｏ）で希釈した１０μｇ ｍｌ－１の組み換えラミニン－５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ、ＬＮ５２１－０３）で３７℃にて３時間コーティングした。１０ｃｍディッシュに設置したパラフィルム上にマイクロパターンを表向きに置き、８００μｌのラミニン溶液をマイクロパターンに添加した。３７℃で３時間後、コーティングされたマイクロパターンを５ｍｌのＰＢＳ＋／＋の入った３５ｍｍディッシュに移した。ＰＢＳ＋／＋で２回完全に洗浄する前に、ＰＢＳ＋／＋で６回連続希釈（希釈１：４）してラミニンを除去した。次に、コーティングされたマイクロパターンをＰＢＳ＋／＋中で３７℃に保った。細胞は以下のように播種した：培養ディッシュ上のＭＥＦ－ＣＭで増殖している細胞をＰＢＳ－／－（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄し、次にアキュターゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５分間処理した。その後、細胞をピペットで粉砕して単一細胞の懸濁液を確保し、アキュターゼを２０ｎｇ ｍｌ－１ ｂＦＧＦとＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ； Ａｂｃａｍ ａｂ１２０１２９）を添加した４×ＨＵＥＳＭ培地で希釈して除去した。細胞を同じ培地でさらに希釈し、３．０ｍｌの培地中の５×１０５（または指示通り）の細胞を３５ｍｍ組織培養ディッシュ中のマイクロパターン上に置き、３７℃でインキュベートした。３時間後、ディッシュ中のマイクロパターンをＰＢＳ＋／＋で１回洗浄した。ＳＢ＋ＬＤＮ条件の場合：ＰＢＳ＋／＋を，１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－００１０－１０）および０．２μＭ ＬＤＮ １９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－００１９）を含む３Ｎ 培地７３に置き換えた。３日目と５日目に、培地を同じ新鮮な培地に交換し、７日目まで３７℃でインキュベートした。ＳＢ＋ＢＭＰ４条件（ニューロロイド）では、ＰＢＳを、１０μＭ ＳＢ４３１５４２および０．２μＭ ＬＤＮ １９３１８９を含むＨＵＥＳＭに置き換えた。３日目に、培地を１０μＭ ＳＢ４３１５４２およびＢＭＰ４（５０ｎｇ ｍｌ－１または各実験で示した）を含むＨＵＥＳＭに交換した。５日目に、培地を同じ新鮮な培地に交換した後、７日目までインキュベートした。
免疫蛍光法：マイクロパターンのカバースリップを、暖かい培地中４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １５７１３）で３０分間固定し、ＰＢＳ－／－で３回すすいだ後、ＰＢＳ－／－中の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ ９３４４３）を含む３％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ０１７－０００－１２１）で３０分間ブロッキングし透過化させた。マイクロパターンを一次抗体とともに１．５時間インキュベートし、ＰＢＳ－／－で５分間ずつ３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ５９４またはＡｌｅｘａ ６４７とコンジュゲートした二次抗体（１：１，０００ 希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）および１０ｎｇ ｍｌ－１のＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄ１３０６）とともに３０分インキュベートした後、ＰＢＳ－／－で２回洗浄した。同種の抗体による二重染色には、Ａｌｅｘａ ４８８ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， ７１５－５４７－００３）とＦａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， ７１５－００７－００３）を使用した。カバースリップは、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ３６９３４）を用いてスライドにマウントした。
顕微鏡観察：マイクロパターンのカバースリップは、１０倍、２０倍または４０倍の水浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ＬＳＭ ７８０レーザー走査型共焦点顕微鏡で取得した。
７．１．２． 結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロロイド（図１Ａ）と受精後約２１日目のｉｎ ｖｉｖｏ対応物（図１Ｂ）を比較することにより、高いレベルの類似性が明らかになり、ヒト遺伝性障害の研究および表現型逆転に基づく薬物のスクリーニングに最適な前臨床エンドポイントとなっている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロロイド（図１Ａ）と受精後約２１日目のｉｎ ｖｉｖｏ対応物（図１Ｂ）を比較することにより、高いレベルの類似性が明らかになり、ヒト遺伝性障害の研究および表現型逆転に基づく薬物のスクリーニングに最適な前臨床エンドポイントとなっている。
７．２． [実施例２]：ＨＤ細胞株由来のニューロロイドの特徴付け
８つのＨＤ ＲＵＥＳ２同質遺伝子細胞株のライブラリーを、ニューロロイドを形成するように誘導し、多数の分子マーカーの発現についてスクリーニングした。
８つのＨＤ ＲＵＥＳ２同質遺伝子細胞株のライブラリーを、ニューロロイドを形成するように誘導し、多数の分子マーカーの発現についてスクリーニングした。
７．２．１． 材料および方法
細胞培養：全てのｈＥＳＣ株は、マウス胚性線維芽細胞を調整し、２０ｎｇ ｍｌ－１ βＦＧＦ（ＭＥＦ－ＣＭ）２７を補充したＨＵＥＳＭ培地で増殖させた。細胞は２カ月間隔でマイコプラズマ属（Mycoplasma spp）について検査した。細胞はＧｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液をコーティングした組織培養ディッシュで培養し、様々なマーカーの発現を解析した。
細胞培養：全てのｈＥＳＣ株は、マウス胚性線維芽細胞を調整し、２０ｎｇ ｍｌ－１ βＦＧＦ（ＭＥＦ－ＣＭ）２７を補充したＨＵＥＳＭ培地で増殖させた。細胞は２カ月間隔でマイコプラズマ属（Mycoplasma spp）について検査した。細胞はＧｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液をコーティングした組織培養ディッシュで培養し、様々なマーカーの発現を解析した。
７．２．２． 結果
ニューロロイドは、明確な特徴を示した：ＰＡＸ６領域／ロゼット伸長。ニューロロイドにおいて、ＣＡＧ伸長はＰＡＸ６＋領域の増加と関連していた（図２）。このＣＡＧ伸長特異的表現型の発見は、ＨＤ表現型をＷＴに逆転することができる低分子の発見に向けてハイスループットスクリーニングキャンペーンを行うために、この表現型シグネチャーを使用する可能性を開くものである。
ニューロロイドは、明確な特徴を示した：ＰＡＸ６領域／ロゼット伸長。ニューロロイドにおいて、ＣＡＧ伸長はＰＡＸ６＋領域の増加と関連していた（図２）。このＣＡＧ伸長特異的表現型の発見は、ＨＤ表現型をＷＴに逆転することができる低分子の発見に向けてハイスループットスクリーニングキャンペーンを行うために、この表現型シグネチャーを使用する可能性を開くものである。
７．３． [実施例３]：ＨＤ表現型逆転のためのＡＩスクリーニング
ＨＤニューロロイド表現型を野生型に逆転することができる分子について、ＡＩスクリーニングを行った（図３参照）。このようなスクリーニングにおいて、ＷＴコロニーは影響を受けないままであるが、ＣＡＧ伸長によって誘導される有害な効果を逆転させるためにコロニーレベルで作用できる分子は、疾患対立遺伝子に特異的であり、したがって、ＨＤの動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ検証に向けて進歩する有望な治療候補とみなされるであろう。
ＨＤニューロロイド表現型を野生型に逆転することができる分子について、ＡＩスクリーニングを行った（図３参照）。このようなスクリーニングにおいて、ＷＴコロニーは影響を受けないままであるが、ＣＡＧ伸長によって誘導される有害な効果を逆転させるためにコロニーレベルで作用できる分子は、疾患対立遺伝子に特異的であり、したがって、ＨＤの動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ検証に向けて進歩する有望な治療候補とみなされるであろう。
ニューロロイド表現型を特徴付けるために使用され得る最も簡単な特徴は、ＰＡＸ６＋ドメイン伸長である。これは有用な特定の特徴を示すが、大規模な表現型スクリーニングから生じる可能性が高い表現型のバリエーションの全範囲を包含するものではない。理想的には、１）偽陽性／偽陰性の数を最小にするために、ＷＴおよびＨＤニューロロイド間の強力な識別、２）ＷＴおよびＨＤ表現型間のスケールを描くことによる表現型逆転の程度の定量的測定、３）試験した低分子の細胞毒性およびオフターゲット効果の測定を可能にする分析ツールが必要である。
ここ数年、ディープ神経ネットワークに基づく機械学習ツールは、セキュリティビデオにおける顔認識または検索エンジンのために同様のタスクを実行するために使用されている。これらのツールは、創薬にも使用することができる。具体的には、スクリーニングキャンペーンでは、多数のニューロロイドの画像：ＷＴ対照、ＨＤ対照、および薬物で処理したＨＤが返される。これらの画像は全て、臨床での薬の成功を予測する２つの量：薬物毒性と薬物効果を返すように特別に訓練されたディープ神経ネットワークの入力として使用することができる（図４）。
７．３．１． 材料および方法
９６ウェルプレート上のマイクロパターン化された細胞培養およびイメージング：チップ上でのマイクロパターン化細胞培養およびニューロロイド誘導プロトコルは、マイクロパターン化９６ウェルプレート（ＣＹＴＯＯＰＬＡＴＥＳ Ａｒｅｎａ Ａ， Ａｒｅｎａ ７００）を用いて使用した。ニューロロイド誘導は、培地交換、細胞分注、ならびに免疫蛍光のための洗浄およびインキュベーションを必要とする全てのステップを、ＥＬ４０６洗浄／分注ロボットで行うように改変された。細胞播種には、０．１８Ｍ細胞／ｍｌの密度で体積２００μｌの細胞懸濁液を使用した。プレートイメージングは、４倍レンズを通してＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００ハイコンテンツイメージャーで実施した。
９６ウェルプレート上のマイクロパターン化された細胞培養およびイメージング：チップ上でのマイクロパターン化細胞培養およびニューロロイド誘導プロトコルは、マイクロパターン化９６ウェルプレート（ＣＹＴＯＯＰＬＡＴＥＳ Ａｒｅｎａ Ａ， Ａｒｅｎａ ７００）を用いて使用した。ニューロロイド誘導は、培地交換、細胞分注、ならびに免疫蛍光のための洗浄およびインキュベーションを必要とする全てのステップを、ＥＬ４０６洗浄／分注ロボットで行うように改変された。細胞播種には、０．１８Ｍ細胞／ｍｌの密度で体積２００μｌの細胞懸濁液を使用した。プレートイメージングは、４倍レンズを通してＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００ハイコンテンツイメージャーで実施した。
２０８０化合物からなる多数のライブラリーを、マイクロパターン化ガラス底を有する９６ウェルプレートでスクリーニングした。これらのプレートにおいて、各ウェルは約２７の個々のニューロロイドを有する。スクリーニング中、後の解析のためのディープ神経ネットワークを訓練するための十分な対照データを有するために、ＷＴ対照の２プレートおよびＨＤ未処理対照の２プレートを確保した。化合物は、分化の０日目にテストプレートに適用し、３日目と５日目に培地交換のステップで再適用した。各化合物は、１０μＭの特有の濃度で、特有のウェルに適用した。７日目にプレートを固定し、ＤＡＰＩ、ＰＡＸ６、ファロイジンで染色した。染色後、プレートをイメージングし、全てのウェルにおける個々のニューロロイドをセグメント化し、ラベル付けした後、特定のディープ神経ネットワークに供給した。
画像解析：マイクロパターン化またはプレート培養実験から取得した画像タイルをスティッチし、バックグラウンド補正した。ＤＡＰＩチャンネルを閾値処理し、コロニーサイズに関してアルファ形状を計算することにより、コロニーを検出するための前景マスクを作成した。検出された各コロニーは、補正されスティッチングされた画像から抽出した。
表現型レスキューの定量化のためのディープラーニング。多チャンネルのＷＴおよび疾患オルガノイド画像を、訓練（７０％）および検証（３０％）画像に分割する。次いで、神経ネットワーク（ＮＮ）を、訓練データセット上で訓練する。ＮＮはＰｙｔｏｒｃｈ等の機械学習フレームワークを用いてコード化される。２次元画像の場合、このフレームワークは、ＩｍａｇｅＮｅｔデータベースで事前に学習された畳み込み型ＮＮを提供する。残差ネットワーク（ＲｅｓＮｅｔ）は畳み込みネットワークのサブクラスであり、画像の分類に特に有効である。深さの異なる（１８、３４、５０、１０１、１５２層）事前学習ＲｅｓＮｅｔは、全ての主要な機械学習フレームワークにおいて利用可能である。ＲｅｓＮｅｔ５０を選択した。これは、畳み込み、バッチ正規化（ＢａｔｃｈＮｏｒｍ）、整流化線形（ＲｅＬＵ）層からなる層のブロックからなる。最後のＡｖｅｒａｇｅ Ｐｏｏｌｉｎｇと高密度連結層を削除し、カスタムレイヤーに置き換える。まず、事前学習されたネットワークは、画像をＷＴと疾患よりも多くのクラスに分類する。また、ＮＮの最後の層は、最初の層よりもデータセットに特化している。したがって、最後のＡｖｅｒａｇｅ Ｐｏｏｌｉｎｇと完全連結層を削除し、未訓練のＡｄａｐｔｉｖｅ Ａｖｅｒａｇｅ Ｐｏｏｌｉｎｇ、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｐｏｏｌｉｎｇ、Ｂａｔｃｈ Ｎｏｒｍ、Ｄｒｏｐｏｕｔ、および完全連結層と置き換えた後、最後にソフトマックス演算を行う。ここで、５１２ユニットの完全連結層が使われ、直後に最終完全連結層はＷＴと疾患にそれぞれ１ユニットずつ、計２ユニットのみで構成されている。最終的なソフトマックスは、これらのユニットの活性化を、合計が１になる確率に変換する。
訓練は、ネットワークに画像を表示し、ＷＴまたは疾患の出力確率を真値と比較し、次に画像が表示されたときにネットワークが真値により近い予測を与えるようにネットワークの重みを変更することによって実行される。このフィッティング手法は、全ての主要な神経ネットワークに実装されているバックプロパゲーションアルゴリズムを用いて行われる。画像はネットワークに何度も表示される（各実行は「エポック」と呼ばれる）。画像は「拡張」される、すなわち、画像の内容を大きく変えることはないが、ネットワークが学習できる画像のプールを拡張するために、一連の画像変換が適用される。これらのデータ拡張操作は、回転、切り抜き、画像の９０～１１０％への拡大縮小、および画像のコントラスト変更からなる。訓練は、これらのパラメータの最適なセットを見つけるために、異なるハイパーパラメータ（層の数、運動量と学習率、ドロップアウト率、エポック数）を用いて数回行われる。
次に、訓練画像で訓練されたネットワークを用いて、スクリーンからの画像の解析が行われる。最初に、スクリーンからの未処理の対照オルガノイドを使用して、ネットワークの精度を検証する。次に、薬剤化合物で処理したオルガノイドの画像を、各画像に０～１のスコアを割り当てるネットワークによって解析し、ここで、１はＷＴ、０は疾患を表す。スクリーンの解析では、１０未満のインタクトなオルガノイドを有するウェルは、その場合は化合物が毒性効果を有すると想定して、解析から除外した。その他については、ネットワークによって、各ウェルについて、このセクションで説明したツールに基づいて、表現型を逆転させる化合物の能力を測定し、このスコアを各ウェルにわたって平均化した。
細胞毒性の定量化のためのディープラーニング：毒性をアッセイするために、オートエンコーダーベースの方法を使用した。これらの教師なし神経ネットワークは、データをコード化し、低次元の潜在的表現に圧縮する。この機械学習法の教師なしという性質は、オートエンコーダーがデータに関する追加情報（野生型または疾患細胞株由来であること等）なしにデータの表現を学習するため、化合物の毒性を推定する際にバイアスがないという利点がある。また、データをベクトルで表現することで、野生型と疾患表現型の差異をベクトル空間から取り除くことができるという利点もあり、これは差異が毒性の判定に関係しないためである。毒性は以下の方法で決定した：最初に、潜在空間から野生型と疾患の差異を取り除く。次に、野生型と疾患の表現型との平均ベクトルからの距離を計算し、野生型と疾患の表現型との標準偏差と比較する。この距離を毒性として定義する。
７．３．２． 解析結果
解析結果を図５に示す。ほとんどの化合物は、分子が基本的にＨＤニューロロイドに影響を与えない、左下象限に該当する。多数の分子が毒性シグネチャー（毒性スコア＞３）を有し、一握りのヒットが、ＡＩ解析ツールの特徴付けによって定義されるヒット空間に該当し、これは、高い表現型レスキュースコア（＞０．９５）および低い毒性（＜３）として定義された。特に、ブロモスポリンは、低毒性で、特に有効な分子であることが発見された（表現型レスキュー＝０．９８、毒性スコア＝１．９３）。
解析結果を図５に示す。ほとんどの化合物は、分子が基本的にＨＤニューロロイドに影響を与えない、左下象限に該当する。多数の分子が毒性シグネチャー（毒性スコア＞３）を有し、一握りのヒットが、ＡＩ解析ツールの特徴付けによって定義されるヒット空間に該当し、これは、高い表現型レスキュースコア（＞０．９５）および低い毒性（＜３）として定義された。特に、ブロモスポリンは、低毒性で、特に有効な分子であることが発見された（表現型レスキュー＝０．９８、毒性スコア＝１．９３）。
図６（上）は、ＷＴ対照ウェル、ＨＤ対照ウェル、および１０μＭブロモスポリンで処理したＨＤウェルを用いた一次スクリーニングで取得した画像の例を示す。これは、ＨＤバックグラウンドにおけるＰＡＸ６領域の拡張、およびブロモスポリンによるＷＴレベルへの減少を定性的に示すが、ＨＤニューロロイドがブロモスポリンと接触している場合、ＷＴ構成に向かってＨＤ表現型が逆転することも示し、これはＡＩアルゴリズムから得られ図５に示された定量結果と一致している。
ブロモスポリンは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９およびＣＥＣＲ２に対するＩＣ５０がそれぞれ０．４１μＭ、０．２９μＭ、０．１２２μＭおよび０．０１７μＭであるＢＲＤの広範阻害剤として文献に記載されている。ブロモスポリンがｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＤ表現型のモジュレーターであることを確認するために、新鮮なストックパワー（ｐｏｗｅｒ）からブロモスポリンを再構成し、低スケールの実験でその特性を検証した。定性的な結果を図６（下）に示すが、これにより、０．５μＭのブロモスポリン適用により、ＨＤ遺伝子によって誘導された無秩序がレスキューされることが明確に示されている。
７．４． [実施例４]：ブロモスポリンの効力および毒性の定量化
ＨＤニューロロイドの表現型を逆転させる際のブロモスポリンの効力を定量的に測定するために、用量応答実験を実施した。
ＨＤニューロロイドの表現型を逆転させる際のブロモスポリンの効力を定量的に測定するために、用量応答実験を実施した。
７．４．１． 材料および方法
ＨＤニューロロイドは、１０の異なる濃度のブロモスポリンと３つ組で接触させた。表現型の逆転の程度は、各ブロモスポリン濃度についてＡＩアルゴリズムを用いて定量化した。
ＨＤニューロロイドは、１０の異なる濃度のブロモスポリンと３つ組で接触させた。表現型の逆転の程度は、各ブロモスポリン濃度についてＡＩアルゴリズムを用いて定量化した。
７．４．２． 結果
ブロモスポリンは、１２０ｎＭのＥＣ５０を有し、約３００ｎＭで完全に有効であった（図７）。ブロモスポリンの毒性プロファイルは、ＷＴおよびＨＤ－５６ＣＡＧニューロロイドで評価された。毒性応答は、１μＭ超の濃度で起こり始めた。全体的に、これは、ブロモスポリンが、ＨＤの複雑なインビトロモデルにおいて効率的であり、ブロモスポリンがＷＴニューロロイドには影響しないがＨＤニューロロイドをレスキューできる０．３μＭ～１μＭの間の濃度域が存在することを示す。このことは、このアッセイ系における疾患対立遺伝子に対する特異性の領域を強調している。さらに、この濃度範囲において、ブロモスポリンは低い毒性を示す。
ブロモスポリンは、１２０ｎＭのＥＣ５０を有し、約３００ｎＭで完全に有効であった（図７）。ブロモスポリンの毒性プロファイルは、ＷＴおよびＨＤ－５６ＣＡＧニューロロイドで評価された。毒性応答は、１μＭ超の濃度で起こり始めた。全体的に、これは、ブロモスポリンが、ＨＤの複雑なインビトロモデルにおいて効率的であり、ブロモスポリンがＷＴニューロロイドには影響しないがＨＤニューロロイドをレスキューできる０．３μＭ～１μＭの間の濃度域が存在することを示す。このことは、このアッセイ系における疾患対立遺伝子に対する特異性の領域を強調している。さらに、この濃度範囲において、ブロモスポリンは低い毒性を示す。
７．５． [実施例５]：ＨＤニューロロイド表現型逆転のためのＢＲＤ阻害剤のアッセイ
他のＢＲＤ阻害剤がＨＤニューロロイド表現型逆転活性を有するかどうかを発見するためにアッセイを実施した。
他のＢＲＤ阻害剤がＨＤニューロロイド表現型逆転活性を有するかどうかを発見するためにアッセイを実施した。
７．５．１． 材料および方法
選択したＢＲＤ阻害剤を、９６ウェルプレートを用いて試験した。各化合物の有効性および毒性を決定した。
選択したＢＲＤ阻害剤を、９６ウェルプレートを用いて試験した。各化合物の有効性および毒性を決定した。
７．５．２． 結果
選択した１９のＢＲＤ阻害剤を、９６ウェルプレートを用いて１０μＭの単一濃度で試験した。有効性および毒性を、各分子の標的とともに図８にプロットして示す。一次スクリーニングでヒットの定義に使用したものと同じ定量的基準を使用したところ、１分子：ＢＩ７２７３だけが低い毒性を維持しながら十分高い有効性を示した。この分子は、ＢＲＤ９およびＢＲＤ７に対するＩＣ５０がそれぞれ１９ｎＭおよび１１７ｎＭである、強力かつ選択的で、細胞透過性のＢＲＤ９阻害剤であることが公知である。
選択した１９のＢＲＤ阻害剤を、９６ウェルプレートを用いて１０μＭの単一濃度で試験した。有効性および毒性を、各分子の標的とともに図８にプロットして示す。一次スクリーニングでヒットの定義に使用したものと同じ定量的基準を使用したところ、１分子：ＢＩ７２７３だけが低い毒性を維持しながら十分高い有効性を示した。この分子は、ＢＲＤ９およびＢＲＤ７に対するＩＣ５０がそれぞれ１９ｎＭおよび１１７ｎＭである、強力かつ選択的で、細胞透過性のＢＲＤ９阻害剤であることが公知である。
ＢＩ７２７３も正のスコアを示すという事実は、ＢＲＤ阻害剤がＨＤのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて効率的であるという知見を補強するものである。さらに、ＢＲＤ９はブロモスポリンとＢＩ７２７３の分子標的の間の唯一の共通項であるため、ＢＲＤ９が、ＨＤ表現型をレスキューするために阻害され得る本アッセイ系における関連標的であるという可能性が提起される。
ＢＩ９５６４のような他のＢＲＤ９阻害剤は、ＢＲＤ阻害剤のパネル（図８）を用いた実験において正のスコアを示さなかったが、１０μＭという単一かつかなりの高濃度におけるこれらの分子の試験は、高濃度で毒性およびオフターゲット効果を示し始めることができる非常に強力な分子の活性を妨げる可能性がある。
この仮説に従って、他のＢＲＤ９に焦点を当てた阻害剤の濃度依存性応答を、より低い濃度で試験した。これらは、陽性対照としてのブロモスポリン（標的：ＢＲＤ２、ＢＲＤ４、ＢＲＤ９およびＣＥＣＲ２）およびＢＩ７２７３（標的：ＢＲＤ９およびＢＲＤ７）だけでなく、ＢＩ９５６４（標的：ＢＲＤ９およびＢＲＤ７）、ｄＢＲＤ９（選択的ＢＲＤ９ ｐｒｏｔａｃ）およびＩ－ＢＲＤ９（ＢＲＤ９およびＢＲＤ４）からなるものであった。結果を図９に示す。驚くべきことに、これらの分子は全て、サブマイクロモル活性でＨＤニューロロイドをレスキューするのに強力であった（図９ａ）。さらに、ＢＩ７２７３、ＢＩ９５６４、ｄ－ＢＲＤ９およびＩ－ＢＲＤ９の毒性プロファイルは、全てブロモスポリンより低かった（図９ｂ）。このことは、ブロモスポリンの広範囲の活性が、よりＢＲＤ９中心の化合物と比較して高濃度で有害になる可能性があることを示唆している可能性がある。成功したＢＲＤ９阻害化合物を、その活性の簡単な説明とともに、図１０に示す。
７．６． [実施例６]：ＢＲＤ阻害剤の作用機序
ＢＲＤ阻害剤の作用機序を解読するために、ＨＴＴ低下戦略がＨＤマウスモデルにおいて有効性を示し、ＨＤに対する最新の臨床開発の基礎であるという事実に一部基づいて、ＢＲＤ阻害剤をＨＴＴ低下能力について試験した。したがって、ＨＴＴ低下は、ＨＤを治療することを望むための唯一の公知の作用機序である。
ＢＲＤ阻害剤の作用機序を解読するために、ＨＴＴ低下戦略がＨＤマウスモデルにおいて有効性を示し、ＨＤに対する最新の臨床開発の基礎であるという事実に一部基づいて、ＢＲＤ阻害剤をＨＴＴ低下能力について試験した。したがって、ＨＴＴ低下は、ＨＤを治療することを望むための唯一の公知の作用機序である。
そこで、我々は、ＨＤニューロロイドの形成のためのプロトコルを、２つの遺伝的バックグラウンド：５６ＣＡＧおよび７２ＣＡＧで繰り返し、図９に開示された５つのＢＲＤ阻害剤で２つの濃度：１μＭおよび５μＭで処理した。分化プロトコルの最後に、ニューロロイドの溶解物を凍結し、後にそのＨＴＴ含有量を分析した。伸長ＨＴＴレベルおよび総ＨＴＴレベル（伸長＋正規）の両方を、ＥＬＩＳＡベースのメゾスケール発見（ＭＳＤ）電気化学発光アッセイによって定量化した。
７．６．１． 材料および方法
ＨＤニューロロイドは、２つの遺伝的バックグラウンド：５６ＣＡＧおよび７２ＣＡＧで作成し、図１０に開示された５つのＢＲＤ阻害剤で２つの濃度：１μＭおよび５μＭで処理した。分化プロトコルの最後に、ニューロロイド溶解物をそのＨＴＴ含有量について分析した。伸長ＨＴＴレベルおよび総ＨＴＴレベル（伸長＋正規）の両方を、ＥＬＩＳＡベースのメソスケール発見（ＭＳＤ）電気化学発光アッセイによって定量化した。
ＨＤニューロロイドは、２つの遺伝的バックグラウンド：５６ＣＡＧおよび７２ＣＡＧで作成し、図１０に開示された５つのＢＲＤ阻害剤で２つの濃度：１μＭおよび５μＭで処理した。分化プロトコルの最後に、ニューロロイド溶解物をそのＨＴＴ含有量について分析した。伸長ＨＴＴレベルおよび総ＨＴＴレベル（伸長＋正規）の両方を、ＥＬＩＳＡベースのメソスケール発見（ＭＳＤ）電気化学発光アッセイによって定量化した。
７．６．２． 結果
結果を図１１に示す。試験した４つの薬物、ブロモスポリン、ＢＩ７２７３、ＢＩ９５６４およびｄＢＲＤ９の中で、ブロモスポリンだけがＨＴＴレベル低下能力を有していた。特に、ブロモスポリンは、試験した２つの濃度および５６ＣＡＧと７２ＣＡＧの２つの遺伝的バックグラウンドで、伸長ＨＴＴと総ＨＴＴレベルの両方を減少させた。ＨＴＴレベルの低下は、５μＭで全てのバックグラウンドにおいて７５％超、１μＭの低濃度では５０％以上超の伸長ＨＴＴレベルの低下という、有意な低下を示した。興味深いことに、ＢＩ７２７３、ＢＩ９５６４、およびｄＢＲＤ９ではＨＴＴ低下能力が測定されなかった。このことは、これら３つの分子が、ＨＴＴレベル低下とは異なる作用機序で作用し、ＨＤニューロロイドをレスキューすることを示唆している。
結果を図１１に示す。試験した４つの薬物、ブロモスポリン、ＢＩ７２７３、ＢＩ９５６４およびｄＢＲＤ９の中で、ブロモスポリンだけがＨＴＴレベル低下能力を有していた。特に、ブロモスポリンは、試験した２つの濃度および５６ＣＡＧと７２ＣＡＧの２つの遺伝的バックグラウンドで、伸長ＨＴＴと総ＨＴＴレベルの両方を減少させた。ＨＴＴレベルの低下は、５μＭで全てのバックグラウンドにおいて７５％超、１μＭの低濃度では５０％以上超の伸長ＨＴＴレベルの低下という、有意な低下を示した。興味深いことに、ＢＩ７２７３、ＢＩ９５６４、およびｄＢＲＤ９ではＨＴＴ低下能力が測定されなかった。このことは、これら３つの分子が、ＨＴＴレベル低下とは異なる作用機序で作用し、ＨＤニューロロイドをレスキューすることを示唆している。
７．７． [実施例７]：ＢＲＤ阻害剤を介したヒトガストルロイドにおけるＨＤ表現型のレスキュー
ＢＲＤ阻害剤を、それらがヒトガストルロイドにおける他のＨＤ表現型をレスキューすることができるかどうかを決定するために試験した。ヒト胚性幹細胞コロニーをＣＨＩＲおよびＡｃｔｉｖｉｎで４８時間刺激すると、原始ストリーク様の集団、ＳＯＸ１７＋が周辺部に誘導される（図１２ａを参照）。さらに、ＨＤ－５６ＣＡＧ細胞から作られたＨＤガストルロイドでは、周辺部のＳＯＸ１７＋ドメインが大きく伸長している。この効果は、ヌルＨＴＴ－／－細胞株を用いるとさらに顕著であり、これは、タンパク質の非存在を表現することから、ＨＤ変異が実際に発生学的文脈における機能喪失変異であるという知見を支持するものである。
ＢＲＤ阻害剤を、それらがヒトガストルロイドにおける他のＨＤ表現型をレスキューすることができるかどうかを決定するために試験した。ヒト胚性幹細胞コロニーをＣＨＩＲおよびＡｃｔｉｖｉｎで４８時間刺激すると、原始ストリーク様の集団、ＳＯＸ１７＋が周辺部に誘導される（図１２ａを参照）。さらに、ＨＤ－５６ＣＡＧ細胞から作られたＨＤガストルロイドでは、周辺部のＳＯＸ１７＋ドメインが大きく伸長している。この効果は、ヌルＨＴＴ－／－細胞株を用いるとさらに顕著であり、これは、タンパク質の非存在を表現することから、ＨＤ変異が実際に発生学的文脈における機能喪失変異であるという知見を支持するものである。
７．７．１． 材料および方法
ガストルロイド誘導：マイクロパターン化チップのコーティングのプロトコルを用いる。ＰＢＳ＋／＋での最終洗浄後、８ｘ１０５個の細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、Ａｂｃａｍ）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を補充したＭＥＦ－ＣＭの規定量中で各カバースリップ上に播種し、１０分間乱さないようにしてパターン全体に確実に均一な分布になるようにした。播種３時間後にＲＯＣＫ阻害剤を培地から除去し、翌日に５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＭ ＩＷＰ２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＡＣＴＩＶＩＮ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および低分子処理で細胞を誘導した。サンプルは４８時間後に固定し、免疫蛍光法で分析した。
ガストルロイド誘導：マイクロパターン化チップのコーティングのプロトコルを用いる。ＰＢＳ＋／＋での最終洗浄後、８ｘ１０５個の細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、Ａｂｃａｍ）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を補充したＭＥＦ－ＣＭの規定量中で各カバースリップ上に播種し、１０分間乱さないようにしてパターン全体に確実に均一な分布になるようにした。播種３時間後にＲＯＣＫ阻害剤を培地から除去し、翌日に５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＭ ＩＷＰ２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＡＣＴＩＶＩＮ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および低分子処理で細胞を誘導した。サンプルは４８時間後に固定し、免疫蛍光法で分析した。
７．７．２． 結果
１μＭのブロモスポリン、ＢＩ７２７３またはｄＢＲＤ９をＨＤガストルロイドに適用した場合、それぞれの場合において、ＷＴ構成に向かって、周辺部のＳＯＸ１７＋領域の著しい減少が見られた（図１２ｂ参照）。これは、ニューロロイドと直交する第２のＨＤ表現型において、ＢＲＤ阻害剤が表現型レスキューを行う能力を維持することを明確に示している。
１μＭのブロモスポリン、ＢＩ７２７３またはｄＢＲＤ９をＨＤガストルロイドに適用した場合、それぞれの場合において、ＷＴ構成に向かって、周辺部のＳＯＸ１７＋領域の著しい減少が見られた（図１２ｂ参照）。これは、ニューロロイドと直交する第２のＨＤ表現型において、ＢＲＤ阻害剤が表現型レスキューを行う能力を維持することを明確に示している。
７．８． [実施例８]：誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたＢＲＤ９レベルの低下は、ＨＤ表現型をレスキューする
７．８．１． 材料および方法
ＢＲＤ９転写物を効率的に低減させることができる誘導性ＢＲＤ９ノックダウン株をＨＧ－５６ＣＡＧバックグラウンドで作製した。ドキシサイクリン誘導ＴｅｔベースＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を利用し、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の添加後にＢＲＤ９転写物を低下させた。３つの個々のｇＲＮＡを最適化した結果、２日間のＤＯＸ適用後にＢＲＤ９ ｍＲＮＡレベルを５０％低下させることができる構築物が得られた（図１３Ａ）。ＨＤ表現型を分析し、誘導性ノックダウン株と対照として使用したＷＴ－２０ＣＡＧニューロロイドで比較した。
ＢＲＤ９転写物を効率的に低減させることができる誘導性ＢＲＤ９ノックダウン株をＨＧ－５６ＣＡＧバックグラウンドで作製した。ドキシサイクリン誘導ＴｅｔベースＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を利用し、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の添加後にＢＲＤ９転写物を低下させた。３つの個々のｇＲＮＡを最適化した結果、２日間のＤＯＸ適用後にＢＲＤ９ ｍＲＮＡレベルを５０％低下させることができる構築物が得られた（図１３Ａ）。ＨＤ表現型を分析し、誘導性ノックダウン株と対照として使用したＷＴ－２０ＣＡＧニューロロイドで比較した。
７．８．２． 結果
ＨＤ－５６ＣＡＧおよびＷＴ－２０ＣＡＧニューロロイドの解析により、中央のＰＡＸ６＋ドメインが伸長した無秩序化、および対照と比較してＨＤ－５６ＣＡＧにおける周辺のＳＯＸ１０＋細胞の減少が明らかになった（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。５６ＣＡＧバックグラウンドにおいてＤＯＸを適用し、ＢＲＤ９レベルを低下させると、これらの２つのＨＤ関連パラメータにおいて、それらのＷＴ値への有意なレスキューが観察された（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。これらのデータにより、ＢＲＤ９が関心のあるＨＤ標的であり、その阻害がＨＤ表現型の逆転をもたらすことが確認される。
ＨＤ－５６ＣＡＧおよびＷＴ－２０ＣＡＧニューロロイドの解析により、中央のＰＡＸ６＋ドメインが伸長した無秩序化、および対照と比較してＨＤ－５６ＣＡＧにおける周辺のＳＯＸ１０＋細胞の減少が明らかになった（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。５６ＣＡＧバックグラウンドにおいてＤＯＸを適用し、ＢＲＤ９レベルを低下させると、これらの２つのＨＤ関連パラメータにおいて、それらのＷＴ値への有意なレスキューが観察された（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。これらのデータにより、ＢＲＤ９が関心のあるＨＤ標的であり、その阻害がＨＤ表現型の逆転をもたらすことが確認される。
８． 具体的な実施形態
様々な特定の実施形態が例示され、説明されてきたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。本開示は、以下に示される番号付けされた実施形態によって例示される。
１． ハンチントン病（ＨＤ）を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のブロモドメイン９（ＢＲＤ９）阻害剤を対象に投与することを含む、方法。
２． ＢＲＤ９阻害剤がデグロンにコンジュゲートされていない、実施形態１に記載の方法。
３． ＢＲＤ９阻害剤の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＲＤ９のプロテアソーム介在性分解を誘導しない、実施形態１に記載の方法。
４． ＢＲＤ９阻害剤が選択的なＢＲＤ９阻害剤である、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ２と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４に記載の方法。
６． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ３と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４または実施形態５に記載の方法。
７． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ４と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４～６のいずれか一項に記載の方法。
８． ＢＲＤ９阻害剤がピリジノン化合物である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９． ＢＲＤ９阻害剤がＢＩ－９５６４：
様々な特定の実施形態が例示され、説明されてきたが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。本開示は、以下に示される番号付けされた実施形態によって例示される。
１． ハンチントン病（ＨＤ）を有する対象を治療する方法であって、治療有効量のブロモドメイン９（ＢＲＤ９）阻害剤を対象に投与することを含む、方法。
２． ＢＲＤ９阻害剤がデグロンにコンジュゲートされていない、実施形態１に記載の方法。
３． ＢＲＤ９阻害剤の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＲＤ９のプロテアソーム介在性分解を誘導しない、実施形態１に記載の方法。
４． ＢＲＤ９阻害剤が選択的なＢＲＤ９阻害剤である、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ２と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４に記載の方法。
６． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ３と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４または実施形態５に記載の方法。
７． ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ４と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態４～６のいずれか一項に記載の方法。
８． ＢＲＤ９阻害剤がピリジノン化合物である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９． ＢＲＤ９阻害剤がＢＩ－９５６４：
１０． ＢＲＤ９阻害剤がＢＩ－７２７３：
１１． ＢＲＤ９阻害剤がメチルキノリノン化合物である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
１２． ＢＲＤ９阻害剤がＬＰ－９９：
１３． ＢＲＤ９阻害剤がチエノピリドン化合物である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
１４．ＢＲＤ９阻害剤がＩ－ＢＲＤ９：
１５． ＢＲＤ９阻害剤がｄ－ＢＲＤ９：
１６． ＢＲＤ９阻害剤がＴＰ－４７２：
１７． ＢＲＤ９阻害剤がＧＮＥ－３７５：
１８． ＢＲＤ９阻害剤が式（Ｉ）：
ＡはフェニルまたはＮおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５または６員ヘテロアリールであり、ここでフェニルまたはヘテロアリールは非置換であるか、または１～３個のＲ３基で置換されており、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、またはＮＨ２であり、
各Ｒ３は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、または、
Ｘ１は、ＮＲ５またはＯであり、
Ｙ１は、Ｓ（Ｏ）ａまたはＮＲ５であり、
各Ｒ４は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、ハロゲン、または－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
各Ｒ６は、独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
ａは、０、１、または２であり、
ｎおよびｒは、それぞれ独立して、０、１、２、または３である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
１９． ＢＲＤ９阻害剤が式（ＩＩ）：
Ｒ１は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２は、ハロゲン、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはＯＨであり、
Ｘ１はＮまたはＣＲ３であり、Ｘ２はＮまたはＣＲ４であり、ただし、Ｘ１およびＸ２が両方ともＮであることはなく、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ただし、Ｒ３およびＲ４が両方とも（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであることはなく、
あるいは、Ｒ２およびＲ３は一緒になってベンゼン環または５～６員ヘテロアレーン環を形成し、これらの環の各々は独立して非置換であるか、または独立してハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルである１つまたは複数の基で置換されていてよく、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は非置換であるか、または５～６員へテロアリールもしくはフェニルで置換されていてもよく、
Ｒ５およびＲ９は、同一であるか、または異なり、独立して、Ｈ、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ６およびＲ８は、同一であるか、または異なり、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、４～７員ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、またはＮＨＲ１３であり、
Ｒ１３は、それぞれの場合について独立して、ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員ヘテロアリールで置換されており、
あるいは、Ｒ５およびＲ６は一緒になってベンゼン環を形成し、
あるいは、Ｒ７およびＲ６、またはＲ７およびＲ８は一緒になって、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～７員ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＮＨ２、Ｙ－Ｒ１２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、
Ｙは、ＣＲ１０Ｒ１１、ＳＯ２またはＣＯであり、
Ｒ１０およびＲ１１は同一であるか、または異なり、独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は一緒になってＣ３－４シクロアルキルを形成し、
Ｒ１２は、ＮＨ２、ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（Ｒ１５，Ｒ１６）、ＯＲ１７、アリール、または５～６員ヘテロアリールであり、ここでアリールまたはヘテロアリールは、独立して非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲンもしくは４～７員へテロシクロアルキルで置換されており、ヘテロシクロアルキルの各々は、独立して、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルおよびＣＨ２Ｒ１４から選択される１つもしくは複数の基で置換されており、
Ｒ１４は、非置換であるか、またはＮＨ２、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、もしくはＯ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～１０員の単環または二環式アリールもしくはヘテロアリールであり、
Ｒ１５は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ１６は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｃ２～３アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｃ２～３アルキル－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
Ｒ１７は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
ここで、Ｒ７がＹＲ１２である場合、Ｒ６およびＲ８は、同一であってもまたは異なっていてもよく、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
置換基Ｒ５～Ｒ９の少なくとも１つは、水素ではない、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
２０． ＢＲＤ９阻害剤が非選択的ＢＲＤ９阻害剤である、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
２１． ＢＲＤ９阻害剤がブロモスポリン：
２２． ＢＲＤ９阻害剤がアミノ酸抱合体の形態で投与される、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３． アミノ酸抱合体がリジン抱合体である、実施形態２２に記載の方法。
２４． アミノ酸抱合体がフェニルアラニン抱合体である、実施形態２２に記載の方法。
２５． ＢＲＤ９阻害剤が担体とともに対象に投与される、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
２６． 担体が、ナノ粒子、エクソソーム、またはカーボンナノチューブを含む、実施形態２５に記載の方法。
２７． 担体がナノ粒子を含む、実施形態２６に記載の方法。
２８． ナノ粒子が脂質ベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
２９． ナノ粒子がヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
３０． ナノ粒子がアポリポタンパク質ベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
３１． ナノ粒子がポリマーベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
３２． ナノ粒子がデンドリマーベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
３３． ナノ粒子が無機ベースのナノ粒子を含む、実施形態２７に記載の方法。
３４． 担体がエクソソームを含む、実施形態２６に記載の方法。
３５． 担体がカーボンナノチューブを含む、実施形態２７に記載の方法。
３６． 対象に脳透過性増強剤を補助的に投与することをさらに含む、実施形態１～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７． ＢＲＤ９阻害剤および脳透過性増強剤が、単一の医薬組成物中で共投与される、実施形態３６に記載の方法。
３８． 脳透過性増強剤が、セレポート、レガデノソン、またはボルネオールを含む、実施形態３６または実施形態３７に記載の方法。
３９． 脳透過性増強剤がセレポートを含む、実施形態３８に記載の方法。
４０． 脳透過性増強剤がレガデノソンを含む、実施形態３８に記載の方法。
４１． 脳透過性増強剤がボルネオールを含む、実施形態３８に記載の方法。
４２． 対象にマイクロバブル増強超音波を行うことをさらに含む、実施形態１～４１のいずれか一項に記載の方法。
４３． ＢＲＤ９阻害剤が対象に経鼻投与される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
４４． ＢＲＤ９阻害剤が対象に静脈内投与される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
４５． ＢＲＤ９阻害剤が動脈内注射により対象に投与される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
４６． ＢＲＤ９阻害剤が対象のＣＳＦに投与される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
４７． ＢＲＤ９阻害剤が、髄腔内、脳室内または脳実質内に投与される、実施形態４６に記載の方法。
４８． それを必要とする対象におけるハンチントン病（ＨＤ）の治療に用いられるＢＲＤ９阻害剤。
４９． デグロンに結合していない、実施形態４８に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５０． ＢＲＤ９阻害剤の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＲＤ９のプロテアソーム介在性分解を誘導しない、実施形態４８に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５１． ＢＲＤ９阻害剤が選択的ＢＲＤ９阻害剤である、実施形態４８～５０のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５２． ＢＲＤ２と比較して少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態５１に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５３． ＢＲＤ３と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態５１または実施形態５２に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５４． ＢＲＤ４と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、実施形態５１～５３のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５５． ピリジノン化合物である、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５６． ＢＩ－９５６４：
５７． ＢＩ－７２７３：
５８． メチルキノリノン化合物である、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
５９． ＬＰ－９９：
６０． チエノピリドン化合物である、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
６１． Ｉ－ＢＲＤ９：
６２． ｄ－ＢＲＤ９：
６３． ＴＰ－４７２：
６４． ＧＮＥ－３７５：
６５． 式（Ｉ）：
ＡはフェニルまたはＮおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５員または６員ヘテロアリールであり、ここでフェニルまたはヘテロアリールは非置換であるか、または１～３個のＲ３基で置換されており、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、またはＮＨ２であり、
各Ｒ３は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、または、
Ｘ１は、ＮＲ５またはＯであり、
Ｙ１は、Ｓ（Ｏ）ａまたはＮＲ５であり、
各Ｒ４は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、ハロゲン、または－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
各Ｒ６は、独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
ａは、０、１、または２であり、
ｎおよびｒは、それぞれ独立して、０、１、２、または３である、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
６６． 式（ＩＩ）：
Ｒ１は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２は、ハロゲン、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはＯＨであり、
Ｘ１はＮまたはＣＲ３であり、Ｘ２はＮまたはＣＲ４であり、ただし、Ｘ１およびＸ２は両方ともＮであることはなく、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ただし、Ｒ３およびＲ４が、両方とも（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであることはなく、
あるいは、Ｒ２およびＲ３は一緒になってベンゼン環または５～６員ヘテロアレーン環を形成し、これらの環の各々は独立して非置換であるか、または独立してハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルである１つまたは複数の基で置換されていてよく、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は非置換であるか、または５～６員へテロアリールもしくはフェニルで置換されていてもよく、
Ｒ５およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ６およびＲ８は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、４～７員ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、またはＮＨＲ１３であり、
Ｒ１３は、それぞれの場合について独立して、ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ここで（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員ヘテロアリールで置換されており、
あるいは、Ｒ５およびＲ６が一緒になってベンゼン環を形成し、
あるいは、Ｒ７およびＲ６、またはＲ７およびＲ８は一緒になって、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～７員ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＮＨ２、Ｙ－Ｒ１２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、
Ｙは、ＣＲ１０Ｒ１１、ＳＯ２またはＣＯであり、
Ｒ１０およびＲ１１は同一であるかもしくは異なり、独立してＨもしくは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は一緒になってＣ３－４シクロアルキルを形成し、
Ｒ１２は、ＮＨ２、ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（Ｒ１５，Ｒ１６）、ＯＲ１７、アリール、または５～６員ヘテロアリールであり、ここでアリールまたはヘテロアリールは、独立して非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲンもしくは４～７員へテロシクロアルキルで置換されており、ヘテロシクロアルキルの各々は、独立して、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルおよびＣＨ２Ｒ１４から選択される１つもしくは複数の基で置換されており、
Ｒ１４は、非置換であるか、またはＮＨ２、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、もしくはＯ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～１０員の単環または二環式アリールもしくはヘテロアリールであり、
Ｒ１５は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ１６は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｃ２～３アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｃ２～３アルキル－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
Ｒ１７は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
ここで、Ｒ７がＹＲ１２である場合、Ｒ６およびＲ８は、同一であっても、または異なっていてもよく、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ５～Ｒ９の少なくとも１つは、水素ではない、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
６７． 非選択的ＢＲＤ９阻害剤である、実施形態４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
６８． ブロモスポリン：
６９． アミノ酸抱合体の形態で投与される、実施形態４８～６８のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７０． アミノ酸抱合体がリジン抱合体である、実施形態６９に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７１． アミノ酸抱合体がフェニルアラニン抱合体である、実施形態６９に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７２． 担体とともに対象に投与される、実施形態４８～７１のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７３． 担体が、ナノ粒子、エクソソーム、またはカーボンナノチューブを含む、実施形態７２に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７４． 担体がナノ粒子を含む、実施形態７３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７５． ナノ粒子が、脂質ベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７６． ナノ粒子が、ヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７７． ナノ粒子がアポリポタンパク質ベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７８． ナノ粒子がポリマーベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
７９． ナノ粒子がデンドリマーベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８０． ナノ粒子が無機ベースのナノ粒子を含む、実施形態７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８１． 担体がエクソソームを含む、実施形態７３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８２． 担体がカーボンナノチューブを含む、実施形態７３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８３． 対象の治療が、対象に脳透過性増強剤を補助的に投与することをさらに含む、実施形態４８～８２のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８４． ＢＲＤ９阻害剤および脳透過性増強剤が、単一の医薬組成物中で共投与される、実施形態８３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８５． 脳透過性増強剤が、セレポート、レガデノソン、またはボルネオールを含む、実施形態８３または実施形態８４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８６． 脳透過性増強剤がセレポートを含む、実施形態８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８７． 脳透過性増強剤がレガデノソンを含む、実施形態８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８８． 脳透過性増強剤がボルネオールを含む、実施形態８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
８９． 対象の治療が、対象にマイクロバブル増強超音波を行うことをさらに含む、実施形態４８～８８のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９０． 対象に経鼻投与される、実施形態４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９１． 対象に静脈内投与される、実施形態４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９２． 動脈内注射により対象に投与される、実施形態４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９３． 対象のＣＳＦに投与される、実施形態４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９４． 髄腔内、脳室内または脳実質内に投与される、実施形態９３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
９５． ハンチントン病の治療のための医薬の製造におけるＢＲＤ９阻害剤の使用。
９６． ＢＲＤ９阻害剤が、実施形態４９～９４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤である、実施形態９５に記載の使用。
９． 参考文献の引用
本願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることになる。本明細書に組み込まれた１つまたは複数の文献の教示と本開示との間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。
本願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることになる。本明細書に組み込まれた１つまたは複数の文献の教示と本開示との間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。
１０２ 神経細胞
１０４ 神経堤
１０６ 頭蓋プラコード
１０８ 表皮
１０４ 神経堤
１０６ 頭蓋プラコード
１０８ 表皮
Claims (96)
- 治療有効量のブロモドメイン９（ＢＲＤ９）阻害剤を対象に投与することを含む、ハンチントン病（ＨＤ）を有する対象を治療する方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がデグロンにコンジュゲートされていない、請求項１に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＲＤ９のプロテアソーム介在性分解を誘導しない、請求項１に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が選択的ＢＲＤ９阻害剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ２と比較して少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項４に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ３と比較して少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項４または請求項５に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、ＢＲＤ４と比較して少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がピリジノン化合物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＢＩ－９５６４：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＢＩ－７２７３：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がメチルキノリノン化合物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＬＰ－９９：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がチエノピリドン化合物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＩ－ＢＲＤ９：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がｄ－ＢＲＤ９：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＴＰ－４７２：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がＧＮＥ－３７５：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が式（Ｉ）：
ＡはフェニルまたはＮおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５員または６員ヘテロアリールであり、ここで前記フェニルまたはヘテロアリールは非置換であるか、または１～３個のＲ３基で置換されており、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、またはＮＨ２であり、
各Ｒ３は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、または、
Ｘ１は、ＮＲ５またはＯであり、
Ｙ１は、Ｓ（Ｏ）ａまたはＮＲ５であり、
各Ｒ４は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、ハロゲン、または－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
ａは、０、１、または２であり、
ｎおよびｒは、それぞれ独立して、０、１、２、または３である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＢＲＤ９阻害剤が式（ＩＩ）：
Ｒ１は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２は、ハロゲン、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはＯＨであり、
Ｘ１はＮまたはＣＲ３であり、Ｘ２はＮまたはＣＲ４であり、ただし、Ｘ１およびＸ２が両方ともＮであることはなく、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ただし、Ｒ３およびＲ４が、両方とも（Ｃ１～Ｃ３）アルキルではあることはなく、
あるいは、Ｒ２およびＲ３は一緒になってベンゼン環または５～６員ヘテロアレーン環を形成し、これらの環の各々は独立して非置換であるか、または独立してハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルである１つまたは複数の基で置換されていてもよく、ここで前記（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員へテロアリールもしくはフェニルで置換されていてもよく、
Ｒ５およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ６およびＲ８は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、４～７員ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、またはＮＨＲ１３であり、
Ｒ１３は、それぞれの場合について独立して、ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ここで前記（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員ヘテロアリールで置換されており、
あるいは、Ｒ５およびＲ６は一緒になってベンゼン環を形成し、
あるいは、Ｒ７およびＲ６、またはＲ７およびＲ８は一緒になって、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～７員ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＮＨ２、Ｙ－Ｒ１２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、
Ｙは、ＣＲ１０Ｒ１１、ＳＯ２またはＣＯであり、
Ｒ１０およびＲ１１は同一であるかもしくは異なり、独立してＨもしくは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は一緒になってＣ３－４シクロアルキルを形成し、
Ｒ１２は、ＮＨ２、ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（Ｒ１５，Ｒ１６）、ＯＲ１７、アリール、または５～６員ヘテロアリールであり、ここで前記アリールまたはヘテロアリールは、独立して非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲンもしくは４～７員へテロシクロアルキルで置換されており、ヘテロシクロアルキルの各々は、独立して、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルおよびＣＨ２Ｒ１４から選択される１つもしくは複数の基で置換されており、
Ｒ１４は、非置換であるか、またはＮＨ２、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、もしくはＯ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～１０員の単環または二環式アリールもしくはヘテロアリールであり、
Ｒ１５は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ１６は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｃ２～３アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｃ２～３アルキル－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
Ｒ１７は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは、非置換であるかまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
ここで、Ｒ７がＹＲ１２である場合、Ｒ６およびＲ８は、同一であっても、または異なっていてもよく、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ５～Ｒ９の少なくとも１つは、水素ではない、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＢＲＤ９阻害剤が非選択的ＢＲＤ９阻害剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がブロモスポリン：
- 前記ＢＲＤ９阻害剤がアミノ酸抱合体の形態で投与される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アミノ酸抱合体がリジン抱合体である、請求項２２に記載の方法。
- 前記アミノ酸抱合体がフェニルアラニン抱合体である、請求項２２に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が担体とともに前記対象に投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ナノ粒子、エクソソーム、またはカーボンナノチューブを含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記担体がナノ粒子を含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が、脂質ベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が、ヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記ナノ粒子がアポリポタンパク質ベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記ナノ粒子がポリマーベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記ナノ粒子がデンドリマーベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が無機ベースのナノ粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記担体がエクソソームを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記担体がカーボンナノチューブを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記対象に脳透過性増強剤を補助的に投与することをさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤および前記脳透過性増強剤が、単一の医薬組成物中で共投与される、請求項３６に記載の方法。
- 前記脳透過性増強剤が、セレポート、レガデノソン、またはボルネオールを含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
- 前記脳透過性増強剤がセレポートを含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記脳透過性増強剤がレガデノソンを含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記脳透過性増強剤がボルネオールを含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記対象にマイクロバブル増強超音波を行うことをさらに含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が前記対象に経鼻投与される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が前記対象に静脈内投与される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が動脈内注射により前記対象に投与される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が前記対象のＣＳＦに投与される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、髄腔内、脳室内または脳実質内に投与される、請求項４６に記載の方法。
- それを必要とする対象におけるハンチントン病（ＨＤ）の治療に用いられるＢＲＤ９阻害剤。
- デグロンにコンジュゲートされていない、請求項４８に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＲＤ９のプロテアソーム介在性分解を誘導しない、請求項４８に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 選択的ＢＲＤ９阻害剤である、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ＢＲＤ２と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項５１に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ＢＲＤ３と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項５１または請求項５２に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ＢＲＤ４と比較して、少なくとも２倍または少なくとも５倍大きいＢＲＤ９阻害を有する、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ピリジノン化合物である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ＢＩ－９５６４：
- ＢＩ－７２７３：
- メチルキノリノン化合物である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ＬＰ－９９：
- チエノピリドン化合物である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- Ｉ－ＢＲＤ９：
- ｄ－ＢＲＤ９：
- ＴＰ－４７２：
- ＧＮＥ－３７５：
- 式（Ｉ）：
ＡはフェニルまたはＮおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を含有する５員または６員ヘテロアリールであり、ここで前記フェニルまたはヘテロアリールは非置換であるか、または１～３個のＲ３基で置換されており、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、またはＮＨ２であり、
各Ｒ３は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、または、
Ｘ１は、ＮＲ５またはＯであり、
Ｙ１は、Ｓ（Ｏ）ａまたはＮＲ５であり、
各Ｒ４は、独立して、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）ハロアルキル、ハロゲン、または－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
各Ｒ５は、独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
各Ｒ６は、独立してＨまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
ａは、０、１、または２であり、
ｎおよびｒは、それぞれ独立して、０、１、２、または３である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。 - 式（ＩＩ）：
Ｒ１は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２は、ハロゲン、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたはＯＨであり、
Ｘ１はＮまたはＣＲ３であり、Ｘ２はＮまたはＣＲ４であり、ただし、Ｘ１およびＸ２は両方ともＮであることはなく、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ただし、Ｒ３およびＲ４が、両方とも（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであることはなく、
あるいは、Ｒ２およびＲ３は一緒になってベンゼン環または５～６員ヘテロアレーン環を形成し、これらの環の各々は独立して非置換であるか、または独立してハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルである１つまたは複数の基で置換されていてよく、ここで前記（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は非置換であるか、または５～６員へテロアリールもしくはフェニルで置換されていてもよく、
Ｒ５およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ６およびＲ８は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、４～７員ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、またはＮＨＲ１３であり、
Ｒ１３は、それぞれの場合について独立して、ＳＯ２－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、ここで前記（Ｃ１～Ｃ３）アルキル基は、非置換であるか、または５～６員ヘテロアリールで置換されており、
あるいは、Ｒ５およびＲ６は一緒になってベンゼン環を形成し、
あるいは、Ｒ７およびＲ６、またはＲ７およびＲ８は一緒になって、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～７員ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＮＨ２、Ｙ－Ｒ１２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、
Ｙは、ＣＲ１０Ｒ１１、ＳＯ２またはＣＯであり、
Ｒ１０およびＲ１１は同一であるかもしくは異なり、独立してＨもしくは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は一緒になってＣ３－４シクロアルキルを形成し、
Ｒ１２は、ＮＨ２、ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（Ｒ１５，Ｒ１６）、ＯＲ１７、アリール、または５～６員ヘテロアリールであり、ここで前記アリールまたはヘテロアリールは、独立して非置換であるか、または１つもしくは複数のハロゲンもしくは４～７員へテロシクロアルキルで置換されており、ヘテロシクロアルキルの各々は、独立して、非置換であるか、またはハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルおよびＣＨ２Ｒ１４から選択される１つもしくは複数の基で置換されており、
Ｒ１４は、非置換であるか、またはＮＨ２、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、もしくはＯ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換された５～１０員の単環または二環式アリールもしくはヘテロアリールであり、
Ｒ１５は、Ｈまたは（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
Ｒ１６は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｃ２～３アルキル－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ３）アルキル）２、Ｃ２～３アルキル－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
Ｒ１７は、（Ｃ１～Ｃ３）アルキルまたは４～７員ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルは、非置換であるか、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキルで置換されており、
ここで、Ｒ７がＹＲ１２である場合、Ｒ６およびＲ８は、同一であっても、または異なっていてもよく、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）アルキル、Ｏ（Ｃ１～Ｃ３）ハロアルキル、または（Ｃ１～Ｃ３）アルキル－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ３）アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ５～Ｒ９の少なくとも１つは、水素ではない、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。 - 非選択的ＢＲＤ９阻害剤である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ブロモスポリン：
- アミノ酸抱合体の形態で投与される、請求項４８～６８のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記アミノ酸抱合体がリジン抱合体である、請求項６９に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記アミノ酸抱合体がフェニルアラニン抱合体である、請求項６９に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 担体とともに前記対象に投与される、請求項４８～７１のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記担体が、ナノ粒子、エクソソーム、またはカーボンナノチューブを含む、請求項７２に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記担体がナノ粒子を含む、請求項７３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子が、脂質ベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子が、ヒト血清アルブミンベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子がアポリポタンパク質ベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子がポリマーベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子がデンドリマーベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ナノ粒子が無機ベースのナノ粒子を含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記担体がエクソソームを含む、請求項７４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記担体がカーボンナノチューブを含む、請求項７３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記対象の治療が、前記対象に脳透過性増強剤を補助的に投与することをさらに含む、請求項４８～８２のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤および前記脳透過性増強剤が、単一の医薬組成物中で共投与される、請求項８３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記脳透過性増強剤が、セレポート、レガデノソン、またはボルネオールを含む、請求項８３または請求項８４に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記脳透過性増強剤がセレポートを含む、請求項８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記脳透過性増強剤がレガデノソンを含む、請求項８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記脳透過性増強剤がボルネオールを含む、請求項８５に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記対象の治療が、前記対象にマイクロバブル増強超音波を行うことをさらに含む、請求項４８～８８のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記対象に経鼻投与される、請求項４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記対象に静脈内投与される、請求項４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 動脈内注射により前記対象に投与される、請求項４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記対象のＣＳＦに投与される、請求項４８～８９のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、髄腔内、脳室内または脳実質内に投与される、請求項９３に記載のＢＲＤ９阻害剤。
- ハンチントン病の治療のための医薬の製造におけるＢＲＤ９阻害剤の使用。
- 前記ＢＲＤ９阻害剤が、請求項４９～９４のいずれか一項に記載のＢＲＤ９阻害剤である、請求項９５に記載の使用。
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