JP7323874B2

JP7323874B2 - 神経軸索分岐異常の改善剤

Info

Publication number: JP7323874B2
Application number: JP2019060876A
Authority: JP
Inventors: 正志青木; 直輝鈴木; 徹也秋山; 仁割田; 栄之岡野; 輝夫藤井; 与志穂池内; 治良川田
Original assignee: Jiksak Bioengineering
Current assignee: Jiksak Bioengineering
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2023-08-09
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: WO2020196725A1; JP2020158456A

Description

特許法第３０条第２項適用（１）平成３０年１０月３０日に公益財団法人難病医学研究財団のウェブサイトにて公開（２）平成３０年１２月６日にＳＳＲＮのウェブサイトにて公開

本発明は、神経軸索分岐異常の改善剤に関する。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Amyotrophic lateral sclerosis）は、成人発症の神経変性疾患であり、上位（大脳皮質運動野）及び下位（脊髄前角細胞及び脳幹部運動核）の系統的な運動ニューロン障害を呈する。

ＡＬＳの約９０％は孤発性（ＳＡＬＳ；Sporadic ALS）であり、その原因は不明である。近年、孤発性ＡＬＳ患者の下位運動ニューロンに見られるユビキチン陽性封入体の成分として、４３ｋＤａＴＡＲＤＮＡ－結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）が同定され、原因遺伝子として注目されている。一方、残りの約１０％は、家族性のＡＬＳ（ＦＡＬＳ；Familial ALS）であり、その原因遺伝子として、１９９３年に銅/亜鉛スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ１；copper/zinc superoxide dismutase 1）遺伝子が同定されて以降、ＲＮＡ代謝にかかわるＴＡＲＤＢＰ（TAR-DNA binding protein）遺伝子、ＦＵＳ（fused in sarcoma）遺伝子、C9orf72（chromosome 9 open reading frame 72）遺伝子等、２０を超える原因遺伝子の報告がある。

現在、ＡＬＳ治療薬として販売されているのは、グルタミン酸受容体のアンタゴニストであってグルタミン酸抑制作用のあるリルゾール（商品名：リルテック［登録商標］)のみである（特許文献１）。

一方、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有するＡＬＳ患者由来の線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞)を樹立し、アストロサイトへ分化誘導した後、アストロサイトにおけるＳＯＤ１の発現量低下を指標として、ＡＬＳ治療薬の候補物質をスクリーニングできることが報告されている（特許文献２）。また、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有するｉＰＳ細胞を、運動ニューロンへ分化誘導し、運動ニューロンの生存率を指標として、ＡＬＳ治療薬の候補物質をスクリーニングできることが報告されている（特許文献３）。また、ＴＤＰ－４３遺伝子に変異を有するｉＰＳ細胞を、運動ニューロンへ分化誘導し、運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の発現抑制効果や酸化ストレスの抑制効果を指標として、ＡＬＳ治療薬の候補物質をスクリーニングできることが報告されている（特許文献４）。

特許２７１３３８４号公報特開２０１１－１２１９４９号公報国際公開第２０１６／１１４３２２号パンフレット特許第６１５３２３２号公報

本発明の課題は、神経軸索分岐異常を改善する作用を有する物質を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けており、長年にわたるＦＡＬＳ症例の蓄積及び遺伝子型の解析を通じ、ＦＵＳ遺伝子変異がＳＯＤ１遺伝子変異に次いで２番目に多いこと、また、日本を含めたアジア圏におけるＦＡＬＳ中に占めるＦＵＳ遺伝子変異の割合は約１０％と、欧米での約５％という頻度よりも高いことを見いだした。しかし、ＦＵＳ変異症例における病態や遺伝子型－表現型の相関については解明が進んでいなかった。そこで、本発明者らは、ＦＵＳ遺伝子の変異の有無のみが異なる２セットのｉＰＳＣｓを樹立して運動ニューロン（以下、単に「ＭＮ」ということがある）を分化誘導し、各ＭＮの形態及び遺伝子発現プロファイルを比較した。

その結果、本発明者らは、（ｉ）ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮから伸長した軸索では分岐形成が増加すること、また、（ii）ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮでは、転写因子であるアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）と、最初期遺伝子（ＩＥＧ；immediate early gene）に関連する遺伝子とが増加することを明らかにした。さらに、本発明者らは、ＦｏｓＢ遺伝子に注目して種々の解析を行い、（iii）ｓｉＲＮＡによりＦｏｓＢ遺伝子をノックダウンすると、ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮの軸索の分枝形成数が正常レベルまで低下すること、（iv)ＡＰ－１の阻害剤であるＴ－５２２４をＦＵＳ遺伝子変異ＭＮに添加すると分枝形成数が有意に低下することを明らかにした。以上のことから、本発明者らは、ＡＰ－１を阻害する作用を有する物質が、神経軸索の分岐異常を改善する作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＡＰ－１阻害剤を含むことを特徴とする神経軸索分岐異常の改善剤。
〔２〕ＡＰ－１阻害剤が、
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、あるいは、
哺乳動物生体内のＦｏｓＢをコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、又は前記ＲＮＡの発現ベクター
であることを特徴とする上記〔１〕に記載の改善剤。

〔３〕神経軸索分岐異常が、ＦＵＳ遺伝子変異に起因する神経軸索分岐異常であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の改善剤。

また本発明の実施の他の形態として、ＡＰ－１阻害剤を神経軸索分岐異常の改善を必要とする哺乳動物に投与することを含む、神経軸索分岐異常を改善する方法や、神経軸索分岐異常の改善における使用のためのＡＰ－１阻害剤や、神経軸索分岐異常の改善剤の製造における、ＡＰ－１阻害剤の使用や、ＡＰ－１阻害剤を神経軸索分岐異常の予防又は治療を必要する対象者に投与することを含む、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患を予防又は治療する方法や、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患の予防又は治療における使用のためのＡＰ－１阻害剤や、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患の予防又は治療剤を製造するための、ＡＰ－１阻害剤の使用を挙げることができる。

ＡＰ－１阻害剤は、異常な神経軸索分岐形成を阻害・改善する作用を有するため、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患、例えば、ＦＵＳ遺伝子の変異に起因するＦＡＬＳの予防又は治療に有用である。

本実施例の実験の流れの模式図である。４種類のｉＰＳＣｓ（コントロールｉＰＳＣｓ、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ｉＰＳＣｓ、ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ｉＰＳＣｓ、及びＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓ）を分化誘導することにより得られた運動ニューロンの軸索（それぞれ、図中の「コントロール」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ」）の顕微鏡画像である。図中の矢頭は、分岐が認められた軸索部位を示す。図２の顕微鏡画像を基に、神経軸索末端から１５０μｍ軸索上を離れた軸索部位における分岐数（図中の「軸索分岐数」）を測定した結果（図中の「コントロール」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ」；それぞれｎ＝５０［平均値＋標準偏差］）を示す図である。図中の「＊＊＊＊」は、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。マイクロ流体デバイス中で運動ニューロンから伸長した軸索束の４種類の顕微鏡画像（位相差顕微鏡画像［図４Ａ］、ＨＢ９－Ｖｅｎｕｓの蛍光画像［図４Ｂ］、βIIIチューブリンの蛍光画像［図４Ｃ］、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（細胞核）の蛍光画像［図４Ｄ］）である。図４Ｅの左右の画像は、それぞれ図４Ｂ及び４Ｃの四角で囲った領域の拡大図である。ＦＵＳ変異を有する２種類の２ｎｄＭＰＣｓ（ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}２ｎｄＭＰＣｓ及びＦＵＳ－ＡＬＳ２ｎｄＭＰＣｓ）について、２種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ－Ｓｃｒａｍｂｌｅ及びｓｉ－ＦｏｓＢ）存在下又は非存在下で培養後、神経軸索末端から１５０μｍ軸索上を離れた軸索部位における分岐数（図中の「軸索分岐数」）を測定した結果（図中の「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}－」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}＋ｓｉ－Ｓｃｒａｍｂｌｅ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}＋ｓｉ－ＦｏｓＢ」、「ＦＵＳ－ＡＬＳ－」、「ＦＵＳ－ＡＬＳ＋ｓｉ－Ｓｃｒａｍｂｌｅ」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ＋ｓｉ－ＦｏｓＢ」；それぞれｎ＝５０［平均値＋標準偏差］）を示す図である。比較対照として、ＦＵＳ変異を有さない２種類の２ｎｄＭＰＣｓ（コントロール２ｎｄＭＰＣｓ及びＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}２ｎｄＭＰＣｓ）を、上記ｓｉＲＮＡ非存在下で培養後、神経軸索末端から１５０μｍ軸索上を離れた軸索部位における分岐数を測定した結果（「コントロール」及び「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}」；それぞれｎ＝５０）を示す。図中の「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。また、図中の「Ｎ．Ｓ．」は、統計学的に有意差がない（ｐ≧０．０５）ことを示す。ＦＵＳ変異を有する２種類の２ｎｄＭＰＣｓ（ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}２ｎｄＭＰＣｓ及びＦＵＳ－ＡＬＳ２ｎｄＭＰＣｓ）について、Ｔ－５２２４の存在下（図中の「＋Ｔ５２２４」）又は非存在下（図中の「＋ＤＭＳＯ」）培養後、神経軸索末端から１５０μｍ軸索上を離れた軸索部位における分岐数（図中の「軸索分岐数」）を測定した結果（それぞれｎ＝５０［平均値＋標準偏差］）を示す。

本発明の神経軸索分岐異常の改善剤は、「神経軸索（すなわち、運動ニューロンにおける軸索）の分岐異常を改善するため」という用途に特定されたＡＰ－１阻害剤を含有する剤（以下、「本件改善剤」ということがある）である。本件改善剤は、有効成分であるＡＰ－１阻害剤を、単独で飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。かかる飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。

本明細書において、「神経軸索の分岐異常」とは、運動ニューロン（すなわち、骨格筋を支配する神経細胞）の軸索において、異常な分岐（軸索枝）が生じることを意味し、具体的には、神経軸索末端（軸索終末）の成長円錐を除く部位、例えば、神経軸索末端から少なくとも５０μｍ軸索上を離れた軸索部位（換言すると、神経軸索末端から運動ニューロン方向へ少なくとも５０μｍ神経軸索上を近づいた部位）において、１）平均して少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ等）の分岐（軸索枝）が生じること；及び／又は、２）正常な運動ニューロンと比較して、平均して少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．６倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．６倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍等）多い分岐（軸索枝）が生じること；を意味する。上記「少なくとも５０μｍ」とは、例えば、少なくとも６０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１３０μｍ、少なくとも１６０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２３０μｍ、少なくとも２６０μｍ、少なくとも３００μｍ、５０～３００μｍの範囲内、５０～２６０μｍの範囲内、５０～２３０μｍの範囲内、５０～２００μｍの範囲内等を意味する。上記運動ニューロンは、例えば、後述する本実施例に記載の方法に従って、投与対象の哺乳動物から線維芽細胞を採取し、ｉＰＳ細胞を樹立した後、運動ニューロンへ分化誘導することにより得ることができる。また、運動ニューロンの軸索において、異常な分岐が改善しているか否かは、例えば、後述する本実施例に記載のマイクロ流体デバイスを用いて確認することができる。なお、分岐は、軸索枝の長さがある程度認められた場合（例えば、少なくとも１．５μｍ超、少なくとも２μｍ超、少なくとも２．５μｍ超）、生じていると判断してもよい。

本明細書において、「ＡＰ－１阻害剤」とは、哺乳動物生体内のＡＰ（アクチベータータンパク質）－１の発現；又はその転写因子としての機能；を、特異的に阻害（抑制）する物質（例えば、ポリペプチド、抗体等のタンパク質；ポリヌクレオチド；糖類；脂質；有機化合物；無機化合物）を意味する。ＡＰ－１阻害剤により阻害されるＡＰ－１の割合としては、少なくとも５０％が好ましく、少なくとも５５％がより好ましく、少なくとも６０％がさらに好ましく、少なくとも６５％がさらにより好ましく、少なくとも７０％がまたさらに好ましく、少なくとも７５％が特に好ましく、少なくとも８０％がまた特に好ましく、少なくとも８５％が特により好ましく、少なくとも９０％が特にさらに好ましく、少なくとも９５％が特にさらにより好ましく、少なくとも９８％が最も好ましい。

本明細書において、「ＡＰ－１」とは、Ｊｕｎファミリータンパク質(具体的には、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ)同士のホモ二量体；かかるＪｕｎファミリータンパク質と、Ｆｏｓファミリータンパク質（具体的には、ｃ－Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ－１、Ｆｒａ－２)とのヘテロ二量体；及び前記Ｊｕｎファミリータンパク質と、ＡＴＦファミリータンパク質（具体的には、ＡＴＦ－２、ＡＴＦ－３／ＬＲＦ１、Ｂ－ＡＴＦ)とのヘテロ二量体；から選択される１又は２以上の二量体を意味し、より具体的には、ゲノムＤＮＡ上のＡＰ－１結合部位（具体的には、ＴＧＡＣ［Ｔ／Ｇ］ＴＣＡ）に結合し、転写を促進する転写因子である。

上記ＡＰ－１阻害剤としては、例えば、哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質に結合し、これらタンパク質と、ゲノムＤＮＡ上のＡＰ－１結合部位との結合を阻害できる物質、例えば、以下の式（Ｉ）で表される化合物（3-(5-(4-(cyclopentyloxy)-2-hydroxybenzoyl)-2-((3-hydroxybenzo[d]isoxazol-6-yl)methoxy)phenyl)propanoic acid）又はその塩；以下の式（II）で表される化合物（(E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid）又はその塩；以下の式（III）で表される化合物（1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione）；ＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質に特異的に結合する抗体、ＡＰ－１結合配列（ＴＧＡＣ［Ｔ／Ｇ］ＴＣＡ）からなる２本鎖ヌクレオチド）；哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質をコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するＲＮＡ（以下、「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡ」ということがある）又はＡＰ－１を標的とするＲＮＡの発現ベクター；を挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩；や、哺乳動物生体内のＦｏｓＢをコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ（以下、「ＦｏｓＢを標的とするＲＮＡ」ということがある）、又はＦｏｓＢを標的とするＲＮＡの発現ベクター；が好ましい。なお、ここで「ＡＰ－１を構成するタンパク質」とは、具体的には、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、ｃ－Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ－１、Ｆｒａ－２、ＡＴＦ－２、ＡＴＦ－３／ＬＲＦ１、又はＢ－ＡＴＦを意味する。

式（Ｉ）で表される化合物の塩や式（II）で表される化合物の塩としては、生理学的及び／又は薬理学的に許容される塩であればよく、ここで、「生理学的及び／又は薬理学的に許容される塩」とは、妥当な生理学的及び／又は医学的判断の範囲内で、哺乳動物の組織と接触して用いるのに、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答、及び／又は他の合併症を伴うことなく、適度な受益性／危険性比率に相応して適しているそれら化合物、物質、組成物、及び／又は、剤形を意味する。

式（Ｉ）で表される化合物の塩や式（II）で表される化合物の塩としては、塩基塩が存在する。かかる塩基塩には、アンモニウム塩；ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；アルミニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン等の有機塩基との塩；アルギニン、リシン、オルニチン等のアミノ酸との塩；などが含まれる。

式（Ｉ）で表される化合物は、公知の反応を適宜組み合わせることによって合成することができるが、市販品を用いることもでき、かかる市販品としては、例えば、後述する本実施例で使用したＴ－５２２４（富士フィルム富士化学社製）を挙げることができる。式（II）で表される化合物は、公知の反応を適宜組み合わせることによって合成することができるが、市販品を用いることもでき、かかる市販品としては、例えば、ＳＲ１１３０２（Cayman Chemical社製）を挙げることができる。式（III）で表される化合物は、公知の反応を適宜組み合わせることによって合成することができるが、市販品を用いることもでき、かかる市販品としては、例えば、Tanshinone IIA（東京化成工業社製）を挙げることができる。

本明細書において、「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡ」とは、哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質をコードするｍＲＮＡの一部又は全部とアニーリングすることができ、かつ、哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を抑制、及び／又は哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる１本鎖又は２本鎖構造のＲＮＡを意味する。ＡＰ－１を標的とするＲＮＡは、通常、哺乳動物生体内のＡＰ－１を構成する少なくとも１種のタンパク質をコードするｍＲＮＡの一部又は全部と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％）同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。

「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡ」の形態としては、例えば、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｓＲＮＡ（double-strand RNA）、ｍｉＲＮＡ（microRNA）を挙げることができる。

本明細書において、「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡの発現ベクター」とは、投与対象の哺乳動物において、ＡＰ－１を標的とするＲＮＡが発現し得るものを意味する。ＡＰ－１を標的とするＲＮＡの発現ベクターは、通常、プロモーターと、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結された、ＡＰ－１を標的とするＲＮＡをコードする遺伝子とを含むポリヌクレオチドであり、環状のものであっても線状のものであってもよい。

本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。プロモーターには、通常転写開始点（ＴＳＳ）が含まれる。

上記「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡの発現ベクター」としては、「ＡＰ－１を標的とするＲＮＡ」の発現効率を高めるために、エンハンサー領域やターミネーター領域をさらに含むものや、発現ベクターのクローニングのために、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）をさらに含むものであってもよい。

本明細書において、「哺乳動物」としては、例えば、ヒトや、非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス）を挙げることができる。

本件改善剤に含まれるＡＰ－１阻害剤は、神経軸索分岐異常を改善する作用を有する。このため、本件改善剤は、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患の予防又は治療剤に有利に適用することができる。

本明細書において、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患としては、例えば、認知症（例えば、脳血管性型認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、ニューマン・ピック病等）、結節性硬化症、ペリー（Perry）症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症２型を挙げることができる。

本発明において、神経軸索分岐異常としては、孤発性及び家族性のいずれの神経軸索分岐異常も改善対象になり得る。かかる家族性の神経軸索分岐異常としては、例えば、ＦＵＳ（Fused in sarcoma）遺伝子（ＡＬＳや前頭側頭葉変性症の原因遺伝子）、ＳＯＤ１遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、ＴＤＰ－４３遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、C9orf72遺伝子（ＡＬＳや前頭側頭型認知症の原因遺伝子）、ＳＥＴＸ遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、ＶＡＰＢ遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、ＡＰＰ遺伝子（アルツハイマー病の原因遺伝子）、ＰＳＥＮ１／２遺伝子（アルツハイマー病の原因遺伝子）、α-シヌクレイン（synuclein）（アルツハイマー病やパーキンソン病の原因遺伝子）、パーキン遺伝子（パーキンソン病の原因遺伝子）、ＬＲＲＫ２遺伝子（パーキンソン病の原因遺伝子）、ＦＩＧ４遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、ＯＰＴＮ遺伝子（ＡＬＳの原因遺伝子）、ＤＣＴＮ１遺伝子（ペリー症候群の原因遺伝子）、ＳＭＰＤ１（ニューマン・ピック病の原因遺伝子）、ＡＴＸＮ２遺伝子（ＡＬＳや脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子）、ＳＮＣＡ遺伝子（レビー小体型認知症の原因遺伝子）、ＴＳＣ１遺伝子（結節性硬化症の原因遺伝子）、ＴＳＣ２遺伝子（結節性硬化症の原因遺伝子）等の原因遺伝子の変異に起因する神経軸索分岐異常を挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、ＦＵＳ遺伝子変異に起因する神経軸索分岐異常を好適に例示することができる。

上記原因遺伝子の変異としては、例えば、ＦＵＳ遺伝子の変異の場合、ヒトＦＵＳタンパク質の５１７番目のＨｉｓがＡｓｐに置換される変異（ＦＵＳ－Ｈ５１７Ｄ）や、ヒトＦＵＳタンパク質の５１０番目のＬｙｓがＧｌｕに置換される変異（ＦＵＳ－Ｋ５１０Ｅ）等を挙げることができる。また、ＳＯＤ１遺伝子の変異の場合、ヒトＳＯＤ１タンパク質の１４４番目のＬｅｕがＰｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ（Ｘａａは任意のアミノ酸を示す）に置換される変異（ＳＯＤ１－Ｌ１４４ＦＶＸ）、ヒトＳＯＤ１タンパク質の９３番目のＧｌｙがＳｅｒに置換される変異（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ｓ）、ヒトＳＯＤ１タンパク質の１０６番目のＬｅｕがＶａｌに置換される変異（ＳＯＤ１－Ｌ１０６Ｖ）等を挙げることができる。また、ＴＤＰ－４３遺伝子の変異の場合、ヒトＴＤＰ－４３タンパク質の３３７番目のＭｅｔがＶａｌに置換される変異（ＴＤＰ－４３－Ｍ３３７Ｖ）等を挙げることができる。

本件改善剤の添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。

本件改善剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。

本件改善剤におけるＡＰ－１阻害剤の投与量は、年齢、体重、性別、症状、ＡＰ－１阻害剤に対する感受性等に応じて適宜決定され、例えば、０．１μｇ～２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の投与量の範囲である。

本件改善剤としては、ＡＰ－１阻害剤以外の、神経軸索分岐異常を改善する成分を含むものであってもよいが、ＡＰ－１阻害剤単独でも優れた神経軸索分岐異常の改善効果を発揮するため、ＡＰ－１阻害剤以外の、神経軸索分岐異常を改善する成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、植物由来の抽出物）を含まないものが好ましい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．ＦＵＳ遺伝子変異の有無のみ異なるｉＰＳＣｓの樹立
１－１２セットのｉＰＳＣｓ
ＦＵＳ遺伝子変異がＭＮに及ぼす影響を解析するために、同じ遺伝的背景を有し、ＦＵＳ遺伝子の変異の有無のみが異なる２セットのｉＰＳＣｓを樹立した（図１参照）。図１に示すように、一つのセットは、（ａ）健常者由来のコントロールｉＰＳＣｓと、（ｂ）上記（ａ）にＦＵＳ－Ｈ５１７Ｄ変異を導入したｉＰＳＣｓとからなり、もう一つのセットは、（ｃ）ＦＵＳ－Ｈ５１７Ｄ変異を有するＦＡＬＳ患者由来ｉＰＳＣｓと、（ｄ）上記（ｃ）のＦＵＳ－Ｈ５１７Ｄ変異を正常化したｉＰＳＣｓとからなる（以下、上記（ａ）～（ｄ）を、それぞれ、「コントロールｉＰＳＣｓ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ｉＰＳＣｓ」、「ＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓ」、及び「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ｉＰＳＣｓ」といい、これらを総称して、単に「ｉＰＳＣｓ」ということがある）。これらのｉＰＳＣｓをＭＮへ分化誘導し、各セットにおける形態や遺伝子発現を比較することによって、ＦＵＳ遺伝子変異により特異的に引き起こされるＭＮの変化を解析した。

１－２ｉＰＳＣｓの樹立方法
コントロールｉＰＳＣｓとして、ＣｉＲＡ（Center for iPS Cell Research and Application、Kyoto University）より購入した４０９Ｂ２細胞を用いた。また、ＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓとしてＦＵＳ遺伝子にｐ．Ｈ５１７Ｄ変異を有するＦＡＬＳ患者由来ｉＰＳＣｓを用いた（文献「Ichiyanagi N., et al. Stem cell reports 2016; 6: 496-510.」参照）。

さらに、ＴＡＬＥＮゲノム編集により、コントロールｉＰＳＣｓからＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ｉＰＳＣｓを、ＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓからＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ｉＰＳＣｓをそれぞれ樹立した。具体的には、ＴＡＬＥＮ発現ベクターは、プラチナゲートＴＡＬＥＮキット（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、Ｋｉｔ＃１０００００００４３）を用い、改変ゴールデンゲート媒介法によって構築した。また、コントロールｉＰＳＣｓのＦＵＳ遺伝子のエクソン１５にｐ．Ｈ５１７Ｄ変異を導入する標的ドナープラスミド、又は、ＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓのｐ．Ｈ５１７Ｄ変異を正常化する標的ドナープラスミドを、ＭｕｌｔｉｓｉｔｅＧａｔｅｗａｙ－ｂａｓｅｄｋｉｔを用いて構築した（ベクターは、ｐＤＯＮＲＰ３－Ｐ１ｒ、ｐＤＯＮＲ－Ｐ２ｒ－Ｐ４、ｐＵＣ－ＤＥＳＴ－Ｒ３Ｒ４、ＰＢ－ＴＥＴ－Ｐ．Ｈ、及びｐＤＯＮＲ２０１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた）。

コントロールｉＰＳＣｓ及びＦＵＳ－ＡＬＳｉＰＳＣｓをフィーダーフリー培養し、左右のＴＡＬＥＮ発現プラスミド、標的ドナープラスミドをＮＥＰＡ２１（Ｎｅｐａｇｅｎｅ社製、設定：２７５Ｖ、０．５ｍｓ）によるエレクトロポレーション法で導入した。細胞をフィーダーフリー培養で増殖させる過程で、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｐｕｒ）を培地に２４時間添加する選択を２回行うことにより、Ｐｕｒ耐性配列のＰＧＫ－ＰｕｒＴＫカセットを含む相同組換え体を有する細胞を得た。培養後１４～２０日の間に、Ｐｕｒ耐性ｉＰＳＣｓコロニーをＹ２７６３２とＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔを用いて単一細胞まで解離させ純化した。細胞継代時に一部をジェノタイピングに使用し、ＫＩが確認された株を選別した。選別した株からＰＧＫ－ＰｕｒＴＫカセットを除去するため、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクターであるＡｄＥＦＮＣｒｅ－４ＦＶＦ７２）を感染させた（この時点をＤ＝０とする）。Ｄ＝２に、最終濃度２．５μｇ／ｍＬのガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、ＰＧＫ－ＰｕｒＴＫカセットを含まない細胞を選択した。選択後（Ｄ＝１４～２０）、ガンシクロビル耐性ｉＰＳＣコロニーを上記と同様の方法で単一細胞に解離させた後、目的配列の有無をサンガー法で確認し、目的のゲノム編集株を回収した。回収した株の中から、未分化マーカーの発現、Ｇ－ｂａｎｄ染色法による正常な核型、及び３胚葉分化能の存在が確認できた細胞を、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}及びＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}として回収した。なお、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}は、文献「Ichiyanagi N., et al. Stem cell reports 2016; 6: 496-510.」において、既に報告されている。

２．ｉＰＳＣｓ由来の運動ニューロン前駆細胞（ＭＰＣｓ）の取得
２－１１次運動ニューロン前駆細胞（１ｓｔＭＰＣｓ）の取得
実施例１で樹立されたｉＰＳＣｓを、文献「Ichiyanagi N., et al. Stem cell reports 2016; 6: 496-510.」に記載の方法を若干改変した方法に従って、ＭＰＣｓへ分化誘導した。具体的には、まず、実施例１で樹立されたｉＰＳＣｓを継代してオンフィーダー培養を開始し（この時点をＤ＝０とする）、その翌日（Ｄ＝１）に、培地にＳＢ４３１５４２（ＳＢ、Ｗａｋｏ社製）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、Ｗａｋｏ社製）、及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＤＭ、Ｗａｋｏ社製）を添加してＤ＝５まで培養した。Ｄ＝５に継代を行い、その際には、コロニーを剥離し、残存したｍＳＴＯを除くため、ゼラチンコートディッシュで２時間インキュベートした。その後、浮遊しているコロニーのみを回収し、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔを添加してピペッティングし、単一細胞になるまでサスペンドした。

得られた単一細胞を７０μｍセルストレイナーに通して回収した後に、分化誘導培地（Ｙ２７６３２、ヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＳＢ、ＣＨＩＲ、ｂＦＧＦ、Ｂ－２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含む、ＭＨＭ培地）に混合して播種した（播種後の細胞を「１ｓｔＭＰＣｓ」とした）。Ｄ＝６に、レチノイン酸（ＲＡ、Ｗａｋｏ社製）、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（ＰＭ、Ｗａｋｏ社製）を培地に加え、１ｓｔＭＰＣｓをＤ＝１２まで培養し、４種の１ｓｔＭＰＣｓ（「コントロール１ｓｔＭＰＣｓ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}１ｓｔＭＰＣｓ」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}１ｓｔＭＰＣｓ」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ１ｓｔＭＰＣｓ」；これらを総称して、単に「１ｓｔＭＰＣｓ」ということがある）を得た。

２－２２次運動ニューロン前駆細胞（２ｎｄＭＰＣｓ）の取得
Ｄ＝１２に上記１ｓｔＭＰＣｓを継代して、継代後の細胞を「２ｎｄＭＰＣｓ」とした。Ｄ＝１３に、ＤＡＰＴ（Ｗａｋｏ社製）を培地に加えて、さらにＤ＝１９まで２ｎｄＭＰＣｓを培養し、４種の２ｎｄＭＰＣｓ（「コントロール２ｎｄＭＰＣｓ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}２ｎｄＭＰＣｓ」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}２ｎｄＭＰＣｓ」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ２ｎｄＭＰＣｓ」；これらを総称して、単に「２ｎｄＭＰＣｓ」ということがある）。

なお、上記１ｓｔＭＰＣｓ及び２ｎｄＭＰＣｓの培養は、超低接着プレート（６ウェルディッシュ：Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、１０ｃｍディッシュ：Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）を用いて、低酸素（４％）条件下で行った。また、ＭＮの可視化のために、１ｓｔＭＰＣｓ又は２ｎｄＭＰＣｓの培養時に、ＨＢ９レポーターレンチウイルス（運動ニューロン特異的転写因子であるＨＢ９プロモーター下にＧＦＰ由来蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓを発現するレンチウイルス；以下「ＨＢ９（ｅ４３８）：：Ｖｅｎｕｓ」という）を感染させた。また、細胞核の可視化のために、２ｎｄＭＰＣｓをHoechst 33342で処理した。

３．ＭＮの取得とその形態変化
３－１ＭＮ
上記２ｎｄＭＰＣｓからＭＮへ分化誘導した。具体的には、２ｎｄＭＰＣｓを細胞塊（スフェア）の状態で回収して、単一細胞に解離させることなく（スフェアの状態のまま）、１個ずつポリ－Ｌ－オルニチン／マトリゲル（ＰＯ／Ｍ－ゲル）コートしたウェルの中心にプレートして１０日間培養し、４種のＭＮ（「コントロールＭＮ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＭＮ」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ＭＮ」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳＭＮ」；これらを総称して、単に「ＭＮ」ということがある）を得た。

３－２ＭＮの形態変化
プレート後１０日目に、ＭＮから伸びた軸索の形態を、ＨＢ９（ｅ４３８）：：Ｖｅｎｕｓを用いて可視化した。その結果、ＦＵＳ遺伝子の変異を有さないＭＮ（コントロールＭＮ及びＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ＭＮ）と比較して、ＦＵＳ遺伝子の変異を有するＭＮ（ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＭＮ及びＦＵＳ－ＡＬＳＭＮ）では、軸索分枝数が増加している像が得られた（図２参照）。

さらに、軸索末端から１５０μｍ（成長円錐を除く）の範囲における、分岐数をカウントすることにより軸索分岐形成の程度を定量化した。この実験では、長さ２μｍ超の軸索枝を、軸索分岐であると定義してカウントした。カウントした軸索枝からさらに枝分かれしたものはカウントしなかった。また、軸索末端から５０μｍの範囲を成長円錐と定義し、該成長円錐を除いた軸索終末側の１５０μｍの範囲、すなわち、軸索末端から５０μｍ～２００μｍまでをカウントの対象範囲とした。

その結果、ＦＵＳ遺伝子の変異を有さない２種のＭＮ（コントロールＭＮ及びＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ＭＮ）の間では軸索分岐形成数に有意な差は認められなかった（図３及び表１参照）。一方、コントロールＭＮとＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＭＮとの比較、ＦＵＳＲｅｓｃｕｅｄＭＮとＦＵＳ－ＡＬＳＭＮとの比較では、いずれもＦＵＳ遺伝子の変異を有するＭＮにおいて、分岐形成数の有意な増加が認められた（図３及び表１参照）。また、ＦＵＳ遺伝子の変異を有する２種のＭＮ（ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}及びＦＵＳ－ＡＬＳ）の間では、遺伝子変異量に依存して分岐形成数が有意に増加することが明らかとなった（図３及び表１参照）。

以上の結果から、ＦＵＳ遺伝子の変異によりＭＮの正常な軸索形態が損なわれ、分岐形成が異常に増加することが明らかとなった。

４．ＭＮ軸索における網羅的発現プロファイリング
４－１仮説
本発明者らは、ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおいては、変異ＦＵＳタンパク質がＲＮＡ認識モチーフドメインを介して軸索中に異常量のＲＮＡを輸送するのではないかという仮説を立てた。そして、この仮説を確かめるために、神経オルガノイド作製用の新規デバイス（以下、「マイクロ流体デバイス」ということがある）を用いて軸索特異的ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡシークエンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により網羅的ＲＮＡプロファイル解析を行った。

４－２マイクロ流体デバイスを用いたＭＮの培養
実施例２の項目「２－１」に記載の方法に従って、１ｓｔＭＰＣｓを取得し、継代後に超低接着９６ウェルＶ底プレート（Ｓｕｍｉｒｏｎ社製）に１ウェルあたり１×１０^４細胞個となるように播種した（２ｎｄＭＰＣｓ、Ｄ＝０）。その後、必要に応じＤ＝１においてＨＢ９（ｅ４３８）：：Ｖｅｎｕｓを感染させた。ＨＢ９（ｅ４３８）：：Ｖｅｎｕｓを感染させた場合はＤ＝５に培地交換を行い、それ以外の場合は培地交換を行うことなく、Ｄ＝７に、２ｎｄＭＰＣｓをスフェアの状態のままＭ－ｇｅｌコーティングを施したマイクロ流体デバイス上へプレーティングし、ＭＮの分化誘導を行った。

その結果、プレート後２０日目には、マイクロ流体デバイス中でＭＮから肉眼的に観察可能な軸索束が伸長することが明らかとなった（図４参照）。

４－３軸索及び細胞体－樹状突起（somato-dendrites；ＳＤ）からＲＮＡの回収
神経細胞から伸びる樹状突起と軸索とは、長さによって区別でき、４５０μｍを超すものは軸索と考えられている(文献「Taylor AM., et al. Nature methods 2005; 2 :599-605.」参照)。このことから、マイクロ流体中で細胞体から４５０μｍ以上離れた突起を軸索と判断して切断し、４種類の軸索（「コントロール軸索」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}軸索」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}軸索」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳ軸索」；これらを総称して、「軸索サンプル」ということがある）を得た。切断点より遠位側の軸索コンパートメントから、ＲＮｅａｓｙｍｉｃｒｏｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを回収した（ｎ＝２）。なお、デバイス上の全１６ウェルの中から、良好な軸索伸長が見られた１２ウェル分の検体を、軸索コンパートメントの１サンプルとした。また、細胞体及び樹状突起からなるＳＤから、ＲＮＡを同様に回収し、４種類のＳＤ（「コントロールＳＤ」、「ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＳＤ」、「ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ＳＤ」、及び「ＦＵＳ－ＡＬＳＳＤ」；これらを総称して、「ＳＤ」サンプルということがある）のＲＮＡを得た（ｎ＝３）。

以上のように、上記培養システムを用いることで、マイクロ流体デバイス上でオルガノイドに似た運動神経組織が形成され、肉眼的に観察可能な軸索束を採取すること可能となった。また、このシステムは、これまでの報告と比較して、多数の軸索を作製できるという利点がある。また、マイクロ流体デバイスは、東京大学生産技術研究所の藤井輝夫教授・川田治良先生から分与を受け、流路長などの構造に関してフィードバックを行いながら改良を行い開発した。

４－４ＲＮＡ－Ｓｅｑ
上記「４－３」の項目に記載の方法により得らえたＲＮＡを用いてＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。具体的には、ｑＰＣＲのために、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。また、細胞体及び軸索のＲＮＡ－Ｓｅｑ用ライブラリを作成するために、ＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄｍＲＮＡＬＴＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）及びＳＭＡＲＴＥＲｓｅｑｖ４ｕｌｔｒａｌｏｗｉｎｐｕｔＲＮＡＫｉｔｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｔａｋａｒａ社製）をそれぞれ用いてサンプルを調製した。ｑＰＣＲはＳｓｏＦａｓｔＥｖａＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘｅｓ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用い、ＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲで解析した。ＲＮＡ－ＳｅｑはＨｉ－ｓｅｑ２０００（ｉｌｌｕｍｉｎｅ社製）を用いた。データ解析のためにＣｕｆｆｌｉｎｋｓを作成し、オープンソースの統計解析システムであるＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．３．１）のパッケージングであるｃｕｍｍｅＲｂｕｎｄを用いて可視化した。

５．ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおける病態関連遺伝子の同定
５－１ＲＮＡ－Ｓｅｑに基づく病態関連遺伝子候補の選定
実施例４で得られたＲＮＡ－Ｓｅｑ解析データから、軸索サンプル及びＳＤサンプルにおけるＲＮＡプロファイルを比較し、軸索とＳＤとの間で発現の変動が認められる遺伝子を抽出した。この結果、軸索では８７６遺伝子、ＳＤでは２１２遺伝子が変動有りと判定された。抽出された遺伝子群に関してＤＡＶＩＤを用いてクラスタリング解析を行った。

その結果、ＳＤ又は初代マウス脊髄ＭＮの軸索で発現することが既に報告されている遺伝子の大部分は、軸索サンプル及びＳＤサンプルにおいても再現性よく発現していた。また、発現変動遺伝子（differentially expressed gene；ＤＥＧ）は、軸索サンプル及びＳＤサンプルにおいて、それぞれ１，０５２個及び８８４個抽出された。遺伝子オントロジー（ＧＯ）によって分類された、軸索サンプルにおいて頻度の高い遺伝子は、タンパク質結合（ＧＯ：０００５５１５）、ポリ（Ａ）ＲＮＡ結合（ＧＯ：００４４８２２）、及び酵素結合（ＧＯ：００１９８９９）遺伝子であった。この結果は、以前の報告と一致するものであった。

５－２遺伝子発現プロファイルの解析
さらに、ＦＵＳ遺伝子変異による異常な軸索形態の病理学的標的を調べるために、コントロール軸索、コントロールＳＤ、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}軸索、及びＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＳＤにおけるＲＮＡプロファイルを比較した。コントロールＳＤ及びＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＳＤのＲＮＡプロファイルから、実施例４により作製されたＭＮが十分に成熟した上部頚椎ＭＮｓに対応していること、また、細胞株間で差がないことが示された。さらに、各ＭＮ株における野生型又はＨ５１７Ｄ変異ＦＵＳ遺伝子の発現は同レベルであった。

また、ＦＵＳ遺伝子変異による網羅的遺伝子発現プロファイルの差を調べるために、コントロール軸索及びコントロールＳＤ間のＤＥＧｓ、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}軸索及びＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＳＤ間のＤＥＧｓを用いて、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓに対するＧＯｔｅｒｍ解析を行った。その結果、ＳＤでは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に関係するｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓが特に豊富であるのに対し、軸索側では神経ペプチドホルモン活性を有するＤＥＧｓが豊富であることが明らかとなった。

５－３ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮに高発現する遺伝子の解析
次に、ＦＵＳタンパク質の誤局在により、ＲＮＡ認識モチーフを介した軸索画分でのＲＮＡの異常な増加が誘導されるという仮説を立て、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}軸索において、コントロール軸索、コントロールＳＤ、又はＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}ＳＤよりも、アップレギュレートされた遺伝子に焦点を当てた解析を行った。具体的には、ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおいてアップレギュレートされた５５遺伝子（ＧｅｎｅＭＡＮＩＡオンラインツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｅｍａｎｉａ．ｏｒｇ／）によって５５遺伝子のうちの１７遺伝子が認識された）を用いてネットワーク解析を行った。その結果、ＡＰ－１（Ｊｕｎファミリータンパク質、ＡＴＦファミリータンパク質、Ｆｏｓファミリータンパク質を含む）と、ＥＧＲファミリータンパク質及びＦｏｓファミリータンパク質のＩＥＧに関連する遺伝子とが、ＦＵＳ変異ＭＮに蓄積していることが明らかとなった。これらの遺伝子の中で、ＦｏｓＢは共通して認められたことから、ＡＰ－１はＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおいて重要な役割を有する可能性があると考えられた。

６．ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおけるＦｏｓＢ遺伝子の機能の解析
６－１ＦｏｓＢ遺伝子発現の解析
本発明者らは、ＦｏｓＢに焦点を絞ってさらなる解析を行った。まず、定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって、コントロール軸索と比較して、ＦＵＳ^{Ｈ５１７Ｄ／Ｈ５１７Ｄ}軸索におけるＦｏｓＢ遺伝子の発現が有意に増加することが確認された。次に、ＦｏｓＢ遺伝子のアップレギュレーションは、ＦＵＳ^{Ｒｅｓｃｕｅｄ}ＭＮ及びＦＵＳ－ＡＬＳＭＮにおいても、遺伝子変異の用量依存的な様式で確認された。さらに、単一分子蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）によって、神経突起にＦｏｓＢｍＲＮＡが存在しており、特に、ＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおいて優勢に存在することが明らかとなった。

６－２ＦｏｓＢの機能経路
ＦｏｓＢによるＭＮの形態学的異常に関与する機能的経路を検討した。これらの実験のために、ＥＦ－１αプロモーターによって制御されるＶｅｎｕｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（ＥＦ－１α：：Ｖｅｎｕｓ）及びＦｏｓＢ／Ｖｅｎｕｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（ＥＦ－１α：：ＦｏｓＢ／Ｖｅｎｕｓ）を構築した。これらのレンチウイルスを、コントロール２ｎｄＭＰＣに同じ感染多重度（ＭＯＩ＝１）で感染させ、プレート後１０日目でのＲＮＡプロファイルをマイクロアレイで比較した。マイクロアレイにより示されたｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓを用いてＧＯｔｅｒｍ及びＫＥＧＧ経路解析を行った結果、ＥＣＭ関連遺伝子がＦｏｓＢ過剰発現の影響を受けることが明らかになった。

６－３ＦｏｓＢ遺伝子発現の抑制
ｓｉＲＮＡ、過剰発現、及び種々の化合物を含むいくつかの技術を用いて、ＦｏｓＢ経路に介入した。具体的には、プレート後３日目のＭＮｓに、ＦｏｓＢを標的とするｓｉＲＮＡ（カタログ# s223612、Thermo Fisher社製）を導入して、さらに７日間培養を行った。上記ｓｉＲＮＡの導入は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭａｘ（Thermo Fisher Scientific社製）により行った。プレート後１０日目に、ＭＮｓの形態を観察して軸索分岐の程度を定量化した。

その結果、ｓｉＲＮＡによってＦＵＳ変異ＭＮのＦｏｓＢ遺伝子をノックダウンすると、軸索分枝の異常な増加が正常レベルにまで低下すること明らかとなった（図５及び表２～３参照）。一方、ＥＦ－１α：：ＦｏｓＢ／Ｖｅｎｕｓを用いてＦｏｓＢを過剰発現させると、コントロールＭＮの軸索形態の悪化を示した。

また、プレート後３日目のＭＮｓに、ＡＰ－１の阻害剤であるＴ５２２４(Aikawa Y., et al. Nature biotechnology 2008; 26: 817-823.)を、終濃度が１００μＭとなるように添加して、さらに７日間培養を行った。プレート後１０日目にＭＮｓの形態を観察して軸索分岐の程度を定量化した。その結果、Ｔ５２２４は、ＦｏｓＢｍＲＮＡ発現レベルに影響を及ぼすことなく、異常な形態を部分的に正常化し、軸索分岐の程度を有意に減少させることが明らかとなった（図６及び表４参照）。なお、軸索分岐数は、実施例３の項目（３－２）に記載の方法に従って測定した。

以上の結果から、ＦｏｓＢ遺伝子がＦＵＳ遺伝子変異ＭＮにおける軸索分岐形成の鍵となる調節因子であること、また、ＦＵＳ遺伝子変異による軸索分岐形成の異常な増加がＦｏｓＢ遺伝子の発現低下によりできることが明らかとなった。さらに、ＦＵＳ遺伝子変異による軸索分岐形成の異常な増加は、ＡＰ１阻害剤（Ｔ５２２４）によっても抑制できることが明らかとなった。

本発明は、神経軸索分岐異常に関連する神経疾患、例えば、ＦＵＳ遺伝子の変異に起因するＦＡＬＳの医療に資するものである。

Claims

ＡＰ－１阻害剤を含む、神経軸索分岐異常の改善剤であって、
前記ＡＰ－１阻害剤が、
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、あるいは、
哺乳動物生体内のＦｏｓＢをコードするｍＲＮＡに対して特異的にＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、又は前記ＲＮＡの発現ベクターであることを特徴とする、前記改善剤。
神経軸索分岐異常が、ＦＵＳ遺伝子変異に起因する神経軸索分岐異常であることを特徴とする請求項１に記載の改善剤。