KR20230105163A - 신경퇴행성 질환 관련 원형 rna 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

신경퇴행성 질환 관련 원형 rna 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230105163A
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윤광호
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Abstract

본 발명은 circTshz2-2 원형RNA의 증가를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 비만 환자에서 과발현된 circTshz2-2 원형RNA를 측정함으로써 신경퇴행성 질환의 증가된 발병 위험을 예측할 수 있다. 또한, 비만 환자에서 증가된 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 모니터링함으로써 신경퇴행성 질환의 증가된 발병 위험을 예측할 수 있다.
본 발명은 circTshz2-2 원형RNA 억제제를 포함하는 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물과 기억력 저하 예방 또는 개선선용 조성물을 제공에 관한 것이다. 비만 환자에서 과발현된 circTshz2-2 원형RNA를 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방할 수 있고, 기억력을 개선시킬 수 있다.

Description

신경퇴행성 질환 관련 원형 RNA 바이오마커 및 이의 용도{Neurodegenerative disease-related circular RNA biomarker and use thereof}
신경퇴행성 질환과 관련된 원형 RNA 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
비만은 체지방이 과도한 상태를 의미하며, 과도한 체지방으로 인해 심장 질환을 포함한 여러 질병의 원인이 되는 건강 위험 상태로 정의할 수 있다. 세계보건기구(WHO)는 세계적으로 약 1억 600만명 이상의 과체중을 가진 성인들이 있으며 최소 400만명 이상이 비만이며 미국인의 3명 중 2명 이상이 과체중이거나 비만을 가지고 있다고 보고했다 (Low et al, 2009; Cooke and Bloom, 2006). 비만인 사람은 정상 체중인 사람에 비해 제2형 당뇨병, 고지혈증, 관절염 및 무호흡증을 비롯한 여러 질환에 걸릴 위험이 증가하고, 특히 여러 종류의 암과 심장 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
한편, 비만에 의해 유발될 수 있는 대사 증후군은 만성적인 대사 장애로 인하여 내당능 장애, 고혈압, 고지혈증, 비만, 심혈관계 죽상동맥 경화증 등의 여러 가지 질환이 한 개인에게서 한꺼번에 나타나는 것으로, 대사 증후군은 뇌에 신경 병리 생리학적 변화를 일으켜 인지 결손을 유발하고 더 나아가 기억력 저해 및 신경퇴행성 질환을 유발하지만, 이러한 신경퇴행성 질환 어떤 원인에 의해 유발되는 것인지 밝혀진 바가 없었다.
한국공개특허 제2021-0113154호
본 발명은 비만 환자에서 신경퇴행성 질환과 관련된 원형 RNA 바이오마커 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 비만 환자의 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 circTshz2-2 원형RNA는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 것인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 제제는 서열번호 78의 순방향 프라이머 및 서열번호 79의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 또는 서열번호 124의 순방향 프라이머 및 서열번호 125의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매, 노인성 치매, 경도 인지 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병, 근위축성 축삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
5. 1에 있어서, 상기 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준이 증가하면 상기 신경퇴행성 질환의 발병 위험이 높아지는 것으로 예측하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
6. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 조성물로 비만 환자의 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 모니터링하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보제공 방법.
7. circTshz2-2 원형RNA 억제제를 포함하는 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
8. 위 7에 있어서, 상기 억제제는 상기 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA인 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
9. 위 8에 있어서, 상기 백스플라이싱 접합 부위는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 것인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
10. 위 7에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 5의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 7의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 9의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 11의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 13의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA; 및 서열번호 15의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA를 포함하는, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
11. 위 7에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매, 노인성 치매, 경도 인지 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병, 근위축성 축삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
12. 위 7에 있어서, 상기 비만 환자는 기억력 저하를 동반하는 환자인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
본 발명은 비만 환자에서 과발현되는 circTshz2-2 원형RNA와 관련이 있는 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측하고, 이를 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 비만 환자에서 과발현되는 circTshz2-2 원형RNA을 관찰하고 이를 억제함으로써 신경퇴행성 질환의 예방 및 관리에 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명은 신경퇴행성 질환의 증가된 발병 위험을 예측하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명은 비만 환자의 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 뉴런의 세포주기조절에 관여하는 circTshz2-2 원형RNA를 타겟으로 함으로써 비만 환자에서 발생하는 신경퇴행성 질환의 근본적인 예방 또는 치료가 가능하다.
본 발명의 약학 조성물은 신규 약리 기전에 기초하므로 기존 신경퇴행성 질환 치료제와의 병용 투여가 가능하다.
본 발명은 비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
도 1a 내지 1f는 circTshz2-2에 의한 신경구조 조절을 나타낸다.
도 1a는 마우스 Tshz2 유전자좌(mm10)에서 circTshz2-2의 게놈 정보 및 보존을 나타낸다. 게놈 정보 및 PhastCons 데이터는 USCS 게놈 브라우저에서 얻었으며, Sanger 시퀀싱으로 식별된 circRNA의 백 스플라이싱 접합은 은색 삼각형으로 표시된다. 도 2b는 5일째 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 신경 구조 및 신경돌기 길이의 변화를 나타낸다. siCtr은 음성 대조군 siRNA이다. 도 1c는 시험관 내에서 7일 후(DIV 7) 마우스 1차 피질 뉴런(PCN)에서 circTshz2-2 녹다운 후 신경 구조 및 총 신경돌기 길이의 변화를 나타낸다. 도 1d는 DIV 7에서 1차 피질 뉴런(PCN)의 circTshz2-2 녹다운 후 각 체세포의 신경돌기 수 변화를 나타낸다. 도 1b 내지 1d 상자 수염 그래프의 수염은 최소값과 최대값을 나타내고 상자 선은 각각 1사분위수, 중앙값 및 3사분위수를 나타낸다. "+"는 평균을 나타낸다. 도 1e은 DIV 7에서 PCN의 circTshz2-2 녹다운에 따른 신경 복잡성의 변화를 나타낸다. 도 1f는 DIV 7에서 PCN의 circTshz2-2 녹다운 후 SYP 및 PSD-95 단백질 수준의 변화를 나타낸다. 도 1e의 데이터는 일반적인 양방향 ANOVA 테스트를 사용하여 평가되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 2a 내지 2f는 circTshz2-2 조절 장애에 대한 전사 반응 결과를 나타낸다. 도 2a는 5일차에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운에 반응하여 유의한 차별적 발현을 경험하는 유전자를 나타낸다. ap 값이 <0.05인 유전자 및 발현 변화가 50% 이상인 유전자 음성 대조군과 비교하여 circTshz2-2가 감소된 세포는 빨간색 점으로 표시되었다. siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타낸다. 도 2b는 이 데이터세트에서 차등적으로 발현된 단백질 코딩 유전자 169개에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석한 것이다. FDR(False Discovery Rate) q 값을 기반으로 하는 상위 10개 GO 용어가 표시된다. 도 2c는 circTshz2-2 녹다운에 따른 세포 주기 및 세포 분열과 관련된 유전자의 발현을 나타낸다. 도 2d는 circTshz2-2 녹다운 후 신경 기능과 관련된 유전자의 발현을 나타낸다. 도 2c 및 2d에서 색상 막대는 음성 대조군 siRNA을 처리한 군과 비교하였을 때 발현의 차이를 나타낸다. 도 2e는 circTshz2-2 녹다운에 따른 세포 주기 조절 및 염색체 분할에 관여하는 유전자의 발현 변화는 5일째에 분화된 Neuro-2A 세포에서 확인되었으며 평균 ± SEM(n = 3)으로 표시되었다. 도 2f는 circTshz2-2 녹다운 후 신경 기능에 관여하는 유전자의 발현 변화는 5일째에 분화된 Neuro-2A 세포에서 확인되었고 평균 ± SEM(n=3)으로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 3a 내지 3e는 circTshz2-2에 의한 세포주기 조절 결과를 나타낸다. 도 3a는 circTshz2-2 녹다운 후 3일차 미분화(Undiff.) Neuro-2A 세포와 5일차 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 세포 주기 단계의 분포를 나타낸다. 각 단계의 세포 백분율은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 계산되었으며 siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타낸다. PE-A는 피코에리트린 영역(phycoerythrin-area)을 의미하며, 2N, 2N~4N, 4N, <2N, >4N은 각각 G1, S, G2/M, sub-G1 및 G2/M 이후의 모든 단계를 나타낸다. 도 3b는 circTshz2-2 녹다운 후 5일차에 분화된 Neuro-2A 세포에서 핵 형태 및 신경돌기 길이의 변화를 나타낸다. 베타 튜브울린과 핵(화살표)은 각각 빨간색과 파란색(DAPI)으로 표시된다.
도 3a 및 3b에서 sicircTshz2-2 세포의 데이터는 circTshz2-2(#1 및 #2)에 대해 두 개의 서로 다른 siRNA를 혼합한 결과를 나타낸다. 도 3c는 circTshz2-2 녹다운 후 5일째에 분화된 Neuro-2A 세포에서 Cyclin B2, CDK1 및 p-CDK1-Y15의 단백질 수준 변화를 나타낸다. 이러한 발현 변화는 평균 ± SEM(n = 3)으로 표시된다. p-CDK1-Y15는 티로신 15에서 인산화된 CDK1 단백질을 나타낸다. p-CDK1-Y15의 수준은 CDK1에 대해 정규화되었다. 도 3d는 신경 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 Bdnf 전사의 변화를 나타낸다. PCN은 마우스 1차 피질 뉴런을 의미한다. DIV는 day in vitro를 의미한다. 도 3e는 신경 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 proBDNF 및 mBDNF 단백질 수준의 변화를 나탄내다. ns는 유의하지 않음을 의미한다, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 4a 내지 4f는 circTshz2-2 및 YY1 전사 억제자 복합체에 의한 Bdnf 전사 조절결과를 나타낸다. 도 4a는 circTshz2-2 녹다운 후 5일째에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 마우스 Bdnf 유전자 및 전사체 변이체, Bdnf mRNA isoform 수준의 변화를 나타낸다. 마우스 Bdnf 유전자의 대체 스플라이싱 부위 검은색 막대로 표시되어있다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다(n = 3). siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타내낸다. ns는 유의하지 않음을 의미한다, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 도 4b는 RNA-seq 데이터에서 circTshz2-2 감소에 의해 영향을 받는 유전자의 전사를 조절할 수 있는 가능한 단백질 인자의 예측에 관한 것이다. 색상 막대는 각각 BART 평가 및 ChEA3의 통합 점수 순위에 대한 Irwin-Hall p 값을 나타낸다. 도 4c에서 circTshz2-2와 특정 전사 조절자 사이의 상호작용 확률은 RPIseq를 사용하여 예측되었다. 색상 막대는 상호작용 확률 점수(0-1)를 나타낸다. RF와 SVM은 각각 랜덤 포레스트와 지원 벡터 포레스트를 나타낸다. 도 4d에서 circTshz2-2와 TSHZ2 보조인자 또는 RNA 결합 단백질 간의 상호작용 확률은 RPIseq에 의해 예측되었다. 색상 막대는 상호작용 확률 점수(0-1)를 나타낸다. 도 4e는 5일째에 분화된 Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2와 YY1(위쪽) 또는 CTBP(아래쪽) 사이의 RNA-단백질 상호작용함을 나타낸다. 별표로 표시된 밴드는 circTshz2-1 이다. IP는 면역 침전을 나타낸다. 도 4f는 엑손 4에서 6까지의 마우스 Bdnf 유전자 서열에서 프로모터-유사 시그니처(PLS)의 예시이다. PLS 데이터는 ENCODE의 Candidate Cisregulatory Elements 데이터베이스에서 얻었다. YY1 결합 코어 모티프 및 폴리콤 그룹(PcG) 응답 요소는 각각 빨간색과 녹색으로 표시되었다.
도 5a 및 5b는 circTshz2-2/TrkB 신호 전달 경로에 의한 세포 주기 조절 및 미세소관 구성 중심의 재배치에 관한 것이다. 도 5a는 TrkB 길항제(ANA-12) 및 p75NTR 억제제(PD90780)를 처리한 후 5일째에 circTshz2-2가 감소된 분화된 Neuro-2A 세포에서 세포 주기의 변화를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 반복(n = 3)을 나타내며 평균 ± SEM으로 표시되었다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 각 단계의 세포 백분율을 계산했다. siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타낸다. PE-A는 피코에리트린 영역(phycoerythrin-area)을 의미하며, 2N, 2N~4N, 4N, <2N, >4N은 각각 G1, S, G2/M, sub-G1 및 G2/M 이후의 모든 단계를 나타낸다. ns는 유의하지 않음을 의미한다, *p <0.05, **p <0.01, ***p < 0.001.
도 5b는 5일차에 분화된 Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운에 따른 핵 형태의 변화 및 미세소관 구성 중심의 재배치를 나타낸다. 베타-튜불린, 감마-튜불린(삼각형) 및 핵(화살표 )은 각각 빨강, 초록, 파랑으로 표시된다. 데이터는 3개의 독립적인 배양(n = 3)의 대표적인 세포로 표시된다. 도 5a 및 5b에서 sicircTshz2-2 데이터는 circTshz2-2(#1 및 #2)에 대한 두 가지 다른 siRNA의 혼합물이 처리된 세포에서 얻은 것이다.
도 6a 내지 6i는 야생형 및 비만 마우스에서 cirTshz2-2에 의한 공간기억능력 조절과 관련된 것이다. 도 6a는 뇌에 뇌 주입 키트와 삼투 펌프의 주입 위치를 나타낸다. 외측 뇌실의 주입 위치는 브레그마에서 정외측 1.0mm, 전후방 0.3mm, 등복측 2.5mm의 순서로 있다. 도 6b는 용액(대조군 siRNA 또는 circTshz2-2 siRNA)을 포함하는 삼투 펌프의 이식을 표시하는 그림. 뇌 주입 키트를 측뇌실에 삽입했다. 삼투압 펌프는 등쪽 피하 영역에 고정시켰다. sicircTshz2-2(#1 + #2)는 두 개의 독립적인 circTshz2-2 siRNA의 혼합물을 나타낸다. 도 6c에서 야생형(WT) 및 형질전환 비만(ob/ob) 마우스의 뇌 피질 및 해마에서 circTshz2-2의 발현은 각각 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 도 6d에서 야생형 마우스의 뇌 피질 및 해마에서 circTshz2-2의 발현 변화는 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 도 6e에서 비만 마우스의 뇌 피질 및 해마에서 circTshz2-2의 발현 변화는 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 도 6f은 대조군 siRNA 또는 circTshz2-2 siRNA 혼합물을 주입한 후 T-미로 장치에서 야생형 및 비만 마우스의 움직임을 나타낸다. 대표적인 추적은 그룹당 5마리의 마우스의 5분 동안의 움직임을 나타낸다. 도 6g에서 야생형 및 비만 마우스에서 circTshz2-2 고갈 후 자발적 교대 비율의 변화는 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 막대의 점은 각 그룹에서 마우스의 자발적 교대 비율을 의미한다. 도 6h에서 야생형 및 비만 마우스에서 circTshz2-2 고갈 후 1일 및 3일째에 자발적 교대 비율의 변화는 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 도 6i에서 야생형 및 비만 마우스의 뇌 피질 및 해마에서 circTshz2-2 고갈에 따른 사이클린 B2 및 CDK1 수준의 변화는 평균 ± SEM(n = 5)으로 표시되었다. 도 6d 내지 6i에서 WT-siCtr은 대조군 siRNA가 주입된 야생형 마우스를 나타낸다. WT-sicircTshz2-2(#1 + #2)는 2개의 독립적인 circTshz2-2 siRNA의 혼합물이 주입된 야생형 마우스를 나타낸다. ob/ob-siCtr은 대조군 siRNA를 주입한 비만 마우스를 나타낸다. ob/ob-sicircTshz2-2(#1 + #2)는 2개의 독립적인 circTshz2-2 siRNA의 혼합물이 주입된 비만 마우스를 나타낸다. ns는 유의하지 않음을 의미한다, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 7은 뇌에서 비만 관련 circRNA의 세포 유형 특이적 발현을 나타낸다. 미세아교세포(BV-2), 성상세포(C8-D1a) 및 신경 세포(Neuro-2A)에서 비만 관련 circRNA의 특이적 발현을 나타내며, 이 발현은 3개의 샘플(n=3)의 평균으로 측정되었으며 각 세포 유형에서 상대 백분율로 표시되었다. 각 circRNA에 대한 예상 PCR 산물 크기는 괄호 안에 표시되었다. 별표로 표시된 밴드는 각 circRNA의 또 다른 isoform을 의미한다.
도 8은 Neuro-2A 세포에서 분화 3일 후(Diff.) 신경 분화 및 시냅스 소포 발달과 관련된 세포 형태 및 유전자 발현의 변화를 나타낸다. 세포 형태는 3개의 독립적인 세포 배양(n=3)에서 평가되었으며 신경 분화(Rbfox3, Chat, Map2) 및 시냅스 소포 발달(Stx1a 및 Syp)의 마커는 평균 ± SEM(n=3)으로 표시되었다. "Undiff."는 미분화 세포를 의미한다. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 9는 신경 분화 중 비만 관련 circRNA의 차등 발현을 나타낸다. (A) 신경 분화 동안 각 circRNA의 발현의 변화는 평균 ± SEM(n=3)으로 표시되었다. Undiff., Diff. 및 ND는 각각 미분화, 분화 및 미결정을 나타낸다. (B) 3일 후 신경 분화 동안 각 circRNA의 발현 변화는 평균 ± SEM(n=3)으로 표시되었다. (A) 및 (B)에서 별표로 표시된 밴드는 각 circRNA의 다른 isoform을 나타낸다. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 10은 인간 TSHZ2에 대한 Genotype-Tissue 발현(GTEx) 데이터를 나타낸다. GTEx 최종 데이터 릴리스 V8의 RNA-seq 데이터를 기반으로 한 52개의 인간 조직과 2개의 인간 세포주에서 TSHZ2의 중간 유전자 발현 수준에 관한 것이다. 각 조직에는 GTEx 컨소시엄 출판 규칙에 따라 색상이 지정되었다. 데이터는 log10(Transcripts Per Million + a pseudo count number 1)로 표시된다.
도 11은 신경 분화 동안 마우스 Tshz2 isoform의 발현을 나타낸다.
A는 UCSC 게놈 브라우저에서 얻은 Tshz2 isoform의 genomic context이다. 각 Tshz2 isoform을 구별하기 위해 개별적인 프라이머 세트가 사용된다. Fw 및 Rev는 각각 정방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다. B는 1일차에 미분화(Undiff.) Neuro-2A 세포에서 각 Tshz2 isoform의 발현을 나타낸다. C는 뉴런 분화 동안 각 Tshz2 isoform의 발현 변화를 나타낸다. "Undiff"는 분화되지 않은 것을, "Diff"는 분화된 것을 의미한다. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 12는 다양한 종에서 Tshz2 엑손 2의 genomic context를 나타낸다. 태반 포유류(PhyloP 및 PhastCons)에서 이러한 유전자의 genomic context 및 보존 정도는 UCSC 게놈 브라우저에서 얻었다. Tshz2 엑손 2는 예상보다 느리게 진화하고(PhyloP에서 양성 점수) 포유동물에서 잘 보존됨을 보여준다(PhastCons에서 1에 가까움). 60종의 척추동물의 Multiz Alignment는 여러 종에 걸쳐 Tsh2 엑손 2의 높은 보존 정도를 보여준다. (인간 염기에서 99.6%, 쥐 염기에서 99.8%, 토끼 염기에서 99.7%, 붉은털 원숭이 염기에서 99.5%, 닭 염기에서 98.8%, 개 염기에서 99.9%, 개구리 염기에서 98.1%, 제브라피쉬 염기에서 87.1%).
도 13은 쥐의 일차 피질 뉴런(A)과 인간 SHSY5Y뉴런 세포(B)에서 신경 분화, 성숙 및 신경계 발달 동안 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2의 발현변화를 나타낸다. A는 쥐 1차 피질 뉴런(rPCN)의 성숙 동안 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2의 세포 형태 및 발현의 변화를 나타낸다 DIV는 day in vitro를 의미한다. B는 인간 SH-SY5Y 뉴런 분화 동안 circTSHZ2-1, circTSHZ2-2 및 TSHZ2의 세포 형태 및 차등 발현의 변화를 나타낸다. A와 B에서 별표로 표시된 밴드는 circTshz2-1이다. C에서 마우스 해마 발달 및 성체 마우스 뇌 발달 동안 circTshz2-2의 발현은 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터 세트에서 얻었다. E, P 및 wks. 는 각각 배아일(embryonic day), 산후일(postnatal day) 및 주(weeks)를 나타낸다. ns: 유의하지 않음, *: p<0.05, **: p<0.01.
도 14는 미분화(Undiff.)된 또는 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포의 핵(N) 및 세포질(C)에서 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2 isoform의 분포를 나타낸다. 별표로 표시된 밴드는 circTshz2-1이다.
도 15는 circTshz2-2의 녹다운시 또는 과발현시의 효과 및 이로 인한 신경돌기와 신경 복잡성의 변화를 분석한 것이다. A는 circTshz2-2의 백 스플라이싱 접합에 대한 두 개의 독립적인 siRNA(#1 및 #2)의 결합 부위를 표시한 것이다. 각 siRNA에 결합하는 뉴클레오티드의 위치는 "0"으로 표시된 백스플라이싱 접합에 대해 "+" 또는 "-"로 표시된다. 삼각형은 circTshz2-2의 백스플라이싱 접합을 나타낸다. B는 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 5일차에 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2 isoform의 변화를 나타낸다. siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타낸다. C는 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 5일차에 체세포의 신경돌기 수의 변화 및 이차 분지 수의 변화를 나타낸다. D는 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2가 과발현되도록 한 결과이다. Vec은 제어 벡터를 나타낸다. E는 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현(OE) 후 5일차에 신경 구조 및 총 신경돌기 길이의 변화를 나타낸다. Vec은 대조군 벡터를 나타낸다. F는 마우스 1차 피질 뉴런(PCN)에서 circTshz2-2 녹다운 후 In vitro(DIV 7) 7일차에 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2 isoform의 발현 변화를 나타낸다. G는 Sholl 분석을 사용하여 각 체세포의 신경돌기 수와 교차점 수를 분석하는 데 사용되는 방법을 개략적으로 나타낸다. 원호(청록색)는 Sholl 분석에 사용되는 일정한 간격의 동심원이다. C와 E에서 그래프의 수염은 최소값과 최대값을 나타내고 상자 선은 각각 1사분위수, 중앙값 및 3사분위수를 나타낸다. ns: 유의하지 않음을 나타낸다, *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 16은 circTshz2-2 녹다운 동안 식별된 200개의 차등적으로 발현된 유전자에 대한 유전자 유형의 백분율을 보여준다. 유전자 유형 범주는 GENCODE 주석을 기반으로 하였다.
도 17은 분화된 Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현에 의해 변화된 유전자를 나타낸다. circTshz2-2 과발현(OE)에 따른 세포 주기 조절, 염색체 분리 및 신경 기능에 관여하는 유전자의 발현 변화는 5일차에 분화된 Neuro-2A 세포에서 확인되었다. Vec은 제어 벡터를 나타낸다. *: p<0.05.
도 18은 circTshz2-2 녹다운 후 미분화 Neuro-2A 세포의 핵 형태를 나타낸다. 5일째에 미분화(Undiff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 녹다운 후 핵 형태의 변화는 각각 빨간색과 파란색으로 표시되었다. siCtr은 음성 대조군 siRNA를 나타낸다. sicircTshz2-2가 처리된 세포의 데이터는 circTshz2-2(#1 및 #2)에 대한 두 가지 다른 siRNA의 siRNA 혼합물을 세포에 처리하여 얻었다.
도 19는 분화된 Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현 후 세포주기 단백질과 BDNF의 발현을 나타낸다. A는 5일차에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현(OE) 후 Cyclin B2, CDK1 및 p-CDK1-Y15의 단백질 수준 변화를 나타낸다. Vec은 대조군 벡터를 나타낸다. p-CDK1-Y15는 티로신 15에서 인산화된 CDK1 단백질을 나타낸다. p-CDK1-Y15의 수준은 CDK1에 대해 정규화 되었다. B는 5일차에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현(OE) 후 전구체 BDNF(proBDNF) 및 성숙한 BDNF(mBDNF)의 단백질 수준 변화를 나타낸다. Vec은 대조군 벡터를 나타낸다. ns: 유의하지 않음, *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.
도 20은 마우스 Bdnf의 genomic context 및 circTshz2-2 과발현에 따른 이의 변화를 나타낸다. A는 UCSC Genome Browser에서 확인된 11개 마우스 Bdnf 전산체 변이체의 genomic context를 나타낸다. 8개의 정방향(Fw) 프라이머, 범용 역방향(Uni. Rev) 프라이머 및 3' 비번역 영역(UTR)용 프라이머 세트가 표시되었다. B는 3일차에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 Bdnf 전사체 변이체 발현을 나타낸다. 각 Bdnf isoform에 대한 PCR 산물의 예상 크기가 표시되었고 감지되지 않은 isoform은 빨간색으로 표시되었다. C는 5일차에 분화된(Diff.) Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 과발현(OE) 후 Bdnf isofrom의 수준 변화를 나타낸다. Vec은 제어 벡터를 나타낸다. *: p<0.05.
도 21은 인간 BDNF 유전자의 엑손 4와 6 사이에 잠재적인 결합 부위가 있는 BDNF의 가능한 전사 조절자를 나타낸다. 인간 BDNF 유전자에 대한 게놈 정보는 UCSC Genome Browser에서 얻었다. ENCODE 프로젝트의 ChIP-seq 데이터에서 얻은 가능한 전사 인자 클러스터가 표시되었다. 엑손 4와 6 사이의 BDNF 전사체 변이체를 확대하였으며, 가능한 전사 조절자로 주석을 달았다. TSHZ2 보조 인자인 CTBP2는 파란색으로 표시되었다.
도 22는 RNA 결합 단백질 면역 침전결과를 나타낸다. RNA-IP 실험은 본 실험에 사용된 각 항체가 표적 단백질(YY1 및 CTBP)에 효율적으로 결합하는지 확인하기 위해 설계되었다. " cell lysate after "은 자기 비드 및 항체 복합체로 면역침전된 후 잔류 세포 용해물을 나타낸다. "IP wash"는 자기 비드/관심 단백질/항체 면역 침전물 세척 후 상층액을 의미한다. 별표로 표시된 밴드는 YY1 단백질의 절단된 형태를 나타낸다. B는 circTshz2-2와 SUZ12 간의 상호 작용을 나타낸다. 별표로 표시된 밴드는 circTshz2-1이다. IP는 면역 침전immunoprecipitation)을 의미한다. C는 circTshz2-2와 CTIP 사이의 RNA-단백질 상호작용결과를 나타낸다. 별표로 표시된 밴드는 circTshz2-1이다.
도 23은 야생형 및 비만 마우스의 locomotor activitiy를 나타낸다. E 내지 H에서, WT-siCtr은 대조군 siRNA가 주입된 야생형 마우스를 나타내고, WT-sicircTshz2-2(#1+#2)는 2개의 circTshz2-2 siRNA가 주입된 야생형 마우스를 나타낸다. ob/ob-siCtr은 대조군 siRNA 주입 비만 마우스를 나타내고, ob/ob-sicircTshz2-2(#1+#2)는 2개의 circTshz2-2 siRNA가 주입된 비만 마우스를 나타낸다. ns: 유의하지 않음, *: p<0.05, **: p<0.01.
도 24는 뉴런에서 circTshz2-2 관련 메커니즘을 간략하게 나타낸 것이다. 고도로 발현된 circTshz2-2는 YY1 전사 억제자 복합체에 결합하여 뉴런(좌측 상단)에서 Bdnf 전사를 억제한다. circTshz2-2 발현이 억제되면 Bdnf 전사가 시작되어 전구체 BDNF(proBDNF)와 성숙한 BDNF(mBDNF)의 수준이 증가한다. 이러한 증가는 티로신 키나제 B(TrkB) 수용체와 더 많은 mBDNF 상호작용을 허용하고 Cyclin B2/CDK1 복합체의 비활성화를 허용한다. 이 비활성화는 G2/M 세포주기 정지를 초래한다. 이 G2/M 세포주기 정지는 미세소관 구성 중심(MTOC)을 신경돌기로 재배치하여 BDNF/TrkB 수용체 활성화와 함께 신경돌기 길이와 복잡성을 증가시킨다.
본 발명은 비만 환자에서 발생하는 신경퇴행성 질환과 관련된 원형 RNA 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 비만 환자에서 증가된 circTshz2-2 원형RNA를 검출함으로써 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측할 수 있고, 비만 환자에서 증가된 circTshz2-2 원형RNA를 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명은 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물을 제공한다.
circTshz2-2 원형RNA는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제는 피검체로부터 채취된 시료의 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 그 형태는 제한되지 않는다. 예컨대 circTshz2-2에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제는 예컨대 서열번호 78의 순방향 프라이머 및 서열번호 79의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트일 수 있고, 서열번호 124의 순방향 프라이머 및 서열번호 125의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
시료는 피검체로부터 자연적으로 분리되거나 인위적으로 분리한 것일 수 있고, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 타액(saliva), 세포, 조직, 분변, 소변 등일 수 있다.
시료는 공지의 방법에 따라 피검체에서 적절하게 채취될 수 있으며, 검출 방법에 따라 필요한 전처리 과정을 거칠 수 있다. 또한, 시료를 피검체로부터 채취하는 시점은 질병의 발병 전 또는 발병 후일 수 있으나, 바람직하게는 발병 전 시료를 채취하는 것일 수 있다.
circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅 또는 유전자 칩을 이용하여 측정할 수 있으나, circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 상기 열거한 방법으로 제한되는 것은 아니다.
신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매, 노인성 치매, 경도 인지 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병, 근위축성 축삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 "비만 환자"는 이상체중법(Modified Broca's method) 또는 체질량지수(Body mass index; BMI) 등의 임상적 방법으로 비만 진단을 받은 환자를 의미한다.
비만 환자의 circTshz2-2 원형RNA 발현 수준 증가는 G2/M 세포주기 체크포인트 단백질 발현에 영향을 주고, 신경돌기를 신장 및 신경 복잡성 증가를 방해하며 기억력을 저해한다. 따라서, 비만 환자에서 circTshz2-2 원형RNA 발현의 증가가 관찰되는 경우 기억력이 저하될 수 있고, 더 나아가 신경퇴행성 질환의 발병 위험이 circTshz2-2 원형RNA 발현의 증가가 관찰되지 않는 비만 환자에 비해 높아진다.
본 발명의 일 실시예에서 비만 마우스에서 과발현된 circTshz2-2 원형RNA를 억제한 결과 Cyclin B2, CDK1 등과 같은 G2/M 세포주기 체크포인트 단백질과 BDNF의 발현 수준이 유의미하게 변화하였고, 미세소관형성중심(microtubule-organizing center)의 재배치를 유발하여 신경돌기가 신장됐으며, 신경 복잡성(neural complexity)이 증가됐다.
본 발명은 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물로 비만 환자의 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 모니터링하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.
비만 환자를 대상으로 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 모니터링하는 방법은 피검체로부터 시료를 채취하여 시료의 circTshz2-2 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
시료의 종류 및 시료의 채취 방법은 전술한 바와 같다.
circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅 또는 유전자 칩을 이용하여 측정할 수 있으나, circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 상기 열거한 방법으로 제한되는 것은 아니다.
신경퇴행성 질환의 종류는 전술한 바와 같다.
본 발명은 circTshz2-2 원형RNA 억제제를 포함하는 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
circTshz2-2 원형RNA 억제제는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA일 수 있다.
"백스플라이싱 접합 부위"란 선형 pre-mRNA의 양쪽 말단이 원형 RNA가 되기 위해 연결된 부분으로, 예컨대 pre-mRNA 양 말단의 20개 내외의 뉴클레오티드 부위 일수 있으며, 예컨대 서열번호 1의 염기서열의 양 말단인 gacuuccuccugggcauacc-acuugaauuuagagucugug 또는 서열번호 2의 염기서열의 양 말단인 cacagacucuaaauucaagu-gcuacgcccaggaggaacag일 수 있다("-"는 접합되는 지점을 의미한다).
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 circTshz2-2 원형 RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA는 선형 pre-mRNA(circTshz2-2 원형 RNA의 전구체인 선형 mRNA)의 양 말단이 접합되는 지점의 전후 뉴클레오티드를 모두 표적으로 함으로써, 상기 선형 pre-mRNA가 분해되는 것을 방지할 수 있다(도 15의 A 참조). 상기 선형 pre-mRNA(circTshz2-2 원형 RNA의 전구체인 선형 mRNA)의 양 말단이 접합되는 지점의 전후 뉴클레오티드를 모두 표적으로 하는 siRNA는 예컨대 백스플라이싱 접합으로 접합되는 지점 일 말단의 뉴클레오티드 4개와 다른 말단의 뉴클레오티드 15개를 모두 표적으로 하는 siRNA, 접합되는 지점 일 말단의 뉴클레오티드 6개와 다른 말단의 뉴클레오티드 13개를 모두 표적으로 하는 siRNA, 또는 접합되는 지점 일 말단의 뉴클레오티드 8개와 다른 말단의 뉴클레오티드 13개를 모두 표적으로 하는 siRNA 등일 수 있다.
서열번호 1의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형 RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA는 예컨대, 서열번호 5의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA; 또는 서열번호 7의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA일 수 있다.
서열번호 2의 염기서열을 갖는 circTshz2-2 원형 RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA는 예컨대 서열번호 9의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 11의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA, 서열번호 13의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA; 또는 서열번호 15의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA일 수 있다.
상기 circTshz2-2 원형RNA 억제제는 서열번호 5의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 7의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 9의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 11의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 13의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA; 및 서열번호 15의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 9의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 11의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 13의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA; 및 서열번호 15의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 RNA 중 한 쪽 또는 양쪽 가닥은 3′오버행을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "3′오버행(overhang)"은 이중나선의 RNA 가닥의 3′말단으로부터 연장된 적어도 한 개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA는 1 내지 약 6개의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함), 바람직하게는 약 2 내지 약 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 적어도 한 개의 3′오버행을 포함할 수 있다.
siRNA의 센스 및 안티센스 RNA 두 가닥 모두 3′오버행을 포함할 수 있으며, 오버행의 길이는 두 가닥에서 동일하거나 다를 수 있다. 예컨대 3′오버행은 siRNA의 센스 및 안티센스 RNA 두 가닥 모두에 존재하고 2개의 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 상세하게 2개의 뉴클레오티드는 디티미딜릭산(dithymidylic acid, "TT") 또는 디우리딜릭산(diuridylic acid, "UU")일 수 있다.
전술한 서열번호 5 내지 16의 염기서열을 갖는 센스 또는 안티센스 RNA는 디우리딜릭산(diuridylic acid, "UU")의 3′오버행이 포함된 것이며,
상기 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA는 상기 서열번호 5 내지 16의 염기서열을 갖는 센스 또는 안티센스 RNA의 디우리딜릭산(diuridylic acid, "UU") 3′오버행 부분이 제거된 또는 디티미딜릭산(dithymidylic acid, "TT")등과 같은 다른 3′오버행 서열로 치환된 siRNA일 수 있다.
신경퇴행성 질환의 종류는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서, 비만 마우스의 과발현된 circTshz2-2 원형RNA를 억제한 결과, BDNF의 발현이 증가되었고, Cyclin B2 및 CDK1과 같은 G2/M 세포주기 체크포인트 단백질의 발현이 감소되어 세포주기 중 G2/M 세포주기의 정지가 유발되었다. 그 결과 신경돌기가 신장되고 신경 복잡성(neural complexity)이 증가되었으며, 비만 마우스의 공간기억능력이 향상되었다.
본 발명의 circTshz2-2 원형RNA억제제를 포함하는 약학 조성물은 비만 환자에서 과발현된 circTshz2-2 원형RNA를 억제함으로써 비만 환자 신경세포의 신경돌기를 신장시키고, 신경망 복잡성을 증가시킬 수 있으며, 공간기억능력을 향상시킬 수 있다. 이러한 신경세포에 대한 직접적인 효과를 통해 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등일 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명 약학 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제조될 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명 본 발명 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식이 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명은 circTshz2-2 원형RNA 억제제를 포함하는 비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
circTshz2-2 원형RNA 억제제는 전술한 바와 같다.
비만환자에서 circTshz2-2 원형RNA 억제함으로써 기억력 또는 인지능력을 개선시킬 수 있다.
비만환자에서 circTshz2-2 원형RNA 억제함으로써 발생하는 효과는 전술한 바와 같다.
비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물은 약학적 용도로 사용되거나 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물이 약학적 용도로 사용되는 경우 약학 조성물의 제형, 담체, 부형제, 희석제, 투여 경로, 투여량에 관한 것은 전술한 바와 같다.
본 발명의 비만 환자의 기억력 저하 예방 또는 개선용 조성물이 건강기능식품으로 사용되는 경우 조성물을 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함할 수 있다.
예컨대 정제 형태의 건강기능식품은 상기 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 상기 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 상기 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1. 동물 관리
8주령의 수컷 야생형 C57BL/6J(Koatech) 및 C57BL/6J-ob/ob(Japan SLC)을 전남대학교(CNU) 실험실 동물 연구 센터에 16시간 명(light) / 8시간 암(dark) 주기로 23C, 습도 60으로 관리하였다. 실험 절차 수행 시 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 실험은 CNU 동물실험윤리위원회에서 제정한 96개 동물 실험 지침의 권고에 따라 수행되었다. 동물실험윤리위원회는 CNU에서 프로토콜을 승인했다. 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었다.
1.2. 세포주 및 배양
마우스 Neuro-2A 신경모세포종 세포, 마우스 BV-2 미세아교세포, 마우스 C8-D1a 성상세포 및 인간 SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입했다. Neuro-2A 및 SH-SY5Y 세포는 10% 소태아혈청(FBS, Millipore), 1mM 피루브산나트륨(Thermo Scientific) 및 100U/ml 페니실린이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, WELGENE)에서 배양되었다. 스트렙토마이신(Thermo Scientific). BV-2 세포를 5% FBS 및 100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하고 C8-D1a 세포를 10% FBS 및 100U/ml 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 37 ℃ 및 5% CO2 존재하에 배양하였다. 배지는 2일에 한 번 교체되었고 세포는 미리 데워진 1X PBS(GENEALL) 및 0.25% 트립신(Thermo Scientific)을 사용하여 다중 웰 플레이트에서 계대배양되었다.
2% FBS, 1mM 소듐 피루브산 및 100 U/ml 페니실린 스트렙토마이신(DMEM/2% FBS)으로 보충된 DMEM에 20 μM 올트랜스 레티노산(Sigma Aldrich)을 추가하여 Neuro-2A 및 SH-SY5Y 세포의 신경 분화를 유도했다. 20 μM의 모든 트랜스 레티노산을 함유한 DMEM/2% FBS는 세포가 다운스트림 분석에 사용될 준비가 될 때까지 이틀에 한 번씩 교체되었다.
1.3. 1차 배양
모든 1차 배양 절차는 CNU의 동물 관리 지침에 따라 수행되었다. 마우스 및 래트 1차 피질 신경 세포를 각각 배아 14일째에 C57BL/6 마우스 및 Sprague-Dawley 래트의 대뇌 피질로부터 분리하였다(Koatech). 그런 다음 이러한 피질을 해부/해리 배지[1X hank's balanced salt solution (Thermo Scientific), 1mM 피루브산나트륨, 225ug/ml D-글루코스(Thermo Scientific) 및 100mM 4-(2-하이드록시에틸)-1 -피페라진에탄설폰산(HEPES, Thermo Scientific)]을 5분마다 부드럽게 뒤집으면서 15분 동안 피펫팅 방법을 사용하여 단일 세포로 분쇄하였다. 세포를 1X 폴리-L-라이신(Thermo Scientific)으로 코팅된 다중 웰 플레이트 또는 1X 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버슬립(Paul Marienfield)에 접종했다. 그들은 부착을 유도하기 위해 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 plating medium[minimum essential medium with Earle's balanced salts (MEM; WELGENE), 10 % FBS, 100 ug/ml D-glucose, 1 mM sodium pyruvate, 1X GlutaMAX (Thermo Scientific), and 100 U/ml penicillin-streptomycin]에서 배양되었다. 그런 다음 plating medium[Neurobasal medium (Thermo Scientific), 1X B-27 supplement (Thermo Scientific), 1X GlutaMAX, and 100 U/ml penicillin-streptomycin] 은 신경 성숙을 촉진하기 위해 유지 배지로 교체되었다. 유지 배지는 세포가 다운스트림 분석에서 사용할 준비가 될 때까지 2일에 한 번 교체되었다.
1.4. 형질전환
siRNA 및 플라스미드 벡터를 사용하여 circTshz2-2의 기능적 연구를 하였다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 3000(Thermo Scientific)을 사용하여 이들 구성물을 형질감염시켰다. Neuro-2A 세포의 경우, cm2당 2 x 104 cell을 다중 웰 플레이트에 접종한 다음 20μM all-trans retinoic acid를 포함하는 DMEM/2% FBS에서 접종하고 하루 후에 분화했다. 분화 3일째에 최종 농도가 30nM인 siRNA(Bioneer)와 500ng의 plasmid vector로 형질감염 되었다. 형질감염된 세포를 6시간 동안 배양했다. 배지를 20μM all-trans retinoic acid를 포함하는 DMEM/2% FBS로 교체하고 추가로 42시간 동안 배양했다. 미분화 Neuro-2A 세포의 siRNA 형질감염을 위해, 세포를 DMEM/2% FBS에서 24시간 동안 배양한 후, 최종 농도 30nM에서 siRNA 형질감염을 유도했다. 형질감염된 세포를 추가로 6시간 동안 배양한 후 배지를 DMEM/2% FBS로 교체하고 세포를 추가로 42시간 동안 배양하였다.
일차 뉴런으로의 형질감염을 위해 cm2당 1.5 x 105 cell을 폴리-1-리신 코팅된 커버슬립을 포함하는 다중 웰 플레이트에 시딩한 다음, 세포가 시험관 내에서 5일(five days in vitro, DIV 5)에 도달했을 때 30nM의 최종 농도에서 표적 siRNA로 형질감염 되었다. 형질감염된 세포를 6시간 동안 배양한 후 배지를 유지 배지로 교체하고 추가로 42시간 동안 배양하였다.
circTshz2-2 녹다운 후 1차 뉴런의 구조를 분석하기 위해, 제조사의 지침에 따라 FuGENE 6(Promega)을 사용하여 pMAX-GFP 플라스미드(Lonza)를 형질감염시켰다. circTshz2-2가 고갈된 세포가 DIV 6에 도달했을 때, 1 μg pMAX-GFP 플라스미드를 세포에 형질감염시키고 6시간 동안 배양하였다. 그런 다음 이 배지를 유지 배지로 교체하고 추가로 18시간 동안 배양??다.
1.5. siRNA 디자인
siDESIGN Center(https://horizondiscovery.com/en/products/tools/siDESIGN-Center)와 i-Score Designer(https://www.med.nagoya-u.ac.jp/neurogenetics/i_Score/i_score) .html)를 사용하여 circTshz2-2의 백스플라이싱 접합부분(back-splicing junction)을 표적으로 하는 siRNA를 설계하였다. 그런 다음 circTshz2-2 siRNA와 AccuTarget 음성 대조군 siRNA는 Bioneer을 사용해 합성했으며, 이러한 분석에 사용된 siRNA의 서열은 표 1에 기재했다. 각 서열 말단의 =UU 부분은 3′overhang을 나타낸다.
The list of siRNA
Name Sense sequences AntiSense sequences
sicircTshz2-2 #1 서열번호5: ACUCUAAAUUCAAGUGGUA=UU 서열번호6: UACCACUUGAAUUUAGAGU=UU
sicircTshz2-2 #2 서열번호7: AAUUCAAGUGGUAUGCCCG=UU 서열번호8: CGGGCAUACCACUUGAAUU=UU
표 2 내지 4는 마우스, 래츠 및 인간의 각 유전자의 프라이머 서열을 나타낸다.
The list of primer set
Mouse
Name Forward sequence Reverse sequence
5' Exon 1 Bdnf 서열번호17: TTACCTTCCTGCATCTGTTGG 서열번호25: GTCATCACTCTTCTCACCTGG
5' Exon 2 Bdnf 서열번호18: GAGAGCAGAGTCCATTCAGC
5' Exon 3 Bdnf 서열번호19: GGGCTCCTGCTTCTCAAG
5' Exon 4 Bdnf 서열번호20: AGCTGCCTTGATGTTTACTTTG
5' Exon 5 Bdnf 서열번호21: AACCATAACCCCGCACAC
5' Exon 6 Bdnf 서열번호22: GGACCAGAAGCGTGACAAC
5' Exon 7 Bdnf 서열번호23: TGAAAGGGTCTGCGGAAC
5' Exon 8 Bdnf 서열번호24: CTGATTGCTGAAAATGGTGTCG
3' Exon Bdnf 서열번호26: GTTGTCATTGCTTTACTGGCG 서열번호27: AATTTTCTCCATCCCTACTCCG
Cdk1 서열번호28: TGCAGGACTACAAGAACACC 서열번호29: GCCATTTTGCCAGAGATTCG
Ccnb2 서열번호30: CCTCAGAACACCAAAGTACCAG 서열번호31: CCTTCATGGAGACATCCTCAG
Ccnd3 서열번호32: TTTTGGCCCTCTGTGCTAC 서열번호33: GCTCATCCGCAGACATAGA
Cks1b 서열번호34: ACCCATCTGATGTCTGAATCTG 서열번호35: CGGCTTCATTTCTTTGGCTTC
Arpp19 서열번호36: TTAAGGAAAAGATTGCAGAAAGGG 서열번호37: CTGTGGAGTGGGAATGTGG
Smc4 서열번호38: GCAGGGACAGATCATAGAACAG 서열번호39: AGAATGCCTTTCCAACTGGG
B2m 서열번호40: GGTCGCTTCAGTCGTCAG 서열번호41: TTCAGTATGTTCGGCTTCCC
Fbxl17 서열번호42: CGTCTCACTGCCCTTTACTG 서열번호43: TGAGATCTTGTAACACTGGCC
Pcp4 서열번호44: CTTCTGAGCTGTTCTGTGGG 서열번호45: TCTTGTCTTTTCCGTTGGTCG
Prdm8 서열번호46: CATATTCGGTCCCTGTGTACTG 서열번호47: GCCACATGAGACCTTCTGAG
Wnt3 서열번호48: AGCTGCCAAGAGTGTATTCG 서열번호49: CTAGATCCTGCTTCTCATGGG
Plcl1 서열번호50: GAAAGTTCGAGAATACACCATGC 서열번호51: CTCCTTAACAGACACTATGGCG　
Prkar2a 서열번호52: AAGATTGTGGATGTGATCGGG 서열번호53: CCCTCCATTCTTGTTTGACTTG
Bhlhe41 서열번호54: AGGACAGAAACCTCCAAATCG 서열번호55: CAAGCTCCTTTTGGGTTTACAC
Hecw2 서열번호56: CCCCTGTATTACCGTGAAGAAC 서열번호57: AACATCCCTTTCTTGAGCCC
circSorl1 서열번호58: ACTGGGCTGCTCTCATAGGCTTC 서열번호59: GGTGACCATGGAGGCATCATCATG
circMpped1 서열번호60: GATGATGAGTCGGCCATGTTGGTG 서열번호61: GATCCCATTCAAATGCCCTACGGC
circP1ekha5-1 서열번호62: GGTCTATCTTGCCCGTCCTTCTGA 서열번호63: GCTGCTAATAAAGCTGAGACGGC
circArhgap5 서열번호64: CCCAGAGAGTCCAACTACACTGAC 서열번호65: CCTGCAATCACATCTGACCAGGAG
circUbe2k 서열번호66: CTGGAGGTCCTGCTATTTCTCCTC 서열번호67: TCAAGCAGACAGCTCGACTTTGGG
circTmem44 서열번호68: ACGGTGTCACACAGACTCGTTAGG 서열번호69: CTGCTGGGTGCTATTGCTGCCTTT
circZbtb20 서열번호70: TGTCAGATCCATGATGCTCCCCTG 서열번호71: GTGCCCAGTTCTCAAAGGAGGATG
circTtc3 서열번호72: CATCTGCCAAACTGAGACCTCCCT 서열번호73: ATGCACTTAGCGATGGAAAGAGGGC
circSatb1 서열번호74: AGGCACTCCCTGCATCTTTCCAC 서열번호75: GCGTGCTAAAGTGTCCCAAGCAC
circTshz2-1 서열번호76: TGCTGCTCTGGTGTTGAGCAACG 서열번호77: AACGCACAGCAAGTCACCCGAAC
circTshz2-2 서열번호78: GGAGCCACTGTCTTCTTCTTCCTC 서열번호79: CTCACCTGGGCTTCCAAATGAAG
circMapk4 서열번호80: ACCCTTCAGAGGCTTCAGACGAGA 서열번호81: CTTCATCAGCACGGAGGACCTTGT
circSobp 서열번호82: GGCTTTCTCCATCCGTAGTGTAGC 서열번호83: TCTGCAGCGAGAAATGCTTTGCGG
circRims2-1 서열번호84: TGGTAATCTTGCTCCAGTCTGGG 서열번호85: CAAGAAGCGGCGATCTAGCATTG
circRims2-2 서열번호86: CTCTATGTGGATCCCATCCTGAGC 서열번호87: CAAGAAGCGGCGATCTAGCATTG
Rbfox3 서열번호88: GTAGCGGTCCATACCAGGAA 서열번호89: ATGCTAACTGAGGCTTGGGT
Chat 서열번호90: ACCTTCTGCATCTCCAGCTT 서열번호91: AGATTGCTTGGCTTGGTTGG
Map2 서열번호92: TTCCACCGAGCAGTCTTTCT 서열번호93: CCCAAGGTCTTGGAGGTCAT
Stx1a 서열번호94: TTTGTGGAGGTCATGTCCGA 서열번호95: AATTCCTCACTGGTCGTGGT
Syp 서열번호96: ACATGCAAGGAACTGAGGGA 서열번호97: CCAGGTTCAGGAAGCCAAAC
Tshz2 서열번호98: GCGGATGCAAATCTCCAAGT 서열번호99: GGTGCCCTTTGTCCATGTTT
Tshz2 Exon1-2 서열번호100: CGATGCCAAGGAGGAAACAG 서열번호101: TCTGTCCCAGTGTCATTGCT
Tshz2 Exon2-3 서열번호102: AAGGTGGAGCAGGAGATCTC 서열번호103: TGGCTTTCAGTCTCGTGTTG
Satb1 서열번호104: GGAGCAGCAAGTTTCCACAA 서열번호105: CGTGCAAATACTGCCTGTGA
Mapk4 서열번호106: GAGTGCTTCTCACTGTCCCT 서열번호107: ACTGAGCTGGGTCGGTTAAA
Sobp 서열번호108: CGCCACAAGGACCAATGTAG 서열번호109: CAGCAAACCACAGCAGTTCT
Rims2 서열번호110: CAAGAGCAGAAGGGTGATGC 서열번호111: TCCACATCGAGCACAGAACT
Gapdh 서열번호112: AATGTGTCCGTCGTGGATCT 서열번호113: AGACAACCTGGTCCTCAGTG
Rat
Name Forward sequence Reverse sequence
circTshz2-1 서열번호114: TGTCATTGCTGCCCTGGTGTTGA 서열번호115: AACGCACAGCAAGTCACCAGAAC
circTshz2-2 서열번호116: GAACCGCTGTCTTCGTCTTCCTC 서열번호117: CTCACCTGGGCTTCCAAATGAAG
Tshz2 서열번호118: CTCTGCCTCCAAGAAAGGGA 서열번호119: GGGAGTTACTCGACGGCTTA
Gapdh 서열번호120: CAAGGCTGAGAATGGGAAGC 서열번호121: GAAGACGCCAGTAGACTCCA
Human
Name Forward sequence Reverse sequence
circTshz2-1 서열번호122: TGCCACCCTGCAGTTGAGCTACT 서열번호123: AACGCACAGCAAGTCACCCGAAC
circTshz2-2 서열번호124: GTTGAGCTACTGAACCGCTGTCC 서열번호125: CTCACCTGGGTTTCCAAATGAAGG
Tshz2 서열번호126: CACCCGAACACCATTCACAG 서열번호127: CCAGGCTGGAAAGTGGAAAC
GAPDH 서열번호128: ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 서열번호129: GCCATCACGCCACAGTTTC
1.6. circRNA의 클로닝
circTshz2-2 과발현 벡터를 구축하기 위해 제한효소 부위(각각 PacI 및 SacII)를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 circTshz2-2의 서열을 증폭하였다. PCR 산물은 제조사의 지침에 따라 EZ-Fusion Cloning Kit(Enzynomics)를 사용하여 Jeremy Wilusz(Addgene plasmid #69893)의 gift인 pcDNA3.1(+) Laccase2 MCS Exon Vector에 삽입되었다. 프라이머 서열은 표 5에 기재했다.
The list of primer set for circTshz2-2 cloning
Template Name primer sequence
cDNA Forward1_F 서열번호130: ggtatgcccaggaggaagtc
Forward1_R 서열번호131: caccattctgggccttgttg
Forward2_F 서열번호132: cgtaaccacagccatcaacaag
Forward2_R 서열번호133: acttgaatttagagtctgtgtcctc
PCR product Fragment1 Tshz2-2-PacI-F 서열번호134: ttatGCAGAAATTAATTAAggtatgcccaggaggaagtcc
Forward1_R 서열번호135: caccattctgggccttgttg
PCR product Fragment2 Forward2_F 서열번호136: cgtaaccacagccatcaacaag
Tshz2-2-SacII-R 서열번호137: AATACTTACGCTCCGCGGacttgaatttagagtctgtgtcctc
The list of primer set for sequencing
Name primer sequence
pcDNA3.1 (+) Laccase2 MCS Exon vector-internal primer-R 서열번호138: actttacatggtcggaaatgc
Tshz2-2-internal primer-R1 서열번호139: gatgagaagatgctggggg
Tshz2-2-internal primer-F2 서열번호140: ctgactccaccacagggtc
Tshz2-2-internal primer-F1 서열번호141: ggcctcggcttcaagttatc
pcDNA3.1 (+) Laccase2 MCS Exon vector-internal primer-F 서열번호142: tcgactaggctttgatcctg
1.7. 세포 분획
미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포를 다음과 같이 핵 및 세포질 분획으로 분리하였다. 먼저 세포를 모아 완충액 A[10mM HEPES(pH 7.9, Thermo Scientific), 10mM KCl(Sigma Aldrich), 0.1mM EDTA(Sigma Aldrich), 1mM DTT(Sigma Aldrich)]로 처리한 후 다음과 같이 분획하였다. 얼음 위에서 25분 동안 배양한 후, 세포 현탁액에 10% Nonidet P-40(NP-40, Thermo Scientific)을 최종 농도 0.25%로 보충하고 추가로 2분 동안 배양했다. 그런 다음 이들 세포를 원심분리하고 TRIzol LS 시약(Invitrogen)을 사용하여 상등액으로부터 세포질 RNA를 분리했다. 펠릿을 K100 완충액 D[20mM Tris(pH 8.0, Thermo Scientific), 100mM KCl, 0.2mM EDTA]에 재현탁하고 원심분리하여 핵 RNA 분획을 생성했다. 전구체 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (pre-Gapdh) mRNA는 핵 분획에서 대조군으로 사용되었고 성숙한 Gapdh mRNA는 세포질 대조군으로 사용되었다.
1.8. RNA 시퀀싱
제조업체의 지침에 따라 TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 5일째에 음성 대조군 및 circTshz2-2-제거된 분화된 Neuro-2A 세포로부터 총 RNA를 분리했다. 그런 다음 DNase I(Takara)을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하여 잔류 DNA를 제거하고 RNA를 ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 정량화했다. RNA 무결성은 2100 Expert Bioanalyzer(Agilent)를 사용하여 확인했으며 Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit(Illumina)를 사용하여 rRNA를 제거했다. 그런 다음 TruSeq Stranded Total RNA Kit(Illumina)를 사용하여 RNA 시퀀싱 라이브러리를 구성한 다음 HiSeq 2500(Illumina)을 이용해 100개의 시퀀싱 사이클로 페어드 엔드 모드에서 시퀀싱했다.
그후 circTshz2-2 siRNA 2로 처리한 후 통계적으로 유의한 발현 변화를 보이는 유전자를 선택하기 위해 다음과 같은 방법을 이용했다. 간단히 말해서 FASTQ 읽기를 필터링하고 Trimmomatic으로 트리밍한 다음 두 방법 중 하나에 적용했다. 첫 번째 접근 방식에서 필터링된 판독값은 STAR 를 사용하여 마우스 게놈(mm10)에 정렬되었고 Cuffnorm은 FPKM(백만 매핑된 판독값)당 전사체의 킬로베이스당 단편을 계산하는 데 사용되었다. 그런 다음 unpaired two-tailed t-검정을 사용하여 유의하게 변화된 유전자를 선택하였다. 두 번째 접근 방식에서는 필터링된 판독값을 Salmon quantifier에 의한 전사체 정량화에 사용하고 edgeR을 사용하여 발현 변화의 p-값을 계산했다. 그런 다음 평균 p-값이 있는 각 접근 방식에서 유의하게 변화된 유전자를 선택했다. 평균 p-값은 모두 0.05 미만이었다. 그런 다음 이들 유전자를 다시 필터링하여 발현의 log2 변화가 0.5보다 크거나 -0.5보다 작은 유전자를 얻었다.
1.9. 생물정보학 분석
본 연구에 사용된 게놈 정보는 UCSC Genome Browser(https://genome.ucsc.edu/)에서 마우스(GRCm38/mm10) 및 인간(GRCh37/hg19) 게놈 데이터에서 얻었다. YY1 바인딩 시퀀스는 ENCODE Candidate Cis-Regulatory Elements(cCRE)의 공개 데이터를 사용하여 식별되었다; 엑손 4(기탁: EM10E0705371) 및 엑손 6(기탁: EM10E0705372)의 Bdnf 프로모터-유사 서명(PLS).
인간 TSHZ2의 조직 분포는 NIH Genotype-Tissue Expression(GTEx) 프로젝트(Release V8)(https://gtexportal.org/)에서 얻었다. 마우스 해마 발달 및 성인 뇌 발달 동안 circTshz2-2의 발현 수준은 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터 세트(기탁: GSE61991)의 공개 RNA-seq 데이터를 사용하여 분석되었다.
Gene Ontology Resource(http://geneontology.org/)는 RNA-seq 데이터에서 선택된 유전자의 유전자 온톨로지(GO) 분석에 사용되었다. circTshz2-2 녹다운에 대한 반응으로 차등적으로 발현된 200개의 유전자 중 169개는 단백질 코딩 유전자였으며 "biological process" 용어를 선택하여 분석했다. 그런 다음 PANTHER 분류 시스템과 Fisher의 정확한 테스트를 사용하여 유전자 목록을 평가한 다음 FDR(False Discover Rate)을 계산했다. 상위 10개 목록은 FDR에 의해 결정된 중요도 순으로 선택되었으며 표 7에 기재하였다.
Mus musculus (REF)
GO biological process complete # of genes # of genes (input) expected Fold Enrichment raw P value FDR
cell cycle 1204 46 8.71 5.28 8.89E-21 1.41E-16
cell cycle process 801 38 5.79 6.56 3.97E-20 3.15E-16
mitotic cell cycle 536 32 3.88 8.26 9.64E-20 5.11E-16
mitotic cell cycle process 464 30 3.36 8.94 1.92E-19 7.60E-16
cell division 486 30 3.51 8.54 6.48E-19 2.06E-15
chromosome segregation 268 19 1.94 9.8 2.71E-13 7.18E-10
sister chromatid segregation 128 14 0.93 15.13 1.98E-12 3.93E-09
mitotic sister chromatid segregation 101 13 0.73 17.8 1.91E-12 4.34E-09
kinetochore organization 17 8 0.12 65.08 5.77E-12 1.02E-08
mitotic nuclear division 147 14 1.06 13.17 1.11E-11 1.76E-08
regulation of cell cycle 959 30 6.93 4.33 1.87E-11 2.69E-08
regulation of chromosome segregation 103 12 0.74 16.11 4.04E-11 5.35E-08
nuclear division 286 17 2.07 8.22 7.12E-11 8.07E-08
regulation of cell cycle process 582 23 4.21 5.47 7.10E-11 8.68E-08
nuclear chromosome segregation 210 15 1.52 9.88 8.92E-11 9.44E-08
spindle organization 148 13 1.07 12.15 1.57E-10 1.56E-07
microtubule cytoskeleton organization 506 21 3.66 5.74 2.18E-10 2.04E-07
organelle fission 320 17 2.31 7.35 3.69E-10 3.26E-07
microtubule cytoskeleton organization involved in mitosis 115 11 0.83 13.23 1.85E-09 1.54E-06
spindle assembly 92 10 0.67 15.03 3.32E-09 2.63E-06
organelle organization 3116 52 22.53 2.31 3.84E-09 2.90E-06
regulation of mitotic cell cycle 495 19 3.58 5.31 5.74E-09 4.15E-06
microtubule-based process 694 22 5.02 4.38 9.73E-09 6.72E-06
regulation of sister chromatid segregation 82 9 0.59 15.18 1.92E-08 1.27E-05
regulation of mitotic sister chromatid separation 58 8 0.42 19.07 2.39E-08 1.46E-05
chromosome organization 935 25 6.76 3.7 2.34E-08 1.48E-05
cell communication 5230 11 37.82 0.29 3.35E-08 1.97E-05
regulation of mitotic nuclear division 157 11 1.14 9.69 3.79E-08 2.15E-05
regulation of chromosome separation 63 8 0.46 17.56 4.30E-08 2.35E-05
cell cycle phase transition 160 11 1.16 9.51 4.55E-08 2.41E-05
cellular component organization 5084 68 36.76 1.85 4.95E-08 2.46E-05
cytoskeleton-dependent cytokinesis 92 9 0.67 13.53 4.81E-08 2.46E-05
mitotic cytokinesis 66 8 0.48 16.76 5.98E-08 2.88E-05
positive regulation of cell cycle process 252 13 1.82 7.13 6.59E-08 3.08E-05
cytokinesis 98 9 0.71 12.7 7.96E-08 3.51E-05
regulation of mitotic sister chromatid segregation 69 8 0.5 16.03 8.19E-08 3.52E-05
centromere complex assembly 25 6 0.18 33.19 7.91E-08 3.59E-05
kinetochore assembly 12 5 0.09 57.62 1.03E-07 4.32E-05
cellular component organization or biogenesis 5282 69 38.19 1.81 1.18E-07 4.69E-05
negative regulation of mitotic sister chromatid separation 27 6 0.2 30.73 1.18E-07 4.79E-05
negative regulation of chromosome separation 28 6 0.2 29.63 1.42E-07 5.50E-05
signal transduction 4795 10 34.67 0.29 1.89E-07 7.14E-05
negative regulation of mitotic sister chromatid segregation 30 6 0.22 27.66 2.03E-07 7.34E-05
regulation of nuclear division 187 11 1.35 8.13 2.02E-07 7.47E-05
signaling 5124 12 37.05 0.32 2.49E-07 8.60E-05
mitotic cell cycle phase transition 150 10 1.08 9.22 2.48E-07 8.76E-05
regulation of mitotic metaphase/anaphase transition 54 7 0.39 17.93 2.72E-07 9.18E-05
negative regulation of sister chromatid segregation 32 6 0.23 25.93 2.85E-07 9.42E-05
spindle assembly involved in female meiosis I 5 4 0.04 > 100 3.14E-07 1.02E-04
regulation of metaphase/anaphase transition of cell cycle 56 7 0.4 17.29 3.40E-07 1.08E-04
negative regulation of chromosome segregation 34 6 0.25 24.4 3.91E-07 1.22E-04
positive regulation of cell cycle 355 14 2.57 5.45 4.73E-07 1.45E-04
spindle assembly involved in female meiosis 6 4 0.04 92.19 5.20E-07 1.56E-04
cellular component biogenesis 2242 38 16.21 2.34 6.07E-07 1.79E-04
negative regulation of mitotic nuclear division 41 6 0.3 20.24 1.05E-06 3.03E-04
cellular component assembly 2013 35 14.56 2.4 1.21E-06 3.42E-04
cytoskeleton organization 1099 24 7.95 3.02 1.65E-06 4.59E-04
establishment of spindle localization 45 6 0.33 18.44 1.72E-06 4.71E-04
regulation of cell cycle phase transition 292 12 2.11 5.68 2.14E-06 5.75E-04
cell cycle G2/M phase transition 48 6 0.35 17.29 2.42E-06 6.31E-04
spindle assembly involved in meiosis 10 4 0.07 55.32 2.42E-06 6.41E-04
negative regulation of mitotic metaphase/anaphase transition 26 5 0.19 26.59 2.62E-06 6.71E-04
spindle localization 50 6 0.36 16.6 3.01E-06 7.59E-04
negative regulation of metaphase/anaphase transition of cell cycle 27 5 0.2 25.61 3.09E-06 7.65E-04
female meiosis I 11 4 0.08 50.29 3.28E-06 8.02E-04
negative regulation of nuclear division 51 6 0.37 16.27 3.34E-06 8.04E-04
regulation of chromosome organization 365 13 2.64 4.93 3.64E-06 8.62E-04
regulation of mitotic cell cycle phase transition 259 11 1.87 5.87 4.25E-06 9.93E-04
protein-containing complex assembly 1010 22 7.3 3.01 4.87E-06 1.11E-03
mitotic spindle organization 86 7 0.62 11.26 4.87E-06 1.12E-03
positive regulation of mitotic cell cycle 168 9 1.21 7.41 5.53E-06 1.24E-03
regulation of attachment of spindle microtubules to kinetochore 13 4 0.09 42.55 5.66E-06 1.25E-03
cellular nitrogen compound metabolic process 2789 41 20.17 2.03 7.58E-06 1.65E-03
meiotic cell cycle process 176 9 1.27 7.07 7.92E-06 1.70E-03
organelle assembly 666 17 4.82 3.53 8.92E-06 1.89E-03
establishment of mitotic spindle localization 35 5 0.25 19.76 9.62E-06 2.01E-03
meiotic cell cycle 288 11 2.08 5.28 1.12E-05 2.30E-03
nucleic acid metabolic process 1760 30 12.73 2.36 1.18E-05 2.40E-03
establishment of spindle orientation 37 5 0.27 18.69 1.23E-05 2.47E-03
heterocycle metabolic process 2327 36 16.83 2.14 1.28E-05 2.53E-03
cellular process 15074 134 109 1.23 1.30E-05 2.55E-03
meiotic spindle organization 19 4 0.14 29.11 2.04E-05 3.95E-03
protein localization to chromosome, centromeric region 20 4 0.14 27.66 2.43E-05 4.65E-03
nucleobase-containing compound metabolic process 2187 34 15.81 2.15 2.49E-05 4.71E-03
mitotic spindle elongation 6 3 0.04 69.15 2.96E-05 5.39E-03
positive regulation of nuclease activity 6 3 0.04 69.15 2.96E-05 5.46E-03
mitotic spindle midzone assembly 6 3 0.04 69.15 2.96E-05 5.52E-03
meiotic nuclear division 161 8 1.16 6.87 3.11E-05 5.61E-03
G protein-coupled receptor signaling pathway 1820 1 13.16 0.08 3.19E-05 5.62E-03
cellular aromatic compound metabolic process 2401 36 17.36 2.07 3.15E-05 5.62E-03
protein-containing complex subunit organization 1146 22 8.29 2.65 3.31E-05 5.78E-03
establishment of organelle localization 329 11 2.38 4.62 3.65E-05 6.30E-03
cellular protein-containing complex assembly 671 16 4.85 3.3 3.71E-05 6.33E-03
spindle elongation 7 3 0.05 59.27 4.20E-05 7.10E-03
spindle assembly checkpoint 24 4 0.17 23.05 4.58E-05 7.58E-03
mitotic spindle assembly checkpoint 24 4 0.17 23.05 4.58E-05 7.66E-03
spindle checkpoint 26 4 0.19 21.28 6.06E-05 9.82E-03
mitotic spindle checkpoint 26 4 0.19 21.28 6.06E-05 9.93E-03
organic cyclic compound metabolic process 2613 37 18.89 1.96 6.48E-05 1.04E-02
protein-DNA complex assembly 133 7 0.96 7.28 6.97E-05 1.10E-02
negative regulation of chromosome organization 133 7 0.96 7.28 6.97E-05 1.11E-02
spindle midzone assembly 9 3 0.07 46.1 7.62E-05 1.19E-02
negative regulation of cell cycle phase transition 142 7 1.03 6.82 1.03E-04 1.59E-02
organic substance biosynthetic process 2079 31 15.03 2.06 1.09E-04 1.67E-02
establishment of mitotic spindle orientation 31 4 0.22 17.84 1.13E-04 1.70E-02
cytochrome complex assembly 34 4 0.25 16.27 1.56E-04 2.34E-02
negative regulation of cell cycle process 206 8 1.49 5.37 1.62E-04 2.34E-02
RNA splicing, via transesterification reactions 206 8 1.49 5.37 1.62E-04 2.37E-02
RNA splicing, via transesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile 206 8 1.49 5.37 1.62E-04 2.39E-02
mRNA splicing, via spliceosome 206 8 1.49 5.37 1.62E-04 2.41E-02
cytokinetic process 36 4 0.26 15.37 1.91E-04 2.74E-02
organelle localization 473 12 3.42 3.51 2.07E-04 2.94E-02
protein localization to kinetochore 14 3 0.1 29.63 2.29E-04 3.14E-02
chromosome localization 72 5 0.52 9.6 2.33E-04 3.14E-02
mitotic chromosome condensation 14 3 0.1 29.63 2.29E-04 3.17E-02
establishment of chromosome localization 72 5 0.52 9.6 2.33E-04 3.17E-02
regulation of organelle organization 1282 22 9.27 2.37 2.28E-04 3.17E-02
biosynthetic process 2141 31 15.48 2 2.27E-04 3.18E-02
cellular biosynthetic process 1976 29 14.29 2.03 2.46E-04 3.28E-02
female meiotic nuclear division 39 4 0.28 14.18 2.54E-04 3.33E-02
meiosis I 116 6 0.84 7.15 2.54E-04 3.36E-02
DNA metabolic process 636 14 4.6 3.04 2.59E-04 3.36E-02
negative regulation of mitotic cell cycle 222 8 1.61 4.98 2.65E-04 3.42E-02
meiosis I cell cycle process 118 6 0.85 7.03 2.77E-04 3.52E-02
mitotic cell cycle checkpoint 118 6 0.85 7.03 2.77E-04 3.55E-02
sensory perception of chemical stimulus 1212 0 8.76 < 0.01 2.90E-04 3.66E-02
regulation of macromolecule metabolic process 5802 63 41.95 1.5 2.95E-04 3.69E-02
G2/MI transition of meiotic cell cycle 2 2 0.01 > 100 3.04E-04 3.75E-02
meiotic cell cycle phase transition 2 2 0.01 > 100 3.04E-04 3.78E-02
macromolecule biosynthetic process 1213 21 8.77 2.39 3.16E-04 3.86E-02
positive regulation of nuclear division 78 5 0.56 8.86 3.31E-04 3.99E-02
chromosome condensation 42 4 0.3 13.17 3.30E-04 4.00E-02
regulation of cytokinesis 80 5 0.58 8.64 3.70E-04 4.42E-02
protein-DNA complex subunit organization 177 7 1.28 5.47 3.77E-04 4.46E-02
mitochondrial respiratory chain complex assembly 81 5 0.59 8.54 3.91E-04 4.53E-02
G2/M transition of mitotic cell cycle 44 4 0.32 12.57 3.89E-04 4.55E-02
그리고 BART(http://bartweb.org/)와 ChEA3(https://maayanlab.cloud/chea3/) 시스템을 모두 사용하여 circTshz2-2 매개 Bdnf 조절과 관련된 전사 인자와 염색질 조절자를 식별했다. 그런 다음 circTshz2-2 녹다운으로 인해 차등적으로 발현되는 RNA-seq 데이터에서 식별된 유전자 목록을 BART tool의 input으로 사용하고 Irwin-Hall p-값을 기반으로 상위 10개 요인을 선택했다. 동일한 목록이 ChEA3 tool에서 사용되었으며 통합 척도 순위를 기반으로 한 상위 10개 요인이 선택되었다. 이러한 전사 인자는 표 7에 나열되어 있다.
그런 다음 RPIseq(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/)를 사용하여 circTshz2-2와 특정 전사 조절자 사이의 상호작용 확률을 예측했다. circTshz2-2와 전사 조절자 서열이 input으로 사용되었으며 RF(Random Forest) 및 SVM(Support Vector Machine) 분류기를 사용하여 예측한 상호 작용 확률의 점수(범위 0~1)를 그림에서 그래프를 그리는 값으로 사용했다. 이러한 시퀀스, 정보 및 예측된 상호 작용 점수는 표 7에 기재했다.
1.10. RNA 분리 및 PCR
총 RNA는 제조사의 지침에 따라 TRIzol Reagent(Ambion)를 사용하여 분리되었다. 이 RNA는 NanoPhotometer(IMPLEN)를 사용하여 정량화되었고 무작위 6량체(Thermo Fisher Scientific) 및 RevertAid 역전사효소(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)로 역전사 되었다. 그런 다음 Master cycler Nexus X2(Eppendorf)에서 nTaq DNA 중합효소(Thermo Scientific)를 사용하여 반정량적 PCR을 수행했으며 이 PCR 결과는 1.5% 아가로스 겔 전기영동 및 국립보건원(National institute of Health, NIH)에서 제공한 Image J를 사용하여 평가되었다. circRNA 또는 mRNA의 발현은 Gapdh의 발현에 대해 정규화되었으며 프라이머 서열은 표 2에 기재하였다.
Power SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems) 및 Step One Plus real-time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 동일한 cDNA에서 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR)을 수행했다. 유전자 발현은 Gapdh에 대해 정규화되었고 상대 발현 수준은 2-(ΔΔCt) 계산 방법을 사용하여 분석되었다. 이러한 프라이머 서열은 표 2에 기재하였다.
1.11. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯 분석은 이전에 보고된 대로 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 단백질(15-25μg)을 8-12% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 다음, 이를 무수 메탄올(Thermo Fisher Scientific)에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF; Merck Millipore) 막으로 옮겼다. 그런 다음 이러한 막을 차단 용액[5% 소 혈청 알부민(BSA; GenDEPOT) 및 탈지유(BD Bioscience)에서 각각 인산화 및 천연 형태의 단백질 검출을 용이하게 함]에서 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그런 다음 이 막을 적절한 1차 항체(1:1000)와 함께 4C에서 밤새 배양했다. 이러한 1차 항체에는 SYP(Abcam, ab32127), PSD-95(Abcam, ab18258), Cyclin B2(Santa Cruz, sc-28303), p-CDK1-Y15(Santa Cruz, sc-136014), CDK1(Santa Cruz, sc-54), BDNF(Abcam, ab108313) 및 베타-액틴(Cell 신호 전달, 4970)이 포함된다. 적절한 교자무과산화효소(HRP) 표지된 이차 항체(1:5000; Santa Cruz)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한한 후, 막을 ECL 용액(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하고 Fusion Solo(Vilber)를 사용하여 시각화했다. 단백질 발현은 NIH에서 제공되는 Image J 소프트웨어(V1.53c)를 사용하여 측정되었고 베타-액틴에 대해 정규화되었다.
1.12. 신경돌기 길이 및 Sholl 분석
2차 가지의 수, 신경돌기와 동심원 사이의 교차점 수. 체세포의 신경돌기 수와 2차 가지 수는 길이가 1μm보다 클 때만 측정되었다.
선택된 1차 뉴런의 형태는 수동 추적 방법을 사용하여 재구성되었으며 그룹당 10개 이상의 뉴런이 선택되고 블라인드 방식으로 분석되었다. Image J 소프트웨어 10의 Sholl 분석 플러그인을 사용하여 뾰족한 도구를 사용하여 소마 센터를 선택하고 5 μm 스텝 크기로 10 μm와 600 μm 사이의 반지름에서 교차점 수 및 총 뉴라이트 길이와 같은 크기 관련 파라미터를 정량화하는 데 사용했다. 반지름당 샘플 수는 3개로 설정하고 다항식 적합도를 '가장 적합한 정도'로 선택하였다. 그런 다음 Sholl 프로필 목록의 교차 열에서 데이터를 선택하고 결합했다.
1.13. 세포주기 분석
Neuro-2A 세포를 1X PBS로 세척하고 얼음처럼 차가운 70% 에탄올(Thermo Fisher Scientific)에서 30분 동안 고정했다. 고정된 세포를 원심분리하고 1X PBS로 3회 세척한 후 37℃에서 30분 동안 50μl RNase A(100ug/ml; Sigma Aldrich)로 처리했다. 그런 다음 이 세포를 요오드화 프로피디움 400μl(50μg/ml PI; Sigma Aldrich)로 처리한 다음 실온에서 30분 동안 배양한 후 유세포 분석에 사용했다. 세포는 FACSDiva 소프트웨어와 FACSCanto II 세포 분석기(BD bioscience)를 사용하여 498 nm에서 여기 및 578 nm에서 방출(피코에리트린, PE)을 사용하여 분석했다. FlowJoTM 소프트웨어(v10.7.1)의 Watson(Pragmatic) 모델을 사용하여 세포 주기 단계 분포를 분석했다.
1.14. 면역형광
Neuro-2A 세포를 2% 파라포름알데히드(Sigma Aldrich)에 15분 동안 고정한 다음 1차 베타-튜블린 및 감마-튜블린 항체(세포 신호 전달)를 포함하는 gelatin blocking buffer[0.1% 젤라틴 (Sigma Aldrich), 0.3% Triton X-100(Thermo Scientific), 16mM 인산나트륨(Sigma Aldrich), 450mM NaCl(Sigma Aldrich), pH 7.4]에서 4℃로 밤새 배양하였다. 그런 다음 세포를 1X PBS에서 3회 헹구고 Alexa 488-접합된 항-마우스 및 Alexa 594-접합된 항-토끼 항체(Invitrogen)와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했다. 세포를 대조염색하고 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Thermo Scientific)을 포함하는 봉입제를 사용하여 5분 동안 봉입하고 Eclipse Ts2 형광 현미경(Nikon)을 사용하여 이미지를 얻었다.
1.15. RNA 결합 단백질 면역 침전
circTshz2-2에 결합된 단백질의 정체를 확인하기 위해 RNA-결합 단백질 면역침전법(RNA-IP)을 사용했다. 이러한 평가는 제조업체의 지침에 따라 Magna RIP 키트(Millipore)를 사용하여 완료되었다. 간단히 말해서, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 및 RNase 억제제를 함유하는 RIP 용해 완충액에서 용해시킨 다음 원심분리 하였다. 그런 다음 세포 용해물은 밤새 4℃에서 항체 접합 자기 비드와 함께 배양되었으며, 이 비드들은 YY1(Santa Cruz, sc-7341), CtBP(Santa Cruz, sc-17759), CtIP(Santa Cruz, sc- 271339) 및 SUZ12(Santa Cruz, sc-271325)에 대한 1차 항체로 처리되었다. 그 다음 면역침전물을 55℃에서 30분 동안 10% SDS를 포함하는 프로테이나제 K 완충액에서 배양하면서 단백질을 소화시키고, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(125:24:1, Thermo Fisher Scientific) 및 클로로포름( Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, 에탄올로 침전시켰다. 정제된 RNA를 역전사하고 semi-quantitative PCR을 수행하였다.
1.16. 삼투 펌프 이식
10주 된 수컷, 야생형 C57BL/6J 및 비만 C57BL/6J-ob/ob 마우스를 0.3mg/g(체중)의 2,2,2-트리브로모에탄올/2-메틸-2-부탄올(Sigma)로 복강내 주사 마취했으며, 마취 기구 및 마스크(Harvard Apparatus)를 사용하여 혼합 공기와 함께 1-2% 이소플루레인을 유지하였다. 마우스 체온을 유지하기 위해 항온 담요(Harvard Apparatus) 위에 놓았다. 뇌 주입 키트와 삼투압 펌프(Alzet)는 siPORT-NeoFX(Invitrogen)가 함유된 100 ul 용액과 circkTShz2-2용 독립 siRNA 2개를 최종 5 μM 농도로 채우고 단단히 조립했다. 조립체를 37℃에서 16시간 동안 멸균식염수로 배양한 뒤 stereotaxic instrument(Harvard Apparatus)를 사용해 3일간 마우스 뇌의 외측내실(mediolateral 1.0mm, anteroposterior 0.3mm, dorsoventral 2.5mm)에 주입했다.
1.17. T-maze 자발적 교대 테스트
T-maze는 3개의 팔(35x9x15cm)이 있는 흰색 플라스틱 벽을 사용하여 구성되었다. 마우스는 초기 시험 전에 하루에 5분 동안 적응시켰다. 각 마우스는 머리가 시작 팔의 막다른 쪽 끝을 향하도록 하고 5분의 테스트 기간 동안 T-maze의 3개 팔에서 자유롭게 움직일 수 있다. 한 팔에 4개의 발이 들어가는 것을 팔 입장으로 정의했다. 각 마우스의 움직임은 디지털 카메라를 사용하여 기록되었다. 각 기록은 Image J(V1.53c) 플러그인, Animal Tracker 14를 사용하여 마우스 움직임을 추적하는 이미지 시퀀스로 변환되었다. 각 마우스의 총 거리, 속도 및 부동 시간은 운동 활동의 매개변수로 추출되었다. 교대는 겹치는 삼중 세트에서 세 가지 다른 팔에 돌아가면서 들어가는 것으로 정의되었다. 자발적 교대 비율을 다음과 같이 계산했다. [{(교체 횟수) / (총 팔 입장횟수 - 2)} x 100)].
1.18 통계 분석
데이터는 히스토그램에 따라 평균, 로그 값, 평균이 있는 최소에서 최대 또는 평균 ± SEM으로 표시된다. 실험 샘플은 무작위로 대조군 또는 실험 그룹으로 할당되었고, 조사자는 실험 조건에 대해 블라인드 상태였으며, 분석을 위해 제외된 샘플은 없었다. 그룹 샘플 크기는 일반적으로 통계 테스트의 효율성과 파워를 최적화하기 위해 시험관 내 실험의 경우 3개, 생체 내 실험의 경우 5개로 설정되었다. 통계적 검정 전에 데이터의 각 비교군 내 정규분포 및 유사분산을 확인하였다. Welch's correction이 있는 unpaired two-tailed t-test와 일반 양방향 ANOVA를 사용하여 대조군과 실험 샘플 간의 비교를 분석했으며 p-값이 0.05 미만일 때 통계적 유의성이 확립되었다.
2. 결과
2.1. 뉴런에서 특이적으로 발현되는 비만 관련 circRNA의 동정
신경 기능에서 비만 관련 circRNA의 역할을 조사하기 위해 BV-2 소교세포 또는 C8-D1a 성상세포가 아닌 Neuro-2A 신경 기원 세포에서 특이적으로 발현되는 circRNA를 확인했다(도 7). 우리는 15개의 circRNA를 스크리닝했으며 그 중 9개는 Neuro-2A 세포에서 특이적으로 발현되었다(circTtc3, circZbtb20, circSatb1, circTshz2-1, circTshz2-2, circMapk4, circSobp, circRims2-1 및 circRims2-2). circSorl1만이 BV-2 소교세포에서 독특하게 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 나머지 circRNA는 주로 C8-D1a 성상세포에서 발현되었다(circMpped1, circP1ekha5-1, circArhgap5, circUbe2k 및 circTmem44). 즉 이러한 비만 관련 circRNA는 뇌를 구성하는 다양한 세포 유형에서 차별적인 발현을 보임을 확인했다.
2.2. 분화된 뉴런에서 circTshz2-1 및 circTshz2-2의 발현이 증가
Neuro-2A 세포에서 레티노산 유도 분화에 대한 반응으로 차등 발현을 겪는 이러한 뉴런 특이적 circRNA의 하위 집합을 선별했다. 분화(Rbfox3, Chat, Map2) 및 시냅스 소포 성숙(Stx1a 및 Syp)과 관련된 유전자의 발현을 신경 분화의 마커로 사용하였다. 이 마커 유전자의 발현은 1일째의 미분화 세포보다 3일째의 분화된 세포에서 더 높았다(도 8). 또한, 여러 circRNA의 발현은 신경 분화 3일 동안 꾸준히 증가했다(circTshz2-1, circTshz2-2, circSatb1, circTtc3 및 circRims2-1, 도 9의 A). 이들 circRNA의 숙주 유전자에서 분화 동안 Tshz2 및 Satb1의 발현만이 증가하였고, 이러한 증가는 각각의 circRNA에서의 발현 패턴을 반영하였다. circTtc3에 대한 숙주 유전자는 이 분석에서 평가된 어떤 세포에서도 검출되지 않았으며 평가된 circRNA에서 circTshz2-1 및 circTshz2-2만이 분화 3일 후에 발현이 더 증가하는 것으로 나타났다(도 9의 B).
2.3. circTshz2-1 및 circTshz2-2의 특성화 및 보존
Tshz2 발현의 조직 분포를 분석하기 위해 공개적으로 사용 가능한 인간 GTEx RNA-seq 데이터를 조사했다. 인간 Tshz2는 모든 조직에서 발현되며(도 10), 피질, 시상하부 및 척수 전반에 걸쳐 광범위하게 발현되어 뇌에서도 중요한 기능이 있음을 나타냈다. 그리고 뉴런에서 Tshz2의 다양한 동형을 평가하고 이 정보를 사용하여 circTshz2-1 및 circTshz2-2 전사체의 게놈 유전자좌와 기원을 확인했다. UCSC Genome Browser는 마우스에서 3개의 Tshz2 isoform을 식별했다. 더 긴 엑손 2(isoform 1) 또는 더 짧은 엑손 2(isoform 2)를 포함하는 3개의 엑손이 있는 2개의 전사체 및 2개의 엑손(isoform 3)이 있는 전사체(도 1a). 또한, 우리의 이전 RNA-seq 데이터는 circTshz2의 두 가지 동형을 식별했다(circTshz2-1 및 circTshz2-2). Sanger sequemcimg 분석을 사용하여 circTshz2-1 및 circTshz2-2가 Tshz2 isoform 1 또는 2에서 각각 엑손 2의 백 스플라이싱으로 인해 생성되었음을 발견했다(도 1a).
그 후, Tshz2 isoforms 1과 2의 발현을 확인하기 위해 두 세트의 프라이머를 설계하였고 적절한 크기의 전사체를 확인했다(도 11의 A, B). 또한, Tshz2 isoforms 1과 2의 발현이 해당 circRNA와 유사한 발현 패턴을 나타내는 분화된 뉴런에서도 증가한다는 것을 관찰했다(도 11의 C). 태반 이 있는 포유동물의 전사 보존은 PhastCons 및 PhyloP를 사용하여 평가되었으며, 이는 circTshz2-1 및 circTshz2-2를 생성하는 Tshz2의 엑손 2 isoform이 광범위한 종에 걸쳐 잘 보존됨(>96%)을 보여준다(도 1a 및 도 12). 이것은 쥐의 일차 피질 뉴런(도 13의 A)과 인간 SHSY5Y 뉴런 세포(도 13의 B)에서 circTshz2-1과 circTshz2-2 모두에 대한 발현 평가에서 확인되었다. 또한 circTshz2-2 발현이 성숙한 쥐의 1 차 피질 뉴런과 분화된 SH-SY5Y 세포에서 시간이 경과함에 따라 증가한다는 것을 확인했다 (도 13). 또한 공개 GEO 데이터 세트에서 해마의 배아 발달 및 성인 뇌 발달 중에 circTshz2-2 발현도 증가한다는 것을 발견했다(도 13의 C). 그러나 circTshz2-1의 발현은 쥐 피질 뉴런의 분화 동안 변화를 나타내지 않았다(도 13의 A). 이를 통해 다른 종의 신경 조직에서 circTshz2-2의 발현 패턴과 기능이 circTshz2-1의 발현 패턴과 기능보다 더 잘 보존되어 있음을 알 수 있다.
그리고 circTshz2-1, circTshz2-2 및 Tshz2의 세포내 위치를 평가하기 위해 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포에서 핵 및 세포질 분획을 분리했다. circTshz2-1과 circTshz2-2는 모두 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포의 세포질 분획에서 약간 더 우세했다(도 14). Tshz2의 모든 isoform은 세포질보다 핵에서 더 널리 퍼졌다.
2.4. CircTshz2-2의 신경돌기 신장과 신경 복잡(neural complexity)성 조절
신경 기능에서 circTshz2-2의 역할을 조사하기 위해, 엑손 2의 5' 및 3' 말단에 각각 적어도 7개의 염기쌍이 포함된 circTshz2-2의 백 스플라이싱 접합부를 포괄하는, 두 개의 siRNA를 설계했다(도 15의 A). 분화된 Neuro-2A 세포는 이러한 각각의 독립적인 siRNA로 형질감염되었으며 circTshz2-1 및 Tshz2 숙주 유전자의 발현에 영향을 미치지 않고 상당한 정도의 circTshz2-2 하향 조절(~80%)을 보이는 것으로 나타났다(도 15의 B). circTshz2-2 발현의 억제는 대조군 siRNA로 처리된 세포와 비교하여 분화된 세포에서 신경돌기 길이를 향상시켰지만 이러한 샘플에서 체세포의 신경돌기 수 또는 이차 분지 정도에 영향을 미치지 않았다(도 1b 및 도 15의 C). 또한, circTshz2-2를 생성하기 위해 과발현 벡터를 구성했다. 분화된 세포는 이 플라스미드로 형질감염되었고 circTshz2-2 발현의 유의한 증가가 확인되었다(도 15의 D). 우리는 대조군 벡터 처리 세포보다 circTshz2-2가 과발현된 분화 세포에서 유의하게 더 짧은 신경돌기를 관찰했다(도 15의 E). 따라서 이러한 결과는 circTshz2-2가 신경돌기 신장을 조절함을 나타낸다.
circTshz2-2 녹다운에 따른 신경 복잡성(neural complexity) 및 네트워크의 변화를 조사하기 위해 마우스 1차 피질 뉴런을 배양하고 2개의 독립적인 siRNA 및 GFP 플라스미드로 형질감염시켰다. 이들 세포에서 circTshz2-1 또는 Tshz2 숙주 유전자 발현의 변화 없이 circTshz2-2의 유의한 억제(~60%)를 관찰했다(도 15의 F). CircTshz2-2 억제는 마우스 1차 피질 뉴런에서 음성 대조군에 비해 신경돌기 신장을 약 2배 촉진했다(도 1c). 그런 다음 1 차 피질 뉴런을 재구성하고 Sholl 분석 방법을 사용하여 신경 돌기 복잡성을 분석했다 (도 15의 G). CircTshz2-2 녹다운은 마우스 1차 피질 뉴런에서 체세포로부터의 신경돌기의 수(도 1d)와 교차점의 수(도 1 e)를 유의하게 증가시켰다. Sholl 분석에서 동심 고리와 신경돌기 사이의 교차점도 체세포에서 5~35마이크로미터 거리에서 크게 증가했다. 또한 체세포에서 100~380마이크로미터 거리에서 교차점의 현저한 증가가 있었으며, 이는 circTshz2-2 발현의 억제가 이들 세포의 신경돌기 신장과 복잡성을 향상시켰음을 나타낸다. 또한 pre-synapse와 관련된 단백질(Synaptophysin, SYP)과 시냅스 형성의 척도인 post-synapse(postsynaptic density 단백질 95 kDa, PSD-95)는 음성 대조군과 비교하여 1차 피질 뉴런에서 circTshz2-2 녹다운 후 모두 증가했다(도 1f). 즉, circTshz2-2가 시냅스 단백질의 발현을 증가시켜 신경망 복잡성을 조절하였고, circTshz2-2가 뉴런의 신경돌기 신장 및 복잡성을 조절함을 알았다.
2.5. CircTshz2-2로 인한 세포 주기 및 신경 기능과 관련된 유전자의 발현 변화.
분화된 Neuro-2A 세포에서 circTshz2-2 기능의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 RNA-seq를 사용하여 circTshz2-2 발현의 변화에 대한 전사체 변화를 분석했다. 2개의 독립적인 circTshz2-2 siRNA에 의해 변화된 통계적으로 유의한 유전자를 선택하기 위해 2개의 독립적인 알고리즘을 사용하여 전사체를 분석했다. circTshz2-2 억제 후 57개의 상향 조절된 유전자와 143개의 하향 조절된 유전자를 확인했다(도 2a). 이 유전자 중 169개는 단백질 코딩 유전자인 것으로 나타났으며(도 16), 이들은 유전자 온톨로지(GO)를 사용하여 일반적인 기능 경로를 식별하기 위해 평가되었다. 생물학적 기능의 상위 10개 GO 용어는 전적으로 세포 주기 및 분열 과정과 관련되어(그림 2B), circTshz2-2의 주요 기능이 세포 주기의 조절과 관련될 수 있음을 시사한다. 세포 주기 과정에 속하는 모든 유전자는 RNA-seq 데이터 세트에서 circTshz2-2 녹다운에 따라 유의하게 하향 조절되었다(도 2c). 세포주기에 관여하는 유전자 외에도 일부 조절 장애 유전자가 분화, 발달 및 시냅스 가소성과 같은 신경 기능과 관련되어 있음을 발견했다 (도 2d). 이는 circTshz2-2가 다양한 신경 기능 조절에 중요한 역할을 함을 나타낸다. 그런 다음 qRT-PCR 분석을 사용하여 circTshz2-2 감소 세포에서 세포 주기 체크포인트(Cdk1, Ccnb2, Ccnb3, Cks1b) 및 염색체 분리(Arpp19 및 Smc4)와 관련된 유전자의 하향 조절을 확인했다(도 2e). 그리고 RNA-seq 분석에서 확인된 분화(B2m, Fbxl17, Pcp4, Prdm8, Wnt3), 발달(Bhlhe41 및 Hecw2), 시냅스 가소성(Plcl1 및 Prkar2a)과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 확인했다(도 2f).
또한 RNA-seq 분석(도 2f). circTshz2-2 과발현 후 분화된 세포에서 세포주기확인점(Cdk1, Ccnb2, Ccnd3, Cks1b), 염색체 분리(Arpp19, Smc4) 및 신경 기능(B2m, Fbxl17, Plcl1, Hecw2)에 속하는 유전자의 발현을 다시 측정했다. 이들 세포는 circTshz2-2가 고갈된 분화 세포(도 17)의 유전자와 반대의 발현 패턴을 보여 circTshz2-2가 세포 주기 및 신경 기능과 관련된 유전자를 조절함으로써 신경돌기 신장 및 복잡성에 영향을 미칠 수 있음을 확인했다.
2.6. circTshz2-2의 하향 조절이 뉴런의 G2/M 세포주기 정지 및 키네토코어 오작동(kinetochore malfunction)으로 인한 배수성 증가를 유발함
G0/G1 또는 G2/M 세포주기에서 정지된 신경 세포가 분화 및 발달하는 동안 긴 신경돌기를 함유하는 뉴런이 된다고 알려져 있다.
이러한 발견은 원형적인 유사분열 후 세포인 뉴런이 세포 주기의 조절을 통해 신경돌기 신장 및 복잡성을 유지 및 조절할 수 있음을 나타낸다.
먼저, propidium iodide 염색 및 유세포 분석을 사용하여 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포 사이의 세포 주기 분포를 비교했다. 미분화 세포와 비교할 때 분화된 세포에서 G2/M(4N) 및 배수성 단계(>4N) 세포의 비율이 증가했으며, G1(2N), S(2N-4N) 및 Sub-G1(<2N)단계의 세포 비율이 감소했다(그림 3A). 세포 주기 조절 동안 circTshz2-2의 역할을 조사하기 위해, 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포에서 각각 siRNA를 사용하여 circTshz2-2 발현을 억제하였다. circTshz2-2의 억제는 음성 대조군과 비교했을 때미 분화 세포와 분화 세포 모두에서 G1(2N), S(2N-4N) 및 sub-G1(<2N)단계의 세포 수를 감소시키면서 G2/M(4N) 및 배수성 단계(>4N) 세포의 비율을 상당히 증가시켰다. 이를 통해 circTshz2-2 녹다운이 G2/M 세포주기에서 세포 주기를 정지시키고 뉴런이 배수체 상태를 유지하게 함을 확인했다. 이 배수체는 내재복제, 유사분열 미끄러짐(mitotic slippage) 및 유사분열 부재로 인한 세포질분열 실패에 따라 nuclear polyploidy (단핵성) 또는 cellular polyploidy (이핵성 또는 그 이상)로 분류된다. circTshz2-2 녹다운 후에 발생하는 배수체를 특성화하기 위해 circTshz2-2의 발현이 억제된 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포에서 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 사용하여 DNA를 염색하였고, 베타-튜불린 항체를 사용하여 미세소관을 염색했다. 미분화 조건에서 소수의 세포가 이핵성 핵을 가지고 있었지만, 대부분의 세포는 circTshz2-2 녹다운에 의해 putative metaphase로 정의되는 U 자형의 단핵성 핵을 가졌다(도 18). 그러나, 분화된 세포에서 circTshz2-2의 억제 후 긴 신경돌기를 보유하는 대부분 이핵성 및 삼핵성 세포가 관찰됐으며, 이를 통해 이 circRNA가 분화된 세포에서 G2/M 세포주기를 정지시킨 후 배수성을 조절하는 역할을 한다는 것을 확인했다. 또한, circTshz2-2 과발현 후 핵 형태의 변화를 테스트했다. 그러나, 대조군 및 과발현 벡터로 형질감염된 세포 사이에서 핵 형태의 차이는 없었다. circTsh2-2의 양이 일정량 이하일 때만 핵 형태학적 결함이 관측될 가능성이 있고, 그렇지 않으면 circTshz2-2가 과발현된 세포는 이 세포에서 세포 분열 및 염색체 분리와 관련된 유전자의 발현 증가를 고려할 때 G2/M 세포주기에 있지 않을 수 있다(도 17). 유사분열 실패는 염색체를 분리하는 방추 결합 복합체인 키네토코어가 제대로 조립되지 않을 때 발생하며, 결과적으로 내제복제, 유사분열 미끄러짐 및 세포질분열 실패가 발생한다. circTshz2-2의 억제는 RNA-seq 데이터 세트(도 2c)를 기반으로 하는 키네토코어 어셈블리(Ndc80, Spc24)와 관련된 유전자의 발현을 현저히 감소시켰으며, 이는 circTshz2-2의 억제가 G2/M 세포주기 및 kinetochore 기능 장애로 인해 배수성을 나타내는 세포의 비율을 증가시켰음을 의미한다.
2.7. CircTshz2-2의 Cyclin B2/CDK1 및 BDNF 발현 조절
Cyclin B 단백질과 CDK1은 모두 세포 주기 조절 동안 G2/M checkpoint에 특이적이다. Cyclin B 및 CDK1의 발현 또는 활성의 하향 조절은 G2/M 세포주기의 정지를 초래한다. circTshz2-2가 제거된 세포의 RNA-seq 및 qRT-PCR 데이터는 G2/M checkpoint(Ccnb2 및 Cdk1)의 조절과 관련된 유전자의 유의미한 감소는 circTshz2의 녹다운에 의해 유도된 G2/M 세포주기 정지가 Cyclin B2 및 CDK1 발현의 변화와 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 이를 확인하기 위해 분화된 Neuro-2A 세포를 circTshz2-2 siRNA로 형질감염시켰다. CircTshz2-2 녹다운은 분화된 세포에서 Cyclin B2와 CDK1의 발현을 감소시켰다(도 3c). 이전 연구에서는 티로신 15에서 CDK1의 인산화가 또한 Cyclin B/CDK1 복합체를 비활성화하여 4배체 뉴런에서 G2/M 세포주기 정지를 초래한다는 것을 발견했으며, 이번 결과는 또한 circTshz2-2 녹다운이 분화된 4배체 Neuro-2A 세포에서 티로신 15에서 CDK1의 인산화 상태를 증가시켰음을 보여주었다(도 3c). 또한, circTshz2-2 과발현 후 분화된 세포에서 Cyclin B2 및 CDK1 활성을 다시 확인했다. Cyclin B2 및 CDK1의 발현은 분화된 세포에서 circTshz2-2 과발현 후 유의하게 증가하였다. 그러나 대조군과 과발현 벡터로 형질 감염된 세포 사이의 티로신 15 부위에서 CDK1의 인산화에는 차이가 없었다 (도 19의 A). 이러한 결과는 circTshz2-2가 Cyclin B2 및 CDK1을 포함하는 G2/M checkpoint 단백질의 양을 조절함으로써 G2/M 세포주기에서 세포 주기 정지를 조절함을 나타낸다.
circTshz2-2 녹다운과 관련된 G2/M 정지가 뉴런의 BDNF 발현에 의존하는지 여부를 조사하기 위해 Neuro-2A 세포 및 마우스 1차 피질 뉴런을 circTshz2-2 siRNA로 형질감염시키고 qRT-PCR로 평가했다. CircTshz2-2 녹다운은 미분화 및 분화된 Neuro-2A 세포와 일차 피질 뉴런에서 DIV 7(7 days in vitro) 및 DIV 14(도 3d)에 Bdnf mRNA 발현을 유의하게 증가시켰으며, 이는 신경세포에서 circTshz2-2 녹다운이 Bdnf 전사를 증가시킴을 시사한다. Bdnf mRNA는 전구체 BDNF(proBDNF) 단백질로 번역되고 다양한 프로테아제에 의해 성숙한 형태의 BDNF(mBDNF)를 생성하기 위해 proteolytic processing을 거쳤다. 어떤 형태의 BDNF 단백질이 circTshz2-2 녹다운에 의해 조절되는지 조사하기 위해 Neuro-2A 세포와 마우스 1차 피질 뉴런을 circTshz2-2 siRNA로 형질감염시키고 웨스턴 블롯을 실시했다. CircTshz2-2 녹다운은 미분화 Neuro-2A 및 DIV 7의 1차 피질 뉴런에서 proBDNF 수준을 증가시켰다(도 3e). 그러나 두 세포 유형 모두에서 mBDNF 수준이 변화되지 않았으며, 이는 circTshz2-2 녹다운이 미분화 및 미성숙 뉴런에서 proBDNF 발현만을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 반면에, circTshz2-2 녹다운은 DIV 14에서 분화된 Neuro-2A 및 1차 피질 뉴런에서 proBDNF 및 mBDNF 발현을 모두 현저하게 증가시켰으며(도 3e), 이는 circTshz2-2가 분화 및 성숙한 뉴런에서 proBDNF 및 mBDNF 수준을 모두 조절함을 나타낸다. proBDNF 및 mBDNF 수준이 circTshz2-2 과발현에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 분화된 Neuro-2A 세포에 circTshz2-2 과발현 벡터를 형질감염시킨 후 웨스턴 블롯을 수행하였다. CircTshz2-2 과발현은 분화된 세포에서 proBDNF와 mBDNF 수준을 모두 유의하게 감소시켰으며(도 19의 B), 이를 통해 circTshz2-2에 의한 BDNF 발현의 조절을 확인하였다. 이와 같은 결과들을 종합하면, circTshz2-2가 Cyclin B2/CDK1 및 BDNF 발현을 조절함으로써 G2/M 세포주기에서 세포 주기 정지를 조절함을 시사한다.
2.8. CircTshz2-2의 YY1 전사 억제인자 복합체의 조절을 통한 BDNF 발현 조절
Bdnf는 다양한 전사 조절자에 의해 다양한 isoform으로 전사된다. BDNF 발현의 circTshz2-2 매개 조절의 기본 작동 메커니즘을 확인하기 위해 먼저 대조군 벡터 처리 세포와 비교하여 circTshz2-2 과발현 벡터로 형질감염된 세포(도 20의 C)에 따라 어떤 Bdnf mRNA isoform이 증가했는지 평가하여 circTshz2-2가 신경세포에서 두 isoform을 조절함으로써 Bdnf 전사를 조절한다는 것을 확인했다. 이 전사 조절의 기본 메커니즘을 설명하기 위해 먼저 RNA-seq 데이터에서 식별된 차등적으로 발현된 유전자를 일반적으로 조절하는 전사 인자 또는 염색질 조절자를 식별했다. 공개적으로 사용 가능한 두 가지 예측 도구인 BART와 ChEA3를 사용하여 먼저 RNA-seq 데이터에서 세포 주기와 관련된 모든 143개 유전자의 전사를 제어하는 데 관련된 전사 인자와 염색질 조절자를 조사했다(도 2a). 그런 다음 BART와 ChEA3의 예측 점수를 기반으로 하는 상위 10개 전사 인자를 추가 평가를 위해 선택했다(도 4b). 그런 다음 RNA-단백질 상호작용 예측 도구인 RPIseq를 사용하여 circTshz2-2와 상호작용할 가능성이 가장 높은 요인을 식별했다(도 4c). 또한 circTshz2-2 녹다운 후 차등 발현을 보이는 모든 RNA 결합 단백질과 이러한 평가에서 Tshz2와 관련된 모든 보조 인자를 포함시켰다(도 4d). 그런 다음 두 분류자 모두에서 결합 확률이 0.5 이상인 가장 높은 요소가 RPIseq 결과에서 선택되었다(도 4c 및 4d). 확인된 다양한 요인 중 polycomb 단백질 SUZ12, C-말단 결합 단백질(CTBP) 및 Ying Yang 1(YY1)은 모두 이전에 BDNF의 조절자로 확인되었다. 이 단백질들은 polycomb repressive complex에 속하며 BDNF의 전사 억제인자로 작용함을 시사한다. CTBP가 BDNF 전사를 조절하는 자세한 메커니즘은 보고되지 않았지만, 인간 BDNF 전사체의 조절은 인간 ChIP-seq 데이터 세트 (도 21)에서 볼 수 있듯이 exon 4와 6 사이의 DNA 영역의 결합에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다. 중요하게도, YY1 조건부 녹아웃은 Bdnf 발현을 증가시키고 세포질분열 실패를 일으켜 배아 발달 동안 이핵 사배체를 초래하는 것으로 보고되었다. 따라서, 이러한 이전 결과는 circTshz2-2 녹다운이 Bdnf 전사를 증가시키고 뉴런의 키네토코어 오작동(kinetochore malfunction)에 의한 4배체 및 배수체를 증가시키는 이번 실험 결과에서 설명한 것과 유사한 표현형을 보고했다(도 3a 내지 3e). 이를 감안하여 circTshz2-2가 SUZ12, CTBP 및 YY1에 결합하는지 확인하기 위해 일련의 RNA-IP 분석을 완료했다.
circTshz2-2는 YY1 및 CTBP와 결합하지만 SUZ12와는 결합하지 않았다(도 4e 및 도 22의 A 및 B). YY1은 전사 억제인자 복합체에서 파트너로 작용하기 위해 CTBP 공동 억제인자를 recruit하는 것으로 알려져 있으며, CTBP에는 결합 파트너인 CTBP-상호작용 단백질(CTIP)이 있다고 알려져 있다. 또한, circTshz2-2가 분화된 세포에 CTIP를 포함하는 복합체에서도 공침(coprecipitation)됨을 관찰했으며(도 22의 C), 이는 circTshz2-2가 YY1-CTBP-CTIP polycomb 전사 억제 복합체에서 억제 보조 인자로 작용할 가능성이 있음을 나타낸다. 또한, 최근 YY1이 CCAT 및 ATGG를 포함하는 핵심 모티프 서열에 결합하고, 폴리콤 그룹 복합체가 GAGA 공통 서열에 결합하여 유전자 억제를 초래하는 것으로 보고되었다. 또한 polycomb repressor complex는 Bdnf 전사를 억제하기 위해 exon 6 근처의 Bdnf 프로모터에 결합하는 것으로 보고되었다. ENCODE Cis-Regulatory data Elements(cCREs) 데이터베이스의 데이터는 또한 YY1 전사 억제 복합체가 엑손 4 및 6의 Bdnf 프로모터 영역에 결합함을 보여준다(도 4f). 따라서 이러한 결과는 YY1-CTBP-CTIP 폴리콤 억제 복합체가 circTshz2-2와 함께 작용하여 Bdnf 프로모터에 결합하고 Bdnf 전사를 억제한다는 것을 나타낸다.
2.9. CircTshz2-2의 BDNF/TrkB 신호 전달 경로를 통한 G2/M 세포 주기 정지 조절
proBDNF 및 mBDNF는 각각 수용체인 p75 뉴로트로핀 수용체(p75NTR) 및 티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 대한 결합을 통해 다운스트림 신호 전달 경로를 자극하는 것으로 보고되었다. 이번 실험에서 circTshz2-2 녹다운에 의해 촉진되는 G2/M 세포주기 정지가 분화된 Neuro-2A 세포에서 BDNF 수용체의 활성화에 의존하는지 여부를 조사했다. 세포를 circTshz2-2 siRNA로 형질감염시킨 후 TrkB 길항제(ANA-12) 및 p75NTR 억제제(PD90780)로 각각 처리하였다. 그 후 이 세포들의 세포 주기 분포에 대한 분석을 수행했다. TrkB 억제는 대조군에 비해 circTshz2-2-depleted 세포에서 G1(2N) 및 S(2N-4N) 단계의 세포 비율을 증가시켰고, G2/M (4N) 및 polyploidy (>4N) 단계의 세포 비율을 감소시켰다(도 5a). 그러나 p75NTR 억제는 세포 주기 분포에 영향을 미치지 않았으며, 이는 circTshz2-2 녹다운에 의해 촉진되는 G2/M 세포주기 정지가 TrkB 신호 전달 경로에 의존하지만 p75NTR 신호 전달 경로에는 의존하지 않는다는 것을 나타낸다. 이를 감안할 때, 이러한 결과는 circTshz2-2가 mBDNF/TrkB 신호 전달 경로를 통해 G2/M 세포주기 정지를 조절함을 나타낸다.
2.10. circTshz2-2의 하향 조절이 미세소관 구성 중심을 신경돌기에 재배치시킴
미세소관형성중심(microtubule-organizing center, MTOC)은 미세소관 핵형성의 주요 부위이며 세포질분열 과정 동안 염색체를 분할하는 데 필요한 미세소관 방추를 생성하는 주요 역할을 한다. 그러나, 신경돌기 신장 동안, MTOC는 또한 신경돌기 미세소관을 생성하고 재배열하는 역할을 한다. 실험을 통해 circTshz2-2의 억제가 신경돌기 길이를 증가시키고, G2/M 세포주기 정지를 유도하며, 뉴런에서 키네토코어 오작동(kinetochore malfunction)을 촉진하여 이핵 및 삼핵 배수체의 생성을 증가시킴을 관찰했다(도 1a 내지 1f, 도 3a 내지 3e).
따라서 세포분열시 사용하지 않은 MTOC가 재배치되어 circTshz2-2-depleted 세포에서 신경돌기 미세소관을 생성하는지 확인하였다. 세포를 circTshz2-2 siRNA로 형질감염시키고 DAPI로 염색하여 핵을, 항감마-튜불린 항체로 MTOC를, 항-베타불린 항체로 미세소관을 염색하였다. 흥미롭게도, MTOC는 이핵 및 삼핵 배수성을 나타내는 circTshz2-2-depleted 뉴런에서 비교적 긴 신경돌기 내에 고르게 분포되었다(도 5b). 대조군 세포는 또한 새로운 신경돌기의 생성을 보여주었지만, 신경돌기 내 MTOC의 분포는 관찰되지 않았다. 따라서 이러한 결과는 circTshz2-2가 G2/M 세포주기에 관련된 MTOC의 재배치를 통해 신경돌기 신장을 조절함을 나타낸다.
2.11. 야생형 및 비만 마우스에서 공간 기억 및 세포 주기 단백질을 조절하는 CircTshz2-2
신경 구조 및 세포 주기의 변화는 뇌의 신경 퇴행 및 기억 기능과 관련이 있으므로, 뇌에서 circTshz2-2의 녹다운 후 야생형 및 비만(ob/ob) 마우스의 기억 기능을 평가했다. 마우스의 뇌에서 circTshz2-2 발현을 억제하기 위해 2개의 circTshz2-2 siRNA 혼합물을 마우스 뇌의 측뇌실(lateral ventricle)에 주입하였다(도 6a, 6b). 야생형 마우스보다 비만 마우스의 피질과 해마에서 circTshz2-2의 더 높은 발현을 관찰했다(도 6c). circTshz2-2 siRNA의 주입 후, circTshz2-2 발현은 야생형 및 비만 마우스 둘 모두의 피질 및 해마에서 효율적으로 감소되었다(도 6d, 6e).
circTshz2-2 조절장애가 기억 기능에 영향을 미치는지 평가하기 위해 T-maze 테스트를 통해 이들 마우스의 공간 기억을 확인했다. T-maze는 설치류가 이전에 방문한 환경에 대한 공간 기억을 반영하여 새로운 환경을 탐색하려는 의지를 기반으로 한 자발적 교대 테스트에 사용된다. 공간 기억을 평가하기 위해 T-maze에서 각 마우스의 움직임 및 locomotor activities(팔 입장 횟수, 총 거리, 속도 및 부동 시간)을 기록했다(도 6f 및 도 23). 야생형 마우스에 비해 비만 마우스에서 locomotor activities가 유의미하게 감소하는 것을 발견했지만(도 23의 D), 야생형 마우스와 비만 마우스에 관계없이 대조군 마우스와 circ Tsh2-2 siRNA가 주입된 마우스 사이에 locomotor activities의 차이는 없었다(도 23의 E-H). 이는 수술 절차 및 circTshz2-2 감소가 야생형 및 비만 마우스 각각의 움직임 및 locomotor activities에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
또한, 야생형 마우스와 비교하여 비만 마우스에서 공간기억능력의 손상을 관찰했으며(도 6g), 이는 비만으로 인한 공간기억능력 손상을 나타낸다. 흥미롭게도, circTshz2-2 감소는 야생형 마우스에서 공간기억능력을 손상시켰지만 비만 마우스에서는 공간기억능력을 개선시켰다(도 6g). 1일차와 3일차 사이의 공간기억능력을 비교한 결과, 대조군 siRNA를 주입한 야생형 마우스에서 1일차에 비해 3일차에 개선되었다. 그러나, circTshz2-2 siRNA가 주입된 야생형 마우스에서 1일차에 비해 3일차에 공간기억능력이 개선되지 않았으며(도 6h), circTshz2-2 감소는 야생형 마우스에서 실험하는 동안 공간기억 학습을 방해했음을 알 수 있다.
비만 마우스의 경우, 대조군 마우스에서 1일차에 비해 3일차에 공간기억능력이 개선되지 않았다. 그러나, circTshz2-2 siRNAs 주입 마우스에서 1일차과 비교하여 3일차에 공간기억능력이 눈에 띄게 향상되었으며(그림 6h), 이는 circTshz2-2 감소가 비만 마우스에서 공간 학습을 개선함을 나타낸다. 상기 결과들을 종합하면 circTshz2-2 조절장애가 정상 조건에서는 공간 기억능력을 손상시켰지만, circTshz2-2의 억제는 circTshz2-2가 상향 조절되는 비만 마우스의 뇌에서 공간 기억을 개선함을 보여주었다(그림 6c).
또한, circTshz2-2 감소 후 야생형 및 비만 마우스의 피질 및 해마에서 Cyclin B2 및 CDK1의 발현을 조사했다. 먼저 야생형 마우스보다 비만 마우스의 피질과 해마에서 더 높은 Cyclin B2 및 CDK1 발현을 관찰했으며(그림 6i), 이는 비만 유발 신경변성 조건에서 G2/M checkpoint 단백질이 증가함을 나타낸다. 중요하게도, Cyclin B2 및 CDK1 발현은 야생형 및 비만 마우스 모두의 피질 및 해마에서 circTshz2-2 억제 후 유의하게 감소했다(그림 6I). 이러한 결과는 circTshz2-2가 G2/M checkpoint 단백질의 양을 조절하여 공간기억능력을 조절함을 의미하며, circTshz2-2 감소는 비만 상태에서 이러한 단백질의 증가를 저해했음을 알 수 있다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Neurodegenerative disease-related circular RNA biomarker and use thereof <130> 21P10045 <160> 142 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2934 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 1 acuugaauuu agagucugug uccucuucgc cagcuauugu uucuggagac cucugagccg 60 acgacacucg ggagaucucc ugcuccaccu ugcuuugcug gucagccgcc auccggguca 120 uguccuucau uuggaagccc aggugagacu cuagguggcu gauguaggua gaggggguuc 180 ugaacuggga cgcacaguca cugcaguaaa agauggggug cccuuugucc auguuuuuca 240 ggaacuuugu cccaccuguu uuccuaagcu gguauuugac guuagccagc caguggcuga 300 uuguggucau ggagaguccg gugaacuugg agauuugcau ccgcucuugg gggcccaggu 360 cagaaagcag guauuugccc ucugaggucu ggaagaggcu cgaggcaaac ugagcuugca 420 ggaugagaag augcuggggg uuccaguugg acugccggcc uuuccuuuug ugcaaagugg 480 agacuucgcu cgaaacaucc ucgaagcguc ugacgucgau uuccagcuuc auaggaggga 540 cccucgagga ggcggcuggc uuuggggugg uggcuuuggg gaggaccuug accauaucag 600 caaugucaca cagagcaugc uucugaggug gggacgugca ggauugugcu 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1500 gagguuucug uagagagucu ucguaguccu cgcuuuucac accuuguucg ucuucaaugc 1560 ccucucccuu cuccuucuug cuuucuuucu uuaacucggu gguagaggcu gugcacuccg 1620 agggggaguu acuugauggc uuaggggcca gagacucacu guuugggguc ucagacagug 1680 acugcauuuu cuccacagcu agggggucca acacaaguug cuuuccuuuc uuggaggcag 1740 agcuagugac uuugagaaag uggccuguga ccaucaugug gguggugagu uguugcaaag 1800 uaucauggga acugccacac uccauacacu uuaagaucug ggacuugcag gccucgaacu 1860 gccaggugua gcuggcgccg uuuugguagc cguagcggcu guuggagggc agcugcaggu 1920 uagcacucuu cugggaagaa aaggaaucug caagggaccc ugugguggag ucaggggagc 1980 aaggccuguu gacaucgaaa acacgcuucu uggcuggugu gaccaucuug gaggaaaugg 2040 uugguaccgg cuccuucaaa ggcacuuuuu gguaauguuu ugucuuuauc auguggacac 2100 ucaaaucuug cagggaaucg aaggagucac cacaaaacau acauuucagg accuuuuggg 2160 cauccucuuu guccaugucu uggaaggccc uuuuucgggg cuuggaguag cucguggguc 2220 ugagcuuauc uuuuuugcgg uugucaucuu gauaguggcc ugucucguuc augugcacgg 2280 ucagcuccac gagagugucg uaggccgcac ugcacugccu gcagcggaac cugcuggcgc 2340 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aacgagucuc ugcugaguga cgccagugau caggugucgg 240 acaucaagag ugucugcggc agagaugccu cagacaagaa agcacacacu cacgucaggc 300 uuccaaacga agcacacaau ugcauggaua aaaugaccgc ugucuacgcc aacauccugu 360 cggauuccua cuggucaggc cugggccuug gcuucaagcu guccaauagu gagaggagga 420 acugugacac ccgaaacggc agcaacaaga gugauuuuga uuggcaccaa gacgcucugu 480 ccaaaagccu gcagcagaac uugccuucuc gguccgucuc gaaacccagc cuguucagcu 540 cggugcaguu guaccgacag agcagcaaga ugugcgggac uguguucaca ggggccagca 600 gauuccgaug ccgacagugc agcgcggccu augacacccu agucgagcug acugugcaca 660 ugaaugaaac gggccacuau caagaugaca accgcaaaaa ggacaagcuc agacccacga 720 gcuauucaaa gcccaggaaa agggcuuucc aggauaugga caaagaggau gcucaaaagg 780 uucugaaaug uauguuuugu ggcgacuccu uugauucccu ccaagauuug agcguccaca 840 ugauuaaaac aaaacauuac caaaaagugc cuuugaagga gccaguccca accauuuccu 900 cgaaaauggu caccccggcu aagaaacgcg uuuuugaugu caaucggccg uguucccccg 960 auucaaccac aggaucuuuu gcagauucuu uuucuucuca gaagaacgcc aacuugcagu 1020 uguccuccaa caaccgcuau ggcuaccaaa auggagccag cuacaccugg caguuugagg 1080 ccugcaaguc ccagaucuua aagugcaugg agugugggag cucccaugac accuugcagc 1140 agcucaccac ccacaugaug gucacagguc acuuucucaa ggucaccagc ucugccucca 1200 agaaagggaa gcagcuggua uuagacccgu uagcagugga gaaaaugcag ucguugucug 1260 aggccccaaa cagugauucu cuggcuccca agccauccag uaacucagca ucagauugua 1320 cagccucuac aacugaguua aagaaagaga guaaaaaaga aaggccagag gaaaccagca 1380 aggaugagaa agucgugaaa agcgaggacu augaagaucc ucuacaaaaa ccuuuagacc 1440 cuacaaucaa auaucaauac cuaagggagg aagacuugga agauggcuca aaggguggag 1500 gggacauuuu gaaaucuuug gaaaauacug ucaccacagc caucaacaaa gcccaaaacg 1560 gggcccccag cuggagugcc uaccccagca uccacgcagc cuaccagcug ucugagggca 1620 ccaagccgcc uuugccuaug ggaucccagg uacugcagau ccggccuaau cucaccaaca 1680 agcugaggcc cauugcacca aaguggaaag ugaugccacu gguuucuaug cccacacacc 1740 uggccccuua cacucaaguc aagaaagagu cagaagacaa agaugaagcg gugaaggagu 1800 gugggaaaga aaguccccac gaagaggccu caucuuucag ccacagugag ggcgauucuu 1860 uccgcaaaag ugaaacaccu ccagaagcca aaaagaccga gcuggguccc cugaaggagg 1920 aggagaagcu gaugaaagag ggcagcgaga aggagaaacc ccagccccug gagcccacau 1980 cugcucugag caaugggugc gcccucgcca accacgcccc ggcccugcca ugcaucaacc 2040 cacucagcgc ccugcagucc guccugaaca aucacuuggg caaagccacg gagcccuugc 2100 gcucaccuuc cugcuccagc ccaaguucaa gcacaauuuc cauguuccac aagucgaauc 2160 ucaaugucau ggacaagccg gucuugaguc cugccuccac aaggucagcc agcgugucca 2220 ggcgcuaccu guuugagaac agcgaucagc ccauugaccu gaccaagucc aaaagcaaga 2280 aagccgaguc cucgcaagca caaucuugua uguccccacc ucagaagcac gcucugucug 2340 acaucgccga cauggucaaa guccucccca aagccaccac cccaaagcca gccuccuccu 2400 ccaggguccc ccccaugaag cuggaaaugg augucaggcg cuuugaggau gucuccagug 2460 aagucucaac uuugcauaaa agaaaaggcc ggcaguccaa cuggaauccu cagcaucuuc 2520 ugauucuaca agcccaguuu gccucgagcc ucuuccagac aucagagggc aaauaccugc 2580 ugucugaucu gggcccacaa gagcguaugc aaaucucuaa guuuacggga cucucaauga 2640 ccacuaucag ucacuggcug gccaacguca aguaccagcu uaggaaaacg ggcgggacaa 2700 aauuucugaa aaacauggac aaaggccacc 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Claims (12)

  1. circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 circTshz2-2 원형RNA는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 것인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 서열번호 78의 순방향 프라이머 및 서열번호 79의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 또는 서열번호 124의 순방향 프라이머 및 서열번호 125의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매, 노인성 치매, 경도 인지 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병, 근위축성 축삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준이 증가하면 상기 신경퇴행성 질환의 발병 위험이 높아지는 것으로 예측하는, 비만 환자에서 신경퇴행성 질환의 발병 위험 예측용 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 조성물로 비만 환자의 circTshz2-2 원형RNA의 발현 수준을 모니터링하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보제공 방법.
  7. circTshz2-2 원형RNA 억제제를 포함하는 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 억제제는 상기 circTshz2-2 원형RNA의 백스플라이싱 접합 부위를 표적으로 하는 siRNA인 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 백스플라이싱 접합 부위는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖는 것인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 5의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 7의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 9의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 11의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 안티센스 RNA로 이루어진 siRNA, 서열번호 13의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA; 및 서열번호 15의 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 안티센스 RNA 이루어진 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 siRNA를 포함하는, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매, 노인성 치매, 경도 인지 장애, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크병, 근위축성 축삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 비만 환자는 기억력 저하를 동반하는 환자인, 비만 환자의 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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