JP2023521157A - 低免疫原性の細胞ならびにそれらの産生のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

低免疫原性の細胞株、ならびにそれらの産生のための方法および組成物が、提供される。

Description

本特許出願は、2020年4月6日に出願された米国仮出願第63/005,651号からの優先権の利益を主張するものである。
分野
本発明は、低免疫原性の細胞株ならびにそれらの産生のための方法および組成物に関する。
背景
免疫系は、生物の全体性(integrity)を維持するのに重要な役割を果たしている。これは自己を非自己から識別し、細菌の、ウイルスの、および他の微生物に対する防御を開始する。免疫系は、循環(circulation)中の細胞、ならびにほんとどの組織および臓器に存在する常在免疫細胞から構成される。これらの常在免疫細胞は、中枢神経系(CNS)中のミクログリアなど、種々の名称を有する。
常在ミクログリアの起源は、最も信頼の置ける(definitive)研究が、それらが卵黄嚢の原始造血前駆体に由来することを示すまで、物議を醸していた。ミクログリアが中胚葉を起源とする決定的証拠(definitive proof)が、骨髄性細胞PU.1にとって重大な転写因子を欠くマウスはミクログリアがないことを示した遺伝学研究を通して得られた(McKercher et al. EMBO J(1996)15(20):5647-58.22; Beers et al. Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103(43):16021-6)。
免疫系は、免疫系の2つの主要なアーム(arms)を介して、外来抗原を識別する(Chaplin et al. J Allergy Clin Immunol.2010 Feb;125(2 Suppl 2):S3-23)。微生物の、毒性の、またはアレルゲンの構造体の識別を可能にする機序は、先天性免疫経路および適応免疫経路と称される2つの一般カテゴリーに分類され得る。
先天性免疫経路は、宿主の生殖細胞系の遺伝子によってコードされ、かつ哺乳動物宿主には存在しない多くの微生物と毒素との両方によって共有される分子パターンを識別する、生まれつき備わっている(hard-wired)応答である。先天性応答はまた、可溶性タンパク質および生物活性小分子も包含するが、これらは、生体液中に構成的に存在するか(補体タンパク質、デフェンシン、およびフィコリンなど(Hiemstra,P.S. Exp Lung Res.2007;33:537-542; Holmskov et al. Annu Rev Immunol.2003;21:547-578))、または細胞が活性化されたときそれらから放出されるか(他の細胞の機能を調節するサイトカイン、炎症性白血球を呼び込むケモカイン、炎症の脂質メディエーター、反応性の高い遊離のラジカル種、ならびに組織炎症にもまた寄与する生物活性アミンおよび酵素を包含する)のいずれかである。先天性系によって使用される識別分子が、多数の細胞上に広く発現されていることから、一連の第1応答は、先天性免疫応答を構成する。この系は、侵入してきた病原体または毒素に直面した後迅速に作用する態勢が取られており、よって初期宿主応答を構成する。
一連の第2免疫応答は、適応免疫系を構成しており、これはまた後天性免疫系とも言及される。先天性免疫系とは違って、後天性免疫系は、具体的な病原体に対して高度に特異的である。適応免疫経路応答は、体細胞的に再配列することで個々のユニークな外来構造体に対し鋭敏な特異性をもった抗原結合分子を構築する遺伝子要素によってコードされる。ヒト白血球抗原(HLA)系または複合体は、ヒトにおいて、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これら細胞表面タンパク質は、ヒトにおいて免疫系の調節を担う。
先天性免疫系および適応免疫系はしばしば、宿主応答の対照的な別々のアームとして説明される;しかしながら、それらは大抵、宿主防御の最前線に相当する先天性応答と、抗原特異的TおよびB細胞がクローン性増殖(clonal expansion)を経た数日後に顕著になる適応応答と一緒に作用する。先天性系の構成要素は、抗原特異的細胞の活性化に寄与する。加えて、抗原特異的細胞は、それらの応答を、先天性のエフェクター機序を動員することによって増幅することで、侵入してきた微生物の完全な制御をもたらす。よって、先天性免疫応答および適応免疫応答は、それら作用機序の点で根本的に異なるものの、それら応答間の相乗効果は、無傷で十分に有効な免疫応答にとって不可欠である。
免疫系の他の重要な構成要素は、造血幹細胞に由来する。多能性造血幹細胞は、骨髄中で分化して、一般的なリンパ前駆細胞または一般的な骨髄前駆細胞になる。リンパ幹細胞は、B細胞、T細胞、およびNK細胞の系統を生み出す。骨髄幹細胞は、好中球、単球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、巨核球、および赤血球を産生し続ける、二次レベルの系統特異的コロニー形成ユニット(CFU)細胞を生み出す。単球はさらに分化して、末梢組織の区域においてマクロファージになる。樹状細胞(DC)は、そのFlt3受容体の発現によって区別されるDC前駆体から主に発生するようである。この前駆体は、リンパ球または骨髄幹細胞のいずれかから派生し、従来型(classical)DCと形質細胞様DCとの両方を生み出し得る。従来型DCはまた、単球様前駆細胞の分化からも派生し得る。
T細胞はまた、免疫系の重要なアームでもある。T細胞は、分子複合体としての自己抗原と一緒に外来抗原を識別する洗練された機序を進化させてきた。T細胞が自己構造体と外来抗原との両方を識別するというこの要件によって、これらの細胞が自己寛容性を維持する必要性が、殊更重要になる。
免疫応答のT細胞アームの主要な役割は、感染した細胞を同定して破壊することである。T細胞はまた、食作用または飲作用のプロセスを通してAPCによって取り入れられた抗原のペプチドフラグメントも識別し得る。T細胞が感染した宿主細胞を識別できるように免疫系が進化してきた面には、T細胞が自己の構成要素と微生物の構造体との両方を識別することが要される。自己の構造体と微生物の決定基との両方を識別するという問題への洗練された解答は、MHC分子ファミリーである。MHC分子(またヒト白血球関連[HLA]抗原とも呼ばれる)は、細胞内で合成されたか(クラスI MHC分子)、または細胞によって取り込まれてタンパク分解処理されたか(クラスII MHC分子)のいずれかであるタンパク質のペプチドフラグメントへ結合する細胞表面糖タンパク質である。
3つの主要なHLAクラスI分子があり、HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cと指定され、各々は別個の遺伝子によってコードされる。クラスI HLA分子は、12kd 非多形のβ2-ミクログロブリン(β2m)タンパク質と結び付けられた多形の膜貫通型44kd α鎖(またクラスI重鎖とも指定される)からなる細胞表面ヘテロ二量体である。α鎖は、クラスI分子が、HLA-A分子、HLA-B分子、またはHLA-C分子であるかどうかを決定する。HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cのα鎖遺伝子は、第6染色体上MHC内にコードされており、β2-ミクログロブリン遺伝子は、第15染色体上にコードされている。TCRは、抗原性ペプチドと隣接するαヘリックスとの両方に接触する。TCRは、抗原性ペプチド単独に対しては測定可能な親和性を有さず、他のペプチドを含有するMHC分子に対しては極めて低い親和性を有する。T細胞は、それら特定の抗原を、特定の自己MHC分子を伴って提示されたときにのみ識別することが認識されている(Zinkernagel,R.M. and Doherty,P.C.(1977)Major Transplantation Antigens,Viruses,and Specificity of Surveillance T Cells.In:Stutman O.(eds)Contemporary Topics in Immunobiology.Contemporary Topics in Immunobiology,vol 7.Springer,Boston,MA)。
β2-ミクログロブリン遺伝子(B2M)は、第15染色体上にコードされており、クラスI MHC複合体の適切な発現に要される。その不在下では、クラスI HLA複合体は、適切に発現することも機能することもない。
クラスI分子のように、クラスII HLA分子も2つのポリペプチド鎖からなるが、このケースにおいて両鎖はMHCにコードされた膜貫通型タンパク質であって、αおよびβと指定される。3つの主要なクラスIIタンパク質があり、HLA-DR、HLA-DQ、およびHLA-DPと指定される。この領域にコードされた分子は当初、血清学的にかつ細胞性免疫アッセイを使用して定義されたが、その結果として、それらの命名は必ずしも、分子をコードする基礎的遺伝子を反映しているとは限らない。これは具体的に、HLA-DRに当てはまるが、ここでHLA-DR小領域中の遺伝子が、1つの最小多形の(1つの共通アレル、および2つの極めて希少なアレル)α鎖(DRAと指定)と、2つの多形のβ鎖(DRB1およびDRB3と指定)とをコードする。
内在性のタンパク質は、免疫プロテアソームによって、クラスI分子中へ負荷するのに最適な小さいペプチドフラグメントへ消化される。ペプチドは、TAPトランスポーターを介して免疫プロテアソームから小胞体へ移される。タパシン、カルレティキュリン、およびシャペロンErp57の助けを借りて、それらは細胞表面への輸送に先立ち、シャペロンタンパク質カルネキシンによる促進作用(facilitation)を介してβ2mサブユニットと結び付けられたクラスI重鎖中へ負荷され、前記細胞表面上でこれがCD8+ T細胞によって識別され得る。
また近年、従来型のHLAクラスI抗原でもクラスII抗原でもない分子によって提示された抗原を識別する、あるクラスのT細胞が存在することも明確になった。これらクラスのT細胞の1つは、α鎖とβ鎖とから構成される抗原受容体を使用し、CD1分子へ提示、結合した脂質抗原を識別する。CD1分子は、クラスI HLA分子と構造的に関係があり、細胞外ドメインが3つある膜貫通型タンパク質であって、β2-ミクログロブリンと結び付いている。5つのヒトCD1アイソフォームがあり、CD1a～CD1eと指定され、MHCに関連しない連結した遺伝子によってコードされている。
有効な宿主防御にとって不可欠な、追加の先天性免疫エフェクターは、好中球、マクロファージ、ならびに単球およびナチュラルキラー(NK)細胞を包含する食細胞を包含する。
免疫系が、広範囲の微生物の細胞を破壊する能力および広範囲の毒性物質とアレルゲン性物質との両方を一掃する能力を有する多くの強力なエフェクター機序を採用するところ、免疫応答が、これらの破壊機序を哺乳動物宿主自身の組織に対して招くことを避けることができることは不可欠である。免疫応答の、自己組織を損傷することを避ける能力は、自己寛容性と称される。
この同じ免疫応答を制御することはまた、血縁のない2個体間での組織、臓器および骨髄の移植への拒絶反応を防止するのにも重要である。しかしながら、免疫系を回避することが、血縁のない個体間での細胞、組織、および臓器の移植を可能にすることもある一方、かかる回避は、免疫系がその他の重要な機能を実施するのを防止させてはならない。
様々な技法が、自己または同一遺伝子の移植、in uteroでの移植、免疫特権部位への移植、免疫モジュラトリ(modulatory)細胞の同時移植、免疫抑制の局所化、CTLの遮断、抗TCR治療、ABOの寛容化および他の抗原の寛容化、寛容化を導入するT-reg、骨髄移植に付随する混合キメラ、DC細胞の生成、胸腺の若返り、ならびに免疫抑制とのHLA適合を包含する臓器移植を可能にさせるように免疫系をモジュレートしようとするよう進化してきた。
免疫拒絶反応を防止する普遍的な(universal)細胞を生成するための数種のアプローチもまた記載されている。
最初のアプローチは、すべてのクラスIおよびクラスII遺伝子の発現をノックアウトする最新の(modern)遺伝子編集技術の使用を伴うものであった(Lanza, Russell and Nagy 2019)。HLA-Gの他のバリアントを使用すること、HLA-Eを使用すること、または各HLA-クラスを個々にノックアウトすること、またはクラスIIのノックアウトが必要でないであろうと想定することを包含する、大部分は同じ目的のこのストラテジーへの修飾が、様々な他の研修者によって使用されてきた。一般に、これらのストラテジーは実質的に適応免疫を阻害した一方で、慢性拒絶反応へ繋がる先天性免疫応答は、穏やかに低減または増大しただけであった。
クラスIおよびクラスIIノックアウトの欠点を認識した上で、各経路を阻害する1～2分子を選択することによって免疫応答のすべてのアームを阻害することが、代替アプローチとして提案されている(Lanza, Russell and Nagy 2019)。このアプローチは、使用される分子が、HLAミスマッチが存在しかつ組織または細胞の移植片が寛容であるといった特殊な事例において使用される点で、KOアプローチに対して数個の理論的利点を有する。この方法は多くの利点を有するが、8つもの遺伝子が使用され、要求される発現レベルが高く、複数コピーの導入遺伝子を要した点で、極めて実用的に不利な点がいくつかある。
ハイブリッドアプローチを使用したCowan et al.は、3つの免疫モジュラトリ遺伝子をクラスIおよびクラスIIの二重KOへ加えてなお、3つの遺伝子を同時に共発現させることが充分な場合もあることを示した。しかしながら、彼らが使用した3つの遺伝子は、チェックポイント経路(CD47、PDL1、およびHLA-G)をモジュレートし、免疫活性化の実質的な、しかし完全ではない低減を引き起こす(Cowan et al. Nat.Biotechnol.2019 37:252-258)。
同様のハイブリッドストラテジーを使用したDeuse et al.は、単一の遺伝子で充分な場合もあることを示した。彼らは、CD47を使用することで、NK細胞活性の阻害が示され、長期移植片生着を可能にするのに充分であるように思われた。さらに、マウスとヒトとの両方の人工多能性幹細胞(iPSC)は、クラスIおよびII遺伝子が不活性化され、かつチェックポイントインヒビターとして作用するCD47が過剰発現したとき、それらの免疫原性を失うことが示された。しかしながら、hESCおよびそれらの誘導体(内皮細胞および血管平滑筋細胞)上でのHLAクラスIとIIとの発現を欠失させ、かつin vitroおよびマウス研究においてHLA-G、CD47、ならびにPD-L1をノックインすることは、T細胞応答が鈍化するだけで消失しないことを示したが、よってこのことはDeuceの報告について問題を提起し、CD47の発現レベルが不可欠なこともあることを示唆する。
HLA-Eがノックインされた改変HLAクラスIa-陰性hESCもまた、産生されている。これらhESCおよびそれらの分化誘導体(CD45+ 造血細胞)は、同種異系のCD8+ T細胞応答を免れ、in vitroとマウスとの両方においてCD94/NKG2A-陽性NK細胞による細胞溶解に耐性があった。しかしながら、ヒトNK細胞のほぼ50％しかCD94/NKG2A(HLA-Eへ結合してNK細胞を阻害する受容体)を発現しないところ、このアプローチをヒトへ転換するには問題点もある。よって、HLAクラスIa-陰性の、HLA-Eを発現する同種異系の細胞は、CD94/NKG2A-陰性のNK細胞によって、依然として削減させられ得る。
HLAクラスIおよびIIを欠損しかつCD47を過剰発現するように改変されたiPSCならびにそれらの誘導体(内皮細胞および心筋細胞)は、in vitroおよびin vivoで、NK細胞応答および免疫拒絶反応から保護されることが示された。重要なことに、ミスマッチした、免疫能力のある、同種異系の、ヒト化されたマウスにおいて、誘導体は免疫抑制なく長期生存することができた。しかしながら、内皮細胞同種移植片の5分の1が、何の説明もなく失敗した。
よって、免疫応答を発動させない低免疫原性細胞ならびにそれらの産生のための方法および組成物へのニーズがある。
概要
本発明の側面は、クラスIエピトープまたはクラスIIエピトープを発現せず、IL-10因子またはMIF因子を過剰発現する、低免疫原性になるように修飾された細胞に関する。
非限定的な一態様において、細胞は、クラスIとクラスIIとの両エピトープを発現しない。
非限定的な一態様において、細胞は、IL-10因子およびMIF因子を過剰発現する。
本発明の別の側面は、IL-10因子および/またはMIF因子を過剰発現し、かつクラスIおよび/またはクラスIIの活性の喪失を模倣する追加の因子を発現する、低免疫原性になるように修飾された細胞に関する。
本発明の別の側面は、先天性免疫応答も適応免疫応答も活性化しない細胞の産生のための方法に関する。非限定的な一態様において、細胞は、クラスIおよび/またはクラスIIのエピトープを発現しないように、かつIL-10因子および/またはMIF因子を過剰発現するように、修飾されている。非限定的な一態様において、細胞は、IL-10因子および/またはMIF因子を過剰発現するように、かつクラスIおよび/またはクラスIIの活性の喪失を模倣する追加の因子を発現するように、修飾されている。
本発明のもう1つの側面は、細胞中への挿入または組み込みのための核酸構築物に関し、よって細胞が低免疫原性になるように修飾される。非限定的な一態様において、核酸構築物は、Chr.13などのセーフ・ハーバー部位中へ挿入されたCAGプロモーターなどのプロモーターによって推進される、IL-10遺伝子もしくはMIF遺伝子またはIL-10遺伝子とMIF遺伝子との両方を含む。
図の簡単な記載
図1は、クラスIもしくはクラスIIのエピトープまたはその両方、およびIとクラスIIとのエピトープをノックアウトすること、および 免疫モジュラトリ因子IL-10もしくはMIFまたはその両方を、Chr.13上のCLYBLまたはChr.19上のAAVS1などのセーフ・ハーバーにおいて過剰発現することによって、本発明に従う低免疫原性の細胞株を生成する基本(master)設計の非限定例を提供する。
図2A～2Cは、iPSC株(NCL2-GFP)を親株として使用し、RCL-B-1 iPSC株であるB2MのクラスI KOをした株の例を提供する。図2Aは、遺伝子およびガイドRNAの情報を示す。 図2Bは、遺伝子型分析を示す。 図2Cは、核型分析を示す。
図3Aおよび3Bは、iPSC株(NCL2-GFP)を親株として使用し、クラスI(B2M)およびクラスII(CIITA)の二重KOをした株であるRCL-BC-1 iPSC株の例を提供する。図3Aは、遺伝子およびガイドRNAの情報を示す。 図3Bは、核型分析を示す。B2M遺伝子とCIITA遺伝子との両アレルにおける二重KOを、DNA配列決定によって確認した。
図4A～4Cは、セーフ・ハーバー部位(Chr.19上のAAVS1)においてIL-10およびMIFを過剰発現するHLA-KO(B2M/CIITAの二重KO)低免疫原性iPSC株の例を示す。図4Aは、その株を生成するのに使用された、Chr.19上のAAVS1部位にてIL-10およびMIFを発現する標的ベクターを示す。 図4Bは、正確な標的化のDNA配列決定検証を示す。 図4Cは、正確な標的化のPCR検証を示す。
図5は、in vitroでの免疫原性アッセイの結果を示すグラフであって、ここでNK細胞死滅がLDH毒性によって測定された。示されるとおり、NK細胞応答は、セーフ・ハーバー部位にてノックインするか、またはトランスポゾンなどのランダム組み込みによるかのいずれかによって、IL-10もしくはMIFまたはその両方を発現する低免疫原性の細胞において軽減された。IL-10およびMIFの発現株(HLA-KO+IL10-MIF株)は、IL-10およびMIFを発現しない対照およびHLA-KO細胞より少ないNK細胞死滅を惹起した。棒グラフは、各株に由来する神経前駆体に対するNK細胞傷害性の％を表す。種々のエフェクター/標的(E/T)比が実験に使用され、図は1:3 E/T e=比の結果を示した。
詳細な説明
本明細書に開示されるのは、低免疫原性になるように修飾され、それによって先天性免疫応答も適応免疫応答も活性化されない細胞株、ならびにこれら細胞株の産生のための組成物および方法である。
これら低免疫原性の細胞株の非限定的な一態様において、クラスIもしくはクラスIIエピトープまたはその両方の発現は削減される一方、IL-10因子もしくはMIF因子またはその両方の発現は増大する。これら低免疫原性の細胞株の非限定的な別の態様において、IL-10因子もしくはMIF因子またはその両方の発現が増加し、かつクラスIおよび/またはクラスII活性の喪失を模倣する追加の因子が加えられる。
本発明の非限定的な一態様において、低免疫原性の細胞株は、iPSCまたは不死化された株である。しかしながら、本開示を読んだ際に当業者によって理解されるとおり、IL-10因子もしくはMIF因子またはその両方の発現は増加するもののクラスIまたはクラスIIエピトープの発現を有するという所望の特性が削減した細胞の挿入および選択を可能にするのに充分な細胞分裂を経るいずれの増殖性細胞も、使用され得る。かかる細胞の非限定例は、間葉系幹細胞、神経幹細胞、および造血幹細胞を包含する。
インターロイキン10(IL-10)は、広範な白血球ならびに非造血細胞によって産生される、鍵となる免疫抑制性サイトカインである(Shouval et al.,2014)。IL-10は、細胞表面から生まれるIL-10R依存性シグナルを通して、その抗炎症効果を媒介する。IL-10Rは、IL-10Rαの2つのサブユニットおよびIL-10Rβの2つのサブユニットからなるヘテロ四量体である(Moore et al.,2001)。IL-10Rαサブユニットは、IL-10シグナリングにユニークなものである一方、IL-10Rβサブユニットは、IL-22、IL-26、およびIFN-λを包含する他のサイトカイン受容体に共通している(Moore et al.,2001)。IL-10Rを通したIL-10の下流シグナリングは、NF-κB依存シグナルを遮断することによって、炎症促進性のサイトカインの誘導を阻害する(Saraiva and O'Garra,2010)。この経路の喪失は、潰瘍性大腸炎などの炎症促進性の自己免疫疾患を引き起こすことが知られている。より近年になって、この作用は、先天性免疫系のモジュレーションの喪失のせいであって、転じてマクロファージ、食細胞、およびNK細胞に対するその作用に起因する可能性があることが示された。
炎症促進性のサイトカインであるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、腫瘍細胞増殖、遊走、および転移を刺激し、腫瘍血管新生を促進し、p53媒介アポトーシスを抑制し、ならびに抗腫瘍免疫を阻害するが、その大部分は未知の機序によるものである。卵巣がんにおけるMIFの過剰発現は、悪性腫瘍および腹水の存在と相関するものの、機能的にMIFは、NKG2Dをin vitroおよびin vivoで転写的に下方調節することによって、OvCAの免疫逃避へ寄与し、よって腫瘍細胞に対するナチュラルキラー(NK)細胞の細胞傷害性が損なわれる(O'Reilly et al. Med Res Rev. 2016 May;36(3):440-60)。卵巣癌に対するNKG2D媒介反応のさらなる関連性が近年、T細胞受容体の活性化と同時刺激との両方を提供するNKG2Dリガンド以来知られている腫瘍抗原の存在とは無関係に末期の腫瘍でさえも拒絶反応を誘導するキメラNKG2D-CD3 ζ受容体を発現するトランスジェニックT細胞の養子移植において実証された(Bloom et al. Expert Opin Ther Targets.2016 Dec;20(12):1463-1475)。
MIFはまた、抗腫瘍免疫を、CTLおよびNK細胞の応答を阻害することによっても損なわせるが(Krockenberger et al. J Immunol.2008 Jun 1;180(11):7338-7348)、この効果は、MIF誘導T細胞活性化、これに続き活性化に誘導された細胞死によって引き起こされることが提案されている(Yan et al. Cytokine.2006 Feb 21;33(4):188-198)。しかしながら、NK細胞のMIFによる活性化は観察されなかったが、このことはNK細胞のMIF媒介阻害が、異なる機序を介してもたらされることを指し示している(Rosen et al. J Immunol 2004;173:2470-2478)。マウスにおいて、NK細胞の活性化およびT細胞の同時刺激は、DAP10またはDAP12のいずれかを特異的に動員するNKG2Dの2つの異なるアイソフォームを介して媒介される。しかしながら、ヒトにおいては「NKG2Dshort」-DAP12経路は、存在しないようである(Unruh et al. Am J Kidney Dis.2019 Mar;73(3):429-431)。
加えて、MIFは、心臓外科手術後の虚血-再灌流傷害時に心臓を保護する役割を有することが示された多面発現性の(pleiotropic)サイトカインである。複数の細胞型が細胞内プール中にMIFを保管しており、ストレスおよび他のメディエーターに応えてこれを放出する。細胞から遊離後、MIFは、CXCR2、CXCR4、およびCD74を包含する様々な受容体へ結合してもよい。CXCR2またはCXCR4に結合したとき、MIFは炎症を促進する。CD74へ結合するMIFは、CD74/CD44/AMP-活性化タンパク質キナーゼを通した酸化防止機序によって、虚血-再灌流傷害時の心臓において有益な効果を有するようである。虚血性傷害時のMIF誘導腎臓保護(renoprotection)の根底にある下流の機序は依然として、調査中である。しかしながら、いくつかの研究は、AMPK活性化(または虚血プレコンディショニングを模倣する予備活性化(pre-activation))が、齧歯動物の虚血-再灌流傷害モデルおよび肝臓傷害において、腎臓傷害を弱める有益な効果を有することを示した(Miller et al. Nature.2008 Jan 31;451(7178):578-82)。
MIFは、その抗炎症活性だけでなく、炎症促進活性もあるため、細胞移植治療においては大抵考慮されていない。
しかしながら、HLAヌル細胞を伴う本発明において、MIFは大部分が阻害の役割を果たすであろうことが予想される。この阻害は、適応経路の他の同時刺激要因がないので、適応免疫経路の活性がほとんどないかまたはまったくない先天性免疫経路のものであろう。ほとんどの状況において炎症促進性であるが、特定の事例においては、MIFは、強力に抗炎症性であって、がんが免疫監視を免れることができるようになる。結果的に、本発明においてMIFの過剰発現が使用されると、外傷および傷害に対する細胞生存の増強におけるMIFの保護的役割を生かしつつ、HLAヌル細胞が免疫監視を免れることができるようになる。
本発明のこのハイブリッドアプローチを使用して、IL-10および/またはMIFを発現するクラスIおよび/またはクラスIIのノックアウト細胞株(これらに限定されないが、B2MおよびCTIIAの細胞株など)を創出した。かかる細胞を、セーフ・ハーバー部位(AAVS1およびCYBYL)へのノックイン、トランスポゾンによるトランスフェクション、またはレンチウイルスのトランスフェクションのいずれかを使用して創出した。他のハイブリッドアプローチとは違って、CD200、PDL1、およびCD47などの特定の作用機序を有するチェックポイントインヒビターを介する適応免疫系のさらなるモジュレーションは、不要である。その代わり、それらの表現型をT-regまたは調節性マクロファージの表現型へ変えるよう細胞に指示することを介して寛容性を生じさせることが十分に認識されている、先天性免疫経路に特異的なIL-10分子および/またはMIF分子を、過剰発現させることのみが必要となる。これらの分子は通常、常在細胞、とりわけCNSの常在するマクロファージおよびミクログリアによって発現されている。さらに、IL-10およびMIFはしばしば、膠芽腫において過剰発現されており、よって腫瘍が成長して免疫系から免れるのを調節することにおける中心的役割を果たす。
本発明の非限定的な一態様において、クラスI遺伝子座をノックアウトすることは、クラスI分子の構成要素であるB2M遺伝子をノックアウトすることによって達成される。非限定的な別の態様において、クラスI遺伝子座をノックアウトすることは、遺伝子(HLA-A、HLA-B、およびHLA-C)を個々にノックアウトすることによって達成される。非限定的な別の態様において、クラスI抗原の発現を阻害することは、これらに限定されないが、クラスI抗原の表面発現を防止するタパシンなどのプロセシング酵素をノックアウトすることによって達成される。
非限定的な一態様において、クラスII遺伝子座をノックアウトするには、クラスII遺伝子発現に要されるRFANX遺伝子またはCIITA遺伝子などの基本転写因子をノックアウトすることによって達成される。
本発明の低免疫原性の細胞株の非限定的な一態様において、クラスIまたはクラスIIエピトープの発現は削減される一方、IL-10因子またはMIF因子の発現は増加する。本発明の低免疫原性の細胞株の非限定的な一態様において、クラスIおよびクラスIIエピトープは削減される一方、IL-10因子またはMIF因子の発現は増加する。本発明の低免疫原性の細胞株の非限定的な一態様において、クラスIまたはクラスIIエピトープは削減される一方、IL-10およびMIFの発現は増加する。
本発明の低免疫原性の細胞株のもう1つの非限定的な態様において、クラスIおよびクラスIIエピトープは削減される一方、IL-10およびMIFの発現は増加する。細胞が受容体レベルを自己調節し得、かつこれら分子の多面発現性のせいでより低レベルの各サイトカインが使用され得ることから、細胞に対する修飾のこの組み合わせが、先天性免疫応答または適応免疫応答を活性化しない細胞の産生において最も有用であり得ることが予想される。これらの分子は、別個の受容体を介して作用し、種々のサイトカインを活性化し、免疫系の他のアームを異なるようにモジュレートするところ、この非限定的な態様の相乗的な活性もまた予想される。
加えて、IL-10およびMIF(これらに限定されないが、IL-4およびIL-35など)の活性を増強することが知られている追加の因子が細胞へ加えられることで、それらの活性および治療的な実用性がさらに増強され得る。
これらの低免疫原性の細胞株を産生するための様々な方法が使用され得る。非限定例は、セーフ・ハーバー挿入、トランスポゾンによるトランスフェクション、レンチウイルスによるランダム組み込み(またレンチウイルスのトランスフェクションとも称される)、ならびにトランスポゾン技術(これらに限定されないが、Piggy-Bac、sleeping beauty、Tol-2、および他の技術を包含する)を包含する。
本発明の低免疫原性の細胞株の非限定的な別の態様において、IL-10因子もしくはMIF因子またはその両方の発現が増加しており、かつクラスIおよび/またはクラスII活性の喪失を模倣する追加の因子が加えられている。クラスIおよび/またはクラスIIの活性の喪失を模倣するために加えられ得る、かかる因子の非限定例は、細胞表面上のHLA抗原の発現を低減させるアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはsiRNAまたは翻訳のための修飾(modifications for translation)、あるいはT細胞およびB細胞の機能を遮断するかまたは炎症反応を変化させる因子(IL-35、CD200、およびPD-L1など)を包含する。これらの追加の因子の挿入の方法は、これらに限定されないが、電気穿孔法、ヌクレオフェクション(nucleofection)法、リポフェクション法、およびレンチウイルスまたは他のウイルスのベクターを包含する。
本発明はまた、細胞株中への挿入または組み込みのための核酸構築物も提供し、よって細胞株が低免疫原性になるように修飾される。非限定的な一態様において、核酸構築物は、IL-10遺伝子もしくはMIF遺伝子、またはIL-10遺伝子とMIF遺伝子との両方を含む。遺伝子産物の発現は、内在性の遺伝子での挿入がフレーム中にあるときは内在性のプロモーターによって、あるいはCAGもしくはEF-アルファまたはいずれの他の周知の外来から供給されたプロモーターなどの外来性のプロモーターによって、これが挿入または組み込まれた細胞産物中に発現されるという制限付きで、推進され得る。構築物は、Chr.19上のAAVS1部位またはCLYBLなどのChr.13部位などの、知られているセーフ・ハーバー遺伝子座中へ挿入されてもよい。本発明に従うと、核酸構築物は、細胞株中へクラスIエピトープもしくはクラスIIエピトープにおいて挿入または組み込まれるか、あるいはクラスIIエピトープおよびクラスIIエピトープがノックアウトされている。
低免疫原性の細胞株の様々な非限定例を、本発明に従って産生した。本発明に従って低免疫原性の細胞株を創出するための材料設計は、図1に表される。クラスIノックアウト遺伝子をもつ低免疫原性株の非限定例は図2に表され、クラスIとIIとの二重ノックアウトをもつ低免疫原性株の非限定例は図3に表される。本発明に従って創出された細胞株の追加の非限定例は、NCL2-GFP、NCL2(cGMP臨床グレードiPSC株)を親株として使用し、GFPがChr.13上のセーフ・ハーバー部位CLYBLにノックインされて産生されたiPSC株; RCL-B-1、NCL2-GFPを親株として使用して産生された、HLAクラスI(B2M)ノックアウトiPSC株; RCL-BC-1、NCL2-GFPを親株として使用して産生された、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との二重ノックアウトiPSC株; RCL-BC-1-IL、GFPのIL-10とのカセット交換によるRCL-BC-1を親株として使用し、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との両遺伝子をノックアウトして、IL-10をChr.13上にセーフ・ハーバーにノックインすることによって生成されたiPSC株; RCL-BC-1-MIF、GFPのMIFとのカセット交換によるRCL-BC-1を親株として使用し、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との両遺伝子をノックアウトして、MIFをChr.13上のセーフ・ハーバーにノックインすることによって生成されたiPSC株; RCL-BC-1-HLAG、GFPのHLA-Gとのカセット交換によるRCL-BC-1を親株として使用し、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との両遺伝子をノックアウトして、HLA-GをChr.13上のセーフ・ハーバーにノックインすることによって生成されたiPSC株; RCL-BC-1-ILMIF、GFPのIL-10およびMIFとのカセット交換によるRCL-BC-1を親株として使用し、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との両遺伝子をノックアウトして、IL-10とMIFとの両方をChr.13上のセーフ・ハーバーにノックインする(IRESを介して共発現する)ことによって生成されたiPSC株;ならびにRCL-BC-1-ILMIFHLG、GFPのIL-10、MIF、およびHLA-Gとのカセット交換によるRCL-BC-1を親株として使用し、HLAクラスI(B2M)とクラスII(CIITA)との両遺伝子をノックアウトして、IL-10、MIF、およびHLA-GをChr.13上のセーフ・ハーバーにノックインする(IRESを介して共発現する)ことによって生成されたiPSC株を包含する。
本発明の低免疫原性の細胞株は分化して、網膜細胞、CNS系統の細胞、およびMSCになることが示された。よって、本発明の修飾された細胞株は、それらの外胚葉、内胚葉、および中胚葉への分化能において、非修飾親株と同じ能力を維持している。
これら細胞株の挙動は、数種の十分に確立されたin vitroでのアッセイにおいて査定され得る。例えば、混合リンパ球反応における細胞株の試験が使用されて、先天性免疫経路の活性化の欠如が査定され得る。混合末梢血細胞が使用されて、免疫経路の他のアームおよび先天性経路と適応経路との間の相互作用も査定され得る。非修飾親株(対照)と修飾株(低免疫原性の株)との間で比較がなされ得る。
例えば、LDH毒性によって測定されるNK細胞死滅を示唆するin vitroでの免疫原性アッセイは、IL-10および/またはMIFを過剰発現する本発明の低免疫原性の細胞株が、細胞の死滅をより少なく惹起したことを示した。図5を見よ。
HLA-KO iPSCは、NK細胞に媒介される溶解に脆弱であるが、IL-10および/またはMIFを発現するHLA-KO細胞は脆弱でないことが予想された。これを試験するため、NK細胞の脱顆粒アッセイを実施した。CD56+ NK細胞を、NK細胞活性化の出力値としての脱顆粒マーカーCD107aの表面発現についてフローサイトメトリーによって分析した。予想どおり、CD107a+ NK細胞の、IL-10および/またはMIFを発現するHLA-KO細胞との共培養物におけるパーセンテージは、HLA-KO共培養物より有意に低かったが、このことはNK細胞活性がIL-10および/またはMIFによって実際に阻害されることを示唆する。データは、NK細胞の細胞傷害性および脱顆粒が、MIFもしくはIL-10またはその両方を発現するHLA-KO株において有意に低減したことを示した。
加えて、本発明の低免疫原性の細胞または低免疫原性の株に由来する神経前駆細胞(NPC)の異種移植のin vivoでの免疫原性アッセイは、対照と比較して、免疫能力のあるマウス脊髄中の細胞の増加した生存率、ならびにIBA1(アログラフト炎症因子1)の減少した発現を示した。HLA-KOの、MIFおよび/またはIL10過剰発現との組み合わせは、IL-10/MIFの過剰発現がない細胞と比較してマウス脊髄中の細胞の増加した生存率へ繋がった。より具体的に言うと、MIFを発現するHLA-KO細胞は、秀でた生存能および分化能を示した。移植から1週間後にて、細胞は生存することができ、かつ分化し続けてマウス脊髄中で神経ロゼット(neural rosettes)を形成した。移植から2週間後にて、すぐ近くにクラスター化したミクログリアの数が増加したにもかかわらず、移植片は神経系統の分化に沿って存続しており、顕著な神経ロゼットを形成した。我々がこの配置(configuration)にあるこれらの試薬(reagents)が炎症促進性ではないことを予測したとおり、これらの結果はIL-10およびMIFが炎症促進効果を有さないことを示した。
正常マウスおよび免疫無防備状態マウスのin vivoでの奇形腫アッセイもまた、実施され得る。
以下の非限定例は、本発明をさらに解説するために提供される。
例
例1: IL-10のための核酸構築物
IL-10遺伝子の挿入/組み込みのための構築物の非限定例の詳細は、下に提供されるとおりである:
Figure 2023521157000002
Figure 2023521157000003
 (配列番号1)
例2: MIFのための核酸構築物
CAGプロモーターによって推進されるMIF遺伝子を過剰発現させるための、挿入する構築物/部位の非限定例は、下に提供されるとおりである:
Figure 2023521157000004
Figure 2023521157000005
Figure 2023521157000006
 (配列番号2)
例3: 細胞分化
網膜分化
マトリゲルがコーティングされたプレート上の未分化iPSCを、2μMのIWR1(Sigma Aldrich)、10μMのSB431542(Stemgent)、100nMのLDN193189(Stemgent)、および10ng/mlのヒト組換えIGF1(R&D Systems)を含有する網膜誘導培地で5～7日間、毎日培地を変えて処置した。次いで細胞を解離させ、DMEM/F-12 1:1(HyClone)、0.5％ウシ胎仔血清(FBS、Atlanta Biologicals)、1％ペニシリンス トレプトマイシン アムホテリシンB(Lonza)、1％ピルビン酸ナトリウム(Corning)、1％重炭酸ナトリウム(Corning)、1％HEPES緩衝剤(Corning)、1％MEM非必須アミノ酸(Corning)、および1％のN1培地補充物(Sigma Aldrich)から構成される神経幹細胞(NSC)培地中1:3の継代比にて、マトリゲルがコーティングされたプレート上へ継代した。神経-網膜幹細胞を、コンフルエントになったら、Accutase(Global Cell Solutions)を使用し1:3の比にて連続的に継代した。RPEの分化および成熟のため、誘導から2週後にて細胞を、MEM/EBSS(HyClone)を1％FBS、1％ペニシリン ストレプトマイシン アムホテリシンB、1％Glutamax(Gibco)、0.25mg/mlタウリン(Sigma Aldrich)、10μg/mlヒドロコルチゾン(Sigma Aldrich)、および0.0065μg/mlトリヨードチロニン(Sigma Aldrich)とともに、ならびに1％N1培地補充物を含有するRPE培地中、分析するときまで無制限に培養した。
CNS分化
iPSCからのNSCの生成は、これまでに記載されたとおりであった(Swistowski et al.,2009)。手短に言えば、コンフルエントのiPSCを、コラゲナーゼを介して剥がし、100nM LDN193189(Stemgent)、10μM SB431542(Tocris)、2μM パルモルファミン(Stemgent)、3μM CHIR99021(Stemgent)、100ng/ml ソニックヘッジホッグ(Peprotech)、および100ng/ml FGF8(Peprotech)で補充されたSTEMPRO SFM培地(Life Tech.)中、EBとして8日間浮遊培養した。EBは、FGF2の添加によって神経系統へ向かい、NSC維持培地(XCell Science Inc.)中の接着培養において付着させた。付着後、神経管様のロゼット構造体を手作業で解剖し、NSC維持培地中で増殖させた。
例4: 低免疫原性の査定
本発明に従って産生された細胞株の低免疫原性を混合リンパ球反応において査定することで、先天性免疫経路の活性化の欠如が決定できる。混合末梢血細胞を使用して、免疫経路の他のアームおよび先天性経路と適応経路との間の相互作用も査定できる。非修飾親株(対照)と修飾株(低免疫原性の株)との間での比較ができる。
例5: 正常マウスおよび免疫無防備状態マウスにおけるin vivoでの奇形腫アッセイ
5匹のマウスの3群を各々、
群1:NCL2-GFP(対照、親株)
群2:RCL-B-1:NCL2-GFPを親株として使用したB2Mノックアウト(クラスI KO)のクローン)
群3:RCL-BC-1:NCL2-GFPを親株として使用したB2MおよびCIITA KO(クラスIおよびクラスIIの二重KO)のクローン)
を包含する正常マウスにおいて、
群4:NCL2-GFP(対照、親株)
群5:RCL-B-1:NCL2-GFPを親株として使用したB2Mノックアウト(クラスI KO)のクローン)、および
群6:RCL-BC-1:NCL2-GFPを親株として使用したB2MおよびCIITA KO(クラスIおよびクラスIIの二重KO)のクローン)
を包含する免疫無防備状態NCrマウスにおいて試験する。
奇形腫のサイズ、奇形腫の組織学、およびT細胞浸潤を、すべての動物群において査定する。
例6: In vitroでのNK細胞死滅アッセイ
NK細胞死滅アッセイについて、MIFとIL-10との発現が有りおよび無しの低免疫原性の細胞ならびに対照を標的細胞として使用した。40K標的細胞およびNK細胞を、指し示されるエフェクター/標的比にて200μl NK細胞培地中96ウェルU底において20hr共培養した後、上清を回収した。共インキュベーション後に上清を収集し、Pierce(商標)LDH細胞傷害性アッセイキット(ThermoFisher Scientific)によって製造業者の指示に倣い分析した。NK細胞培地(RPMI-10)を背景対照として使用した。単独で培養されたNK細胞または単独で培養された標的細胞を、自発的LDH放出のための対照として使用した。エンドポイントにて溶解された標的細胞を、最大LDH放出として使用した。
例7: NK細胞脱顆粒アッセイ
低免疫原性でかつ非修飾の対照細胞を24ウェルプレートに、アッセイの24時間前に播種した。翌日、細胞をPBSで1度洗浄した後、a-CD107a APC (Biolegend)およびeBioscience(商標)タンパク質輸送インヒビターカクテル(ThermoFisher Scientific)で補充されたNK細胞培地中で100K NK細胞と共インキュベーションした。NK細胞をウェル中へ加えた後、プレートを2,000rpmにて5分間スピンダウンして充分なエフェクター-標的接触を達成させた。20時間のインキュベーション後にNK細胞をa-CD56 PE(Biolegend)で染色した後、FACSCalibur(商標)上CD107a細胞表面発現について分析した。標的細胞のないNK細胞培養物を陰性対照として使用した。PMA(ホルボール12-ミリスタート-13-アセタート)およびイオノマイシンを包含する細胞活性化カクテル(ブレフェルジンAなし)で処置されたNK細胞を、脱顆粒のための陽性対照として使用した。
例8: In vivoでの免疫原性アッセイ
低免疫原性で対照の(非修飾)iPSC株、または低免疫原性iPSC株に由来する神経前駆細胞ならびに対照株に由来する神経前駆細胞を、野生型C57/BL6成体マウス脊髄中へ移植した。動物を安楽死させ、脊髄を移植から1週間後、2週間後、および4週間後に夫々切開した。対照からの数細胞は宿主脊髄中で生存することができたが、MIFおよびIL-10を発現する、より多くのHLA-KOおよびHLA-KO(B2MおよびCIITAの二重ノックアウト)は、移植から1週間後に組み込まれて遊走することができた。重要なことに、IBA1染色は、MIFを発現するHLA-KOで移植された動物において、有意に低減されたマクロファージ/ミクログリア活性化を示した。これらのデータは、IL-10およびMIFを発現するHLA-KOが、動物宿主において低免疫原性細胞の免疫回避を増強することを指し示している。これはまた、MIFおよびIL-10が炎症促進効果を有さなかったという我々の予測も裏付ける。

Claims (14)

  1. クラスIエピトープまたはクラスIIエピトープを発現せず、かつインターロイキン10(IL-10)因子または遊走阻止因子(MIF)因子を過剰発現する、低免疫原性の細胞株。
  2. クラスIエピトープを発現せず、かつクラスIIエピトープを発現しない、請求項1に記載の低免疫原性の細胞株。
  3. IL-10因子およびMIF因子を過剰発現する、請求項1に記載の低免疫原性の細胞株。
  4. iPSCまたは不死化細胞株である、請求項1に記載の低免疫原性の細胞株。
  5. 前記細胞が、クラスIもしくはクラスIIエピトープの削減および/またはIL-10因子もしくはMIF因子の発現増加を呈する細胞の挿入ならびに選択を可能にするのに充分な細胞分裂を経るいずれの増殖性細胞でもある、請求項1に記載の低免疫原性の細胞株。
  6. 前記細胞が、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または造血幹細胞である、請求項1に記載の低免疫原性の細胞株。
  7. セーフ・ハーバー部位へのノックインまたはトランスポゾンによるトランスフェクションによって産生される、請求項1～6のいずれか一項に記載の低免疫原性の細胞。
  8. IL-10因子もしくはMIF因子またはその両方の発現が増加しており、かつクラスIおよび/またはクラスIIの活性の喪失を模倣する追加の因子が加えられている、低免疫原性の細胞株。
  9. 追加の因子が、細胞表面上のHLA抗原の発現を低減させるアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはsiRNA、または翻訳のための修飾、あるいはTおよびB細胞の機能を遮断するかまたは炎症反応を変化させる因子である、請求項8に記載の低免疫原性の細胞。
  10. 先天性免疫応答または適応免疫応答を活性化しない細胞株の産生のための方法であって、該方法が、細胞株を、以下:
    クラスIエピトープまたはクラスIIエピトープを発現しないように、あるいはクラスIおよび/またはクラスIIの活性の喪失を模倣する追加の因子を包含するように;ならびに
    IL-10因子またはMIF因子を発現するように
    修飾することを含む、前記方法。
  11. 細胞株が、クラスIエピトープおよびクラスIIエピトープを発現しないように修飾されている、請求項10に記載の方法。
  12. 細胞株が、IL-10因子およびMIF因子を過剰発現するように修飾されている、請求項10に記載の方法。
  13. 細胞株が、セーフ・ハーバー部位へのノックインまたはトランスポゾンによるトランスフェクションによって修飾されている、請求項10～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 細胞中への挿入または組み込みのための核酸構築物であって、該構築物が、細胞のセーフ・ハーバーにおいて、過剰発現のためのIL-10遺伝子および/またはMIF遺伝子を含む、前記構築物。
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