JP2023518849A - 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するヒトモノクローナル抗体 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と称するコロナウイルスに結合し、且つそれを中和する抗体及びその使用方法に関する。

Description

関連出願の参照
本出願は、２０２０年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，２９９号明細書、２０２０年３月３１日に出願された同第６３／００２，８９６号明細書、２０２０年４月１日に出願された同第６３／００３，７１６号明細書、２０２０年５月１２日に出願された同第６３／０２３，５４５号明細書、２０２０年５月１３日に出願された同第６３／０２４，２０４号明細書、２０２０年５月１３日に出願された同第６３／０２４，２４８号明細書、２０２０年５月１９日に出願された同第６３／０２７，１７３号明細書、２０２０年６月１１日に出願された同第６３／０３７，９８４号明細書、２０２０年６月１７日に出願された同第６３／０４０，２２４号明細書、２０２０年６月１７日に出願された同第６３／０４０，２４６号明細書、２０２１年１月２７日に出願された同第６３／１４２，１９６号明細書及び２０２１年３月１６日に出願された同第６３／１６１，８９０号明細書に対する優先権を主張するものであり、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の補助金の開示
本発明は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）によって交付されたＨＲ００１１－１８－２－０００１及びアメリカ国立アレルギー・感染症研究所／アメリカ国立衛生研究所によって交付されたＨＨＳ契約書７５Ｎ９３０１９Ｃ０００７４に基づき、政府の援助を受けてなされた。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
電子的に提出された配列表の参照
電子的に提出された配列表の内容（名称：４８１５－００１ＰＣ０Ｄ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：８７，７６９バイト；及び作成日：２０２１年３月２４）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、医薬、感染症疾患及び免疫の分野に関する。より詳細には、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と称する新型コロナウイルスに結合するヒト抗体及びその使用方法に関する。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染は、中国本土で発症し、加えて他の１７９ヶ国及び領域でも発症した。新型コロナウイルスは、中国湖北省の省都である武漢で特定されており、その後、明らかな原因もなく４１人が肺炎を発症した。コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と称される急性呼吸器疾患を引き起こすウイルスは、人から人への蔓延が可能である。潜伏期間（暴露から症状の発症までの時間）は、平均３～５日として０～２４日の範囲であるが、この期間中及び回復後に伝染性となる可能性がある。症状としては、発熱、咳嗽及び呼吸困難が挙げられる。２０２０年２月の死亡率の推定値は、確認された症例の２％であり、入院が必要な人々の間ではより高いものであった。
２０２０年２月１０日時点で、中国の省レベルの区域の全てを含めて４０，６２７例の症例が確認されている（６，４９５例が重篤）。より多くの人々が感染している可能性があるが、（特に軽度の症例では）検出されていない。２０２０年２月１０日時点で、１月９日に最初に確認された死亡例以来、９１０例の死亡例がこのウイルスに起因しており、３，３２３例が回復している。中国国外の最初の地域的な伝播は、ベトナムの家族間で発生しているが、家族に関連しない最初の国家間での伝播は、ドイツで１月２２日に発生している。中国国外での最初の死亡例は、フィリピンにおけるものであり、武漢出身の男性が２月１日に死亡している。２０２０年２月１０日時点で、このウイルスに起因する死亡者数は、２００３年の世界的規模のＳＡＲＳの大流行を上回っていた。
２０２０年２月初旬時点では、認可されたワクチン及び特定の治療法が存在していなかったが、いくつかのワクチン手法及び抗ウイルス薬が研究されている。この大流行により、医療制度が脆弱な国々に蔓延する場合にウイルスが有する可能性のある起こり得る影響に基づき、世界保健機構（ＷＨＯ）により、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）が宣言されている。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生物学及び病理学並びに本ウイルスに対するヒト免疫応答を調査する喫緊の必要性が存在する。
従って、本開示によれば、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＣＯＶＩＤ－１９感染症を検出する方法であって、（ａ）前記対象由来の試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｂ）前記試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原への前記抗体又は抗体フラグメントの結合により、前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することとを含む方法が提供される。試料は、体液、例えば血液、痰、涙液、唾液、粘液又は血清、精液、頸管粘液又は膣分泌物、羊水、胎盤組織、尿、滲出液、漏出液、組織擦過物又は糞便であり得る。検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテラルフローアッセイ又はウエスタンブロットを含み得る。本方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を２回実行することと、最初のアッセイと比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原レベルの変化を測定することとを更に含み得る。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合し得る。抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。
別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を治療するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減する方法であって、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む方法が提供される。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体又は二重特異性抗体であり得る。抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、表面スパイクタンパク質などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合し得る。抗体又は抗体フラグメントは、感染前又は感染後に投与され得る。対象は、６０歳以上であり得るか、易感染性であり得るか、又は呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患っていることができる。送達は、抗体又は抗体フラグメントの投与或いは抗体又は抗体フラグメントをコードするＲＮＡ配列若しくはＤＮＡ配列又はベクターによる遺伝子送達を含み得る。
なお別の実施形態では、モノクローナル抗体であって、抗体又は抗体フラグメントは、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、モノクローナル抗体が提供される。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体であり得、二重特異性抗体であるか又は細胞内抗体である。抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合し得る。
抗体又は抗体フラグメントをコードするハイブリドーマ又は改変細胞であって、抗体又は抗体フラグメントは、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、ハイブリドーマ又は改変細胞である。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体又は細胞内抗体であり得る。抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合し得る。
更になお別の実施形態では、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、１つ以上の抗体又は抗体フラグメントを含むワクチン製剤が提供される。前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表１のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列、表１のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含み得るか、又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。前記抗体フラグメントの少なくとも１つは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。前記抗体の少なくとも１つは、キメラ抗体、二重特異性抗体又は細胞内抗体であり得る。抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の表面スパイクタンパク質に結合し得る。
更なる実施形態では、本明細書で記載されるような第１の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを含むワクチン製剤が提供される。発現ベクターは、シンドビスウイルスベクター又はＶＥＥベクターであり得る。ワクチンは、針による注射、ジェット注射又はエレクトロポレーションによる送達のために製剤化され得る。ワクチン製剤は、請求項２６～３４の別個の抗体又は抗体フラグメントなど、第２の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを更に含み得る。
なお更なる実施形態では、６０歳以上の対象、易感染性の対象又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているか若しくは感染するリスクのある、呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患う対象の健康を保護する方法であって、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む方法が提供される。抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列又は表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体は、キメラ抗体又は二重特異性抗体であり得る。前記抗体又は抗体フラグメントは、感染前又は感染後に投与され得る。抗体又は抗体フラグメントは、表面スパイクタンパク質などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合し得る。送達は、抗体又は抗体フラグメントの投与或いは抗体又は抗体フラグメントをコードするＲＮＡ配列若しくはＤＮＡ配列又はベクターによる遺伝子送達を含み得る。抗体又は抗体フラグメントは、無治療対照と比較して対象の呼吸を改善することができ、且つ／又は無治療対照と比較してウイルス負荷を低減することができる。
なお更なる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断する方法であって、（ａ）前記抗原を含む試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する第１の抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｂ）前記抗原への前記第１の抗体又は抗体フラグメントの検出可能な結合により、前記抗原の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断することとを含む方法が提供される。試料は、組換え産生された抗原又はワクチン製剤又はワクチン製造バッチを含み得る。検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴法を用いるバイオセンサー若しくはバイオレイヤー干渉法又はフローサイトメトリー染色を含み得る。第１の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。第１の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含み得るか、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得るか、又は表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。第１の抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。本方法は、抗原の抗原安定性を経時的に判断するために、工程（ａ）及び（ｂ）を２回実行することを更に含み得る。
本方法は、（ｃ）前記抗原を含む試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する第２の抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｄ）前記抗原への前記第２の抗体又は抗体フラグメントの検出可能な結合により、前記抗原の抗原完全性を判断することとを更に含み得る。第２の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列又は表１に記載されるようなクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされ得る。第２の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含み得るか、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％若しくは９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得るか、又は表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含み得る。第２の第１の抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントであり得る。本方法は、抗原の抗原安定性を経時的に判断するために、工程（ｃ）及び（ｄ）を２回実行することを更に含み得る。
ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント又はそれを産生するハイブリドーマ若しくは改変細胞も提供され、前記抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の表面スパイクタンパク質に結合する。
本明細書に提供される一態様（Ａ１）では、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＣＯＶＩＤ－１９感染症を検出する方法は、（ａ）前記対象由来の試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｂ）前記試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原への前記抗体又は抗体フラグメントの結合により、前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することとを含む。Ａ１の一態様では（Ａ２）、前記試料は、体液である。Ａ１又はＡ２の一態様では（Ａ３）、前記試料は、血液、痰、涙液、唾液、粘液又は血清、精液、頸管分泌物又は膣分泌物、羊水、胎盤組織、尿、滲出液、漏出液、組織擦過物又は糞便である。Ａ１～Ａ３のいずれか１つの一態様では（Ａ４）、検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテラルフローアッセイ又はウエスタンブロットを含む。Ａ１～Ａ４のいずれか１つの一態様では（Ａ５）、本方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を２回実行することと、最初のアッセイと比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原レベルの変化を測定することとを更に含む。Ａ１～Ａ５のいずれか１つの一態様では（Ａ６）、抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列によってコードされる。Ａ１～Ａ５のいずれか１つの一態様では（Ａ７）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ１～Ａ５のいずれか１つの一態様では（Ａ８）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対配列と１００％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ１～Ａ５のいずれか１つの一態様では（Ａ９）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ１～Ａ５のいずれか１つの一態様では（Ａ１０）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ１～Ａ１０のいずれか１つの一態様では（Ａ１１）、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する。Ａ１～Ａ１１のいずれか１つの一態様では（Ａ１２）、抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。
本明細書に提供される一態様では（Ａ１３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を治療するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減する方法は、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む。Ａ１３の一態様では（Ａ１４）、抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ１３又はＡ１４の一態様では（Ａ１５）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ１３の一態様では（Ａ１６）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ１３の一態様では（Ａ１７）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ１３の一態様では（Ａ１８）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ１３～Ａ１８のいずれか１つの一態様では（Ａ１９）、抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ１３～Ａ１９のいずれか１つの一態様では（Ａ２０）、前記抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである。Ａ１３～Ａ１８のいずれか１つの一態様では（Ａ２１）、前記抗体は、キメラ抗体又は二重特異性抗体である。Ａ１３～Ａ２１のいずれか１つの一態様では（Ａ２２）、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する。Ａ１３～Ａ２２のいずれか１つの一態様では（Ａ２３）、前記抗体又は抗体フラグメントは、感染前又は感染後に投与される。Ａ１３～Ａ２３のいずれか１つの一態様では（Ａ２４）、前記対象は、６０歳以上であるか、易感染性であるか、又は呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患っている。Ａ１３～Ａ２４のいずれか１つの一態様では（Ａ２５）、送達は、抗体又は抗体フラグメントの投与或いは抗体又は抗体フラグメントをコードするＲＮＡ配列若しくはＤＮＡ配列又はベクターによる遺伝子送達を含む。
一態様では（Ａ２６）、モノクローナル抗体であて、抗体又は抗体フラグメントは、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、モノクローナル抗体が本明細書に提供される。Ａ２６の一態様では（Ａ２７）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ２６の一態様では（Ａ２８）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ２６の一態様では（Ａ２９）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ２６の一態様では（Ａ３０）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ２６～Ａ３０のいずれか１つの一態様では（Ａ３１）、抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ２６～Ａ３０のいずれか１つの一態様では（Ａ３２）、前記抗体は、キメラ抗体であるか又は二重特異性抗体である。Ａ２６～Ａ３２のいずれか１つの一態様では（Ａ３３）、前記抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである。Ａ２６～Ａ３３のいずれか１つの一態様では（Ａ３４）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表面スパイクタンパク質などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する。Ａ２６～Ａ３４のいずれか１つの一態様では（Ａ３５）、前記抗体は、細胞内抗体である。
本明細書に提供される一態様では（Ａ３６）、ハイブリドーマ又は改変細胞は、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる抗体又は抗体フラグメントをコードする。Ａ３６の一態様では（Ａ３７）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ３６の一態様では（Ａ３８）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ３６の一態様では（Ａ３９）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対可変配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ３６の一態様では（Ａ４０）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ３６の一態様では（Ａ４１）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ３６の一態様では（Ａ４２）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ３６～Ａ４２のいずれか１つの一態様では（Ａ４３）、抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ３６～Ａ４３のいずれか１つの一態様では（Ａ４４）、前記抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体又は細胞内抗体である。Ａ３６～Ａ４３のいずれか１つの一態様では（Ａ４５）、前記抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである。Ａ３６～Ａ４５のいずれか１つの一態様では（Ａ４６）、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する。
本明細書に提供される一態様では（Ａ４７）、ワクチン製剤は、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列によって特徴付けられる、１つ以上の抗体又は抗体フラグメントを含む。Ａ４７の一態様では（Ａ４８）、前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表１のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ４７の一態様では（Ａ４９）、前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表１のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ４７の一態様では（Ａ５０）、前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表１のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ４７の一態様では（Ａ５１）、前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ４７の一態様では（Ａ５２）、前記抗体又は抗体フラグメントの少なくとも１つは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ４７～Ａ５２のいずれか１つの一態様では（Ａ５３）、前記抗体フラグメントの少なくとも１つは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ４７～Ａ５２のいずれか１つの一態様では（Ａ５４）、前記抗体の少なくとも１つは、キメラ抗体であり、二重特異性抗体又は細胞内抗体である。Ａ４７～Ａ５４のいずれか１つの一態様では（Ａ５５）、前記抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである。Ａ４７～Ａ５５のいずれか１つの一態様では（Ａ５６）、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する。
本明細書に提供される一態様では（Ａ５７）、ワクチン製剤は、Ａ２６～Ａ３４のいずれか１つによる第１の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを含む。Ａ５７の一態様では（Ａ５８）、前記発現ベクターは、シンドビスウイルスベクター又はＶＥＥベクターである。Ａ５７又はＡ５８の一態様では（Ａ５９）、ワクチン製剤は、針による注射、ジェット注射又はエレクトロポレーションによる送達のために製剤化される。Ａ５７の一態様では（Ａ６０）、ワクチン製剤は、Ａ２６～Ａ３４のいずれか１つの別個の抗体又は抗体フラグメントなど、第２の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを更に含む。
本明細書に提供される一態様では（Ａ６１）、６０歳以上の対象、易感染性の対象又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているか若しくは感染するリスクのある、呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患う対象の健康を保護する方法は、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む。Ａ６１の一態様では（Ａ６２）、抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ６１又はＡ６２の一態様では（Ａ６３）、抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるような少なくとも９５％の同一性を有するクローン対軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ６１又はＡ６２の一態様では（Ａ６４）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表１のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ６１の一態様では（Ａ６５）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ６１の一態様では（Ａ６６）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ６１の一態様では（Ａ６７）、前記抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ６１～Ａ６７のいずれか１つの一態様では（Ａ６８）、抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ６１～Ａ６８のいずれか１つの一態様では（Ａ６９）、前記抗体は、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである。Ａ６１～Ａ６７のいずれか１つの一態様では（Ａ７０）、前記抗体は、キメラ抗体又は二重特異性抗体である。Ａ６１～Ａ７０のいずれか１つの一態様では（Ａ７１）、前記抗体又は抗体フラグメントは、感染前又は感染後に投与される。Ａ６１～Ａ７１のいずれか１つの一態様では（Ａ７２）、前記抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する。Ａ６１～Ａ７２のいずれか１つの一態様では（Ａ７３）、送達は、抗体又は抗体フラグメントの投与或いは抗体又は抗体フラグメントをコードするＲＮＡ配列若しくはＤＮＡ配列又はベクターによる遺伝子送達を含む。Ａ６１の一態様では（Ａ７４）、抗体又は抗体フラグメントは、無治療対照と比較して対象の呼吸を改善する。Ａ６１の一態様では（Ａ７５）、抗体又は抗体フラグメントは、無治療対照と比較してウイルス負荷を低減する。
本明細書に提供される一態様では（Ａ７６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断する方法は、（ａ）前記抗原を含む試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する第１の抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｂ）前記抗原への前記第１の抗体又は抗体フラグメントの検出可能な結合により、前記抗原の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断することとを含む。Ａ７６の一態様では（Ａ７７）、前記試料は、組換え産生された抗原を含む。Ａ７６の一態様では（Ａ７８）、前記試料は、ワクチン製剤又はワクチン製造バッチを含む。Ａ７６～Ａ７８の一態様では（Ａ７９）、検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴法若しくはバイオレイヤー干渉法を用いるバイオセンサー又はフローサイトメトリー染色を含む。Ａ７６～Ａ７９の一態様では（Ａ８０）、第１の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列によってコードされる。Ａ７６～Ａ７９の一態様では（Ａ８１）、前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ７６～Ａ７９のいずれか１つの一態様では（Ａ８２）、前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ７６～Ａ７９のいずれか１つの一態様では（Ａ８３）、前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ７６～Ａ７９のいずれか１つの一態様では（Ａ８４）、前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ７６～Ａ７９のいずれか１つの一態様では（Ａ８５）、前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ７６～Ａ８５のいずれか１つの一態様では（Ａ８６）、第１の抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ７６～Ａ８６のいずれか１つの一態様では（Ａ８７）、本方法は、抗原の抗原安定性を経時的に判断するために、工程（ａ）及び（ｂ）を２回実行することを更に含む。Ａ７６～Ａ８７のいずれか１つの一態様では（Ａ８８）、本方法は、（ｃ）前記抗原を含む試料を、それぞれ表３及び４のクローン対重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する第２の抗体又は抗体フラグメントに接触させることと、（ｄ）前記抗原への前記第２の抗体又は抗体フラグメントの検出可能な結合により、前記抗原の抗原完全性を判断することとを更に含む。Ａ８８の一態様では（Ａ８９）、第２の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列によってコードされる。Ａ８９の一態様では（Ａ９０）、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対可変配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ８９の一態様では（Ａ９１）、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、表１に記載されるようなクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列によってコードされる。Ａ８９の一態様では（Ａ９２）、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列に従った軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ８９の一態様では（Ａ９３）、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ８９の一態様では（Ａ９４）、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、表２のクローン対配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変配列を含む。Ａ８９の一態様では（Ａ９５）、第２の抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである。Ａ８９の一態様では（Ａ９６）、本方法は、抗原の抗原安定性を経時的に判断するために、工程（ｃ）及び（ｄ）を２回実行することを更に含む。
本明細書に提供される一態様では（Ａ９７）、ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント又はそれを産生するハイブリドーマ若しくは改変細胞であって、前記抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する、ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント又はそれを産生するハイブリドーマ若しくは改変細胞である。
単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において用語「含む」と共に使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」の意味とも一致する。単語「約」は、明記された数のプラス又はマイナス５％を意味する。
任意の本明細書で記載される方法又は組成物は、任意の他の本明細書で記載される方法又は組成物に対して実行され得ることが意図される。本開示の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本開示の特定の実施形態を示すが、本開示の趣旨及び範囲内の種々の変更形態及び修正形態がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、単に実例として与えられることを理解すべきである。
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれる。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公報のコピーは、要請があり、必要な手数料を支払うことで特許庁により提供される。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、更に本開示の特定の態様を実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と共に、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解することができる。
生きたＢＳＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いた、ＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０のカクテルによる相乗的な中和活性を評価する用量反応マトリックス。個々のｍＡｂの最も高い試験濃度（２５０ｎｇ／ｍＬ）（０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６＋２５０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０及び２５０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６＋０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０の枠）では、ごくわずかに中和されていないウイルスが定性的に存在したが、組み合わせによる低いＡｂ濃度の範囲では完全に中和されていた（１００％）。１５．６ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６＋６３ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０の枠は、１５．６ｎｇ／ｍＬのｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６及び６３ｎｇ／ｍＬのｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０を併用することによって最大の相乗効果があり、ウイルスの９６％を中和した領域を示しているが、個々のＡｂでは、それぞれ６又は０％（０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６＋６３ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０及び１５．６ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６＋０ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０における楕円形）の中和のみを示した。３回の技術的反復の平均値が示されている。 ＢＳＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスを用いた、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６＋ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０のカクテルによる相乗的な中和活性を評価する用量反応マトリックス。技術的反復の３回の値の平均が示されている。データを可視化し、ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して相乗効果を評価した。 ＢＳＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスを用いた、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６＋ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０のカクテルによる相乗的な中和活性を評価する用量反応マトリックス。相乗効果スコアの説明：＜－１０：相互作用が拮抗的である可能性が高い；－１０～１０：相互作用が相加的である可能性が高い；＞１０：相互作用が相乗的である可能性が高い。 構築されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する中和ヒトｍＡｂの治療効果。（図４Ａ）マウスを１０５ＰＦＵのＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内経路によって接種し、１２時間後、指示された抗体治療剤を腹腔内注射によって与えた。ウイルスをチャレンジして２日後、プラークアッセイによって肺のウイルス負荷を測定した。個々のマウスの測定値及び力価の中央値を示し、ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡを用いて、各群をアイソタイプ対照と比較した（＊ｐ＜０．０５）。データは、１回の実験を表す。（図４Ｂ）１０～１１週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（１回の実験での１群当たり３～９匹のマウス）を抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂで治療し、１日後に鼻腔内経路によってＡｄＶ－ｈＡＣＥ２で形質導入した。４日後、マウスを１０５ＦＦＵの標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内経路によって接種し、１２時間後、指示されたｍＡｂ治療剤を腹腔内注射によって与えた。ウイルスをチャレンジして２ｄｐｉに、プラークアッセイによって肺のウイルス負荷を測定した。プラーク中和アッセイを実行するための２つの対照には、感染しなかった個体又はｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０カクテルで治療したマウス由来の肺ホモジネートと１：１（体積：体積）で混合した、個々のアイソタイプ治療マウス由来の肺ホモジネートが含まれていた。個々のマウスの測定値及び力価の中央値を示し、ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡを用いて、各群をアイソタイプ対照と比較した（＊＊ｐ＜０．０１）。データは、１回の実験を表す。（図４Ｃ）サイトカイン及びケモカインの遺伝子発現を、図４Ｂのように採取された肺からｑＰＣＲ分析によって測定した。個々のマウスの測定値及び中央値を示す。マン・ホイットニーＵ検定を用いて群を比較した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。 ヒトｍＡｂをマカクに注入した後の抗体の薬物動態。 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる鼻腔内及び気管内チャレンジ後のマカクの気管支肺胞洗浄液検査における（サブゲノムの新たに生成されたＲＮＡとして測定した）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷。 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる鼻腔内及び気管内チャレンジ後のマカクの鼻腔スワブ検体における（サブゲノムの新たに生成されたＲＮＡとして測定した）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷。 Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１９６と複合体化したＳタンパク質のＲＢＤの結晶構造。（図８Ａ）ＲＢＤと複合体化したＣＯＶ２－２１９６の概略的な表現。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖を青緑色で、軽鎖を紫紅色で、且つＲＢＤを緑色で示す。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図８Ａで見ることができる。（図８Ｂ）ＣＯＶ２－２１９６－ＲＢＤ複合体の構造を、ＲＢＤ構造を基準として用いて、ＲＢＤ－ヒトＡＣＥ２複合体の構造（ＰＤＢ ＩＤ：６Ｍ０Ｊ）に重ね合わせている。ＣＯＶ２－２１９６－ＲＢＤ複合体の配色は、図８Ａのものと同じである。ＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体中のＲＢＤを明るい青色で、ヒトＡＣＥ２ペプチダーゼドメインを灰色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図８Ｂで見ることができる。（図８Ｃ）ＣＯＶ２－２１９６－ＲＢＤ複合体の構造を、「上向きの」立体構造のＲＢＤを基準として用いて、「上向きの」立体構造の単体のＲＢＤを有するスパイクの構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＸＭ４）に重ね合わせている。ＣＯＶ２－２１９６－ＲＢＤ複合体の配色は、図８Ａのものと同じである。スパイクの３つのサブユニットを灰色、黄色又は明るい青でそれぞれ着色している（「上向きの」立体構造のＲＢＤを含むサブユニットは、黄色である）。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図８Ｃで見ることができる。（図８Ｄ）ＣＯＶ２－２１９６によって認識されるＲＢＤのエピトープの概略的な表現。エピトープ残基を異なる濃淡の緑色で着色し、黒でラベル表示している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図８Ｄで見ることができる。（図８Ｅ）ＣＯＶ２－２１９６及びＲＢＤ間の抗体－抗原相互作用。ＲＢＤは、図８Ｄのものと同じ表面表現及び向きとで示されている。ＣＯＶ２－２１９６のパラトープ残基は、棒表示で示されている。重鎖を青緑色で着色し、軽鎖を紫紅色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図８Ｅで見ることができる。 Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の両方と複合体化したＳタンパク質のＲＢＤの結晶構造。（図９Ａ）ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０のＦａｂの両方と複合体化したＳタンパク質のＲＢＤの結晶構造の概略的な表現。ＲＢＤを緑色で、ＣＯＶ２－２１９６の重鎖を青緑色で、ＣＯＶ２－２１９６の軽鎖を紫紅色で、ＣＯＶ２－２１３０の重鎖を黄色で、且つＣＯＶ２－２１３０の軽鎖をオレンジ色で示す。ＣＯＶ２－２１３０のＣＤＲがラベル表示されている。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ａで見ることができる。（図９Ｂ）ＣＯＶ２－２１３０－ＲＢＤ複合体の構造を、ＲＢＤ構造を基準として用いて、ＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体の構造（ＰＤＢ ＩＤ：６Ｍ０Ｊ）に重ね合わせている。ＣＯＶ２－２１３０－ＲＢＤ複合体の配色は、図９Ａのものと同じである。ＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体中のＲＢＤを明るい青色で、ヒトＡＣＥ２ペプチダーゼドメインを灰色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ｂで見ることができる。（図９Ｃ）ＣＯＶ２－２１３０－ＲＢＤ複合体の構造を、あるプロトマー内のＲＢＤを基準として用いて、「下向きの」立体構造の全てのＲＢＤを含むスパイクの構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＺＯＹ）に重ね合わせている。ＣＯＶ２－２１３０－ＲＢＤ複合体の配色は、図９Ａのものと同じである。スパイクの３つのプロトマーを灰色、明るい青又は紫色でそれぞれ着色した。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ｃで見ることができる。（図９Ｄ）ＣＯＶ２－２１９６－２１３０－ＲＢＤ複合体の構造を、「上向きの」立体構造のＲＢＤを基準として用いて、「上向きの」立体構造の１つのＲＢＤを含むスパイクの構造（ＰＤＢ ＩＤ：７ＣＡＫ）に重ね合わせている。ＣＯＶ２－２１３０－ＲＢＤ複合体の配色は、図９Ａのものと同じである。スパイクの３つのプロトマーを灰色、明るい青又は紫色でそれぞれ着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ｄで見ることができる。（図９Ｅ）ＣＯＶ２－２１３０によって認識されるＲＢＤのエピトープの概略的な表現。エピトープ残基を異なる色で示し、黒でラベル表示している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ｅで見ることができる。（図９Ｆ）ＣＯＶ２－２１３０のパラトープ残基とエピトープとの相互作用。ＲＢＤは、図９Ｅのものと同じ表面表現及び向きとで示されている。パラトープ残基は、棒表示で示されている。重鎖を黄色で着色し、軽鎖をオレンジ色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図９Ｆで見ることができる。 （図１０Ａ）ＣＯＶ２－２１９６の重鎖及び軽鎖のＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎの結果。主要な相互作用残基及びそれらの対応する生殖系列遺伝子の残基を枠内に示す。図１０Ａ内の配列の配列番号を以下に示す。
Figure 2023518849000001
 （図１０Ｂ）ＣＯＶ２－２１９６の点突然変異体の結合曲線。上記において枠で囲った重鎖の点突然変異体をコードするｃＤＮＡを、組換えＩｇＧタンパク質を作製するためにＤＮＡとして設計及び合成し、スパイクタンパク質への結合活性について検査した。Ｄ１０８残基の変異体は、左上のグラフであり、生殖系列配列への推測される体細胞変異の復帰変異体変異は、右上のグラフであり、Ｐ９９変異体は、左下のグラフであり、ＨＣＤＲ３のジスルフィド結合を除去した変異体は、右下のグラフである。
耐性変異体の選択と組み合わせた網羅的突然変異スキャニングによる、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０に重要な残基の同定。（図１１Ａ）ＣＯＶ２－２１９６（左）又はＣＯＶ２－２１３０（右）の強力な回避を伴うＲＢＤ部位の全ての変異回避割合のロゴプロット。文字が高く伸びているほど、抗体結合回避がより大きくなることを示す。ＲＢＤのヒトＡＣＥ２への結合を低減する程度に基づいて変異を着色している。図示されるデータは、２つの独立した酵母菌ライブラリーを用いた２つの独立した回避選択実験の平均である。相関関係を図１８Ｂ～Ｃに示す。これらのロゴプロットの双方向的で拡大可能なバージョンは、ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓ／に存在する。本発明者らは、０の値が、変異体が常に抗体に結合していることを意味し、１の値が、常に抗体結合を回避することを意味するような、抗体回避ビンに該当する特定の変異体を発現する細胞の推定された割合であることを示す方法に記載されるような回避割合を測定した。（図１１Ｂ）回避選択に用いられるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１参考株由来の一塩基置換によって到達可能となるＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の変異回避割合のロゴプロット（図１１Ｅ～Ｆ）。ＡＣＥ２の結合に及ぼすそれぞれの置換の影響を図１１Ａに示す。（図１１Ｃ）左パネル：ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６構造内のＲＢＤ表面にマッピングしたＣＯＶ２－２１９６の網羅的突然変異スキャニング回避変異体。ヒートマップを用いてＣＯＶ２－２１９６の結合を抑制する変異をＲＢＤ構造上に表示し、青色は、最も多く累積した抗体回避を伴うＲＢＤ部位を示し、白色は、回避が検出されなかったことを示す。灰色は、ＲＢＤの発現に及ぼす有害作用により、抗体結合における変異の影響についての評価が妨げられた残基を表す。右パネル：左パネルを拡大したものであり、ＲＢＤの最も強力な回避部位の周囲で相互作用する残基を示す。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖を青緑色で着色し、軽鎖を紫紅色で着色している。図１１Ａに記載したように、独立したライブラリーで２回の反復を実行した。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図１１Ｃで見ることができる。（図１１Ｄ）右パネル：ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１３０構造内のＲＢＤ表面にマッピングしたＣＯＶ２－２１３０の網羅的突然変異スキャニング回避変異体。図１１Ｃのように、ヒートマップを用いてＣＯＶ２－２１３０の結合を抑制する変異をＲＢＤ構造上に表示した。左パネル：左パネルを拡大したものであり、ＲＢＤの最も強力な回避部位の周囲で相互作用する残基を示す。ＣＯＶ２－２１３０の重鎖を黄色で着色し、軽鎖をサーモンピンクで着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の図１１Ｄで見ることができる。（図１１Ｅ）ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及びそれらを併用したものによるＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避選択実験の結果を示す表。選択された回避変異体の数及び実行された回避選択複写物の合計数並びに回避変異ウイルスを配列決定することによって同定された残基が記載されている。（図１１Ｆ）亜中和濃度のＡＺＤ８８９５（ＣＯＶ２－２１９６をベースとした）、ＡＺＤ１０６１（ＣＯＶ２－２１３０をベースとした）及びＡＺＤ７４４２（ＡＺＤ８８９５＋ＡＺＤ１０６１）の存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を継代した結果を示す表。中和耐性のあるプラークを配列決定することによって同定された耐性関連ウイルス変異が表示されている。（図１１Ｇ）ｘ軸が変異回避割合であり、ｙ軸がＡＣＥ２結合に及ぼす影響である、図１１ＡのＤＭＳデータを示す散布図。×は、多塩基置換によってのみ到達可能な変異を意味する一方、○は、一塩基置換によって到達可能な変異を示す。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｋ４４４Ｒ、Ｋ４４４Ｅ）又は標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｒ３４６Ｉ）において、ＣＯＶ２－２１３０によって選択されたアミノ酸置換が表示されている。（図１１Ｈ）ＦＲＮＴによって測定された、参考株及び目的のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する抗体中和。中和アッセイを２回実施して２回繰り返し、１回の実験的反復からの結果を示す。エラーバーは、それぞれの点の範囲を表す。ＷＡ－１参考株と比較した変異が表示されている。Ｂ．１．１．７－ＯＸＦには、６９～７０及び１４４～１４５の欠失並びに以下の置換：Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ及びＴ７１６Ｉが含まれている。 ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６－２１３０複合体内のＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６の下部構造と、ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６の結晶構造との重ね合わせ。 ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６及びスパイク－Ｓ２Ｅ１２複合体間で共有されたＲＢＤ部位のＦ４８６における、類似した芳香族スタッキング及び疎水性相互作用パターン。（図１３Ａ及びＢ）２つの複合体の構造内で残基Ｆ４８６を取り囲む同一の水素結合パターン。（図１３Ｃ）ＣＯＶ２－２１９６及びＲＢＤ間の詳細な相互作用。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖を青緑色で着色し、軽鎖を紫紅色で着色し、ＲＢＤを緑色で着色している。重要な相互作用残基を棒表示で示す。Ａｂ－Ａｇ相互作用に関与する水分子をピンク色の球体として表している。直接的な水素結合をオレンジ色の破線で、水によって媒介される水素結合を黄色の破線で示す。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図２Ｃで見ることができる。（図１３Ｄ）Ｓ２Ｅ１２／ＲＢＤのクライオＥＭ構造を、抗体の可変ドメインを基準として、ＣＯＶ２－２１９６／ＲＢＤの結晶構造に重ね合わせたもの。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖は、青緑色であり、軽鎖は、紫紅色であり、Ｓ２Ｅ１２の重鎖は、淡い青緑色であり、軽鎖は、明るいピンク色である。２つの対応するＲＢＤ構造は、それぞれ緑色又は黄色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図２Ｄで見ることができる。（図１３Ｅ）ＣＯＶ２－２１３０の重鎖及びＲＢＤ間の詳細な相互作用。パラトープ残基を棒表示で示し、黄色で着色し、エピトープ残基を緑色の棒で示している。水素結合又は強い極性の相互作用は、紫紅色の破線として表されている。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図２Ｅで見ることができる。（図１３Ｆ）ＣＯＶ２－２１３０の軽鎖及びＲＢＤ間の詳細な相互作用。パラトープ残基を棒表示で示し、オレンジ色で着色し、エピトープ残基を緑色の棒で示している。水素結合は、紫紅色の破線として表されている。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図２Ｆで見ることができる。 同一の結合メカニズムを有する抗ＲＢＤ抗体の一般的なクローン型。（図１４Ａ）ＣＯＶ２－２１９６／ＲＢＤの結晶構造。（図１４Ｂ）Ｓ２Ｅ１２／ＲＢＤのクライオＥＭ構造。（図１４Ｃ）ＣＯＶ２－２３８１／ＲＢＤの相同性モデル。ＣＯＶ２－２０７２は、ＨＣＤＲ３にＮ－結合型グリコシル化シークオンをコードしており、灰色の球体で示されている。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図３Ｄで見ることができる。（図１４Ｄ）ＣＯＶ２－２０７２／ＲＢＤの相同性モデル。（図１４Ｅ）ＣＯＶ２－２１９６／ＲＢＤの結晶構造（図１４Ａ）と、Ｓ２Ｅ１２／ＲＢＤのクライオＥＭ構造（図１４Ｂ）の重ね合わせ。 ウイルス未感作の個体の抗体可変遺伝子レパートリーにおける、ＣＯＶ２－２１９６に遺伝的に類似した推定上のパブリッククローン型メンバーの同定。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖（図１５Ａ）及び軽鎖（図１５Ａ及び１５Ｂ）と同じ配列の特徴を有する健常者由来の抗体可変遺伝子配列をアライメントしている。異なる３人のドナー由来の配列及び臍帯血に、パブリッククローン型の特徴を有する配列が含まれていた。配列の特徴及びＣＯＶ２－２１９６に用いられる接触残基は、各多重配列アライメントの下の枠で強調されている（枠は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図４Ａでは赤色で着色されている）。図１５Ａの重鎖配列の配列番号は、以下の通りである：ＨＩＰ１：配列番号１６６、ＨＩＰ２：配列番号１６７、ＨＩＰ３：配列番号１６８及びＣＯＲＤ：配列番号１６９。図１５Ａの軽鎖配列の配列番号は、以下の通りである：ＨＩＰ１：配列番号１７０、ＨＩＰ２：配列番号１７１及びＨＩＰ３：配列番号１７２。図１５ＢのＨＩＰ１の軽鎖配列の配列番号は、以下の通りである：配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７（上から下）。図１５ＢのＨＩＰ２の軽鎖配列の配列番号は、以下の通りである：配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１及び配列番号１８２（上から下）。図１５ＢのＨＩＰ３の軽鎖配列の配列番号は、以下の通りである：配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７（上から下）。 （図１６Ａ）詳細なＣＯＶ２－２１３０のＨＣＤＲ３ループ構造。ループの立体構造を安定化する近距離の水素結合を破線で示す（破線は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図５Ａでは紫紅色で着色されている）。（図１６Ｂ）ＣＯＶ２－２１３０の軽鎖の残基は、ＨＣＤＲ３と芳香族スタッキング相互作用及び水素結合を形成し、更にＨＣＤＲ３ループを安定化させる。（図１６Ｃ）長いＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ＲＢＤエピトープに相補的な結合表面を形成する。ＲＢＤは、灰色の表面表現として示されている。ＣＯＶ２－２１３０の重鎖を黄色で、ＨＣＤＲ３をオレンジ色で着色し、軽鎖をサーモンピンクで、ＬＣＤＲ１を紫紅色で着色している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図３Ｄで見ることができる。（図１６Ｄ）図１６Ｃを１８０°回転させた図。 ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０と複合体化したＲＢＤの結晶構造における、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０間の界面。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖又は軽鎖は、それぞれ青緑色又は紫紅色で概略的に示されており、ＣＯＶ２－２１３０の重鎖又は軽鎖は、それぞれ黄色又はサーモンピンクで示されている。ＲＢＤは、緑色で着色されている。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図６で見ることができる。界面残基を棒表示で示す。 抗体結合に影響する変異の網羅的突然変異スキャニングによる同定及びＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる抗体耐性変異体の選択方法。（図１８Ａ）上：前方散乱光及び側方散乱光を使用して単一の酵母細胞を選択するための（最初の３つのパネル）及びＲＢＤを発現する酵母細胞を選択するための（右パネル）、代表的なゲーティング手法を示すフローサイトメトリーのプロット。各プロットは、直前のゲートから導出した。下：ＲＢＤ＋、抗体－の酵母細胞（即ちＲＢＤを発現するが、変異により抗体結合が阻害されている細胞）のゲーティングを示すフローサイトメトリーのプロット。独立した２つのライブラリーがそれぞれで示された、ＣＯＶ２－２１９６又はＣＯＶ２－２１３０に関する選択実験を示す。（図１８Ｂ）ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０との１：１の混合物を使用した酵母菌ライブラリー選択実験間において、抗体結合の回避が観察された部位の相関関係。ｘ軸は、ライブラリー１に関する各部位の累積的な回避割合を示し、ｙ軸は、ライブラリー２に関する各部位の累積的な回避割合を示している。各グラフで相関係数及びｎが表示されている。（図１８Ｃ）ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０との１：１の混合物を使用した酵母菌ライブラリー選択実験間において、抗体結合を回避する観察された変異の相関関係。ｘ軸は、ライブラリー１に関する各アミノ酸変異の回避割合を示し、ｙ軸は、ライブラリー２に関する各アミノ酸変異の回避割合を示している。各グラフで相関係数及びｎが表示されている。（図１８Ｄ－Ｆ）ＣＯＶ２－２１９６（図１８Ｄ）、ＣＯＶ２－２１３０（図１８Ｅ）又はＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２ ２１３０との１：１の混合物のＤＭＳ結果。（図１８Ｅ）左パネル：中央及び右パネルのロゴプロットに対応するピークにより、ＲＢＤ全体にわたる回避部位が示されている。中央パネル：図１１Ａにおけるような、ＣＯＶ２－２１９６若しくはＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０の強力な回避変異を含む、全てのＲＢＤ部位の累積的な回避変異割合のロゴプロット。ＲＢＤのヒトＡＣＥ２への結合を抑制させる程度に基づいて変異を着色している。右パネル：ここでも同じように、ロゴプロットは、累積的な回避割合を示しているが、変異が酵母ディスプレイ系においてＲＢＤの発現をもたらす程度に基づいて着色している。これらのロゴプロットの双方向的で拡大可能なバージョンは、ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓ／に存在する。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図７Ｆで見ることができる。（図１８Ｇ）抗体中和を回避したウイルスを示す、代表的なＲＴＣＡセンサーグラム。飽和濃度（５μｇ／ｍＬ）の抗体、ＣＯＶ２－２１３０の存在下でウイルスを接種したＶｅｒｏ Ｅ６細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を動態学的に観察した。回避（紫紅色）又は検出可能な回避がない（青色）、代表的な実例が示されている。非感染細胞（緑色）又は抗体を含まずにウイルスを接種した細胞（赤色）は、対照として機能する。紫紅色及び青色の曲線は、単一の代表的なウェルを表し、赤色及び緑色の対照は、２回の技術的反復の平均値である。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図７Ｇで見ることができる。（図１８Ｈ）図１８ＧのＣＯＶ２－２１３０によって選択された変異ウイルスが実際にＣＯＶ２－２１３０を回避した（紫紅色）が、ＣＯＶ２－２１９６によって中和された（明るい青）ことを検証する、代表的なＲＴＣＡセンサーグラム。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の拡張データ図７Ｈで見ることができる。（図１８Ｉ）ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０、ＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０との１：１の混合物による回避選択実験のための９６ウェルＥプレート分析の個々のウェルからの例示的なセンサーグラム。ＣＯＶ２－２１３０からの回避の実例が示されているが、ＣＯＶ２－２１９６又はＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０の存在下では回避が検出されなかった。陽性及び陰性対照が第１のプレートに示されている。 標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる抗体耐性変異体の選択方法。 中和ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＡｂの機能特性。（図２０Ａ）ｍＡｂの中和活性、ｈＡＣＥ２の遮断活性及び三量体Ｓ２Ｐｅｃｔｏタンパク質又は単量体ＳＲＢＤとの結合のヒートマップ。ｍＡｂを中和効力によって順番に並べた（最上部が最も高く、最下部が最も低い）。破線は、中和ＩＣ５０値がｗｔウイルスの１５０ｎｇ／ｍＬ未満である１３個の抗体を示す。ＩＣ５０値は、ウイルス中和及びｈＡＣＥ２阻害に関して視覚化されており、ＥＣ５０値は、結合に関して視覚化されている。交差反応性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＳＲＢＤのｍＡｂ、ＣＲ３０２２の組換え形態を陽性対照として示す一方、抗デングｍＡｂ、２Ｄ２２を陰性対照として示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を代表し、それぞれが２回の技術的反復で実行される。「阻害せず」は、＞１０，０００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値を示す一方、「結合せず」は、＞１０，０００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値を示す。（図２０Ｂ－Ｅ）ｍＡｂのｈＡＣＥ２遮断、Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体結合又はＳＲＢＤ結合と、それらの中和活性との相関関係。対数変換値の線形回帰分析のＲ２値が示されている。濃い丸（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図１Ｂ～Ｅでは紫色で示される）は、中和ＩＣ５０値が１５０ｎｇ／ｍＬよりも低いｍＡｂを示す。（図２０Ｅ）ｈＡＣＥ２遮断及びＳ２Ｐｅｃｔｏ三量体結合の相関関係。対数変換値の線形回帰分析のＲ２値が示されている。（図２０Ｆ）標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和アッセイにおける、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の中和曲線。算出されたＩＣ５０値がグラフに表されている。エラーバーは、それぞれの点の標準偏差を表す。データは、少なくとも２回の独立した実験を代表し、それぞれが２回の技術的反復で実行される。（図２０Ｇ）偽ウイルス中和アッセイにおけるＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の中和曲線。エラーバーは、それぞれの点の標準偏差を表す。図示される値は、単一の実験からの２回の技術的反復の値である。最低６回の実験から算出されたＩＣ５０値をグラフに表す。（図２０Ｈ）ｈＡＣＥ２遮断ＥＬＩＳＡにおけるＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及び非遮断ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ｍＡｂ、ｒＣＲ３０２２のｈＡＣＥ２遮断曲線。算出されたＩＣ５０値をグラフに表す。エラーバーは、それぞれの点の標準偏差を表す。図示される値は、２回繰り返した代表的な実験からの３回の技術的反復の値である。（図２０Ｉ）ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及びｒＣＲ３０２２の、三量体Ｓ２ＰｅｃｔｏへのＥＬＩＺＡ結合。算出されたＥＣ５０値をグラフに表す。エラーバーは、それぞれの点の標準偏差を表す。図示される値は、２回繰り返した代表的な実験からの３回の技術的反復の値である。 競合結合分析によるｍＡｂのエピトープマッピング及び一対のｍＡｂによる相乗的な中和。（図２１Ａ）左：抗マウスＦｃバイオセンサーに負荷された、マウスＦｃに融合されたＲＢＤ（ＲＢＤ－ｍＦｃ）への参照ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６及びｒＣＲ３０２２の結合を阻害するｍＡｂの能力を測定する、バイオレイヤー干渉法ベースの競合結合アッセイ。四角形内の値は、模擬競合対照に対する競合ｍＡｂの存在下における参照ｍＡｂの結合率である。黒色の四角形は、完全な競合を意味する（非競合対照に対して＜３３％の結合）一方、白色の四角形は、競合しないことを意味する（非競合対照に対して＜６７％の結合）。右：ｈＡＣＥ２の結合を阻害するｍＡｂの能力を測定する、バイオレイヤー干渉法ベースの競合結合アッセイ。値は、競合の不在下におけるｈＡＣＥ２結合に標準化されたｈＡＣＥ２の結合率を表す。陰影は、ｍＡｂのｈＡＣＥ２との競合を意味する。（陰影は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図２Ａでは赤色で示される。）（図２１Ｂ）参照ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０、ＣＯＶ２－２１９６又はｒＣＲ３０２２との中和ｍＡｂパネルの競合。参照ｍＡｂをビオチン化し、参照ｍＡｂの三量体Ｓ２Ｐｅｃｔｏへの結合を競合ＥＬＩＳＡにおいて飽和量の各ｍＡｂの存在下で測定した。各参照ｍＡｂのＥＬＩＳＡのシグナルを非結合抗デングｍＡｂ ２Ｄ２２の存在下でシグナルに標準化した。黒色は、完全な競合（参照ｍＡｂの＜２５％の結合）、灰色は、部分的な競合（参照ｍＡｂの２５～６０％の結合）及び白色は、競合しないこと（参照ｍＡｂの＞６０％の結合）を意味する。（図２１Ｃ）ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０による野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の相乗的な中和。上：各ｍＡｂの連続希釈による中和マトリックス。３回の技術的反復で実験を行った。３回の技術的反復で実行された代表的な実験の回数が示されている。ｍＡｂのそれぞれを併用した中和率は、それぞれの四角形内に示されている。白色から黒色のヒートマップは、それぞれ０％の中和から１００％の中和を意味する。（ヒートマップは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図２Ｃでは白色から赤色で示される。）（図２１Ｄ）図２１ＣのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和を基準とした相乗効果マトリックス。濃い色（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図２Ｄでは赤色で示される）は、相乗的な中和が観察された領域を表し、黒枠は、２つのｍＡｂ間で最大となる相乗効果の領域を表す。 エピトープの同定及びｍＡｂの構造特性。（図２２Ａ）アラニン及びアルギニン変異誘発による重要な接触残基の同定。上：バイオレイヤー干渉法によって測定された、野生型（ｗｔ）又は変異ＳＲＢＤ構築物へのＣＯＶ２－２１３０（金色）、ＣＯＶ２－２１６５（栗色）又はＣＯＶ２－２１９６（濃い紫色）の結合。ｙ軸には、ｗｔ ＳＲＢＤへの結合で観察されるシグナルに標準化された応答が示されている。下：ｗｔ又は変異させた重要な接触残基を含むＳＲＢＤ構築物へのＣＯＶ２－２１９６の代表的な結合曲線。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ａで見ることができる。（図２２Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（青色）及びｈＡＣＥ２（緑色）の結晶構造（ＰＤＢ（６Ｍ０Ｊ）。ｈＡＣＥ２認識モチーフをオレンジ色で着色している。ＣＯＶ２－２１３０にとって重要な接触残基を金色の球体で示す一方、ＣＯＶ２－２１９６にとって重要な接触残基を紫色の球体で示している。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ｂで見ることができる。（図２２Ｃ）６０個のアミノ酸のｈＡＣＥ２認識モチーフへのｍＡｂのＥＬＩＳＡ結合。陰性対照としてｒ２Ｄ２２（抗デングｍＡｂ）が示されている。下：紫色で示されたＣＯＶ２－２１９６の重要な接触残基を含む、オレンジ色のｈＡＣＥ２認識モチーフの構造。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ｃで見ることができる。（図２２Ｄ）単一Ｆａｂ：ＣＯＶ２－２１３０（金色）、ＣＯＶ２－２１６５（栗色）又はＣＯＶ２－２１９６（濃い紫色）の、ネガティブ染色電子顕微鏡によって視覚化されたＳ２Ｐｅｃｔｏ三量体複合体。ＲＢＤを青色で示し、ＳのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を赤色で示す。電子密度を灰色で示す。三量体の状態（開いた又は閉じた状態）がそれぞれの複合体で表されている。各複合体の代表的な２Ｄクラス平均が下部に示されている（ボックスサイズは、１２８ピクセルである）。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ｄで見ることができる。（図２２Ｅ）Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体と複合体化したＣＯＶ２－２１３０及びＣＯＶ２－２１９６のＦａｂ。Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体へのＣＯＶ２－２１３０（金色）及びＣＯＶ２－２１９６（紫色）のＦａｂの同時結合。電子密度を灰色で示す。三量体の状態（開いた又は閉じた状態）が表されている。複合体の代表的な２Ｄクラス平均が下部に示されている（ボックスサイズは１２８ピクセル）。全ての画像は、Ｃｈｉｍｅｒａで作製した。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ｅで見ることができる。（図２２Ｆ）Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体上で視覚化された競合結合分析。ＣＲ３０２２の結晶構造を、二重Ｆａｂ：Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体構造にドッキングした。ＣＲ３０２２を青緑色で示す。色は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１６１，８９０号明細書の実施例５の図３Ｆで見ることができる。下：定量的なベン図は、各競合グループにおけるｍＡｂの数と、グループ間の重複とを記載している。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する中和ヒトｍＡｂの防御効果。（図２３Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のチャレンジモデル。１０～１１週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（２回の実験での１群当たり４～５匹のマウス）を抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂで治療し、１日後にｉ．ｎ．経路によってＡｄＶ－ｈＡＣＥ２で形質導入した。４日後、２００μｇのｍＡｂ ＣｏＶ２－２１９６、ＣｏＶ２－２１３０若しくは併用（１：１の比率）又はアイソタイプ対照ｍＡｂでｉ．ｐ．経路によってマウスを治療した。１日後、ｉ．ｎ．経路によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した。分析のために組織を７ｄｐｉで採取した（図２３Ｃ及び２３Ｄ）。（図２３Ｂ）パネルａにおけるマウスの体重変化（テューキーの事後検定を伴う二元配置通常ＡＮＯＶＡ：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。（図２Ｃ）肺、脾臓及び心臓のウイルス負荷をＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した：ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡ（＊、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。点線は、アッセイの検出限界を示す。（図２３Ｄ）サイトカイン及びケモカインの遺伝子発現をｑＰＣＲ分析によって測定した。ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡ（＊、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（図２３Ｅ）ＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のチャレンジモデル。１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）を、１０５ＰＦＵのＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でｉ．ｎ．経路によって接種した。マウスの体重変化を示す。（図２３Ｆ）肺のウイルス負荷を、（図２３Ｅ）から、２ｄｐｉにＲＴ－ｑＰＣＲによって（左）又はプラークアッセイ（右）によって測定した：ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡ（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ｍＡｂパネルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和曲線。ヒトｍＡｂによる標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和。２回の技術的反復の平均値±ＳＤが示されている。データは、２回以上の独立した実験の１つを表す。 Ｓ２ＰｅｃｔｏのｈＡＣＥ２への結合を阻害するｍＡｂの阻害曲線。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和ヒトｍＡｂによるＳ２ＰｅｃｔｏへのｈＡＣＥ２結合の遮断。１回の実験を３回反復した平均値±ＳＤが示されている。抗体ＣＲ３０２２及び２Ｄ２２は、対照として機能した。 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和ヒトｍＡｂの、三量体ＳＲＢＤ、Ｓ２Ｐｅｃｔｏ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳ２Ｐｅｃｔｏ抗原へのＥＬＩＳＡ結合。３回の反復の平均値±ＳＤ及び２回の実験を代表するものが示されている。抗体ＣＲ３０２２及び２Ｄ２２は、対照として機能した。 アラニン及びアルギニン変異誘発並びにバイオレイヤー干渉法による、ｍＡｂの重要な接触残基のマッピング。（図２７Ａ）左：ｗｔに標準化された、ｗｔ又は変異ＳＲＢＤ構築物へのｍＡｂ結合の反応値。アスタリスクは、ｍＡｂの解離の増大が観察された残基を意味し、これは、残基がｍＡｂのエピトープの近位にある可能性が高いことを示している。右：ｍＡｂのｗｔ又は変異ＳＲＢＤ構築物との会合及び解離に関する完全な反応曲線。（図２７Ｂ）いくつかのｍＡｂにとって重要な接触残基を強調したＲＢＤの構造及びそれらの構造における位置。
上述のように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、活動性症例が日々増加する、重大な健康問題である。従って、このウイルスの生態学及びその性質並びにウイルスに対するヒト免疫応答の範囲を理解することは、最も重要である。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するヒト抗体の配列を同定した。そのような抗体のそれらの配列及び使用が、本明細書で開示される。
更に、ある抗体（ＣＯＶ２－２１９６）とＲＢＤとの相互作用を詳細に研究することにより、本重鎖及び軽鎖の両方に関わる複雑な構造的立体配置によって動作する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパブリッククローン型を選択するための分子基盤が発明者により特定される。このクローン型で共有される構造的特徴は、重鎖及び軽鎖の両方の残基を含むパラトープの形成に寄与しているが、驚くべきことに、通常、抗原と抗体の相互作用を支配しているＨＣＤＲ３に依存しない。このパブリッククローン型は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤに対する、ヒトによって作られる強力な中和抗体のより頻繁に共有される型の１つであることが、本発明者らによって示されている。詳細に構造を研究することにより、一般に形成される抗体のパラトープは、重鎖及び軽鎖の界面を取り囲むパラトープ内の５つの芳香族残基によって形成される「芳香族ケージ」を生じさせることが明らかとなった。このケージ構造は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質上の芳香族残基に配位するが、これは、これらの抗体の高い特異性と親和性とによって説明される。注目すべきことに、このパブリッククローン型を形成するには、重鎖及び軽鎖の両方を必要とする（従って、クローン型において標準的なＩＧＨＶ、ＩＧＨＪ、ＩＧＬＶ及びＩＧＬＪ遺伝子を画定する）が、ＨＣＤＲ３は、この相互作用に最小限に影響する。これらのＩＧＨＶ１－５８－ＩＧＨＪ３重鎖及びＩＧＫＶ３－２０－ＩＧＫＪ１軽鎖組換えは、免疫前のＢ細胞レパートリーでは一般的であるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染又はワクチン接種に反応する際、多くの個体でそのようなクローンが作られる可能性が高い。このパブリッククローン型の複雑な予め構成された構造によって認識される抗原部位は、ヒト個体群におけるＢ細胞クローンの発現頻度並びに可変遺伝子セグメントによってコードされる抗体の中和効力及び防御効力により、ＣＯＶＩＤ－１９の予防ワクチンの重要な構成成分となる可能性が高い。
本開示のこれらの及び他の態様を以下で詳細に説明する。
Ｉ．コロナウイルス２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と称する急性呼吸器疾患を引き起こす伝染性ウイルスであり、呼吸器感染症である。このウイルスは、現在進行中の２０１９～２０年のコロナウイルスの大流行、即ち地球規模の健康上の緊急事態の原因となっている。ゲノム配列決定により、このウイルスは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡコロナウイルスであることが明らかとなっている。
現在進行中の大流行の間に、このウイルスは、多くの場合、一般的な専門用語で「コロナウイルス」、「新型コロナウイルス」及び「武漢コロナウイルス」と言及されているが、ＷＨＯでは「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の名称を推奨している。国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）では、このウイルスの正式名称をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と公表している。
多くの初期症例は、中国の都市である武漢の大規模な海産物及び動物市場と関連しており、ウイルスは人畜共通感染症が起源であると考えられている。このウイルス試料と他のウイルス試料とで遺伝子配列を比較すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（７９．５％）及びコウモリコロナウイルス（９６％）との類似性が示される。この知見により、最終的な起源は、コウモリである可能性が高いとされているが、センザンコウなどの中間宿主を除外することはできない。ウイルスは、２つ以上のコロナウイルスから形成された組換えウイルスである可能性がある。
ウイルスのヒト－ヒト感染が確認されている。コロナウイルスは、主に濃厚接触、特に約６フィート（１．８ｍ）の範囲内の咳及びくしゃみからの呼吸器飛沫を通じて蔓延する。ウイルスＲＮＡは、感染患者由来の糞便試料内でも発見されている。ウイルスは、潜伏期間中であっても伝染することができる可能性がある。
ウイルスに感染したことが判明した最初の個体の多くが、華南海鮮市場で働いていたため、当初、食用に販売されていた動物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の保有宿主又は中間宿主であることが疑われていた。２００３年のＳＡＲＳの大流行の際にも生きた動物を食用に販売する市場が非難されたが、そのような市場は新しい病原体が生み出される環境であると考えられている。この大流行により、中国では、野生動物の取引及び消費の一時的な禁止が喚起された。しかしながら、華南海鮮市場がヒトへのウイルス伝播の感染源ではない可能性があることを一部の研究者が示唆している。
十分な数の配列決定されたゲノムがあれば、ウイルスのファミリーの変異歴についての系統樹を再構成することができる。２００３年のＳＡＲＳの大流行の起源を研究することにより、多くのＳＡＲＳ様コウモリコロナウイルスが発見されることとなり、その多くがキクガシラコウモリ属のキクガシラコウモリが起源のものであった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、この分類のＳＡＲＳ関連コロナウイルスに該当する。２０１５年及び２０１７年に公開された、チュウゴクキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）に由来する２つのゲノム配列には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と８０％の類似点があることが示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と９６％の類似点を有するナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ）由来の第３のウイルスゲノム、「ＲａＴＧ１３」が、雲南省で採取された［２８］［２９］。比較のために、この量のウイルス内の変形は、Ｈ３Ｎ２ヒトインフルエンザウイルス株で１０年かけて観察される変異の量と類似している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルスとして知られている広範なウイルスのファミリーに属しており、より明確な名称が選ばれるまでは、「ｎＣｏＶ」が新型コロナウイルスを指すものとして使用された標準的な用語である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。他のコロナウイルスは、感冒から中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）などのより重篤な疾患に至る範囲の病気を引き起こす可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶの後に続く、人に感染することが知られている７つめのコロナウイルスである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などは、サルベコウイルス（Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ）亜属（ベータ－ＣｏＶ系統Ｂ）のメンバーである。そのＲＮＡ配列は約３０，０００塩基長である。１月１２日までに、武漢からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５つのゲノムが単離され、中国疾病対策予防センター（ＣＣＤＣ）及び他の機関によって報告されている。ゲノム数は、１月２６日までに２８個まで増加した。最も初期のＧｅｎｂａｎｋゲノムを除き、ゲノムはＧＩＳＡＩＤで禁輸品目になっている。試料の系統分析は、Ｎｅｘｔｓｔｒａｉｎを通じて利用可能である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの公表により、ウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合タンパク質（ＲＢＤ）において、いくつかのタンパク質をモデル化する実験を行うことになった。結果により、Ｓタンパク質がアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体に対して十分な親和性を保持しており、これを細胞内移行のメカニズムとして用いることが示唆されている。１月２２日、完全なウイルスを対象として研究をする中国のグループと、リバースジェネティクスを対象として研究をする米国のグループとが、独自にヒトＡＣＥ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であることを実験的に実証した。
潜在的なプロテアーゼ阻害剤を模索するため、ＯＲＦ１ａポリタンパク質由来のウイルス性３Ｃ様プロテアーゼＭ（ｐｒｏ）も薬物ドッキング実験のためにモデル化された。Ｉｎｎｏｐｈｏｒｅ社では、ＳＡＲＳプロテアーゼを基にした２つの計算モデルを作成し、中国科学院では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼの未公開の実験的な構造体を作成した。加えて、ミシガン大学の研究者が、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の全ての成熟ペプチドの構造をモデル化した。
最初に知られたヒト感染は、２０１９年１２月初旬に発生した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の大流行は、２０１９年１２月中旬に中国の武漢で最初に発見され、単一の感染動物に由来するものと思われた。ウイルスは、続いて中国の全省に蔓延し、アジア、欧州、北米及びオセアニアにおける２０数か国以上の他の国に蔓延した。これらの地域の全てで、ウイルスのヒト－ヒト感染が確認されている。２０２０年１月３０日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＷＨＯによって地球規模の健康上の緊急事態と指定された。
２０２０年２月１０日時点（１７：１５協定世界時）で、４０，６４５例の確認された感染症例が存在しており、その４０，１９６例が中国本土内のものであった。当初、中国国外のほぼ全ての症例は、武漢からの旅行者又はこの地域からの旅行者と直接接触した人で発生していた。その後、旅行者から他国への蔓延により、世界中の多くの国々に感染がもたらされた。確認された感染又は診断可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２急性呼吸器疾患への増悪をもたらす感染の割合は依然として不明であったが、ウイルスに起因する死亡総数は２０２０年３月２５日時点で１９，０００例を超えていた。
ウイルスの基本再生産数（Ｒ０）は、１．４～３．９であると推定されている。これは、無検査の場合、このウイルスにより、確定した感染症について典型的には１．４～３．９例の新たな症例が生じることを意味する。ウイルスは、少なくとも４人の人間の連鎖をたどって伝播可能であることが確定している。
２０２０年１月、複数の組織及び機関が、公開されたゲノムに基づいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのワクチンの生成に着手した。中国では、中国疾病対策予防センターが、新型コロナウイルスに対するワクチンを開発中である。香港大学も、ここでワクチンを開発中であることを公表している。上海東方医院も、バイオテクノロジー企業であるＳｔｅｍｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓと協働してワクチンを開発中である。
他には、感染症流行対策イノベーション連合（ＣＥＰＩ）によって３つのワクチン事業が支援を受けており、バイオテクノロジー企業であるＭｏｄｅｒｎａ及びＩｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる事業並びにクイーンズランド大学による別の事業が含まれている。米国のアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）は、Ｍｏｄｅｒｎａと協働してコロナウイルス表面のスパイクと一致するＲＮＡワクチンを作っており、２０２０年３月に第Ｉ相臨床試験が開始された。Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、ＤＮＡを用いたワクチン接種を開発中であり、中国の規制当局による承認を早めるために中国企業と共同研究しており、２０２０年の夏にワクチンの臨床試験を行うことが期待されている。オーストラリアでは、クイーンズランド大学が、コロナウイルスを模倣して免疫反応を刺激するようにウイルスタンパク質を遺伝子変異させる、分子クランプワクチンの潜在性について調査中である。
独立事業では、カナダ公衆衛生庁が、ワクチンに着手するためサスカチュワン大学の国際ワクチンセンター（ＶＩＤＯ－ＩｎｔｅｒＶａｃ）に許可を与えている。ＶＩＤＯ－ＩｎｔｅｒＶａｃは、２０２０年３月に生産及び動物実験を開始し、２０２１年に人体実験を開始することを目指している。ロンドンのインペリアルカレッジ医学部は、現在、動物へのワクチンを試験する段階にある。
ＣＯＶＩＤ－１９急性呼吸器疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるウイルス性呼吸器疾患である。この疾患は、２０１９～２０年の武漢コロナウイルス大流行時に最初に発見された。症状としては、発熱、乾性咳嗽及び息切れを挙げることができる。２０２０年３月時点では、症状を軽減し、機能を補助することに焦点を当てた試みを伴った、利用可能な特定の承認された治療は存在していない。
感染者は、無症候性であるか、又は発熱、咳、息切れなどの軽度から重度の症状を有し得る。下痢又は上気道感染症の症状（例えば、くしゃみ、鼻水、咽頭痛）は、それほど頻繁に見られない。重症感染の症例は、重症肺炎、多臓器不全及び死亡に増悪する可能性がある。暴露から症状の発症までの時間は、世界保健機構では２～１０日、米国のアメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）では２～１４日と推定されている。
世界中の保健機関では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の機会を低減させるために個人が取ることができる予防措置を公表している。推奨事項は、他のコロナウイルスのためにこれまでに公表されたものと類似しており、石鹸及び水による頻繁な手洗い、目、鼻又は口を不潔な手で触らないこと並びに良好な呼吸器の衛生の実践が含まれる。
ＷＨＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのいくつかの検査手順を公表している。検査には、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＲＴ－ＰＣＲ）が使用される。検査は、呼吸器試料又は血液試料で行うことができる。一般に、結果は数時間から数日以内に入手することができる。
２０２０年１月に、この疾患のための潜在的な治療の研究が開始された。中国疾病対策予防センターは、１月下旬にコロナウイルス関連肺炎における既存の肺炎治療の試験を開始した。ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるレムデシビル及びインターフェロンβも検討されている。２０２０年１月下旬に、中国の医療研究者は、レムデシビル、クロロキン及びロピナビル／リトナビルの臨床試験を開始する意図があることを示しており、探索的調査では、その全てがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に細胞レベルで「かなり良好な阻害効果」を有するようであった。２０２０年２月５日、中国は、この疾患のためにレムデシビルの特許使用を開始した。
現在の大流行では、致死率が時間の経過と共に変化する可能性があるため、また診断可能な疾患に増悪する感染症の割合が依然として不明確であるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症に起因する全体的な死亡率及び罹病率は不明である。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２急性呼吸器疾患の予備調査では、得られた致死率の数は２％～３％であり、ＷＨＯは、２０２０年１月に致死率が約３％であったことを示した。５５例の致死例における査読前のインペリアルカレッジのプレプリント研究では、無症候性感染を見逃しているために初期の死亡率の推定値が高すぎる可能性があることを言及していた。彼らは、平均感染致死率（感染者の間の死亡率）が、無症候性保菌者を含む場合の０．８％から、湖北省の症候性症例のみを含む場合の１８％までの範囲にあると推定した。
初期のデータには、武漢内の病院に受け入れられた最初の４１例の確認された症例の中で、１３人（３２％）の個体が集中治療を必要とし、６人（１５％）の個体が死亡したことが示されている。死亡した個体の多くは、免疫系を損なう高血圧症、糖尿病又は心血管疾患のような症状を示すことを発端にした不健康な健康状態にあった。死亡をもたらすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２急性呼吸器疾患の初期の症例では、疾患の経過時間中央値が１４日であることが判明し、範囲全体で６～４１日であった。
ＩＩ．モノクローナル抗体及びその生成
「単離抗体」とは、その自然環境の成分から単離及び／又は回収されたものである。その自然環境の夾雑物成分は、診断又は抗体の治療用途と干渉することになる材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質溶質又は非タンパク質溶質が含まれ得る。特定の実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって測定されるような９５重量％超の抗体、最も特に９９重量％以上の抗体となるまで；（２）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで；又は（３）クマシーブルー染色若しくは銀染色を用いた還元条件又は非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質となるまで精製される。単離抗体としては、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内の生体内原位置の抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
基本的な４本鎖の抗体単位は、２個の同一の軽（Ｌ）鎖と２個の同一の重（Ｈ）鎖とからなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に５つの基本的なヘテロ四量体単位から構成され、従って１０個の抗原結合部位を含有する一方、分泌型ＩｇＡ抗体は、重合してＪ鎖と共に２～５個の基本的な４本鎖の単位からなる多価の集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じた１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に隔てられた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変領域（ＶＨ）があり、続いてα鎖及びγ鎖の各々では３つの定常ドメイン（ＣＨ）があり、μアイソタイプでは４つのＣＨドメインがある。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変領域（ＶＬ）があり、続いてその他方の端に定常ドメイン（ＣＬ）がある。ＶＬはＶＨと並んでおり、ＣＬは重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変領域の間の境界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬとが共に対合することで、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造及び性質については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ ７１，ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
あらゆる脊椎動物種のＬ鎖は、それらの定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる明確に異なる２つのタイプの１つに割り当てることができる。それらの重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラス、即ちアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称する重鎖を有する。それらのγ及びαクラスは、ＣＨ配列の比較的わずかな相違及び機能を基準にして、更にサブクラスに分けられ、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
「可変」という用語は、Ｖドメインの特定のセグメントが抗体の中の配列で大きく異なっているという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定抗体のその特定抗原に対する特異性を画定する。しかしながら、その変異性は、可変領域の１１０個のアミノ酸の全長にわたって均一に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９～１２個のアミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極度の変異性を有するより短めの領域によって隔てられた、１５～３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから構成されている。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ４つのＦＲを含み、このＦＲは大部分がβシート構造をとり、３つの超可変領域により接続されているが、この超可変領域がβシート構造を接続し、場合によりその一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、他方の鎖由来の超可変領域とＦＲによって近接して共に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与するものではないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）及び抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」、即ち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム：Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に従って番号付けされた場合、ＶＬ内の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）のあたり且つＶＨ内の残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３））のあたり；並びに／又は「超可変ループ」由来のそのような残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム：Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）に従って番号付けされた場合、ＶＬ内の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）並びにＶＨ内の残基２６～３２（Ｈ１）、５２～５６（Ｈ２）及び９５～１０１（Ｈ３））；並びに／又は「超可変ループ」／ＣＤＲ由来のそのような残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステム：Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９－２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９－２２１（２０００）に従って番号付けされた場合、ＶＬ内の残基２７～３８（Ｌ１）、５６～６５（Ｌ２）及び１０５～１２０（Ｌ３）並びにＶＨ内の残基２７～３８（Ｈ１）、５６～６５（Ｈ２）及び１０５～１２０（Ｈ３））を含む。任意選択的に、抗体は、ＡＨｏ：Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０（２００１）に従って番号付けされた場合、以下の点、ＶＬ内の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４～７５（Ｌ２）及び１２３（Ｌ３）並びにＶｓｕｂＨ内の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４～７５（Ｈ２）及び１２３（Ｈ３）の１つ以上に対称的な挿入を有する。
「生殖系列核酸残基」とは、定常領域又は可変領域をコードする生殖系列遺伝子に自然に発生する核酸残基を意味する。「生殖系列遺伝子」は、生殖細胞（即ち卵子又は精子になることが決定されている細胞）に見られるＤＮＡである。「生殖細胞系列変異」は、子孫に受け継がれるときに、生殖細胞又は単細胞段階の接合子に生じた特定のＤＮＡ内の遺伝的変化を指し、そのような変異は身体のあらゆる細胞に組み込まれる。生殖細胞系列変異は、単一の体細胞で獲得される体細胞変異とは対照的なものである。場合により、可変領域をコードする生殖系列ＤＮＡ配列内のヌクレオチドは、変異して（即ち体細胞変異）異なるヌクレオチドによって置き換えられる。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能な変異を除いて同一のものである。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。更に、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を標的とする。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加え、他の抗体が混入することなくそれらを合成することができる点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈すべきでない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ手法によって調製され得るか、或いは感染若しくは免疫化又はバルクソーティングした抗原特異的コレクション内で結合した単一細胞からの重鎖及び軽鎖の捕捉に応答する抗原特異的Ｂ細胞、抗原特異的形質芽細胞をシングルセルソーティングした後、細菌性動物細胞、真核動物細胞若しくは植物細胞における組換えＤＮＡ手法を用いて作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
Ａ．一般的方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するモノクローナル抗体は、いくつかの用途を有することが理解されるであろう。これらには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を検出して診断するだけでなく、これを治療するために使用される診断キットの製造が含まれる。これらに関連して、そのような抗体を診断又は治療剤に関連付けるか、それらを競合アッセイで捕捉剤若しくは競合剤として使用するか、又はこれに付随する追加の剤を含まずにそれらを個別に使用することができる。抗体は、更に下記で説明するように変異又は改変され得る。抗体を調製し、特性決定する方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；米国特許第４，１９６，２６５号明細書を参照されたい）。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ系統に従って開始する。これらの両方の方法での第１の工程は、適切な宿主を免疫化すること又は以前に自然感染しているか若しくは承認済み若しくは実験的ワクチンで接種することによって免疫した対象を特定することである。当技術分野においてよく知られているように、免疫化するための所与の組成物は、その免疫原性が異なる可能性がある。従って、多くの場合、宿主の免疫系を追加免疫する必要があり、これは、ペプチド又はポリペプチド免疫原を担体に結合させることによって達成され得る。例示的で好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン又はウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも担体として使用することができる。担体タンパク質にポリペプチドをコンジュゲートする手段は、当技術分野においてよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド及びビスビアゾ化ベンジジンが挙げられる。また、当技術分野において公知の通り、特定の免疫原性組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激物質を使用することによって増強させることができる。動物における例示的で好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅させた結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられ、ヒトの場合、ミョウバン、ＣｐＧ、ＭＦＰ５９及び免疫賦活性分子の組み合わせ（ＡＳ０１又はＡＳ０３などの「アジュバント系」）が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＢ細胞を誘導するための更なる実験的な接種形態が考えられるが、これらには、物理的送達システムにおけるナノ粒子ワクチン又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子として送達される遺伝子にコードされる抗原（脂質ナノ粒子又は金バイオリスティックビーズなど）が含まれ、針、遺伝子銃、経皮エレクトロポレーション装置によって送達される。抗原遺伝子は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス若しくはアルファウイルスレプリコンなどの複製可能若しくは欠損ウイルスベクター又は代わりにウイルス様粒子によってコードされることにより伝達することができる。
天然の病原体に対するヒト抗体の場合、好適な手法は、疾患に罹患したと診断されている対象或いは病原体に対する防御免疫を生じさせるか又は実験的ワクチンの安全性若しくは有効性を検査するためにワクチン接種を受けた対象など、病原体に暴露された対象を特定することである。循環血液中の抗病原体抗体は、検出可能であり、次いで抗体陽性対象に由来するＢ細胞をコード又は産生する抗体を得ることができる。
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原性組成物の量は、免疫原の性質及び免疫化のために用いられる動物によって変動する。様々な経路を使用して免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内及び腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で免疫動物の血液を採取することによって監視され得る。また、２回目のブースター注射を与え得る。好適な力価が得られるまで、追加免疫及び力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫動物を出血させ、その血清を単離して保存することができ、且つ／又はこの動物を、ＭＡｂを生成するために使用することができる。
免疫後、ＭＡｂを生成する手順に使用するために、抗体を産生する可能性のある体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）を選択する。これらの細胞は、生検された脾臓、リンパ節、扁桃腺若しくは咽頭扁桃、骨髄吸引液若しくは骨髄生検、肺若しくは胃腸管のような粘膜臓器由来の組織生検又は循環血液から得ることができる。次いで、免疫動物又は免疫したヒト由来の抗体産生Ｂリンパ球を、一般に免疫した動物と同種のものであるか、又はヒト若しくはヒト／マウスキメラ細胞である不死化ミエローマ細胞の細胞と融合する。ハイブリドーマを生成する融合手順に使用するのに適したミエローマ細胞株は、抗体非産生細胞であることが好ましく、高い融合効率を有し、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する、特定の選択培地での増殖を不可能にする酵素欠損を有する。当業者に公知の多数のミエローマ細胞のいずれか１つを使用することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，ｐｐ．６５－６６，１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｐｐ．７５－８３，１９８４）。ＨＭＭＡ２．５細胞又はＭＦＰ－２細胞は、そのような細胞の特に有用な例である。
抗体を産生する脾臓又はリンパ節細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を（化学的又は電気的に）促進する薬剤（複数可）の存在下で、体細胞をミエローマ細胞と２：１の割合で混合することを含むが、この割合は、約２０：１～約１：１でそれぞれ変動させ得る。場合により、最初の工程としてエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）でヒトＢ細胞を形質転換することによりＢ細胞のサイズが大きくなり、これにより比較的大きいサイズのミエローマ細胞との融合が促進される。ＥＢＶによる形質転換効率は、形質転換培地にＣｐＧ及びａＣｈｋ２阻害剤を用いることによって向上する。代わりに、ＩＬ－２１及びＴＮＦスーパーファミリーのＩＩ型メンバーであるヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）などの追加の可溶性因子を含有する培地中でＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現する形質移入細胞株と共培養することにより、ヒトＢ細胞を活性化することができる。センダイウイルスを用いた融合方法は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）によって記載されている。電気的に誘発される融合方法を用いることも妥当であり（Ｇｏｄｉｎｇ，ｐｐ．７１－７４，１９８６）、より良好な効率のためのプロセスが存在する（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。融合手順は、通常、約１×１０－６～１×１０－８個の生存可能なハイブリッドを低頻度で産生するが、最適化された手順では、２００分の１に近い融合効率を達成することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかしながら、選択培地中で培養することにより、生存可能な融合ハイブリッドが親注入細胞（特に、通常、無期限に分裂を続けることになる注入ミエローマ細胞）から分化するため、比較的低い融合効率は問題とならない。選択培地は一般に、組織培地中のヌクレオチドのデノボ合成を遮断する薬剤を含有させたものである。例示的で好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンである。アミノプテリン及びメトトレキサートは、プリン及びピリミジンの両方のデノボ合成を遮断する一方、アザセリンは、プリンの合成のみを遮断する。アミノプテリン又はメトトレキサートを使用する場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチン及びチミジンを培地に充填する（ＨＡＴ培地）。アザセリンを使用する場合、ヒポキサンチンを培地に充填する。Ｂ細胞の供給源がＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞株である場合、ミエローマに融合しなかったＥＢＶ形質転換系統を排除するために、ウアバインを添加する。
好ましい選択培地は、ＨＡＴ又はウアバイン含有ＨＡＴである。ヌクレオチドのサルベージ経路を機能させることができる細胞のみがＨＡＴ培地中で生存することができる。ミエローマ細胞は、サルベージ経路の鍵酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が欠損しており、生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を機能させることができるが、培養液中における寿命は限られており、一般に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存することができる細胞のみが、ミエローマ及びＢ細胞から形成されたハイブリッドである。融合に用いられるＢ細胞の供給源が、本明細書のようなＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の系統である場合、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は、薬物によって死滅しやすい一方、使用されるミエローマのパートナーが、ウアバインに耐性があるように選択されるため、ハイブリッドの薬物選択にウアバインも使用することができる。
培養によってハイブリドーマの集団を提供し、そこから特異的なハイブリドーマを選択する。典型的には、マイクロタイタープレート内で単一クローン希釈によって細胞を培養することによりハイブリドーマの選択を行い、その後、所望の反応について個々のクローンの上清を検査する（約２～３週間後）。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなど、感度がよく、簡便且つ迅速なものでなくてはならない。次いで、選択されたハイブリドーマを段階的に希釈するか、又はフローサイトメトリーによる選別によってシングルセルソーティングを行って個々の抗体産生細胞株にクローニングし、次いでこのクローンを無期限に増殖させると、ｍＡｂを得ることができる。細胞株は、ＭＡｂを生成するために、２つの基本的な方法で利用することができる。ハイブリドーマの試料は、動物（例えば、マウス）に（多くの場合、腹膜腔に）注射することができる。任意選択的に、動物は、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で注射前にプライミングされる。ヒトハイブリドーマをこの方法で使用する場合、腫瘍拒絶を回避するために、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的なモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、血清又は腹水などの動物の体液を採取して、高濃度のＭＡｂを提供することができる。また、個々の細胞株をインビトロで培養することも可能であり、この場合、培地にＭＡｂを自然に分泌させ、そこから速やかに高濃度のＭＡｂを得ることができる。代わりに、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用して、細胞上清内に免疫グロブリンを生成することができる。細胞株は、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために、無血清培地中の増殖に適合させることができる。
必要に応じて、いずれかの手段によって産生されたＭＡｂを、濾過、遠心分離及びＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフ法を用いて更に精製し得る。本開示のモノクローナル抗体のフラグメントは、ペプシン若しくはパパインなどの酵素による消化を含む方法及び／又は化学還元によるジスルフィド結合の切断により、精製されたモノクローナル抗体から得ることができる。代わりに、本開示に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。
また、モノクローナル抗体を生成するために、分子クローニング手法が使用され得ることが検討される。形質芽細胞若しくは活性化Ｂ細胞マーカーであるために感染症若しくはワクチン接種に応答すると特定された単一のＢ細胞又は目的の抗原で標識した記憶Ｂ細胞を、常磁性ビーズ選択又はフローサイトメトリー選別を用いて物理的に選別することができ、次いで単一細胞及びＲＴ－ＰＣＲによって増幅された抗体遺伝子からＲＮＡを単離することができる。単一細胞から抗体可変遺伝子を得るために、様々なシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ法が利用可能である。代わりに、細胞の抗原特異的なバルクソーティングされた集団を微小胞に分離し、重鎖及び軽鎖アンプリコンの物理的結合又は小胞からの重鎖及び軽鎖遺伝子の共通のバーコード法を用いて、単一細胞から回収された重鎖及び軽鎖可変遺伝子に適合させることができる。また、適合した単一細胞からの重鎖及び軽鎖遺伝子は、抗原特異的Ｂ細胞の集団から、ＲＴ－ＰＣＲプライマーを有する細胞透過性ナノ粒子及び転写物を１細胞当たり１つのバーコードでマーキングするバーコードで細胞を処理することによって得ることができる。抗体可変遺伝子も、ハイブリドーマ系統及びＲＴ－ＰＣＲによって得られた抗体遺伝子をＲＮＡ抽出することによって単離し、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。代わりに、細胞株から単離したＲＮＡからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製し、ウイルス抗原を用いてパニングすることによって適切な抗体を発現するファージミドを選択する。従来のハイブリドーマ技法を上回る本手法の利点は、約１０４倍もの多くの抗体を産生し、且つ１ラウンドでスクリーニングすることができ、Ｈ鎖及びＬ鎖を組み合わせることによって新たな特異性を生じさせ、これにより適切な抗体を発見する機会を更に増大させることにある。
本開示において有用な抗体の生成について教示する、各々が参考として本明細書に組み込まれる他の米国特許としては、コンビナトリアル手法を用いたキメラ抗体の生成について記載する米国特許第５，５６５，３３２号明細書；組換え免疫グロブリンの調製について記載する米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及び抗体－治療剤コンジュゲートについて記載する米国特許第４，８６７，９７３号明細書が挙げられる。
Ｂ．本開示の抗体
本開示による抗体は、第一に、それらの結合特異性によって定義することができる。当業者は、当業者によく知られた技法を用いて所与の抗体の結合特異性／親和性を評価することにより、そのような抗体が現請求項の範囲内に該当するかどうかを判断することができる。例えば、所与の抗体が結合するエピトープは、抗原分子（例えば、ドメイン内の直線状エピトープ）内に位置する３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個）のアミノ酸の単一の連続配列から構成され得る。代わりに、エピトープは、抗原分子（例えば、立体構造エピトープ）内に位置する複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）から構成され得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の２つの主な分類には、表面スパイク（Ｓ）タンパク質及び内在性タンパク質、特にヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質がある。Ｓタンパク質に対する抗体は、発症予防、又は治療、又は診断、又はワクチンの特性決定に有用である。Ｓタンパク質抗体は、このタンパク質との更なる結合特異性を有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の完全長の外部ドメインに結合する特定の抗体（モノマー又はタイマーなどのオリゴマーとして存在し、重要部位でのプロリンの導入などの変異（「２Ｐ変異」）を安定化する立体構造の有無に関わらない）、及び（ａ）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する抗Ｓタンパク質抗体、（ｂ）ＲＢＤ以外のドメインに結合する抗Ｓタンパク質抗体を含む。ＲＢＤ以外のドメインに結合するサブセットの一部がＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）に結合するが、他のサブセットは、ＮＴＤ又はＲＢＤ以外のエピトープに結合し、及び（ｃ）Ｓタンパク質抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のその受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）への結合を遮断することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することが更に判明され得、受容体の結合を中和するが、遮断しない他のものを含む。最終的に、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及び／又はＨＣｏＶ－ＨＫＵ１などの他のコロナウイルスとのＳタンパク質との両方と交差反応することができ、同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とこれらの他のコロナウイルスとの両方と交差中和することができる。
別の特異性は、主に診断用途を有するＮ抗体（又は他の内在性標的）に結合する抗体である。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質又は他の内在性タンパク質に対する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に認識するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びに他のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及び／若しくはＨＣｏＶ－ＨＫＵ１を交差反応によって認識する。
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用」するかどうかを判断することができる。例示的な技法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されるような慣用的な交差遮断アッセイが挙げられる。交差遮断は、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法又は表面プラズモン共鳴法などの様々な結合アッセイで測定することができる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３，２００４）、ペプチド切断解析、単粒子再構成法を用いた高分解能電子顕微鏡技法、クライオＥＭ又は断層撮影法、結晶学的研究及びＮＭＲ解析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６，２０００）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識した後、重水素標識タンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移すと、抗体複合体によって保護されたアミノ酸内の交換可能なプロトンが、界面の一部でないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。その結果、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸が重水素を保持するため、界面に含まれないアミノ酸と比較して、相対的に高い重量を呈し得る。抗体を解離させた後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析にかけることにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基が明らかとなる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９（１９９９）；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａ（２００１）を参照されたい。抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するときに、高濃度の抗体の存在下のインビトロ又は動物モデルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増殖させることにより、抗体回避変異体を単離することができる。抗体によって標的化される抗原をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子の配列分析により、抗体回避を付与する変異が明らかとなり、これによってエピトープの残基又はエピトープの構造にアロステリックに影響を及ぼす残基が示される。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞に応答する抗原の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸又はタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒への暴露の際に保持される一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８～１０個の独自の空間的な立体構造のアミノ酸を含む。
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の改変援用プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的に又は酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似点に従って、同一の抗原を標的とする多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（その全体が参考として具体的に本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書を参照されたい）。各分類には、別の分類によって提示されるエピトープと明確に異なるか、又は部分的に重複する独自のエピトープが反映され得る。この技法により、遺伝的に同一の抗体を迅速に選別することが可能となり、これによって特性決定について遺伝的に異なる抗体に着目することができる。ハイブリドーマのスクリーニングに適用する場合、ＭＡＰによって所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンを同定することが容易となり得る。ＭＡＰを使用して、本開示の抗体を異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類し得る。
本開示は、同一のエピトープ又はエピトープの一部に結合し得る抗体を含む。同様に、本開示は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれかを含む、標的又はそのフラグメントとの結合について競合する抗体も含む。抗体が参照抗体と同一のエピトープに結合するか又はそれとの結合について競合するかどうかは、当技術分野において公知の常法を使用することによって容易に判断することができる。例えば、検査抗体が参照抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを判断するために、飽和条件下で参照抗体を標的に結合させる。次に、検査抗体の標的分子に結合する能力を評価する。参照抗体との結合が飽和した後に検査抗体が標的分子に結合することができる場合、検査抗体は、参照抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方では、参照抗体との結合が飽和した後に検査抗体が標的分子に結合することができない場合、検査抗体は、参照抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合し得る。
抗体が参照抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体との結合と競合するかどうかを判断するために、上記に記載された結合手法を２つの方針で実行する：第１の方針では、飽和条件下で参照抗体をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合させた後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分子への検査抗体の結合性を評価する。第２の方針では、飽和条件下で検査抗体をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原分子に結合させた後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分子への参照抗体の結合性を評価する。いずれの方針でも、最初の（飽和している）抗体のみがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することができる場合、検査抗体及び参照抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への結合について競合すると結論付けられる。当業者に理解される通り、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するというわけではないが、重複しているか又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断している可能性がある。
他方が抗原に結合するのをそれぞれ競合的に阻害（遮断）する場合、２つの抗体は、同一か又は重複するエピトープと結合している。即ち、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰な一方の抗体は、競合的結合アッセイで測定する場合、他方の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％、９０％又は更に９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。代わりに、本質的に、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原内の全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は、同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。いくつかの態様では、ＣＯＶ２－２１９６と同一か又は重複するエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントは、ＣＯＶ２－２１３０と同一か又は重複するエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントと組み合わせて使用される。
次いで、更なる通常の実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施して、観察された検査抗体の結合性の欠如が、実際に参照抗体と同一のエピトープに結合することによるものであるか、又は立体配置による遮断（又は別の現象）が、観察された結合性の欠如に関与するかどうかを確認することができる。この種の実験は、当技術分野において利用可能なＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリー又は任意の他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。ＥＭ又は結晶学による構造研究により、２つの抗体が、同一のエピトープを認識する結合について競合するか否かを立証することもできる。
別の態様では、表３及び４にそれぞれ例示されるような、重鎖及び軽鎖由来のクローン対ＣＤＲを有するモノクローナル抗体が提供される。そのような抗体は、本明細書に記載される方法を用いて、実施例の項の以下で説明されるクローンによって産生され得る。
別の態様では、抗体は、更なる「フレームワーク」領域を含むそれらの可変配列によって定義され得る。更に、抗体配列は、任意選択的に、下記により詳細に説明される方法を用いてこれらの配列から変化させ得る。例えば、核酸配列は、上記で述べたものから以下の点で変化させ得る：（ａ）可変領域を軽鎖及び重鎖の定常ドメインと離れて分離させ得るか、（ｂ）核酸を上記で述べたものから変化させ得るが、それにコードされる残基に影響を与えないか、（ｃ）核酸を上記で述べたものから所与の割合、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性で変化させ得るか、（ｄ）核酸を上記で述べたものから、約５０℃～約７０℃の温度の約０．０２Ｍ～約０．１５ＭのＮａＣｌによって提供されるような、低塩条件及び／若しくは高温条件によって例示される高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力によって変化させ得るか、（ｅ）アミノ酸を上記で述べたものから所与の割合、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性で変化させ得るか、又は（ｆ）アミノ酸を（以下で説明される）保存的置換を可能にすることによって上記で述べたものから変化させ得る。前述の各々は、核酸配列及びアミノ酸配列に当てはまる。
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列内のヌクレオチド又はアミノ酸の配列が、下記で説明するように最大限に対応するようにアライメントしたときに同一である場合、２つの配列は「同一」であると言及される。２つの配列間の比較は、典型的に、比較窓上で配列を比較し、配列が類似する局所領域を同定及び比較することによって行われる。「比較窓」は、本明細書で使用する場合、少なくとも約２０個、通常、３０～約７５個、４０～約５０個の隣接する位置のセグメントを指し、２つの配列が最適にアライメントされた後、配列を同数の隣接する位置の参照配列と比較することができる。
比較のための配列の最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを用いたバイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｕｉｔｅ内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）を使用して実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアライメントスキームを組み入れている：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－－Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５－３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｐｐ．６２６－６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６－４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ－－ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６－７３０。
代わりに、比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似した方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装形態（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は検査によって実施され得る。
配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの１つの特定の例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０にそれぞれ記載されている。例えば、本明細書に記載されるパラメーターでＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０を使用して、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列同一性の割合を決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターを通じて公的に入手可能である。抗体配列の再構成された性質及び可変長の各遺伝子では、単一の抗体配列の複数ラウンドのＢＬＡＳＴ検索が必要となる。また、異なる遺伝子の手動アセンブリは困難であり、誤りが生じやすい。配列分析ツールであるｌｇＢＬＡＳＴ（ワールドワイドウェブ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）は、生殖系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子との一致、再構成接合部の詳細、ＩｇのＶドメインのフレームワーク領域の記述及び相補性決定領域を識別する。ｌｇＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド又はタンパク質配列を分析することが可能であり、配列をバッチで処理することができ、生殖系列遺伝子データベースと他の配列データベースとを同時に検索して、可能な限り最も一致する生殖系列Ｖ遺伝子を見逃す機会を最小限にすることができる。
一例示的実施例では、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（一致する残基対の報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基のペナルティスコア；常に＞０）を使用して、累積スコアを算出することができる。各方向でヒットしたワードの拡張は、以下の場合に停止させる：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負にスコア付された残基アライメントが累積することにより、累積スコアがゼロ以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）及び１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アライメント、５０の（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両鎖の比較を使用する。
アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを算出することができる。各方向でヒットしたワードの拡張は、以下の場合に停止させる：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負にスコア付された残基アライメントが累積することにより、累積スコアがゼロ以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。
１つの手法では、「配列同一性の割合」は、２つの最適にアライメントされた配列を少なくとも２０個の位置の比較窓上で比較することによって決定し、比較窓内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の位置は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常、５～１５パーセント又は１０～１２パーセントの付加又は欠失（即ちギャップ）を含み得る。この割合は、一致する位置の数を得るために同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列内に存在する位置の数を決定し、この一致する位置の数を参照配列（即ちウィンドウサイズ）の位置の総数で除算し、この結果に１００を積算して配列同一性の割合を得ることにより算出する。
抗体を定義する更に別の方法は、下記に記載される抗体及びそれらの抗原結合フラグメントのいずれかの「誘導体」としてのものである。「誘導体」という用語は、免疫特異的に抗原に結合するが、「親（又は野生型）」分子と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失又は改変を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。そのようなアミノ酸置換又は付加により、天然に存在する（即ちＤＮＡにコードされている）又は天然に存在しないアミノ酸残基を導入することができる。「誘導体」という用語は、例えば、増強された又は損なわれたエフェクター特性又は結合特性を呈する変異Ｆｃ領域を有する抗体などが形成されるように、例えば改変されたＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４領域を有する変異体として包含する。「誘導体」という用語は、非アミノ酸修飾、例えば、グリコシル化（例えば、改変されたマンノース、２－Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、５－Ｎ－アセチルノイラミン酸、５－グリコルノイラミン酸などの含分を有するもの）、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などが可能なアミノ酸を追加的に包含する。いくつかの実施形態では、変化した炭水化物修飾により、以下の１つ以上：抗体の可溶化、抗体の細胞内輸送及び分泌の促進、抗体の会合の促進、立体構造的完全性及び抗体媒介性エフェクター機能が調節される。特定の実施形態では、変化した炭水化物修飾は、炭水化物修飾のない抗体と比較して抗体媒介エフェクター機能を増強する。変化した抗体媒介エフェクター機能をもたらす炭水化物修飾は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｌａｃｋ Ｏｆ Ｆｕｃｏｓｅ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－２６７４０；Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＧｎＴＩＩＩ Ｉｎ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ＣＨＯ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ Ｌｅａｄｓ Ｔｏ Ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｉｎ ＡＤＣＣ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｉｇｈｅｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ ＦＣ Ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７４（４）；２８８－２９４を参照されたい）。炭水化物の内容を変更する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ ＶＨ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｏｆ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｐｈａ（１－－－－６）Ｄｅｘｔｒａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｉｔｓ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ，”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（３）：１０９９－１１０９；Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）“Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｆ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｕｓｅ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（８）：２５９５－２６０１；Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣＤ３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０（８）：８４７－５３；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４１４－２１；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｌａｃｋ ｏｆ Ｆｕｃｏｓｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）；２６７３３－２６７４０）を参照されたい。
誘導体抗体又は抗体フラグメントは、ビーズベースアッセイ若しくは細胞ベースアッセイ又は動物モデルにおけるインビボ研究によって測定した場合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）又は抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）機能において好ましいレベルの活性を付与するために、改変配列又はグリコシル化状態で生成することができる。
誘導体抗体又は抗体フラグメントは、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に公知の技法を使用する化学修飾によって修飾され得る。一実施形態では、抗体誘導体は、親抗体と類似又は同一の機能を有する。別の実施形態では、抗体誘導体は、親抗体と比較して変化した活性を示す。例えば、誘導体抗体（又はそのフラグメント）は、親抗体よりも強固にそのエピトープに結合し得るか、又はタンパク質分解に対してより耐性があり得る。
Ｃ．抗体配列の改変
様々な実施形態では、改善された発現、改善された交差反応性又は減少したオフターゲット結合などの様々な理由のため、同定された抗体の配列を改変することを選択し得る。改変抗体は、標準的な分子生物学的技術又はポリペプチドの化学合成による発現を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。組換え発現の方法は、本明細書の他の箇所で対応している。以下は、抗体改変に関連する目的の技術の一般的な考察である。
ハイブリドーマを培養し、次いで細胞を溶解させ、トータルＲＮＡを抽出し得る。ランダムヘキサマーを室温で用いてＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成し、次いで全てのヒト可変遺伝子配列を増幅することが予想されるＰＣＲプライマーの複数の混合物を使用して、ＰＣＲを実行し得る。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングし、次いで標準的なベクタープライマーを使用する自動ＤＮＡ塩基配列決定法によって配列を決定することができる。ハイブリドーマ上清から回収された抗体を使用して結合アッセイ及び中和アッセイを実行し、プロテインＧカラムを使用するＦＰＬＣによって精製し得る。
組換え完全長ＩｇＧ抗体は、重鎖及び軽鎖ＦｖのＤＮＡをクローニングベクターからＩｇＧプラスミドベクターにサブクローニングし、２９３（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）細胞又はＣＨＯ細胞に形質移入することによって生成することができ、抗体は、２９３細胞又はＣＨＯ細胞上清から回収して精製することができる。他の適切な宿主細胞系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、昆虫細胞（Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）、植物細胞（例えば、ヒト様グリカンの改変の有無に関わらないタバコ）、藻類又は様々な非ヒトトランスジェニックに関連するもの、例えばマウス、ラット、ヤギ若しくはウシが挙げられる。
後続の抗体の精製及び宿主の免疫化の両方の目的のための、抗体をコードする核酸の発現も意図される。抗体コード配列は、天然ＲＮＡ又は改変ＲＮＡなどのＲＮＡであり得る。改変ＲＮＡは、ｍＲＮＡに向上した安定性及び低い免疫原性を付与する特定の化学修飾を意図したものであり、これにより治療上重要なタンパク質の発現が促進される。例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍΨ）は、いくつかの他のヌクレオシド修飾及びそれらの組み合わせよりも翻訳能力の点で優れた性能を有する。翻訳の免疫／ｅＩＦ２αリン酸化依存性阻害を遮断することに加えて、組み込まれたＮ１ｍΨヌクレオチドは、ｍＲＮＡ上のリボソーム休止とその密度を増加させることにより、翻訳プロセスの動態を劇的に変化させる。改変ｍＲＮＡのリボソームの負荷が増加すると、同一のｍＲＮＡにおけるリボソームのリサイクル又は新規のリボソームの動員に有利になることにより、それらの開始がより許容されるようになる。そのような改変を用いて、ＲＮＡを接種した後のインビボにおける抗体発現を増強させることができる。天然であるか又は改変されたかに関わらず、ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡとして又は脂質ナノ粒子などの送達ビヒクル内で送達され得る。
代わりに、同じ目的のために、抗体をコードするＤＮＡを使用し得る。ＤＮＡには、設計された宿主細胞で活性化するプロモーターを含む発現カセットが含まれる。有利なことに、発現カセットは、従来のプラスミド又はミニベクターなどの複製可能なベクターに含まれている。ベクターとしては、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターが挙げられ、レンチウイルスが意図される。ＶＥＥウイルス又はシンドビスウイルスをベースとしたアルファウイルスレプリコンなどの抗体遺伝子をコードするレプリコンも意図される。そのようなベクターの送達は、筋肉内、皮下若しくは皮内経路を介して針により、又はインビボ発現が所望される場合には経皮エレクトロポレーションにより行うことができる。
最終的なｃＧＭＰ製造プロセスと同一の宿主細胞及び細胞培養プロセスで産生される抗体を迅速に得ることができることにより、プロセス開発プログラムの期間が縮小される可能性がある。Ｌｏｎｚａ社により、ＣＨＯ細胞内で少量（最大５０ｇ）の抗体を迅速に産生するために、ＣＤＡＣＦ培地中で増殖させたプールした形質移入体を用いる一般的方法が開発された。本物の一過性系よりわずかに遅いものの、その利点として、高い生成物濃度並びに産生細胞株と同一の宿主及びプロセスを使用することが挙げられる。使い捨てバイオリアクター内でモデル抗体を発現するＧＳ－ＣＨＯプールの増殖及び産生能に関する例として、形質移入の９週間以内に、流加モードで動作する使い捨てバッグバイオリアクター培養液（５Ｌの仕込量）中で２ｇ／Ｌの収集抗体濃度が達成された。
抗体分子は、例えば、ｍＡｂのタンパク質分解切断又は例えば組換え手段によって産生可能な単鎖免疫グロブリンによって生成されるフラグメント（Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２など）を含む。Ｆ（ａｂ’）抗体誘導体は一価だが、Ｆ（ａｂ’）２抗体誘導体は二価である。一実施形態では、そのようなフラグメントを互いに又は他の抗体フラグメント若しくは受容体リガンドと組み合わせて、「キメラ」結合分子を形成することができる。重要なことに、そのようなキメラ分子は、同一分子の異なるエピトープに結合可能な置換基を含有し得る。
関連する実施形態では、抗体は、開示される抗体の誘導体、例えば、開示される抗体のものと同一のＣＤＲ配列を含む抗体である（例えば、キメラ抗体又はＣＤＲ移植抗体）。代わりに、抗体分子に保存的変化を導入するような改変を行うことが望ましい場合がある。そのような変更を行う際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、従ってそのタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認識されている。
そのようなアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行い得ることも当技術分野において理解される。参考として本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号明細書には、タンパク質の生物学的性質と相関する、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大の局所的な平均親水性が明記されている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳細に記載されているように、アミノ酸残基には、以下の親水性値が割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）及びヒスチジン（－０．５）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、アスパラギン（＋０．２）及びグルタミン（＋０．２）；親水性非イオン性アミノ酸：セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）及びスレオニン（－０．４）、硫黄含有アミノ酸：システイン（－１．０）及びメチオニン（－１．３）；疎水性非芳香族アミノ酸：バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）及びグリシン（０）；疎水性芳香族アミノ酸：トリプトファン（－３．４）、フェニルアラニン（－２．５）及びチロシン（－２．３）。
アミノ酸を、類似した親水性を有する別のアミノ酸に置換し、生物学的に又は免疫学的に改変されたタンパク質を生成できることを理解されたい。そのような変化では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更に特に好ましい。
上記に概説した通り、アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特性を考慮に入れた例示的な置換は、当業者によく知られており、アルギニン及びリシン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
本開示は、アイソタイプの改変も意図される。異なるアイソタイプを有するようにＦｃ領域を改変することにより、異なる機能を得ることが可能となる。例えば、ＩｇＧ１への変化によって抗体依存性細胞傷害性を増大させることができ、クラスＡへのスイッチによって組織分布を改善することができ、クラスＭへのスイッチによって価数を改善させることができる。
代わりに又は更に、アミノ酸改変を、ＩＬ－２３ｐ１９結合分子のＦｃ領域のＣ１ｑ結合機能及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）機能を変化させる１つ以上の更なるアミノ酸改変と組み合わせることが有用であり得る。特に興味深い結合ポリペプチドは、Ｃ１ｑに結合し、補体依存性細胞傷害性を示す結合ポリペプチドであり得る。既存のＣ１ｑ結合活性を有し、任意選択的にＣＤＣを媒介する能力を更に有するポリペプチドを、これらの活性の一方又は両方が増強するように改変し得る。Ｃ１ｑを変化させ、且つ／又はその補体依存性細胞傷害機能を改変するアミノ酸改変は、例えば、参照として本明細書に組み込まれる国際公開第００４２０７２号パンフレットに記載されている。
例えば、Ｃ１ｑ結合性及び／又はＦｃγＲ結合性を改変することにより、変化したエフェクター機能を有する抗体のＦｃ領域を設計することができ、これによりＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を変化させることができる。「エフェクター機能」は、（例えば、対象における）生物活性を活性化又は減少させることに関与する。エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合性、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合性、抗体依存性細胞媒介障害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせたＦｃ領域を必要とする場合があり、様々なアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を用いて評価することができる。
例えば、改善されたＣ１ｑ結合性及び改善されたＦｃγＲＩＩＩ結合性を有する（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性及び改善されたＣＤＣ活性の両方を有する）抗体の変異Ｆｃ領域を生成することができる。代わりに、エフェクター機能を低減又は除去することが望ましい場合、変異Ｆｃ領域は、ＣＤＣ活性を低減及び／又はＡＤＣＣ活性を低減することによって改変することができる。他の実施形態では、これらの活性の一方のみを向上させ得、また任意選択的に他方の活性を低減させ得る（例えば、ＡＤＣＣ活性が改善するが、ＣＤＣ活性を低減させた（その逆も同様の）Ｆｃ領域変異体を生成する）。
ＦｃＲｎ結合性。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を変化させ、薬動動態特性を向上させるために、Ｆｃ変異を導入して改変することもできる。改善されたＦｃＲｎへの結合性を有するヒトＦｃ変異体のコレクションが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）．Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩ，ＦｃγＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＦｃγＲ，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４）。増加した半減期を生じさせることが可能な多数の方法が公知であり（Ｋｕｏ ａｎｄ Ａｖｅｓｏｎ，（２０１１））、例えばアラニンスキャニング変異誘発、ランダム突然変異誘発並びに新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性及び／又はインビボにおける挙動を評価するためのスクリーニングを含む技法によってアミノ酸改変を生じさせ得る。変異させるアミノ酸変異の１つを選択するために、計算戦略後に変異誘発を用い得る。
従って、本開示は、最適化されたＦｃＲｎへの結合性を有する抗原結合タンパク質の変異体を提供する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の前記変異体は、前記抗原結合タンパク質のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記改変は、前記親ポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域の２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９７、２９８、２９９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６及び４４７からなる群から選択され、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。本開示の更なる態様では、改変は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅである。
加えて、様々な刊行物は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子に導入するか、又は分子をＦｃＲｎ結合親和性が保存されているが他のＦｃ受容体への親和性が大きく低下した抗体と融合させるか、又は抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させることにより、半減期が変更された生理学的に活性な分子を得るための方法を記載している。例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００９）を参照されたい。
哺乳動物、特にヒトにおける親抗体の半減期（例えば、血清半減期）を変更するために誘導体化抗体を使用し得る。そのような変更により、１５日超、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヶ月超、３ヶ月超、４ヶ月超又は５ヶ月超の半減期をもたらし得る。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本開示の抗体又はそのフラグメントの半減期が増加することにより、哺乳動物の前記抗体又は抗体フラグメントの血清力価が高くなる結果となり、これによって前記抗体又は抗体フラグメントの投与頻度が低減し、且つ／又は投与される前記抗体又は抗体フラグメントの濃度が低減する。インビボ半減期が増加した抗体又はそのフラグメントは、当業者に公知の技法によって生成することができる。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又はそのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失又は付加）することによって生成することができる。
Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）では、デングウイルス感染を亢進する傾向があるために、ＣＨ２ドメインの１．３位及び１．２位のロイシン残基（ＩＭＧＴのＣドメインのための独自の番号付けによる）をアラニン残基で置換したものを生成することによる中和ｍＡｂの改変がすでに報告されている。この改変は、Ｈｅｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）に記載されているように、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩａに結合する抗体を無効にする「ＬＡＬＡ」変異としても知られている。変異組換えｍＡｂと未改変組換えｍＡｂを、４種のデングウイルス血清型による感染を中和及び亢進する能力について比較した。ＬＡＬＡ変異体は、未改変ｍＡｂと同じ中和活性を保持したが、完全には活性を亢進しなかった。従って、本明細書に開示される抗体に関連して、この種のＬＡＬＡ変異が意図される。
グリコシル化の変化。本開示の特定の実施形態は、シアル酸、ガラクトース又はフコースを含まずに実質的に均一なグリカンを含有する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。モノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、その両方は、それぞれ重鎖定常領域又は軽鎖定常領域に結合され得る。上述した実質的に均一なグリカンは、重鎖定常領域に共有結合され得る。
本開示の別の実施形態は、新規のＦｃグリコシル化パターンを有するｍＡｂを含む。単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＧＮＧＮ又はＧ１／Ｇ２グリコフォームで表される実質的に均一な組成物中に存在する。Ｆｃのグリコシル化は、治療用ｍＡｂの抗ウイルス特性及び抗癌特性に重要な役割を果たしている。本開示は、フコースを含まない抗ＨＩＶ ｍＡｂがインビトロにおいて抗レンチウイルス細胞媒介性ウイルス阻害を増加させたことを示す近年の研究と一致するものである。コアフコースを欠く均一なグリカンによる本開示の本実施形態は、２倍超の係数で特定のウイルスに対する防御が増大することを示した。コアフコースを排除することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって媒介されるｍＡｂのＡＤＣＣ活性が劇的に向上するが、多形核細胞（ＰＭＮ）のＡＤＣＣ活性は逆の影響があるように思われる。
ＧＮＧＮ又はＧ１／Ｇ２グリコフォームで表される実質的に均質な組成物を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、実質的に均一なＧＮＧＮグリコフォームを含まず、且つＧ０、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、ＧＮＦ、ＧＮＧＮＦ又はＧＮＧＮＦＸ含有グリコフォームを含む同一の抗体と比較して、ＦｃガンマＲＩ及びＦｃガンマＲＩＩＩへの結合親和性が向上したことを示している。本開示の一実施形態では、抗体は、ＦｃガンマＲＩから１×１０－８Ｍ以下のＫｄで解離し、ＦｃガンマＲＩＩＩから１×１０－７ＭのＫｄで解離する。
Ｆｃ領域のグリコシル化は、典型的にはＮ－結合又はＯ－結合のいずれかである。Ｎ－結合は、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合していることを指す。Ｏ－結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに結合していることを指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンも用いられ得る。炭水化物部分がアスパラギン側鎖のペプチド配列に酵素的に結合するための認識配列は、アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニンであり、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。従って、ポリペプチドにこれらのペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。
例えば、ポリペプチド内に見られる１つ以上のグリコシル化部位を欠失させること及び／又はポリペプチドに存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することにより、グリコシル化パターンを変化させ得る。抗体のＦｃ領域へのグリコシル化部位の付加は、便宜上、上記に記載したトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって達成される（Ｎ－結合型グリコシル化部位の場合）。例示的なグリコシル化変異体には、重鎖の残基Ａｓｎ２９７のアミノ酸置換がある。また、元のポリペプチドの配列に１つ以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することによって変更を行い得る（Ｏ－結合型グリコシル化部位の場合）。加えて、Ａｓｎ２９７からＡｌａに変更することにより、グリコシル化部位の１つを除去することができる。
特定の実施形態では、抗体は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）を発現する細胞に発現し、これによりＧｎＴ ＩＩＩがＩＬ－２３ｐ１９抗体にＧｌｃＮＡｃを付加する。そのような様式で抗体を生成するための方法は、国際公開第９９５４３４２号パンフレット、国際公開第０３０１１８７８号パンフレット、特許公開２００３０００３０９７Ａ１号明細書及びＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：１７６－１８０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９９に示されている。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）などのゲノム編集技術を使用して、グリコシル化などの特定の翻訳後修飾を促進、又は減少、又は排除するように細胞株を変更することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、組換えモノクローナル抗体を発現させるのに用いられる２９３細胞又はＣＨＯ細胞内のグリコシル化酵素をコードする遺伝子を排除することができる。
モノクローナル抗体タンパク質の配列易障害性の排除。ヒトＢ細胞から得られた抗体可変遺伝子配列を改変し、それらの製造可能性及び安全性を高めることが可能である。潜在的なタンパク質の配列易障害性は、以下を含有する部位に関連する配列モチーフを探索することによって同定することができる：
１）不対Ｃｙｓ残基、
２）Ｎ－結合型グリコシル化、
３）Ａｓｎの脱アミド、
４）Ａｓｐの異性化、
５）ＳＹＥのトランケーション、
６）Ｍｅｔの酸化、
７）Ｔｒｐの酸化、
８）Ｎ末端のグルタミン酸、
９）インテグリンの結合、
１０）ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８の結合、又は
１１）断片化。
そのようなモチーフは、組換え抗体をコードするｃＤＮＡの合成遺伝子を変更することによって排除することができる。
治療用抗体の開発の分野におけるタンパク質を改変する取り組みにより、特定の配列又は残基が溶解度の差に関与することが明示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｅｓｃａｍｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（１０），１３０２－１３０６，２００４；Ｃｈｅｎｎａｍｓｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６（２９），１１９３７－１１９４２，２００９；Ｖｏｙｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，２１（２），３８５－３９２，２０１０）。文献内の溶解度を変化させる変異体から得た証拠により、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンなどの一部の親水性残基が、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、リシン及びアルギニンなどの他の親水性残基よりも著しく有利にタンパク質の溶解度に寄与することが示されている。
安定性。抗体は、生物物理学的特性を向上させるために改変することができる。高温で抗体をアンフォールディングし、平均的な見かけの融解温度を用いて相対的な安定性を判断することができる。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）では、分子の熱容量、Ｃｐ（１度当たりの分子を温めるのに必要となる熱）を、温度の関数として測定する。ＤＳＣを使用して、抗体の熱安定性を試験することができる。ｍＡｂのＤＳＣデータは、ｍＡｂ構造内の個々のドメインのアンフォールディングを消散させる場合があり、サーモグラムに（Ｆａｂ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアンフォールディングに由来する）最大で３つのピークを生じさせるため、特に興味深いものである。典型的には、Ｆａｂドメインのアンフォールディングが最も強いピークを生じさせる。Ｆｃ部分のＤＳＣプロファイル及び相対的な安定性は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスで特徴的な差異を示す（Ｇａｒｂｅｒ ａｎｄ Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５，７５１－７５７，２００７）。ＣＤ分光計によって実行される円偏光二色性（ＣＤ）により、平均の見かけの融解温度を測定することもできる。０．５ｎｍ間隔での２００～２６０ｎｍの範囲で抗体の遠紫外線ＣＤスペクトルが測定される。最終的なスペクトルは、２０回の累積した平均として測定することができる。バックグラウンド除去の後に残基の楕円率の値を算出することができる。抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ）の熱変性を、２５～９５℃から１℃／分の加熱速度において２３５ｎｍで観察することができる。動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、凝集する傾向について評価することができる。ＤＬＳは、タンパク質を含む様々な粒子のサイズを特性化するために使用される。系のサイズが分散していない場合、粒子の平均有効径を測定することができる。この測定値は、粒子コアのサイズ、表面構造体のサイズ及び粒子濃度に依存する。ＤＬＳは、実質的に粒子による散乱光強度の変動を測定するものであるため、粒子の拡散係数を測定することができる。市販のＤＬＡ機器内のＤＬＳソフトウェアにより、異なる直径の粒子集団が表示される。安定性試験は、ＤＬＳを使用して簡便に行うことができる。試料のＤＬＳ測定値は、粒子の流体力学半径が増大するかどうかを測定することにより、粒子が経時的に又は温度変化によって凝集するかどうかを示すことができる。粒子が凝集する場合、より大きい半径を有するより大きい粒子の集団を観察することができる。温度をその場で制御することにより、温度に応じた安定性を分析することができる。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）技術には、抗体安定性の特徴を決定するための立証された方法が含まれる。ｉＣＥ手法を使用して、脱アミド、Ｃ末端リシン、シアリル化、酸化、グリコシル化及びタンパク質のｐＩの変化を生じさせることが可能な任意の他のタンパク質に変更することにより、抗体タンパク質電荷変異体を分離することができる。発現した抗体タンパク質の各々は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍａｕｒｉｃｅ機器を使用した、ハイスループットな自由溶液のキャピラリーカラムでの等電点電気泳動法（ＩＥＦ、ｃＩＥＦ）によって評価することができる。等電点（ｐＩ）に集束する分子をリアルタイムで観察するために、全カラムのＵＶ吸収検出を３０秒毎に実施することができる。この手法は、流動工程の必要性を排除しながら、カラムベースの分離に見られる定量化及び自動化の利点を有する高分解能の従来のゲルＩＥＦを組み合わせたものである。この技法により、発現した抗体の同一性、純度及び不均一性プロファイルの再現可能な定量的分析がもたらされる。この結果により、吸光度及び固有蛍光検出モードの両方において且つ０．７μｇ／ｍｌまでの検出感度で、抗体における電荷の不均一性及び分子サイジングが同定される。
溶解度。抗体配列の真の溶解度スコアを測定することができる。真の溶解度スコアは、ＣａｍＳｏｌ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃを用いて算出することができる（Ｓｏｒｍａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２７，４７８－４９０，２０１５）。ｓｃＦｖなどの各抗体フラグメントのＨＣＤＲ３内の残基９５～１０２（Ｋａｂａｔ番号付け）のアミノ酸配列を、オンラインプログラムによって評価して、溶解度スコアを算出することができる。また、検査技術を用いて溶解度を測定することもできる。溶液が飽和して溶解限度に達するまで、凍結乾燥したタンパク質を溶液に添加すること又は好適な分画分子量によるマイクロ濃縮器での限外濾過によって濃縮することを含む、様々な技法が存在する。最も簡単な方法は、アモルファス沈殿を誘発することであり、これによって硫酸アンモニウムを使用したタンパク質沈殿に関する方法を使用して、タンパク質の溶解度を測定する（Ｔｒｅｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３６６：４４９－４６０，２００７）。硫酸アンモニウム沈殿により、相対的な溶解度の値について迅速且つ正確な情報が得られる。硫酸アンモニウム沈殿は、十分に画定された水相及び固相を含む沈殿した溶液を生じ、比較的少量のタンパク質が必要とされる。硫酸アンモニウムによるアモルファス沈殿の誘発によって行われる溶解度の測定は、異なるｐＨ値で容易に行うこともできる。タンパク質の溶解度はｐＨに大きく依存し、ｐＨは溶解度に影響を及ぼす最も重要な外因子であると見なされる。
自己反応性。一般に、自己反応性のクローンは、負の選択によって個体発生の間に排除されなければならないと考えられているが、しかしながら、成体の成熟したレパートリー内に自己反応性の特性を備える多くのヒト天然抗体が残存しており、この自己反応性が、病原体に対する多くの抗体の抗ウイルス機能を増強する可能性があることが明らかになってきている。初期Ｂ細胞の発達中の抗体内のＨＣＤＲ３ループは、正電荷に富んでいることが多く、自己反応性パターンを示すことが知られている（Ｗａｒｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，１３７４－１３７７，２００３）。ヒト由来の細胞に対する結合のレベルを、顕微鏡検査（接着ＨｅＬａ細胞又はＨＥｐ－２上皮細胞を使用する）並びにフローサイトメトリー細胞表面染色（懸濁ジャーカットＴ細胞及び２９３Ｓヒト胎児腎臓細胞を使用する）で評価することにより、所与の抗体の自己反応性を検査することができる。自己反応性は、組織アレイ内の組織に対する結合性の評価によって調査することもできる。
好ましい残基（「ヒト類似性」）。多くの近年の研究において、供血者からのヒトＢ細胞のＢ細胞レパートリーのディープシークエンシングが広範に実施されている。かなりの部分のヒト抗体レパートリーに関する配列情報により、健康なヒトに共通する抗体配列の特徴を統計的に評価することが容易となる。ヒト組換え抗体可変遺伝子の参照データベースにおける抗体配列の特徴に関する知見により、抗体配列の位置特異的な「ヒト類似性（ＨＬ）」の程度を推定することができる。ＨＬは、治療用抗体又はワクチンとしての抗体などの臨床用途における抗体の開発に有用であることが示されている。その目的は、抗体のヒト類似性を向上させ、起こり得る有害反応及び抗体薬物の有効性を著しく低下させることになるか、又は重篤な健康に及ぼす影響を引き起こす可能性のある抗抗体免疫応答を低減させることである。３人の健康なヒト供血者の全体で約４億個の配列を組み合わせた抗体レパートリーの抗体特性を評価し、抗体の超可変領域に着目した新しい「相対的ヒト類似性」（ｒＨＬ）スコアを生成することができる。ｒＨＬスコアにより、ヒト配列（正のスコア）及び非ヒト配列（負のスコア）を容易に識別することが可能となる。ヒトレパートリーで一般的でない残基を排除するように抗体を改変することができる。
Ｄ．単鎖抗体
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短い（通常、セリン、グリシン）リンカーに共に連結された、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域が除去され、リンカーペプチドが導入されているにも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。この改変では、通常、特異性が変化せずに残っている。歴史的に、これらの分子は、単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現することが極めて簡便となるファージディスプレイを容易にするために生成されたものである。代わりに、サブクローニングされたハイブリドーマ又はＢ細胞由来の重鎖及び軽鎖からｓｃＦｖを直接生成することができる。単鎖可変フラグメントには、完全な抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域がなく、従って共通の結合部位（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を使用して抗体を精製する。これらのフラグメントは、プロテインＬがκ軽鎖の可変領域と相互作用するため、多くの場合、プロテインＬを使用して精製／固定化することができる。
フレキシブルリンカーは、一般に、アラニン、セリン及びグリシンなどのヘリックス及びターンを促進するアミノ酸残基から構成されている。しかしながら、他の残基も同様に機能することができる。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）では、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）に適合させたリンカーをタンパク質リンカーライブラリーから迅速に選択する手段として、ファージディスプレイを使用している。重鎖及び軽鎖可変ドメインの遺伝子を可変組成の１８個のアミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントで連結したランダムリンカーライブラリーを構築した。ｓｃＦｖレパートリー（約５×１０６個の異なるメンバー）を繊維状ファージ上にディスプレイし、ハプテンによる親和性選択を行った。選択された変異体の集団は結合活性の大幅な増大を示したが、かなりの配列多様性を保持していた。続いて、１０５４個の個々の変異体をスクリーニングすることにより、可溶性形態で効率的に生成された、触媒活性のあるｓｃＦｖが得られた。配列分析により、選択されたテザーの唯一の共通の特徴として、ＶＨのＣ末端の２つの残基の後ろにあるリンカーに保存されたプロリンと、他の位置における豊富なアルギニン及びプロリンとが明らかとなった。
また、本開示の組換え抗体は、受容体の二量体化又は多量体化を可能にする配列又は部分に関与し得る。そのような配列としては、Ｊ鎖と連動して多量体の形成を可能にするＩｇＡから誘導されるようなものが挙げられる。別の多量体化ドメインは、Ｇａｌ４二量体化ドメインである。他の実施形態では、ビオチン／アビジンなどの薬剤で鎖を改変し得、これにより２つの抗体を組み合わせることが可能となる。
個別の実施形態では、単鎖抗体は、非ペプチドリンカー又は化学的ユニットを用いて受容体軽鎖及び重鎖を結合することにより生成することができる。一般に、軽鎖及び重鎖は、別個の細胞で産生されて精製され、続いて適切な様式で共に連結される（即ち重鎖のＮ末端が適切な化学架橋を介して軽鎖のＣ末端に結合される）。
２つの異なる分子の官能基を結び付ける分子架橋を形成するために、架橋試薬、例えば、安定化剤及び凝固剤が使用される。しかしながら、同一の類似体又は異なる類似体から構成される異種複合体の二量体又は多量体を生成できることが意図される。段階的な方法で２つの異なる化合物を連結させるために、不要なホモポリマーの形成を排除するヘテロ二機能性架橋剤を使用することができる。
例示的なヘテロ二機能性架橋剤は、２つの反応性基：一方が一級アミン基（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）と反応するもの及び他方がチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応するものを含有する。第一級アミン反応性基により、架橋剤が一方のタンパク質（例えば、選択された抗体又はフラグメント）のリシン残基と反応することができ、チオール反応性基により、すでに最初のタンパク質に結び付いた架橋剤が他方のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（スルフヒドリル基を含まない）と反応する。
血中で妥当な安定性を有する架橋剤を使用することが好ましい。標的剤及び治療剤／防止剤をコンジュゲートするために有利に使用することができる、様々な種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。立体的に障害されるジスルフィド結合を含有するリンカーにより、インビボにおける良好な安定性が得られることが証明され、これによって作用部位に到達する前に標的ペプチドが放出されるのを回避することができる。従って、これらのリンカーは連結剤の一グループである。
別の架橋試薬はＳＭＰＴであり、これは、隣接するベンゼン環及びメチル基によって「立体的に障害される」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織及び血液中に存在する可能性のあるグルタチオンなどのチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、これによって結合した薬剤が標的部位に送達される前にコンジュゲートが分離するのを防止する手助けをすると考えられている。
他の多くの公知の架橋試薬と同様に、ＳＭＰＴ架橋試薬は、システインのＳＨ又は一級アミン（例えば、リシンのεアミノ基）などの官能基を架橋する能力を有する。別の考えられる種類の架橋剤としては、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３－ジチオプロピオナートなどの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二機能性の光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル基は、一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解時）は、あらゆるアミノ酸残基と非選択的に反応する。
障害された架橋剤に加えて、非障害性リンカーも本明細書に従って使用することができる。保護されたジスルフィドを含有又は生成すると見なされない、他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ及び２－イミノチオランが挙げられる（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）。そのような架橋剤を使用することは、当技術分野において十分に理解されている。別の実施形態では、フレキシブルリンカーの使用を伴う。
米国特許第４，６８０，３３８号明細書には、リガンドとアミン含有ポリマー及び／又はタンパク質とのコンジュゲートを生成するのに有用な、特に、キレート化剤、薬物、酵素、検出可能な標識などとコンジュゲートする抗体を形成するのに有用な二官能性リンカーが記載されている。米国特許第５，１４１，６４８号明細書及び同第５，５６３，２５０号明細書には、様々な穏やかな条件下で切断可能な不安定な結合を含む、切断可能なコンジュゲートが開示されている。このリンカーは、目的の薬剤がリンカーに直接結合され、切断によって活性剤の放出が生じ得る点で特に有用である。特定の用途には、遊離アミノ基又は遊離スルフヒドリル基を抗体などのタンパク質又は薬物に付加することが含まれる。
米国特許第５，８５６，４５６号明細書では、ポリペプチド成分を結合して融合タンパク質、例えば単鎖抗体を作製するのに使用されるペプチドリンカーが提供されている。リンカーは、長さが最大で約５０個のアミノ酸であり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニン又はリシン）の後に少なくとも１回出現するプロリンを含み、良好な安定性及び低減された凝集を特徴とするものである。米国特許第５，８８０，２７０号明細書では、様々な免疫診断及び分離技法に有用なアミノオキシ含有リンカーが開示されている。
Ｅ．多重特異性抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、二重特異性又は多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体では、第１の抗原結合部位を第２の抗原の結合部位と組み合わせることができる。代わりに、感染細胞に対する細胞防御機構に焦点を当て、これを突き止めるために、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）又はＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと抗病原体アームを組み合わせ得る。二重特異性抗体は、感染細胞に細胞傷害性薬物を局在化させるために使用することもできる。このような抗体は、病原体結合アームと、細胞傷害性薬物（例えば、サポリン、抗インターフェロン－α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。国際公開第９６／１６６７３号パンフレットには、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号明細書には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩ抗体が開示されている。国際公開第９８／０２４６３号パンフレットには、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体が示されている。米国特許第５，８２１，３３７号明細書には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。
二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野において公知である。従来の完全長二重特異性抗体の生成は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の同時発現に基づくものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）によって１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物が生成されるが、そのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われるが、かなり扱いにくく、生成物の収率が低い。同様の手順は、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。
異なる手法により、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、融合体は、少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインを含む。融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖が結合するのに必要となる部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体及び必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主細胞に同時形質移入する。これにより、この構造に使用される３つのポリペプチド鎖の比率が等しくないことにより、所望の二重特異性抗体の最適な収率がもたらされる場合の実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合をより柔軟に調整することがもたらされる。しかしながら、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現によって高い収率が得られるか、又はこの比率が所望の鎖の組み合わせの収率に著しい効果を及ぼさない場合、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することができる。
この手法の特定の実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とで構成される。この非対称構造により、二重特異性分子の２分の１に過ぎない免疫グロブリン軽鎖の存在によって容易な分離方法が提供されるため、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが容易になることが見出された。この手法は、国際公開第９４／０４６９０号パンフレットに開示されている。二重特異性抗体を生成する更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号明細書に記載されている別の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように改変することができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換される。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより、大きい側鎖と同一か又は同様の大きさの「空洞」が代償として第２の抗体分子の界面に形成される。これにより、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体などの他の不要な最終生成物の収率以上に増加させるための機構が提供される。
二重特異性抗体には、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化して（米国特許第４，６７６，９８０号明細書）、ＨＩＶ感染を治療する（国際公開第９１／００３６０号パンフレット、国際公開第９２／２００３７３号パンフレット及び欧州特許第０３０８９号明細書）ことが提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、当技術分野においてよく知られており、様々な架橋技法と共に米国特許第４，６７６，９８０号明細書に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）には、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するためにインタクト抗体をタンパク質分解によって切断する手順が記載されている。隣接したジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を妨げるために、これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元する。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ’－チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＦａｂ’－ＳＨフラグメントを直接回収することを容易にし、これを化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる技法が存在する。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７－２２５（１９９２）には、ヒト化二重特異性抗体のＦ（ａｂ’）２分子の生成が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から別々に分泌させ、インビトロで誘導される化学的結合を受けさせて二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体及び通常のヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合することができるだけでなく、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を引き起こすことも可能であった。
二重特異性抗体フラグメントを組換え細胞培養物から直接作製し、単離するための様々な技法についても記載されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，６７７－６８１（１９９８）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８－６７７ｐｍｉｄ：９６６１２０４）。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３，１９９２）。遺伝子融合により、Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合した。抗体のホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いでこれを再度酸化して抗体のヘテロ二量体を形成した。本方法は、抗体のホモ二量体を生成するために使用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）によって記載されている「ダイアボディー」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供している。フラグメントは、同一の鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないほど短いリンカーによってＶＬに結合されたＶＨを含む。従って、一方のフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインが、もう一方のフラグメントの相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対形成することが強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）二量体を使用することにより二重特異性抗体フラグメントを作製する別の方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成され得る（例えば、その各々の実施例の項が参考として本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２１，０５６号明細書、同第７，５２７，７８７号明細書、同第７，５３４，８６６号明細書、同第７，５５０，１４３号明細書及び同第７，６６６，４００号明細書を参照されたい）。一般に、この技法は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節性（Ｒ）サブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、様々なＡＫＡＰタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列との間に生じる特異性及び高親和性結合相互作用を利用するものである（Ｂａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４；Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、あらゆるタンパク質、ペプチド又は他の分子に結合され得る。ＤＤＤ配列は、自発的に二量体化してＡＤ配列に結合するため、この技法により、ＤＤＤ又はＡＤ配列に結合することのできるあらゆる選択された分子間で複合体を形成することが可能になる。
３つ以上の価数を有する抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０，１９９１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５８（６３５９）：８５－９０，２０１７）。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも早く内在化（及び／又は異化）され得る。本開示の抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）であり得、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸を組換え発現によって容易に生成することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はそれからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、このＦｃ領域に対する３つ以上の抗原結合部位のアミノ末端とを含むことになる。好ましい本明細書の多価抗体は、３つ～約８つ、ただし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（又はそれからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は、２つ以上の可変領域を含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃ（式中、ＶＤ１は第１の可変領域であり、ＶＤ２は第２の可変領域であり、ＦｃはＦｃ領域の一方のポリペプチド鎖、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である）を含み得る。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ－ＣＨ１－フレキシブルリンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（及び好ましくは４つ）の軽鎖可変領域のポリペプチドを更に含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２～約８つの軽鎖可変領域のポリペプチドを含み得る。本明細書で意図される軽鎖可変領域のポリペプチドは軽鎖可変領域を含み、任意選択的にＣＬドメインを更に含む。
Ｆａｂ分子内のアミノ酸置換により、軽鎖と一致しない重鎖との誤対合（ベンスジョーンズ型副生物）が減少する結果となり、これにより、それらの結合アームの１つ（３つ以上の抗原結合性Ｆａｂ分子を含む分子の場合、それを超える）のＶＨ／ＶＬが交換された、Ｆａｂをベースとした二重／多重特異性抗原結合分子の生成を生じさせることができる場合、電荷を変更することは、多重特異性抗体に関連して特に有用である（その全体が本明細書に参照として組み込まれるＰＣＴ出願公開の国際公開第２０１５／１５０４４７号パンフレット、特にその実施例も参照されたい）。
従って、特定の実施形態では、治療剤に含まれる抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨとＦａｂ重鎖とが互いに置き換えられている、第２のＦａｂ分子と
を含み、第１の抗原が活性化したＴ細胞抗原であり、第２の抗原が標的細胞の抗原であるか、又は第１の抗原が標的細胞の抗原であり、第２の抗原が活性化したＴ細胞抗原であり；
ｉ）ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換されるか；又は
ｉｉ）ｂ）の下の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、ｂ）の下の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
抗体は、ｉ）及びｉｉ）の下で言及された両方の改変を含まなくてもよい。第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換されていない（即ち交換されずに維持される）。
抗体の別の実施形態では、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立してリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）（１つの好ましい実施形態では、独立してリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
更なる実施形態では、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立してリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
特定の実施形態では、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立してリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）（１つの好ましい実施形態では、独立してリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））によって置換され、１２３位のアミノ酸が独立してリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）（１つの好ましい実施形態では、独立してリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換され、２１３位のアミノ酸が独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
より特定の実施形態では、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリシン（Ｋ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、１２３位のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
更により特定の実施形態では、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリシン（Ｋ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けられる）によって置換され、ａ）の下の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けられる）によって置換される。
Ｆ．キメラ抗原受容体
人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としても公知である）は、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する改変受容体である。典型的には、これらの受容体を使用してモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するが、それらのコード配列の移入はレトロウイルスベクターによって促進される。このように、養子細胞移入のための多数の標的特異的なＴ細胞を生成することができる。本手法の第Ｉ相臨床試験で有効性が示されている。
これらの分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３ゼータ膜貫通及び内部ドメインに融合された、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子により、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してゼータシグナルの伝達が生じる。そのような構築物の例は、１４ｇ２ａゼータであり、これは、ハイブリドーマ１４ｇ２ａ（ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）に由来するｓｃＦｖの融合体である。Ｔ細胞がこの分子を発現すると（通常、オンコレトロウイルスベクターの形質導入によって達成される）、ＧＤ２を発現する標的細胞（例えば、神経芽腫細胞）を認識し、死滅させる。悪性Ｂ細胞を標的化するために、研究者は、Ｂ系列分子であるＣＤ１９に特異的なキメラ免疫受容体を用いて、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトした。
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変部分をフレキシブルリンカーによって融合し、ｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖは、新生タンパク質を小胞体に誘導した後に表面発現させるために、シグナルペプチドの前に配置される（これが切断される）。フレキシブルスペーサーにより、ｓｃＦｖを抗原結合が可能となるように異なる方向に配向させることができる。典型的には、膜貫通ドメインは、通常、シグナル伝達内部ドメインの元の分子に由来する疎水性のαヘリックスであり、細胞内に突出して所望のシグナルを伝達する。
Ｉ型タンパク質は、実際は２つのタンパク質ドメインであり、その間が膜貫通αヘリックスによって連結されている。細胞膜の脂質二重層は、膜貫通ドメインがその中を通っており、内側部分（内部ドメイン）を外部部分（外部ドメイン）から分離する役割を果たす。一方のタンパク質の外部ドメインをもう一方のタンパク質の内部ドメインと結合することにより、前者の認識及び後者のシグナルを組み合わせた分子が生じることは、それほど驚くことではない。
外部ドメイン。シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体に誘導する。これは、受容体がグリコシル化され、細胞膜に固定される場合に必要不可欠である。通常、あらゆる真核生物のシグナルペプチド配列が良好に機能する。一般に、アミノ末端のほとんどの構成要素に自然に結合するグナルペプチドが使用される（例えば、軽鎖－リンカー－重鎖の配向のｓｃＦｖでは、軽鎖の天然のシグナルが使用される）。
抗原認識ドメインは、通常、ｓｃＦｖである。しかしながら、多くの代替形態が存在する。単純な外部ドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するＣＤ４外部ドメイン）と、結合サイトカイン（サイトカイン受容体を保持する細胞の認識を生じさせる）などのより外来性の認識成分とを有するような、天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ単鎖由来の抗原認識ドメインが記載されている。実際に、所与の標的に高い親和性で結合するほとんど全てのものを抗原認識領域として用いることができる。
スペーサー領域は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結する。スペーサー領域は、抗原結合ドメインが異なる方向に配向して抗原認識を容易にすることができるほど十分に柔軟でなければならない。最も単純な形態は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域である。代替形態としては、免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３領域及びＣＤ３の一部が挙げられる。ほとんどのｓｃＦｖをベースとした構築物では、ＩｇＧ１ヒンジで十分である。しかしながら、多くの場合、最良のスペーサーを実験的に決定すべきである。
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性αヘリックスである。一般に、内部ドメインの最も膜に近位の構成要素に由来する膜貫通ドメインが使用される。興味深いことに、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを用いると、人工ＴＣＲが、天然のＣＤ３ゼータ膜貫通荷電アスパラギン酸残基の存在に依存する因子である天然ＴＣＲに組み込まれる結果となり得る。膜貫通ドメインが異なると、受容体の安定性が異なる結果となる。ＣＤ２８膜貫通ドメインにより、明らかに発現した安定的な受容体がもたらされる。
内部ドメイン。このドメインは、受容体の「機能部分」である。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ゼータである。これにより、抗原が結合した後のＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。ＣＤ３ゼータは十分に適格な活性化シグナルをもたらさない場合があり、更なる共刺激シグナル伝達が必要となる。
「第一世代」のＣＡＲは、典型的に、内在性ＴＣＲからのシグナルの主要伝達物質であるＣＤ３ξ鎖由来の細胞内ドメインを有する。「第二世代」のＣＡＲには、更なるシグナルをＴ細胞に提供するために、ＣＡＲの細胞質側末端に、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインが付加されている。前臨床試験では、第二世代のＣＡＲの設計がＴ細胞の抗腫瘍活性を向上させることが示されている。より近年になると、「第三世代」のＣＡＲは、更に効力を増大させるために、ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０のように、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせている。
Ｇ．ＡＤＣ
抗体薬物複合体、即ちＡＤＣは、感染症疾患を有する人々を治療するための標的療法として設計された、新たな種類の極めて強力な生物製剤である。ＡＤＣは、不安定な結合を有する安定的な化学的リンカーを介して生物学的に活性な細胞傷害性／抗ウイルスペイロード又は薬物に連結された、抗体（全ｍＡｂ又は単鎖可変フラグメント、即ちｓｃＦｖなどの抗体フラグメント）で構成される複合分子である。抗体薬物複合体は、バイオ複合体及び免疫複合体の例である。
抗体薬物複合体は、モノクローナル抗体の独自の標的化能力を、細胞傷害性薬物の癌を殺傷する能力と組み合わせることにより、健康な組織と患部組織を感度よく識別することができる。これは、従来の体系的な手法とは対照的に、抗体薬物複合体が、健康な細胞にそれほど深刻な影響を及ぼさないように感染細胞を標的化して攻撃することを意味する。
ＡＤＣをベースとした抗腫瘍療法の開発では、特定の細胞マーカー（例えば、理想的には感染細胞のみに見られるか又は感染細胞上に存在するタンパク質）を特異的に標的化する抗体に抗癌薬（例えば、細胞毒、即ちサイトトキシン）を結合する。抗体は、これらのタンパク質を体内で追跡し、それら自身を癌細胞の表面に結合させる。抗体及び標的タンパク質（抗原）間の生化学的反応によって腫瘍細胞にシグナルを引き起こし、次いでサイトトキシンと共に抗体を吸収させるか又は内在化させる。ＡＤＣが内在化した後に細胞傷害性薬物が放出され、細胞を死滅させるか又はウイルスの複製を阻害する。この標的化のために、薬物は、理想的には他の薬剤より副作用が少なく、治療域がより広範なものとなる。
抗体及び細胞傷害性／抗ウイルス性薬剤間における安定的な連結は、ＡＤＣの非常に重要な側面である。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾン又はペプチド（切断可能）若しくはチオエーテル（開裂不能）を含む化学的モチーフをベースとしたものであり、標的細胞への細胞傷害性薬物の分布及び送達を制御する。切断可能及び開裂不能な種類のリンカーは、前臨床試験及び臨床試験で安全であることが証明されている。ブレンツキシマブベドチンは、強力且つ極めて有毒性の微小管阻害薬のモノメチルアウリスタチンＥ、即ちＭＭＡＥである合成抗悪性腫瘍剤をヒト特異的ＣＤ３０陽性悪性細胞に送達する、酵素感受性の切断可能リンカーを含む。その高い毒性ゆえ、チューブリンの重合を遮断することによって細胞分裂を阻害するＭＭＡＥは、単剤の化学療法剤として使用することができない。しかしながら、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体（ｃＡＣ１０、腫瘍壊死因子、即ちＴＮＦ受容体の細胞膜タンパク質）に連結されたＭＭＡＥの組み合わせは、細胞外液中で安定であり、カテプシンによって切断可能であり、且つ治療に安全であることが証明されている。トラスツズマブエムタンシンは、他の承認されたＡＤＣであるが、安定的な非切断可能リンカーによって結合された、微小管形成阻害剤であるメルタンシン（ＤＭ－１）、マイタンシンの誘導体及び抗体であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）の組み合わせである。
より良好で、且つより安定的なリンカーが利用できることで、化学結合の機能が変化する。切断可能又は開裂不能リンカーの種類は、細胞傷害性（抗癌）薬に特異的な特性を付与する。例えば、非切断可能リンカーは、薬物を細胞内に保持する。その結果、抗体、リンカー及び細胞傷害性薬物全体が標的となる癌細胞に侵入し、そこで抗体がアミノ酸のレベルに分解される。得られた複合体（アミノ酸、リンカー及び細胞傷害性薬物）が、ここで活性薬物となる。対照的に、切断可能リンカーは、宿主細胞内の酵素によって触媒され、そこで細胞傷害性薬物を放出する。
細胞傷害性／抗ウイルス性薬物と切断部位との間に追加の分子を加えた別の種類の切断可能リンカーが現在開発中である。このリンカー技術により、研究者が切断動態の変化を案じることなく、より柔軟にＡＤＣを生成することができる。研究者は、エドマン分解に基づくペプチド切断の新たな方法である、ペプチド内のアミノ酸の配列決定方法も開発中である。ＡＤＣの開発における将来的な方向としては、安定性及び治療指数を更に改善するための部位特異的コンジュゲーション（ＴＤＣ）並びにα放射免疫複合体及び抗体複合ナノ粒子の開発も挙げられる。
Ｈ．ＢｉＴＥ
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、抗癌薬として使用するために研究された人工の二重特異性モノクローナル抗体の種類である。ＢｉＴＥは、宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の感染細胞に対する細胞傷害活性を誘導する。ＢｉＴＥは、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧの登録商標である。
ＢｉＴＥは、約５５キロダルトンの単一のペプチド鎖における、異なる抗体の２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又は４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの一方がＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方が特定の分子を介して感染細胞に結合する。
他の二重特異性抗体のように且つ通常のモノクローナル抗体と異なり、ＢｉＴＥは、Ｔ細胞及び標的細胞間の連結を形成する。これにより、Ｔ細胞が、ＭＨＣ Ｉ分子又は共刺激分子の存在とは無関係に、パーフォリン及びグランザイムなどのタンパク質を生成することにより、感染細胞に対して細胞傷害／ウイルス活性を発揮する。これらのタンパク質は、感染細胞に侵入して細胞のアポトーシスを惹起する。この作用は、感染細胞に対するＴ細胞の攻撃の間に観察される生理学的プロセスを模倣するものである。
Ｉ．細胞内抗体
特定の実施形態では、抗体は、細胞の内部で作用するのに好適な組換え抗体であり、そのような抗体は、「細胞内抗体」として公知である。これらの抗体は、様々な機序により、例えば細胞内タンパク質のトラフィッキングを変化させ、酵素機能を妨害し、タンパク質－タンパク質又はタンパク質－ＤＮＡ相互作用を遮断することにより、標的の機能を妨害することができる。多くの点において、それらの構造は、上記で説明した単鎖及び単一ドメイン抗体の構造を模倣しているか又はそれらと類似している。実際に、単一転写物／単鎖は、標的細胞における細胞内発現を可能にし、同様にタンパク質が細胞膜を透過して移行することをより実現可能にする重要な機構である。しかしながら、更なる機構が必要とされる。
細胞内抗体治療の実行に影響を及ぼす２つの主な問題は、細胞／組織の標的化を含む送達及び安定性である。送達に関して、組織指向型送達、細胞型特異的プロモーターの使用、ウイルス系送達及び細胞透過性／膜転移ペプチドの使用などの様々な手法が使用されている。安定性に関して、手法は、一般にファージディスプレイを含み、配列の成熟若しくはコンセンサス配列の開発を含み得る方法などの総当たりでのスクリーニング又は配列（例えば、Ｆｃ領域、シャペロンタンパク質配列、ロイシンジッパー）を安定化する挿入及びジスルフィド置換／改変などの更に標的化された改変のいずれかである。
細胞内抗体が必要となる可能性のある更なる機構は、細胞内標的化のためのシグナルである。細胞内抗体（又は他のタンパク質）を細胞質、核、ミトコンドリア及びＥＲなどの細胞内領域に標的化することができるベクターが設計されており、市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
細胞に侵入するそれらの能力により、細胞内抗体は、他の種類の抗体が獲得することができない更なる用途を有する。本抗体の場合、生細胞内のＭＵＣ１細胞質ドメインと相互作用する能力により、シグナル伝達機能（他の分子に結合する）又はオリゴマー形成などのＭＵＣ１ ＣＤに関連する機能が阻害される可能性がある。特に、そのような抗体を使用して、ＭＵＣ１二量体形成を阻害することが意図される。
Ｊ．精製
特定の実施形態では、本開示の抗体は、精製され得る。「精製される」という用語は、本明細書で使用する場合、他の成分から単離可能な組成物を指すことを意図し、タンパク質は、その天然で得られる状態と比較して任意の程度に精製される。従って、精製されたタンパク質は、自然に発生し得る環境から遊離したタンパク質も指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この表記は、タンパク質又はペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上を構成するような組成物の主要成分を形成する組成物を指す。
タンパク質の精製技術は、当業者によく知られている。これらの技術は、あるレベルでは、細胞環境の粗分画をポリペプチド及び非ポリペプチド分画にすることに関する。他のタンパク質からポリペプチドを分離したら、部分的又は完全精製（又は均質化するまで精製）を達成するために、クロマトグラフ及び電気泳動技術を使用して目的のポリペプチドを更に精製し得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動法である。タンパク質精製のための他の方法としては、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体など、又は熱変性による沈殿後の遠心分離；ゲル濾過；逆相、ヒドロキシルアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィー；並びにそのような技術及び他の技術の組み合わせが挙げられる。
本開示の抗体を精製する際、原核生物又は真核生物発現系でポリペプチドを発現し、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付き部分に結合するアフィニティーカラムを使用して他の細胞成分から精製され得る。一般に、当技術分野において公知のように、種々の精製工程を実施する順番を変更し得るか、又は特定の工程を省略し得るが、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質又はペプチドを調製する好適な方法がもたらされると考えられる。
一般に、完全抗体は、抗体のＦｃ部分に結合する薬剤（即ちプロテインＡ）を使用して分画される。代わりに、抗原を使用して、適切な抗体を同時に精製及び選択し得る。そのような方法では、多くの場合、カラム、フィルタ又はビーズなどの支持体に結合された選択剤が使用される。抗体は、支持体に結合され、夾雑物が除去され（例えば、洗い流され）、条件（塩、熱など）の適用により抗体が放出される。
タンパク質又はペプチドの精製の程度を定量化するための各種方法は、本開示の見地から当業者に公知であろう。これらには、例えば、活性分画の比活性を測定すること又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。分画の純度を評価するための別の方法は、分画の比活性を計算して初期の抽出物の比活性と比較をし、これによって純度の程度を計算することである。活性の量を表すのに使用される実際の単位は、当然のことながら、精製後に選択される特定のアッセイ技法及び発現タンパク質又はペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
ポリペプチドの泳動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ条件が異なると、ときに著しく変化する可能性があることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。従って、異なる電気泳動条件下では、精製される又は部分的に精製される発現産物の分子量が明らかに変動する可能性があることが理解されるであろう。
ＩＩＩ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の能動／受動免疫及び治療／防止
Ａ．製剤及び投与
本開示は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス抗体及びそれを生成するための抗原を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、予防若しくは治療有効量の抗体若しくはそのフラグメント又はペプチド免疫原及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物及びより具体的にはヒトに使用するために、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、賦形剤又は溶媒を指す。そのような薬学的担体は、滅菌液、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の特定の担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も特に注射溶液のための液体担体として使用することができる。他の適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体が含まれ得る。好適な医薬品の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者に適切な投与形態を提供するように、適当量の担体と共に、予防又は治療有効量の抗体又はそのフラグメントを好ましくは精製された形態で含有する。製剤は、経口、静脈内、動脈内、頬内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入、直腸内、膣内、局所又は人工呼吸による送達であり得る投与方法に適している必要がある。
そのように開示される抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクのある対象においてインビボ生成される場合、活性ワクチンも想定される。そのようなワクチンは、非経口投与のために製剤化することができ、例えば皮内、静脈内、筋肉内、皮下又は更に腹腔内経路を介した注射のために製剤化することができる。皮内及び筋肉内経路の投与が意図される。代わりに、ワクチンは、局所経路により、例えば点鼻薬、ネブライザーによる吸入又は直腸内若しくは膣内送達により粘膜に直接投与することができる。薬学的に許容される塩としては、酸性塩、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来するものであり得る。
人工獲得受動免疫として公知の抗体の受動伝達は、一般に静脈内又は筋肉内注射の使用を含む。抗体の形態は、プールされた静注用ヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）又は筋注用ヒト免疫グロブリン（ＩＧ）用途として、免疫化したドナー又は疾患から回復したドナー由来の高力価のヒトＩＶＩＧ又はＩＧとして及びモノクローナル抗体（ＭＡｂ）としてのヒト又は動物の血漿又は血清であり得る。そのような免疫は、一般に短期間のみ継続し、過敏症反応及び特に非ヒト由来のγグロブリンによる血清病の潜在的リスクも存在する。しかしながら、受動免疫によって即効性の保護がもたらされる。抗体は、注射に好適な、即ち無菌で注射可能な担体中で製剤化される。
一般に、本開示の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を表示するアンプル又は小袋などの密閉容器内の乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、単位用量剤形で別々に又は共に混合されて提供される。組成物が点滴によって投与される場合、組成物を滅菌医薬品グレード水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分を投与前に混合することができるように、無菌注射用水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
本開示の組成物は、中性又は塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するようなアニオンと形成されるもの及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、第二鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するようなカチオンと形成されるものが挙げられる。
２．ＡＤＣＣ
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞によって抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はそのフラグメントが一般にＮ末端のタンパク質部分を介してＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。「増加した／減少した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する抗体」は、当業者に公知の任意の好適な方法によって測定した場合に増加した／減少したＡＤＣＣを有する抗体を意味する。
本明細書で使用する場合、「増加した／減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機序により、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の所与の濃度において、所与の時間内で溶解した標的細胞の数の増加／減少及び／又はＡＤＣＣの機序により、所与の時間内で所与の数の標的細胞の溶解を達成するのに必要となる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加／減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加／減少は、同一の標準的な生成、精製、形成及び保存方法（当業者に公知の）を用いるが、改変されていない同一の種類の宿主細胞によって産生された同一の抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。例えば、変更されたグリコシル化パターンを有するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼであるＧｎＴＩＩＩ又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現するように）、本明細書に記載される方法によって改変された宿主細胞で産生された抗体によって媒介されるＡＤＣＣの増加は、同じ種類の改変されていない宿主細胞で産生された同一の抗体で媒介されるＡＤＣＣと比較される。
３．ＣＤＣ
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、補体系の機能である。これは、抗体又は免疫系の細胞が関与することなく、病原体の膜を損傷させることによって殺傷する、免疫系のプロセスである。３つの主要なプロセスが存在する。３つの全てにおいて１つ以上の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を病原体に挿入し、これにより致死性の膠質浸透圧の膨張、即ちＣＤＣを引き起こす。これは、抗体又は抗体フラグメントが抗ウイルス性効果を有する機序の１つである。
ＩＶ．抗体コンジュゲート
本開示の抗体は、少なくとも１つの薬剤と連結して抗体コンジュゲートを形成し得る。診断剤又は治療剤としての抗体分子の有効性を向上させるために、少なくとも１つの所望の分子又は部分と連結又は共有結合又は複合体を形成することが一般的である。そのような分子又は部分は、限定されるものではないが、少なくとも１つのエフェクター分子又はリポーター分子であり得る。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合されているエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが挙げられる。これに対し、リポーター分子は、アッセイを用いて検出され得るあらゆる部分として定義される。抗体にコンジュゲートされているリポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射線標識、ハプテン、蛍光標識、リン光性分子、化学発光性分子、発色団、光親和性分子、着色粒子又はリガンド、例えばビオチンが挙げられる。
抗体コンジュゲートは、一般に診断剤として使用することが好ましい。抗体診断は、一般に、様々なイムノアッセイなどのインビトロ診断に使用するためのものと、一般に「抗体指向性造影法」として公知のインビボでの診断プロトコルに使用するためのものとの２つの分類の範囲内に含まれる。多くの適切な造影剤が、それらを抗体に結合するための方法として当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号明細書、同第４，９３８，９４８号明細書及び同第４，４７２，５０９号明細書を参照されたい）。用いられる造影部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲで検出可能な物質及びＸ線造影剤であり得る。
常磁性イオンの場合、一例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及び／又はエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンが言及され得、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影などの他との関連において有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
治療及び／又は診断用途のための放射性同位体の場合、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ及び／又はイットリウム９０が言及され得る。多くの場合、特定の実施形態で使用するのに１２５Ｉが好ましく、また低エネルギーであり広範囲の検出に好適であるため、テクネチウム９９ｍ及び／又はインジウム１１１も好まれることが多い。当技術分野においてよく知られた方法に従い、放射活性物質で標識した本開示のモノクローナル抗体を生成し得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウム及び／若しくはヨウ化カリウム並びに次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤又はラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤に接触させることによってヨウ素化することができる。本開示によるモノクローナル抗体は、配位子交換プロセス、例えばパーテクネートをスズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラムにキレートし、このカラムに抗体を加えることにより、テクネチウム９９ｍで標識され得る。代わりに、例えばパーテクネート、ＳｎＣｌ２などの還元剤、ナトリウム－カリウムフタレート溶液などの緩衝溶液及び抗体をインキュベートすることにより、直接標識技法を使用し得る。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するのに多くの場合に用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
コンジュゲートとしての使用が意図される蛍光標識の中では、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６－ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン及び／又はテキサスレッドが挙げられる。
本開示で意図される更なる種類の抗体は、主にインビトロで使用することが意図されるものであり、抗体は、二次結合リガンド及び／又は発色基質に接触すると着色された生成物を生成する酵素（酵素タグ）に連結される。好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）ハイドロジェンペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチン及びアビジン及びストレプトアビジン化合物である。そのような標識を使用することは、当業者によく知られており、例えば米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，２７７，４３７号明細書、同第４，２７５，１４９号明細書及び同第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。
分子が抗体に部位特異的に結合する更に別の公知の方法には、抗体のハプテンベースのアフィニティー標識との反応が含まれる。基本的に、ハプテンベースのアフィニティー標識が抗原結合部位内のアミノ酸と反応し、それによってこの部位が破壊されて特異抗原反応を遮断する。しかしながら、これは、抗体コンジュゲートによる抗原結合性が失われてしまうため、有利でない場合がある。
また、アジド基を含有する分子を使用して、低強度紫外線光によって生成される反応性のナイトレン中間体を介してタンパク質と共有結合を形成し得る（Ｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，１９８３）。詳細には、粗製細胞抽出物内のヌクレオチド結合タンパク質を同定するために、部位特異的光プローブとしてプリンヌクレオチドの２－及び８－アジド類似体が使用されている（Ｏｗｅｎｓ＆Ｈａｌｅｙ，１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。２－及び８－アジドヌクレオチドは、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするのにも使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｄｈｏｌａｋｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、抗体結合剤として使用され得る。
抗体をそのコンジュゲート部分に結合又はコンジュゲートするためのいくつかの方法が当技術分野において公知である。ある結合方法は、例えば、抗体に結合されたジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ－クロロ－ｐ－トルエンスルホンアミド；及び／又はテトラクロロ－３α－６α－ジフェニルグリコウリル－３などの有機キレート剤を用いる、金属キレート複合体の使用に関わるものである（米国特許第４，４７２，５０９号明細書及び同第４，９３８，９４８号明細書）。また、モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下において又はイソチオシアネートと反応させることによって調製される。米国特許第４，９３８，９４８号明細書では、乳房腫瘍の造影がモノクローナル抗体を用いて達成され、検出可能な造影部分が、メチル－ｐ－ヒドロキシベンズイミデート又はＮ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを用いて抗体と結合されている。
他の実施形態では、抗体結合部位を変化させることのない反応条件を用いて、スルフヒドリル基を免疫グロブリンのＦｃ領域に選択的に導入することによって免疫グロブリンを誘導体化することが意図される。この方法に従って生成される抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性及び感受性を示すことが開示されている（米国特許第５，１９６，０６６号明細書であり、参考として本明細書に組み込まれる）。エフェクター分子又はリポーター分子がＦｃ領域の炭水化物残基にコンジュゲートされた、エフェクター分子又はリポーター分子の部位特異的な結合も文献に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。この手法は、診断的及び治療的に有望な抗体を生成することが報告されており、現在臨床評価中である。
Ｖ．免疫検出方法
また更なる実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその関連する抗原を結合、精製、除去、定量化又は他に一般に検出するための免疫検出方法に関する。そのような方法は、従来の感覚で適用することができるが、別の用途は、ワクチン及び他のウイルスストックの品質管理及び監視におけるものであり、この場合、本開示による抗体を使用してウイルスの抗原の量又は完全性（即ち長期安定性）を評価することができる。代わりに、本方法を使用して、様々な抗体を適切な／所望の反応特性についてスクリーニングし得る。
他の免疫検出方法には、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在するかを判断するための特定のアッセイが含まれる。多種多様なアッセイ形式が意図されるが、具体的には、対象から得られた体液、例えば、唾液、血液、血漿、痰、精液又は尿中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いられるものが意図される。特に、精液がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための実行可能な試料として証明されている（Ｐｕｒｐｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍａｎｓｕｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｂａｒｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，２００９；ＣＤＣ，２０１６；Ｈａｌｆｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５）。アッセイは、非医療（家庭用）用途のために有利に形式化され得、家庭用妊娠検査に類似したラテラルフローアッセイ（下記を参照されたい）を含む。これらのアッセイは、対象の家族によって使用することができるように、適切な試薬及び指示書を含むキットの形態でパッケージ化され得る。
いくつかの免疫検出方法としては、数例を挙げると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ及びウエスタンブロットが挙げられる。特に、試料中の特異的寄生エピトープを標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出及び定量化するための競合アッセイも提供される。様々な有用な免疫検出方法の工程は、例えば、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ａｎｄ Ｂｅｎ－Ｚｅｅｖ（１９９９），Ｇｕｌｂｉｓ ａｎｄ Ｇａｌａｎｄ（１９９３），Ｄｅ Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）及びＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）などの科学文献に記載されている。一般に、免疫結合方法には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有することが疑われる試料を得ることと、場合により免疫複合体の形成が可能となるのに有効な条件下において、本開示に従って試料を第１の抗体に接触させることとが含まれる。
これらの方法には、試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連する抗原を精製するための方法が含まれる。抗体は、好ましくは、カラムマトリックスの形態などの固体支持体に連結され、この固定化抗体にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は抗原成分を含有することが疑われる試料が加えられる。不要な成分をカラムから洗い流し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を固定化抗体に免疫複合体化させ、次いでこれをカラムから微生物又は抗原を除去することによって回収する。
免疫結合方法には、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連する成分の量を検出及び定量化するための方法並びに結合プロセス中に形成されたあらゆる免疫複合体の検出及び定量化も含まれる。ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその抗原を含有することが疑われる試料を入手し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその構成成分に結合する抗体と試料を接触させた後、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出及び定量化する。抗原検出の点から、分析される生体試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有することが疑われるあらゆる試料、例えば組織切片若しくは検体、ホモジナイズした組織抽出物、血液若しくは血清を含む体液又は糞便若しくは尿などの分泌物であり得る。
効果的な条件下において、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成が可能となるのに十分な期間、選択された生体試料を抗体に接触させることは、一般に、単に抗体組成物を試料に添加し、その混合物を抗体が免疫複合体を形成する、即ち存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は抗原に結合するのに十分に長い期間でインキュベートすることである。その後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット又はウエスタンブロットなどの試料－抗体組成物は、一般に、あらゆる非特異的に結合した抗体種を除去するために洗浄され、これにより一次免疫複合体内に特異的に結合したこれらの抗体のみを検出することが可能となる。
一般に、免疫複合体の形成を検出することは、当技術分野において公知であり、多くの手法を適用することによって達成され得る。これらの方法は、一般に、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ及び酵素タグのいずれかのような標識又はマーカーを検出することに基づく。そのような標識の使用に関する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，２７７，４３７号明細書、同第４，２７５，１４９号明細書及び同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。当然のことながら、当技術分野において公知のように、第２の抗体及び／又はビオチン／アビジンリガンド結合配置などの二次結合リガンドを使用することにより、更なる利点を見出すことができる。
検出に用いられる抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結され得、単にこの標識を検出するだけでなく、これにより組成物中の一次免疫複合体の量を検出することが可能となる。代わりに、一次免疫複合体内に結合するようになった第１の抗体を、この抗体に結合親和性を有する第２の結合リガンドによって検出し得る。このような場合、第２の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。第２の結合リガンドは、それ自体が抗体である場合が多く、従って「第２の」抗体と称されることもある。効果的な条件下で、二次免疫複合体を形成することができるほど十分な時間、標識した二次結合リガンド又は抗体と一次免疫複合体を接触させる。次いで、一般に二次免疫複合体を洗浄し、あらゆる非特異的に結合する標識二次抗体又はリガンドを除去し、次いで二次免疫複合体に残った標識を検出する。
更なる方法としては、二段階の手法による一次免疫複合体の検出が挙げられる。抗体に結合親和性を有する抗体などの第２の結合リガンドは、上記に記載したように二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、再度、効果的な条件下で、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成することができるほど十分な時間、第２の抗体に結合親和性を有する第３の結合リガンド又は抗体と二次免疫複合体を接触させる。第３のリガンド又は抗体は、検出可能な標識に連結され、このようにして形成された三次免疫複合体を検出することが可能となる。この系では、所望される場合、シグナル増幅をもたらすことができる。
免疫検出の１つの方法では、異なる２つの抗体が使用される。第１のビオチン化抗体を使用して標的抗原を検出し、次いで第２の抗体を使用して複合体化したビオチンに結合したビオチンを検出する。この方法では、検査される試料は、第１の工程の抗体を含有する溶液中で最初にインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、一部の抗体が抗原に結合してビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで、ストレプトアビジン（若しくはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ及び／又は相補的なビオチン化ＤＮＡの溶液中で連続的にインキュベートすることによって抗体／抗原複合体を増幅し、各工程で追加のビオチン部位を抗体／抗原複合体に添加する。増幅工程を好適な増幅のレベルが達成されるまで繰り返すが、この時点で、ビオチンに対する第２の工程の抗体を含有する溶液中で試料がインキュベートされる。この第２の工程の抗体を、例えば、発色基質を用いる組織酵素化学によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用することができる酵素で標識する。好適な増幅により、肉眼で見えるコンジュゲートを生成することができる。
免疫検出の別の公知の方法は、免疫ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）手法を利用することである。ＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡとインキュベートするまではＣａｎｔｏｒ法と類似しているが、しかしながら、複数回のストレプトアビジン及びビオチン化ＤＮＡのインキュべーションを用いる代わりに、抗体を放出する低ｐＨ又は高塩濃度緩衝剤でＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を洗浄する。次いで、得られた洗浄溶液を使用して、適切に制御された好適なプライマーを用いてＰＣＲ反応を実行する。少なくとも理論上では、ＰＣＲの絶大な増幅能力及び特異性を利用して、単一の抗原分子を検出することができる。
Ａ．ＥＬＩＳＡ
イムノアッセイは、それらの最も単純で直接的な意味では、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、当技術分野において公知の様々な種類の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学検出も特に有用である。しかしながら、検出は、そのような技法に限定されるものではなく、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＦＡＣＳ解析なども使用され得ることが容易に理解されるであろう。
ある例示的なＥＬＩＳＡでは、ポリスチレン製マイクロタイタープレート内のウェルなどのタンパク質親和性を示す選択された表面に、本開示の抗体が固定化される。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有することが疑われる試験組成物をウェルに添加する。結合させて洗浄し、非特異的に結合する免疫複合体を除去した後、結合した抗原を検出することができる。検出は、検出可能な標識に連結された別の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を添加することによって達成され得る。この種類のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、第２の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を添加した後、第２の抗体に結合親和性を有する、検出可能な標識に連結された第３の抗体を添加することによっても達成され得る。
別の例示的なＥＬＩＳＡでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有することが疑われる試料をウェル表面に固定化し、次いで本開示の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に接触させる。結合させて洗浄し、非特異的に結合する免疫複合体を除去した後、結合した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する。最初の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体を直接検出し得る。やはりこの場合にも、免疫複合体は、第１の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に結合親和性を有する、検出可能な標識に連結された第２の抗体を用いて検出することができる。
使用される形式に関わらず、ＥＬＩＳＡは、コーティング、インキュベート及び結合、非特異的に結合された種を除去するための洗浄並びに結合した免疫複合体の検出など、共通する特定の特徴を有する。これらを下記に記載する。
プレートを抗原又は抗体のいずれかでコーティングする場合、一般に抗原又は抗体の溶液を含むプレートのウェルを、一晩又は指定された時間でインキュベートする。次いで、プレートのウェルを洗浄し、不完全に吸着した物質を除去する。ウェルの任意の残された利用可能な表面を、次いで試験抗血清に対して抗原的に中性の非特異的なタンパク質で「コーティング」する。これらには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は粉乳溶液が挙げられる。コーティングすることにより、固定化された表面上の非特異的な吸着部位を遮断することができ、それにより抗血清がこの表面に非特異的に結合することによって引き起こされるバックグラウンドが低減する。
ＥＬＩＳＡでは、直接的な手順よりも、二次又は三次検出手段を使用することがおそらくより習慣的であろう。従って、タンパク質又は抗体をウェルに結合させ、非反応性材料でコーティングしてバックグラウンドを低減させ、結合していない材料を除去するために洗浄した後、免疫複合体（抗原／抗体）の形成が可能となる効果的な条件下で試験するために、固定化表面を生体試料に接触させる。免疫複合体の検出は、標識した二次結合リガンド又は抗体及び標識した三次抗体又は第３の結合リガンドと連結した二次結合リガンド又は抗体が必要となる。
「免疫複合体（抗原／抗体）の形成が可能となる効果的な条件下」は、条件に、好ましくはＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で抗原及び／又は抗体を希釈することが含まれていることを意味する。これらの添加される薬剤も、非特異的なバックグラウンドの低減を補助する傾向を有する。
また、「好適な」条件は、インキュベーションが、効果的な結合が可能となるのに十分な温度又は期間であることを意味する。インキュベーション工程は、典型的には、好ましくは２５℃～２７℃のオーダーの温度で約１～２～４時間程度又は約４℃位で一晩であり得る。
ＥＬＩＳＡでの全てのインキュベーション工程後、非複合化材料を除去するように接触表面を洗浄する。好ましい洗浄処置としては、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ又はホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することが挙げられる。試験試料及び元々結合していた材料間で特異的な免疫複合体が形成され、その後、洗浄した後、たとえ微量でも免疫複合体が発生したことを測定することができる。
検出手段を提供するために、第２又は第３の抗体は、検出することが可能となる関連する標識を有する。この標識は、好適な発色基質とインキュベートしたときに発色を生じさせる酵素であることが好ましい。従って、例えば、ある期間、更なる免疫複合体の形成の発達に有利な条件下で、第１及び第２の免疫複合体をウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はハイドロジェンペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗体と接触又はインキュベートする（例えば、室温で２時間、ＰＢＳ－ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳ含有溶液中でインキュベートする）ことが望ましい。
標識抗体とインキュベートさせ、その後、洗浄して結合していない材料を除去した後、例えば酵素標識としてのペルオキシダーゼの場合、尿素、又はブロモクレゾールパープル、又は２，２’－アジノ－ジ－（３－エチル－ベンズチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）、又はＨ２Ｏ２などの発色基質とインキュベートすることによって標識の量を定量化する。次いで、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して発色の程度を計測することによって定量化を実行する。
別の実施形態では、本開示は、競合形式を使用することを意図する。これは、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するのに特に有用である。競合ベースのアッセイでは、未知量の分析物又は抗体は、既知量の標識抗体又は分析物を置き換える能力によって測定される。従って、シグナルの定量化可能な減少は、試料中の未知の抗体又は分析物の量を示している。
ここで、標識したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体を使用して、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の量を測定することが本発明者によって提案される。基本的な形式には、既知量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体（検出可能な標識に連結されている）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又は粒子に接触させることが含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又は微生物は、支持体に結合していることが好ましい。標識モノクローナル抗体を支持体に結合させた後、試料を添加し、試料中のあらゆる非標識抗体が競合し、ゆえに標識モノクローナル抗体を置き換えることが可能となる条件下でインキュベートする。失われた標識又は残されたラベルのいずれかを測定することにより（及び結合標識の元々の量から差し引くことにより）、どの程度の量の非標識抗体が支持体と結合しているか、従ってどの程度多くの抗体が試料中に存在するかを測定することができる。
Ｂ．ウエスタンブロット
ウエスタンブロット（代わりにタンパク質免疫ブロット）は、組織ホモジネート又は抽出物の所与の試料中の特定のタンパク質を検出するのに用いられる分析技術である。この技術は、ゲル電気泳動を使用して、ポリペプチドの長さ（変性状態）又は３Ｄ構造のタンパク質（天然／非変性状態）によって天然又は変性タンパク質を分離する。次いで、タンパク質を膜（典型的にはニトロセルロース又はＰＶＤＦ）に転写し、それらを標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブする（検出する）。
試料は、全組織又は細胞培養物から採取され得る。多くの場合、固体組織は、ブレンダーを使用して（比較的大きい試料体積の場合）、ホモジナイザーを使用して（比較的小さい体積の場合）又は超音波処理によって最初に機械的に分解される。細胞は、上記の機械的方法の１つによっても破裂させ得る。しかしながら、細菌、ウイルス又は環境試料がタンパク質源であり得、従って、ウエスタンブロットは、細胞研究のみに制限されるわけではないことに留意されたい。細胞の溶解を促進し、タンパク質を可溶化するために、界面活性剤、塩及び緩衝剤を組み合わせて使用し得る。多くの場合、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を添加して、試料のそれ自身の酵素による消化を阻止する。組織の調製は、多くの場合、タンパク質の変性を回避するために低温で行う。
ゲル電気泳動を使用して、試料のタンパク質を分離する。タンパク質の分離は、等電点（ｐＩ）、分子量、電荷又はこれらの要因の組み合わせによって行われ得る。分離の性質は、試料の処理及びゲルの性質に依存する。これは、タンパク質を判断するのに非常に有用な方法である。単一試料由来のタンパク質を２次元に展開させる２次元（２Ｄ）ゲルを使用することもできる。１次元ではタンパク質を等電点（中性の正味の電荷となるｐＨ）に従って分離し、２次元ではタンパク質の分子量に従って分離する。
タンパク質を抗体検出に利用できるようにするために、それらをゲル内部からニトロセルロース又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）でできた膜に移動させる。膜は、ゲルの上部に配置されており、その上部には積層した濾紙が配置されている。積層全体が、毛管現象によって紙の上部に移動する緩衝溶液内に配置されており、それと共にタンパク質が移動する。タンパク質を転写するための別の方法は、電気ブロッティングと呼ばれており、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ又はニトロセルロース膜に引き寄せるために電流を使用する。タンパク質は、ゲル内部に保持していた組織を維持しながら、ゲル内部から膜に移動する。このブロッティングプロセスの結果、検出のためにタンパク質が薄い表面層に露出する（下記を参照されたい）。いずれの種類の膜もそれらの非特異的なタンパク質結合特性（即ち全てのタンパク質に等しく十分に結合する）のために選択される。タンパク質結合は、疎水性相互作用並びに膜及びタンパク質間の荷電相互作用に基づく。ニトロセルロース膜は、ＰＶＤＦよりも安価であるが、はるかに壊れやすく、繰り返しのプロービングには十分に耐えられない。膜をクマシーブリリアントブルー又はポンソーＳ染料で染色することにより、ゲルから膜へのタンパク質の転写の均一性及び全体的な有効性を調べることができる。転写された時点で、標識一次抗体又は非標識一次抗体を使用してタンパク質を検出した後、一次抗体のＦｃ領域に結合する標識したプロテインＡ又は二次標識抗体を使用して間接的検出を行う。
Ｃ．ラテラルフローアッセイ
ラテラルフローアッセイは、ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイとしても公知であり、専用の装置及び割高な装置を必要とせずに、試料（マトリックス）中の標的分析物の存在（又は不在）を検出することを意図した簡単なデバイスであるが、読み取り装置によってサポートされる多くの実験室ベースの用途が存在する。典型的には、これらの検査は、家庭用検査、ポイントオブケア検査又は実験室用途のいずれかの低リソースの医学的診断として使用される。広範に普及し、よく知られた用途は、家庭用妊娠検査である。
この技術は、多孔性紙又は焼結ポリマーの小片などの一連のキャピラリーベッドに基づくものである。これらの要素の各々は、流体（例えば、尿）を自発的に運搬する能力を有する。第１の要素（試料パッド）はスポンジとして機能し、過剰な試料流体を保持する。浸漬した時点で、流体は、製造業者が、標的分子（例えば、抗原）と、粒子表面に固定化されたその化学的パートナー（例えば、抗体）との間の最適化された化学反応を保証するために全てを含有する塩－糖マトリックス中に、生理活性粒子（下記を参照されたい）の乾燥形態であるいわゆるコンジュゲートを貯蔵する、第２の要素（コンジュゲートパッド）に移動する。試料流体は、塩－糖マトリックスを溶解しながら粒子も溶解し、ある組み合わされた輸送作用では、多孔質構造体の中を流れながら試料及びコンジュゲート混合物を溶解する。このように、分析物は、第３のキャピラリーベッドを通って更に移動しながら粒子に結合する。この材料は、第３の分子が製造業者によって固定化された、１つ以上の領域（ストリップと呼ばれることが多い）を有する。試料－コンジュゲート混合物がこれらのストリップに到達するときまでに分析物が粒子に結合し、第３の「捕捉」分子が複合体に結合する。しばらくして、更に多くの流体がストリップを通過すると、粒子が蓄積されてストリップ領域が変色する。典型的には、少なくとも２つのストリップが存在する：１つ（対照）はあらゆる粒子を捕捉することによって反応条件及び技法が良好に機能したことを示すものであり、２つめは特定の捕捉分子を含有しており、分析物分子が固定化された粒子のみを捕捉するものである。これらの反応領域を通過した後、流体は、単に廃棄物容器としての役割を果たす、最後の多孔質材料であるウィックに入る。ラテラルフロー検査は、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイとして機能し得る。ラテラルフローアッセイは、米国特許第６，４８５，９８２号明細書に開示されている。
Ｄ．免疫組織化学的検査
本開示の抗体は、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）による研究のために調製される、新鮮凍結ブロック及び／又はホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックの両方に関連しても使用され得る。これらの粒子状検体から組織ブロックを調製する方法は、これまでの様々な予後因子のＩＨＣ研究に問題なく用いられており、当業者によく知られている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ａｌｌｒｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
要約すると、凍結切片は、５０ｎｇの冷凍「粉砕した」組織を小さいプラスチック製カプセル内のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温において再水和すること；遠心分離によって粒子をペレット化すること；それらを粘稠な包埋剤（ＯＣＴ）中に再懸濁すること；カプセルを反転及び／若しくは遠心分離によって再度ペレット化すること；－７０℃のイソペンタン中で急速冷凍すること；プラスチック製カプセルを切断するか及び／若しくは組織の冷凍シリンダーを取り出すこと；組織のシリンダーをクライオスタットミクロトームのチャック上に固定すること；並びに／又はカプセルから２５～５０個の連続切片に切断することによって調製され得る。代わりに、連続切片を切断するために、冷凍した全組織試を使用し得る。
永久切片は、プラスチック製マイクロチューブ中の５０ｍｇの試料を再水和すること；ペレット化；１０％ホルマリン中で４時間固定するために再懸濁すること；洗浄／ペレット化；温めた２．５％アガー中で再懸濁すること；ペレット化；アガーを固めるために氷水中で冷却すること；チューブから組織／アガーブロックを取り出すこと；ブロックをパラフィン中に浸潤及び／若しくは包埋すること；並びに／又は最大５０個の連続した永久切片を切断することを含む類似の方法によって調製され得る。ここでも同じように、全組織試料を代わりに用い得る。
Ｅ．免疫検出キット
また更なる実施形態では、本開示は、上記に記載された免疫検出方法と共に使用するための免疫検出キットに関する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を検出するために抗体が使用され得るため、抗体は、キットに含まれ得る。免疫検出キットは、従って、好適な容器手段内において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合する第１の抗体と、任意選択的に免疫検出試薬とを含む。
特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をカラムマトリックス及び／又はマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に予め結合させ得る。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に関連するか又は連結される検出可能な標識のようなものを含む種々の任意の１つの形態をとることができる。二次結合リガンドに関連するか又は結合する検出可能な標識も意図される。例示的な二次リガンドは、第１の抗体に結合親和性を有する二次抗体のリガンドである。
本キットに使用される更に好適な免疫検出試薬には、検出可能な標識に連結された、第２の抗体に結合親和性を有する第３の抗体と共に、第１の抗体に結合親和性を有する二次抗体を含む２成分の試薬が含まれる。上記で述べたように、多くの例示的な標識が当技術分野において公知であり、全てのそのような標識を本開示に関連して使用することができる。
キットは、検出アッセイのための標準曲線を作成するために使用することができるような、標識又は非標識に関わらない、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の適切に分取された組成物を更に含み得る。キットは、完全にコンジュゲートされた形態で、中間体の形態において又はキットの使用者によってコンジュゲートされる別々の部分としてのいずれかで抗体－標識コンジュゲートを含有し得る。キットの構成要素は、水媒体又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化され得る。
キットの容器手段としては、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器又は他の容器手段が挙げられ、その中に抗体を入れ得るか、又は好ましくは適切に分取され得る。本開示のキットは、典型的に、抗体、抗原及び商業的販売のために厳重に密閉した任意の他の試薬容器を含有するための手段も含む。そのような容器としては、射出成形又は吹込成形プラスチック容器を挙げられ得、その中に所望のバイアルが保持される。
Ｆ．ワクチン及び抗原品質管理アッセイ
本開示は、試料中のウイルス抗原の抗原完全性を評価するのに使用される、本明細書で記載されるような抗体及び抗体フラグメントの使用も意図する。ワクチンなどの生物学的医薬品は、通常、分子的に特性決定できない点で化学薬品と異なっている。抗体は極めて複雑な巨大分子であり、調製物ごとに広範に変動する能力を有している。それらは、生まれたばかりの子供を含む健康な個体に投与されるものでもあり、従って、それら自身で害を引き起こすことなく、生命を脅かす疾患を防止又は治療するのに有効であることを保証するために、可能な限り最大限にそれらの品質を強調する必要がある。
ワクチンの製造及び流通におけるグローバル化の高まりは、公衆の健康問題をよりよく管理するための新たな可能性を開いたが、様々な供給源にわたって調達されるワクチンの同等性及び互換性についての問題も提起されている。出発材料の、製造及び品質管理の検査の国際標準化並びにこれらの製品が製造及び使用される途上の規制監督に対する期待の高い状態は、従って、継続的な成功の礎となっている。しかし、分野は、常に変化し続けており、当分野の継続的な技術的進歩は、最も古い公衆衛生の脅威と同様に、新しい脅威、２～３例挙げるとマラリア、新型インフルエンザ及びＨＩＶに対しても強力な新しい対抗手段を開発することを約束するものであるが、製造業者、規制当局及びより広範な医学界に、製品が到達可能な最高水準の品質に合致し続けることを保証するように大きい圧力を加えている。
従って、あらゆる供給源から又は製造工程のあらゆる時点で抗原又はワクチンを得ることができる。従って、品質管理プロセスは、本明細書で開示される抗体又はフラグメントのウイルス抗原への結合を同定するイムノアッセイのための試料を調製することから開始する。そのようなイムノアッセイは、本明細書の他の箇所に記載されており、これらのいずれかを使用して抗原の構造的／抗原完全性を評価し得る。容認できる量の抗原的に正しく且つインタクトな抗原を含有する試料を発見するための基準は、監督官庁によって確立されている場合がある。
抗原完全性が評価される別の重要な実施形態は、保存期間及び保存安定性を決定することである。ワクチンを含むほとんどの医薬は、時間の経過と共に劣化する可能性がある。従って、ワクチン中におけるような抗原が劣化又は不安定化し、それにより対象に投与されたときにもはや抗原性がなく、且つ／又は免疫応答を生じさせることが不可能になるような程度かどうかを時間の経過と共に判断することは、重要である。ここでも同じように、容認できる量の、抗原的にインタクトな抗原を含有する試料を発見するための基準は、監督官庁によって確立されている場合がある。
特定の実施形態では、ウイルス抗原は、２つ以上の保護エピトープを含有し得る。これらの場合、２つ以上の抗体、例えば２、３、４、５つ又はそれを超える抗体の結合性を調べるアッセイを利用することが有用であることが判明され得る。これらの抗体は、隣接するか又は更に互いに重畳するように、密接に関連したエピトープに結合する。他方では、それらは、抗原の異なる部分に由来する別個のエピトープを意味し得る。複数のエピトープの完全性を調べることにより、抗原の全体的な完全性をより完全に描写し、従って防御免疫応答を生じさせる能力を測定することができる。
本開示に記載されるような抗体及びそのフラグメントは、防御的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出することによってワクチン接種処置の有効性を監視するためにもキット内で使用され得る。本開示に記載されるような抗体、抗体フラグメント又はその変異体及び誘導体は、所望される免疫原性を伴うワクチン製造を監視するためにもキット内で使用され得る。
以下の実施例は、好ましい実施形態を証明するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、実施形態を実践するにあたって良好に機能させるために本発明者によって発見された技法を表しており、従ってそれを実践するための好ましい方法を構成するものと見なし得ることは、当業者によって理解されるであろう。しかしながら、本開示の見地から、当業者は、開示された特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様の又は類似した結果を得ることができることが理解されるであろう。
実施例１ － 抗体の相乗効果
相乗効果とは、抗体の同じ総濃度（インビトロ）又は用量（インビボ）での個々のｍＡｂに媒介される中和活性と比較した場合、２つのｍＡｂのカクテルに媒介される中和活性が高くなるものとして本明細書で定義される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するのに２つのｍＡｂがカクテル中で相乗作用を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者は、すでに報告されている手法を用いて相乗効果を定量化した（Ｉａｎｅｖｓｋｉ Ａ，Ｈｅ Ｌ，Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ Ｔ，Ｔａｎｇ Ｊ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３３，２４１３－２４１５，２０１７）。ｍＡｂを併用することによる有益な効果の有意性を評価するために、観察された併用反応（用量反応マトリックス）を、相乗効果スコアリングモデルによって算出した予想される反応と比較した（Ｉａｎｅｖｓｋｉ Ａ，Ｈｅ Ｌ，Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ Ｔ，Ｔａｎｇ Ｊ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３３，２４１３－２４１５，２０１７）。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶｅｒｏ－Ｅ２細胞培養単層を用いた、従来のフォーカス減少法による中和試験（ＦＲＮＴ）アッセイでウイルス中和を測定した。個々のｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０を異なる濃度で混合し、カクテル中で異なるｍＡｂ比率の中和活性を評価した。具体的には、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０の７倍希釈液（５００ｎｇ／ｍＬから開始する）の各々を、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６の９倍希釈液（５００ｎｇ／ｍＬから開始する）の各々と各条件について総体積５０μＬで混合し、次いで細胞培養培地（２％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地）中で５０μＬの生きたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインキュベートし、その後、９６ウェルプレート内で増殖させたコンフルエントなＶｅｒｏ－Ｅ２細胞に加えた。対照値には、個々のｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０について別々に測定した中和活性の用量反応についての値が含まれており、これらをカクテル中のものと同じ用量で評価した（図１～３を参照されたい）。それぞれの測定を２回繰り返して行った。次に、発明者は、各条件のウイルス中和率を算出し、次いでカクテル中のこれらの２つのｍＡｂの間の相互作用を相乗的であると定義する、相乗効果スコア値を算出した（相乗効果スコア＝１７．４）。－１０未満の相乗効果スコアは拮抗作用を示し、－１０～１０のスコアは相加効果を示し、１０を超えるスコアは相乗効果を示すことに注意されたい。図１～３の例は、用量反応マトリックスを示しており、カクテル中の７９ｎｇ／ｍＬの用量の併用されたｍＡｂ（１６ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６及び６３ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０）が、２５０ｎｇ／ｍＬの各個々のｍＡｂと同一の活性を有していたことを証明するものである。この発見は、ウイルス中和における同一の効力を達成するのに、カクテル中で用量を３倍超だけ減少させ得ることを示している。
治療の治療効果を評価するため、本発明者らは、まず、ＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルを使用して、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６若しくはＣＯＶ２－２１３０又はそれらを１：１で併用したものを試験した。全ての治療で、ウイルス接種の２日後の肺組織のプラーク力価によって測定されるように、肺の感染性ウイルスが減少した。肺負荷を最大３×１０４倍著しく減少させるため、マウス当たり４００μｇ（約２０ｍｇ／ｋｇ）の用量で送達されるカクテル治療が最も効果が高く、本治療群の５匹のうちの４匹の動物にはすでに肺に感染性ウイルスが存在しなかった（図４Ａ）。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体であるヒトＡＣＥ２（ＡｄＶ－ｈＡＣＥ２）を発現するように組換えアデノウイルスで形質導入された肺を有するマウスを、標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジの１２時間後にマウス当たり４００μｇのｍＡｂカクテルによって治療することにより、肺の感染性ウイルスがインビボにおいて完全に中和されたことが明らかとなった（図４Ｂ）。炎症の指標であるＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ２サイトカイン並びにケモカインの遺伝子発現も、アイソタイプ対照治療マウスの肺と比較した場合、ｍＡｂカクテル治療マウスの肺で減少した（図４Ｃ）。これらの結果は共に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルマウスにおけるＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０のカクテルによって媒介される暴露後の治療の有効性を示唆するものであった。
実施例２ － 非ヒト霊長類チャレンジ試験
ＭＡｂの生成及び精製。合成され（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩｇＧ１モノシストロン性発現ベクター（ｐＴｗｉｓｔ－ｍＣｉｓ＿Ｇ１と表記する）にクローニングされたｍＡｂの配列を、哺乳類細胞培養によってｍＡｂを分泌させるために使用した。このベクターは、形質移入の際に単一の構築物からｍＡｂの重鎖及び軽鎖遺伝子を同時に発現することが可能となる、強化された２Ａ配列及びＧＳＧリンカーを含有する１。９６ウェルプレート内の１ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ培養物におけるｍＡｂのマイクロスケールの発現が、本発明者らによってこれまでに記載されている２。より大規模にｍＡｂを発現させるため、本発明者らは、販売業者によって記載される通り、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系と、５０ｍＬの小型バイオリアクターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のプロトコルとを使用して、ＣＨＯ細胞培養物の形質移入を行った（抗体当たり１～３００ｍＬ）。ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ、旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２４カラムの並列タンパク質クロマトグラフィーシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）で培養液上清を精製した。精製されたｍＡｂをＰＢＳに緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４ ５０ＫＤａ遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮し、使用するまで４℃で保存した。精製されたｍＡｂをエンドトキシンレベルについて規定どおりに検査すると、ＮＨＰ試験の場合、＜１ＥＵ／ｍｇのＩｇＧであったことが判明した。感度が１０～０．１ＥＵ／ｍＬの範囲のＰＴＳ２０１Ｆカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）及びＥｎｄｏｓａｆｅ Ｎｅｘｇｅｎ－ＭＣＳ機器（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して、エンドトキシン検査を実施した。
本発明者らは、最近記載されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非ヒト霊長類（ＮＨＰ）チャレンジモデルを使用して、ｍＡｂの防御効果を検査した３，４。このモデルでは、本発明者らは、ＣＯＶ２－２１９６と同一の可変遺伝子セグメントによってコードされているが、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３における多くの著しいアミノ酸差異を利用した中和ｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６を単剤療法として検査した。－３日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６又はアイソタイプ対照ｍＡｂの一方を静脈内に受けた動物を、次いで０日目に１．１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の用量で鼻腔内及び気管内にチャレンジした。チャレンジ後、本発明者らは、気管支肺胞洗浄液検査（ＢＡＬ）及び鼻腔スワブでのＲＴ－ｑＰＣＲによってウイルスＲＮＡを評価した。アイソタイプ対照ｍＡｂで治療したＮＨＰにおいて、高レベルのサブゲノムウイルスＲＮＡが観察され、鼻腔スワブにおける平均ピークは、７．５３（５．３７～８．２３の範囲）ｌｏｇ１０ＲＮＡコピー／スワブであり、ＢＡＬにおける平均ピークは、４．９７（３．８１～５．２４の範囲）ｌｏｇ１０ＲＮＡコピー／ｍＬであった。サブゲノムウイルスＲＮＡは、ｍＡｂ治療群由来の試料では検出されず（ＬＯＤ＝５０［１．７ｌｏｇ１０］ＲＮＡコピー／スワブ又はｍＬ当たりのＲＮＡコピー）、防御されていることを示している。薬物動態解析により、ＮＨＰにおける循環血液中のヒトｍＡｂが安定的な濃度であったことが明らかとなった。
ＮＨＰチャレンジ試験。ＮＨＰ研究試験は、実験動物の管理と使用に関する指針の第８版に明記される原理を遵守したものであった。本研究が実施された施設（Ｂｉｏｑｕａｌ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって完全に公認されており、実験動物福祉局に認可を受けている。ＮＨＰ試験は、全ての関連する地域、州及び連邦規制を遵守して実施されており、関連する動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されているものであった。
インド由来の８匹の健康な成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（体重５～１５ｋｇ）を試験した。動物を、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＡｂ治療群（１群当たりｎ＝４）と、一対照（アイソタイプ治療）群（１群当たりｎ＝４）とに無作為に割り当てた。－３日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６又はアイソタイプ対照ｍＡｂの一方を静脈内に受けた動物を、次いで１．１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で３日間チャレンジし、ｉ．ｎ経路によって１ｍＬを、且つ気管内経路によって１ｍＬとして投与した。チャレンジ後、記載されるように、複数の時点で気管支肺胞洗浄液検査及び鼻腔スワブでのＲＴ－ｑＰＣＲによってウイルスＲＮＡを評価した５，６。全ての動物に身体検査を受けさせた。加えて、動物実験委員会によって承認されている内部スコアリングプロトコルで全ての動物を毎日観察した。これらの試験は盲検化しなかった。
ＮＨＰ血清中の循環ヒトｍＡｂの検出。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（サル吸着済み）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で４℃において一晩コーティングし、次いで２時間ブロッキングした。血清試料をＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）希釈剤で、１：３の希釈度から開始して３倍希釈でアッセイした。試料を周囲温度で１時間インキュベートし、次いでこれを取り出して、プレートを洗浄した。次いで、ウェルを１：４，０００の希釈度でＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（サル吸着済み）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、次いでＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｓｅｒａｃａｒｅ）（１００μＬ／ウェル）と３分間インキュベートした後、ＴＭＢ停止液（Ｓｅｒａｃａｒｅ）（１００μＬ／ウェル）で反応を停止させた。マイクロプレートを４５０ｎｍで読み取った。バージョン８．０のＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、精製されたヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）標準曲線の線形範囲からヒトｍＡｂの濃度を補間した。
実施例３ － 実施例４の材料及び方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の組換え受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の発現及び精製。Ｓタンパク質のＲＢＤ（残基３１９～５２８）に対応するＤＮＡセグメントは、発現のために最適化され、合成された、ＩＬ－２シグナルペプチド（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ）（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の下流のｐＴｗｉｓｔ－ＣＭＶ発現ＤＮＡプラスミドにクローニングされた配列であった。タンパク質精製を容易にするために、３つのアミノ酸リンカー（ＧＳＧ）及びＨｉｓタグを発現構築物のＣ末端に組み込んだ。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、ＲＢＤをコードするプラスミドで一過性に形質移入し、５日後に培養液上清を採取した。ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えるニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、上清からＲＢＤを精製した。結晶化実験で使用されるタンパク質を生成するため、５μＭのキフネンシンを培地に含め、高マンノースグリカンのＲＢＤを生成した。続いて、この高マンノース糖タンパク質を、エンドグリコシダーゼＦ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理して、均質に脱グリコシル化されたＲＢＤを得た。
組換えＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０のＦａｂの発現及び精製。ヒトκ鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン及び軽鎖可変ドメインと共に、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の重鎖可変ドメインに対応するＤＮＡフラグメントを合成し、ｐＴｗｉｓｔベクター（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にクローニングした。このベクターは、各Ｆａｂの重鎖、その後にＧＧＧＧＳリンカー、フューリン切断部位、Ｔ２Ａリボソーム切断部位及び各Ｆａｂの軽鎖を含む。重鎖及び軽鎖の発現は、同一のＣＭＶプロモーターによって誘発される。発現プラスミドで一過性形質移入することにより、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０のＦａｂをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に発現させた。抗ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、培養液上清から組換えＦａｂを精製した。ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６複合体の場合、発現のためにＣＯＶ２－２１９６のｗｔ配列を使用した。ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６／ＣＯＶ２－２１３０複合体の場合、可変領域の最初の２つのアミノ酸がＱＭからＥＶに変異した、ＣＯＶ２－２１９６のＦａｂの改変バージョンを使用した。
抗体－抗原複合体の結晶化及び構造決定。精製されたＣＯＶ２－２１９６のＦａｂを、脱グリコシル化されたＲＢＤと１：１．５のモル比で混合し、この混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで更に精製して、抗体－抗原複合体を得た。ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６／ＣＯＶ２－２１３０の三者複合体を得るために、精製され、脱グリコシル化されたＲＢＤを、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０のＦａｂの両方と１：１．５：１．５のモル比で混合し、この三者複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムで精製した。複合体を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、結晶化実験を行った。ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６複合体を、１６％～１８％のＰＥＧ３３５０、０．２のトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～８．５）中で結晶化させ、ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６／ＣＯＶ２－２１３０複合体を、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１０００、１００ｍＭのリン酸二ナトリウム／クエン酸（ｐＨ４．２）、４０％（ｖ／ｖ）の試薬アルコール中で結晶化させた。両方の複合体の結晶のために、結晶化溶液を１００％のグリセロールと２０：７の体積比で混合することによって凍結保護溶液を作製した。タンパク質結晶を凍結保護溶液に迅速に浸漬させた後に液体窒素で急速冷凍した。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいて、ＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６複合体の場合にはビームライン２１－ＩＤ－Ｆで、且つＲＢＤ／ＣＯＶ２－２１９６／ＣＯＶ２－２１３０複合体の場合にはビームライン２１－ＩＤ－Ｇで回折データを収集した。回折データをＸＤＳ５８及びＣＣＰ４スイート５９で処理した。プログラムＰｈａｓｅｒ６０により、Ｆａｂ ＣＣ１２．１（ＰＤＢ ＩＤ ６ＸＣ２）及びＭＲ７８のＦａｂ構造（ＰＤＢ ＩＤ ５ＪＲＰ）と複合体化したＲＢＤの構造を用いた分子置換により結晶構造を解析した。それぞれＰｈｅｎｉｘ６１又はＣｏｏｔ６２によって構造を手動で精製及び再構築した。このモデルはプロテインデータバンクに寄託されている。全ての構造図を作製するために、ＰｙＭＯＬソフトウェア６３を使用した。
水素重水素質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）実験。Ｍ－Ｃｌａｓｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣシステム及びＨＤＸマネージャー（Ｗａｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｍｓｌｏｗ、ＵＫ）と連結された自動試料ハンドリングロボット（ＬＥＡＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して、ＨＤＸ－ＭＳ実験を実施した。７．６μＬの４．３μＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｐスパイク三量体を単独で又はＡＺＤ１０６１又はＡＺＤ８８９５の１：１．１２のモル比のいずれかで、５２．４μＬの標識緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＤ６．２）に添加し、２０℃で１分間インキュベートした。インキュベート後、５０μＬの本試料を、５０μＬのクエンチ溶液（５０ｍＭのリン酸カリウム、２００ｍＭのＴＣＥＰ、２ＭのＧｄｎ－ＨＣｌ、ｐＨ２．３）に１℃で添加した。５０μＬのクエンチされた試料を、２０℃において１００μＬ／分（約４，０００ｐｓｉ）で４分間、固定化されたＢＥＨペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｍｓｌｏｗ、ＵＫ）に通過させ、その後、ＶａｎｇｕａｒｄプレカラムＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８トラップカラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×５ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｍｓｌｏｗ、ＵＫ）を用いて、得られたペプチドをトラップした。バルブ切り替え後、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８分析カラム（１．７μｍ、１ｍｍ×１００ｍｍ）を使用して、４０μＬ／分で６分間かけてＨ２Ｏ（０．２％ｖ／ｖギ酸）中０～３５％ＭｅＣＮ（０．２％ｖ／ｖギ酸）の勾配溶離で１℃においてペプチドを単離した。１２０Ｋの分解能のオービトラップ検出モード（重水素化された試料）又はオービトラップ－イオントラップＤＤＡモード（ｔ＝０試料）のいずれかで動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ペプチドを分析した。ペプチドを同定するために使用されるペプチドＭＳ／ＭＳデータを、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ ｖ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析し、重水素の取り込みをＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖ２．０（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して定量化した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒからのペプチドプールの結果及び取り込みをまとめた表のｃｓｖエクスポートを、取り込みプロット図及びＰＡＶＥＤ（リーズ大学）を使用して構造ヒートマップを生成するために、ｉｎ－ｈｏｕｓｅ Ｒ：ｓｃｒｉｐｔを使用して再フォーマットした６４。
ＣＯＶ２－２１９６変異体のＥＬＩＳＡ結合。３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、精製された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ６Ｐタンパク質で４℃において一晩コーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する、ＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ－Ｔ）中２％の脱脂粉乳及び２％の標準ヤギ血清によってプレートを１時間ブロッキングした。抗体を１０μｇ／ｍＬまで希釈し、ＤＰＢＳ－Ｔ中で２倍の２３回滴定してウェルに添加した後、室温で１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して結合抗体を検出した。反応を１Ｎの塩酸でクエンチし、吸光度を、分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎｍで測定した。
抗体結合を回避する全ての変異体のマッピング。抗体結合を回避する全ての変異体を、ＤＭＳ手法４１によってマッピングした。本発明者らは、前述した酵母菌ディスプレイによるＲＢＤ変異体ライブラリー４１，４２を使用した。要約すると、複製した変異ライブラリーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（単離されたＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７、残基Ｎ３３１－Ｔ５３１）由来のスパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）で構築され、３，８１９個の可能なアミノ酸変異のうちの３，８０４個を含有し、＞９５％が単一の変異体として存在している。下流の配列決定を容易にするために、各ＲＢＤ変異体を独自の１６ヌクレオチドバーコード配列に連結した。上述したように、ＲＢＤの発現及びＡＣＥ２への結合でライブラリーを選別して、完全にミスフォールドしたか又は非機能的な（即ち適度なＡＣＥ２結合親和性を欠如した４１）ＲＢＤ変異体を排除した。
軽微な変更を加えて、上述したように、２つの独立した変異ＲＢＤライブラリーを使用して生物学的複製で抗体回避マッピング実験を実施した４１。要約すると、ＲＢＤを発現するように誘発された変異酵母菌ライブラリーを洗浄し、穏やかに撹拌しながら室温で１時間、４００ｎｇ／ｍＬの抗体とインキュベートした。抗体をインキュベートした後、ライブラリーをＲＢＤ発現のために標識するために１：１００のＦＩＴＣ結合抗ＭＹＣ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂ、ＣＹＭＣ－４５Ｆ）で、結合抗体のために標識するために１：２００のＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １０９－１１５－０９８）で二次標識した。フローサイトメトリーソーティングを使用して、ライブラリー試料の１％の抗体濃度で標識した未変異のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞の捕捉を対象とする選択ゲートを介して、抗体結合が低減したＲＢＤ変異体を発現する細胞を濃縮した。各試料について、血球計算器で約１，０００万個のＲＢＤ＋細胞を処理した。抗体を回避した細胞をＳＤ－ＣＡＡ（６．７ｇ／Ｌの酵母ニトロゲンベース、５．０ｇ／Ｌのカザミノ酸、１．０６５ｇ／ＬのＭＥＳ酸及び２％ｗ／ｖのデキストロース）中で一晩増殖させ、プラスミド抽出の前に細胞を増殖させた。
プラスミド試料を、上述したように、抗体を回避した細胞の予選択及び一晩培養物から調製した（Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ）４１。記載されているように、各ＲＢＤ変異体を同定する１６ヌクレオチドバーコード配列をＰＣＲで増幅させ、５０ｂｐのシングルエンドリードによってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００で配列決定した４１、４２。
記載されているように、下記で述べるように軽微な変更を加えて回避割合を算出した４１。本発明者らは、ｄｍｓ＿ｖａｒｉａｎｔｓパッケージ（ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｄｍｓ＿ｖａｒｉａｎｔｓ／、バージョン０．８．２）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列を、前述の６５バーコード／ＲＢＤルックアップテーブルを使用して、それぞれの予め選別された集団及び抗体回避集団内のそれぞれのバーコードＲＢＤ変異体をカウントするように処理した。
それぞれの抗体選択に関して、本発明者らは、元の集団及び抗体回避集団の各変異体のディープシークエンシングカウントを使用して、各バーコード変異体の「回避割合」を算出し、前述の式４１によって抗体結合を回避したライブラリーの全ての割合を算出した。これらの回避割合は、０の値が、変異体が常に血清に結合していることを意味し、１の値が常に抗体結合を回避することを意味するような、抗体回避ビンに該当する特定の変異体を発現する細胞の推定された割合を表す。次いで、本発明者らは、計算上のフィルタを適用し、シークエンシングカウントが低いか、又は酵母細胞表面上で適切に折り畳まれたＲＢＤの発現が不十分であることによって単に抗体回避が引き起こされる可能性のある極めて有害な変異を有する変異体を除去した４１、４２。具体的には、上述したように４２、変異レベル及び突然変異レベルの網羅的突然変異スキャニングスコアを使用して、ＡＣＥ２結合スコアが＜－２．３５又は発現スコアが＜－１を有する（又はそのような変異を含有する）変異体を除去した。これらのフィルタ基準は、ヒト抗体のパネルをマッピングするのにこれまでに使用されていた基準よりもわずかに厳しいものであるが４１、ｍＡｂ６５及びポリクローナル血清５４の結合に影響を及ぼすＲＢＤ残基を明確にする最近の研究に使用される基準と同一であることに留意されたい。
次に、本発明者らは、（ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｄｍｓ＿ｖａｒｉａｎｔｓ／ｄｍｓ＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｇｌｏｂａｌｅｐｉｓｔａｓｉｓ．ｈｔｍｌ）で詳述され、記載されているように４１、ｄｍｓ＿ｖａｒｉａｎｔｓパッケージに実装された網羅的エピタシスモデル６６を使用して、変異レベルの回避スコアを単一変異の回避割合推定値にデコンボリューションした。報告された文書全体にわたる回避割合は、ライブラリー全体の平均値であり（相関関係を図１８Ａ～Ｂに示す）、これらのスコアは表Ｂにもある。ロゴプロットで強調するため、各抗体由来の強力に回避した部位は、変異性回避スコアの合計が選択の平均の部位的な合計値の少なくとも１０倍であり、且つ最も強力に選択された部位の部位的な合計値の１０倍の範囲内である部位としてヒューリスティックに決定された。コンピュータ分析の完全な説明書は、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓに存在する。これらの結果は、ｈｔｔｐｓ：／／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓ／の双方向フォームでも利用可能である。
ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による抗体回避選択実験。ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０による回避選択実験に関して、本発明者らは、Ｃ末端の２１個のアミノ酸を欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質をコードする複製可能な組換えＶＳＶウイルスを使用した４３。前述のように、スパイクを発現するＶＳＶウイルスをＭＡ１０４細胞（アフリカミドリザル、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３７８．１）で増殖させ４３、ウイルスストックをＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層培養液に滴定した。ニュートラルレッド染色を使用してプラークを視覚化した。ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０との１：１の混合物で構成されるカクテルの存在下で選択された回避変異体をスクリーニングするために、本発明者らは、リアルタイム細胞分析アッセイ（ＲＴＣＡ）及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ分析器（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）並びに前述の回避選択スキーム４１を使用した。要約すると、５０μＬの細胞培養培地（２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）を９６ウェルＥプレートの各ウェルに添加し、バックグラウンドの読み取り値を得た。５０μＬの細胞培養培地に、１万８千（１８，０００）個のＶｅｒｏ Ｅ６細胞をウェル毎に播種し、このプレートを分析器上に置いた。１５分毎に自動的に測定値を取り、バージョン２．１．０のＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してセンサーグラムを視覚化した。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（１ウェル当たり５ｅ３プラーク形成単位（ＰＦＵ）、約０．３ＭＯＩ）を、飽和中和濃度のＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０抗体との１：１の混合物（５μｇ／ｍｌの総濃度の抗体）と、１００μＬの総体積で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞に播種して１６～２０時間後、このウイルス－抗体混合物を細胞単層に添加した。抗体の不在下でウイルスのみを含有するウェルと、培地中にＶｅｒｏ Ｅ６細胞のみを含有するウェルとを、各プレートに対照として含有させた。プレートを連続して（１５分毎に）７２時間測定した。細胞生存能の下落について細胞指数を監視することによって回避変異体を同定した。抗体選択からの回避を検証するために、ＣＯＶ２－２１３０の存在下で細胞変性効果が観察されたウェルを、後続のＲＴＣＡ実験において１０μｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６の存在下で評価した。選択されたウイルスのＣＯＶ２－２１３０による中和に対する耐性を確認した後、ウイルス分離体を１０μｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０の存在下のＶｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖させた。製造業者のプロトコルに従って、ＱｉＡｍｐウイルスＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してウイルスＲＮＡを単離し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子を逆転写し、Ｓ遺伝子に隣接するプライマーを用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、ＳＰＲＩ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を１：１の比率で使用して精製し、ＲＢＤの順方向及び逆方向リードを付与するプライマーを使用して、サンガー法によって配列決定した。
ｍＡｂ耐性変異を選択するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の連続継代及び検査。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株であるＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０を、各継代でそれぞれＩＣ５０値から開始して段階的にＩＣ９０値に増加させた濃度で、Ｖｅｒｏ細胞単層培養液中でＡＺＤ８８９５、ＡＺＤ１０６１又はＡＺＤ７４４２と共に連続継代した。対照として、抗体の不在下でウイルスを継代した。最終継代後、ＩＣ９０の濃度の１０倍の終濃度における相反性の抗体に対するウイルスの感受性を、プラークアッセイによって評価した。ＡＺＤ１０６１培養液のためにプラーク（ｎ＝６）を無作為に選択し、それらのウイルススパイクコード遺伝子を配列決定した。
変異残基を有するウイルスを含む標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの単離又は生成。英国ケントの感染した個体の鼻咽頭スワブから、ＵＫ Ｂ．１．１．７－ＯＸＦ分離菌を入手した。書面によるインフォームドコンセント後に検体を入手するための臨床試験は、英国オックスフォードのジョン・ラドクリフ病院によって承認されている。試料を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに希釈し、０．４５μｍのフィルタに通し、その後、Ｖｅｒｏ－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Ａ．Ｃｒｅａｎｇａ及びＢ．Ｇｒａｈａｍの寄贈）の単層に添加した。２日後に上清を採取し、継代ゼロ（ｐ０）ストックを構築した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２０１９ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０１９分離菌を米国疾病管理センター（ＣＤＣ）から入手し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で継代した。スパイク遺伝子（Ｄ６１４Ｇ及びＥ４８４Ｋ／Ｄ６１４Ｇ）の個々の点変異を、前述のように、２０１９ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０１９株の感染性ｃＤＮＡクローンに導入した６７。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型感染性クローンのスパイク遺伝子を含有するサブクローンのｐｕｃ５７－ＣｏＶ－２－Ｆ６に、ヌクレオチド置換を導入した６８。変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの完全長の感染性ｃＤＮＡクローンを、前述のプロトコルに従って７つの隣接するｃＤＮＡフラグメントをインビトロで連結することによって組み立てた６８。次いで、インビトロ転写を実施して、完全長のゲノムＲＮＡを合成した。変異ウイルスを回収するため、ＲＮＡ転写物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞に電気穿孔した。４０時間後に細胞の上清からウイルスを収集し、ｐ０ストックとして使用した。全てのウイルスストックを配列決定によって確認した。
フォーカス減少法による中和試験。ｍＡｂ又は血清の連続希釈液を、１０２フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の異なる株又は変異体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３７℃で１時間インキュベートした。抗体－ウイルス複合体を９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞単層培養液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、細胞を２％のＦＢＳを補充したＭＥＭ中１％（ｗ／ｖ）のメチルセルロースで重層した。２０時間後に重層を取り除くことによってプレートを回収し、ＰＢＳ中４％のＰＦＡで室温において２０分間固定した。プレートを洗浄し、その後０．１％のサポニン及び０．１％のウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳ中で、抗Ｓ ｍＡｂ及びＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧのオリゴクローナルのプールとインキュベートした。ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞巣を視覚化し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ微量分析器（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量化した。
多重配列アライメント。本発明者らは、ＣＯＶ２－２１９６をコードする配列と同じ特徴を起源とする抗体可変遺伝子配列を探索し、検査された各個体のレパートリーから一致する配列を検索した。３人の健常者の公的に利用可能な大規模な抗体配列レパートリー及び臍帯血レパートリー（ＳＲＰ１７４３０５で寄託されている）の中で類似した配列を探索した。重鎖の探索パラメーターは、Ｐ９９、Ｄ１０８及びＦ１１０残基を含むＩＧＨＶ１－５８及びＩＧＨＪ３を含んだ配列であった。加えて、軽鎖の検索パラメーターは、Ｙ９２及びＷ９８残基を含む配列であった。各個体に属する一致したクローン型に由来する配列を、ＣｌｕｓｔａｌＯ（重鎖）又はＭＵＳＣＬＥ（軽鎖）のいずれかとアライメントした。次いで、ＷｅｂＬｏｇｏを使用して、アライメントされた配列のＬＯＧＯプロットを生成した。
データ及び材料の入手可能性：本文献で報告される結晶構造は、アクセッション番号７Ｌ７Ｄ、７Ｌ７Ｅのもとでプロテインデータバンクに寄託されている。アライメントしたヒト抗体遺伝子レパートリーデータセットの配列リードアーカイブの寄託は、ＮＣＢＩ：ＰＲＪＮＡ５１１４８１で寄託されている。他の全てのデータは、本文又は補足資料中で利用できる。
ソフトウェアの入手可能性。抗体回避変異の網羅的突然変異スキャニング分析のための計算パイプラインは、ＧｉｔＨｕｂ；ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓ上で利用可能である。ＦＡＳＴＱファイルは、ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＰＲＪＮＡ６３９９５６の一部としてのＢｉｏＳａｍｐｌｅ ＳＡＭＮ１７５３２００１のもと、ＮＣＢＩ配列リードアーカイブ上で利用可能である。変異当たりの回避割合は、ＧｉｔＨｕｂ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿ＡＺ＿Ａｂｓ／ｂｌｏｂ／ｍａｉｎ／ｒｅｓｕｌｔｓ／ｓｕｐｐ＿ｄａｔａ／ＡＺ＿ｃｏｃｋｔａｉｌ＿ｒａｗ＿ｄａｔａ．ｃｓｖ）上及び表Ｂで利用可能である。
実施例４ － 結果及び考察
ＣＯＶ２－２１９６をベースとした抗体は、非競合ＲＢＤ特異抗体であるＣＯＶ２－２１３０をベースとした抗体と併用して予防又は治療ついて調査されている。ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０によってＲＢＤを認識する分子の詳細並びに動物モデルにおける２つの非競合ｍＡｂの予防的な保護に示される、相乗効果の根底にある考えられる構造的メカニズムを理解するために１、本発明者らは、Ｓタンパク質のＲＢＤの結晶構造をＣＯＶ２－２１９６との複合体では２．５０Åで同定し（図８Ａ～Ｅ、表Ｂ）、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の両方との複合体では３．００Åで同定した（図９Ａ～Ｆ、表Ｂ）。ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６－２１３０複合体内のＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６の下部構造は、ＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６複合体の構造に重ね合わせることが可能である（図１２）。ＣＯＶ２－２１９６及びＲＢＤ間の界面の埋没した表面領域は、いずれの結晶構造でも約６５０Åであり２、ＣＯＶ２－２１３０及びＲＢＤ間の界面の埋没した表面領域は約７４０Åである２。ＣＯＶ２－２１９６は、ＲＢＤの受容体結合隆起部分に結合し、ＣＯＶ２－２１３０は、残基Ｋ４４４周辺のＲＢＤの端の一方の側及びＡＣＥ２結合部位と重なり合う受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）の鞍状領域に結合する（図８Ａ～Ｂ、図９Ａ～Ｂ）。これらの特徴は、これまでの研究から、抗体とＡＣＥ２との間でＲＢＤ結合について競合することを説明するものであり、例えば、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の両方がＲＢＤのヒト受容体ＡＣＥ２への接近を遮断することによってウイルスを中和する１。ＣＯＶ２－２１９６の重鎖及び軽鎖由来の芳香族残基が、ＲＢＤの残基Ｆ４８６及び隣接する残基（Ｇ４８５、Ｎ４８７）を取り囲む疎水性ポケットを形成する（図８Ａ、８Ｄ及び８Ｅ；図１３Ａ～Ｃ）。この様式でのＡｂ－Ａｇ相互作用は、抗体ポケットの形成がＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３の広い空間的な隔たりに起因する点で稀なものである。加えて、ＣＯＶ２－２１９６によって認識される抗原部位は、それ自体のＳ三量体のプロトマー間の界面に埋没されることはないが、ＣＯＶ２－２１９６は、隣接したＳプロトマーにおけるＲＢＤとの立体的衝突に起因する「下向きの」立体構造でＲＢＤに結合することができない。従って、ＣＯＶ２－２１９６は「上向きの」立体構造でのみＲＢＤに結合する（図８Ｃ）。ＣＯＶ２－２１３０との複合体化したＲＢＤの下部構造（図９Ｃ）と、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の両方と複合体したＲＢＤの構造（図９Ｄ）との重ね合わせは、ＣＯＶ２－２１３０がＳ三量体の「上向き」及び「下向き」の立体構造の両方でＲＢＤに結合できることを示している。これらの構造的な発見は、ネガティブ染色電子顕微鏡を使用した、これまでのより低分解能の複合体の結果と一致するものである１。
ＲＢＤと複合体化したＣＯＶ２－２１９６を構造的に分析することにより、ＣＯＶ２－２１９６がどのようにＲＢＤ上の受容体結合隆起部分を認識しているかが明らかとなる。主な接触残基の１つであるＦ４８６は、結合部位の中央に位置し、疎水性効果及びファン・デル・ワールス相互作用により、ＣＯＶ２－２１９６の重鎖／軽鎖間の疎水性ポケット（重鎖の残基Ｐ９９及び５つの芳香族側鎖によって形成される「芳香族ケージ」）と広範に相互作用する（図８Ｄ～Ｅ、図１３Ａ～Ｂ）。４個の直接的なＡｂ－ＡｇのＨ結合及び１６個の水媒介性Ｈ結合によって構成される水素結合（Ｈ結合）ネットワークは、残基Ｆ４８６を取り囲み、Ａｂ－Ａｇ相互作用を強化する（図１３Ｃ）。重要なことに、エピトープと広範に相互作用する１つ（重鎖の残基Ｐ９９）を除いた全ての残基では、それらは、生殖系列配列によってコードされる（重鎖の場合にはＩＧＨＶ１－５８＊０１及びＩＧＨＪ３＊０２、軽鎖の場合にはＩＧＫＶ３－２０＊０１及びＩＧＫＪ１＊０１）（図１０Ａ）か、又はそれらの骨格原子のみが重鎖のＮ１０７及びＧ９９並びに軽鎖のＳ９４などのＡｂ－Ａｇ相互作用に関与する。本発明者らは、ＣＯＶ２－２１９６の遺伝子と類似しているが、ただしＩＧＨＤ遺伝子が異なる可能性が最も高い（ＩＧＨＤ２－１５に対してＩＧＨＤ２－２）、同一のＩＧＨＶ／ＩＧＨＪ及びＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ組換えによってコードされる、文献内の別の抗体であるＳ２Ｅ１２に着目した３８。Ｓタンパク質（ＰＤＢ ７Ｋ４Ｎ）と複合体化したＳ２Ｅ１２のクライオＥＭ構造を比較すると、ｍＡｂ Ｓ２Ｅ１２が、ＣＯＶ２－２１９６とほぼ同一のＡｂ－Ａｇ相互作用を用いる可能性が高いことを示唆しているが、界面残基の側鎖の立体構造が変化していることが確認できる（図１３Ｄ）。例えば、軽鎖の残基Ｙ９２の場合、結晶構造におけるフェニル環は、ぴったりと合うようにＥＭ構造内の環に対して直角となっている。
本発明者らは、遺伝子データベースを検索して、これらの構造的特徴が他者によって分離された追加のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＡｂに存在するかどうかを判断し、更なるメンバーのクローン型を見出した（図１０Ａ）。他の２つの研究では、複数のＣＯＶＩＤ－１９の回復期患者から分離された抗体の同一又は類似したクローン型について報告しており４、３８、一方の試験では、Ｄ遺伝子を使用したか又はＪ遺伝子を使用したかについての情報が提供されずに、同一のＩＧＨＶ１－５８及びＩＧＫＶ３－２０の対合を有する３つの抗体が見出された３９。これらの抗体の全ては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＲＢＤに貪欲に結合し、高い効力でウイルスを中和することが報告されている１、４、３８、３９。これまでに、これらの利用可能なＶＨ（ＤＨ）ＪＨ及びＶＫ－ＪＫ組換えによってコードされる抗体の２つの原子分解構造、即ち本明細書で提示されるＣＯＶ２－２１９６の構造とＳ２Ｅ１２の構造のみが存在している３８。本発明者らは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の独自のパネルから、このクローン型の２つの追加の抗体のホモロジーモデリングを行い、ＣＯＶ２－２０７２及びＣＯＶ２－２３８１と命名した。予期される通り、これらの抗体が共通する遺伝子クローン型のメンバーであると仮定すると、ＣＯＶ２－２０７２／ＲＢＤ及びＣＯＶ２－２３８１／ＲＢＤ複合体のモデル化された構造を、Ａｂ－Ａｇ界面におけるＣＯＶ２－２１９６／ＲＢＤ及びＳ２Ｅ１２／ＲＢＤの構造に実質上重ね合わせることが可能となる（図１４Ａ～Ｅ）。加えて、ＣＯＶ２－２０７２は、ＨＣＤＲ３にＮ－結合型グリコシル化シークオンをコードしており（図１４Ｄ）、ＣＤＲのグリコシル化が抗原認識に悪影響を与える可能性があることを考えると、抗体にとって稀な特徴である。しかしながら、ＣＯＶ２－２１９６構造は、このクローン型においてジスルフィド結合で固定されたＨＣＤＲ３が結合部位と逆の角度にあることを示しており、ＣＯＶ２－２０７２におけるこの稀なＨＣＤＲ３のグリコシル化が、結合性を損なうことなく許容されることが可能である様子を説明している（図１４Ｅ）。
次に、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２無感作の個体由来の循環Ｂ細胞の抗体可変遺伝子レパートリーで、このパブリッククローン型の潜在的な前駆体を同定することができるかどうかを判断した。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の病歴のない３人の健康なヒトドナーに由来する前述の網羅的なレパートリーのデータセット及びＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックの前に採取された臍帯血由来のデータセットでＶ（Ｄ）Ｊ及びＶＪ遺伝子を探索した４０。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性パブリッククローン型に対して、全部で３８６、１９３、４７又は７つの重鎖配列が各ドナー又は臍帯血レパートリーのそれぞれで見出された（図１５Ａ）。加えて、本発明者らは、同一の軽鎖のＶ－Ｊ組換えを有する５１６，７３８個のヒト抗体配列を見出した（ＩＧＫＶ３－２０－ＩＧＫＪ１＊０１）。このパブリッククローン型に対して、全部で１０３，５３４、１９１，０３９又は２２２，１６５個の軽鎖配列が各ドナーでそれぞれ見出された。配列数が多いため、各ドナーから上位５つの豊富な配列をアライメントした。ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを使用して各ドナーの配列に対して多重配列アライメントを生成し、ロゴプロットを生成した。各ドナーで同一の組換え事象を有する上位５つの配列は同一であり、結果として同一のロゴプロットとなった（図１５Ａ～Ｂ）。
本発明者らは、抗体における結合に重要な９つのうちの８つの共通の残基が生殖系列遺伝子配列によってコードされ、全てが４つの異なる抗体発見チームにより本明細書に列挙された全ての１４個のメンバーのパブリッククローン型を示していたことに着目した（図１０Ａ）。これらの特徴の重要性を検証するため、パラトープに点変異を有する変異抗体を発現させ、保存残基における変異の影響を測定した（図１０Ｂ）。Ｄ１０８残基のＡ、Ｎ又はＥへの変更は影響が小さかったが、そのループを固定するＨＣＤＲ３のジスルフィド結合を除去すると、結合が低減した。Ｐ９９Ｇ変異体が低減した結合を示すため、抗原との相互作用部位から離れてＨＣＤＲ３ループの方向を向いたＰ９９残基も重要であり、Ｐ９９を含むＣＯＶ２－２１９６の生殖系列の復帰変異体形態は抗原に結合したが、生殖系列の復帰変異体のバックグラウンドにおけるＰ９９Ｇは結合しなかった（図１０Ｂ）。
ＣＯＶ２－２１９６可変領域をベースとした抗体は、ＣＯＶ２－２１３０可変領域をベースとした抗体と併用して臨床試験で検査されている。２２個のアミノ酸残基のＣＯＶ２－２１３０のＨＣＤＲ３は、ヒト抗体にとって比較的長いものであり、推定される生殖系列であるＩＧＨＤ３遺伝子から高度に変異されている。ＨＣＤＲ３は、小さいループから構成される長く構造化されたループを形成し、ＨＣＤＲ３内の近距離での水素結合及び疎水性相互作用／芳香族スタッキングによって安定化し、軽鎖の残基とのその相互作用（水素結合及び芳香族スタッキング）によって更に強化される（図１６Ａ～Ｂ）。ＣＯＶ２－２１３０の重鎖及び軽鎖は、生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３－１５及びＩＧＫＶ４－１によってそれぞれコードされ、この２つの遺伝子は、最も長い生殖系列にコードされたＨＣＤＲ２（１０ａａ）及びＬＣＤＲ１（１２ａａ）ループをコードしており、これらは、ＣＯＶ２－２１３０で用いられている。重鎖Ｖ（Ｄ）Ｊの組換え、ＨＣＤＲ３の変異並びに重鎖及び軽鎖の対合により、Ｓ４４３～Ｙ４４９ループを中心とするＲＢＤ領域の形状と一致する重鎖及び軽鎖間の結合間隙がもたらされる（図９Ａ、図１６Ｃ）。これらの構造的特徴に密接に関係しているため、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ２のみがパラトープの形成に関与する（図９Ｅ～Ｆ、図１３Ｅ～Ｆ）。Ａｂ－Ａｇ界面を検査することにより、相互作用の大部分のエネルギーを誘発する可能性のある領域が明らかとなる。ＲＢＤの残基Ｋ４４４の側鎖は、ＨＣＤＲ３ループのサブループＹ１０４～Ｖ１０９に囲まれており、側鎖のＮＺ分子の正電荷は、ＨＣＤＲ３の残基Ｄ１０７の側鎖、Ｙ１０５、Ｄ１０７及びＶ１０９に由来する３つの主鎖のカルボニル酸素原子並びにＹ１０４フェニル環の電子が豊富な面（カチオン－π相互作用）によって中和される（図１３Ｅ）。相互作用している原子が溶媒から完全に保護されるため、そのような制限された空間内で相互作用が極めて集中していることは、エネルギー的に有利である。更に、Ａｂ－Ａｇ界面のこの「ホットスポット」は、ＲＢＤの残基Ｒ３４６とＨＣＤＲ２のＤ５６との間の塩橋、ＲＢＤのＲ３４６とＨＣＤＲ３のＹ１０６の主鎖の酸素との間の静電相互作用、ＲＢＤのＮ４５０とＨＣＤＲ３のＹ１０５の主鎖の酸素との間の水素結合、ＲＢＤのＶ４４５の主鎖の酸素とＨＣＤＲ３のＹ１０４の側鎖との間の水素結合、Ｖ４４５の側鎖とＨＣＤＲ３のＬ１１３及びＦ１１８の側鎖との間の疎水性相互作用を含む、低い自由エネルギー利得を有するＡｂ－Ａｇ相互作用によって溶媒に囲まれるか又は溶媒から保護される（図１３Ｅ）。また、ＨＣＤＲ３の残基Ｙ１０５とＬＣＤＲ２の残基Ｗ５６との間の芳香族スタッキングは、溶媒から「ホットスポット」を遮蔽することに関与する（図１３Ｅ）。加えて、ＣＯＶ２－２１３０の軽鎖ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、ＲＢＤと広範囲に接触する。なかでも、ＬＣＤＲ１のＳ３２の側鎖、Ｓ３３の主鎖の酸素、Ｎ３４の側鎖及びＬＣＤＲ２のＹ５５の側鎖は、ＲＢＤのＥ４８４の側鎖、Ｓ４９４の主鎖の窒素、Ｙ４４９の主鎖の酸素及びＧ４４６の主鎖の窒素と水素結合を形成する（図１３Ｆ）。残基ＬＣＤＲ１のＫ３６、Ｙ３８及びＬＣＤＲ２のＷ５６は、芳香族スタッキング及びカチオン－π相互作用によってＲＢＤのＹ４４９と相互作用し、「相互作用クラスター」を形成するが（図１３Ｆ）、これらの相互作用は、ＲＢＤのＫ４４４の場合ほどエネルギー的に強いものでない可能性が高い。
ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の両方と複合体化したＲＢＤの結晶構造において、本発明者らは、密集したＣＯＶ２－２１９６のＦａｂとＣＯＶ２－２１３０のＦａｂとの間の相互作用に着目した（図１７）。ＲＢＤに結合した状態の２つのＦａｂの間の相互作用は、これまでに観察されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の相乗的な中和に寄与し得る可能性がある１。しかしながら、どの程度多くの相乗効果がこのＦａｂ－Ｆａｂ相互作用に寄与し得るかは、明確ではない。
ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の結合に重要なＲＢＤ部位をよりよく理解するために、本発明者らは、網羅的突然変異スキャニング（ＤＭＳ）手法を使用して、抗体結合を回避するＲＢＤに対して全ての変異をマッピングした４１；（図１８）。両抗体に対して、ＲＢＤ変異によって結合が強く阻害された、全て抗体の構造的なフットプリント内にあるいくつかの主要な部位を特定した（図１１Ａ～Ｄ）。本発明者らは、ＡＣＥ２の結合に及ぼすＲＢＤの変異の影響を定量化したこれまでの研究を活用し４２、ＲＢＤへの抗体結合を抑制する変異がＡＣＥ２の結合に及ぼす影響に重ね合わせた（図１１Ａ～Ｂ）。ＣＯＶ２－２１９６の場合、Ｆ４８６及びＮ４８７に対する多くの変異は、１に近似する回避割合を有しており（即ちそれらのＲＢＤ変異体が検査条件下で抗体結合を完全に回避した）、抗体結合に対するこれらの２つの残基の寄与の重要性がより確実なものとなった。同様に、ＣＯＶ２－２１３０の場合、部位Ｋ４４４から他の１９アミノ酸のいずれかに変異することで抗体結合が抑制され、この位置におけるリシンがＡｂ－Ａｇ相互作用に重要なものであることを示していた。
それでもなお、全ての抗体の接触残基が、変異によって結合が大幅に低減する部位として特定されたわけではない。いくつかの解釈が可能である：１）一部の結合部位残基は、結合にそれほど重要でない可能性があるか、２）一部の残基が、それらの骨格原子を用いて、結合界面と離れて向いている側鎖と相互作用する可能性があるか、又は３）一部の部位に対する変異が認容されない可能性がある４２。例えば、残基Ｌ４５５、Ｆ４５６及びＱ４９３は、ＣＯＶ２－２１９６のために構造的に定義された結合部位の一部であるが（図８Ｄ）、これらの部位に対する変異は、検出可能となるほど抗体結合に影響を及ぼすことはなく（図１１Ａ及び１１Ｃ）、これらの残基は、決定的に結合に寄与するものでないことを示唆している。ＣＯＶ２－２１９６／ＲＢＤ構造をＳ２Ｅ１２／ＲＢＤ構造に重ね合わせることにより、ＲＢＤの隆起部分と、抗体が結合するときに維持されるＲＢＤの残部との間のフレキシブルなヒンジ領域が明確に示される（図１３Ｄ）。この発見は、これらの３つの位置における変異がＡｂ－Ａｇ結合に十分認容され得ることを示し、ＣＯＶ２－２１９６又はＳ２Ｅ１２に結合することがこれらの特定の残基の必須の性質でないことを裏付けるものである。
重要なことに、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０は、ＲＢＤへの結合について競合することはなく１、それらが予防用途又は治療用途のための回避耐性カクテルを含み得ることを示唆している。実際に、これらの２つの抗体の構造的な結合部位及び回避変異体のマップは、重複していない。両抗体の結合を回避することができる単一変異が存在するかどうかを検査するために、本発明者らは、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０抗体の１：１の混合物によって回避変異体マッピング実験を行ったが、単一の抗体の各々で最大の影響を有する変異は約１であった一方、０．２を超える回避割合を有していた任意の変異は検出されなかった（図１８Ｄ）。
これらの実験では、ＲＢＤへの抗体結合を回避する全ての変異がマッピングされるが、本発明者らは、ウイルス増殖中にどのような変異が生じる可能性があるかも特定しようと努めた。この問題に対処するため、まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を発現する組換えＶＳＶを使用して、回避変異体を選択することを試みた４３：（図１１Ｅ）。本発明者らは、ウイルス増殖中に選択されるアミノ酸変異のみが、１）一塩基のＲＮＡ変化を生じさせるもの、２）ＡＣＥ２の結合及び発現に及ぼす最低限の有害効果を引き起こすもの、及び３）抗体結合に実質的に影響を及ぼすものであることを予測した４１、４２。実際に、ＡＣＥ２の結合に及ぼす影響に関して、一塩基で到達可能であり、且つ比較的良好な忍溶性の両方を備えた任意のＣＯＶ２－２１９６誘発突然変異が本発明者らによって検出されず（図１１Ｂ）、これにより、抗体の存在下で組換えＶＳＶを増殖させた８８個の独立した複写物のいずれかにおいて回避変異体が選択されなかった理由を説明することができる（図１１Ｅ、図１８Ｇ）。ＣＯＶ２－２１３０の場合、比較的変異に寛容な部位である、部位Ｋ４４４に対する変異によって４２、ＶＳＶキメラウイルスによるハイスループットな抗体回避選択で最も頻繁に抗体結合を回避することが実証された。抗体選択実験の４０％で、ウイルス増殖中に、抗体結合に最大の影響を及ぼす一塩基変異の２つ、Ｋ４４４Ｒ（２０個の複写物のうちの６個で選択された）及びＫ４４４Ｅ（２０個の複写物のうちの２個で選択された）が出現した（図１１Ｅ、図１８Ｇ）。
標準的な感染性ウイルスとの耐性を調査するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株であるＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０を、各継代でそれぞれのＩＣ５０値から始めて段階的にＩＣ９０値に増加させた濃度で、ＣＯＶ２－２１９６（ＡＺＤ８８９５）、ＣＯＶ２－２１３０（ＡＺＤ１０６１）又はそれらの１：１の組み合わせ（ＡＺＤ７４４２）をベースとした臨床抗体と共にＶｅｒｏ細胞単層培養液中で連続継代した（図１９）。対照として、抗体の不在下でウイルスを継代した。最終継代後、ＩＣ９０の濃度の１０倍の終濃度における相反性の抗体に対するウイルスの感受性を、プラークアッセイによって評価した。ＡＺＤ８８９５（ＣＯＶ２－２１９６をベースとした）又はＡＺＤ７４４２のカクテルによる中和に耐性のある任意のプラークは、本発明者らによって検出されることはなかった。ＡＺＤ１０６１中で連続継代されたウイルスは、１０倍のＩＣ９０値の濃度のＡＺＤ１０６１の存在下で１．２×１０７ｐｆｕ／ｍＬの力価となるまでプラークを形成したが、ＡＺＤ７４４２ではプラークが形成されなかった。プラーク（ｎ＝６）を無作為に選択して、それらのウイルススパイクをコードする遺伝子を配列決定すると、独立して選択されて配列決定されたプラークの６つ全てで同一の３つのアミノ酸の変化：Ｎ７４Ｋ、Ｒ３４６Ｉ及びＳ６８６Ｇが明らかとなった（図１１Ｆ）。Ｓ６８６Ｇの変化は、フェレット４５又はＮＨＰ４６でのチャレンジ試験から単離されたＶｅｒｏ細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の連続継代に関連することがこれまでに報告されており４４、フューリンの活性を低下させることが予測されている４４。Ｎ７４Ｋ残基は、ＡＺＤ１０６１の結合部位の外側のＮ末端ドメインに位置し、グリカンの減少をもたらす４７。Ｒ３４６Ｉ残基は、ＡＺＤ１０６１の結合部位に位置し、ＡＺＤ１０６１耐性と関連する可能性がある。ＡＺＤ１０６１（ＣＯＶ２－２１３０）のＳタンパク質への結合に及ぼすＲ３４６Ｉの変化の影響を図１１Ｇに示す。ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系で選択されるＫ４４４Ｒ及びＫ４４４Ｅの置換並びに標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と継代することによって選択されるＲ３４６Ｉ置換は、一塩基置換により到達可能であり、且つＡＣＥ２結合活性を保存するものであり（図１１Ｇ）、本発明者らのＤＭＳ分析が、ＣＯＶ２－２１３０抗体の存在下で選択される変異を予測したことを示している。まとめると、これらの結果により、全てのアミノ酸置換のＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０の結合に及ぼす影響が網羅的にマッピングされ、ウイルス進化に懸念される可能性のある部位が特定される。とは言うものの、残基Ｋ４４４及びＲ３４６に変異を含む変異体は、ＧＩＳＡＩＤデータベースに存在する全ての配列決定されたウイルスの中でも希少なものである（１２／２３／２０にアクセスした時点で全て≦０．０１％）。
近年、感染力の増大したウイルス変異体及び潜在的な抗原性突然変異が臨床分離株で報告されている４８～５１。本発明者らは、これらの急激に明らかになりつつある株における変異残基の一部がこれらの強力な中和抗体の活性を抑制するかどうかを検査した。ＮＴＤの６９～７０及び１４４～１４５の欠失並びにＮ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ及びＰ６８１Ｈに置換を含むスパイク遺伝子変異を規定するＢ．１．１．７系列を含有する、英国のオックスフォードで入手した鼻試料由来のウイルス分離体（ＵＫ Ｂ．１．１．７－ＯＸＦと命名されたＢ．１．１．７ウイルス）を検査した４９。本発明者らは、ＷＡ－１株のバックグラウンド（２０１９ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０１９、［ＷＡ－１］）における同質遺伝子的なＤ６１４Ｇ及びＥ４８４Ｋ変異体も検査し、全てを標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスとして調製し、フォーカス減少法による中和試験に使用した４３。Ｅ４８４Ｋ変異は、この残基がＦａｂのフットプリントの極めて周辺に存在するにも関わらず、ＦａｂとＲＢＤとの複合体において各々のｍＡｂの４．５Åの範囲内に位置しており、明らかになりつつある系統Ｂ．１．３５１（５０１Ｙ．Ｖ２）５０及びＰ．１（５０１Ｙ．Ｖ３）５１に存在し、一部のモノクローナル抗体５２、５３及びヒトポリクローナル血清抗体５４の結合性を変化させることが示されているため、特に注目すべき変異である。Ｅ４８４Ｋを含有する変異体も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生存者由来の回復期の血清及び血漿により、中和効果が低いことが示されている５５、５６。ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及びＣＯＶ２－２０５０（残基Ｅ４８４と相互作用するために、本発明者らが比較のために含めた第３の中和抗体）では、Ｄ６１４Ｇ変異又はＵＫ Ｂ．１．１．７－ＯＸＦ株に存在する一連の変異の影響は実質的にないことが判明した；強いて言えば、後者の循環ウイルスに対しては若干の改善傾向（ＩＣ５０値における２～３倍の低下）が本発明者らによって観察された（図１１Ｈ）。しかしながら、Ｄ６１４Ｇ／Ｅ４８４Ｋウイルスによって中和に及ぼす影響が観察された。ＣＯＶ２－２０５０は完全に中和活性を失っており、ＣＯＶ２－２０５０結合を抑制する変異としてＥ４８４Ｋを定義するこれまでの研究と一致するものである４１。対照的に、ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及びＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０は、わずかに低い阻害能力（ＩＣ５０値における２～５倍の増加）を示すのみであった。
考察。これらの構造解析により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤの同一の領域を標的化する重鎖Ｖ－Ｄ－Ｊ及び軽鎖Ｖ－Ｊ組換えを共有するヒト抗体のパブリッククローン型を頻繁に選択するための分子的機序が規定される。重鎖及び軽鎖内の生殖系列抗体遺伝子にコードされた残基は、抗原認識に極めて重要な役割を果たしており、このクローン型の抗体変異に少数の体細胞変異が必要となることを示唆している。ＩＧＨＤ２遺伝子にコードされたジスルフィド結合は、ＲＢＤ上の抗原部位に対する形状及び化学的な相補性を有する立体構造をとるために、ＨＣＤＲ３に更なる制約を提供する。異なる３つのＩＧＨＤ２遺伝子（ＩＧＨＤ２－２、ＩＧＨＤ２－８及びＩＧＨＤ２－１５）は、このクローン型に関連して機能することができるＨＣＤＲ３の一部をコードするものと思われる。高い特異性及び強力な中和活性を可能にする事前構成された構造的特徴を有する、共通の生殖系列遺伝子によってコードされる抗体がこのように発生することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する初代ヒト免疫応答の予想外且つ有益な特徴であることが本発明者らによって示唆される。このパブリッククローン型からＢ細胞を選択することにより、回避に抵抗する超強力な中和抗体を速やかに単離することが可能となり、場合により臨床で観察されているＳタンパク質ベースのワクチンの優れた効果を部分的に説明することができる。ヒト免疫応答を刺激してこのクローン型を誘発するために、この抗原部位に対するドメイン又はモチーフベースのワクチン設計を利用して、更に高い中和効力を有する血清中和抗体価を誘発する可能性を想定することができる。
本明細書に提示されるＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１９６及びＲＢＤ－ＣＯＶ２－２１３０複合体の構造解析は、界面の表面積の単位当たりの高いエネルギー密度による「リベットのような」相互作用を形成することにより、２つの抗体がＲＢＤ抗原に結合することを示唆するものであり、この発見は、どのようにしてそのような強力な抗体がＡｂ－Ａｇ界面においてそのように比較的小さい（＜７５０Å２）埋没した表面領域を有することができるかを説明するものである。本発明で研究された２つの抗体の回避変異体のマッピングは、回避変異体の遺伝子座がＡｂ－Ａｇの結晶構造によって特定された結合部位と一致することを示しており、ＤＭＳ手法の精度を更に確証させるものであった。例えば、ＣＯＶ２－２１３０又はＣＯＶ２－２１９６のそれぞれに最も高い回避割合を有するＫ４４４又はＦ４８６残基が、抗原－抗体複合体の構造において抗体と最も強力な相互作用を示すため、抗原に対する抗体又はより一般的にはタンパク質に対するタンパク質の計算上のドッキングの制限として、回避割合データを将来に使用できることが本発明者らによって示唆される。
近年の、感染力が増大し、多くの公知の中和部位に変異配列を有する変異ウイルス系統の出現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が開発及び検査中の現行の抗体対策を免れる能力に関係している。本発明者らは、抗体及び両方のカクテルの活性を検査し、Ｅ４８４Ｋ変異を含むウイルス及び複数のＳ遺伝子変異を有するＢ．１．１．７ウイルスを含む、いくつかの重要な変異体に対して持続的な活性があることを見出した。この広範な活性に関する遺伝子的及び構造的基盤は、本発明者らが本明細書で提示する結晶構造及びＤＭＳ研究によって明らかになる。ＣＯＶ２－２１９６の「芳香族ケージ」ドメインによる比較的不変のＦ４８６残基の中央の認識部分は、この残基の変異がウイルス適応性の低下に関連するものであるため有益である。この結合部位の標的化は、「開いた」及び「閉じた」Ｓ三量体の両方を認識するｍＡｂのＣＯＶ２－２１３０と併用した相乗的な中和状況で特に効果的であると思われる。従って、この組み合わせは、回避に抵抗する広範で強力な阻害メカニズムを提供するものと思われる。
Figure 2023518849000002
実施例１及び２の参考文献
１．ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｆｏｒ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３６３，２１３９－２１４１（２００４）．
２．Ｚｈｏｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂａｔ ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５７９，２７０－２７３（２０２０）．
３．Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２０１３．０９２６１９（２０２０）．
４．Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｅｆｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２０１２．０８８７１６（２０２０）．
５．Ｎｉｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１８，１２４９－１２６０（２０１８）．
６．Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ａｖｏｉｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｓｃａｐｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２，ｅ０２００２－１７（２０１８）．
実施例３及び４の参考文献
１ Ｚｏｓｔ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｎａｔｕｒｅ ５８４，４４３－４４９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２５４８－６（２０２０）．
２ Ｙｕａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，１１１９－１１２３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｄ２３２１（２０２０）．
３ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２８，５１６－５２５ ｅ５１５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０９．００２（２０２０）．
４ Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５８４，４３７－４４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２４５６－９（２０２０）．
５ Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｅｆｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，６４３－６５０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｃ５９０２（２０２０）．
６ Ｚｈｏｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂａｔ ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５７９，２７０－２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２０１２－７（２０２０）．
７ Ｚｈｕ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，２０１９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８２，７２７－７３３，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２００１０１７（２０２０）．
８ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃｅｌｌ １８１，２７１－２８０ ｅ２７８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０２．０５２（２０２０）．
９ Ｌｅｔｋｏ，Ｍ．，Ｍａｒｚｉ，Ａ．＆Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｖ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓａｇｅ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５，５６２－５６９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０２０－０６８８－ｙ（２０２０）．
１０ Ｗａｈｂａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｔａ－Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅａｒｃｈ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｎｇｏｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｖｉｒｏｍｅｓ．ｍＳｐｈｅｒｅ ５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＳｐｈｅｒｅ．００１６０－２０（２０２０）．
１１ Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｃｔｏｎｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４，１１１５７－１１１６２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０８７２７１１４（２０１７）．
１２ Ａｌｇａｉｓｓｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ａｎｄ Ｎ－ｂａｓｅｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｒｅｖｅａｌ ｒａｐｉｄ ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，１６５６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－７３４９１－５（２０２０）．
１３ Ｌｏｎｇ，Ｑ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６，８４５－８４８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０２０－０８９７－１（２０２０）．
１４ Ｐｉｃｃｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｂｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０９．０３７（２０２０）．
１５ Ｃａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｐａｔｉｅｎｔｓ’Ｂ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １８２，７３－８４ ｅ１６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０５．０２５（２０２０）．
１６ Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎｓ ｙｉｅｌｄ ａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｃｋｔａｉｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，１０１０－１０１４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｄ０８２７（２０２０）．
１７ Ｊｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５８４，１１５－１１９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２３８０－ｚ（２０２０）．
１８ Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５８４，４５０－４５６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２５７１－７（２０２０）．
１９ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，９５６－９６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｃ７５２０（２０２０）．
２０ Ｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｎａｔｕｒｅ ５８４，１２０－１２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２３８１－ｙ（２０２０）．
２１ Ｗｅｉｔｋａｍｐ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ ｓｈａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１，４６８０－４６８８，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７１．９．４６８０（２００３）．
２２ Ｂｅｎｔｏｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２７７２－０（２０２０）．
２３ Ｗｒａｐｐ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１２６０－１２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７（２０２０）．
２４ Ｗｒｏｂｅｌ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ｂａｔ ＲａＴＧ１３ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｆｏｒｍ ｏｎ ｖｉｒｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７，７６３－７６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９４－０２０－０４６８－７（２０２０）．
２５ Ｚｏｓｔ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６，１４２２－１４２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０２０－０９９８－ｘ（２０２０）．
２６ Ｔｉａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＶＨ１－４６ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｄｏｍｉｎａｎｔ ｃｌｏｎｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０，３２７９－３２８８，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８０．５．３２７９（２００８）．
２７ Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｆｏｃｕｓｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１５９３－１６０２，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０７５３２（２０１１）．
２８ Ｚｈｏｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ＨＩＶ－１－Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ４ Ｓｕｐｅｒｓｉｔｅ ｉｎ １４ Ｄｏｎｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １６１，１２８０－１２９２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０５．００７（２０１５）．
２９ Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ａｎｄ ＶＨ－ｇｅｎｅ ｕｓａｇｅ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｔｈｅ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｇｐ１２０．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，２７０６－２７１１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０３０８５２７１００（２００４）．
３０ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＨＩＶ－１ ＶＡＣＣＩＮＥＳ．Ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｇｐ４１－ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９，ａａｂ１２５３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｂ１２５３（２０１５）．
３１ Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ Ｇｒｏｕｐ １ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ ２ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｅｌｌ １６６，６０９－６２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．０４３（２０１６）．
３２ Ｐａｐｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５１６，４１８－４２２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３７６４（２０１４）．
３３ Ｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６，２６５－２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．１５６６（２００９）．
３４ Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｈ５Ｎ１ Ｖａｃｃｉｎｅ－Ｅｌｉｃｉｔｅｄ Ｍｅｍｏｒｙ Ｂ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＩＧＨＶ Ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｓｔｅｍ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９５，６０２－６１０，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１４０２８３５（２０１５）．
３５ Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｅｗ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２，ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．９２８７２（２０１７）．
３６ Ｇｉａｎｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９，６２０５－６２１０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１４９２７１０９（２０１２）．
３７ Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ｏｒｏ，Ｕ．，Ｆｉｎｃｏ，Ｏ．＆Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ，Ｅ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ２．０；Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎｓｔｒｕｃｔｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１３，４６９－４８１，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１５１９６０（２０１６）．
３８ Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｅ３３５４（２０２０）．
３９ Ｋｒｅｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｎｅａｒ－Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ １８２，８４３－８５４ ｅ８１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０６．０４４（２０２０）．
４０ Ｓｏｔｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｓｈａｒｅｄ ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６６，３９８－４０２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９３４－８（２０１９）．
４１ Ｇｒｅａｎｅｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔ ｅｓｃａｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．１１．００７（２０２０）．
４２ Ｓｔａｒｒ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｏｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＣＥ２ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １８２，１２９５－１３１０ ｅ１２２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０８．０１２（２０２０）．
４３ Ｃａｓｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＡＣＥ２ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２８，４７５－４８５ ｅ４７５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０６．０２１（２０２０）．
４４ Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇｒｏｗｔｈ，ｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅ－ｓｉｔｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １０１，１１５６－１１６９，ｄｏｉ：１０．１０９９／ｊｇｖ．０．００１４８１（２０２０）．
４５ Ｓａｗａｔｚｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｆｅｒｒｅｔｓ ｎｏｔ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｓｅｔｔｉｎｇ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００８．２０２１．２５４９９５，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０８．２１．２５４９９５（２０２０）．
４６ Ｂａｕｍ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＲＥＧＮ－ＣＯＶ２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｎｄ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０，１１１０－１１１５，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｅ２４０２（２０２０）．
４７ Ｌｉ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １８２，１２８４－１２９４ ｅ１２８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０７．０１２（２０２０）．
４８ Ｇａｌｌｏｗａｙ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ Ｌｉｎｅａｇｅ － Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２９，２０２０－Ｊａｎｕａｒｙ １２，２０２１．ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ７０，９５－９９，ｄｏｉ：１０．１５５８５／ｍｍｗｒ．ｍｍ７００３ｅ２（２０２１）．
４９ Ｌｅｕｎｇ，Ｋ．，Ｓｈｕｍ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｍ，Ｔ．Ｔ．＆Ｗｕ，Ｊ．Ｔ．Ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ５０１Ｙ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ｔｏ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０２０．Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ ２６，ｄｏｉ：１０．２８０７／１５６０－７９１７．ＥＳ．２０２０．２６．１．２００２１０６（２０２１）．
５０ Ｔｅｇａｌｌｙ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ｌｉｎｅａｇｅ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｉｋｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ．ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０．２０１２．２０２１．２０２４８６４０，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．２１．２０２４８６４０（２０２０）．
５１ Ｖｏｌｏｃｈ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｌｉｎｅａｇｅ ｆｒｏｍ Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ，Ｂｒａｚｉｌ．ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０．２０１２．２０２３．２０２４８５９８，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．２３．２０２４８５９８（２０２０）．
５２ Ｌｉｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２０１１．２００６．３７２０３７，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１１．０６．３７２０３７（２０２１）．
５３ Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｅｌｉｆｅ ９，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．６１３１２（２０２０）．
５４ Ｇｒｅａｎｅｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２０１２．２０３１．４２５０２１，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．３１．４２５０２１（２０２１）．
５５ Ｗｉｂｍｅｒ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５０１Ｙ．Ｖ２ ｅｓｃａｐｅｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｄｏｎｏｒ ｐｌａｓｍａ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２１．２００１．２０１８．４２７１６６，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０１．１８．４２７１６６（２０２１）．
５６ Ａｎｄｒｅａｎｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｓｃａｐｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ＣＯＶＩＤ－１９ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｐｌａｓｍａ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２０１２．２０２８．４２４４５１，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．２８．４２４４５１（２０２０）．
５７ Ｈｕｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｓｐｉｋｅ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２８，４４５－４５４ ｅ４４６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０６．０１０（２０２０）．
５８ Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，１２５－１３２，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０９０４７３３７（２０１０）．
５９ Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，２３５－２４２，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９１００４５７４９（２０１１）．
６０ ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４０，６５８－６７４，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ００２１８８９８０７０２１２０６（２００７）．
６１ Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＰＨＥＮＩＸ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｙｔｈｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２１３－２２１，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０９０５２９２５（２０１０）．
６２ Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ－ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２１２６－２１３２，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０４０１９１５８（２００４）．
６３ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．８（２０１５）．
６４ Ｃｏｒｎｗｅｌｌ，Ｏ．，Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｓ．Ｅ．，Ａｓｈｃｒｏｆｔ，Ａ．Ｅ．＆Ａｕｌｔ，Ｊ．Ｒ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｆａｓｔ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｄｅｌｔａＮ６ ｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２９，２４１３－２４２６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３３６１－０１８－２０６７－ｙ（２０１８）．
６５ Ｓｔａｒｒ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｅｓｃａｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ ＣＯＶＩＤ－１９．ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１１．３０．４０５４７２（２０２０）．
６６ Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，ＭｃＣａｎｄｌｉｓｈ，Ｄ．Ｍ．＆Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｊ．Ｂ．Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｅｐｉｓｔａｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１５，Ｅ７５５０－Ｅ７５５８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８０４０１５１１５（２０１８）．
６７ Ｐｌａｎｔｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｋｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄ６１４Ｇ ａｌｔｅｒｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｆｉｔｎｅｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２８９５－３（２０２０）．
６８ Ｘｉｅ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７，８４１－８４８ ｅ８４３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０４．００４（２０２０）．
Figure 2023518849000003
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体の結合を遮断し、動物を防御する強力な中和ヒト抗体
著者：Ｓｅｔｈ Ｊ．Ｚｏｓｔ１＊、Ｐａｖｌｏ Ｇｉｌｃｈｕｋ１＊、Ｊａｍｅｓ Ｂｒｅｔｔ Ｃａｓｅ３、Ｅｌａｄ Ｂｉｎｓｈｔｅｉｎ１、Ｒｉｔａ Ｅ．Ｃｈｅｎ２、３、Ｊｏｓｅｐｈ Ｘ．Ｒｅｉｄｙ１、Ａｎｄｒｅｗ Ｔｒｉｖｅｔｔｅ１、Ｒａｃｈｅｌ Ｓ．Ｎａｒｇｉ１、Ｒａｃｈｅｌ Ｅ．Ｓｕｔｔｏｎ１、Ｎａｖｅｅｎｃｈａｎｄｒａ Ｓｕｒｙａｄｅｖａｒａ１、Ｌａｕｒｅｎ Ｅ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ４、Ｅｌａｉｎｅ Ｃ．Ｃｈｅｎ４、Ｔａｙｌｏｒ Ｊｏｎｅｓ１、Ｓａｍｕｅｌ Ｄａｙ１、Ｌｕｋｅ Ｍｙｅｒｓ１、Ａｈｍｅｄ Ｏ．Ｈａｓｓａｎ３、Ｎａｔａｓｈａ Ｍ．Ｋａｆａｉ２、３、Ｅｍｍａ Ｓ．Ｗｉｎｋｌｅｒ２、３、Ｊｕｌｉｅ Ｍ．Ｆｏｘ３、Ｊａｍｅｓ Ｊ．Ｓｔｅｉｎｈａｒｄｔ６、Ｋｕｉｓｈｕ Ｒｅｎ７、Ｙｕｅｈ－Ｍｉｎｇ Ｌｏｏ７、Ｎｉｃｏｌｅ Ｌ．Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ７、Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ５、Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｓｃｈａｅｆｅｒ５、Ｌｉｓａ Ｅ．Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ５、Ｒａｌｐｈ Ｓ．Ｂａｒｉｃ５、Ｌａｒｉｓｓａ Ｂ．Ｔｈａｃｋｒａｙ３、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｄｉａｍｏｎｄ２、３、８、９、Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｃａｒｎａｈａｎ１、１０＊＊、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｃｒｏｗｅ，Ｊｒ．１、４、１０＊＊
所属：
１Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，３７２３２，ＵＳＡ
２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，６３１１０，ＵＳＡ
３Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，６３１１０，ＭＯ，ＵＳＡ ４Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，３７２３２，ＵＳＡ
５Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，ＮＣ，２７５９９，ＵＳＡ
６Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒ＆Ｄ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８７８，ＵＳＡ
７Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒ＆Ｄ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８７８，ＵＳＡ
８Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，６３１１０，ＵＳＡ
９Ａｎｄｒｅｗ Ｍ．ａｎｄ Ｊａｎｅ Ｍ．Ｂｕｒｓｋｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，６３１１０，ＵＳＡ
１０Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，３７２３２，ＵＳＡ
連絡先：
Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｃｒｏｗｅ，Ｊｒ．，Ｍ．Ｄ．［筆頭連絡先］
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ
郵便宛先：
Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ
１１４７５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ＩＶ
２２１３ Ｇａｒｌａｎｄ Ａｖｅｎｕｅ
Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ ３７２３２－０４１７，ＵＳＡ
電話 （６１５）３４３－８０６４
電子メール ｊａｍｅｓ．ｃｒｏｗｅ＠ｖｕｍｃ．ｏｒｇ
更なるタイトルページの脚注
＊これらの著者は、同等の貢献をした
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キーワード：コロナウイルス；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ；ＣＯＶＩＤ－１９；抗体；モノクローナル；ヒト；適応免疫。
ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックは、限定された医学的な対策のみが存在し、液性免疫のメカニズムが十分に理解されていないため、世界的な健康に対して大きい脅威となっている１、２。感染した対象のＢ細胞から分離されたスパイク（Ｓ）糖タンパク質を標的化するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルから、偽ウイルス又は野生型（ｗｔ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和検査において、それぞれＩＣ５０値が０．９又は１５ｎｇ／ｍＬ程度に低い、強力な中和活性を示すいくつかのｍＡｂを同定した。最も強力なｍＡｂは、Ｓの受容体結合ドメイン（ＳＲＢＤ）を、ヒトＡＣＥ２との相互作用から完全に遮断する。競合結合試験、構造的試験及び機能的試験により、主なＳＲＢＤ上の抗原部位内で個々のエピトープを認識する画定されたクラスにｍＡｂをクラスター化することが可能となる。電子顕微鏡試験により、これらのｍＡｂが三量体Ｓタンパク質の個々の立体構造状態を認識することが明らかとなった。固有部位を認識する強力な中和ｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０は、Ｓに同時に結合し、標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを相乗的に中和した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の２つのマウスモデルでは、ＣＯＶ２－２９１６若しくはＣＯＶ２－２１３０を単独で又は両ｍＡｂを併用した受動伝達により、重篤な体重減少からマウスが保護され、肺ウイルス負荷及び炎症が低減した。これらの結果により、ＳＲＢＤ上の保護的なエピトープが特定され、合理的にワクチンを設計するための構造に基づいたフレームワーク及び頑強な免疫治療カクテルの選択が提供される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質は、ウイルスの付着、融合及び宿主細胞への侵入の分子決定基である３。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前安定化三量体Ｓタンパク質外部ドメイン（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ）のクライオＥＭ構造により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質の構造と特徴が類似していることが明らかとなった４。このＩ型膜内在性タンパク質及びクラスＩ融合タンパク質は、受容体に対する結合を媒介するＮ末端サブユニット（Ｓ１）と、ウイルス－細胞膜の融合を媒介するＣ末端サブユニット（Ｓ２）を有する。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端ドメイン（ＳＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＳＲＢＤ）を含有する。約７８％の配列同一性をそれらのゲノムで共有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ１は、共に侵入受容体としてヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を利用する５～７。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ８～１２及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）１３～２２を含む、他の高病原性の人畜共通感染症であるベータコロナウイルスに対するヒト免疫のこれまでの研究では、Ａｂがウイルス表面スパイク（Ｓ）糖タンパク質に対する防御免疫を媒介することが示されている。最も強力なＳタンパク質特異的ｍＡｂは、受容体の結合を直接媒介するＳＲＢＤ上の領域に結合することによってウイルスが宿主細胞に付着するのを遮断することにより、ベータコロナウイルスを中和するものと思われる。ヒトＡｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防、暴露後の予防又は治療に使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染中の疾患を改変するために使用される見込みがある可能性がある２３。回復期の血漿を評価する無作為化対照試験を含む多くの試験と、過免疫の免疫グロブリンを評価する１つの治験が進行中であるが、そのような治療が罹病率又は死亡率を低下させることができるかどうかはまだ明確となっていない２４。
これまでに中国の武漢でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した、２人の個体のＢ細胞由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質反応性のｍＡｂの大規模パネルを単離した２５。それらの抗体のサブセットは、Ｓの受容体結合ドメイン（ＳＲＢＤ）と結合し、標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による迅速なスクリーニングアッセイにおいて中和活性を示した２５。ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性ランドスケープを明らかにし、ＳＲＢＤのどの部位が防御的なｍＡｂの標的となるかを特定した。迅速な中和スクリーニングアッセイによって以前に事前選択した４０個の抗ＳヒトｍＡｂのパネルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＷＡ１／２０２０を用いた定量的なフォーカス減少法による中和試験（ＦＲＮＴ）において検査した。これらのアッセイにより、１５～４，０００ｎｇ／ｍＬを超える範囲の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を示すパネルが明らかとなった（図２０ａのヒートマップ、表Ｂに示す値及び図２４に示す全曲線として視覚化した）。これらのＳＲＢＤ反応性ｍＡｂの多くは、ｈＡＣＥ２に対するＳＲＢＤの結合を遮断することによってウイルス感染を中和すると仮定した。実際に、検査したほとんどの中和ｍＡｂは、ｈＡＣＥ２の三量体Ｓタンパク質との相互作用を直接的に阻害した（図２０ａ、図２５）。これらの結果と一致するものであるが、これらのｍＡｂは、三量体Ｓ外部ドメイン（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ）タンパク質又は単量体ＳＲＢＤにも強く結合した（図２０ａ、図２６）。Ｓ２Ｐｅｃｔｏ若しくはＳＲＢＤ結合効力又はｈＡＣＥ２遮断効力が、結合中和効力を独立して予測するかどうかを評価したが、これらの測定値のいずれもが中和効力と相関しなかった（図２０ｂ～ｄ）。しかしながら、また、最大の中和効力段階（ＩＣ５０＜１５０ｎｇ／ｍＬ）における各々のｍＡｂにより、ｈＡＣＥ２に対する最も強力な遮断活性（ＩＣ５０＜１５０ｎｇ／ｍＬ）と、Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体及びＳＲＢＤに対する並外れた結合活性（ＥＣ５０＜２ｎｇ／ｍＬ）とが明らかになった（図２０ｅ）。ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０と命名された２つの強力な中和ｍＡｂの代表的な中和曲線を（図２０ｆ）に示す。偽ウイルス中和アッセイを使用することにより、強力な中和が確認され、これによってｗｔウイルスよりもはるかに感受性のある中和表現型が明らかとなり、ｍＡｂの効力を評価するための生ウイルスアッセイに用いられる要件が実証された（図２０ｇ）。これらのｍＡｂのいずれもＳ２Ｐｅｃｔｏ三量体に強く結合し、ｈＡＣＥ２結合を完全に遮断した（図２０ｈ～ｉ）。
次に、競合結合分析により、中和ｍＡｂのＳＲＢＤ上の主な抗原部位を明らかにした。まず、最小のＳＲＢＤドメインによるバイオレイヤー干渉法を基準とした競合アッセイを使用し、強力な中和ｍＡｂであるＣＯＶ２－２１９６又は保存された潜在的なエピトープを認識する前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ ｍＡｂ、ＣＲ３０２２の組換えバージョンとの結合が競合するかについてｍＡｂをスクリーニングした１０、２６。３つの主な競合ｍＡｂのグループを特定した（図２１ａ）。ｍＡｂの最大のグループは、ＣＯＶ２－２１９６を遮断するが、ｒＣＲ３０２２を遮断しない一方、一部のｍＡｂは、ｒＣＲ３０２２によって遮断されたが、ＣＯＶ２－２１９６によって遮断されなかった。ＣＯＶ２－２１３０を含む２つのｍＡｂは、参照ｍＡｂのいずれにも遮断されなかった。ほとんどのｍＡｂは、ｈＡＣＥ２と結合について競合したが、これは、これらがＳＲＢＤのｈＡＣＥ２結合部位の近傍に結合することを示唆している。三量体Ｓ２Ｐｅｃｔｏタンパク質とのＥＬＩＳＡベースの競合結合アッセイにＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１３０及びｒＣＲ３０２２を使用し、一部のｍＡｂを２つ以上の部位で接触させる可能性のある、主な３つの抗原部位をＳＲＢＤが含有していることも判明した（図２１ｂ）。強力な中和ｍＡｂの大部分が、ＣＯＶ２－２１９６との結合に直接的に競合した。
ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０がＳＲＢＤへの結合について競合しなかったため、これらのｍＡｂが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのｍＡｂで以前観察された現象である、ウイルス中和について相乗効果をもたらすかどうかを評価した１０。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用して、ＦＲＮＴにおいて併用反応を検査し（図２１ｃの用量反応中和マトリックスを参照されたい）、これらの実験値を相乗効果スコアリングモデルで算出された予想される反応と比較した２７。この比較により、ＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０を併用することが相乗的であったことが明らかとなった（１７．４の相乗効果スコアを有し、＞１０のあらゆるスコアは相乗効果を示す）。図２１ｃのデータは、用量反応相乗効果マトリックスを示しており、カクテル中の７９ｎｇ／ｍＬの用量の併用されたｍＡｂ（１６ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１９６及び６３ｎｇ／ｍＬのＣＯＶ２－２１３０）が、２５０ｎｇ／ｍＬの各個々のｍＡｂと同一の活性を有していたことを証明するものである（図２１ｃを参照されたい）。この発見は、インビトロでのウイルス中和の同一の効力を達成するのに、カクテルの各ｍＡｂの用量の使用を３倍超だけ減少させ得ることを示している。
次に、中和について相乗効果をもたらす２つの主な競合結合グループ内で代表的なｍＡｂによって認識されるエピトープを明らかにした。アラニン又はアルギニン置換を用いてＳＲＢＤの変異誘発試験を行い、中和ｍＡｂの結合に重要な残基を特定した（図２７）。結合の消失試験により、Ｆ４８６Ａ又はＮ４８７ＡがＣＯＶ２－２１９６に重要な残基であり、Ｎ４８７ＡがＣＯＶ２－２１６５に重要な残基であることが明らかとなり、それらは、互いに結合について競合しており、同様にＫ４４４Ａ及びＧ４４７Ｒ変異体を用いたＣＯＶ２－２１３０に対する変異誘発試験により、これらの残基が認識のために重要なものであることが明らかになった（図２２ａ）。これまでの構造的研究により、ＳＲＢＤ及びｈＡＣＥ２間の相互作用が明らかとなった（図２２ｂ）２８。ＳＲＢＤにおける相互作用残基の大部分は、ｈＡＣＥ２認識モチーフを画定している６０個のアミノ酸の直鎖ペプチド内に含まれる（図２２ｃ）。次に、この最小限のペプチドに対するヒトｍＡｂの結合を試験すると、ＣＯＶ２－２１９６、ＣＯＶ２－２１６５及びＣＯＶ２－２８３２を含む、最大の競合結合グループの強力な中和メンバーがこのペプチドを認識したことが判明した（図２２ｃ）。これは、これらのｍＡｂがｈＡＣＥ２認識モチーフ内部で決定的に接触することを示唆している。
Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体／Ｆａｂ複合体のネガティブ染色電子顕微鏡を使用して、これらのｍＡｂに対するエピトープを構造的に特定した。強力な中和抗体であるＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１６５は、ＳＲＢＤのｈＡＣＥ２認識モチーフと結合し、Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体の「開いた」立体構造（図２２ｄ）の状態を認識した。しかしながら、あるスパイク「本体」に対する結合ポーズ及び角度は、「閉じた」位置でＳ２Ｐｅｃｔｏ三量体のＲＢＤと結合する（図２２ｄ）第２の競合結合グループを代表する他のＣＯＶ２－２１３０と比較して異なっているため、これらの２つの抗体の結合様式は異なるものであった。ＣＯＶ２－２１９６とＣＯＶ２－２１３０とは、結合について競合しないため、同時にＳ２Ｐｅｃｔｏ三量体に結合する、両方のＦａｂの複合体の作製を試みた。両方のＦａｂは、Ｓ２Ｐｅｃｔｏ三量体が開いた位置の場合に同時に結合することが判明し、これは、ＣＯＶ２－２１３０がいずれの立体構造でもＳＲＢＤを認識できることを示している（図２２ｅ）。この２つのＦａｂ複合体とＲＢＤ：ＣＲ３０２２複合体の構造を重ね合わせると２６、競合結合試験に基づいて予測される通り、これらの抗体がＳＲＢＤ上の別々の３つの部位に結合することが観察された（図２２ｆ）。
次に、ＣＯＶ２－２１９６若しくはＣＯＶ２－２１３０の単剤療法又はＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０を併用した予防効果を、新たに開発された、鼻腔内アデノウイルス（ＡｄＶ－ｈＡＣＥ２）形質導入後にｈＡＣＥ２を肺に発現させたＢａｌｂ／ｃマウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデルで検査した。この比較的厳密な疾患モデルにおいて、単回用量の抗Ｉｆｎａｒ１抗体も投与してウイルス感染及び発病を増大させ、これにより播種性間質性肺炎を生じさせた（Ａ．Ｈａｓｓａｎ及びＭ．Ｄｉａｍｏｎｄ、刊行物に投稿されている）。単回用量のｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＯＶ２－２１３０（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０の併用（それぞれ５ｍｇ／ｋｇ）又はアイソタイプ対照ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、４×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内チャレンジする１日前にＡｄＶ－ｈＡＣＥ２形質導入マウスに受動伝達した。ＣＯＶ２－２１９６若しくはＣＯＶ２－２１３０又はそれらを併用することによる予防は、感染の第１週にわたって重篤なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘発性の体重減少を阻止した（図２３ａ）。ウイルスＲＮＡレベルは、肺並びに心臓及び脾臓を含む遠位部位において７ｄｐｉで著しく減少した（図２３ｂ）。炎症の指標であるインターフェロンγ（ＩＮＦ－ｇ）、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ２サイトカイン及びケモカインの遺伝子発現も、７ｄｐｉ（疾患のピーク）において治療されたマウスの肺で減少した（図２３ｃ）。
また、ＣＯＶ２－２１９６若しくはＣＯＶ２－２１３０又はそれらを併用した予防効果について、マウス適合（ＭＡ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを使用した免疫適格性モデルで検査した２９（図２３ｄ）。インビトロ検査では、中和のＩＣ５０値が、これらのｍＡｂでｗｔウイルス及びＭＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに匹敵するものであったことが示された（データは示さず）。ｍＡｂ治療の各々を２００μｇ／マウスの用量（約８ｍｇ／ｋｇ）で送達すると、肺のウイルスＲＮＡレベルがアイソタイプ対照群と比較した場合に２ｄｐｉで最大１０５倍減少した（図２３ｅ、左）。それと一致して、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１９６＋ＣＯＶ２－２１３０治療群の全ての動物並びにＣＯＶ２－２１３０で治療した動物の１０匹中８匹には、肺組織のプラーク力価によって測定した場合、肺には２ｄｐｉですでに感染性ウイルスが存在しなかった（図２３ｅ、右）。まとめると、マウスにおけるこれらの結果は、ＣＯＶ２－２１９６又はＣＯＶ２－２１３０の単独又は併用は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は防止に有望な候補であることを示唆するものであった。
ここで、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して極めて強力なｍＡｂの大規模パネルの抗原性ランドスケープを明らかにした。数百のより大規模なパネルからこのｍＡｂのパネルが同定された、これらの詳細な試験及びスクリーニング試験２５は、多様なヒト中和抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の自然感染によって誘発されるが、それらのｍＡｂの少数のサブセットのみが高い効力を有し（生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対してＩＣ５０＜５０ｎｇ／ｍＬ）、従って治療のための開発に好適であることを証明するものである。これらの強力なｍＡｂの生化学的及び構造解析により、ＳＲＢＤでのＳＡＲＳ－ＣｏＶによる自然感染によって誘発される、ヒトｍＡｂによる中和に対して脆弱な３つの主要な抗原部位が明らかとなった。２つの最も強力な抗原部位に由来する代表的なｍＡｂは、インビトロにおいて相乗効果をもたらし、インビボにおけるカクテルとして防御することが示された。この発見により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する効果的な体液性免疫の重要な特徴が明らかとなり、これは、ポリクローナル応答における相乗的な中和活性の役割を更に調査する必要があることを示唆している。更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が広まり続ける場合、自然感染によって誘発される集団免疫が、中和抗体の選択圧から回避する抗原変異体を選択し始め、これによってワクチン又は免疫治療薬においてＳタンパク質の複数のエピトープを標的化する必要性が高まる可能性がある。
今日までに報告された世界中の一般的なＳ遺伝子変異体は、Ｄ６１４Ｇ、Ｖ４８３Ａ、Ｌ５Ｆ、Ｑ６７５Ｈ、Ｈ６５５Ｙ及びＳ９３９Ｆ位に位置しており３０、本明細書の主要なｍＡｂ試験のために変異試験で同定された残基４８６又は４８７のアミノ酸変異体とは離れている。本明細書に記載されるような合理的に選択された治療用カクテルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回避に対してより良好な耐性を提供することができる。これらの試験は、ヒトにおけるＣＯＶＩＤ－１９免疫治療として使用するための候補として同定されたｍＡｂの前臨床評価及び開発のきっかけとなっている。
データの入手可能性。ＥＭマップは、アクセッションコードＥＭＢＤ ２１９６５（Ｓ２Ｐｅｃｔｏアポ）、ＥＭＤ－２１９７４（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ＋Ｆａｂ ＣＯＶｓ－２１６５）、ＥＭＤ－２１９７５（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ＋Ｆａｂ ＣＯＶｓ－２１９６）、ＥＭＤ－２１９７６（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ＋Ｆａｂ ＣＯＶｓ－２１３０）及びＥＭＤ－２１９７７（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ＋Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１９６＋Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１３０）によって電子顕微鏡データバンクに寄託されている。本試験で報告された材料は入手可能となっているが、物質移動合意書の履行が必要となる場合がある。
謝辞。Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ ＶＡＮＴＡＧＥ中央検査機関のＡｎｇｅｌａ Ｊｏｎｅｓ及びそのスタッフの迅速な配列決定、Ｒｏｓｓ Ｔｒｏｓｓｅｔｈのデータ管理及び分析支援、ＶＵＭＣのＲｏｂｉｎ Ｂｏｍｂａｒｄｉ及びＣｉｎｑｕｅ Ｓｏｔｏのゲノム手法における技術援助、ＷＵＳＴＬのＡｒｔｈｕｒ Ｋｉｍ、Ａｄａｍ Ｂａｉｌｅｙ、Ｌａｕｒａ ＶａｎＢｌａｒｇａｎ、Ｊａｍｅｓ Ｅａｒｎｅｓｔ、Ｂｒｏｃ ＭｃＣｕｎｅ及びＳｗａｔｈｉ Ｓｈｒｉｈａｒｉの実験支援及び主要試薬、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＫｅｖｉｎ Ｍ．Ｔｕｆｆｙ、Ｓｅｍｅ Ｄｉａｌｌｏ、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｍ．ＭｃＴａｍｎｅｙ及びＬｏｒｉ Ｃｌａｒｋｅのタンパク質の生成並びに偽ウイルス試薬及び関連データに対し、謝意を表す。本試験は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）助成金、ＨＲ００１１－１８－２－０００１及びＨＲ００ １１－１８－３－０００１、ＮＩＨ契約書、７５Ｎ９３０１９Ｃ０００７４及び７５Ｎ９３０１９Ｃ０００６２並びにＶａｎｄｅｒｂｉｌｔのＤｏｌｌｙ Ｐａｒｔｏｎ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄによる支援を受けたものである。この研究は、助成金による支援（ＮＣＡＴＳ／ＮＩＨからのＵＬ１ＴＲ００２２４３）によるＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ（ＶＡＮＴＡＧＥ）及びＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈを擁する次世代核酸シークエンサーのためのＮＩＨ助成金、１Ｓ１０ＲＲ０２８１０６－０１Ａ１による支援を受けたものである。Ｓ．Ｊ．Ｚは、ＮＩＨ Ｔ３２ ＡＩ０９５２０２による支援を受けた。Ｊ．Ｂ．Ｃ．は、Ｈｅｌｅｎ Ｈａｙ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐによる支援を受けている。Ｄ．Ｒ．Ｍ．は、ＮＩＨ Ｔ３２ ＡＩ００７１５１及びＢｕｒｒｏｕｇｈｓ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｕｎｄ Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｗａｒｄによる支援を受けた。Ｊ．Ｅ．Ｃ．は、この研究を研究助成金で支援したＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ Ｇｅｒｍａｎｙからの２０１９年度のＦｕｔｕｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｐｒｉｚｅを受賞している。本内容は、著者のみに帰属するものであり、必ずしも米国政府又は他の支援者の公式の見解を表すものではない。
著者の貢献。プロジェクトの構想：Ｓ．Ｊ．Ｚ．、Ｐ．Ｇ．、Ｒ．Ｈ．Ｃ．、Ｌ．Ｂ．Ｔ．、Ｍ．Ｓ．Ｄ．、Ｊ．Ｅ．Ｃ．；資金調達：Ｊ．Ｅ．Ｃ．及びＭ．Ｓ．Ｄ．室内実験の実行：Ｓ．Ｊ．Ｚ．、Ｐ．Ｇ．、Ｊ．Ｂ．Ｃ．、Ｅ．Ｂ．、Ｒ．Ｅ．Ｃ．、Ｊ．Ｘ．Ｒ．、Ａ．Ｔ．、Ｒ．Ｓ．Ｎ．、Ｒ．Ｅ．Ｓ．、Ｎ．Ｓ．、Ｌ．Ｅ．Ｗ．、Ａ．Ｏ．Ｈ．、Ｎ．Ｍ．Ｋ．、Ｅ．Ｗ．、Ｊ．Ｍ．Ｆ．、Ｌ．Ｂ．Ｔ．、Ｊ．Ｊ．Ｓ．、Ｋ．Ｒ．、Ｙ．－Ｍ．Ｌ．、Ａ．Ｓ．、Ｌ．Ｅ．Ｇ．、Ｄ．Ｒ．Ｍ．；計算作業の実行：Ｅ．Ｃ．Ｃ．、Ｔ．Ｊ．、Ｓ．Ｄ．、Ｌ．Ｍ．；研究監督：Ｎ．Ｌ．Ｋ、Ｍ．Ｓ．Ｄ．、Ｌ．Ｂ．Ｔ．、Ｒ．Ｓ．Ｂ．、Ｒ．Ｈ．Ｃ．、Ｊ．Ｅ．Ｃ．本明細書の原案の執筆：Ｓ．Ｊ．Ｚ．、Ｐ．Ｇ．、Ｒ．Ｈ．Ｃ．、Ｊ．Ｅ．Ｃ．であり、全ての著者によって最終原稿が精査され、承認されている。
利害関係。Ｒ．Ｓ．Ｂ．は、ワクチンに関する問題において武田薬品工業及びＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒのコンサルタントを務めている。Ｍ．Ｓ．Ｄ．は、Ｉｎｂｉｏｓ、Ｖｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＧＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙのコンサルタントであり、Ｍｏｄｅｒｎａの科学諮問委員会に在籍し、Ｍｏｄｅｒｎａの非関連の研究助成金の過去の受給者であり、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓの非関連の研究助成金の現在の受給者である。Ｊ．Ｅ．Ｃ．は、Ｓａｎｏｆｉのコンサルタントを務めており、ＣｏｍｐｕＶａｘ及びＭｅｉｓｓａ Ｖａｃｃｉｎｅｓの科学諮問委員会に在籍し、Ｍｏｄｅｒｎａ及びＳａｎｏｆｉの以前の非関連の研究助成金の受給者であり、ＩＤＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．の創設者である。Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙは、本研究に関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に関する特許を申請している。ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａは、本研究に関連する材料／発見についての特許を出願している。Ｊ．Ｊ．Ｓ．、Ｋ．Ｒ．、Ｙ．－Ｍ．Ｌ．及びＮ．Ｌ．Ｋ．は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの従業員であり、現在ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの株式又は自社株購入権を保有している。他の全ての著者は、利害関係がないことを明言している。
追加情報
補足情報が本明細書で利用可能である。材料に関する対応及び依頼は、Ｊ．Ｅ．Ｃ．で対応するものとする。
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９．ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｆｏｒ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３６３，２１３９－２１４１（２００４）．
１０．ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ｓｙｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ３，ｅ２３７（２００６）．
１１．Ｚｈｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，１２１２３－１２１２８（２００７）．
１２．Ｒｏｃｋｘ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔ ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２，３２２０－３２３５（２００８）．
１３．Ｃｈｅｎ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｍａｒｍｏｓｅｔ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１５，１８０７－１８１５（２０１７）．
１４．Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｂ－ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １５，ｅ０２３２７５７（２０２０）．
１５．Ｎｉｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１８，１２４９－１２６０（２０１８）．
１６．Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ａｖｏｉｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｓｃａｐｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２（２０１８）．
１７．Ｗａｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ１－ＮＴＤ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２８，３３９５－３４０５ ｅ３３９６（２０１９）．
１８．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２４，４４１－４５２（２０１８）．
１９．Ｃｏｒｔｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＭＥＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，１０４７３－１０４７８（２０１５）．
２０．Ｊｉａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６，２３４ｒａ２５９（２０１４）．
２１．Ｔａｎｇ，Ｘ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１，Ｅ２０１８－２０２６（２０１４）．
２２．Ｙｉｎｇ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８，７７９６－７８０５（２０１４）．
２３．Ｊｉａｎｇ，Ｓ．，Ｈｉｌｌｙｅｒ，Ｃ．＆Ｄｕ，Ｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４１，３５５－３５９（２０２０）．
２４．Ｖａｌｋ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｐｌａｓｍａ ｏｒ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｐｅｏｐｌｅ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９；ａ ｒａｐｉｄ ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ５，ＣＤ０１３６００（２０２０）．
２５．Ｚｏｓｔ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２０１２．０９１４６２（２０２０）．
２６．Ｙｕａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８，６３０－６３３（２０２０）．
２７．Ｉａｎｅｖｓｋｉ，Ａ．，Ｈｅ，Ｌ．，Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｔ．＆Ｔａｎｇ，Ｊ．ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３，２４１３－２４１５（２０１７）．
２８．Ｌａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５８１，２１５－２２０（２０２０）．
２９．Ｄｉｎｎｏｎ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｏｕｓｅ－ａｄａｐｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２００６．０８１４９７（２０２０）．
３０．Ｌａｈａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ，ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２００３．０６６２６６（２０２０）．
Figure 2023518849000004
Figure 2023518849000005
方法
抗体。本明細書で試験されたヒト抗体は、中国で得られた、これまでに検査機関で確認された症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を有する北米の２人の対象由来の血液試料から単離されたものであった。書面によるインフォームドコンセント後の検体を得るための元来の臨床試験は前述されており１、ヴァンダービルト大学メディカルセンターの施設内審査委員会及びトロント大学の研究倫理委員会によって承認されている。対象（５６歳の男性及び５６歳の女性）は夫婦で、中国武漢在住であり、カナダのトロントに旅行し、そこで症状の発症の５０日後に白血球アフェレーシスによってＰＢＭＣを得た。単離のための様々なツールを使用して抗体を単離し、モノクローナル抗体をコードする単一の抗原特異的Ｂ細胞及び抗体可変遺伝子をクローニングした１。
細胞培養物。Ｖｅｒｏ Ｅ６（ＣＲＬ－１５８６、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ）、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）を、１０％（体積／体積）の加熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを含有するダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中５％のＣＯ２で３７℃において維持した。Ｖｅｒｏ－フューリン細胞をＴ．Ｐｉｅｒｓｏｎ（ＮＩＨ）から入手し、これは、前述されている２。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１４５２）を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１４３５１０２）中８％のＣＯ２で３７℃において維持した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２９１２７）を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２９１０００２）中８％のＣＯ２で３７℃において維持した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ及びＥｘｐｉＣＨＯ培養物のマイコプラズマ試験を、ＰＣＲベースのマイコプラズマ検出キット（ＡＴＣＣ、３０－１０１２Ｋ）を使用して月毎に実施した。
ウイルス。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株である２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０を、疾病予防管理センターから入手した（Ｎａｔａｌｉｅ Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇからの寄贈）。ウイルスをＶｅｒｏ ＣＣＬ８１細胞で継代し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のプラークアッセイによって滴定した。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による全ての研究は、ワシントン大学医学部又はＵＮＣ－チャペルヒル機関内生物安全委員会によって承認されており、適切な電動ファン付濾過式呼吸用保護具及び個人用保護具を使用して、承認済みのＢＳＬ３施設で実施した。
組換え抗原及びタンパク質。融合前立体構造安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ２Ｐｅｃｔｏ）タンパク質の外部ドメインをコードする遺伝子を合成し、哺乳類細胞のためのＤＮＡプラスミド発現ベクターにクローニングした。同様に設計された、２つのプロリンを含み、Ｓの融合前形態の安定化のためにフューリン切断部位を除去したＳタンパク質抗原がこれまでに報告されている３。要約すると、この遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の外部ドメイン（残基１，２０８まで）、Ｔ４フィブリチン三量体化ドメイン、ＡｖｉＴａｇ部位特異的ビオチン化配列及びＣ末端の８×Ｈｉｓタグを含んでいる。融合前立体構造の構築物を安定化させるため、本発明者らは、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐの置換を含ませ、残基６８２～６８５のフューリン切断部位をＲＲＡＲからＡＳＶＧに変異させた。この組換えスパイク２Ｐ－安定化タンパク質（本明細書ではＳ２Ｐｅｃｔｏと表記する）を、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の金属アフィニティークロマトグラフィーによって単離し、タンパク質調製物をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。三量体の融合前立体構造のＳタンパク質の存在を、ネガティブ染色電子顕微鏡で確認した１。Ｓ及びＦａｂによる顕微鏡検査のために、本発明者らは、これまでに記載されたものと類似した、ＡｖｉＴａｇを欠くがＣ末端にＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇを含有するＳ２Ｐｅｃｔｏの変異体を発現させた３。発現タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の金属アフィニティークロマトグラフィーによって単離した後、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷ ＸＬ（東ソー株式会社）のサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＳＲＢＤサブドメインを発現させるために、残基３１９～５４１を哺乳類発現ベクターのＩＬ－２シグナルペプチドの下流並びにトロンビン切断部位、ＡｖｉＴａｇ及び６×－Ｈｉｓタグの上流にクローニングした。マウスＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＲＢＤタンパク質（ＲＢＤ－ｍＦｃと表記する）を、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（４０５９２－Ｖ０５Ｈ）から購入した。アラニンスキャニングによるエピトープマッピングのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（残基３３４～５２６）又はＲＢＤ単一突然変異体を、Ｎ末端のＣＤ３３リーダー配列及びＣ末端のＧＳＳＧリンカー、ＡｖｉＴａｇ、ＧＳＳＧリンカー及び８×ＨｉｓＴａｇと共にクローニングした。スパイクタンパク質をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で発現させ、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって単離した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、純度と適切な分子量であることとを保証した。
電子顕微鏡（ＥＭ）染色グリッドの調製、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｐｅｃｔｏタンパク質又はＳ２Ｐｅｃｔｏ／Ｆａｂ複合体のイメージング及び処理。ＥＭイメージングを実施するために、クロマトグラフィーで精製された組換えＩｇＧを、樹脂に固定化したシステインプロテアーゼ酵素を用いて消化させることによってＦａｂを生成した（ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ、Ｇｅｎｏｖｉｓ）。１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．２中で室温において約１６時間消化を行った。切断されたＦｃ及びインタクトなＩｇＧを除去するため、消化混合物をＰＢＳ緩衝液中でＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｆｃ樹脂（Ｇｅｎｏｖｉｓ）と室温で３０分間インキュベートした。必要に応じて、Ｚｅｂａスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遠心分離することにより、Ｆａｂをトリス緩衝液に緩衝液交換した。
ヒトＦａｂと複合体化したネガティブ染色（ＮＳ）されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２Ｐｅｃｔｏタンパク質をスクリーニング及びイメージングするため、タンパク質を約１時間インキュベートし、約１０～１５μｇ／ｍＬの濃度の約３μＬの試料を、４００スクエアメッシュの銅製ＥＭグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に連続的な炭素フィルムを備えたグロー放電したグリッドに加えた。グリッドを０．７５％のギ酸ウラニル（ＵＦ）で染色した４。２００ｋｅＶで動作し、ＳｅｒｉａｌＥＭで制御したＦＥＩ ＴＦ２０（ＴＦＳ）透過型電子顕微鏡を使用して、Ｇａｔａｎ ＵＳ４０００ ４ｋ×４ｋ ＣＣＤカメラで画像を記録した５。全ての画像を、１．５～１．８μｍのデフォーカスの低線量モードで、画素当たり２．１８Åの画素サイズによる５０，０００×の倍率で撮像した。顕微鏡写真の総線量は、約２５～３８ｅ－／Åであった２。ｃｒｙｏＳＰＡＲＣソフトウェアパッケージを使用して、画像処理を行った６。画像を取り込み、粒子にＣＴＦ推定を行った。次いで画像をノイズ除去し、Ｔｏｐａｚで選択した７。２５６画素のボックスサイズで粒子を抽出し、１２８画素にビニングした。２Ｄクラス平均を行い、良好なクラスを第一原理モデルに選択し、対称性を伴わずに精密化した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｐｅｃｔｏタンパク質のＥＭモデルのドッキングでは、ＥＭマップにドッキングするために、閉じたモデル（ＰＤＢ：６ＶＸＸ）をＣｈｉｍｅｒａ８に使用した（詳細については、表Ｃも参照されたい）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｐｅｃｔｏ／Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１６５及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｐｅｃｔｏ／Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１６５複合体では、ＥＭマップにドッキングするために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の開いたモデル（ＰＤＢ：６ＶＹＢ）及びＦａｂ（Ｆａｂ：１２Ｅ８）をＣｈｉｍｅｒａに使用した（詳細については、表Ｃも参照されたい）。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｓ２Ｐｅｃｔｏ／Ｆａｂ ＣＯＶ２－２１３０複合体では、ＥＭマップにドッキングするために、閉じたモデル及びＦａｂ（ＰＤＢ：１２Ｅ８）をＣｈｉｍｅｒａに使用した（詳細については、表Ｃも参照されたい）。全ての画像はＣｈｉｍｅｒａで作製した。
ｍＡｂの生成及び精製。合成され（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩｇＧ１モノシストロン性発現ベクター（ｐＴｗｉｓｔ－ｍＣｉｓ＿Ｇ１と表記する）にクローニングされたｍＡｂの配列を、哺乳類細胞培養によってｍＡｂを分泌させるために使用した。このベクターは、形質移入の際に単一の構築物からｍＡｂの重鎖及び軽鎖遺伝子を同時に発現することが可能となる、強化された２Ａ配列及びＧＳＧリンカーを含有する９。本発明者らにより、９６ウェルプレート内の１ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ培養物でのｍＡｂのマイクロスケールの発現がこれまでに記載されている１。より大規模にｍＡｂを発現させるため、本発明者らは、販売業者によって記載される通り、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システムと、５０ｍＬの小型バイオリアクターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のプロトコルとを使用して、ＣＨＯ細胞培養物の形質移入を行った（抗体当たり１～３００ｍＬ）。ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ、旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２４カラムの並列タンパク質クロマトグラフィーシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）で培養液上清を精製した。精製されたｍＡｂをＰＢＳに緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４ ５０ＫＤａ遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮し、使用するまで４℃で保存した。
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ。９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、精製された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＲＢＤタンパク質で４℃において一晩コーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ－Ｔ）中２％の脱脂粉乳及び２％の標準ヤギ血清で、プレートを１時間ブロッキングした。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して結合抗体を検出した。発色を観察し、１Ｎの塩酸を添加して反応を停止し、吸光度を、分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎｍで測定した。用量反応アッセイのため、精製されたｍＡｂの連続希釈液をウェルに３回適用し、結合したｍＡｂを上記で詳述したように検出した。結合に対する最大半量効果濃度（ＥＣ５０）値を、シグモイド用量反応非線形回帰分析を用いてｍＡｂ濃度を対数変換した後、Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定した。
ＲＢＤ最小ＡＣＥ２結合モチーフペプチド結合ＥＬＩＳＡ。３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンで４℃において一晩コーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ－Ｔ）中５％のＢＳＡによってプレートを１時間ブロッキングした。プレートを１×ＰＢＳＴで４回洗浄し、２μｇ／ｍＬのビオチン化ＡＣＥ２結合モチーフペプチド（ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＬＬＣのカタログ番号ＬＴ５５７８）を添加して、ストレプトアビジンに室温で１時間結合させた。精製されたｍＡｂをブロッキング緩衝液で希釈してウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（カタログ番号２０１４－０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して結合抗体を検出した。発色を観察し、１Ｎの塩酸を添加して反応を停止し、吸光度を、分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎｍで測定した。用量反応アッセイのため、精製されたｍＡｂの１０μｇ／ｍＬの濃度から開始した段階３倍希釈液をウェルに３回適用し、結合したｍＡｂを上記で詳述したように検出した。
抗体のアラニン又はアルギニン点変異を含む変異ＲＢＤタンパク質への結合の分析。Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び野生型ＲＢＤタンパク質又は画定された位置のアラニン又はアルギニンへの単一アミノ酸変化を含む変異ＲＢＤタンパク質を使用して、バイオレイヤー光干渉法（ＢＬＩ）を実施した。ＲＢＤタンパク質の結合を、最初にオクタ－Ｈｉｓタグ付きＲＢＤ野生型タンパク質又は変異タンパク質を１０μｇ／ｍＬ（２００ｎＭとほぼ等しい）溶液からペンタ－Ｈｉｓバイオセンサーに入れて３００秒間捕捉することによって確認した。次いで、バイオセンサーチップを結合緩衝液（ＰＢＳ／０．２％のＴｗｅｅｎ ２０）に６０秒間浸して洗浄した後、１５０ｎＭのｍＡｂを含有する溶液に１８０秒間浸漬し（会合）、その後引き続き結合緩衝液に１８０秒間浸漬した（解離）。各ＲＢＤ変異タンパク質の反応を野生型ＲＢＤタンパク質の反応に標準化した。
フォーカス減少法による中和試験（ＦＲＮＴ）。ｍＡｂの連続希釈液を１０２ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３７℃で１時間インキュベートした。ｍＡｂ－ウイルス複合体を９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞培養単層に３７℃で１時間にわたって添加した。続いて、細胞を２％の加熱不活性化したＦＢＳを含有するように補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中１％（ｗ／ｖ）のメチルセルロースで重層させた。重層を取り除くことで３０時間後にプレートを固定し、ＰＢＳ中４％のＰＦＡで室温において２０分間固定した。０．１％（ｗ／ｖ）のサポニン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＰＢＳ中で、１μｇ／ｍＬのｒＣＲ３０２２抗Ｓ抗体１０及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧで順次プレートをインキュベートした。ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞巣を視覚化し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ５．０．３７マクロ分析器（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、データを処理した。
Ｓタンパク質偽型レンチウイルスの生成。２９３細胞の懸濁液を播種し、以下をコードするパッケージングプラスミドと共にルシフェラーゼを発現する第三世代のＨＩＶベースのレンチウイルスベクターで形質移入した：Ｃ末端に１９個のアミノ酸欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、Ｒｅｖ及びＧａｇ－ｐｏｌ。形質移入して１６～２０時間後に培地を変更し、２４時間後にウイルスを含有する上清を回収した。細胞片を低速の遠心分離によって除去し、上清を０．４５μｍのフィルタユニットに通した。偽ウイルスを超遠心分離によってペレット化し、１００倍濃縮原液とするためにＰＢＳ中に再懸濁した。
偽ウイルス中和アッセイ。ｍＡｂの連続希釈液を３８４ウェルマイクロタイタープレート中で調製し、偽ウイルスと３７℃で３０分間プレインキュベートし、そこにヒトＡＣＥ２を安定的に発現する２９３細胞を添加した。プレートを３７℃のインキュベーターに戻し、次いで製造業者の推奨事項に従って、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０５ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４８時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。阻害率は、偽ウイルス単独の対照と比較して算出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン８．１．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、非線形回帰によってＩＣ５０値を測定した。各抗体の平均ＩＣ５０値は、最低３回の独立した実験から決定した。
抗体の併用による相乗的な中和の測定。相乗効果とは、インビトロにおける抗体の同じ総濃度での個々のｍＡｂに媒介される中和活性と比較した場合、２つのｍＡｂのカクテルに媒介される中和活性が高くなるものとして定義されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するのに２つのｍＡｂがカクテル中で相乗作用を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者らは、すでに報告されている手法を用いて相乗効果を定量化した１１。ｍＡｂを併用することによる有益な効果の有意性を評価するために、観察された併用反応（用量反応マトリックス）を、相乗効果スコアリングモデルによって算出した予想される反応と比較した１１。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞培養単層を用いた、従来のフォーカス減少法による中和試験（ＦＲＮＴ）アッセイでウイルス中和を測定した。個々のｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６及びＣＯＶ２－２１３０を異なる濃度で混合し、カクテル中で異なるｍＡｂの比率の中和活性を評価した。具体的には、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１３０の７倍希釈液（５００ｎｇ／ｍＬから開始する）の各々を、ｍＡｂ ＣＯＶ２－２１９６の９倍希釈液（５００ｎｇ／ｍＬから開始する）の各々と各条件について総体積５０μＬで混合し、次いで細胞培養培地（２％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地）中で５０μＬの生きたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインキュベートし、その後、９６ウェルプレート内で増殖させたコンフルエントなＶｅｒｏ Ｅ６細胞に加えた。対照値には個々のｍＡｂ、ＣＯＶ２－２１９６又はＣＯＶ２－２１３０について別々に測定した中和活性の用量反応を決定するための値が含まれており、これらをカクテル中のものと同じ用量で評価した。それぞれの測定を２回繰り返して行った。次に、本発明者らは、各条件のウイルス中和率を算出し、次いでカクテル中のこれらの２つのｍＡｂ間の相互作用を定義する、相乗効果スコア値を算出した。－１０未満の相乗効果スコアは、拮抗作用を示し、－１０～１０のスコアは、相加効果を示し、１０を超えるスコアは、相乗効果を示す１１。
ｍＡｂの定量化。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用し、ヒトＩｇＧの減衰係数を考慮した紫外分光光度法により、精製されたｍＡｂの定量化を行った。
バイオレイヤー干渉法による競合結合分析。Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオレイヤー干渉計機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕捉バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ １８－５０８９）を、１×カイネティクス緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ １８－１１０５）中で１０分間浸漬させた後、ベースラインシグナルを６０秒間測定した。マウスＩｇＧ１に融合した組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（ＲＢＤ－ｍＦｃ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５９２－Ｖ０５Ｈ）を、バイオセンサーチップに１８０秒間で固定した。３０秒間の１×カイネティクス緩衝液中での洗浄工程後、抗原を含有するバイオセンサーと参照抗体（５μｇ／ｍＬ）を６００秒間インキュベートした。参照抗体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶヒトｍＡｂ、ＣＲ３０２２及びＣＯＶ２－２１９６が含まれていた。３０秒間の１×カイネティクス緩衝液中での洗浄工程後、次いでバイオセンサーチップを第２の抗体（５μｇ／ｍＬ）に３００秒間浸漬した。各抗体の最大結合性を緩衝液のみの対照に標準化した。自己ブロッキングは差し引いた。各抗体の最大シグナル間の比較を用いて、各抗体の結合率を決定した。最大シグナルが非競合シグナルの＜３３％まで低下すると、参照抗体の存在下で第２の抗体への結合が完全に競合するものと見なした。最大シグナルが非競合の３３～６７％まで低下すると、参照抗体の存在下で第２の抗体への結合が中程度に競合するものと見なした。最大シグナルの結合率＞６７％は、参照抗体の存在下で第２の抗体への結合の競合が存在しないものと見なした。
ハイスループットなＡＣＥ－２結合阻害分析。３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、精製された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２Ｐｅｃｔｏタンパク質で４℃において一晩コーティングした。ＤＰＢＳ－Ｔ中２％の脱脂粉乳及び２％の標準ヤギ血清で、プレートを１時間ブロッキングした。マイクロスケール発現から精製されたｍＡｂを、ブロッキング緩衝液で１０μｇ／ｍＬから開始して２倍希釈してウェルに３回添加し（２０μＬ／ウェル）、周囲温度で１時間インキュベートした。Ｃ末端にＦＬＡＧタグタンパク質を含む組換えヒトＡＣＥ２を、抗体を洗浄せずに、５μＬ／ウェルの容積中２μｇ／ｍＬ（最終的に０．４μｇ／ｍＬのＡＣＥ２濃度）でウェルに添加し、次いで周囲温度で４０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）及びＴＭＢ基質を使用して、結合したＡＣＥ２を検出した。抗体を含まないＡＣＥ２結合は、対照として機能した。検査した抗体の各希釈液の存在下でＡＣＥ２の結合から得られたシグナルを、バックグラウンドシグナルを差し引いた後の抗体を含まないＡＣＥ２結合の割合として表した。Ｓ２Ｐｅｃｔｏタンパク質のｍＡｂのＡＣＥ２への結合による阻害に関する最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、シグモイド用量反応非線形回帰分析（Ｐｒｉｓｍソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０）を用いて抗体濃度を対数変換した後に測定した。
バイオレイヤー干渉計のバイオセンサーを用いたＡＣＥ２遮断アッセイ。Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオレイヤー干渉計機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の抗マウスＩｇＧバイオセンサーを、１×カイネティクス緩衝液中で１０分間浸漬させた後、ベースラインシグナルを６０秒間測定した。マウスＩｇＧ１に融合した組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（ＲＢＤ－ｍＦｃ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ４０５９２－Ｖ０５Ｈ）を、バイオセンサーチップに１８０秒間で固定した。３０秒間の１×カイネティクス緩衝液中での洗浄工程後、参照抗体（５μｇ／ｍＬ）を抗原でコーティングされたバイオセンサーと６００秒間インキュベートした。３０秒間の１×カイネティクス緩衝液中での洗浄工程後、次いでバイオセンサーチップをＡＣＥ２受容体（２０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＳＡＥ００６４）に３００秒間浸漬した。ＡＣＥ２の最大結合性を緩衝液のみの対照に標準化した。抗体の存在下のＡＣＥ２の結合率を、ＡＣＥ２の最大結合性と比較した。最大シグナルが＜３０％に低下すると、ＡＣＥ２が遮断されたと見なした。
ハイスループットな競合結合分析。３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、精製された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質で４℃において一晩コーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ－Ｔ）中２％のＢＳＡによってプレートを１時間ブロッキングした。マイクロスケールで精製された非標識のｍＡｂをブロッキング緩衝液で１０倍希釈してウェルに４回添加し（２０μＬ／ウェル）、周囲温度で１時間インキュベートした。前述のｍＡｂ、ＣＲ３０２２１２の可変遺伝子配列をベースとした組換えｍＡｂのビオチン化調製物、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の別個の抗原性領域を認識した新たに同定されたｍＡｂ、ＣＯＶ２－２０９６、ＣＯＶ２－２１３０及びＣＯＶ２－２１９６を、非標識抗体を洗浄せずに、対応するｍＡｂを５μＬ／ウェルの容積中２．５μｇ／ｍＬ（最終的に０．５μｇ／ｍＬのビオチン化ｍＡｂの濃度）を含む４つのウェルのそれぞれに添加し、次いで周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合アビジン（Ｓｉｇｍａ）及びＴＭＢ基質を使用して、結合した抗体を検出した。非標識の検査した抗体の存在下でビオチン標識参照抗体の結合に関して得られたシグナルを、バックグラウンドシグナルを差し引いた後の参照抗体単独の結合の割合として表した。検査したｍＡｂを、それらの存在によって参照抗体の結合がその最大結合性の４１％未満に低下した場合に競合すると見なし、シグナルが７１％を超えた場合に競合しないと見なした。４０～７０％のレベルは中程度の競合であると見なした。
アラニン又はアルギニンＲＢＤ変異体に対するｍＡｂの結合分析。Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、バイオレイヤー光干渉法を実施した。最初にオクタ－Ｈｉｓタグ付きＲＢＤ変異体１０μｇ／ｍＬ（２００ｎＭとほぼ等しい）をペンタ－Ｈｉｓバイオセンサーに入れて３００秒間捕捉することによって結合を確認した。次いで、バイオセンサーを、洗浄のため結合緩衝液（ＰＢＳ／０．２％のＴＷＥＥＮ ２０）に６０秒間浸した後、１５０ｎＭのｍＡｂを含有する溶液に１８０秒間浸漬し（会合）、その後引き続き結合緩衝液に１８０秒間浸漬した（解離）。各ＲＢＤ変異体の反応を野生型ＲＢＤの反応に標準化した。
ヒトｈＡＣＥ２形質導入マウスを用いたマウス実験。動物試験は、アメリカ国立衛生研究所の実験動物の管理及び使用に関する指針の推奨事項に従って実行した。プロトコルは、ワシントン大学医学部の動物実験委員会により承認されているものであった（保証書番号Ａ３３８１－０１）。ウイルス接種は、塩酸ケタミン及びキシラジンによって導入及び維持された麻酔下で実施し、動物の苦痛を最小限にするためにあらゆる努力を行った。
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＢａｌｂ／ｃマウスを購入した（系統０００６５１）。雌マウス（１０～１１週齢）に、２．５×１０８ＰＦＵのＡｄＶ－ｈＡＣＥ２を鼻腔内投与する１日前に、抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂ（ＭＡＲ１－５Ａ３１３、Ｌｅｉｎｃｏ）の２ｍｇの単回の腹腔内注射を与えた。ＡｄＶ形質導入の５日後、マウスに４×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内経路によって接種した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒトｍＡｂ又はアイソタイプ対照ｍＡｂを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種の２４時間前に投与した。体重を毎日観察し、感染後の５又は７日目に動物を屠殺して組織を採取した。
ウイルス負荷の測定。組織を計量し、２％の加熱不活性化したＦＢＳを補充した１ｍｌのＤＭＥＭ培地中で、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のジルコニアビーズによってホモジナイズした。組織ホモジネートを１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により清澄化し、－８０℃で保存した。ＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａトータルＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ９６ウェル抽出装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＲＮＡを抽出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＮ９０８９４７）配列をガイドとして使用して、Ｎ遺伝子の保存領域を標的化するようにＴａｑＭａｎプライマーを設計した（Ｌプライマー；ＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡ；Ｒプライマー：ＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣ；プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＴＣＡＡＧＧＡＡＣ／ＺＥＮ／ＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／）。ＲＮＡ標準曲線を構築するために、ｇＢｌｏｃｋｓフラグメント（ＩＤＴ）内にＮ遺伝子の連結セグメントを生成し、これをＰＣＲ－ＩＩ ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ベクターを線状化して、インビトロでＴ７－ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写を行い、定量標準曲線のための材料を生成した。
サイトカイン及びケモカインのｍＲＮＡ測定。上に記載したように、７ｄｐｉで肺ホモジネートからＲＮＡを単離した。製造業者のプロトコルに従って、ＲＮａｓｅ阻害剤が追加されたＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＤＮａｓｅで処理したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＩＦＮγ（ＩＤＴ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．４１７６９２４０）、ＩＬ－６（Ｍｍ．ＰＴ．５８．１０００５５６６）、ＣＸＣＬ１０（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４３５７５８２７）、ＣＣＬ２（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４２１５１６９２に特異的な市販のプライマー／プローブセットを備えたＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してサイトカイン及びケモカインの発現を測定し、結果をＧＡＰＤＨ（Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．１）のレベルに標準化した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｍＡｂ治療マウス又はアイソタイプ対照ｍＡｂ治療マウスと無治療対照とを比較して、２－ΔΔＣｔ法を用いて倍数変化を測定した。
野生型マウスを用いたマウス実験。動物試験は、アメリカ国立衛生研究所の実験動物の管理及び使用に関する指針の推奨事項に従って実行した。プロトコルは、ＵＮＣチャペルヒル医学部の動物実験委員会により承認されているものであった（ＮＩＨ／ＰＨＳ動物福祉保証書番号は、Ｄ１６－００２５６（Ａ３４１０－０１）である）。ウイルス接種は、塩酸ケタミン及びキシラジンによって導入されて維持された麻酔下で実施し、動物の苦痛を最小限にするためにあらゆる努力を行った。
マウス適合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルス。ウイルスを前述の通りに生成した１４。１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩ及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中で培養したＶｅｒｏ Ｅ６細胞でウイルスを増殖させた。ウイルス力価をプラークアッセイによって測定した。要約すると、ウイルスを段階希釈してＶｅｒｏ Ｅ６細胞の融合性単層に播種した後、アガロースを重層した。ニュートラルレッド色素で染色した後、感染後の２日目にプラークが可視化された。
野生型マウス。Ｅｎｖｉｇｏの１２月齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを実験に使用した。実験が開始する前の少なくとも７２時間、マウスをＢＳＬ３内で馴化させた。感染の６時間前に、マウスを腹腔内注射による２００μｇのヒトモノクローナル抗体で予防的に治療した。翌日、マウスをケタミン及びキシラジンの混合物で麻酔し、ＰＢＳで希釈した１０５ＰＦＵのＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内感染させた。毎日の体重減少を測定し、感染後２日目のマウスを、組織を採取する前にイソフルランを過量投与することによって安楽死させた。
肺組織ホモジネートのプラークアッセイ。ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、右肺の下葉を１ｍＬのＰＢＳ中でホモジナイズした。ウイルスの連続希釈液をＶｅｒｏ Ｅ６細胞培養単層に滴定し、接種して２日後にニュートラルレッド染色によってウイルスプラークを可視化した。このアッセイの検出限界は肺当たり１００ＰＦＵである。
定量化及び統計分析。記載したように、連続変数のために記述統計学的な平均値±ＳＥＭ又は平均値±ＳＤを求めた。技術的反復と生物学的反復は、図の凡例に記載されている。マウス試験では、インビボにおける体重変化及びウイルス負荷の分析は、それぞれ二元配置ＡＮＯＶＡ検定及びマン・ホイットニー検定によって求めた。Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて統計分析を実施した。
オンライン方法のための参考文献
１ Ｚｏｓｔ ＳＪ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｈｅｎ ＲＥ，Ｃａｓｅ ＪＢ，Ｒｅｉｄｙ ＪＸ，Ｔｒｉｖｅｔｔｅ Ａ，Ｎａｒｇｉ ＲＳ，Ｓｕｔｔｏｎ ＲＥ，Ｓｕｒｙａｄｅｖａｒａ Ｎ，Ｃｈｅｎ ＥＣ，Ｂｉｎｓｈｔｅｉｎ Ｅ，Ｓｈｒｉｈａｒｉ Ｓ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ Ｍ，Ｃｈｕ ＨＹ，Ｄｉｄｉｅｒ ＪＥ，ＭａｃＲｅｎａｒｉｓ ＫＷ，Ｊｏｎｅｓ Ｔ，Ｄａｙ Ｓ，Ｍｙｅｒｓ Ｌ，Ｌｅｅ ＦＥ－Ｈ，Ｎｇｕｙｅｎ ＤＣ，Ｓａｎｚ Ｉ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＤＲ，Ｂａｒｉｃ ＲＳ，Ｔｈａｃｋｒａｙ ＬＢ，．Ｄｉａｍｏｎｄ ＭＳ，Ｃａｒｎａｈａｎ ＲＨ，Ｃｒｏｗｅ ＪＥ Ｊｒ．．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０５．１２．０９１４６２；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．１２．０９１４６２（２０２０）
２ Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｔａｂｌｅ ｆｕｒｉｎ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４９７，３３－４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１６．０６．０２２（２０１６）．
３ Ｗｒａｐｐ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１２６０－１２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７（２０２０）．
４ Ｏｈｉ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．＆Ｗａｌｚ，Ｔ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ６，２３－３４，ｄｏｉ：１０．１２５１／ｂｐｏ７０（２００４）．
５ Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ，Ｄ．Ｎ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５２，３６－５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｂ．２００５．０７．００７（２００５）．
６ Ｐｕｎｊａｎｉ，Ａ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｆｌｅｅｔ，Ｄ．Ｊ．＆Ｂｒｕｂａｋｅｒ，Ｍ．Ａ．ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，２９０－２９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４１６９（２０１７）．
７ Ｂｅｐｌｅｒ，Ｔ．，Ｎｏｂｌｅ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｔｏｐａｚ－Ｄｅｎｏｉｓｅ：ｇｅｎｅｒａｌ ｄｅｅｐ ｄｅｎｏｉｓｉｎｇ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｃｒｙｏＥＭ．ｂｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ：１０．１１０１／８３８９２０（２０１９）．
８ Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ－－ａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ２５，１６０５－１６１２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｃ．２００８４（２００４）．
９ Ｃｈｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．ＭＡｂｓ ７，４０３－４１２，ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１００８３５１（２０１５）．
１０ Ｙｕａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８，６３０－６３３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ７２６９（２０２０）．
１１ Ｉａｎｅｖｓｋｉ，Ａ．，Ｈｅ，Ｌ．，Ａｉｔｔｏｋａｌｌｉｏ，Ｔ．＆Ｔａｎｇ，Ｊ．ＳｙｎｅｒｇｙＦｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３，２４１３－２４１５，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｘ１６２（２０１７）．
１２ ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｆｏｒ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３６３，２１３９－２１４１，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（０４）１６５０６－９（２００４）．
１３ Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ １（ＩＦＮＡＲ－１） ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ２６，８０４－８１９（２００６）．
１４ Ｄｉｎｎｏｎ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｏｕｓｅ－ａｄａｐｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０５．０６．０８１４９７；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．０６．０８１４９７（２０２０）．
Figure 2023518849000006
Figure 2023518849000007
Figure 2023518849000008
Figure 2023518849000009
Figure 2023518849000010
Figure 2023518849000011
Figure 2023518849000012
Figure 2023518849000013
本明細書に開示及び特許請求される組成物及び方法の全ては、本開示の見地から過度な実験をすることなく作製及び実行することができる。本開示の組成物及び方法を好ましい実施形態の見地から説明してきたが、組成物及び方法に対して且つ工程又は本明細書に記載される方法の工程の順番において、本開示の概念、趣旨及び範囲を逸脱することなく変形形態を適用し得ることことは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的のいずれにも関連する特定の薬剤は、本明細書に記載される薬剤に置き換えられ得る一方、同一又は類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の置換形態及び修正形態は、添付の請求の範囲によって規定されるように、本開示の趣旨、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。
ＶＩＩ．参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものに例示的な手順又は他の詳細の捕捉を提供する点で特に参考として本明細書に組み込まれる。
米国特許第３，８１７，８３７号明細書
米国特許第３，８５０，７５２号明細書
米国特許第３，９３９，３５０号明細書
米国特許第３，９９６，３４５号明細書
米国特許第４，１９６，２６５号明細書
米国特許第４，２７５，１４９号明細書
米国特許第４，２７７，４３７号明細書
米国特許第４，３６６，２４１号明細書
米国特許第４，４７２，５０９号明細書
米国特許第４，５５４，１０１号明細書
米国特許第４，６８０，３３８号明細書
米国特許第４，８１６，５６７号明細書
米国特許第４，８６７，９７３号明細書
米国特許第４，９３８，９４８号明細書
米国特許第５，０２１，２３６号明細書
米国特許第５，１４１，６４８号明細書
米国特許第５，１９６，０６６号明細書
米国特許第５，５６３，２５０号明細書
米国特許第５，５６５，３３２号明細書
米国特許第５，８５６，４５６号明細書
米国特許第５，８８０，２７０号明細書
米国特許第６，４８５，９８２号明細書
“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８．
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Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３２，１５５－１７１，１９８５．
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Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ８，２７１－２８３，２０１０．
Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２；１３０（１），：１１１－１２１，１９９０．
Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｄｓ．ｐｐ．７５－８３，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８４．
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Ｄｅ Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３（２），１６５－１７９，１９９３．
Ｄｈｏｌａｋｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０６３８－２０６４２，１９８９．
Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７，２５７８－２５８６，２００３．
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ａｎｄ Ｂｅｎ－Ｚｅｅｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０９，：２１５－２３７，１９９９．
Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０，２５３６－２５４３，２００９．
Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐａｒｔ ＩＩ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐａｒｔ ＩＩＩ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；２００５．
Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１－２３６，１９７７．
Ｇｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｐｒｏｄ Ｍｅｄ．２０１６ Ｓｅｐ；３４（５）：２８５－２９２．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ １４．
Ｇｕｌｂｉｓ ａｎｄ Ｇａｌａｎｄ，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２４（１２），１２７１－１２８５，１９９３．
Ｈａｌｆｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１０；５（５）ｅ１０５６９
Ｈｅｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４９，１０１－４，２００７．
Ｋｈａｔｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２６，２１０－２１９，１９８９．
Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１０２１０－１０２１８，１９８９．
Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１－５１９，１９７６．
Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５－４９７，１９７５．
Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７（１）：１０５－１３２，１９８２．
Ｍａｎｓｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１６ Ｏｃｔ；１６（１０）：１１０６－７．
Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２７，１９８７．
Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，９９，１５３－１６１，１９８７．
Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：１，１９９７
Ｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９１，６１３－６３３，１９８３．
Ｐｕｒｐｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１６ Ｏｃｔ；１６（１０）：１１０７－８．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ １９．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，３：６２４－６５２，１９９０．
Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２８３２４－２８３３０，１９９６．
Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｕｕｇａｔｅｓ Ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｇｅｌ（Ｅｄ．），ＮＹ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２８，１９８７．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３６，１４２－１５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２００８．０４．００８，２００８．

Claims (69)

  1. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する単離抗体又は抗体フラグメントであって、
    （ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｇ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｈ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    （ｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；又は
    （ｊ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３
    を含む単離抗体又は抗体フラグメント。
  2. （ａ）配列番号３３のアミノ酸配列及び配列番号３４のアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列及び配列番号４０のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列及び配列番号２２のアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列及び配列番号２４のアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列及び配列番号２６のアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号２９のアミノ酸配列及び配列番号３０のアミノ酸配列；
    （ｈ）配列番号３１のアミノ酸配列及び配列番号３２のアミノ酸配列；
    （ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列及び配列番号３６のアミノ酸配列；又は
    （ｊ）配列番号３７のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列
    と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する重鎖及び軽鎖可変配列を含む、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  3. （ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｇ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｈ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；
    （ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列；又は
    （ｊ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列
    を含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  4. モノクローナルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  5. 前記抗体フラグメントは、組換えｓｃＦｖ（単鎖フラグメント可変）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦｖフラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  6. ＹＴＥ変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  7. ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ ＰＧ、Ｎ２９７、ＧＡＳＤ／ＡＬＩＥ、ＤＨＳ、ＹＴＥ又はＬＳ変異など、半減期を増加させ、且つ／又は治療効果を増加させるためにＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように変異されたＦｃ部分或いは酵素若しくは化学的付加又はグリカンの除去若しくは規定のグリコシル化パターンで改変された細胞株における発現など、ＦｃＲ相互作用を変化（排除又は増強）させるように改変されたグリカンを含むＩｇＧ又は組換えＩｇＧ抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  8. Ｖｅｒｏ－Ｅ２細胞培養単層を使用したフォーカス減少法による中和試験（ＦＲＮＴ）アッセイにおいて、生きたＢＳＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和することができ、任意選択的に、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記生きたＢＳＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの９６％を中和することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  9. ヒト受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の結合を遮断し、任意選択的に、ｈＡＣＥ２に対する活性をＩＣ５０＜１５０ｎｇ／ｍＬで遮断する、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  10. Ｄ６１４Ｇ置換を含むスパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和することができ、任意選択的に、前記スパイクタンパク質は、Ｅ４８４Ｋ置換を含まない、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  11. 「上向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  12. 「上向き」及び「下向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  13. 「下向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  14. 三量体スパイクタンパク質の外部ドメインに結合することができ、且つ単量体スパイクタンパク質のＲＢＤに結合することができ、任意選択的に、前記三量体スパイクタンパク質の外部ドメインへの前記結合及び／又は前記単量体スパイクタンパク質のＲＢＤへの前記結合は、ＥＣ５０＜２ｎｇ／ｍＬである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  15. 検出可能な標識を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  16. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を治療するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１の抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む方法。
  17. ６０歳以上の対象、易感染性の対象又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているか若しくは感染するリスクのある、呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患う対象の健康を保護する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１の抗体又は抗体フラグメントを前記対象に送達することを含む方法。
  18. 前記対象に第２の抗体又は抗体フラグメントを送達することを更に含み、任意選択的に、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントである、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を治療するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減する方法であって、前記対象に第１の抗体又は抗体フラグメント及び第２の抗体又は抗体フラグメントを送達することを含み、前記第１及び第２の抗体又は抗体フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和において相乗的である、方法。
  20. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、１７．４の相乗効果スコアを有する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントの用量は、ウイルス中和において同じ効力を達成するために、前記第１の抗体若しくは抗体フラグメント又は前記第２の抗体若しくは抗体フラグメント単独の用量の３倍超だけ減少され得る、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、「上向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができ、且つ「下向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができない、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、「上向き」及び「下向き」の両方の立体構造でＲＢＤに結合することができる、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、ＲＢＤへの結合について競合しない、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記送達は、前記対象におけるＩＮＦ－γ、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ２の発現を低減する、請求項１６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記送達は、静脈内である、請求項１６～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記対象は、６０歳以上であるか、易感染性であるか、又は呼吸器障害及び／若しくは心血管障害を患っている、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記送達は、無治療対照と比較して前記対象の呼吸を改善する、請求項１６～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記送達は、無治療対照と比較してウイルス負荷を低減する、請求項１６～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記送達は、感染前である、請求項１７～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記送達は、感染後である、請求項１７～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体又は抗体フラグメントを含むワクチン製剤。
  37. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントを更に含み、任意選択的に、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントである、請求項３６に記載のワクチン製剤。
  38. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを含むワクチン製剤。
  39. 前記発現ベクターは、シンドビスウイルスベクター又はＶＥＥベクターである、請求項３８に記載のワクチン製剤。
  40. 針による注射、ジェット注射又はエレクトロポレーションによる送達のために製剤化される、請求項３８又は３９に記載のワクチン製剤。
  41. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントをコードする１つ以上の発現ベクターを更に含み、任意選択的に、前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントである、請求項４０に記載のワクチン製剤。
  42. 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＣＯＶＩＤ－１９感染症を検出する方法であって、
    （ａ）前記対象由来の試料を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメントに接触させることと、
    （ｂ）前記試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原への前記抗体又は抗体フラグメントの結合により、前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することと
    を含む方法。
  43. 前記試料は、体液である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記試料は、血液、痰、涙液、唾液、粘液又は血清、精液、頸管粘液又は膣分泌物、羊水、胎盤組織、尿、滲出液、漏出液、組織擦過物又は糞便である、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. 前記検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテラルフローアッセイ又はウエスタンブロットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断する方法であって、
    （ａ）前記抗原を含む試料を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメントに接触させることと、
    （ｂ）前記抗原への前記抗体又は抗体フラグメントの検出可能な結合により、前記抗原の抗原完全性、正しい立体構造及び／又は正しい配列を判断することと
    を含む方法。
  47. 前記試料は、組換え産生された抗原を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記試料は、ワクチン製剤又はワクチン製造バッチを含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴法若しくはバイオレイヤー干渉法を用いるバイオセンサー又はフローサイトメトリー染色を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記抗原の抗原安定性を経時的に判断するために、工程（ａ）及び（ｂ）を２回実行することを更に含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むハイブリドーマ又は改変細胞。
  52. 単離ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント又はそれを産生するハイブリドーマ若しくは改変細胞であって、前記抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント又はそれを産生するハイブリドーマ若しくは改変細胞。
  53. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする核酸配列及び／又は前記抗体若しくは抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
  54. 配列番号１～２０のいずれか１つの配列を含む、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. 請求項５４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  56. 請求項５３若しくは５４に記載のポリヌクレオチド、請求項５５に記載のベクター又は請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む第１のベクター及び前記抗体若しくはその抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む第２のベクターを含む宿主細胞。
  57. 抗体又は抗体フラグメントを作製する方法であって、（ａ）請求項５６に記載の細胞を培養することと、（ｂ）前記培養された細胞から前記抗体又はその抗体フラグメントを単離することとを含む方法。
  58. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第１の抗体又は抗体フラグメントと、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントとを含む組成物であって、任意選択的に薬学的に許容される組成物である組成物。
  59. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第１の抗体又は抗体フラグメントと、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２表面スパイクタンパク質に結合する第２の抗体又は抗体フラグメントとを含むキットであって、任意選択的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象を治療するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に罹患するリスクのある対象の感染の可能性を低減するために、前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントを使用するための指示書を更に含むキット。
  60. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、１７．４の相乗効果スコアを有する、請求項５８又は５９に記載の組成物又はキット。
  61. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントの用量は、ウイルス中和において同じ効力を達成するために、前記第１の抗体若しくは抗体フラグメント又は前記第２の抗体若しくは抗体フラグメント単独の用量の３倍超だけ減少され得る、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  62. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、「上向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができ、且つ「下向き」の立体構造でＲＢＤに結合することができない、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  63. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、「上向き」及び「下向き」の両方の立体構造でＲＢＤに結合することができる、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  64. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、ＲＢＤへの結合について競合しない、請求項５８～６３のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  65. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、請求項５８～６４のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  66. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む、請求項５８～６５のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  67. 前記第１の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  68. 前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の組成物又はキット。
  69. 前記第１の抗体又は抗体フラグメント及び前記第２の抗体又は抗体フラグメントは、別々の容器内にある、請求項５９～６８のいずれか一項に記載のキット。
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