JP2023518659A

JP2023518659A - 結腸癌に対する抗潰瘍性及び化学的防御効果を有する経口懸濁液及びその調製方法

Info

Publication number: JP2023518659A
Application number: JP2022547267A
Authority: JP
Inventors: カナヴァシオロ，ビクトルルイスゴンザレス; ムリルロ，ロクサナヴィンセント; ザモラ，レイネリオロドリゲス; グエルラ，ニウルカベニテッツ; レイエス，エデュアルドアントニオロドリゲス; キュエバス，ビビアンモリナ; カスターノ，サラヒメンドーサ; イエラ，アムバーオヤルザバル
Original assignee: セントロナシオナルデインヴェスティガシオンズシエンチフイカス; エムプレッサラボラトリオファーマシューチコリクイドスオラレスメディリップ
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2023-05-08
Also published as: CN115087432A; WO2021155871A1; EP4101444A1; CU20200007A7; CA3169969A1; AU2020427452A1; EP4101444A4; AU2020427452B2; CU24638B1; KR20230129150A; US20230071637A1

Abstract

【課題】胃潰瘍及び結腸癌の予防及び治療のための経口水性懸濁液からなる新規医薬組成物若しくは栄養補助食品、ならびにそれを調製するための手順が開示される。【解決手段】この懸濁液からなる医薬若しくは栄養補助食品は、ミツバチワックスからの脂肪アルコールの精製抽出物、微結晶性セルロース、及び製薬業界によって受け入れられている賦形剤を含有することを特徴とする。この懸濁液を調製する方法は脂肪アルコール抽出物（脂肪アルコールの精製抽出物ともいう）を、乳化剤の存在下、＞1000rpmで＜1. 5マイクロメートルに粒径を減少させるプロセスに供することを特徴とし;前記活性成分と微結晶性セルロースとの、それらが製剤化される割合及び濃度での混合物はこれらの成分を相乗的に作用させ、この組成物に強力な抗潰瘍及び化学的防御効果を付与する。

Description

本発明は、経口水性懸濁液からなる新規な医薬組成物、並びにその製造方法に関する。本懸濁液は、胃粘膜に対する抗潰瘍作用及び結腸癌に対する化学防御作用を有し、(Apis mellifera)ミツバチの精製ワックス（単に、ワックス若しくはミツバチワックスともいう）からの脂肪アルコールを含む精製抽出物(以下、脂肪アルコールの抽出物若しくは脂肪アルコール抽出物という)を活性成分として含有することを特徴とし、その粒径は、技術的手法により＜1.5μmに縮小されている。

精製されたワックスの抽出物は、脂肪アルコールに加えて、少量の成分として脂肪酸のジオール、パラフィン及びカリウム塩を含有する。

この新規組成物は、又、脂肪アルコールの抽出物の粒径を減少させる工程において使用される1つ以上の乳化剤、ならびに保湿剤、甘味剤、懸濁化剤、保存剤、香味剤及び水を含む、製薬産業によって受け入れられている一連の賦形剤を含有しうる。

胃潰瘍は、粘膜層、時には胃の筋層まで広がる傷害であり、その周囲に急性及び慢性の炎症を伴う空洞を形成し、これは、その主要な合併症の1つ、消化管出血の主な原因である (Valley 2002, Sadic 2009)。

他の合併症としては、穿孔、穿通、及び閉塞が挙げられ、これらは全て、患者の生活の質の著しい障害をもたらす(Sung 2010)。

潰瘍は、攻撃的因子(酸分泌、ペプシン、ヘリコバクター・ピロリ、非ステロイド性抗炎症薬)と防御因子(粘液及び重炭酸塩分泌、血液微小循環、プロスタグランジン、成長因子)との間の不均衡、すなわちヘリコバクター・ピロリ感染と、非ステロイド性抗炎症薬の継続的使用が主な原因である(Ramakrishnan 2007)。

H. pylori除菌療法の現在の進歩にもかかわらず、消化性潰瘍合併症による死亡率は安定したままである。

臨床診療において、胃潰瘍の治療のために最も一般的に使用される薬物はプロトンポンプ阻害剤及びH2受容体アンタゴニストであるが、これらは悪心、便秘、女性化乳房及びインポテンス等の様々な有害作用を有する(Forgerini 2018)。

これらの影響は、それらの使用を制限し、抗潰瘍剤として有効であり、より高い安全性プロファイルを有する新規医薬組成物の探索及び使用を正当化する。

抗潰瘍物質の可能性を研究するために最も広く使用されている薬理学的モデルは、評価される物質が、その抗潰瘍効果を発揮する可能性のある異なる機構をカバーする方法として、アルカリ性物質、エタノールによる、又は幽門結紮による、潰瘍の誘発である。

一方、癌は現在の主要な死因の1つであり、世界中で毎年800万人を超える死亡を伴っており、結腸癌は、増加傾向にある、世界中の、特に、より少ない財源の国々において、5つの主要な死因の1つである (Torre 2015、Chatenoud 2014)。

この疾患の高い発生率、ならびにその治療方法は、一般的に外科的であり、続いて化学療法であるという事実を考慮すると、消化管における潰瘍性プロセス(潰瘍性大腸炎、クローン病及びその他)等、この種の癌を有するか又はその危険因子を有する患者の予防及び治療に使用することができる化学的防御医薬組成物の探索及び使用が正当化される。

この疾患に対する潜在的な化学的防御物質の研究のために最も広く使用されている薬理学的モデルは、癌誘導剤の使用に基づくものである。

後者の中で、最も有効で使用されるもの1つは、1,2-ジメチルヒドラジンである。この発癌物質の代謝は、誘導の数時間以内に結腸細胞に対して細胞毒性物質を生成し始める(Corpet 2003, Reddy 2004)。

胃潰瘍及び結腸癌は、生活の質に影響を及ぼし、それを患う人々の死亡を引き起こす可能性があり、世界的に重要な健康問題を構成すること、ならびに既存の従来の療法が、その臨床的使用を制限する様々な有害作用に関連し、及びこれらの疾患の発生を治癒又は予防することを、必ずしも意図しないという事実から、両方の医学的状態のための有効な治療剤を探索することが必要である。

新しい安全で効果的な抗潰瘍及び抗癌治療戦略の必要性は、今日的問題である。
本発明の組成物の調製において使用される精製ワックスの精製抽出物、ならびにその製造方法は以前に特許を受けており、前記抽出物は抗炎症活性を有する胃潰瘍及び十二指腸潰瘍の治療のための高級第一級脂肪族アルコールの天然混合物として権利化されており、その最も適切な投与形態は錠剤、丸剤又はカプセル剤(CU 22412 A1：参考ファミリー US6235795B1 及び US6465526B1)の形態、すなわち、完成した固体形態であった。

上記に従い、脂肪アルコールの50mgの用量に標準化されたこの活性成分を有する錠剤は、機能性食品又は代替医薬品としてキューバ及び他の国で栄養補助食品として登録された。

しかしながら、この製剤は、以下のようないくつかの欠点を有する；
大量の賦形剤及び高い製造コストをもたらす大きなサイズ(655mg);その賦形剤の2つ(クロスカルメロースナトリウム及びポリビニルピロリドン)の使用の異なる国における拒絶反応の増加;及びそれが含有する脂肪アルコールの非常に低いバイオアベイラビリティ(＜10%)。

前記錠剤の抗潰瘍剤としての薬理学的効力は、本発明の懸濁液によって達成される効力よりもはるかに低いことに留意すべきである。

本発明の脂肪アルコールの抽出物が特定の乳化剤の存在下で、攪拌による温度変化によって剪断又は沈殿の技術的プロセスに供され、その粒径を減少させ、その後、微結晶性セルロースと、ある割合及び特定の濃度で混合された水性懸濁液中に製剤化される場合、その薬理学的有効性は相乗的に増強され、これは、従来技術からは、予測できないものであった。

本発明の水性懸濁液の目的は、錠剤形態の脂肪アルコールの抽出物及び微結晶性セルロースの両方の抗潰瘍効果を著しく上回り、これらの2つの物質のいずれについても以前に報告されていなかった結腸癌に対する強力な化学的防御効果を有していることであり、これは実施例において確認することができる。

一方、微結晶性セルロース(αセルロース由来)は、主に、化粧品、洗剤のためのクリーム及び固体懸濁液の製造において、ならびに食品における安定剤として使用されている(Nsor-Atindana、2017年)。

製薬業界では、圧縮及び充填剤として錠剤及びカプセル剤の調製に使用されるが、その胆汁酸封鎖能も報告されており(Paniagua 1999)、12%用量で抗潰瘍効果を有する懸濁液中の活性成分として使用されている(Barzaga 2004)。

前記12%懸濁液について報告された薬理学的効果は、実施例3に見られるように、微結晶性セルロースのはるかに低い用量である(≦2%)本発明に係る懸濁液で達成されたものよりも、はるかに低いことに留意すべきである。

これは微結晶性セルロースが、特定の割合及び濃度でワックス(ミツバチワックス)からの脂肪アルコールの精製抽出物と混合されるときに生じる相乗効果の結果であり、これはその抗潰瘍効果を増強し、組成物を、従来の製剤では見られなかった結腸癌に対して強力な化学的防御効果を獲得させるものであり、これは従来技術からは導くことはできなかった。

製薬産業における精製ワックス（精製ミツバチワックス)及び微結晶セルロースの使用は、これまで、その製剤が活性成分の制御放出を可能にする固形薬剤の製剤(Kallai 2010; Reiner, 2018)、又は坐剤もしくは他の製剤における不活性充填-賦形剤(Lee, 2018)としての2つの使用〔精製ワックス（精製ミツバチワックス)及び微結晶セルロース〕に限定されてきた。

２つの物質が、相乗的に作用し、強力な抗潰瘍及び化学的防御効果を組成物に提供するという、水性懸濁液中の、ワックス（精製ミツバチワックス) からの脂肪アルコールの抽出物及び微結晶性セルロースの併用については、本発明の前には報告されていない。

錠剤(CU 22412 A1)の形態で２つの物質を使用する場合、実施例に見られるように、本発明に記載される水性懸濁液で観察される効果は、達成されない。

CU22412A1公報ファミリー US6235795B1 及び US6465526B1)

Revista Cubana De Farmacia, 2004, Vol.38, No.2

本発明の医薬組成物を得るための手順は、以下によって特徴づけられる：
A) 乳化剤として使用される物質、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油性若しくはポリソルベート(2～4%)と、ミツバチワックスから抽出された脂肪アルコールの抽出物（1～2％）とを混合すること;
B) 抽出物の粒径を＜1. 5マイクロメートルに減少させるための技術的プロセスに供すること、これは＞1000rpm及び＞80℃で＞1分間、粒子を剪断することができる均質化装置を用いて行う、又は前記調製された混合物を＞1000rpm及び＞80℃で＞1分間処理後、同じ撹拌速度で温度を＜60℃に下げることによって行う;
C) 攪拌しながら、以下をいれ込む：第2の活性成分として微結晶性セルロース(1～2%)、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン(methyl and propyl parabens)(0.1～0.6%)、保湿剤としてグリセリン(20～30%)、甘味剤としてソルビトール又はサッカリンナトリウム(1～6%)), 懸濁化剤としてのカルボキシメチルセルロース(0.1～1%)、香味剤としての精油(0.01～0.05%)及び精製水(50～70%)。

この方法の結果、得られるものは、活性成分(脂肪アルコールの抽出物及び微結晶性セルロース)が相乗的に作用し、強力な抗潰瘍及び化学的防御効果を与える、経口使用のための水性懸濁液であることを特徴とする新規医薬組成物である。

この新規医薬組成物は、消化管に対するその保護的性質、及び結腸癌に対するその化学的保護効果を考慮して、潰瘍性プロセス及び他の関連状態を予防又は治療することを可能にする。

前記活性成分が、この医薬組成物中に存在する割合は、それが含有する活性成分の相乗作用の結果をもって所望の薬理学的効果をえることを保証する特定の濃度及び割合であり、最終組成物中の活性成分及び賦形剤の両方の含有量を特定化・標準化するために実施されるいくつかの検討の結果である。

本発明の組成物の強力な薬理学的効果は、本発明の組成物中に個々に存在する用量よりも高い用量によって、両方の活性成分を、別々に投与する場合での、効果よりもはるかに高い。このことは、本願の実施態様において確認でき、先行知見から損なわれることのない、本発明の組成物の相乗効果の発生が実証された。

この組成物の他の既存の組成物に対する利点は、その抗潰瘍効果が、50mgのワックス（ミツバチワックス）脂肪アルコールを含む現在(医療で使用される)登録されている錠剤のそれよりも優れており、又、その効果が、以前に報告された12%微結晶性セルロース懸濁液のそれよりも優れていることであり、言い換えれば、本組成物は、活性成分のより低い用量でさえも、両方の以前の製剤のそれよりもはるかに高い抗潰瘍効果を有する。

一方、本組成物は、実施例6に見られるように、大腸癌に対して効果的な化学的防御効果を有し、両方の活性成分を別々に類似の懸濁液中で調製したものよりも有意にその効果が高いことが示された。

この効果は、ミツバチワックスの精製抽出物又は微結晶性セルロースについて、以前には観察されておらず、これは本発明の懸濁液による、対象における両方の物質（活性成分）の相乗作用の結果である。
さらに、この懸濁液の工業的製造は、50mgの脂肪アルコールを含む錠剤の製造よりも安価であり、現在の製薬産業での使用に制限のある賦形剤を含有しない。

本発明は、工業的用途を有し、組成物は、新規であり、懸濁液自体及びその製造方法の両方が、進歩性を有すると思料される。というのも、2つの異なる抗潰瘍活性成分の混合物が、特定の割合及び濃度で、そのどちらも発癌過程での化学的保護効果について開示されていないという先行技術の状態において、胃潰瘍に対する薬理学的利益及び結腸癌に対する化学的保護効果における相乗効果を示したことは、当技術分野の現状からは到底想定できないのであるから、進歩性があると思料される。

本発明は得られた組成物が、消化管に対するその有益な予防効果のために栄養補助食品として使用することができ、又、潰瘍及び癌の治療のための医薬としても使用することができることから、食品及び製薬産業に寄与する。

50 L容量(R1)の補助ステンレス鋼容器中に、12 Lの精製水を添加し、1kgの微結晶性セルロースを、少しずつ、間隔をおいて、撹拌しながら投入した。均質なペーストが得られるまで、それを60rpmで30分間撹拌した。5kgの70%ソルビトール及び24kgのグリセリンを撹拌しながら添加し、撹拌を10分間続けて混合物1(M1)を得た。
一方、300 L容量のステンレス製反応器では、60 Lの水を90℃に加熱し、補助容器(R2)に10Lを分離し、1200rpmで攪拌しながら3kgのポリソルベート80を混入し、1200rpmで5分間攪拌した。1.2kgの脂肪族アルコールの精製抽出物（脂肪アルコールの抽出物ともいう）を少しずつ、間隔をもって加え、攪拌を10分間維持して混合物2(M2)を得た後、攪拌を維持しながら30±2℃に下げた。
別の容器において、0.18kgのメチルパラベン及び0.02kgのプロピルパラベンを、60rpmで撹拌しながら1.5リットルのエタノールに溶解した。0.2kgのカルボキシメチルセルロースナトリウムA/Vを湿らせ(were moistened)、0.03kgの香味剤を加え、5分間撹拌して混合物3(M3)を得た。
別の5L補助容器中で、1kgのグリセリンを0.5Lのエタノールと混合し、60rpmで5分間撹拌して混合物4(M4)を得た。
混合物M2が得られた反応器中に、M1が投入され、R2で分離された水の最小量で残渣をドラッグ（drag:掻き出す、ともいう）し、60rpmで10分間撹拌した。この時間の後、M3を投入し、残渣をM4でドラッグした。その後、懸濁液の残りを、R2中にある温水でドラッグし、10分間撹拌した。次いで、撹拌を停止し、混合物を10時間静置した。この時間の後、残りのアルコールを懸濁液の表面に振りかけ(was sprinkled)、水でマークに合わせて100リットルの懸濁液を完成させた。これを1200rpmで5分間撹拌し、懸濁液を濾過し、品質管理のために試料を採取した。最終調製物を、プラスチックスクリューキャップで覆われたアンバーガラス瓶に詰め、瓶を室温で保管した。

50 L容量(R1)の補助ステンレス鋼容器において、12 Lの精製水を添加し、1kgの微結晶性セルロースを、間隔をおいて、40rpmで撹拌しながら、少しずつ投入した。均質なペーストが得られるまで、それを30分間撹拌した。攪拌しながら70%ソルビトール5kg及びグリセリン24kgを加え、40rpmで10分間攪拌して混合物1(M1)を得た。
一方、ポリトロン型ホモジナイザーシステムを備えた300 L容量のステンレス鋼製反応器では、60 Lの水を90℃に加熱し、10Lを補助容器(R2)に分離し、攪拌しながら投入した。9000rpmで、 3kgのクレモファーRH 40を5分間撹拌した。1.2kgの脂肪アルコールの精製抽出物を少しずつ、間隔をもって加え、攪拌を10分間維持して混合物2(M2)を得た後、攪拌を維持しながら30±2 ℃に下げた。
別の容器において、0.18kgのメチルパラベン及び0.02kgのプロピルパラベンを、40rpmで撹拌しながら1.5リットルのエタノールに溶解した。0.3kgのカルボキシメチルセルロースナトリウムA/Vを湿らせ(were moistened)、0.03kgの香味剤を加え、5分間撹拌して混合物3(M3)を得た。別の5L補助容器中で、1kgのグリセリンを0.5Lのエタノールと混合し、5分間撹拌して混合物4(M4)を得た。
混合物M2が得られた反応器中に、M1が投入され、R2で分離された水の最小量で残渣をドラッグし、40rpmで10分間撹拌した。この時間の後、M3を組み込み、残渣をM4でドラッグした。続いて、懸濁液の残りを、R2中にある温水でドラッグし、1000rpmで10分間撹拌した。次いで、撹拌を停止し、混合物を12時間静置した。この時間の後、残りのアルコールを懸濁液の表面に振りかけ(was sprinkled)、水でマークに合わせて100リットルの懸濁液を完成させた。これを1000rpmで5分間撹拌し、懸濁液を濾過し、品質管理のために試料を採取した。最終調製物を、プラスチックスクリューキャップで覆われたアンバーガラス瓶に詰め、瓶を室温で保管した。

実施例1で得られた組成物(以下、FAMC)を、動物を用いた前臨床試験に供し、その抗潰瘍効果を、登録された脂肪アルコール錠剤(以下、RAT)、及び脂肪アルコール(以下、FA)と微結晶セルロース(以下、MC)の各懸濁液(後者の2つは、FAMC懸濁液中の両方の物質の用量に等しい用量のFA及びMCで調製した)の抗潰瘍効果と比較した。この試験で用いた実験モデルは、水酸化ナトリウムによるラットの胃潰瘍の誘発であった。雄Sprague‐Dawleyラット(250～300g)を用い、これを20～25℃、相対湿度60±5%、明/暗サイクル12時間で通常の実験室条件に7日間適合させ、水に自由にアクセスし、ロッド用標準飼料を用いた。
隔離終了後、動物を無作為に10の実験群(10匹/群)に分けた：ビヒクルのみを投与した陰性対照群及び0.2N水酸化ナトリウムで潰瘍を誘導した9群（陽性対照群）、この陽性対照群のうちいずれの抗潰瘍剤も投与していない群及び表1に示すように評価すべき物質を投与した8群。
懸濁液をそのまま投与し、一方、RATをアカシアガム/水ビヒクル(1%)中で調製した。陰性対照群(水酸化ナトリウムによる損傷を受けていない)、及び陽性対照群(損傷を受けている、及び任意の物質による治療を受けていない)の使用は実験条件下でのモデルの妥当性を確証し、評価された物質の抗潰瘍効力を比較することを可能にした。全ての処置及び水酸化ナトリウムは、胃内挿管によって単回用量として経口投与された。選択された用量は、以前の予備的経験において証明された有効用量の範囲内である。胃潰瘍を誘発するために、動物を実験前に24時間絶食させ、水を自由に摂取させた。ビヒクルの単回投与及び異なる治療の1時間後、各ラットに胃挿管により潰瘍誘発剤(1mL/200g)を投与した。1時間後、ラットをハロタン雰囲気中で屠殺し、胃を取り出し、大わん曲部で開いた。胃粘膜病変を、2人の独立した盲検観察者によって定量化した。病変スコアは、mm²単位の病変サイズの合計として定義した(Ohara 1992)。異なる群における平均潰瘍面積間の統計的比較を、ノンパラメトリックマン・ホイットニーU検定を用いて行った。先験的に、α=0.05の有意水準を設定し、市販のWindows用パッケージStatistic(Release 4.2, StatSoft, Inc USA)を使用した。
表1：ラットの水酸化ナトリウム誘発胃潰瘍に対するFAMC、MC、FA懸濁液、及びRATの影響。

表1に示されるように、NaOH(0.2N)の経口投与は、健常動物(陰性対照)と比較して陽性対照群の動物において胃病変を生じ、これは実験条件におけるモデルの妥当性を実証する。FAMC, FA, RATの経口投与は、胃潰瘍指数を低下させたが、CMは有意ではないわずかな低下のみをもたらした。
FAMC懸濁液(25及び200mg/kg)は、胃潰瘍指数の低下をもたらし、これは陽性対照群との比較だけでなく、同じ用量のMC、FA及びRAT懸濁液と比較しても有意であった。したがって、FAMC懸濁液で最も高い抗潰瘍効果が達成されたが、それは特に、試験した最高用量200mg/kgで胃潰瘍指数の～100%(総数)阻害をもたらしたからである。
さらに、FAMC懸濁液は、MC及びFA懸濁液を別々に用いて達成されたものの合計よりも高い阻害パーセンテージをもたらし、FAMCにおいて相乗作用を示し、FA抽出物及びMCの存在は、表示する割合及び濃度において、より大きな抗潰瘍効力を促進する。又、FAMC懸濁液の抗潰瘍効果は、いずれもアルカリ性胃炎潰瘍誘発モデルにおいて評価された12% CM懸濁液(Barzaga 2004)について報告された効果よりもはるかに高いことに留意すべきである。
したがって、25及び200mg/kgのFAMC懸濁液(それぞれ、86.5及び98.6%)で達成された阻害の割合は、より高い用量(356.38mg/kg)で50%であったMC(Barzaga 2004)について報告されたものよりも高く、これは、この実施例で観察されたFAMCの相乗効果と一致する。又、本実施例において、試験した最低用量の25mg/kgのFAMC懸濁液は、胃潰瘍に対して86.5%の高い阻害率をもたらし、これは、高い有効性に加えて、FAMC懸濁液も高い力を有することを示すことにも留意する価値がある。

実施例2で得られた組成物(FAMC)を、動物を用いた前臨床試験に供し、その抗潰瘍効果を、登録された脂肪アルコール錠剤(RAT)、ならびに脂肪アルコール(FA)及び微結晶セルロース(MC)の各懸濁液(後者の2つは、FAMC懸濁液中の両方の物質の用量に等しい用量のFA及びMCで調製された)の抗潰瘍効果と比較した。
この試験で用いた実験モデルは、エタノールによるラットの胃潰瘍を誘発したものであった。雄Sprague-Dawleyラット(250～300g)を使用し、これを20～25℃、相対湿度60±5%、明/暗サイクル12時間で通常の実験室条件で7日間適応させ、げっ歯類のための水及び標準飼料を自由に摂取させた。
隔離終了後、動物を無作為に11の実験群(10匹/群)に分けた：表2に示すように、ビヒクルのみを投与した陰性対照群及び60%エタノールで潰瘍を誘導した10群、これらのうちいずれの抗潰瘍剤でも処置していない陽性対照群、評価対象物質で処置した8群、及び参照物質としてオメプラゾールで処置した群。
懸濁液をそのまま投与し、一方、1%アカシアガムを含む懸濁液中で錠剤を調製した。陰性対照群(エタノールによる損傷を受けていない)、並びに陽性対照群(損傷を受けている、及び任意の物質による治療を受けていない)の使用は、モデルの機能を検証し、評価された物質の抗潰瘍効果を比較することを可能にした。
全ての処置及びエタノールは、胃内挿管によって単回用量として経口投与された。選択された用量は、以前の予備的経験において検証された有効用量の範囲内であり、オメプラゾール(20mg/kg)の用量も、又、このモデルにおいて有効であった。
胃潰瘍を誘発するために、動物を実験前に24時間絶食させ、水を自由に摂取させた。ビヒクルの単回投与及び異なる治療の1時間後、各ラットに胃挿管により潰瘍誘発剤(1mL/200g)を投与した。1時間後、ラットをハロタン雰囲気中で屠殺し、胃を取り出し、大わん曲部で開いた。胃潰瘍指数の定量化は、実施例3に記載されるように行った。
エタノール誘発潰瘍指数に関する結果(表2)は、エタノールの経口投与が陰性対照群(健常)の動物と比較して、陽性対照群の動物において胃病変の形成をもたらしたことを示す。25及び200mg/kgの用量で、FAMC懸濁液で処置した動物は、損傷を有する動物(陽性対照)と比較してより低い潰瘍指数を示した。
前記懸濁液による治療は、胃潰瘍指数を顕著かつ有意に減少させ、25及び200mg/kgの用量でそれぞれ93.95%及び99.85%阻害に達した。使用した異なる処置の効果の間の統計的比較は同様の用量で有意な差異を示し、FAMC懸濁液が最良の結果を示し、FA及びMC懸濁液の阻害のパーセンテージの合計よりもさらに高く、胃粘膜のより大きな保護を示すことが強調して確認された。
使用した標準物質(オメプラゾール)も胃潰瘍指数を減少させ、これは、本発明者らの実験条件で得られた結果の妥当性を裏付ける。FAMC懸濁液は両方の物質を比較する試験の目的ではなかったので、同じ用量では投与されないが、オメプラゾールのものよりも優れた効果を達成したことは注目に値する。
表2：
ラットにおけるエタノール誘発性胃潰瘍に対するFAMC、MC、FA懸濁液、及びRATの影響。

この実施例に提示された試験の結論として、FAMC懸濁液を用いた経口投与は、ラットにおいてエタノールによって誘導される胃潰瘍の形成を顕著かつ有意に阻害し、登録された錠剤及び同じ用量の懸濁液FA及びMCを用いて達成されたものよりも高い効力を有することが確認され得る。
さらに、FAMC懸濁液の有効性は、評価された両方の個々の用量におけるFA及びMC懸濁液の有効性の合計よりも大きいことが観察され、これは本発明の組成物の目的における相乗効果の存在を実証する。

実施例2で得られた組成物(FAMC)を、動物を用いた前臨床試験に供し、その抗潰瘍効果を、登録された脂肪アルコール錠剤(RAT)、ならびに脂肪アルコール(FA)及び微結晶セルロース(MC)の各懸濁液(後者の2つは、FAMC懸濁液中の両方の物質の用量に等しい用量のFA及びMCで調製された)で比較された。
この検査で用いた実験モデルは、先の実施例で示したモデルとは異なり、酸依存性モデルである幽門の結紮によるラットにおける胃潰瘍の誘発のモデルであった。雄Sprague-Dawleyラット(250～300g)を使用し、これを20～25℃、相対湿度60±5%、明/暗サイクル12時間で通常の実験室条件で7日間適応させ、げっ歯類のための水及び標準飼料を自由に摂取させた。
隔離終了後、動物を11の実験群(10匹/群)に無作為に分けた：表3に示すように、ビヒクルのみを投与した陰性対照群及び幽門結紮により潰瘍を誘発した10群、これらのうちいずれの抗潰瘍剤で処置していない陽性対照群、評価対象物質で処置した8群、及び参照物質としてオメプラゾールで処置した群。
懸濁液をそのまま投与し、一方、1%アカシアガムを含む懸濁液を調製して錠剤を投与した。陰性対照群(幽門結紮を受けていない)及び陽性対照群(損傷を受けている、及び任意の物質による治療を受けていない)の使用はモデルの機能を検証し、評価された物質の抗潰瘍効力を比較することを可能にした。全ての治療は、胃内挿管によって、単回用量として経口投与された。選択された用量は、あらかじめおこなった予備的経験において検証された有効用量の範囲内であり、オメプラゾール(20mg/kg)の用量も、又、このモデルにおいて有効であった。胃潰瘍を誘発するために、動物を実験前に24時間絶食させ、水を自由に摂取させた。
ビヒクルの単回投与及び異なる治療の1時間後、動物を、チオペンタールナトリウム(35mg/kg)を腹腔内注射することによって麻酔し、2cm長の切開を、線状腹部中膜の前3分の1に行い、胃の位置を特定し、絹縫合糸No.2を用いて幽門括約筋を結紮し、腹壁を絹糸で縫合した。1時間後、ラットをハロタン雰囲気中で屠殺し、胃を取り出し、胃液を試験管に回収した。後者を3000rpmで遠心分離し、上清を分離し、mlで定量した。実施例3に記載のように、胃を大わん曲部を通して開き、胃潰瘍指数を定量化した。
幽門結紮により誘発された潰瘍指標(表3)の結果は、胃病変の形成が、陰性対照群(健常)の動物に対して、陽性対照群の動物で起こったことを示す。25及び200mg/kgの用量で、FAMC懸濁液で処置した動物は、損傷を有する動物(陽性対照)と比較してより低い潰瘍指数を示した。前記懸濁液による治療は、胃潰瘍指数を顕著かつ有意に減少させ、25及び200mg/kgの用量でそれぞれ76.3%及び99.7%阻害に達した。
同様の用量での異なる治療での効果の統計的比較は、FAMC懸濁液が、RATよりも有意に優れているので、最大の抗潰瘍効果を示すことが評価された物質であり、FA及びMCのそれぞれの単剤療法を有する懸濁液よりもそれぞれ優れていることを示した。さらに、FAMC懸濁液によって達成された阻害が、MC及びFAを用いて個々に達成された阻害の合計よりも大きかったという事実は、FAMC懸濁液の混合物でのこれらの2つの成分の存在の相乗効果を実証する。
一方、対照物質であるオメプラゾールは、胃潰瘍指数を有意に減少させ、これは我々の実験条件で得られた結果の妥当性を裏付ける。胃液の容量は、FAMC, MC, FAの懸濁液やRATでは効果を発揮せず、これらの物質の抗潰瘍作用は胃酸生成に依存しないことが示唆された。オメプラゾールのみが、この変数を減少させ、これは、抗分泌性プロトンポンプ阻害剤としてのその作用機序と一致する。
表3.
ラットの幽門結紮により誘発された胃潰瘍に対するFAMC、MC、FA懸濁液、及びRATの影響。

FAMC：脂肪アルコール+微結晶セルロースの懸濁液
MC：微結晶セルロース懸濁液
FA：脂肪アルコールの懸濁液
RAT：栄養補助食品として登録された脂肪アルコール錠剤
I阻害、Data as Mean ± SEM(平均値の標準誤差)
* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.0001、陽性対照との比較
^。p＜0.0001 FAの同用量との比較、
ap＜0.0001 MCの同用量との比較
bp＜0.0001同用量のRATとの比較
(マン・ホイットニーU検定)
この実施例に提示された試験の結論として、FAMC懸濁液を用いた経口投与はラットにおける幽門結紮によって誘発される胃潰瘍の形成を著しくかつ有意に阻害し、登録された錠剤及び同じ用量のFA及びMC懸濁液を用いて達成されたものよりも高い効力を有することを示すことができる。さらに、FAMC懸濁液の有効性は、評価された両方の用量におけるFA及びMC懸濁液の有効性の合計よりも大きいことが観察され、これは本発明の組成物の目的における相乗効果の存在を実証する。

実施例1で得られた組成物(FAMC)を、動物を用いた前臨床試験に供し、その化学的防御効果を、登録された脂肪アルコール錠剤(RAT)、及びFAMC組成物中に存在するものと等しい濃度の脂肪アルコール(FA)及び微結晶セルロース(MC)の各懸濁液の化学的防御効果と比較した。評価のために、結腸癌を1,2‐ジメチルヒドラジン(DMH)でHoltzmannラットに誘導した。3ヶ月齢及び250±20gの動物を、以下の群に無作為に分配した：2mL/kgのポリソルベートナトリウム；DMH 20mg/kg；ならびにDMH+FAMC、RAT、FA；及びMC懸濁液。
DMHを、pH 6.5で安定剤として0.4mg/mLのEDTAを用いて、蒸留水中で4mg/mLで調製した。20mg/kg体重を週1回18週間皮下投与し、懸濁液とポリソルベートを18週間経口投与した。予定時間の後、最後の投与の1時間後、ラットを100mg/kgペントバルビタールで屠殺し、結腸を病理組織学的分析のために取り出し、それを生理食塩水で穏やかに洗浄して、血液及び組織への付着破片を除去し;腫瘍塊領域を10%緩衝ホルマリン溶液中で7日間固定し；次いで、3～5μmの部分を選択し、パラフィン中で固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
評価は、顕微鏡観察で、新生物及び異形成に基づいた。化学的防御効果を評価するための統計解析は、Shapiro-Wilk正規性検定、ノンパラメトリックKruskal Wallis及びフィッシャー検定であり、95%信頼水準であった。
表4は、試験に含まれ、結腸癌で誘導され、異なる懸濁液で処置されたラットの結腸の組織病理学的観察の割合を要約する。Kruskal Wallis検査を95%の信頼水準で適用した場合、すべての症例においてp＜0.05が認められ、異なる群の結果は、すべての治療タイプと癌発生の段階(正常、異形成及び新生物)との間に有意な差異を示した。DMHのみで処置された全ての動物(100%)は、異形成又は新生物を発症し、これは、モデルの機能を示す。
新生物の出現が観察されなかった唯一の群はFAMC組成物で処置された群であり、これらの動物の20%のみが異形成を発症し、これは、これらの動物の80%が発癌剤の適用によって影響を受けなかったことを意味する。懸濁液FA、MC及びRATで処置した群ではそれぞれ20%、10%及び10%の動物のみが、癌誘導剤によって影響を受けなかった。このようにして、本発明の目的である懸濁液に化学的保護効果を与える、脂肪アルコールの抽出物とMCとの間の関連する相乗効果が実証された。FAMC懸濁液の化学的保護効果は、そのような個々の物質の懸濁液の化学的保護効果よりもはるかに大きかった。
表4.
病理組織学的結果は、ビヒクル(PS)、ジメチルヒドラジン(DMH)及び異なる懸濁液(頻度割合)で処置したラットの結腸である。

PS：3%ポリソルベートナトリウム。
Kruskal-Wallis検定を用いて統計学的評価を行い、各癌病期群における治療カテゴリーの分布を決定した(有意水準0.05)。
正常(p=0.01)、異形成(p=0.049)、新生物(p=0.01)。
+ ポリソルベートビヒクルを含む群と比較して、+p＜0.05； ++p＜0.01； +++p＜0.001；(フィッシャー検定)。
結論として、組織病理学的研究の指標は、脂肪アルコールと微結晶セルロース(FAMC)の混合物を含む懸濁液が、新生物の100%阻害を有するラットにおいてジメチルヒドラジンにより誘導された結腸癌において有意な抗腫瘍活性を示した唯一のものであることを明らかにした。

Claims

ミツバチ(Apis mellifera bee)精製ワックスからの脂肪アルコールの精製抽出物(以下、脂肪アルコール抽出物ともいう)及び微結晶セルロースを活性成分として含有する水性懸濁液であることを特徴とする、抗潰瘍及び結腸癌に対する化学的防御効果を有する経口懸濁液からなる医薬若しくは栄養補助食品。
成分が以下の比率：
1-2% 脂肪アルコール抽出物と、
1-2% 微結晶セルロースと、
2-4% 乳化剤と、
0.1-0.6% 保存剤と、
20-30% 保湿剤と、
1-6% 甘味剤と、
0.1-1% 懸濁化剤と、
0.01-0.05% 香味剤と
50～70% 精製水と、
であることを特徴とする、請求項1に記載の経口懸濁液からなる医薬若しくは栄養補助食品。
精製ワックスからの脂肪アルコールの精製抽出物の粒径が、1.5マイクロメートル未満であることを特徴とする、請求項2に記載の医薬若しくは栄養補助食品。
乳化剤が、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリソルベートであり、保存剤が、メチル及びプロピルパラベンであり、保湿剤が、グリセリンであり、甘味剤が、ソルビトール又はサッカリンナトリウムであり、懸濁化剤がカルボキシメチルセルロースであり、香味剤が精油であることを特徴とする、請求項2及び3に記載の医薬若しくは栄養補助食品。
A)脂肪アルコールでの精製抽出物と1つ以上の乳化剤との混合と、
B)前記混合物を、抽出物の粒径を＜1. 5マイクロメートルに減少させるための技術的プロセスに供する工程と、
C)1000rpmを超える微結晶性セルロース及び保存剤、保湿剤、甘味剤、懸濁化剤、香味剤及び精製水を一定に撹拌しながら混合物に組み込むと、
を特徴とする、結腸がんに対する抗潰瘍及び化学的防御効果を有する水性懸濁液からなる医薬若しくは栄養補助食品を得るための方法。
脂肪アルコール抽出物（脂肪アルコールでの精製抽出物ともいう）が、ミツバチ(Apis mellifera)ミツロウから抽出及び精製することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
脂肪アルコール抽出物の粒径を減少させるために適用される技術的方法が、前記精製抽出物及び乳化剤の混合物を、撹拌速度＞1000rpmで、温度＞80℃で＞1分間、均質化装置を用いて剪断プロセスに供することに基づくことを特徴とする、請求項5及び6に記載の方法。
脂肪アルコール抽出物の粒径を減少させるために適用される技術的方法が前記精製抽出物と乳化剤との混合物を、＞80℃の温度で＞1000rpmの撹拌速度に＞1分間供し、次いで同じ撹拌速度で温度を＜60℃に減少させることに基づくことを特徴とする、請求項5及び6に記載の方法。