JP2023518540A - インタクトな組織試料からの生物学的物質の空間依存的分析 - Google Patents

Abstract

生物学的研究は、組織試料からの物質、例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の単離および分析を必要とする。本明細書に記載の方法および組成物は、大きいインタクトな組織試料の高解像度画像化、およびその後の正確かつ位置依存的な方法での物質の単離を可能にする。本明細書に記載の方法および組成物は、例えば、バイオマーカーの発見、細胞集団の同定、病理分析、および特定の関心領域における発現データの生成に使用することができる。【選択図】図８Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／９９１，５８３号および２０２０年９月４日に出願された米国仮出願第６３／０７４，６９３号の優先権を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、各々の優先権が主張される。

組織分析のための分子生物学に基づく方法の大部分の間、分析される物質の空間的状況は失われる。配列分析を空間情報と組み合わせる当技術分野で公知の技術には、制限、例えば、他の制約の中でも、低配列決定深度、試料体積制限、個々の組織切片の分析、または時間のかかる読み取りがある。現在、知る限りでは、単離の精度と分析の深度とを組み合わせた利用可能な方法はない。本明細書に記載の方法および組成物は、当技術分野におけるこれらおよび他の問題に対処する。

本技術は、一般的に、組織または組織試料の細胞または他の領域の３次元標識のための方法および組成物に関する。方法は、関心領域（または細胞）を適切な標識と接触させ、次いで前記関心領域（または細胞）を多光子レーザに供することによって標識された、透明化された組織または試料の画像化を含む。次いで、標識領域を組織または試料から単離し、分析、例えば、限定されないが、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、プロテオーム分析、エピジェネティック分析、免疫組織化学分析、染色体コンフォメーション捕捉または免疫蛍光分析に供することができる。レーザ支援顕微解剖、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、または浮力活性化細胞選別（ＢＡＣＳ）等の種々の関心標識領域（または細胞）の単離方法を使用することができるが、これらに限定されない。そのような分析は、組織または試料の個別の領域に関する情報を提供することができる。

一局面において、組織または組織試料の領域を標識する方法が提供される。方法は、ａ）３次元組織または組織試料を提供すること；ｂ）試料を透明化すること；ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；およびｄ）組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって領域を標識することを含み得る。

他の局面において、インタクトな組織または組織試料の３次元発現プロファイリングのための方法が提供される。方法は、ａ）３次元のインタクトな組織または組織試料を提供すること；ｂ）試料を透明化すること；ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；ｄ）組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって領域を標識すること；ｅ）標識領域を画像化して画像を作成すること；ｆ）組織または組織試料から標識領域を単離すること；ｇ）単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定すること；ｈ）画像を単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成物と組み合わせて、インタクトな組織または組織試料の３次元発現プロファイルを作成することを含み得る。

一局面において、組織または組織試料中の単一細胞または核を単離するための方法が提供される。方法は、ａ）目的の細胞または核を含む３次元組織または組織試料を提供すること；ｂ）試料を透明化すること；ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；ｄ）細胞または核を多光子レーザに供し、それによって細胞または核を標識すること；ｅ）標識細胞核を組織または組織試料から解離させること；およびｆ）標識細胞または核を単離することを含み得る。

他の局面において、組成物が提供される。組成物は組織試料、組織に類似または一致する屈折率を有する媒体、および光活性化可能標識を含み得る。

一局面において、透明化された組織試料が提供される。透明化された組織試料は、光活性化可能標識、および組織に類似または一致する屈折率を有する媒体を含み得る。

組織の透明化前（左）および透明化後（右）のマウス脳を示す。

透明化された組織（下列）または対照組織（上列）における異なる蛍光タンパク質の安定性を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。この図では、２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下でそれぞれＥＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＶｅｎｕｓの発現を駆動するプラスミドでトランスフェクトした。

光反応性標識を使用して、透明化された組織中の目的の細胞または核を標識するための２光子顕微鏡法の使用の一実施形態を示す図である。図３Ａは、２６０ｎｍ～４７５ｎｍの波長の光に曝露した際の、光反応性基を有する光反応性標識とビオチンタグとによる分子の標識を示す図である。図３Ｂは、従来の共焦点顕微鏡法（左）と比較して、目的の細胞または核を標識するための２光子顕微鏡法（右）の使用の利点を示す図である。伝統的な共焦点顕微鏡法は、光（赤色）および光活性化可能化合物（緑色）の両方に曝露される組織の全領域の光活性化をもたらす。対照的に、２光子顕微鏡法は、より正確な光活性化および標的部位（赤い星）を可能にし、それによって非標的組織の非特異的標識を回避する。 光反応性標識を使用して、透明化された組織中の目的の細胞または核を標識するための２光子顕微鏡法の使用の一実施形態を示す図である。図３Ａは、２６０ｎｍ～４７５ｎｍの波長の光に曝露した際の、光反応性基を有する光反応性標識とビオチンタグとによる分子の標識を示す図である。図３Ｂは、従来の共焦点顕微鏡法（左）と比較して、目的の細胞または核を標識するための２光子顕微鏡法（右）の使用の利点を示す図である。伝統的な共焦点顕微鏡法は、光（赤色）および光活性化可能化合物（緑色）の両方に曝露される組織の全領域の光活性化をもたらす。対照的に、２光子顕微鏡法は、より正確な光活性化および標的部位（赤い星）を可能にし、それによって非標的組織の非特異的標識を回避する。

２光子標識技術を用いた分析例の概要を示す。３次元（３Ｄ）細胞構造を有する組織を透明化し、光活性化可能色素（例えば、フォトビオチン）に浸漬し、２光子レーザ（例えば、図３Ｂに示す）を使用して標識し、続いて分析、例えば単一細胞分析（例えば、ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ）のために標識核を単離する。

逆転写後、室温（ＲＴ）または４℃（４Ｃ）で３日後のＥＤＣ処理なしの処理試料のポリヌクレオチド長さプロファイルを示す。

インタクトな組織試料からの生物学的物質の空間依存的分析の方法の概要を示す。図６Ａは、例示的な組織透明化（図６Ａ、パネルＡ）および標識プロセス（パネルＢ～Ｅ）、ならびに光標識核の単離（パネルＦ）を示す。得られた試料を、単離された光標識核（パネルＧおよびＨ）からのＳＰＬｉＴ ｓｅｑライブラリ調製によって分析し、その後のデータ分析（Ｉ）を行うことができる。加えて（または代替的に）、単離された組織からのＤＮＡ（図６Ｂ）またはタンパク質（図６Ｃ）が分析できる。 インタクトな組織試料からの生物学的物質の空間依存的分析の方法の概要を示す。図６Ａは、例示的な組織透明化（図６Ａ、パネルＡ）および標識プロセス（パネルＢ～Ｅ）、ならびに光標識核の単離（パネルＦ）を示す。得られた試料を、単離された光標識核（パネルＧおよびＨ）からのＳＰＬｉＴ ｓｅｑライブラリ調製によって分析し、その後のデータ分析（Ｉ）を行うことができる。加えて（または代替的に）、単離された組織からのＤＮＡ（図６Ｂ）またはタンパク質（図６Ｃ）が分析できる。 インタクトな組織試料からの生物学的物質の空間依存的分析の方法の概要を示す。図６Ａは、例示的な組織透明化（図６Ａ、パネルＡ）および標識プロセス（パネルＢ～Ｅ）、ならびに光標識核の単離（パネルＦ）を示す。得られた試料を、単離された光標識核（パネルＧおよびＨ）からのＳＰＬｉＴ ｓｅｑライブラリ調製によって分析し、その後のデータ分析（Ｉ）を行うことができる。加えて（または代替的に）、単離された組織からのＤＮＡ（図６Ｂ）またはタンパク質（図６Ｃ）が分析できる。

ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析によるホルマリン固定および透明化された試料のＲＮＡ品質を示す。図７Ａは、バーコードランク（バーコードｌｏｇ１０スケール）の関数としてバーコード当たりの固有カウント（ｌｏｇ２（ＵＭＩ））を示すプロットである。図７Ｂは、固定試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｙ軸上に示し、透明化された試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｘ軸上に示す散布図である（ＴＰＭ：転写／百万）。図７Ｃは、マウス（ｍｍ１０）２番染色体の７２ｋｂストレッチのｃＤＮＡカバレッジを提示する例示的なゲノムブラウザウィンドウ（上）を、固定および透明化された試料（中央）および固定試料（下）の比較と共に示す。図７Ａ～図７Ｃに示すように、脊髄をＣｙ３－ＰＡにおいて光活性化した。核を抽出し、標識組み込みのために選別した。ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑライブラリを作製し、ＨｉＳｅｑによって配列決定した。 ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析によるホルマリン固定および透明化された試料のＲＮＡ品質を示す。図７Ａは、バーコードランク（バーコードｌｏｇ１０スケール）の関数としてバーコード当たりの固有カウント（ｌｏｇ２（ＵＭＩ））を示すプロットである。図７Ｂは、固定試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｙ軸上に示し、透明化された試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｘ軸上に示す散布図である（ＴＰＭ：転写／百万）。図７Ｃは、マウス（ｍｍ１０）２番染色体の７２ｋｂストレッチのｃＤＮＡカバレッジを提示する例示的なゲノムブラウザウィンドウ（上）を、固定および透明化された試料（中央）および固定試料（下）の比較と共に示す。図７Ａ～図７Ｃに示すように、脊髄をＣｙ３－ＰＡにおいて光活性化した。核を抽出し、標識組み込みのために選別した。ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑライブラリを作製し、ＨｉＳｅｑによって配列決定した。 ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析によるホルマリン固定および透明化された試料のＲＮＡ品質を示す。図７Ａは、バーコードランク（バーコードｌｏｇ１０スケール）の関数としてバーコード当たりの固有カウント（ｌｏｇ２（ＵＭＩ））を示すプロットである。図７Ｂは、固定試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｙ軸上に示し、透明化された試料についてのｌｏｇ２（ＴＰＭ）をｘ軸上に示す散布図である（ＴＰＭ：転写／百万）。図７Ｃは、マウス（ｍｍ１０）２番染色体の７２ｋｂストレッチのｃＤＮＡカバレッジを提示する例示的なゲノムブラウザウィンドウ（上）を、固定および透明化された試料（中央）および固定試料（下）の比較と共に示す。図７Ａ～図７Ｃに示すように、脊髄をＣｙ３－ＰＡにおいて光活性化した。核を抽出し、標識組み込みのために選別した。ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑライブラリを作製し、ＨｉＳｅｑによって配列決定した。

脊髄組織の２光子標識の使用を示す。図８Ａは、色付きの円として背側の層が示されている、脊髄の異なる領域を示す、マウス脊髄の断面図である。拡大パネルでは、光活性化を受けた領域が強調表示されている。図８Ｂは、マウス脊髄から単離された、透明化されたが光活性化されていない核のＦＡＣＳプロットである。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。図８Ｃは、マウス脊髄から単離された、透明化され、光活性化された核のＦＡＣＳプロットである（図９Ａに示す）。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。 脊髄組織の２光子標識の使用を示す。図８Ａは、色付きの円として背側の層が示されている、脊髄の異なる領域を示す、マウス脊髄の断面図である。拡大パネルでは、光活性化を受けた領域が強調表示されている。図８Ｂは、マウス脊髄から単離された、透明化されたが光活性化されていない核のＦＡＣＳプロットである。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。図８Ｃは、マウス脊髄から単離された、透明化され、光活性化された核のＦＡＣＳプロットである（図９Ａに示す）。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。 脊髄組織の２光子標識の使用を示す。図８Ａは、色付きの円として背側の層が示されている、脊髄の異なる領域を示す、マウス脊髄の断面図である。拡大パネルでは、光活性化を受けた領域が強調表示されている。図８Ｂは、マウス脊髄から単離された、透明化されたが光活性化されていない核のＦＡＣＳプロットである。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。図８Ｃは、マウス脊髄から単離された、透明化され、光活性化された核のＦＡＣＳプロットである（図９Ａに示す）。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はこの実験に使用したＰＡ色素：Ｃｙ３－ＰＡを示す。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。

本発明の方法で使用するための例示的化合物を示す。図９Ａは、光標識に使用することができる光反応性化合物の例を示す。図９Ｂは、紫外線（ＵＶ）光によって誘導されたアリールアジドに対する例示的な改変を示す。図９Ｃは、合成された光反応性化合物の例を示す。 本発明の方法で使用するための例示的化合物を示す。図９Ａは、光標識に使用することができる光反応性化合物の例を示す。図９Ｂは、紫外線（ＵＶ）光によって誘導されたアリールアジドに対する例示的な改変を示す。図９Ｃは、合成された光反応性化合物の例を示す。 本発明の方法で使用するための例示的化合物を示す。図９Ａは、光標識に使用することができる光反応性化合物の例を示す。図９Ｂは、紫外線（ＵＶ）光によって誘導されたアリールアジドに対する例示的な改変を示す。図９Ｃは、合成された光反応性化合物の例を示す。

ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析を使用した、脊髄由来の透明化された核の発現プロファイリングを示す。図１０Ａは、細胞種の発現プロファイル（示された細胞種に関連する遺伝子の発現量）を示すグラフである。図１０Ｂは、図１０ＡのデータのＵＭＡＰによって生成されたグラフである。 ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析を使用した、脊髄由来の透明化された核の発現プロファイリングを示す。図１０Ａは、細胞種の発現プロファイル（示された細胞種に関連する遺伝子の発現量）を示すグラフである。図１０Ｂは、図１０ＡのデータのＵＭＡＰによって生成されたグラフである。

多重化がどのように複数の標識イベントを可能にし得るかの一例の図示である。組織を第１の色素（色素１）に曝露し、続いて第１の関心領域を２光子標識することができる（左パネル）。次いで、同一組織を第２の色素（色素２）と接触させ（任意に洗浄後）、続いて第２の関心領域の２光子標識化を行うことができる（中央パネル）。所望により、同一組織を第３の色素（色素３）と接触させ（任意に洗浄後）、続いて第３の関心領域の２光子標識化を行うことができる（中央パネル）。

マウント全体における光活性化のための標的化合物の適用領域の例を示す。適用領域の例としては、腫瘍不均一性、炎症性腫瘍（ｉｍｆｌａｍｅｄ ｔｕｍｏｒ）／免疫砂漠および血管系への近接（図１２Ａ）、低密度な細胞集団（図１２Ｂ）の発見および標識、発現データの生成、ならびに３Ｄ組織学（図１２Ｃ）が挙げられる。 マウント全体における光活性化のための標的化合物の適用領域の例を示す。適用領域の例としては、腫瘍不均一性、炎症性腫瘍（ｉｍｆｌａｍｅｄ ｔｕｍｏｒ）／免疫砂漠および血管系への近接（図１２Ａ）、低密度な細胞集団（図１２Ｂ）の発見および標識、発現データの生成、ならびに３Ｄ組織学（図１２Ｃ）が挙げられる。 マウント全体における光活性化のための標的化合物の適用領域の例を示す。適用領域の例としては、腫瘍不均一性、炎症性腫瘍（ｉｍｆｌａｍｅｄ ｔｕｍｏｒ）／免疫砂漠および血管系への近接（図１２Ａ）、低密度な細胞集団（図１２Ｂ）の発見および標識、発現データの生成、ならびに３Ｄ組織学（図１２Ｃ）が挙げられる。

この説明を読んだ後、種々の代替の実施形態および代替の適用において本開示を実施する方法は当技術分野の当業者に明らかになるであろう。ただし、本発明の種々の実施形態の全てについて本明細書では説明しない。ここに提示される実施形態は、例としてのみ提示され限定するものではでないことは理解されよう。したがって、種々の代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲または幅を限定すると解釈されるべきではない。

本技術を開示および説明する前に、以下に記載される局面は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはその使用に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の態様を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。

読者の便宜のためだけに様々なセクションに分けられた詳細な説明および任意のセクションに見られる開示は、他のセクションのものと組み合わされてもよい。タイトルまたはサブタイトルが、読者の便宜のために本明細書で使用されてもよく、本開示の範囲に影響を及ぼすことを意図しない。
定義

別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書で使用される、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限りは、複数形を同様に含むことが意図されている。

「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載されるイベントまたは状況が起こり得るか、または起こり得ないこと、およびその説明が、そのイベントまたは状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。

「約」という用語は、例えば温度、時間、量、濃度等、範囲を含む数値指定の前に使用される場合、（＋）もしくは（－）１０％、５％、１％、またはそれらの間の任意の部分範囲もしくは部分値によって変化し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、用量に関して使用される場合、用量が＋／－１０％変化し得ることを意味する。

「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、および方法が、記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載された目的のための組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本発明で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される技術の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分および実質的な方法工程の微量よりも多い要素を除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
方法

一局面において、組織または組織試料の領域を標識する方法が提供される。方法は、（ａ）３次元組織または組織試料を提供すること；（ｂ）試料を透明化すること；（ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；および（ｄ）組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって領域を標識することを含み得る。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、２光子レーザである。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、３光子レーザである。

本明細書に記載する方法について、いくつかの実施形態では、領域は、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物を含む。いくつかの実施形態において、領域は細胞を含む。いくつかの実施形態において、領域は細胞内区画を含む。いくつかの実施形態において、領域は凝集物を含む。いくつかの実施形態において、領域は分泌凝集物を含む。いくつかの実施形態において、細胞内区画は核である。

いくつかの実施形態において、方法は、組織または組織試料を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織試料を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、組織または組織試料は固定組織または固定組織試料である。いくつかの実施形態において、組織は、固定組織である。いくつかの実施形態において、組織は、固定組織試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織試料である。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、検出可能部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、発光部分を含む。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、生物発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分の１つは抗体またはその機能性誘導体を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はタグを含む。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、オリゴヌクレオチドタグまたはビオチンタグを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、タグはアフィニティタグである。いくつかの実施形態において、タグはエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは蛍光タグである。いくつかの実施形態において、タグはオリゴヌクレオチドタグである。いくつかの実施形態において、タグはビオチンタグである。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、試料透明化プロセスは、試料を脱水すること、および組織と類似または一致する屈折率を有する媒体に試料を移すことを含む。いくつかの実施形態において、屈折率は約１．３～約１．６である。いくつかの実施形態において、屈折率は約１．３である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．３２５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．３５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．３７５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．４である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．４２５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．４５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．４７５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．５２５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．５５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．５７５である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．６である。いくつかの実施形態において、屈折率は、約１．３、約１．３２５、約１．３５、約１．３７５、約１．４、約１．４２５、約１．４５、約１．４７５、約１．５、約１．５２５、約１．５５、約１．５７５、または約１．６である。屈折率は、端点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲、または記載された値のいずれかの間の任意の範囲であってもよい。

いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体はＢＡＢＢ溶液を含む。

本明細書で提供される方法について上述したように、いくつかの実施形態では、試料透明化プロセスは試料を脱水することを含む。いくつかの実施形態において、試料は、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液によって脱水される。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、トリメチルアミン、テトラヒドロフラン、エタノールまたはメタノールを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、トリメチルアミンを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、テトラヒドロフランを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、エタノールを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、メタノールを含む。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、疎水性である。本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はテトラフルオロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はジアジリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアジド－メチルクマリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、ソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアリールアジド基を含む。

いくつかの実施形態において、方法は、組織または組織試料から標識領域または標識領域の一部を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織から標識領域を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織から標識領域の一部を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織試料から標識領域を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織試料から標識領域の一部を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、標識領域または一部は、標識についてのＦＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、方法は、単離された標識領域の組成を分析して分析データを作成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のＤＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のＲＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識領域のタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ＳＰＬＩＴｓｅｑによって分析される。

本明細書で記載する方法について、いくつかの実施形態では、標識領域を単離する前に組織または試料を画像化して画像を作成しており、画像を分析データと組み合わせて領域の３次元組成マップを作成することをさらに含む。

一局面において、インタクトな組織または組織試料の３次元発現プロファイリングのための方法が提供される。方法は、（ａ）３次元のインタクトな組織または組織試料を提供すること；（ｂ）試料を透明化すること；（ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；（ｄ）組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって領域を標識すること；ｅ）標識領域を画像化して画像を作成すること；（ｆ）組織または組織試料から標識領域を単離すること；（ｇ）単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定すること；（ｈ）画像を単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成と組み合わせて、インタクトな組織または組織試料の３次元発現プロファイルを作成することを含み得る。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、２光子レーザである。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、３光子レーザである。いくつかの実施形態において、領域は、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物である。いくつかの実施形態において、領域は細胞である。いくつかの実施形態において、領域は細胞内区画である。いくつかの実施形態において、領域は凝集物である。いくつかの実施形態において、領域は分泌凝集物である。いくつかの実施形態において、単離された標識領域は、単一核である。いくつかの実施形態において、単離された標識領域のＲＮＡ組成が決定される。

一局面において、組織または組織試料中の単一細胞または核を単離するための方法が提供される。方法は、（ａ）３次元組織または組織試料を提供すること；（ｂ）試料を透明化すること；（ｃ）組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；（ｄ）細胞を多光子レーザに供し、それによって細胞を標識すること；（ｅ）標識細胞を組織または組織試料から解離させること；および（ｆ）標識細胞または核を単離することを含み得る。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、２光子レーザである。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、３光子レーザである。

いくつかの実施形態において、方法は、組織または組織試料を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、組織試料を画像化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、組織または組織試料は固定組織または固定組織試料である。いくつかの実施形態において、組織は、固定組織である。いくつかの実施形態において、組織は、固定組織試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織試料である。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、検出可能部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、発光部分を含む。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、生物発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は抗体またはその機能性誘導体を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はタグを含む。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、オリゴヌクレオチドタグまたはビオチンタグを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、タグはアフィニティタグである。いくつかの実施形態において、タグはエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは蛍光タグである。いくつかの実施形態において、タグはオリゴヌクレオチドタグである。いくつかの実施形態において、タグはビオチンタグである。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、試料透明化プロセスは、試料を脱水すること、および組織と類似または一致する屈折率を有する媒体に試料を移すことを含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体はＢＡＢＢ溶液を含む。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、試料は、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液によって脱水される。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、トリメチルアミン、テトラヒドロフラン、エタノールまたはメタノールを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、トリメチルアミンを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、テトラヒドロフランを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、エタノールを含む。いくつかの実施形態において、ｔｅｒｔ－ブタノール溶液は、メタノールを含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は疎水性である。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はテトラフルオロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はジアジリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアジド－メチルクマリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、ソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアリールアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、図９Ａに示す基を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、標識細胞または核を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識細胞を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識核を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、標識細胞または核は、標識についての蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞は、標識についてのＦＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、核は、標識についてのＦＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞または核は、標識についての磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞は、標識についてのＭＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識核は、標識についてのＭＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞または核は、標識についての浮力活性化細胞選別（ＢＡＣＳ）選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞は、標識についてのＢＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識核は、標識についてのＢＡＣＳ選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞または核は、標識についてのアフィニティベースのカラム精製（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識細胞は、標識についてのアフィニティベースのカラム精製選別によって単離される。いくつかの実施形態において、標識核は、標識についてのアフィニティベースのカラム精製選別によって単離される。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、単離された標識細胞または核を分析することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、単離された標識細胞を分析することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、単離された標識核を分析することをさらに含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のＤＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のＲＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞または核のタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞のＤＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞のＲＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識細胞のタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識核のＤＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識核のＲＮＡ組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分析は、単離された標識核のタンパク質組成を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって分析される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ＳＰＬＩＴｓｅｑによって分析される。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、方法は、組織または組織試料を第２の光活性化可能標識と接触させること、および組織または組織試料中の第２の細胞または核を多光子レーザに供し、それによって第２の細胞または核を標識することをさらに含む。例えば、図１１を参照されたい。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、２光子レーザである。いくつかの実施形態において、多光子レーザは、３光子レーザである。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、組織または組織試料は、器官全体、腫瘍または動物である。いくつかの実施形態において、組織または組織試料は、器官全体である。いくつかの実施形態において、組織または組織試料は、腫瘍である。いくつかの実施形態において、組織または組織試料は、動物である。いくつかの実施形態において、組織は、器官全体である。いくつかの実施形態において、組織は、腫瘍である。いくつかの実施形態において、組織は、動物である。いくつかの実施形態において、組織試料は、器官全体である。いくつかの実施形態において、組織試料は、腫瘍である。いくつかの実施形態において、組織試料は、動物である。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、２光子レーザ内の各光子の波長は、約５００ｎｍ～約１１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約５９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約６９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約７９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約８９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約９９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１００５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１０９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザの各光子の波長は約１１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、２光子レーザ内の各光子の波長は、約９０５ｎｍ、約９１０ｎｍ、約９１５ｎｍ、約９２０ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９３０ｎｍ、約９３５ｎｍ、約９４０ｎｍ、約９４５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９５５ｎｍ、約９６０ｎｍ、約９６５ｎｍ、約９７０ｎｍ、約９７５ｎｍ、約９８０ｎｍ、約９８５ｎｍ、約９９０ｎｍ、約９９５ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１００５ｎｍ、約１０１０ｎｍ、約１０１５ｎｍ、約１０２０ｎｍ、約１０２５ｎｍ、約１０３０ｎｍ、約１０３５ｎｍ、約１０４０ｎｍ、約１０４５ｎｍ、約１０５０ｎｍ、約１０５５ｎｍ、約１０６０ｎｍ、約１０６５ｎｍ、約１０７０ｎｍ、約１０７５ｎｍ、約１０８０ｎｍ、約１０８５ｎｍ、約１０９０ｎｍ、約１０９５ｎｍ、または約１１００ｎｍである。波長は、端点を含む記載された範囲内の任意の値または部分範囲、または列挙された値のいずれかの間の任意の範囲であってもよい。

本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、３光子レーザ内の各光子の波長は、約６９０ｎｍ～約２５００ｎｍである。本明細書で提供される方法について、いくつかの実施形態では、３光子レーザ内の各光子の波長は、約６９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約６９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約７９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約８９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約９９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１００５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１０９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約１１９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２００５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２０９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１
５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２１９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２２９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２３９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４００ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４０５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４１０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４３０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４４０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４５５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４６５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４７０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４７５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４８５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４９０ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２４９５ｎｍである。いくつかの実施形態において、３光子レーザの各光子の波長は約２５００ｎｍである。
組成物

一局面において、組成物が提供される。組成物は組織試料、組織に類似または一致する屈折率を有する媒体、および光活性化可能標識を含み得る。いくつかの実施形態において、組織は、標識領域を含む。いくつかの実施形態において、領域は、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物を含む。いくつかの実施形態において、領域は細胞を含む。いくつかの実施形態において、領域は細胞内区画を含む。いくつかの実施形態において、領域は凝集物を含む。いくつかの実施形態において、領域は分泌凝集物を含む。いくつかの実施形態において、細胞は多光子法によって標識された。いくつかの実施形態において、細胞は２光子法によって標識された。いくつかの実施形態において、細胞は３光子法によって標識された。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は検出可能部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、発光部分を含む。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、生物発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、フルオロフォアを含む。

本明細書で提供される組成物について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、タグを含む。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、オリゴヌクレオチドタグまたはビオチンタグを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、タグはアフィニティタグである。いくつかの実施形態において、タグはエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは蛍光タグである。いくつかの実施形態において、タグはオリゴヌクレオチドタグである。いくつかの実施形態において、タグはビオチンタグである。いくつかの実施形態において、検出可能部分は抗体またはその機能性誘導体である。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は疎水性である。

本明細書で提供される組成物について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はテトラフルオロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルトニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はジアジリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアジド－メチルクマリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、ソラレン基を含む。

本明細書において供給される組成物について、いくつかの実施形態では、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体はＢＡＢＢ溶液を含む。いくつかの実施形態において、記載された構成要素の１つ以上を明示的に除外することができる。

一局面において、透明化された組織試料が提供される。透明化された組織試料は、光活性化可能標識、および組織に類似または実質的に一致する屈折率を有する媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物について、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルアルコールの溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含む、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体は、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含まない、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む。いくつかの実施形態において、媒体はＢＡＢＢ溶液を含む。いくつかの実施形態において、列挙された構成要素の１つ以上を明示的に除外することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される透明化された組織は、標識細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は多光子法によって標識された。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は検出可能部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、発光部分を含む。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、蛍光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、化学発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は、生物発光部分である。いくつかの実施形態において、発光部分は電気化学発光部分である。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はタグを含む。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、オリゴヌクレオチドタグまたはビオチンタグを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、タグはアフィニティタグである。いくつかの実施形態において、タグはエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは蛍光タグである。いくつかの実施形態において、タグはオリゴヌクレオチドタグである。いくつかの実施形態において、タグはビオチンタグである。いくつかの実施形態において、検出可能部分は抗体またはその機能性誘導体である。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は疎水性である。いくつかの実施形態において、列挙された標識の１つ以上を明示的に除外することができる。

本明細書で提供される透明化された組織について、いくつかの実施形態では、光活性化可能標識は、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルト－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ヒドロキシフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はテトラフルオロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はオルトニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はメタ－ニトロフェニルアジド基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はジアジリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識はアジド－メチルクマリン基を含む。いくつかの実施形態において、光活性化可能標識は、ソラレン基を含む。いくつかの実施形態において、列挙された標識の１つ以上を明示的に除外することができる。
用途

本明細書に記載の方法および組成物は、３次元組織分析が望ましい任意の用途に使用することができる。以下の使用は例にすぎず、限定することを意図するものではない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、腫瘍または腫瘍試料（例えば、生検）の不均一性を検出することができる。患者由来の腫瘍試料は、本明細書に記載されるように透明化し得る。次いで、腫瘍試料を光活性化可能標識と接触させ、１つ以上の関心領域を多光子レーザ（例えば、２光子レーザ）に供してもよい。関心領域は、腫瘍内の種々の領域、ならびに腫瘍隣接 「正常」 細胞を含み得る。標識領域を単離し、１つ以上の分析方法、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質分析によって分析することができる。腫瘍試料は、単離または分析の前、例えば、透明化の前または後、光活性化可能標識との接触の前または後等に、任意の工程または複数の工程で画像化し得る。分析から決定されたＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質プロファイルを画像と組み合わせて、腫瘍の詳細なマップを提供することができる。種々の領域内の腫瘍ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の分析は、腫瘍不均一性の３次元進化モデルの構築を可能にし得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、試料、例えば腫瘍試料中の免疫細胞（またはその欠如）を同定することができる。例えば、本明細書に記載されるように、試料の１つ以上の領域を標識、画像化し、および単離することができる。単離された領域は、例えば、目的の１つ以上の免疫細胞によって発現（優先的に発現）されるＲＮＡおよび／またはタンパク質について分析することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、試料、例えば腫瘍試料中の血管の位置を同定し、および／または血管への近接に基づいてＤＮＡ、またはＲＮＡもしくはタンパク質の発現を分析することができる。例えば、本明細書に記載されるように、試料の１つ以上の領域を血管への近接に基づいて標識、画像化し、および単離することができる。単離された領域は、例えば、目的の１つ以上の細胞によって発現（優先的に発現）されるＲＮＡおよび／またはタンパク質について分析することができる。同様に、転移または転移の疑いのある領域は、これらの方法を使用して分析することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、細胞の低密度な集団の位置を見出すことができる。いくつかの細胞種は、特定の組織に少数で見られる、および／または組織内の個別の領域に分散している。本明細書に記載の組成物および方法は、組織内のそれらの細胞または領域を特定／位置特定するのに役立ち得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、試料中の特定の細胞種をプロファイリングできる。例えば、限定されるものではないが、脊髄は、後根神経節の複数の層／領域から構成され、各層または領域は異なる細胞種を含む。本明細書に記載の組成物および方法は、種々の層における細胞間の差異（および／または類似性）を特定するのに役立ち得る。したがって、複数の細胞種から構成される任意の組織を分析することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、３Ｄ組織学による組織または試料の分析後に、組織または試料の関心領域についてのデータ、例えば発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）または突然変異（例えば、ＤＮＡ）データを生成することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、組織または試料内の正確な関心領域を標識および抽出することができる。例えば、関心領域は、（２０倍レンズを使用して）１．６×１．６×３μｍの分解能内で標識することができる。

本明細書に記載の実施例および実施形態が例示のみを目的とするものであり、それを考慮に入れたさまざまな改変または変化が当業者に提案され、本出願精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることは理解されよう。本明細書で引用される全ての公報、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

当業者は、本明細書に記載の粒子の作製および使用の説明が例示のみを目的としており、本開示がこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
実施例１．組織の脱水および透明化

脱水および組織透明化

残留血液のない臓器を採取するために、温ＰＢＳ／ヘパリン（５Ｕ／ｍｌ；定常圧力（重力流または灌流１システム；１～１．５ｍＨ２Ｏ（Ｌｅｉｃａ））で５０～１００ｍｌ／マウス）でマウスを灌流し、続いてＰＦＡ ２％（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＢＳで希釈）で灌流した。試料透過性に応じて、除去した臓器を４℃で一晩ＰＦＡ中で後固定した。試料を３０％および５０％のｔｅｒｔ－ブタノール（ｐＨ＝９．５、ＲＴ）、続いて、順次７０％、８０％、９６％および１００％のｔｅｒｔ－ブタノール（ｐＨ＝９．５、３０℃）中でそれぞれＸ時間（ここで、Ｘは、参照としての役割を果たす２４時間インキュベートしたマウス脳でのＦｉｃｋの拡散法則によって決定される時間であり；Ｔ＝（１／［２Ｄ］）ｒ^２、Ｄ＝拡散係数（マウス脳寸法およびインキュベート時間＝０．０００１５３４９から推測）、ｒ＝試料中心に最も近い距離）インキュベートし、最後にＢＡＢＢ（体積比１：２のベンジルアルコール：ベンジルベンゾエート、ｐＨ＝９．５、３０℃）中で透明化した。最終的な透明化工程の後、臓器をＢＡＢＢ溶液中で少なくとも１年間、４℃で保存することができる。工程あたり約２４時間インキュベートした、このプロトコル後の透明化されたマウス脳の例を図１に見ることができる。

安定性実験

上記のプロトコルが細胞の安定性および完全性を変化させなかったことを示すために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＥＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＶｅｎｕｓをそれぞれコードするプラスミドでトランスフェクトした。細胞をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＺスライド上に播種し、ＰＦＡ ４％で固定し、次いで、上記のプロトコルにしたがって、工程あたり１５分のインキュベート時間で処理した。マウントのために、ＢＡＢＢをマウント媒体として使用し、ガラスカバースリップを使用して細胞を覆った。次いで、蛍光タンパク質の励起／発光スペクトルに一致する波長を有するＬｅｉｃａ ＳＰ８直立レーザ走査型顕微鏡を使用して細胞を画像化した。対照スライドは、透明化プロトコルに供さず、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄマウント媒体を使用して封入した。これらの安定性実験の結果を図２に示す。
実施例２．組織の２光子標識

組織深部の光反応性化合物の空間的に定義された活性化のために、室温（ＲＴ）でＦｉｃｋの拡散法則によって記載される時間、または４℃で一晩、ＢＡＢＢ（１２．５μｇ／ｍｌ）に溶解した適切な化合物と共に試料をインキュベートした。関心部位への化合物のコンジュゲーションの成功は、２０倍レンズ（Ｌｅｉｃａ ＨＣＸ ＡＰＯ Ｌ ２０ｘ／０．９５ ＩＭＭ）および７００ ｎｍのレンズでの７５ｍＷのレーザ出力で５１２ｘ５１２の解像度の１０μｓの画素滞留時間を使用することによって達成された。フォトビオチン（ビオチン－リンカー－フェニルアジド；Ｓｉｇｍａ Ａ１９３５－１ＭＧ）の組成に基づいて、１ｍｇ／ｍｌ（ストック濃度）のｐＨ調整ＢＡＢＢに容易に溶解する光活性化可能なＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＡｌｅｘａ ４８８を合成した。試料の光標識の直後に、試料をＢＡＢＢ（ｐＨ＝９．５、３０℃）、次いで１００％ ｔｅｒｔ－ブタノール（ｐＨ＝９．５、３０℃）でＦｉｃｋの法則によって決定された時間、（各溶液に試料を移すことによって）洗浄し、続いて１００％ ＤＭＳＯ（ｐＨ＝９．５、３０℃）で最終洗浄工程を行い、続いてさらに処理するまで１００％ ＤＭＳＯ中４℃で保存した。
実施例３．光標識核の単離および精製

全ての機器をＲＮＡｓｅで処理した。ＤＭＳＯ中に保存した光標識組織を、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）を補充したＰＢＳ中、シェーカー上、２０℃で３０分間インキュベートすることによって再水和させた。組織を１ｍｍ未満のビットに細断し、溶解緩衝液（二価を含有する９７５μｌのＨＢＳＳ、１０μｌのプロテイナーゼＫ、１０μｌのＲＮＡｓｅ非含有ＤＮＡｓｅ、および０．２Ｕ／ｍｌのＲＮＡｓｅ阻害剤）に移した。３０℃で１５分間のインキュベート後、組織ビットをＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、１ｍｌのＨＢＳＳ＋溶液（ＨＢＳＳ、３％ ＢＳＡ（脂肪酸非含有）および０．２Ｕ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ阻害剤）を添加した後、５～１０ストローク（気泡を避けて）均質化した。ホモジネートを予め濡らした７０μｍフィルタで濾過し、３００ｒｃｆで３～５分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットをＨＢＳＳ＋に再懸濁し、２００μｌのチップで研和して核塊を破壊し、３００ｒｃｆでペレット化し、１ｍｌのＨＢＳＳ＋に再懸濁し、等体積の冷２５％ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した後、氷上に置いた。氷上で、２ｍｌの４０％ Ｏｐｔｉｐｒｅｐを底部に添加し、上部に２ｍｌの２５％ Ｏｐｔｉｐｒｅｐをピペッティングし、その上に核混合物を慎重に積層することによって、１５ｍｌチューブ内で勾配を調製した。次いで、チューブを予冷揺動バケットロータ内で２５００ｒｃｆで２０分間回転させた。２５％および４０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ溶液（破片のふわふわした不透明な層の下に位置し、褐色がかった色相で透明に見える場合がある）の界面に位置する核を回収し、３体積のＨＢＳＳ＋に再懸濁した後、２５０ｒｃｆで１０分間スピンした。次いで、ペレットをＨＢＳＳ＋で洗浄した後、ＨＢＳＳ＋に再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＰＩまたはＤＡＰＩ）のための適切な核標識またはストレプトアビジン連結色素を添加してビオチン組み込みのために染色した。ＲＴで５分間インキュベートした後、試料をスピンダウンし、ＨＢＳＳ＋に再懸濁した。選別のために、単一核（核標識を使用）および光標識核の光活性化およびゲートに使用された光に曝露されることを除いて試料と同一の処理をされた非標識対照を調製する。
実施例４．画像取得および解析

透明化された試料を、不活性シリコーンゴム表面（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ、ＲＴＶ６１５）に固定した昆虫ピン（Ａｕｓｔｅｒｌｉｔｚ）にマウントし、ＢＡＢＢで完全に覆い、白色光レーザおよび低解像度用のＬｅｉｃａ ＢＡＢＢ液浸レンズＨＣＸ ＰＬ ＦＬＵＯＴＡＲ ５ｘ／０．１５ＩＭＭレンズおよび高解像度用のＨＣＸ ＡＰＯ Ｌ ２０ｘ／０．９５ＩＭＭレンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８顕微鏡を使用して画像化した。取得したＬｅｉｃａ画像コンテナをＩｍａｒｉｓコンテナ（Ｉｍａｒｉｓファイルコンバータ９．１．２、Ｂｉｔｐｌａｎｅ）に変換し、Ｉｍａｒｉｓ ９．３．１（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いた画像解析のためにパワーワークステーション（Ｄｕａｌ Ｘｅｏｎ Ｅ５－２６８７Ｗ ｖ４、１ＴＢメモリ、ＧｅＦｏｒｃｅ Ｔｉｔａｎ（パスカル））に移した。必要に応じて、シグナル強度を、非シグナルチャネルを使用して補償し、Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）のａｄａｐｔｈｒｅｓｈ関数または画像データを、Ｈｕｙｇｅｎｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂ．Ｖ．）を使用してデコンボリューションした。
実施例５．脊髄からの透明化された核のＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ

透明化された核をＣｙ３－ＰＡ光標識マウス脊髄から単離し、色素取り込みについて選別し、ライブラリをＳＰＬｉＴ ｓｅｑ法にしたがって調製し、ＭｉＳｅｑ装置を使用してＲＮＡを配列決定した。図７Ａには、検出された総バーコード数に対する固有バーコードのプロットされた数が示されている。次いで、２つのサブライブラリを２：１の比（固定：透明化）で混合した（固定されたが透明化されていない組織から単離された核および固定され、透明化された組織から単離された核）。図７Ｂに示されるように、ＴＰＭカウントを両方のライブラリについてプロットし、これは線形相関を示し、透明化のプロセスが配列決定結果を変化させないことを示した。図７Ｃには、固定されているが透明化されていない、ならびに固定され透明化されたマウス脊髄から生成されたリードを有するマウス第２染色体からのランダム領域が示されている。
実施例６．マウス肺におけるＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質組成の３Ｄ分析

適切に調製されたマウス肺片を透明化プロトコルに供し、画像化し、光活性化可能化合物をｉｎ ｓｉｔｕで添加する（組織を移動させなかった）。一方、関心領域は、以前に生成され、光活性化のためにプログラムされ、光活性化されたデータを使用して特定される。次いで、組織をアンマウントし、洗浄し、再水和させる。次いで、組織は、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して核を抽出するか、核を標的にして単離し、次いで、これを関連化合物（例えば、光活性化可能化合物としてフォトビオチンが使用される場合、ストレプトアビジン）で染色することによって処理することができる。透明化された核を光標識された肺から単離し、ストレプトアビジン結合色素を用いて染色し、色素取り込みについて選別する。ライブラリをＳＰＬｉＴ ｓｅｑ法にしたがって調製し、ＲＮＡを適切な方法を用いて配列決定する。あるいは、ＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲ、電気泳動等を含む任意の方法によって分析することができる。

ＤＮＡ配列決定の場合、プロセスは同様であり、核の単離および選別の後、適切な方法を用いてＤＮＡを配列決定することができる。ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ、電気泳動、または任意の他の適切な方法によって分析することもできる。

タンパク質分析のために、質量分析読み取り（例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析）または他の適切なタンパク質分析方法を使用して、ＰＡ化合物が組み込まれたタンパク質の組成を決定することができる。他のタンパク質分析方法は、電気泳動、タンパク質ブロット、エドマン分解または他のタンパク質配列決定等を含み得る。
実施例７．脊髄におけるＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質組成の３Ｄ分析

図８Ａは、色付きの円として背側の層が示されている、脊髄の異なる領域を示す、マウス脊髄の断面図である。拡大パネルでは、光活性化を受けた領域が強調表示されている。本実施例では、ＰＡの領域はさらに精密化されていないことに留意されたい－これは、解像度が使用されるレンズの光学解像度と相関するため、可能である。例えば：２０倍レンズは、０．８９μｍ×０．８９μｍ×１．６μｍの解像度を提供する。

図８Ｂは、本明細書に記載された手順を使用してマウス脊髄から単離された、透明化されたが光活性化されていない核のＦＡＣＳプロットである。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はＰＡ色素を示す（Ｃｙ３－ＰＡ）。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。

図８Ｃは、マウス脊髄から単離された、透明化され、光活性化された核のＦＡＣＳプロットを示す（図９Ａに示す）。Ｙ軸は核対比染色剤であるＤＡＰＩのシグナルを示し、Ｘ軸はＰＡ色素を示す（Ｃｙ３－ＰＡ）。ボックスは、組み込まれたＣｙ３について陰性（左）または組み込まれたＣｙ３について陽性（右）の単一核を示す。
実施例８．脊髄由来の透明化された核のＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ

透明化された組織がＳＰＬｉＴ－ｓｅｑによって分析され得ることを示すために、マウス脊髄を実施例１に記載されるように透明化に供した。透明化された組織から核を単離し、ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ分析に供した。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、ＳＰＬｉＴ－ｓｅｑ発現プロファイリングは、ニューロン、乏突起膠細胞および星状膠細胞を含む、透明化された組織に存在する、予想される細胞種のマーカーの発現を示した。ＲＮＡ発現プロファイルを、ＲＮＡ発現データベースに基づいて決定した。図１０Ａは、ＲＮＡ発現レベルのｎＦｅａｔｕｒｅプロット（左）およびｎカウントプロット（右）を示す。図１０Ｂは、ＲＮＡ発現レベルのＵＭＡＰプロットを示す。
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Claims (113)

1. 組織または組織試料の領域を標識するための方法であって、
   ａ） ３次元組織または組織試料を提供すること；
   ｂ） 前記試料を透明化すること；
   ｃ） 前記組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；および
   ｄ） 前記組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって前記領域を標識することを含む、方法。
2. 前記多光子レーザが、２光子レーザである、請求項１に記載の方法。
3. 前記多光子レーザが、３光子レーザである、請求項１に記載の方法。
4. 前記領域が、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細胞内区画が核である、請求項４に記載の方法。
6. 前記組織または組織試料を画像化することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記組織または組織試料が固定組織または固定組織試料である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記光活性化可能標識が検出可能部分を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記検出可能部分が発光部分を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記発光部分が、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である、請求項９に記載の方法。
11. 前記蛍光部分がフルオロフォアを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記検出可能部分の１つが抗体またはその機能性誘導体を含む、請求項８に記載の方法。
13. 前記光活性化可能標識がタグを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記タグが、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、オリゴヌクレオチドタグまたはビオチンタグを含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記試料透明化プロセスが、前記試料を脱水すること、および前記組織と類似または一致する屈折率を有する媒体に前記試料を移すことを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記屈折率が約１．３～約１．６である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記媒体が、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記媒体がＢＡＢＢ溶液を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記試料がｔｅｒｔ－ブタノール溶液によって脱水される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ｔｅｒｔ－ブタノール溶液が、トリメチルアミン、テトラヒドロフラン、エタノールまたはメタノールを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記光活性化可能標識が疎水性である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記光活性化可能標識が、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記光活性化可能標識がアリールアジド基を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記組織または組織試料から前記標識領域または前記標識領域の一部を単離することをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記標識領域または一部が、前記標識についてのＦＡＣＳ選別によって単離される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記単離された標識領域の組成物を分析して分析データを作成することをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 分析が、前記単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定することを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＲＮＡが配列決定によって分析される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＲＮＡがＳＰＬＩＴｓｅｑによって分析される、請求項２７に記載の方法。
30. 前記タンパク質が質量分析によって分析される、請求項２７に記載の方法。
31. 前記ＤＮＡがＤＮＡ配列決定によって分析される、請求項２７に記載の方法。
32. 前記標識領域を単離する前に前記組織または組織試料を画像化して画像を作成する方法であって、前記画像を前記分析データと組み合わせて前記領域の３次元組成マップを作成することをさらに含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. インタクトな組織または組織試料の３次元発現プロファイリングのための方法であって、
    ａ） ３次元のインタクトな組織または組織試料を提供すること；
    ｂ） 前記試料を透明化すること；
    ｃ） 前記組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；
    ｄ） 前記組織または組織試料の領域を多光子レーザに供し、それによって前記領域を標識すること；
    ｅ） 前記標識領域を画像化して画像を作成すること；
    ｆ） 前記組織または組織試料から前記標識領域を単離すること；
    ｇ） 前記単離された標識領域のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定すること；
    ｈ） 前記画像を前記単離された標識領域の前記ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成と組み合わせて、インタクトな前記組織または組織試料の３次元発現プロファイルを作成することを含む、方法。
34. 前記多光子レーザが、２光子レーザである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記多光子レーザが、３光子レーザである、請求項３３に記載の方法。
36. 前記領域が、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記単離された標識領域が単一の核である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記単離された標識領域のＲＮＡ組成が決定される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記ＲＮＡ組成が配列決定によって決定される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記ＲＮＡ組成がＳＰＬＩＴｓｅｑによって決定される、請求項３８に記載の方法。
41. 前記単離された標識領域のタンパク質組成が決定される、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記タンパク質組成が質量分析によって決定される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記単離された標識領域のＤＮＡ組成が決定される、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記ＤＮＡ組成がＤＮＡ配列決定によって決定される、請求項４３に記載の方法。
45. 組織または組織試料中の単一細胞または核を単離するための方法であって、
    ａ） ３次元組織または組織試料を提供すること；
    ｂ） 前記試料を透明化すること；
    ｃ） 前記組織または組織試料を光活性化可能標識と接触させること；
    ｄ） 細胞を多光子レーザに供し、それによって前記細胞を標識すること；
    ｅ） 前記組織または組織試料から前記標識細胞を解離すること；および
    ｆ） 前記標識細胞または核を単離することを含む、方法。
46. 前記多光子レーザが、２光子レーザである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記多光子レーザが、３光子レーザである、請求項４５に記載の方法。
48. 前記組織または組織試料を画像化することをさらに含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記組織または組織試料が固定組織または固定組織試料である、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記光活性化可能標識が検出可能部分を含む、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記検出可能部分が発光部分を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記発光部分が、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または電気化学発光部分である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記蛍光部分がフルオロフォアを含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記検出可能部分が抗体またはその機能性誘導体を含む、請求項５０に記載の方法。
55. 前記光活性化可能標識がタグを含む、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記タグが、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、またはビオチンタグを含む群から選択される、請求項５５に記載の方法。
57. 前記試料透明化プロセスが、前記試料を脱水すること、および前記組織と類似または一致する屈折率を有する媒体に前記試料を移すことを含む、請求項３３～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記媒体が、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記媒体がＢＡＢＢ溶液を含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記試料がｔｅｒｔ－ブタノール溶液によって脱水される、請求項３３～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記ｔｅｒｔ－ブタノール溶液が、トリメチルアミン、テトラヒドロフラン、エタノールまたはメタノールを含む、請求項６０に記載の方法。
62. 前記光活性化可能標識が疎水性である、請求項３３～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記光活性化可能標識が、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む、請求項３３～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記光活性化可能標識がアリールアジド基を含む、請求項６３に記載の方法。
65. 前記標識細胞または核を単離することをさらに含む、請求項４５～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記標識細胞または核が、前記標識についてのＦＡＣＳ選別によって単離される、請求項３３～４４または６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記単離された標識細胞または核を分析することをさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
68. 分析が、前記単離された標識細胞または核のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質組成を決定することを含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記ＲＮＡが単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって分析される、請求項３８または６８記載の方法。
70. 前記ＲＮＡ組成が配列決定によって決定される、請求項６８に記載の方法。
71. 前記単離された標識領域のタンパク質組成が決定される、請求項６８に記載の方法。
72. 前記タンパク質組成が質量分析によって決定される、請求項７１に記載の方法。
73. 前記単離された標識領域のＤＮＡ組成が決定される、請求項６８に記載の方法。
74. 前記ＤＮＡ組成がＤＮＡ配列決定によって決定される、請求項７３に記載の方法。
75. 前記ＲＮＡがＳＰＬＩＴｓｅｑによって分析される、請求項６８に記載の方法。
76. 前記組織または組織試料を第２の光活性化可能標識と接触させること、および前記組織または組織試料中の第２の細胞または核を多光子レーザに供し、それによって前記第２の細胞または核を標識することをさらに含む、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記多光子レーザが、２光子レーザである、請求項７６に記載の方法。
78. 前記多光子レーザが、３光子レーザである、請求項７６に記載の方法。
79. 前記組織または組織試料が、器官全体、腫瘍または動物である、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記２光子レーザ内の各光子の波長が約１７５ｎｍと約３５０ｎｍの間である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記組織または組織試料が腫瘍由来である、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 組織試料、前記組織に類似または一致する屈折率を有する媒体、および光活性化可能標識を含む、組成物。
83. 前記組織が標識領域を含む、請求項８２に記載の組成物。
84. 前記領域が、細胞、細胞内区画、凝集物または分泌凝集物を含む、請求項８３に記載の組成物。
85. 前記細胞が多光子法によって標識された、請求項８３または８４に記載の組成物。
86. 前記細胞が２光子法によって標識された、請求項８５に記載の組成物。
87. 前記細胞が３光子法によって標識された、請求項８５に記載の組成物。
88. 前記光活性化可能標識が検出可能部分を含む、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の組成物。
89. 前記検出可能部分が発光部分を含む、請求項８８に記載の組成物。
90. 前記発光部分が、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分、または電気化学発光部分である、請求項８９に記載の組成物。
91. 前記蛍光部分がフルオロフォアを含む、請求項９０に記載の組成物。
92. 前記光活性化可能標識がタグを含む、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の組成物。
93. 前記タグが、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、またはビオチンタグを含む群から選択される、請求項９２に記載の組成物。
94. 前記検出可能部分が抗体またはその機能性誘導体である、請求項８８に記載の組成物。
95. 前記光活性化可能標識が疎水性である、請求項８２～９４のいずれか一項に記載の組成物。
96. 前記光活性化可能標識が、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む、請求項８２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
97. 前記媒体が、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む、請求項８２～９６のいずれか一項に記載の組成物。
98. 前記媒体がＢＡＢＢ溶液を含む、請求項９７に記載の組成物。
99. 光活性化可能標識、および前記組織の屈折率に実質的に一致する屈折率を有する媒体を含む、透明化された組織試料。
100. 前記媒体が、トリエチルアミン、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、α－トコフェロールおよび／またはクアドロールの１つ以上を含むか、または含まない、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート（ＢＡＢＢ）またはその誘導体の溶液を含む、請求項９９に記載の透明化された組織。
101. 前記媒体がＢＡＢＢ溶液を含む、請求項１００に記載の透明化された組織。
102. 標識細胞を含む、請求項９９～１０１のいずれか一項に記載の透明化された組織。
103. 前記細胞が多光子法によって標識された、請求項１０２に記載の透明化された組織。
104. 前記光活性化可能標識が検出可能部分を含む、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載の透明化された組成物。
105. 前記検出可能部分が発光部分を含む、請求項１０４に記載の透明化された組織。
106. 前記発光部分が、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分、または電気化学発光部分である、請求項１０５に記載の透明化された組織。
107. 前記蛍光部分がフルオロフォアを含む、請求項１０６に記載の透明化された組織。
108. 前記光活性化可能標識がタグを含む、請求項９９～１０７のいずれか一項に記載の透明化された組織。
109. 前記タグが、アフィニティタグ、エピトープタグ、蛍光タグ、またはビオチンタグを含む群から選択される、請求項１０８に記載の透明化された組織。
110. 前記検出可能部分が抗体またはその機能性誘導体である、請求項１０４に記載の透明化された組織。
111. 前記光活性化可能標識が疎水性である、請求項９９～１１０のいずれか一項に記載の透明化された組織。
112. 前記光活性化可能標識が、フェニルアジド基、オルト－ヒドロキシフェニルアジド基、メタ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラヒドロフェニルアジド基、オルト－ニトロフェニルアジド基、メタ－ニトロフェニルアジド基、ジアジリン基、アジド－メチルクマリン基、またはソラレン基を含む、請求項９９～１１１のいずれか一項に記載の透明化された組織。
113. 前記組織または組織試料が腫瘍由来である、請求項８２～１１２のいずれか一項に記載の組成物または透明化された組織。

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