CN115943299A - 来自完整组织样品的生物材料的空间依赖性分析 - Google Patents

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Abstract

生物学研究需要从组织样品中分离和分析材料，例如RNA、DNA和蛋白质。本文所述的方法和组合物允许对大且完整的组织样品进行高分辨率成像，并随后以精确和位置依赖性方式分离材料。本文所述的方法和组合物可用于例如生物标志物的发现、细胞群的鉴定、病理学分析和特定目标区域中表达数据的产生。

Description

来自完整组织样品的生物材料的空间依赖性分析
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2020年3月18日提交的美国临时申请号62/991,583和2020年9月4日提交的美国临时申请号63/074,693的优先权，这些美国临时申请中的每一者整体并且出于所有目的并入本文。
背景技术
在大多数基于分子生物学的组织分析方法中，被分析材料的空间上下文会丢失。本领域已知的将序列分析与空间信息相结合的技术具有局限性，例如，低测序深度、样品体积限制、单个组织切片的分析或耗时的读出，以及其他约束。目前，据我们所知，没有可用的方法将分离精度与分析深度相结合。本文所述的方法和组合物解决了本领域中的这些和其他问题。
发明内容
本技术一般涉及用于对组织或组织样品的细胞或其他区域进行三维标记的方法和组合物。该方法包括对透明化的组织或样品进行成像，该透明化的组织或样品已通过以下进行标记：使目标区域(或细胞)与适当的标记接触，然后使所述目标区域(或细胞)经受多光子激光。然后可以从组织或样品中分离经标记区域并进行分析，诸如但不限于DNA测序、RNA测序、蛋白质组学分析、表观遗传学分析、免疫组织化学分析、染色体构象捕获或免疫荧光分析。可以使用各种分离目标经标记区域(或细胞)的方法，诸如但不限于激光辅助显微切割术、荧光辅助细胞分选(FACS)、磁活化细胞分选(MACS)或浮力活化细胞分选(BACS)。此类分析可以提供关于组织或样品的离散区域的信息。
在一方面，提供了一种用于标记组织或组织样品的区域的方法。该方法可以包括：a)提供三维组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；和d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域。
在另一方面，提供了一种用于完整组织或组织样品的三维表达谱分析的方法。该方法可以包括：a)提供三维完整组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域；e)对经标记区域进行成像以创建图像；f)从组织或组织样品中分离标记区域；g)确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成；h)使图像与分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成组合，以创建完整组织或组织样品的三维表达谱。
在一方面，提供了一种用于分离组织或组织样品中的单个细胞或细胞核的方法。该方法可以包括：a)提供包含目标细胞或细胞核的三维组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；d)使细胞或细胞核经受多光子激光，从而标记细胞或细胞核；e)从组织或组织样品中解离标记的细胞核；和f)分离经标记细胞或细胞核。
在另一方面，提供了一种组合物。该组合物可以包括组织样品、具有与组织相似或匹配的折射率的培养基以及光活化标记。
在一方面，提供了透明化的组织样品。透明化的组织样品可以包括光活化标记和具有与组织的折射率基本匹配的折射率的培养基。
附图说明
图1示出了组织透明化之前(左)和之后(右)的小鼠大脑。
图2是一系列荧光显微镜图片，示出了不同荧光蛋白在透明化的组织(下排)或对照组织(上排)中的稳定性。在该图中，293T细胞分别用在CMV启动子控制下驱动EGFP、mKate2、tdTomato或Venus的表达的质粒转染。
图3A至图3B是示出使用双光子显微镜以使用光反应性标记来标记透明化的组织中的目标细胞或细胞核的实施例的图。图3A是示出当标记暴露于波长在260nm和475nm之间的光时，用具有光反应性基团和生物素标签的光反应性标记标记分子的图。图3B是展示了与传统共聚焦显微镜(左)相比，使用双光子显微镜(右)标记目标细胞或细胞核的优势的图。传统的共聚焦显微镜会导致暴露于光(红色)和光激活化合物(绿色)的组织的整个区域发生光激活。相比之下，双光子显微镜允许更准确的光激活和靶标位点(红星)，从而避免非靶标组织的非特异性标记。
图4展示了使用双光子标记技术的示例性分析的概述。具有三维(3D)细胞结构的组织进行透明化，浸泡在光活化染料(例如，光生物素)中，使用双光子激光标记(例如，如图3B所示)，然后分离标记的细胞核用于分析，例如单细胞分析(例如，SPLiT-seq)。
图5示出了在室温(RT)或4℃(4C)三天后，在逆转录后未经EDC处理的处理样品的多核苷酸长度谱。
图6A至图6C展示了对来自完整组织样品的生物材料进行空间依赖性分析的方法的概述。图6A示出了示例性组织透明化(图6A，小图A)和标记过程(小图B至小图E)，以及经光标记细胞核的分离(小图F)。由此产生的样品可以通过从分离的经光标记细胞核(小图G和小图H)制备的SPLiT seq文库进行分析，随后进行数据分析(I)。此外(或替代地)，可以分析来自分离的组织的DNA(图6B)或蛋白质(图6C)。
图7A至图7C通过SPLiT-seq分析示出了经福尔马林固定的和透明化的样品的RNA质量。图7A是示出了每个条形码的唯一计数(log2(UMI))相对于条形码等级(条形码log10标度)的图。图7B是散点图，在y轴上示出固定的样品的log2(TPM)，在x轴上示出透明化的样品的log2(TPM)(TPM：每百万个转录本)。图7C示出了一个示例性基因组浏览器窗口，展示了小鼠(mm10)染色体2(顶部)的72kb片段的cDNA覆盖率，并比较了固定的且透明化的(中心)样品和固定的(底部)样品。如图7A至图7C所示，脊髓在Cy3-PA中被光活化。提取细胞核并分类用于标记并入。生成SPLiT-seq文库并通过HiSeq测序。
图8A至图8C示出了使用双光子标记的脊髓组织。图8A是小鼠脊髓的横截面图，示出了脊髓的不同区域，背侧层用彩色圆圈指示。在放大的小图中，突出显示了经受光激活的区域。图8B是从小鼠脊髓分离的透明化的但不是光活化的细胞核的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了用于本实验的PA染料：Cy3-PA。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入的Cy3呈阳性(右)。图8C是从小鼠脊髓分离的透明化的且光活化的细胞核(如图9A所示)的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了用于本实验的PA染料：Cy3-PA。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入的Cy3呈阳性(右)。
图9A至图9C展示了用于本发明方法中的示例性化合物。图9A示出了可用于光标记的光反应性化合物的实例。图9B示出了对由紫外(UV)光诱导的芳基叠氮化物的示例性修饰。图9C示出了合成的光反应性化合物的实例。
图10A至10B示出了使用SPLiT-seq分析，来自脊髓的透明化的细胞核的表达谱。图10A是示出了细胞类型的表达谱(与所示细胞类型相关的基因的表达水平)的图。图10B是通过图10中的数据的UMAP所生成的图。
图11是多重复用如何允许多个标记事件的示例卡通图。可以将组织暴露于第一染料(染料1)，然后对第一目标区域进行双光子标记(左小图)。然后可以将相同的组织与第二染料(染料2)接触(任选地在洗涤后)，然后对第二目标区域(中小图)进行双光子标记。如果需要，可以将相同的组织与第三染料(染料3)接触(任选地在洗涤后)，然后对第三目标区域进行双光子标记(右图)。
图12A至图12C展示了在整个固定中用于光激活的靶标化合物的应用领域的实例。应用领域的实例包括肿瘤异质性、炎症肿瘤/免疫沙漠型和接近血管系统(图12A)，发现并标记稀疏细胞群(图12B)，生成表达数据和3D组织学(图12C)。
具体实施方式
在阅读本说明书之后，如何在各种替代实施例和替代应用中实现本公开对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，本文将不描述本发明的全部的各种实施例。应当理解，此处所呈现的实施例仅以示例的方式呈现，而非限制性的。因此，各种替代实施例的详细描述不应被解释为限制如本文所述的本公开的范围或广度。
在公开和描述本技术之前，应当理解，下文描述的方面不限于特定的组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因为这些当然可能有所不同。另外应当了解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。
仅为方便读者而划分为各个部分的详细描述和在任何部分中发现的公开内容可与其他部分中的内容相结合。为方便读者，本说明书中可能会使用标题或副标题，其不旨在影响本公开的范围。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。在本说明书和随后的权利要求中，将引用多个定义为具有以下含义的术语：
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。
“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能或不可能发生，并且该描述包括该事件或情况发生的情况和不发生的情况。
在数字标号(例如，温度、时间、量、浓度和此类其他标号，包括范围)之前使用的术语“约”表明可能以(+)或(-)10％、5％、1％或它们之间的任何子范围或子值变化的近似值。优选地，术语“约”在用于剂量时是指剂量可变化+/-10％。
“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”表示出于所述目的，排除对该组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物不排除不会实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”表示排除其他成分的微量元素以外的部分和实质性方法步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的实施例均在本公开的范围内。
方法
在一方面，提供了一种用于标记组织或组织样品的区域的方法。该方法可以包括：(a)提供三维组织或组织样品；(b)透明化样品；(c)使组织或组织样品与光活化标记接触；和(d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域。在实施例中，多光子激光是双光子激光。在实施例中，多光子激光是三光子激光。
对于本文提供的方法，在实施例中，该区域包括细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。在实施例中，该区域包括细胞。在实施例中，该区域包括亚细胞区室。在实施例中，该区域包括聚集体。在实施例中，该区域包括分泌的聚集体。在实施例中，亚细胞区室是细胞核。
在实施例中，该方法进一步包括对组织或组织样品进行成像。在实施例中，该方法进一步包括对组织进行成像。在实施例中，该方法进一步包括对组织样品进行成像。在实施例中，组织或组织样品是固定组织或固定组织样品。在实施例中，组织为固定组织。在实施例中，组织为固定组织样品。在实施例中，组织样品为固定组织。在实施例中，组织样品为固定组织样品。
对于本文提供的方法，在实施例中，光活化标记包括可检测部分。在实施例中，可检测部分包括发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分。在实施例中，发光部分为化学发光部分。在实施例中，发光部分为生物发光部分。在实施例中，发光部分为电化学发光部分。在实施例中，荧光部分包括荧光团。在实施例中，可检测部分之一包括抗体或其官能性衍生物。在实施例中，光活化标记包括标签。在实施例中，标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。在实施例中，标签为亲和标签。在实施例中，标签为表位标签。在实施例中，标签为荧光标签。在实施例中，标签为寡核苷酸标签。在实施例中，标签为生物素标签。
对于本文提供的方法，在实施例中，样品透明化过程包括使样品脱水并且将样品转移到具有与组织相似或匹配的折射率的培养基中。在实施例中，折射率在约1.3和约1.6之间。在实施例中，折射率为约1.3。在实施例中，折射率为约1.325。在实施例中，折射率为约1.35。在实施例中，折射率为约1.375。在实施例中，折射率为约1.4。在实施例中，折射率为约1.425。在实施例中，折射率为约1.45。在实施例中，折射率为约1.475。在实施例中，折射率为约1.5。在实施例中，折射率为约1.525。在实施例中，折射率为约1.55。在实施例中，折射率为约1.575。在实施例中，折射率为约1.6。在实施例中，折射率为约1.3、约1.325、约1.35、约1.375、约1.4、约1.425、约1.45、约1.475、约1.5、约1.525、约1.55、约1.575或约1.6。折射率可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点，或任何所述值之间的任何范围。
在实施例中，培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括BABB溶液。
如上文所述的本文提供的方法，在实施例中，样品透明化过程包括使样品脱水。在实施例中，样品通过叔丁醇溶液来脱水。在实施例中，叔丁醇溶液包括三甲胺、四氢呋喃、乙醇或甲醇。在实施例中，叔丁醇溶液包括三甲胺。在实施例中，叔丁醇溶液包括四氢呋喃。在实施例中，叔丁醇溶液包括乙醇。在实施例中，叔丁醇溶液包括甲醇。
对于本文提供的方法，在实施例中，光活化标记为疏水性。对于本文提供的方法，在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括四氟苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括双吖丙啶基团。在实施例中，光活化标记包括叠氮基甲基香豆素基团。在实施例中，光活化标记包括补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括芳基叠氮化物基团。
在实施例中，该方法进一步包括从组织或组织样品中分离经标记区域或经标记区域的一部分。在实施例中，该方法进一步包括从组织中分离经标记区域。在实施例中，该方法进一步包括从组织中分离经标记区域的一部分。在实施例中，该方法进一步包括从组织样品中分离经标记区域。在实施例中，该方法进一步包括从组织样品中分离经标记区域的一部分。在实施例中，经标记区域或部分通过针对标记的FACS分选来分离。在实施例中，该方法进一步包括分析分离的经标记区域的组成以产生分析数据。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的DNA、RNA和蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的DNA、RNA或蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的DNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的RNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记区域的蛋白质组成。在实施例中，通过SPLITseq分析RNA。
对于本文提供的方法，在实施例中，在分离经标记区域之前对组织或组织样品进行了成像以创建图像，进一步包括使图像与分析数据组合以创建区域的三维组成图。
在一方面，提供了一种用于完整组织或组织样品的三维表达谱分析的方法。该方法可以包括：(a)提供三维完整组织或组织样品；(b)透明化样品；(c)使组织或组织样品与光活化标记接触；(d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域；(e)对经标记区域进行成像以创建图像；(f)从组织或组织样品中分离标记区域；(g)确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成；(h)使图像与分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成组合，以创建完整组织或组织样品的三维表达谱。在实施例中，多光子激光是双光子激光。在实施例中，多光子激光是三光子激光。在实施例中，该区域为细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。在实施例中，该区域为细胞。在实施例中，该区域为亚细胞区室。在实施例中，该区域为聚集体。在实施例中，该区域为分泌的聚集体。在实施例中，分离的经标记区域为单个细胞核。在实施例中，确定分离的经标记区域的RNA组成。
在一方面，提供了一种用于分离组织或组织样品中的单个细胞或细胞核的方法。该方法可以包括：(a)提供三维组织或组织样品；(b)透明化样品；(c)使组织或组织样品与光活化标记接触；(d)使细胞经受多光子激光，从而标记细胞；(e)从组织或组织样品中解离经标记细胞；和(f)分离经标记细胞或细胞核。在实施例中，多光子激光是双光子激光。在实施例中，多光子激光是三光子激光。
在实施例中，该方法进一步包括对组织或组织样品进行成像。在实施例中，该方法进一步包括对组织进行成像。在实施例中，该方法进一步包括对组织样品进行成像。在实施例中，组织或组织样品是固定组织或固定组织样品。在实施例中，组织为固定组织。在实施例中，组织为固定组织样品。在实施例中，组织样品为固定组织。在实施例中，组织样品为固定组织样品。
对于本文提供的方法，在实施例中，光活化标记包括可检测部分。在实施例中，可检测部分包括发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分。在实施例中，发光部分为化学发光部分。在实施例中，发光部分为生物发光部分。在实施例中，发光部分为电化学发光部分。在实施例中，荧光部分包括荧光团。在实施例中，可检测部分包括抗体或其官能性衍生物。在实施例中，光活化标记包括标签。在实施例中，标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。在实施例中，标签为亲和标签。在实施例中，标签为表位标签。在实施例中，标签为荧光标签。在实施例中，标签为寡核苷酸标签。在实施例中，标签为生物素标签。
对于本文提供的方法，在实施例中，样品透明化过程包括使样品脱水并且将样品转移到具有与组织相似或匹配的折射率的培养基中。在实施例中，培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括BABB溶液。
对于本文提供的方法，在实施例中，样品通过叔丁醇溶液来脱水。在实施例中，叔丁醇溶液包括三甲胺、四氢呋喃、乙醇或甲醇。在实施例中，叔丁醇溶液包括三甲胺。在实施例中，叔丁醇溶液包括四氢呋喃。在实施例中，叔丁醇溶液包括乙醇。在实施例中，叔丁醇溶液包括甲醇。在实施例中，光活化标记为疏水性。
对于本文提供的方法，在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括四氟苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括双吖丙啶基团。在实施例中，光活化标记包括叠氮基甲基香豆素基团。在实施例中，光活化标记包括补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括芳基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括图9A所示的基团。
在实施例中，本文提供的方法进一步包括分离经标记细胞或细胞核。在实施例中，该方法进一步包括分离经标记细胞。在实施例中，该方法进一步包括分离经标记细胞核。在实施例中，经标记细胞或细胞核通过针对标记的荧光活化细胞分选(FACS)分选来分离。在实施例中，经标记细胞通过针对标记的FACS分选来分离。在实施例中，细胞核通过针对标记的FACS分选来分离。在实施例中，经标记细胞或细胞核通过针对标记的磁活化细胞分选(MACS)分选来分离。在实施例中，经标记细胞通过针对标记的MACS分选来分离。在实施例中，经标记细胞核通过针对标记的MACS分选来分离。在实施例中，经标记细胞或细胞核通过针对标记的浮力活化细胞分选(BACS)分选来分离。在实施例中，经标记细胞通过针对标记的BACS分选来分离。在实施例中，经标记细胞核通过针对标记的BACS分选来分离。在实施例中，经标记细胞或细胞核通过针对标记的基于亲和力的柱纯化(例如亲和层析)分选来分离。在实施例中，经标记细胞通过针对标记的基于亲和力的柱纯化分选来分离。在实施例中，经标记细胞核通过针对标记的基于亲和力的柱纯化分选来分离。
在实施例中，本文提供的方法进一步包括分析分离的经标记细胞或细胞核。在实施例中，该方法进一步包括分析分离的经标记细胞。在实施例中，该方法进一步包括分析分离的经标记细胞核。在实施例中，分析包括确定分离的标记细胞或细胞核的DNA、RNA和/或蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞或细胞核的DNA、RNA和蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞或细胞核的DNA、RNA或蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞或细胞核的DNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞或细胞核的RNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞或细胞核的蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞的DNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞的RNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞的蛋白质组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞核的DNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞核的RNA组成。在实施例中，分析包括确定分离的经标记细胞核的蛋白质组成。在实施例中，通过单细胞RNA测序(scRNAseq)分析RNA。在实施例中，通过SPLITseq分析RNA。
对于本文提供的方法，在实施例中，该方法进一步包括使组织或组织样品与第二光活化标记接触，并使组织或组织样品中的第二细胞或细胞核经受多光子激光，从而标记第二细胞或细胞核。参见例如图11。在实施例中，多光子激光是双光子激光。在实施例中，多光子激光是三光子激光。
对于本文提供的方法，在实施例中，组织或组织样品为整个器官、肿瘤或动物。在实施例中，组织或组织样品为整个器官。在实施例中，组织或组织样品为肿瘤。在实施例中，组织或组织样品为动物。在实施例中，组织为整个器官。在实施例中，组织为肿瘤。在实施例中，组织为动物。在实施例中，组织样品为整个器官。在实施例中，组织样品为肿瘤。在实施例中，组织样品为动物。
对于本文提供的方法，在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长在约500nm与约1100nm之间。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约500nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约505nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约510nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约515nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约520nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约525nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约530nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约535nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约540nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约545nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约550nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约555nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约560nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约565nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约570nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约575nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约580nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约585nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约590nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约595nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约600nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约605nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约610nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约615nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约620nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约625nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约630nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约635nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约640nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约645nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约650nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约655nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约660nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约665nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约670nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约675nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约680nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约685nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约690nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约695nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约700nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约705nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约710nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约715nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约720nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约725nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约730nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约735nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约740nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约745nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约750nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约755nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约760nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约765nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约770nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约775nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约780nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约785nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约790nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约795nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约800nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约805nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约810nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约815nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约820nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约825nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约830nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约835nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约840nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约845nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约850nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约855nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约860nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约865nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约870nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约875nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约880nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约885nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约890nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约895nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约900nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约905nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约910nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约915nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约920nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约925nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约930nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约935nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约940nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约945nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约950nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约955nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约960nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约965nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约970nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约975nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约980nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约985nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约990nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约995nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1000nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1005nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1010nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1015nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1020nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1025nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1030nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1035nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1040nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1045nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1050nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1055nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1060nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1065nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1070nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1075nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1080nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1085nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1090nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1095nm。在实施例中，双光子激光中的每个光子的波长为约1100nm。在实施例中，两个光子激光中的每个光子的波长为约905nm、约910nm、约915nm、约920nm、约925nm、约930nm、约935nm、约940nm、约945nm、约950nm、约955nm、约960nm、约965nm、约970nm、约975nm、约980nm、约985nm、约990nm、约995nm、约1000nm、约1005nm、约1010nm、约1015nm、约1020nm、约1025nm、约1030nm、约1035nm、约1040nm、约1045nm、约1050nm、约1055nm、约1060nm、约1065nm、约1070nm、约1075nm、约1080nm、约1085nm、约1090nm、约1095nm或约1100nm。波长可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点，或任何所述值之间的任何范围。
对于本文提供的方法，在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长在约690nm与约2500nm之间。对于本文提供的方法，在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约690nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约695nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约700nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约705nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约710nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约715nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约720nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约725nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约730nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约735nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约740nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约745nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约750nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约755nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约760nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约765nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约770nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约775nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约780nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约785nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约790nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约795nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约800nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约805nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约810nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约815nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约820nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约825nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约830nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约835nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约840nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约845nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约850nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约855nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约860nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约865nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约870nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约875nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约880nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约885nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约890nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约895nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约905nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约910nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约915nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约920nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约925nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约930nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约935nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约940nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约945nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约950nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约955nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约960nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约965nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约970nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约975nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约980nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约985nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约990nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约995nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1000nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1005nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1010nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1015nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1020nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1025nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1030nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1035nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1040nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1045nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1050nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1055nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1060nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1065nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1070nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1075nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1080nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1085nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1090nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1095nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1100nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1105nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1110nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1115nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1120nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1125nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1130nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1135nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1140nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1145nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1150nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1155nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1160nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1165nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1170nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1175nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1180nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1185nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1190nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约1195nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2000nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2005nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2010nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2015nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2020nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2025nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2030nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2035nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2040nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2045nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2050nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2055nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2060nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2065nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2070nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2075nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2080nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2085nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2090nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2100nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2105nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2110nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2115nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2120nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2125nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2130nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2135nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2140nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2145nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2150nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2155nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2160nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2165nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2170nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2175nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2180nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2185nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2190nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2195nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2200nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2205nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2210nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2215nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2220nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2225nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2230nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2235nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2240nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2245nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2250nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2255nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2260nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2265nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2270nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2275nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2280nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2285nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2290nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2295nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2300nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2305nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2310nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2315nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2320nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2325nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2330nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2335nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2340nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2345nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2350nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2350nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2355nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2360nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2365nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2370nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2375nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2380nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2385nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2390nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2395nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2400nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2405nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2410nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2415nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2420nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2425nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2430nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2435nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2440nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2445nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2450nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2455nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2460nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2465nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2470nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2475nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2480nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2485nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2490nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2495nm。在实施例中，三光子激光中的每个光子的波长为约2500nm。
组合物
在一方面，提供了一种组合物。该组合物可以包括组织样品、具有与组织相似或匹配的折射率的培养基以及光活化标记。在实施例中，组织包括经标记区域。在实施例中，该区域包括细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。在实施例中，该区域包括细胞。在实施例中，该区域包括亚细胞区室。在实施例中，该区域包括聚集体。在实施例中，该区域包括分泌的聚集体。在实施例中，细胞通过多光子方法标记。在实施例中，细胞通过双光子方法标记。在实施例中，细胞通过三光子方法进行标记。在实施例中，光活化标记包括可检测部分。在实施例中，可检测部分包括发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分。在实施例中，发光部分为化学发光部分。在实施例中，发光部分为生物发光部分。在实施例中，发光部分为电化学发光部分。在实施例中，荧光部分包括荧光团。
对于本文提供的组合物，在实施例中，光活化标记包括标签。在实施例中，标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。在实施例中，标签为亲和标签。在实施例中，标签为表位标签。在实施例中，标签为荧光标签。在实施例中，标签为寡核苷酸标签。在实施例中，标签为生物素标签。在实施例中，可检测部分为抗体或其官能性衍生物。在实施例中，光活化标记为疏水性。
对于本文提供的组合物，在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括四氟苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括双吖丙啶基团。在实施例中，光活化标记包括叠氮基甲基香豆素基团。在实施例中，光活化标记包括补骨脂素基团。
对于本文提供的组合物，在实施例中，培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括BABB溶液。在实施例中，可明确排除一个或多个列出的组合物。
在一方面，提供了一种透明化的组织样品。透明化的组织样品可以包括光活化标记和具有与组织的折射率基本匹配的折射率的培养基。在实施例中，对于本文提供的透明化的组织，培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲醇的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。在实施例中，培养基包括BABB溶液。在实施例中，可明确排除一个或多个列出的组合物。
在实施例中，此处提供的透明化的组织包括经标记细胞。在实施例中，细胞通过多光子方法标记。在实施例中，光活化标记包括可检测部分。在实施例中，可检测部分包括发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。在实施例中，发光部分为荧光部分。在实施例中，发光部分为化学发光部分。在实施例中，发光部分为生物发光部分。在实施例中，发光部分为电化学发光部分。在实施例中，荧光部分包括荧光团。在实施例中，光活化标记包括标签。在实施例中，标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。在实施例中，标签为亲和标签。在实施例中，标签为表位标签。在实施例中，标签为荧光标签。在实施例中，标签为寡核苷酸标签。在实施例中，标签为生物素标签。在实施例中，可检测部分为抗体或其官能性衍生物。在实施例中，光活化标记为疏水性。在实施例中，可明确排除一个或多个列出的标记。
对于本文提供的透明化的组织，在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。在实施例中，光活化标记包括苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间羟基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括四氟苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括邻硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括间硝基苯基叠氮化物基团。在实施例中，光活化标记包括双吖丙啶基团。在实施例中，光活化标记包括叠氮基甲基香豆素基团。在实施例中，光活化标记包括补骨脂素基团。在实施例中，可明确排除一个或多个列出的标记。
用途
本文所述的方法和组合物可用于需要进行三维组织分析的任何应用中。以下用途仅为示例，并非旨在限制。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于检测肿瘤或肿瘤样品中的异质性(例如，活检)。来自患者的肿瘤样品可以如本文所述进行透明化。然后可以使肿瘤样品与光活化标记接触，并使一个或多个目标区域经受多光子激光(例如，双光子激光)。目标区域可包括肿瘤内的各个区域，以及与肿瘤相邻的“正常”细胞。经标记区域可以通过一种或多种分析方法进行分离和分析，例如DNA、RNA和/或蛋白质分析。可以在分离或分析之前的任何步骤或多个步骤对肿瘤样品进行成像，例如在透明化之前或之后、在与光活化标记接触之前或之后等。从分析中确定的DNA、RNA和/或蛋白质谱可以与成像相结合，以提供肿瘤的详细图谱。对不同区域内的肿瘤DNA、RNA和/或蛋白质的分析可以允许构建肿瘤异质性的三维进化模型。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于鉴定样品(例如肿瘤样品)中的免疫细胞(或缺乏免疫细胞)。例如，可以对样品的一个或多个区域进行标记、成像和分离，如本文所述。可以分析分离的区域，例如针对由一种或多种目标免疫细胞表达(优先表达)的RNA和/或蛋白质。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于在样品(例如肿瘤样品)中识别血管的位置和/或基于与血管的接近程度分析DNA或RNA或蛋白质表达。例如，如本文所述，可基于与血管的接近程度对样品的一个或多个区域进行标记、成像和分离。可以分析分离的区域，例如针对由一种或多种目标细胞表达(优先表达)的RNA和/或蛋白质。类似地，可以使用这些方法分析转移区域或疑似转移区域。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于寻找稀疏细胞群的位置。某些细胞类型在某些组织中发现的数量很少，且/或分散在组织内的离散区域中。本文所述的组合物和方法可以帮助识别/定位组织内的那些细胞或区域。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于分析样品中的特定细胞类型。例如但不限于，脊髓由背根神经节的多个层/区域组成，每一层或区域包含不同的细胞类型。本文所述的组合物和方法可以帮助识别各种层中的细胞之间的差异(和/或相似性)。因此，可以分析由多种细胞类型组成的任何组织。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于生成数据，例如针对用3D组织学分析组织或样品后，组织或样品中目标区域的表达(例如RNA或蛋白质)或突变(例如DNA)数据。
在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于标记和提取组织或样品内的精确目标区域。例如，可以在1.6x1.6x3μm的分辨率内标记目标区域(使用20x镜头)。
应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且其各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及本发明所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
实例
本领域技术人员将理解，制备和使用本文所述颗粒的描述仅用于说明的目的，并且本公开不受该说明的限制。
实例1.组织的脱水和透明化
脱水和组织透明化
为了收获没有残余血液的器官，用温热的PBS/肝素(5U/ml；在稳定压力下每只小鼠50-100ml(重力流或Perfusion One系统；1-1.5mH2O(Leica)))灌注小鼠，随后灌注2％PFA(Electron Microscopy Sciences，在PBS中稀释)。根据样品的渗透性，将取出的器官在PFA中进行后固定于4℃过夜。每个样品在30％和50％叔丁醇(pH＝9.5，RT)中孵育X小时(其中X是由菲克扩散定律确定的时间，以小鼠大脑孵育24小时作为参考；T＝(1/[2D])r2，D＝扩散系数(从小鼠脑尺寸和孵育时间推断＝0.00015349)，r＝到样品中心的最近距离)，随后依次在70％、80％、96％和100％叔丁醇(pH＝9.5，30℃)中，最后在BABB(苯甲醇:苯甲酸苄酯，体积比为1:2，pH＝9.5，30℃)中透明化。在最后的透明化步骤之后，器官可以在BABB溶液中在4℃储存至少一年。遵循此方案的大约每步24小时孵育的透明化的小鼠大脑的实例，可以在图1中找到。
稳定性实验
为了表明上述方案没有改变细胞的稳定性和完整性，HEK293细胞分别用编码EGFP、mKate2、tdTomato或Venus的质粒转染。将细胞铺在Millipore EZ载玻片上，用4％PFA固定，然后按照上述方案进行处理，每步孵育时间为15分钟。对于安装，BABB用作安装介质，且玻璃盖玻片用于覆盖细胞。然后使用Leica SP8立式激光扫描显微镜对细胞进行成像，其波长与荧光蛋白的激发/发射光谱相匹配。对照载玻片未经过透明化方案并使用VectaShield安装介质安装。这些稳定性实验的示例性结果显示在图2中。
实例2.组织的双光子标记
针对组织深处内的光反应性化合物的空间限定活化，将样品与溶解在BABB(12.5μg/ml)中的合适化合物一起在室温(RT)按菲克扩散定律描述的时间孵育或在4℃过夜孵育。通过使用10μs的像素停留时间、512x512的分辨率、20x镜头(Leica HCX APO L 20x/0.95IMM)和75mW的激光功率在700nm，在镜头下成功地将该化合物缀合到目标位点。基于光生物素(生物素-连接剂-苯叠氮化物；Sigma A1935-1MG)的组成，合成了光活化海水蓝、Cy3、Cy5和Alexa 488，它们易溶解在经pH调节的BABB(1mg/ml(原液浓度))中。对样品进行光标记后，立即按照通过菲克定律确定的时间在BABB(pH＝9.5，30℃)中洗涤样品(通过将样品转移到相应的溶液中)，然后在100％叔丁醇(pH＝9.5，30℃)中洗涤，随后在100％DMSO(pH＝9.5，30℃)中进行最后的洗涤步骤，随后在100％DMSO中在4℃储存直至进一步处理。
实例3.经光标记细胞核的分离和纯化
所有设备都用RNAse处理。储存在DMSO中的经光标记组织通过在添加了RNAse抑制剂(Takara)的PBS中在摇床上在20℃孵育30分钟进行再水化。将组织切成<1mm的碎片并转移到裂解缓冲液(包含二价的975μl HBSS、10μl蛋白酶K、10μl无RNAse的DNAse和0.2U/mlRNAse抑制剂)。在30℃孵育15分钟后，将组织碎片转移到Dounce匀浆器中，并在5至10次(避免气泡)匀浆前加入1ml HBSS+溶液(HBSS、3％BSA(不含脂肪酸)和0.2U/ml RNAse抑制剂)。通过预先润湿的70μm过滤器过滤匀浆，并以300rcf旋转3至5分钟。弃去上清液，将沉淀重新悬浮在HBSS+中，用200μl尖端研磨以打碎细胞核团块，以300rcf沉淀，重新悬浮在1ml HBSS+中，然后放在冰上之前与等体积的冷25％Optiprep(Sigma-Aldrich)混合。在冰上，通过将2ml 40％Optiprep添加到底部，在顶部移取2ml 25％Optiprep并小心地将细胞核混合物覆盖在其上层，在15ml管中制备梯度。然后将管在预冷的浮桶式转头中以2500rcf旋转20分钟。收集位于25％和40％Optiprep溶液界面处的细胞核(位于蓬松不透明的碎片层下，可能呈褐色透明)并在以250rcf旋转10分钟之前重悬于3体积的HBSS+中。然后用HBSS+洗涤沉淀，再将其重新悬浮在HBSS+中，并添加适当的FACS(PI或DAPI)细胞核标记或链霉抗生物素蛋白连接染料来染色以掺入生物素。在室温下孵育5分钟后，将样品离心并重新悬浮在HBSS+中。针对分选准备一个未标记的对照，该对照处理与样品相同，除了暴露在用于光活化的光和用于单个细胞核(使用细胞核标记)和经光标记的细胞核的门控。
实例4.图像采集和分析
将透明化的样品安装在固定在惰性硅橡胶表面(Momentive，RTV615)的昆虫针(Austerlitz)上，完全用BABB覆盖，并使用配备白激光和Leica BABB浸没透镜(HCX PLFLUOTAR 5x/0.15IMM镜头用于低分辨率，HCX APO L 20x/0.95IMM镜头用于高分辨率)的Leica SP8显微镜进行成像。将获取的Leica图像容器转换为Imaris容器(Imaris FileConverter 9.1.2，Bitplane)并传输到电源工作站(双Xeon E5-2687W v4，1TB内存，GeForce Titan(Pascal))，使用Imaris 9.3.1(Bitplane)进行图像分析。必要时，使用非信号通道补偿信号强度，并使用Matlab(MathWorks)的adapthresh函数或使用Huygens(Scientific Volume Imaging B.V.)对图像数据进行反卷积。
实例5.来自脊髓的透明化的细胞核的SPLiT-seq
从Cy3-PA光标记的小鼠脊髓分离出透明化的细胞核，对染料掺入进行分类，根据SPLiT seq方法制备文库，并使用MiSeq机器对RNA进行测序。图7A所示是唯一条形码的计数与检测到的总条形码数量的图。然后以2:1的比例(固定：透明化)混合两个子文库(从固定但未透明化的组织中分离的细胞核和从固定和透明化的组织中分离的细胞核)。如图7B所示，绘制了两个文库的TPM计数并显示了线性相关性，表明透明化过程不会改变测序结果。如图7C所示是来自小鼠2号染色体的随机区域，具有从固定但未透明化以及固定且透明化的小鼠脊髓产生的读数。
实例6.小鼠肺中DNA/RNA/蛋白质成分的3D分析
对准备充分的小鼠肺片进行透明化方案、成像，并在原位(组织未移动)添加光活化化合物。同时，使用先前生成的数据识别目标区域，对光活化进行程序化，并进行光活化。然后将组织卸下、清洗并再水化。然后可以通过以下方式处理组织：使用Dounce匀浆器提取细胞核，然后靶向分离用相关化合物(例如，当光生物素用作光活化化合物时，链霉抗生物素蛋白)染色的细胞核。将透明化的细胞核从光标记的肺分离，使用链霉抗生物素蛋白偶联染料染色，并针对染料掺入分类。该文库是根据SPLiT seq方法制备的，并使用适当的方法对RNA进行测序。或者，可以通过任何方法分析RNA，包括RT-PCR、电泳等。
对于DNA测序，过程类似；在分离细胞核和分选后，可以使用适当的方法对DNA进行测序。DNA也可以通过例如PCR、电泳或任何其他合适的方法进行分析。
对于蛋白质分析，质谱读出(例如液相色谱/质谱)或其他合适的蛋白质分析方法可用于确定掺入PA化合物的蛋白质的组成。其他蛋白质分析方法可以包括电泳、蛋白质印迹、埃德曼降解或其他蛋白质测序等。
实例7.脊髓中DNA/RNA/蛋白质成分的3D分析
图8A是小鼠脊髓的横截面图，示出了脊髓的不同区域，背侧层用彩色圆圈指示。在放大的小图中，突出显示了经受光激活的区域。请注意，在此实例中，PA的区域没有进一步细化—这是可能的，因为分辨率与所用镜头的光学分辨率相关。例如：20x镜头将提供0.89μm X 0.89μm x 1.6μm的分辨率。
图8B示出了使用本文描述的程序从小鼠脊髓分离的透明化的但不是光活化的细胞核的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了PA染料(Cy3-PA)。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入的Cy3呈阳性(右)。
图8C示出了从小鼠脊髓分离的透明化的且光活化的细胞核(如图9A所示)的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了PA染料(Cy3-PA)。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入的Cy3呈阳性(右)。
实例8.来自脊髓的透明化的细胞核的SPLiTseq
为了表明可以通过SPLiT-seq分析透明化的组织，如实例1中所述对小鼠脊髓进行透明化。从透明化的组织中分离出细胞核，并进行SPLiT-seq分析。如图10A和10B所示，SPLiT-seq表达谱示出了透明化组织中存在的预期细胞类型的标志物的表达，包括神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。RNA表达谱是基于RNA表达数据库确定的。图10A示出了RNA表达水平的nFeature图(左)和nCount图(右)。图10B示出了RNA表达水平的UMAP图。
参考文献
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2.Rodriques,S.,Stickels,R.,Goeva,A.,Martin,C.,Murray,E.,Vanderburg,C.,Welch,J.,Chen,L.,Chen,F.and Macosko,E.(2019).Slide-seq:A scalabletechnology for measuring genome-wide expression at high spatialresolution.Science,363(6434),pp.1463-1467。
3.Schwarz,M.K.,Scherbarth,A.,Sprengel,R.,Engelhardt,J.,Theer,P.,&Giese,G.(2015).Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imagingof cleared,intact mouse brains.PLoS ONE,10,1–26。
4.Wang,X.,Allen,W.,Wright,M.,Sylwestrak,E.,Samusik,N.,Vesuna,S.,Evans,K.,Liu,C.,Ramakrishnan,C.,Liu,J.,Nolan,G.,Bava,F.and Deisseroth,K.(2018).Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-celltranscriptional states.Science,361(6400),p.eaat5691。

Claims (113)

1.一种用于标记组织或组织样品的区域的方法，其包括：
a)提供三维组织或组织样品；
b)透明化所述样品；
c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；和
d)使所述组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记所述区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述区域包括细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述亚细胞区室为细胞核。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括对所述组织或组织样品进行成像。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品为固定组织或固定组织样品。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括可检测部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测部分包括发光部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述荧光部分包括荧光团。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测部分之一包括抗体或其官能性衍生物。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括标签。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中样品透明化过程包括使所述样品脱水并且将所述样品转移到具有与所述组织相似或匹配的折射率的培养基中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述折射率在约1.3与约1.6之间。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养基包括BABB溶液。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品通过叔丁醇溶液来脱水。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述叔丁醇溶液包括三甲胺、四氢呋喃、乙醇或甲醇。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述光活化标记为疏水性的。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述光活化标记包括芳基叠氮化物基团。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其进一步包括从所述组织或组织样品中分离经标记区域或所述经标记区域的一部分。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述经标记区域或部分通过针对所述标记的FACS分选来分离。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其进一步包括分析分离的经标记区域的组成以产生分析数据。
27.根据权利要求26所述的方法，其中分析包括确定所述分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNA通过测序来分析。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNA通过SPLITseq来分析。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述蛋白质通过质谱法来分析。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述DNA通过DNA测序来分析。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中在分离所述经标记区域之前对所述组织或组织样品进行了成像以创建图像，进一步包括使所述图像与所述分析数据组合以创建所述区域的三维组成图。
33.一种用于完整组织或组织样品的三维表达谱分析的方法，其包括：
a)提供三维完整组织或组织样品；
b)透明化所述样品；
c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；
d)使所述组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记所述区域；
e)对经标记区域进行成像以创建图像；
f)从所述组织或组织样品中分离所述经标记区域；
g)确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成；
h)使所述图像与所述分离的经标记区域的所述DNA、RNA和/或蛋白质组成组合，以创建所述完整组织或组织样品的三维表达谱。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述区域为细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述分离的经标记区域为单个细胞核。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的RNA组成。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述RNA组成通过测序来确定。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述RNA组成通过SPLITseq来确定。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的蛋白质组成。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述蛋白质组成通过质谱法来确定。
43.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的DNA组成。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述DNA组成通过DNA测序来确定。
45.一种用于分离组织或组织样品中的单个细胞或细胞核的方法，其包括：
a)提供三维组织或组织样品；
b)透明化所述样品；
c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；
d)使细胞经受多光子激光，从而标记所述细胞；
e)从所述组织或组织样品中解离经标记细胞；和
f)分离所述经标记细胞或细胞核。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其进一步包括对所述组织或组织样品进行成像。
49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品为固定组织或固定组织样品。
50.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括可检测部分。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述可检测部分包括发光部分。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述荧光部分包括荧光团。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述可检测部分包括抗体或其官能性衍生物。
55.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括标签。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签或生物素标签。
57.根据权利要求33至56中任一项所述的方法，其中样品透明化过程包括使所述样品脱水并且将所述样品转移到具有与所述组织相似或匹配的折射率的培养基中。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基包括BABB溶液。
60.根据权利要求33至59中任一项所述的方法，其中所述样品通过叔丁醇溶液来脱水。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述叔丁醇溶液包括三甲胺、四氢呋喃、乙醇或甲醇。
62.根据权利要求33至61中任一项所述的方法，其中所述光活化标记为疏水性的。
63.根据权利要求33至62中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述光活化标记包括芳基叠氮化物基团。
65.根据权利要求45至64中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述经标记细胞或细胞核。
66.根据权利要求33至44或65中任一项所述的方法，其中所述经标记细胞或细胞核通过针对所述标记的FACS分选来分离。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其进一步包括分析分离的经标记细胞或细胞核。
68.根据权利要求67所述的方法，其中分析包括确定所述分离的经标记细胞或细胞核的DNA、RNA和/或蛋白质组成。
69.根据权利要求38或68所述的方法，其中所述RNA通过单细胞RNA测序(scRNAseq)来分析。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述RNA组成通过测序来确定。
71.根据权利要求68所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的蛋白质组成。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述蛋白质组成通过质谱法来确定。
73.根据权利要求68所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的DNA组成。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述DNA组成通过DNA测序来确定。
75.根据权利要求68所述的方法，其中所述RNA通过SPLITseq来分析。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的方法，其进一步包括使所述组织或组织样品与第二光活化标记接触，并使所述组织或组织样品中的第二细胞或细胞核经受多光子激光，从而标记所述第二细胞或细胞核。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。
79.根据权利要求1至78中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品为整个器官、肿瘤或动物。
80.根据权利要求1至79中任一项所述的方法，其中所述双光子激光中的每个光子的波长在约175nm与约350nm之间。
81.根据权利要求1至80中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品来自肿瘤。
82.一种组合物，其包括组织样品、具有与所述组织相似或匹配的折射率的培养基以及光活化标记。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述组织包括经标记区域。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述区域包括细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。
85.根据权利要求83或84所述的组合物，其中所述细胞通过多光子方法来标记。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述细胞通过双光子方法来标记。
87.根据权利要求85所述的组合物，其中所述细胞通过三光子方法来标记。
88.根据权利要求82至87中任一项所述的组合物，其中所述光活化标记包括可检测部分。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述可检测部分包括发光部分。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述荧光部分包括荧光团。
92.根据权利要求82至87中任一项所述的组合物，其中所述光活化标记包括标签。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签或生物素标签。
94.根据权利要求88所述的组合物，其中所述可检测部分为抗体或其官能性衍生物。
95.根据权利要求82至94中任一项所述的组合物，其中所述光活化标记为疏水性的。
96.根据权利要求82至95中任一项所述的组合物，其中所述光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。
97.根据权利要求82至96中任一项所述的组合物，其中所述培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述培养基包括BABB溶液。
99.一种透明化的组织样品，其包括光活化标记和具有与组织的折射率基本匹配的折射率的培养基。
100.根据权利要求99所述的透明化的组织，其中所述培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α-生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。
101.根据权利要求100所述的透明化的组织，其中所述培养基包括BABB溶液。
102.根据权利要求99至101中任一项所述的透明化的组织，其包含经标记细胞。
103.根据权利要求102所述的透明化的组织，其中所述细胞通过多光子方法来标记。
104.根据权利要求99至103中任一项所述的透明化的组织，其中所述光活化标记包括可检测部分。
105.根据权利要求104所述的透明化的组织，其中所述可检测部分包括发光部分。
106.根据权利要求105所述的透明化的组织，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。
107.根据权利要求106所述的透明化的组织，其中所述荧光部分包括荧光团。
108.根据权利要求99至107中任一项所述的透明化的组织，其中所述光活化标记包括标签。
109.根据权利要求108所述的透明化的组织，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签或生物素标签。
110.根据权利要求104所述的透明化的组织，其中所述可检测部分为抗体或其官能性衍生物。
111.根据权利要求99至110中任一项所述的透明化的组织，其中所述光活化标记为疏水性的。
112.根据权利要求99至111中任一项所述的透明化的组织，其中所述光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。
113.根据权利要求82至112中任一项所述的组合物或透明化的组织，其中所述组织或组织样品来自肿瘤。
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