JP2023516974A - VI-E型及びVI-F型CRISPR-Casシステム並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に記載される本発明は、本明細書においてCas13e及びCas13fと呼ばれることがある、新規なクラス2、VI型Casエフェクタータンパク質を提供する。本発明の新規なCas13タンパク質は、それらが、それらのcrRNAコード配列と共に、AAVベクターなどの低容量遺伝子治療ベクター中に容易にパッケージングされ得るように、以前に発見されたCas13エフェクタータンパク質(Cas13a-Cas13d)よりはるかに小さい。さらに、Cas13a、Cas13b、及びCas13dエフェクタータンパク質と比較して、新たに発見されたCas13e及びCas13fエフェクタータンパク質は、RNA標的配列をノックダウンする際により強力であり、RNA単一塩基編集においてより効率的である一方、スペーサー配列が特定の狭い範囲(例えば、約30ヌクレオチド)内にある場合を除いて、crRNAベースの標的認識による活性化後に、ごくわずかな非特異的/コラテラルRNase活性を示す。したがって、これらの新たなCasタンパク質は、遺伝子治療に理想的に適している。
一態様において、本明細書に記載される本発明は、高等真核生物及び原核生物のヌクレオチド結合(HEPN)ドメインに特徴的な、2つの厳密に保存されたRX4-6H(RXXXXH)モチーフを有するCRISPRクラス2、VI型エフェクターの2つの新規なファミリーを提供する。2つのHEPNドメインを含有する同様のCRISPRクラス2、VI型エフェクターが、以前に特徴付けられており、例えば、CRISPR Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、及びCas13dを含む。
また、本発明は、本明細書中に記載されるタンパク質(例えば、CRISPR関連タンパク質又は付属タンパク質)及びガイドRNA(例えばcrRNA)をコードする核酸を提供する。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、少なくともRNAガイド(例えば、gRNA又はcrRNA)を含む。
標的RNAは、注目するあらゆるRNA分子であり得、天然に存在するRNA分子及び操作されたRNA分子が挙げられる。標的RNAは、mRNA、tRNA、リボソームRNA(rRNA)、マイクロRNA(miRNA)、干渉RNA(siRNA)、リボザイム、リボスイッチ、サテライトRNA、マイクロスイッチ、マイクロザイム、又はウイルスRNAであり得る。
本発明の一態様は、(1)本明細書中に記載されるあらゆるCas13e/Cas13fエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合体、誘導体、コンジュゲート、又は機能断片、及び(2)本明細書中に記載されるあらゆるガイドRNA(各々、標的RNAに少なくとも部分的に相補的であるように設計されたスペーサー配列を含む)、及びCas13e/Cas13fエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合体、誘導体、コンジュゲート、又は機能断片と和合性のDR配列を含むCRISPR/Cas13e複合体又はCRISPR/Cas13f複合体を提供する。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、細胞型の多重化の際に標的ポリヌクレオチド又は核酸を修飾する(例えば、欠失させる、挿入する、転座させる、不活化する、又は活性化する)ことを含む多種多様な有用性を有する。CRISPRシステムは、例えば、DNA/RNA検出(例えば、特異的高感度酵素リポーターアンロック(SHERLOCK))、核酸の追跡及び標識化、富化アッセイ(所望の配列を背景から抽出)、干渉RNA又はmiRNAの制御、循環腫瘍DNAの検出、次世代ライブラリの調製、薬物スクリーニング、疾患診断及び予測、並びに種々の遺伝的障害の処置における広範囲の用途がある。
一態様において、本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、DNA又はRNA検出に用いることができる。実施例に示されるように、本発明のCas13eタンパク質及びCas13fタンパク質は、スペーサー配列が約30ヌクレオチドである場合、そのガイドRNA依存性特異的RNase活性の活性化により、非特異的/コラテラルRNase活性を示す。ゆえに、本発明のCRISPR関連タンパク質は、CRISPR RNA(crRNAs)により再プログラム化されて、特異的RNA検知用のプラットフォームを提供することができる。特定のスペーサー配列長を選択するによって、そしてそのRNA標的の認識により、活性化されたCRISPR関連タンパク質は、直ぐ近くの非標的RNAの「コラテラル」切断に携わる。このcrRNAプログラム化コラテラル切断活性により、CRISPRシステムは、プログラム細胞死をトリガーすることによって、又は標識されたRNAの非特異的分解によって、特定のRNAの存在を検出することができる。
細胞プロセスは、タンパク質とRNAとDNA間の分子相互作用のネットワークによって決まる。タンパク質-DNA相互作用及びタンパク質-RNA相互作用の正確な検出が、そのようなプロセスを理解するための鍵である。インビトロ近接標識技術が、リポーター基、例えば、光活性化基と組み合わせた親和性タグを使用して、注目するタンパク質又はRNAの近くでポリペプチド及びRNAをインビトロ標識する。UV照射の後に、光活性化基は、タグ付けされた分子に近接するタンパク質及び他の分子と反応することによって、タグ付けされた分子を標識する。その後、標識された相互作用分子を回収して同定することができる。CRISPR関連タンパク質は、例えば、選択されたRNA配列にプローブを向けるのに用いることができる。また、当該用途は、疾患、又は培養が困難な細胞型のインビボ画像化用の動物モデルに応用することができる。核酸の追跡及び標識化の方法は、例えば、米国特許第8,795,965号明細書、国際公開第2016205764号パンフレット、及び国際公開第2017070605号パンフレットに記載されており、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書中に記載されるCRISPRシステム(例えばCRISPR関連タンパク質)を用いて、RNAを単離且つ/又は精製することができる。CRISPR関連タンパク質は、RNA-CRISPR関連タンパク質複合体を単離且つ/又は精製するのに用いることができる親和性タグに融合し得る。当該用途は、例えば、細胞内の遺伝子発現プロファイルの分析に有用である。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムを、次世代配列決定(NGS)ライブラリを調製するのに用いることができる。例えば、対費用効果の高いNGSライブラリを生じさせるために、CRISPRシステムを用いて、標的遺伝子のコード配列を崩壊させることができ、そしてCRISPR関連タンパク質が形質移入されたクローンを、次世代配列決定(例えば、Ion Torrent PGMシステムによる)によって同時にスクリーニングすることができる。NGSライブラリを如何に調製するかに関する詳細な説明を、例えば、Bell et al.,“A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing”,BMC Genomics,15.1(2014):1002において見出すことができ、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
微生物(例えば、大腸菌(E.coli)、酵母、及び微細藻類)が、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の開発は、種々の臨床用途が挙げられる広い有用性がある。例えば、プログラム可能なCRISPRシステムを用いて、標的細胞死についての毒性ドメインのタンパク質を、例えば標的転写産物として癌関連RNAを用いて、分割することができる。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用に関与する経路が、例えばキナーゼ又は酵素等の適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生体系において影響され得る。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、植物における多種多様の有用性がある。一部の実施形態において、CRISPRシステムを用いて、植物のゲノムを操作する(例えば、生産を向上させるか、所望の翻訳後修飾を有する生成物を製造するか、又は工業製品を生成するための遺伝子を導入する)ことができる。一部の実施形態において、CRISPRシステムを用いて、所望の形質を植物(例えば、ゲノムへの遺伝性の修飾がある、又はない)に導入するか、又は植物細胞若しくは植物全体における内因性遺伝子の発現を調節することができる。
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子のセットの遺伝が、好都合に偏る現象である。本明細書中に記載されるCRISPRシステムを用いて、遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、CRISPRシステムを、遺伝子の特定の対立遺伝子を標的として破壊するように設計して、これにより細胞は、第2の対立遺伝子をコピーして、配列を固定することができる。コピーのおかげで、第1の対立遺伝子は、第2の対立遺伝子に変換されて、第2の対立遺伝子が後代に伝えられる見込みが増すこととなる。本明細書中に記載されるCRISPRシステムを如何に用いて、遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法が、例えば、Hammond et al.,“A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae”,Nat.Biotechnol.34(1):78-83,2016に記載されており、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書中に記載される、プールドCRISPRスクリーニングは、生物学的機構、例えば、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染に関与する遺伝子を同定するための強力なツールである。細胞に、本明細書中に記載されるガイドRNA(gRNA)コードベクターのライブラリが大量に形質導入されて、gRNAの分布が、選択的チャレンジ(selective challenge)を施す前後に測定される。プールドCRISPRスクリーンが、細胞の生存及び増殖に影響を与える機構に上手く機能し、そして個々の遺伝子の活性を測定するために(例えば、操作されたリポーター細胞株を用いて)伸長され得る。一度に1つの遺伝子のみが標的とされる、アレイドCRISPRスクリーンにより、RNAseqをリードアウトとして用いることが可能となる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるCRISPRシステムを、単細胞CRISPRスクリーンに用いることができる。プールドCRISPRスクリーニングに関する詳細な記載を、例えば、Datlinger et al.,“Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome read-out”,Nat.Methods.14(3):297-301,2017において見出すことができ、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムを、インサイチュ飽和変異誘発に用いることができる。一部の実施形態において、プールしたガイドRNAライブラリを用いて、特定の遺伝子又は調節要素についてインサイチュ飽和変異誘発を実行することができる。そのような方法は、これらの遺伝子又は調節要素(例えばエンハンサー)の重要な最小の特徴及び別々の脆弱性を明らかにすることができる。当該方法は、例えば、Canver et al.,“BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis”,Nature 527(7577):192-7,2015に記載されており、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、種々のRNA関連用途があり得、例えば、遺伝子発現を調節すること、RNA分子を分解すること、RNA発現を阻害すること、RNA若しくはRNA産物をスクリーニングすること、lincRNA若しくは非コードRNAの機能を判定すること、細胞休止状態を誘導すること、細胞周期停止を誘導すること、細胞成長及び/若しくは細胞増殖を引き下げること、細胞アネルギーを誘導すること、細胞アポトーシスを誘導すること、細胞壊死を誘導すること、細胞死を誘導すること、且つ/又はプログラム細胞死を誘導することがある。これらの用途の詳細な説明を、例えば、国際公開第2016/205764 A1号パンフレットにおいて見出すことができ、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。様々な実施形態において、本明細書中に記載される方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで実行することができる。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムを用いて、遺伝子発現を調節することができる。CRISPRシステムを、適切なガイドRNAと共に用いて、RNAプロセシングの制御を介して、遺伝子発現を標的とすることができる。RNAプロセシングの制御の例として、RNAプロセシング反応、例えばRNAスプライシング(例えば選択的スプライシング)、ウイルス複製、及びtRNA生合成が挙げられ得る。また、RNA標的タンパク質を、適切なガイドRNAと組み合わせて用いて、RNA活性化(RNAa)を制御することができる。RNA活性化は、プロモータ標的短二本鎖RNA(dsRNA)が標的遺伝子発現を転写/エピジェネティックレベルにて誘導する低分子RNAガイド及びアルゴノート(Ago)依存性遺伝子調節現象である。RNAaは、遺伝子発現の促進に至るので、遺伝子発現の制御は、RNAaの破壊又は引下げによって達成され得る。一部の実施形態において、方法は、RNA標的化CRISPRを、例えば干渉リボ核酸(例えば、siRNA、shRNA、又はdsRNA)の代替物として使用することを含む。遺伝子発現を調節する方法は、例えば、国際公開第2016205764号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
干渉RNA又はマイクロRNA(miRNA)の制御は、干渉RNA又はmiRNAの寿命をインビボ又はインビトロで短くすることによって、オフターゲット効果を引き下げる一助とすることができる。一部の実施形態において、標的RNAとして、干渉RNA、すなわち、RNA干渉経路に関与するRNA、例えば低分子ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉(siRNA)その他が挙げられ得る。一部の実施形態において、標的RNAの例として、miRNA又は二本鎖RNA(dsRNA)が挙げられる。
リボスイッチは、低分子に結合して、次に遺伝子発現を調節する、メッセンジャーRNAの調節セグメントである。この機構により、細胞は、当該低分子の細胞内濃度を検知することができる。特定のリボスイッチは典型的に、隣接する遺伝子の転写、翻訳、又はスプライシングを変更することによって、当該遺伝子を調節する。ゆえに、一部の実施形態において、リボスイッチ活性は、リボスイッチを標的とするのに適したガイドRNAと組み合わせてRNA標的化タンパク質を用いることによって制御することができる。これは、リボスイッチの切断、又はリボスイッチへの結合を介して達成され得る。CRISPRシステムを用いてリボスイッチを制御する方法が、例えば、国際公開第2016205764号パンフレット及び国際公開第2017070605号パンフレットに記載されており、これらの出願は双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるCRISPR関連タンパク質は、塩基-編集ドメイン、例えば、ADAR1、ADAR2、APOBEC、又は活性化によって誘導されるシチジンデアミナーゼ(AID)に融合することができ、そしてRNA配列(例えばmRNA)を修飾するのに用いることができる。一部の実施形態において、CRISPR関連タンパク質は、1つ以上の変異を(例えば触媒ドメイン内に)含み、これによりCRISPR関連タンパク質は、RNAを切断することができない。
MS2(MS2コートタンパク質)
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
Qbeta(Qbetaコートタンパク質)
MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
PP7(PP7コートタンパク質)
MSKTIVLSVGEATRTLTEIQSTADRQIFEEKVGPLVGRLRLTASLRQNGAKTAYRVNLKLDQADVVDCSTSVCGELPKVRYTQVWSHDVTIVANSTEASRKSLYDLTKSLVVQATSEDLVVNLVPLGR
一部の実施形態において、本明細書中に記載される不活化CRISPR関連タンパク質(例えば、触媒ドメイン内に1つ以上の変異を有するCRISPR関連タンパク質)を用いて、RNA転写産物上の特定のスプライシング部位を標的として、これに結合することができる。不活化CRISPR関連タンパク質の、RNAへの結合は、スプライセオソームの、転写産物との相互作用を立体配置的に阻害して、特定の転写産物アイソフォームの生成の頻度の改変が可能となる。そのような方法を用いて、エキソンスキッピングにより疾患を、変異を有するエキソンが、成熟タンパク質内でスキップされ得るように処置することができる。CRISPRシステムを用いてスプライシングを改変する方法が、例えば、国際公開第2017/219027号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が、特にRNAスプライシングの考察に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書中に記載されるCRISPRシステムは、種々の治療用途があり得る。そのような用途は、対象CRISPR/Cas13e又はCas13fシステムの、以下の能力の1つ以上に、インビトロ及びインビボ双方で基づき得る:細胞の老化を誘導し、細胞周期停止を誘導し、細胞の成長及び/又は増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、壊死を誘導する能力その他。
特定の実施形態において、本発明の方法を用いて、本明細書中に記載されるCRISPRシステムを細胞中に導入して、細胞及び/又はその後代に、1つ以上の細胞生成物、例えば、抗体、デンプン、エタノール、又は他の所望のあらゆる生成物の生成を改変させることができる。そのような細胞及びその後代は、本発明の範囲内である。
本開示及び当該技術における知識により、本明細書中に記載されるCRISPRシステム、又は本明細書中に記載されるそのあらゆる構成要素(Casタンパク質、その誘導体、機能断片、又は種々の融合体若しくは付加物、及びガイドRNA/crRNA)、その核酸分子、及び/又はその構成要素をコードしているか、若しくは提供する核酸分子は、当該技術における適切なあらゆる手段を用いて、ベクター、例えばプラスミドベクター及びウイルス送達ベクター等の種々の送達システムによって送達することができる。そのような方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、形質移入、超音波処理、遺伝子銃その他が挙げられる(これらに限定されない)。
本発明の別の態様は、本明細書中に記載される対象CRISPR/Casシステム、例えばCas13e及びCas13fタンパク質、それらの誘導体、機能断片、又は種々の融合体若しくは付加物、ガイドRNA/crRNA、それらの複合体、これらを包含するベクター、或いはこれらを包含する宿主のいずれか2つ以上の構成要素を含むキットを提供する。
コンピュータパイプラインを用いて、ゲノム源及びメタゲノム源からクラス2 CRISPR-Casシステムの拡張データベースを生成した。ゲノム配列及びメタゲノム配列を、NCBI(Benson et al.,2013;Pruitt et al.,2012)、NCBI whole genome sequencing(WGS)、及びDOE JGI Integrated Microbial Genomes(Markowitz et al.,2012)からダウンロードした。タンパク質を、少なくとも5kb長の全てのコンティグで予測して(anonモードのProdigal(Hyatt et al.,2010))、重複排除して(すなわち、同一のタンパク質配列を除去する)、完全なタンパク質データベースを構築した。600残基よりも大きなタンパク質を、ラージタンパク質(LP)とみなした。現在同定されているCas13タンパク質は、大部分が、900残基サイズよりも大きいので、算出の複雑性を減らすために、ラージタンパク質のみをさらに考慮した。
GCTGGAGCAGCCCCCGATTTGTGGGGTGATTACAGC(配列番号8)
GCTGAAGAAGCCTCCGATTTGAGAGGTGATTACAGC(配列番号9)
GCTGTGATAGACCTCGATTTGTGGGGTAGTAACAGC(配列番号10)
GCTGTGATAGACCTCGATTTGTGGGGTAGTAACAGC(配列番号11)
GCTGTGATAGACCTCGATTTGTGGGGTAGTAACAGC(配列番号12)
GCTGTGATGGGCCTCAATTTGTGGGGAAGTAACAGC(配列番号13)
GCTGTGATAGGCCTCGATTTGTGGGGTAGTAACAGC(配列番号14)
新たに同定したCas13eタンパク質が、CRISPR/Casシステムにおいて機能する有効なRNaseであることを確認するために、Cas13e.1コード配列を、ヒト発現のためにコドン最適化して(配列番号22)、GFP遺伝子を有する第1のプラスミド中にクローニングした。一方、リポーター遺伝子(mCherry)mRNAを標的とするガイドRNA(gRNA)のコード配列を、GFP遺伝子を有する第2のプラスミド中にクローニングした。gRNAは、Cas13e.1用の2つのダイレクトリピート配列が側面に位置するスペーサーコード領域からなる(配列番号29)。GFP及びmCherryリポーター遺伝子の配列は、それぞれ、配列番号30~31である。
Cas13eシステムは理論的に、DR+スペーサー(5’DR)又はスペーサー+DR(3’DR)のいずれかの向きを利用し得るので、どちらがCas13eによって利用される正確な向きであるのかを判定するために、本実験を設計した。
GCTGGAGCAGCCCCCGATTTGTGGGGTGATTACAGCGGTCTTCGATATTCAAGCGTCGGAAGACCT(配列番号32)
GGTCTTCGATATTCAAGCGTCGGAAGACCTGCTGGAGCAGCCCCCGATTTGTGGGGTGATTACAGC(配列番号33)
Cas13e.1の特異的活性及びコラテラル活性に及ぼすスペーサー配列長の影響を研究するために、スペーサー配列長が20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、又は50ntの、mCherryリポーター遺伝子を標的とする一セットのsgRNAを設計した(配列番号34~40)。
TTGGTGCCGCGCAGCTTCAC(配列番号34)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGT(配列番号35)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATG(配列番号36)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTC(配列番号37)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGT(配列番号38)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTGC(配列番号39)
TTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTGCAGGGA(配列番号40)
Cas13eをRNA単一塩基編集に用いることができるかを試験するために、2つのRXXXXHモチーフを変異させてRNase活性を排除することによって、dCas13e.1を生成した。続いて、E488Q及びT375Gの二重変異を有する高フィデリティADAR2DDミュータントを、dCas13e.1(のC末端)に融合させて、推定のAからGへの単一塩基RNAエディタを生じさせて、dCas13e.1-ADAR2DDと命名した。配列番号41内のコード配列参照。
RNA単一塩基編集に用いることができるdCas13e.1の最小サイズを判定するために、各々がC末端由来の30未満の残基を有する、dCas13e.1の漸進的に大きくなるC末端欠失を発現する一連の5つの構築体を生成した(すなわち、30-、60-、90-、120-、及び150-残基の欠失)。結果として生じた構築体を用いて、各C末端にて高フィデリティadar2(ADAR2DD)と融合するdCas13e.1のコード配列を生じさせた。これらの構築体を、実施例4と類似した実験に用いるVysz15(「V15」)~Vysz-19(「V19」)プラスミド(図15)中にクローニングした。これらの全ての構築体において、融合タンパク質を、CMVプロモータ(pCMV)、及びイントロンの直ぐ下流側にある、タンパク質発現をさらに増強するエンハンサー(eCMV)から発現させた。2つの核局在化シグナル(NLS)を、融合体のdCas13e.1部分のN末端及びC末端に配置して、ADAR2ドメイン(例えばADAR2DD)を、NLSリンカーを介してC末端NLSに融合させて、HA-タグによってC末端にタグ付けした。EFSプロモータ(pEFS)の独立制御下のEGFPコード配列が、全てのプラスミドのポリA付加配列の下流側に存在した。
この実験は、Cas13e及びCas13fタンパク質、とりわけCas13f.1が、以前に同定されたCas13タンパク質よりも十分に、哺乳動物内因性標的mRNAをノックダウンするのに非常に有効であることを実証した。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
[態様1]
(1)標的RNAにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して3’側にダイレクトリピート(DR)配列を含むRNAガイド配列;並びに
(2)配列番号1~7のいずれか1つのアミノ酸配列を有するCRISPR関連タンパク質(Cas)、又は前記Casの誘導体若しくは機能断片
を含む、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート(CRISPR)-Cas複合体であって;
前記Cas、前記Casの前記誘導体及び前記機能断片は、(i)前記RNAガイド配列に結合すること、且つ(ii)前記標的RNAを標的とすることができるが、
前記スペーサー配列は、前記複合体が配列番号1~7のいずれか1つの前記Casを含む場合に、天然に存在するバクテリオファージ核酸と100%相補的でないことを条件とする、CRISPR-Cas複合体。
[態様2]
前記DR配列は、配列番号8~14のいずれか1つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、態様1に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様3]
前記DR配列は、配列番号8~14のいずれか1つによってコードされている、態様1に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様4]
前記標的RNAは、真核生物DNAによってコードされている、態様1~3のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様5]
前記真核生物DNAは、非ヒト哺乳動物DNA、非ヒト霊長類DNA、ヒトDNA、植物DNA、昆虫DNA、鳥類DNA、爬虫類DNA、齧歯類DNA、魚類DNA、蠕虫/線虫DNA、酵母DNAである、態様4に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様6]
前記標的RNAはmRNAである、態様1~5のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様7]
前記スペーサー配列は、15~60ヌクレオチド、25~50ヌクレオチド、又は約30ヌクレオチドである、態様1~6のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様8]
前記スペーサー配列は、前記標的RNAと90~100%相補的である、態様1~7のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様9]
前記誘導体は、配列番号1~7のいずれか1つの、1つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を含む、態様1~8のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様10]
前記誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む、態様9に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様11]
前記誘導体は、HEPNドメイン又はRXXXXHモチーフ内に、配列番号1~7のいずれか1つの野生型Casと同一の配列を有する、態様1~10のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様12]
前記誘導体は、前記標的RNAにハイブリダイズする前記RNAガイド配列に結合することができるが、前記CasのRNase触媒部位内の変異に起因して、RNase触媒活性を有していない、態様1~9のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様13]
前記誘導体は、210残基以下のN末端欠失及び/又は180残基以下のC末端欠失を有する、態様12に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様14]
前記誘導体は、約180残基のN末端欠失及び/又は約150残基のC末端欠失を有する、態様13に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様15]
前記誘導体はさらに、RNA塩基-編集ドメインを含む、態様12~14のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様16]
前記RNA塩基-編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、例えば二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(例えば、ADAR1又はADAR2);アポリポタンパク質B mRNA編集酵素;catalytic polypeptide-like(APOBEC);又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)である、態様15に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様17]
前記ADAR2は、E488Q/T375G二重変異を有するか、又はADAR2DDである、態様16に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様18]
前記塩基-編集ドメインはさらに、RNA結合ドメイン、例えばMS2に融合する、態様15~17のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様19]
前記誘導体はさらに、RNAメチルトランスフェラーゼ、RNAデメチラーゼ、RNAスプライシング修飾子、局在化因子、又は翻訳修飾因子を含む、態様12~14のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様20]
前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、核局在化シグナル(NLS)配列又は核外搬出シグナル(NES)を含む、態様1~19のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様21]
前記標的RNAの標的化は、前記標的RNAの修飾をもたらす、態様1~20のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様22]
前記標的RNAの前記修飾は、前記標的RNAの切断である、態様21に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様23]
前記標的RNAの前記修飾は、アデノシン(A)の、イノシン(I)への脱アミノ化である、態様21に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様24]
前記スペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む標的RNAをさらに含む、態様1~23のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
[態様25]
(1)態様1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片、及び(2)異種機能ドメインを含む融合タンパク質。
[態様26]
前記異種機能ドメインは:核局在化シグナル(NLS)、リポータータンパク質若しくは検出標識(例えば、GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、DNA結合ドメイン(例えば、MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、エピトープタグ(例えば、His、myc、V5、FLAG、HA、VSV-G、Trxその他)、転写活性化ドメイン(例えば、VP64又はVPR)、転写阻害ドメイン(例えば、KRAB部分又はSID部分)、ヌクレアーゼ(例えばFokI)、脱アミノ化ドメイン(例えば、ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID、又はTAD)、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、HDAC、ssRNA切断活性を有するポリペプチド、dsRNA切断活性を有するポリペプチド、ssDNA切断活性を有するポリペプチド、dsDNA切断活性を有するポリペプチド、DNA若しくはRNAリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、態様25に記載の融合タンパク質。
[態様27]
前記異種機能ドメインは、前記融合タンパク質内で、N末端に、C末端に、又は内部に融合している、態様25又は26に記載の融合タンパク質。
[態様28]
(2)異種機能部分にコンジュゲートした、(1)態様1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片を含むコンジュゲート。
[態様29]
前記異種機能部分は:核局在化シグナル(NLS)、リポータータンパク質若しくは検出標識(例えば、GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、DNA結合ドメイン(例えば、MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、エピトープタグ(例えば、His、myc、V5、FLAG、HA、VSV-G、Trxその他)、転写活性化ドメイン(例えば、VP64又はVPR)、転写阻害ドメイン(例えば、KRAB部分又はSID部分)、ヌクレアーゼ(例えばFokI)、脱アミノ化ドメイン(例えば、ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID、又はTAD)、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、HDAC、ssRNA切断活性を有するポリペプチド、dsRNA切断活性を有するポリペプチド、ssDNA切断活性を有するポリペプチド、dsDNA切断活性を有するポリペプチド、DNA若しくはRNAリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、態様28に記載のコンジュゲート。
[態様30]
前記異種機能部分は、前記Cas、前記その誘導体、又は前記その機能断片に対して、N末端に、C末端に、又は内部にコンジュゲートされている、態様28又は29に記載のコンジュゲート。
[態様31]
配列番号15~21のいずれでもないことを条件とする、配列番号1~7のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド、又はその誘導体、若しくはその機能断片、若しくはその融合タンパク質。
[態様32]
細胞内での発現のためにコドン最適化されている、態様31に記載のポリヌクレオチド。
[態様33]
前記細胞は真核細胞である、態様32に記載のポリヌクレオチド。
[態様34]
配列番号8~14のいずれか1つの誘導体を含む、天然に存在しないポリヌクレオチドであって、前記誘導体は、(i)配列番号8~14のいずれか1つと比較して、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個)のヌクレオチドの付加、欠失、若しくは置換を有し;(ii)配列番号8~14のいずれか1つに対して、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、若しくは97%の配列同一性を有し;(iii)配列番号8~14のいずれか1つ、若しくは(i)及び(ii)のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし;又は(iv)(i)~(iii)のいずれかの相補体であるが、前記誘導体は、配列番号8~14のいずれでもないこと、及び前記誘導体は、配列番号8~14によってコードされるRNAのいずれかと実質的に同じ二次構造を維持しているRNAをコードする(又はRNAである)ことを条件とする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
[態様35]
前記誘導体は、態様1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片のいずれか1つのDR配列として機能する、態様34に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
[態様36]
態様31~35のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[態様37]
前記ポリヌクレオチドは、プロモータ、及び場合によってはエンハンサーに作動可能に連結されている、態様36に記載のベクター。
[態様38]
前記プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、ユビキタスプロモータ、又は組織特異的プロモータである、態様37に記載のベクター。
[態様39]
プラスミドである、態様36~38のいずれか一項に記載のベクター。
[態様40]
レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、AAVベクター、又はレンチウイルスベクターである、態様36~38のいずれか一項に記載のベクター。
[態様41]
前記AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、又はAAV13の組換えAAVベクターである、態様40に記載のベクター。
[態様42]
(1)送達ビヒクル、及び(2)態様1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、態様25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、態様28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、態様31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は態様36~41のいずれか一項に記載のベクターを含む送達システム。
[態様43]
前記送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃である、態様42に記載の送達システム。
[態様44]
態様1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、態様25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、態様28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、態様31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は態様36~41のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞又はその後代。
[態様45]
真核細胞(例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は植物細胞)、又は原核細胞(例えば細菌細胞)である、態様44に記載の細胞又はその後代。
[態様46]
態様44又は45に記載の細胞を含む非ヒト多細胞真核生物。
[態様47]
ヒト遺伝的障害のための動物(例えば、齧歯類又は霊長類)モデルである、態様46に記載の非ヒト多細胞真核生物。
[態様48]
標的RNAを修飾する方法であって、前記標的RNAを、態様1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体と接触させることを含み、前記スペーサー配列は、前記標的RNAの少なくとも15ヌクレオチドと相補的であり;前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記RNAガイド配列と結合して、前記複合体を形成し;前記複合体は、前記標的RNAに結合し;前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的RNAを修飾する、方法。
[態様49]
前記標的RNAは、前記Casによる切断によって修飾される、態様48に記載の方法。
[態様50]
前記標的RNAは、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって修飾される、態様48に記載の方法。
[態様51]
前記標的RNAは、mRNA、tRNA、rRNA、非コードRNA、lncRNA、又は核RNAである、態様48~50のいずれか一項に記載の方法。
[態様52]
前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、及び前記機能断片は、実質的な(又は検出可能な)コラテラルRNase活性を示さない、態様48~51のいずれか一項に記載の方法。
[態様53]
前記標的RNAは、細胞内にある、態様48~52のいずれか一項に記載の方法。
[態様54]
前記細胞は癌細胞である、態様53に記載の方法。
[態様55]
前記細胞に、感染性因子が感染する、態様53に記載の方法。
[態様56]
前記感染性因子は、ウイルス、プリオン、原虫、真菌、又は寄生虫である、態様55に記載の方法。
[態様57]
前記CRISPR-Cas複合体は、配列番号1~7のいずれか1つをコードする第1のポリヌクレオチド、又はその誘導体若しくは機能断片、並びに配列番号8~14のいずれか1つ、及び前記標的RNAに結合することができるスペーサーRNAをコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドによってコードされており、前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドは、前記細胞中に導入される、態様53~56のいずれか一項に記載の方法。
[態様58]
前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドは、同じベクターによって前記細胞中に導入される、態様57に記載の方法。
[態様59]
(i)細胞の老化のインビトロ又はインビボ誘導;(ii)インビトロ又はインビボ細胞周期停止;(iii)インビトロ若しくはインビボ細胞増殖阻害及び/又は細胞増殖阻害;(iv)アネルギーのインビトロ又はインビトロ誘導;(v)アポトーシスのインビトロ又はインビトロ誘導;及び(vi)壊死のインビトロ又はインビトロ誘導の1つ以上を引き起こす、態様53~58のいずれか一項に記載の方法。
[態様60]
容体又は疾患の処置が必要な対象において容体又は疾患を処置する方法であって、前記対象に、態様1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み;前記スペーサー配列は、前記容体又は疾患と関連する標的RNAの少なくとも15ヌクレオチドと相補的であり;前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記RNAガイド配列と結合して前記複合体を形成し;前記複合体は、前記標的RNAに結合し;前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的RNAを切断することによって、前記対象における前記容体又は疾患を処置する、方法。
[態様61]
前記容体又は疾患は、癌又は感染症である、態様60に記載の方法。
[態様62]
前記癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌である、態様61に記載の方法。
[態様63]
インビトロ方法、インビボ方法、又はエクスビボ方法である、態様60~62のいずれか一項に記載の方法。
[態様64]
態様48~59のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞又はその後代であって、天然に存在しない修飾(例えば、前記細胞/後代の転写されたRNA内の天然に存在しない修飾)を含む細胞及びその後代。
[態様65]
標的RNAの存在を検出する方法であって、前記標的RNAを、態様25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は態様28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含み、前記融合タンパク質又は前記コンジュゲートは、検出可能な標識(例えば、蛍光、ノーザンブロット、又はFISHによって検出され得るもの)及び前記標的RNAに結合することができる合成スペーサー配列を含む、方法。
[態様66]
クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート(CRISPR)-Cas複合体を含む真核細胞であって、前記CRISPR-Cas複合体は:
(1)標的RNAにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して3’側にダイレクトリピート(DR)配列を含むRNAガイド配列;並びに
(2)配列番号1~7のいずれか1つのアミノ酸配列を有するCRISPR関連タンパク質(Cas)、又は前記Casの誘導体若しくは機能断片を含み;
前記Cas、前記Casの前記誘導体及び前記機能断片は、(i)前記RNAガイド配列に結合すること、且つ(ii)前記標的RNAを標的とすることができる、真核細胞。
Claims (66)
- (1)標的RNAにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して3’側にダイレクトリピート(DR)配列を含むRNAガイド配列;並びに
(2)配列番号1~7のいずれか1つのアミノ酸配列を有するCRISPR関連タンパク質(Cas)、又は前記Casの誘導体若しくは機能断片
を含む、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート(CRISPR)-Cas複合体であって;
前記Cas、前記Casの前記誘導体及び前記機能断片は、(i)前記RNAガイド配列に結合すること、且つ(ii)前記標的RNAを標的とすることができるが、
前記スペーサー配列は、前記複合体が配列番号1~7のいずれか1つの前記Casを含む場合に、天然に存在するバクテリオファージ核酸と100%相補的でないことを条件とする、CRISPR-Cas複合体。 - 前記DR配列は、配列番号8~14のいずれか1つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、請求項1に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記DR配列は、配列番号8~14のいずれか1つによってコードされている、請求項1に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記標的RNAは、真核生物DNAによってコードされている、請求項1~3のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記真核生物DNAは、非ヒト哺乳動物DNA、非ヒト霊長類DNA、ヒトDNA、植物DNA、昆虫DNA、鳥類DNA、爬虫類DNA、齧歯類DNA、魚類DNA、蠕虫/線虫DNA、酵母DNAである、請求項4に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記標的RNAはmRNAである、請求項1~5のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記スペーサー配列は、15~60ヌクレオチド、25~50ヌクレオチド、又は約30ヌクレオチドである、請求項1~6のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記スペーサー配列は、前記標的RNAと90~100%相補的である、請求項1~7のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、配列番号1~7のいずれか1つの、1つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む、請求項9に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、HEPNドメイン又はRXXXXHモチーフ内に、配列番号1~7のいずれか1つの野生型Casと同一の配列を有する、請求項1~10のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、前記標的RNAにハイブリダイズする前記RNAガイド配列に結合することができるが、前記CasのRNase触媒部位内の変異に起因して、RNase触媒活性を有していない、請求項1~9のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、210残基以下のN末端欠失及び/又は180残基以下のC末端欠失を有する、請求項12に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体は、約180残基のN末端欠失及び/又は約150残基のC末端欠失を有する、請求項13に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体はさらに、RNA塩基-編集ドメインを含む、請求項12~14のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記RNA塩基-編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、例えば二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(例えば、ADAR1又はADAR2);アポリポタンパク質B mRNA編集酵素;catalytic polypeptide-like(APOBEC);又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)である、請求項15に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記ADAR2は、E488Q/T375G二重変異を有するか、又はADAR2DDである、請求項16に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記塩基-編集ドメインはさらに、RNA結合ドメイン、例えばMS2に融合する、請求項15~17のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記誘導体はさらに、RNAメチルトランスフェラーゼ、RNAデメチラーゼ、RNAスプライシング修飾子、局在化因子、又は翻訳修飾因子を含む、請求項12~14のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、核局在化シグナル(NLS)配列又は核外搬出シグナル(NES)を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記標的RNAの標的化は、前記標的RNAの修飾をもたらす、請求項1~20のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記標的RNAの前記修飾は、前記標的RNAの切断である、請求項21に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記標的RNAの前記修飾は、アデノシン(A)の、イノシン(I)への脱アミノ化である、請求項21に記載のCRISPR-Cas複合体。
- 前記スペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む標的RNAをさらに含む、請求項1~23のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体。
- (1)請求項1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片、及び(2)異種機能ドメインを含む融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインは:核局在化シグナル(NLS)、リポータータンパク質若しくは検出標識(例えば、GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、DNA結合ドメイン(例えば、MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、エピトープタグ(例えば、His、myc、V5、FLAG、HA、VSV-G、Trxその他)、転写活性化ドメイン(例えば、VP64又はVPR)、転写阻害ドメイン(例えば、KRAB部分又はSID部分)、ヌクレアーゼ(例えばFokI)、脱アミノ化ドメイン(例えば、ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID、又はTAD)、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、HDAC、ssRNA切断活性を有するポリペプチド、dsRNA切断活性を有するポリペプチド、ssDNA切断活性を有するポリペプチド、dsDNA切断活性を有するポリペプチド、DNA若しくはRNAリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項25に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインは、前記融合タンパク質内で、N末端に、C末端に、又は内部に融合している、請求項25又は26に記載の融合タンパク質。
- (2)異種機能部分にコンジュゲートした、(1)請求項1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片を含むコンジュゲート。
- 前記異種機能部分は:核局在化シグナル(NLS)、リポータータンパク質若しくは検出標識(例えば、GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、DNA結合ドメイン(例えば、MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、エピトープタグ(例えば、His、myc、V5、FLAG、HA、VSV-G、Trxその他)、転写活性化ドメイン(例えば、VP64又はVPR)、転写阻害ドメイン(例えば、KRAB部分又はSID部分)、ヌクレアーゼ(例えばFokI)、脱アミノ化ドメイン(例えば、ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID、又はTAD)、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、HDAC、ssRNA切断活性を有するポリペプチド、dsRNA切断活性を有するポリペプチド、ssDNA切断活性を有するポリペプチド、dsDNA切断活性を有するポリペプチド、DNA若しくはRNAリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項28に記載のコンジュゲート。
- 前記異種機能部分は、前記Cas、前記その誘導体、又は前記その機能断片に対して、N末端に、C末端に、又は内部にコンジュゲートされている、請求項28又は29に記載のコンジュゲート。
- 配列番号15~21のいずれでもないことを条件とする、配列番号1~7のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド、又はその誘導体、若しくはその機能断片、若しくはその融合タンパク質。
- 細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- 前記細胞は真核細胞である、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号8~14のいずれか1つの誘導体を含む、天然に存在しないポリヌクレオチドであって、前記誘導体は、(i)配列番号8~14のいずれか1つと比較して、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個)のヌクレオチドの付加、欠失、若しくは置換を有し;(ii)配列番号8~14のいずれか1つに対して、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、若しくは97%の配列同一性を有し;(iii)配列番号8~14のいずれか1つ、若しくは(i)及び(ii)のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし;又は(iv)(i)~(iii)のいずれかの相補体であるが、前記誘導体は、配列番号8~14のいずれでもないこと、及び前記誘導体は、配列番号8~14によってコードされるRNAのいずれかと実質的に同じ二次構造を維持しているRNAをコードする(又はRNAである)ことを条件とする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
- 前記誘導体は、請求項1~24のいずれか一項に記載のCas、その誘導体、又はその機能断片のいずれか1つのDR配列として機能する、請求項34に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
- 請求項31~35のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ポリヌクレオチドは、プロモータ、及び場合によってはエンハンサーに作動可能に連結されている、請求項36に記載のベクター。
- 前記プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、ユビキタスプロモータ、又は組織特異的プロモータである、請求項37に記載のベクター。
- プラスミドである、請求項36~38のいずれか一項に記載のベクター。
- レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、AAVベクター、又はレンチウイルスベクターである、請求項36~38のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、又はAAV13の組換えAAVベクターである、請求項40に記載のベクター。
- (1)送達ビヒクル、及び(2)請求項1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、請求項25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項36~41のいずれか一項に記載のベクターを含む送達システム。
- 前記送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃である、請求項42に記載の送達システム。
- 請求項1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、請求項25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項36~41のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞又はその後代。
- 真核細胞(例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は植物細胞)、又は原核細胞(例えば細菌細胞)である、請求項44に記載の細胞又はその後代。
- 請求項44又は45に記載の細胞を含む非ヒト多細胞真核生物。
- ヒト遺伝的障害のための動物(例えば、齧歯類又は霊長類)モデルである、請求項46に記載の非ヒト多細胞真核生物。
- 標的RNAを修飾する方法であって、前記標的RNAを、請求項1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体と接触させることを含み、前記スペーサー配列は、前記標的RNAの少なくとも15ヌクレオチドと相補的であり;前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記RNAガイド配列と結合して、前記複合体を形成し;前記複合体は、前記標的RNAに結合し;前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的RNAを修飾する、方法。
- 前記標的RNAは、前記Casによる切断によって修飾される、請求項48に記載の方法。
- 前記標的RNAは、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって修飾される、請求項48に記載の方法。
- 前記標的RNAは、mRNA、tRNA、rRNA、非コードRNA、lncRNA、又は核RNAである、請求項48~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、及び前記機能断片は、実質的な(又は検出可能な)コラテラルRNase活性を示さない、請求項48~51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的RNAは、細胞内にある、請求項48~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は癌細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞に、感染性因子が感染する、請求項53に記載の方法。
- 前記感染性因子は、ウイルス、プリオン、原虫、真菌、又は寄生虫である、請求項55に記載の方法。
- 前記CRISPR-Cas複合体は、配列番号1~7のいずれか1つをコードする第1のポリヌクレオチド、又はその誘導体若しくは機能断片、並びに配列番号8~14のいずれか1つ、及び前記標的RNAに結合することができるスペーサーRNAをコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドによってコードされており、前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドは、前記細胞中に導入される、請求項53~56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチド及び前記第2のポリヌクレオチドは、同じベクターによって前記細胞中に導入される、請求項57に記載の方法。
- (i)細胞の老化のインビトロ又はインビボ誘導;(ii)インビトロ又はインビボ細胞周期停止;(iii)インビトロ若しくはインビボ細胞増殖阻害及び/又は細胞増殖阻害;(iv)アネルギーのインビトロ又はインビトロ誘導;(v)アポトーシスのインビトロ又はインビトロ誘導;及び(vi)壊死のインビトロ又はインビトロ誘導の1つ以上を引き起こす、請求項53~58のいずれか一項に記載の方法。
- 容体又は疾患の処置が必要な対象において容体又は疾患を処置する方法であって、前記対象に、請求項1~24のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas複合体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み;前記スペーサー配列は、前記容体又は疾患と関連する標的RNAの少なくとも15ヌクレオチドと相補的であり;前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記RNAガイド配列と結合して前記複合体を形成し;前記複合体は、前記標的RNAに結合し;前記標的RNAへの前記複合体の結合により、前記Cas、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的RNAを切断することによって、前記対象における前記容体又は疾患を処置する、方法。
- 前記容体又は疾患は、癌又は感染症である、請求項60に記載の方法。
- 前記癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌である、請求項61に記載の方法。
- インビトロ方法、インビボ方法、又はエクスビボ方法である、請求項60~62のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項48~59のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞又はその後代であって、天然に存在しない修飾(例えば、前記細胞/後代の転写されたRNA内の天然に存在しない修飾)を含む細胞及び後代。
- 標的RNAの存在を検出する方法であって、前記標的RNAを、請求項25~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項28~30のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含み、前記融合タンパク質又は前記コンジュゲートは、検出可能な標識(例えば、蛍光、ノーザンブロット、又はFISHによって検出され得るもの)及び前記標的RNAに結合することができる合成スペーサー配列を含む、方法。
- クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート(CRISPR)-Cas複合体を含む真核細胞であって、前記CRISPR-Cas複合体は:
(1)標的RNAにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して3’側にダイレクトリピート(DR)配列を含むRNAガイド配列;並びに
(2)配列番号1~7のいずれか1つのアミノ酸配列を有するCRISPR関連タンパク質(Cas)、又は前記Casの誘導体若しくは機能断片を含み;
前記Cas、前記Casの前記誘導体及び前記機能断片は、(i)前記RNAガイド配列に結合すること、且つ(ii)前記標的RNAを標的とすることができる、真核細胞。
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