CN115386560A - 在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统 - Google Patents

在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统。具体地，本发明提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，所述筛选系统包含：(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与用于检测旁切的第一可检测标记物共表达；(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达。本发明的筛选系统可高通量的筛选或确定基因编辑蛋白是否具有旁切效应。

Description

在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统。
背景技术
CRISPR-Cas13系统最近已被用于降解酵母，植物，哺乳动物细胞系和动物中的RNA。Cas13诱导的旁切作用可为大肠埃希氏菌提供抗MS2噬菌体的免疫力，并在核酸检测(SHERLOCK)中得到了很好的应用。但是，在哺乳动物细胞和成体动物中是否存在由Cas13介导的敲除引起的旁切影响一直是一个有争议的问题，这阻碍了Cas13的临床应用。
因此，本领域迫切需要开发一种快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。
发明内容
本发明目的就是提供了一种快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。
本发明的另一目的在于在哺乳动物细胞上瞬转快速筛选旁切效应高或者低的基因编辑蛋白、在稳转dox系统上评估基因编辑蛋白长时间表达对细胞增殖和转录组的影响，以及在体内验证基因编辑蛋白的安全性和旁切强弱。
在本发明的第一方面，提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，所述筛选系统包含：
(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；
(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物通过自剪切蛋白连接。
在另一优选例中，在启动子(比如，CAG、EF1α、CMV、PGK)存在下，所述基因编辑蛋白的编码序列与第一可检测标记物的编码序列共表达。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物通过不同的启动子连接，分别表达。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)启动子来驱动所述基因编辑蛋白的表达。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)启动子来驱动所述第一可检测标记物的表达。
在另一优选例中，所述gRNA与第二可检测标记物通过不同的启动子连接，分别表达。
在另一优选例中，所述gRNA通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK、U6)来驱动所述gRNA的表达。
在另一优选例中，所述第二可检测标记物通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)来驱动所述第二可检测标记物的表达。
在另一优选例中，所述第二可检测标记的表达量提高时，第一可检测标记物的强度显著降低。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括P2A。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白包括Cas13。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：Cas13a、Cas13b、Cas13d、Cas13x、Cas13y、或其组合。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物、第二可检测标记物各自独立的选自下组：荧光基团、发光标记物、量子点、或其组合。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：mCherry、EGFP、tdTomato、BFP、GFP、YFP、或其组合。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物和第二可检测标记物不相同。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括RNA、单链核苷酸。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子为RNA。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子选自下组：RPL4、PKM、PFN1、mCherry、EGFP、tdTomato、BFP、GFP、YFP、或其组合。
在另一优选例中，当第一可检测标记物的强度显著降低且靶标核酸分子(比如第二可检测标记)的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物的强度显著降低指第一可检测标记物的强度的降低幅度≥60％，较佳地，≥80％，更佳地，≥99％。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子(比如第二可检测标记)的强度显著降低指靶标核酸分子(比如第二可检测标记)的强度的降低幅度≥60％，较佳地，≥80％，更佳地，≥99％。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物的强度的降低幅度小是指第一可检测标记物的强度的降低幅度≤10％，较佳地，≤5％，更佳地，≤1％。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白包括Dox诱导的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括内源靶标核酸分子和外源靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述内源靶标核酸分子包含于细胞基因组中。
本发明第二方面提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选组合物，所述筛选组合物包含：
(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；
(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
本发明第三方面提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的方法，包括：
(i)将组分(a)和(b)导入细胞，其中组分(a)为待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；组分(b)为gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
(ii)通过第一可检测标记物的强度变化，从而判断所述基因编辑蛋白是否为具有旁切效应的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：HEK293T、Hela、u2os、N2a、U87、NIH3T3、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物的强度显著降低指第一可检测标记物的强度的降低幅度≥60％，较佳地，≥80％，更佳地，≥99％。
在另一优选例中，所述第一可检测标记物的强度的降低幅度小是指第一可检测标记物的强度的降低幅度≤10％，较佳地，≤5％，更佳地，≤1％。
在另一优选例中，所述导入包括选自下组的一种或多种方法：磷酸钙介导的转染、核转染、电穿孔、阳离子聚合物转染、病毒转导、病毒体转染、病毒粒子转染、脂质体转染、阳离子脂质体转染、免疫脂质体转染、非脂质体转染、树枝状大分子转染、热击转染、磁转染、脂质转染、基因枪递送、impalefection、声致穿孔和光学转染。
本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的筛选体系或本发明第二方面所述的筛选组合物的用途，用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在试管、哺乳动物细胞和小鼠成体中检测旁切效应。
a，基于体外Cas13的旁切作用开发的SHERLOCK示意图，在培养的细胞或小鼠中尚不清楚是否存在旁切效应。
b，上图，在细胞水平上通过双荧光报告系统检测哺乳动物细胞中旁切作用的示意图。将Cas13，mCherry gRNA和双重荧光报告基因共转染到HEK293T细胞中。转染后48小时分析mCherry和EGFP以及WGS的荧光强度和RNA转录本。下图，在Dox诱导的Cas13细胞系中检测到的旁切作用的示意图。将具有TRE-Cas13，mCherry gRNA和荧光报告基因的每个单个细胞分选到每个96孔板中，以产生具有Dox诱导的Cas13表达的HEK293T稳定细胞系。测量用或不用Dox处理的每个克隆的生长曲线和MTT测定。
c，具有常规或条件piggyBac转座子的Cas13转基因小鼠的存活和安全性评估示意图。将含有Cas13和Tyr/Syr gRNA的piggyBac转座酶和ggyBac载体共注射到受精卵中，以获得Cas13PB F0小鼠。通过类似的方法获得Cas13LSL-PB和Cre小鼠。将Cas13PB F0小鼠与C57BL/6小鼠杂交获得Cas13PB F1小鼠，将Cas13LSL-PB F0小鼠与Cre F0小鼠杂交获得Cas13LSL-PB。Cre F1小鼠。分析了两只F1小鼠的表型和Kaplan-Meier曲线。
图2显示了使用双荧光报告基因评估瞬时转染的HEK293T中CasRx介导的转录敲低和旁切效应。
a，用于评估Cas13(CasRx/Cas13a)介导的RNA抑制的旁切作用的哺乳动物双荧光报告系统的示意图。DR：直接重复，P2A：来自猪破伤风病毒-1启动子的2A肽。b，对于三种不同的mCherry gRNA，CasRx/Cas13a敲低mCherry和EGFP RNA的HEK293T细胞的代表性明场和荧光图像。NT：作为阴性对照的非靶向gRNA，比例尺，300μm。c-d，使用CasRx(c)或Cas13a(d)和三种不同的mCherry gRNA的mCherry和EGFP转录本的相对敲低。e，来自HEK293T中三个内源基因(RPL4，PFN1，PKM)的qPCR分析的相对mRNA水平(空白)和人蛋白质图谱的蛋白质水平(红色)。fh，CasRx介导的三种不同内源转录物的敲低：RPL4(f)(n＝4)，PFN1(g)(n＝4)和PKM(h)以及HEK293T中EGFP RNA水平的变化，每种方法使用四个不同的gRNA成绩单，与NT相比。NT：非靶向gRNA。i，分别与NT gRNA相比，CasRx和靶向RPL4的gRNA1(左)或gRNA2(右)转染的HEK293T细胞中差异表达基因的火山图。橙色：上调成绩单，蓝色：下调成绩单，FC：倍数变化，P.Adj：BH调整后的P值。所有值均为平均值±s.d。(n＝3)，除非另有说明。两尾未配对的两样本t检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，无显著性。
图3显示了在稳定转染的HEK293T细胞克隆中，CasRx介导的转录敲低和旁切效应的评估。
a，具有mCherry gRNA的dox诱导型CasRx/dCasRx稳定细胞示意图，用于检查旁切效应。b，经或未经dox处理的dox诱导的CasRx细胞克隆和dCasRx细胞克隆的代表性明场图像。在存在或不存在dox的情况下，CasRx(c)或dCasRx(d)用mCherry gRNA2敲除c-d，相对mCherry和EGFP RNA。e-f，用或不用dox处理的dox诱导的CasRx/dCasRx细胞克隆的生长曲线(e)和MTT分析(f)。所有值均为平均值±s.d。(n＝3)，除非另有说明。两尾未配对的两样本t检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，无显著性。
图4显示了检测成体水平上CasRX的旁切效应。
a，使用piggyBac系统的CasRx介导的Tyr或Sry敲低的示意图。b，与WT小鼠在相比，由CasRx介导的Tyr敲低产生的F1代白化小鼠。c，与WT雄性Sry+小鼠相比，由CasRx介导的Sry敲低引起的具有性别转变的F1代雌性小鼠，Sry-作为雌性小鼠对照。d，表达CasRx(n＝8)，带有Tyr gRNA(n＝19)或WT(n＝5)的F1代小鼠的Kaplan-Meier曲线。e，表达CasRx，带有Sry-gRNA或WT的CasRx的F1代小鼠的生存曲线。f，基于piggyBac转座子的Cre-LoxP系统，CasRX引起的的Tyr降低。g，F1代小鼠表现出EGFP阳性和CasRx过表达，mCherry阳性以及TyrgRNA和Cre转座酶。*EGFP和mCherry的显著表达。h，EGFP和mCherry转基因小鼠，mCherry转基因小鼠和WT小鼠的F1代的存活曲线。所有值均为平均值±s.d。(n＝3)，除非另有说明。对数秩Mantel-Cox测试。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，无显著性。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统。使用该筛选体系，可以高通量地筛选或确定基因编辑蛋白是否具有旁切效应。具体地，通过检测与基因编辑蛋白共表达的第一可检测标记物的强度变化，从而判断基因编辑蛋白是否具有旁切效应。在此基础上完成本发明。
基因编辑蛋白
本发明主要关注Class II CRISPR-Cas系统Cas13蛋白家族,其具备切割单链RNA的能力，且不需要PAM。目前已经发现并证明有活性的有Cas13a、Cas13b、Cas13d、Cas13x、Cas13y。这些蛋白在体外和体内旁切活性的验证对Cas13蛋白的应用至关重要。
在本发明中，所述“是否具有旁切效应的基因编辑蛋白”指具有旁切效应(或旁切效应强)或不具有旁切效应(或旁切效应弱)的基因编辑蛋白。
本发明的筛选体系及方法
本发明首次发现，Cas13诱导的旁切作用可为大肠埃希氏菌提供抗MS2噬菌体的免疫力，并在核酸检测(SHERLOCK)中得到了很好的应用(图1a)。本发明建立了在细胞和成体水平上量化蛋白质降解靶标和非靶标RNA的综合系统，包括通过瞬时转染双荧光报告系统进行的初步旁切效应筛选，Cas13稳转细胞系中的增殖能力存活评估(图1b)以及在动物中的进一步长期安全性评估(图1c)。通过本发明的系统可以发现，在哺乳动物细胞中Cas13介导的降解外源或者内源基因的RNA均可诱导大量旁切效应，阻碍细胞增殖、导致小鼠存活时间变短。因此，本发明的结果显示了本发明可以快速验证蛋白质的旁切效应，并为将来的CRISPR-Cas13应用和治疗提供了一个快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。
具体地，在本发明中，本发明提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，包含：
(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；
(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
本发明的筛选体系可高通量的筛选或确定基因编辑蛋白是否具有旁切效应，并可根据第一可检测标记物的强度变化来检测基因编辑蛋白的旁切效率。
具体地，在本发明的一优选的筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选流程中：
1.先通过瞬时转染基因编辑蛋白+第一可检测标记物与gRNA+第二可检测标记物到HEK293T细胞，48小时后通过流式定量第一可检测标记物与第二可检测标记物的阳性比例，gRNA靶向的第二可检测标记物的强度显著降低(≥60％)且gRNA非靶向的第一可检测标记物的强度显著降低(≥60％),则视为该基因编辑工具具有显著的旁切活性；
2.建立Dox诱导的基因编辑蛋白细胞稳转系，观察上述步骤1筛选出来低旁切活性的基因编辑工具(gRNA靶向的第二可检测标记物的强度显著降低(≥60％)且gRNA非靶向的第一可检测标记物的强度显著降低(≤60％))，在dox诱导长时间表达的情况下细胞增殖能力和转录组水平的变化；
3.建立基因编辑工具的PB转座小鼠，检测上述步骤2中筛选出来的对细胞增殖能力没有造成显著影响(ns)的基因编辑蛋白是否会对小鼠生长、发育和繁殖过程造成影响。
在本发明中，第一可检测标记物、第二可检测标记物强度的变化用常规的荧光成像、流式细胞仪定量或者免疫荧光的方法进行检测。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次开发了一种筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统。使用该筛选体系，可以高通量地筛选或确定基因编辑蛋白是否具有旁切效应。
(2)本发明通过检测与基因编辑蛋白共表达的第一可检测标记物的强度变化，从而判断基因编辑蛋白是否具有旁切效应，还可判断基因编辑蛋白的旁切效率。
(3)本发明可以快速验证蛋白质的旁切效应，并为将来的CRISPR-Cas13应用和治疗提供了一个快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。
(4)体外的细胞实验快速筛选旁切强或者弱的基因编辑蛋白，体内长时间表达充分且全面评估基因编辑工具的安全性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则实施例中的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
1.瞬转验证：转染基因编辑蛋白(CasRx)+第一可检测标记物(EGFP)与gRNA+第二可检测标记物(mCherry)到HEK293T细胞，48小时后通过流式定量第一可检测标记物(EGFP)与第二可检测标记物(mCherry)的阳性比例。
2.稳转Dox系统：将dox诱导的基因编辑蛋白(CasRx)+第一可检测标记物(EGFP)以及gRNA+第二可检测标记物(mCherry)分别插入PB转座序列之间，与PB转座酶表达质粒一起转入HEK293T细胞，7天后分析单个细胞到96孔板，克隆长起来后加dox检测细胞增殖能力(MTT assay)，统计生长曲线，RNA SEQ观察转录组变化。
3.小鼠体内检测基因编辑工具的旁切：将基因编辑蛋白(CasRx)+Tyr或者SrygRNA PB转座序列之间，与PB转座酶mRNA一起注射到小鼠受精卵，拿到F0代小鼠后与C57小鼠回交获得F1代小鼠，观察小鼠表型(白化/性别逆转)，统计小鼠体重变化和存活曲线。
gRNA的序列:
Figure BDA0003083677600000091
Figure BDA0003083677600000101
Figure BDA0003083677600000111
CasRx的核苷酸序列：
ATCGAGAAGAAGAAGAGCTTCGCCAAGGGCATGGGAGTGAAGAGCACCCTGGTGTCCGGCTCTAAGGTGTACATGACCACATTTGCTGAGGGAAGCGACGCCAGGCTGGAGAAGATCGTGGAGGGCGATAGCATCAGATCCGTGAACGAGGGAGAGGCTTTCAGCGCCGAGATGGCTGACAAGAACGCTGGCTACAAGATCGGAAACGCCAAGTTTTCCCACCCAAAGGGCTACGCCGTGGTGGCTAACAACCCACTGTACACCGGACCAGTGCAGCAGGACATGCTGGGACTGAAGGAGACACTGGAGAAGAGGTACTTCGGCGAGTCCGCCGACGGAAACGATAACATCTGCATCCAGGTCATCCACAACATCCTGGATATCGAGAAGATCCTGGCTGAGTACATCACAAACGCCGCTTACGCCGTGAACAACATCTCCGGCCTGGACAAGGATATCATCGGCTTCGGAAAGTTTTCTACCGTGTACACATACGACGAGTTCAAGGATCCAGAGCACCACCGGGCCGCTTTTAACAACAACGACAAGCTGATCAACGCCATCAAGGCTCAGTACGACGAGTTCGATAACTTTCTGGATAACCCCAGGCTGGGCTACTTCGGACAGGCTTTCTTTTCTAAGGAGGGCAGAAACTACATCATCAACTACGGAAACGAGTGTTACGACATCCTGGCCCTGCTGAGCGGACTGAGGCACTGGGTGGTGCACAACAACGAGGAGGAGTCTCGGATCAGCCGCACCTGGCTGTACAACCTGGACAAGAACCTGGATAACGAGTACATCTCCACACTGAACTACCTGTACGACAGGATCACCAACGAGCTGACAAACAGCTTCTCCAAGAACTCTGCCGCTAACGTGAACTACATCGCTGAGACCCTGGGCATCAACCCAGCTGAGTTCGCTGAGCAGTACTTCAGATTTTCCATCATGAAGGAGCAGAAGAACCTGGGCTTCAACATCACAAAGCTGAGAGAAGTGATGCTGGACAGAAAGGATATGTCCGAGATCAGGAAGAACCACAAGGTGTTCGATTCTATCAGAACCAAGGTGTACACAATGATGGACTTTGTGATCTACAGGTACTACATCGAGGAGGATGCCAAGGTGGCCGCTGCCAACAAGAGCCTGCCCGACAACGAGAAGTCTCTGAGCGAGAAGGATATCTTCGTGATCAACCTGAGAGGCTCCTTTAACGACGATCAGAAGGACGCTCTGTACTACGATGAGGCCAACAGGATCTGGAGAAAGCTGGAGAACATCATGCACAACATCAAGGAGTTCCGGGGAAACAAGACCCGCGAGTACAAGAAGAAGGACGCTCCAAGGCTGCCTAGGATCCTGCCTGCTGGAAGGGACGTGAGCGCCTTCAGCAAGCTGATGTACGCCCTGACAATGTTTCTGGACGGAAAGGAGATCAACGATCTGCTGACCACACTGATCAACAAGTTCGACAACATCCAGTCTTTTCTGAAAGTGATGCCTCTGATCGGCGTGAACGCTAAGTTCGTGGAGGAGTACGCCTTCTTTAAGGAC AGCGCCAAGATCGCTGATGAGCTGCGGCTGATCAAGTCCTTTGCCAGGATGGGAGAGCCAATCGCTGACGCTAGGAGAGCTATGTACATCGATGCCATCCGGATCCTGGGAACCAACCTGTCTTACGACGAGCTGAAGGCTCTGGCCGACACCTTCAGCCTGGATGAGAACGGCAACAAGCTGAAGAAGGGCAAGCACGGAATGCGCAACTTCATCATCAACAACGTGATCAGCAACAAGCGGTTTCACTACCTGATCAGATACGGCGACCCAGCTCACCTGCACGAGATCGCTAAGAACGAGGCCGTGGTGAAGTTCGTGCTGGGACGGATCGCCGATATCCAGAAGAAGCAGGGCCAGAACGGAAAGAACCAGATCGACCGCTACTACGAGACCTGCATCGGCAAGGATAAGGGAAAGTCCGTGTCTGAGAAGGTGGACGCTCTGACCAAGATCATCACAGGCATGAACTACGACCAGTTCGATAAGAAGAGATCTGTGATCGAGGACACCGGAAGGGAGAACGCCGAGAGAGAGAAGTTTAAGAAGATCATCAGCCTGTACCTGACAGTGATCTACCACATCCTGAAGAACATCGTGAACATCAACGCTAGATACGTGATCGGCTTCCACTGCGTGGAGCGCGATGCCCAGCTGTACAAGGAGAAGGGATACGACATCAACCTGAAGAAGCTGGAGGAGAAGGGCTTTAGCTCCGTGACCAAGCTGTGCGCTGGAATCGACGAGACAGCCCCCGACAAGAGGAAGGATGTGGAGAAGGAGATGGCCGAGAGAGCTAAGGAGAGCATCGACTCCCTGGAGTCTGCTAACCCTAAGCTGTACGCCAACTACATCAAGTACTCCGATGAGAAGAAGGCCGAGGAGTTCACCAGGCAGATCAACAGAGAGAAGGCCAAGACCGCTCTGAACGCCTACCTGAGGAACACAAAGTGGAACGTGATCATCCGGGAGGACCTGCTGCGCATCGATAACAAGACCTGTACACTGTTCCGGAACAAGGCTGTGCACCTGGAGGTGGCTCGCTACGTGCACGCCTACATCAACGACATCGCCGAGGTGAACTCCTACTTTCAGCTGTACCACTACATCATGCAGAGGATCATCATGAACGAGAGATACGAGAAGTCTAGCGGCAAGGTGTCTGAGTACTTCGACGCCGTGAACGATGAGAAGAAGTACAACGATAGACTGCTGAAGCTGCTGTGCGTGCCTTTCGGATACTGTATCCCACGGTTTAAGAACCTGAGCATCGAGGCCCTGTTCGACCGCAACGAGGCTGCCAAGTTTGATAAGGAGAAGAAGAAGGTGAGCGGCAACTCC(SEQ ID NO.:41)
Cas13a的核苷酸序列：
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实施例1细胞水平瞬时转染质粒检测CasRx蛋白(Cas13d的一个种属)的旁切效应
为了评估CasRx在哺乳动物细胞中的旁切效果，我们首先将CasRx与EGFP共转染，然后将mCherry与靶向(mCherry)或非靶向(NT)引导RNA(gRNA)共转染到HEK293T细胞中，以及EGFP和mCherry的表达水平转染48小时后进行流式和qPCR检测(图2a)。我们发现，与NTgRNA相比，使用三种不同的mCherry gRNA，CasRx不仅介导了mCherry荧光强度的下降，而且导致非靶向的EGFP荧光强度显著下降(图2b)。通过进一步的EGFP和mCherry转录本分析，发现了相似的结果(图2c)。此外，Cas13a在哺乳动物细胞中显示出相似的旁切效果(图2a，b，d)。这些发现表明，当靶向瞬时过表达的外源基因时，CasRx介导的RNA降解在哺乳动物细胞中产生旁切效果。
接下来，我们通过靶向内源基因RPL4，PKM和PFN1来测试CasRx在HEK293T中的旁切效果(图2e)。首先，我们针对每个转录本设计4个gRNA，检测到每组gRNA都能显著敲低目标转录组(图2f-h)。同时，检查了携带这些gRNA的EGFP mRNA水平，以评估CasRx介导的RNA敲除对相同三个基因的旁切影响。我们观察到四个RPL4 gRNA中有三个的EGFP转录本显著敲低(对于gRNA1，gRNA3，gRNA4分别为77±7％，58±9％，63±5％)，而带有RPL4 gRNA2的EGFP转录则没有可检测到的敲低(图2f-h)，这与以前的报道一致，针对相同转录本的不同gRNA表现出不同的旁切效应扩展。我们还发现，带有PKM和PFN1 gRNA(每个基因携带4个gRNA)的EGFP转录物没有显示出显著的敲低(p>0.05)(图2g，h，图2c，d)。进一步的流式细胞术实验表明，RPL4 gRNA1或gRNA3显著降低了EGFP和mCherry(图2e，f)，而PKM和PFN1 gRNA则略有降低(图2e，g，h)。这些发现表明，CasRx介导的RNA减少的旁切影响是gRNA依赖性的，并且与内源基因的底物表达水平相关。
为了全面搜索CasRx敲除的旁切影响，我们进行了转录组范围的RNA测序(RNA-seq)。我们用带有gRNA1或gRNA2的CasRx靶向RPL4转录本，显示RPL4的降低水平相当，但旁切效果水平不同。差异表达分析表明，在gRNA1条件下有数百个显著上/下调的基因，而在gRNA2条件下则少得多(图2i)。进一步的分析表明，RPL4 gRNA1诱导的一些下调基因大部分在代谢，细胞过程和信号转导途径中富集，而上调的基因则显示出较少的途径变化，而在上，下游都发现了较少的显著富集的途径。gRNA2诱导的调控基因(图3a，b)。另外，几乎没有改变的基因富含细胞凋亡。同时，我们在带有CasRx和RPL4 gRNA1，gRNA2和LacZ gRNA的带有CasRx的HEK293T细胞中进行了TUNEL分析，几乎没有检查所有样品中的凋亡细胞(图3c，d)。那些提示CasRx介导的RNA减少的旁切效果可能会抑制细胞生长，这与以前的报道一致，即Cas13诱导的大量宿主转录物降解导致细胞发育迟缓和休眠。
实施例2细胞水平piggyBac转座质粒检测CasRx蛋白的旁切效应
使用piggyBac转座子系统，我们构建了多西环素(Dox)诱导的CasRx或dCasRx的HEK293T稳转细胞系，以及携带靶向(mCherry)gRNA的双色报告基因(图3a)。在HEK293T稳转细胞的生长过程中，只有携带CasRx和mCherry gRNA表达的克隆导致细胞增殖能力受阻(图3b)。通过生长曲线和MTT分析，我们发现带有CasRx和mCherry gRNA的克隆在Dox诱导下携带明显的细胞生长迟缓和细胞存活水平降低，而带有dCasRx和mCherry gRNA的克隆没有这种变化(图3e-f)。此外，我们检测了有无Dox诱导的mCherry(靶向降解)和EGFP(旁切效应)转录本水平，在Dox诱导下，CasRx和mCherry gRNA的克隆mCherry和EGFP转录水平显著降低，而携带dCasRx和mCherry gRNA的克隆则没有这种变化(图3d-e)。这些发现表明，Dox诱导的CasRx和靶向的gRNA表达在HEK293T细胞中产生了大量的旁切作用，从而导致严重的细胞生长迟缓。
实施例3成体水平piggyBac转座质粒检测CasRx蛋白的旁切效应
为了进一步研究CasRx在体内的旁切作用，我们构建了转基因小鼠并检查了CasRx对内源基因的RNA靶向能力，分别设计了针对Tyr(用于毛色控制)和Sry(用于性别决定)的gRNAs。将含有gRNA，CasRx和EGFP报告基因的Pbase mRNA和piggyBac载体共注入小鼠受精卵后，我们获得了CasRX PB F0小鼠，并与野生型C57BL/6小鼠杂交(图4a)。出生后两周，与野生型的F1小鼠相比，靶向Tyr CasRx PB F1小鼠出现白毛，且在EGFP激发场中观察到绿色荧光(图4b)。此外，在出生后3天，我们观察到带有Sry gRNA的Sry+或Sry-CasRxPB F1小鼠携带绿色荧光的雌性特征，而野生型Sry+小鼠仍然携带雄性特征(图4c，图4a)。这些发现证明了CasRx在体内的RNA靶向活性。然而，与野生型(n＝5)相比，携带CasRx的小鼠(n＝8)或携带CasRx和Tyr gRNA的小鼠(n＝19)均无法存活，并且携有Tyr gRNA靶向的CasRx导致的致死率高于没有gRNA的致死率(图4d)。此外，对于Sry+小鼠，与野生型小鼠(n＝8)相比，携带CasRx(n＝6)的小鼠和携带CasRx和Sry gRNA(n＝9)的小鼠均无法存活，并且携带CasRx和Sry gRNA的小鼠也表现出更高死亡率(图4e)。类似地，对于Sry-小鼠，与野生型小鼠(n＝8)相比，携带CasRx(n＝7)或携带CasRx和Sry gRNA(n＝7)的小鼠无法存活，但没有显著差异(图4e)。同时，我们观察到靶向Sry的小鼠的体重没有变化(扩展数据图4b)。为避免在F0小鼠中旁切效应已经发挥作用，我们构建了条件型表达小鼠，CasRx表达可通过Rosa26位点的Cre重组酶释放。我们将含有CAG-LoxP-Stop-LoxP-CasRx的小鼠与含有Tyr gRNA和mCherry报告基因的Cre小鼠杂交(图4f)，发现了相同的旁切效应(图4g-h)。这些发现表明，成体水平CasRX本身不仅会引起旁切，而且携带靶向gRNA和on-target的RNA后旁切效应会进一步被激活。
总结：
Cas13蛋白在细胞和体内编辑RNA时是否存在旁切未见报道。申请人首次通过质粒瞬时转染、PB转座等手段提高靶向基因(第一可检测标记物的RNA)的表达量，就可以很明显看到Cas13在细胞和体内的旁切效应。随后让Cas13蛋白在小鼠上持续表达，靶向到基因Tyr的小鼠出现明显存活率下降，表明即使靶向的基因表达量不够高，短时间看不到旁切效应，但这种长时间旁切效应的积累对小鼠模型的制作、基因功能性研究以及成体治疗都是有害的。本发明提供了一个过表达靶向基因来筛选高或者低旁切效应基因编辑蛋白(比如，Cas13蛋白)的系统，能够灵敏、快速找到适合应用于基础科研或者基因治疗的基因编辑工具。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心
<120> 在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统
<130> P2021-0617
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 35
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accgtgtaca catacgacga gttcaaggat ccagagcacc accgggccgc ttttaacaac 540
aacgacaagc tgatcaacgc catcaaggct cagtacgacg agttcgataa ctttctggat 600
aaccccaggc tgggctactt cggacaggct ttcttttcta aggagggcag aaactacatc 660
atcaactacg gaaacgagtg ttacgacatc ctggccctgc tgagcggact gaggcactgg 720
gtggtgcaca acaacgagga ggagtctcgg atcagccgca cctggctgta caacctggac 780
aagaacctgg ataacgagta catctccaca ctgaactacc tgtacgacag gatcaccaac 840
gagctgacaa acagcttctc caagaactct gccgctaacg tgaactacat cgctgagacc 900
ctgggcatca acccagctga gttcgctgag cagtacttca gattttccat catgaaggag 960
cagaagaacc tgggcttcaa catcacaaag ctgagagaag tgatgctgga cagaaaggat 1020
atgtccgaga tcaggaagaa ccacaaggtg ttcgattcta tcagaaccaa ggtgtacaca 1080
atgatggact ttgtgatcta caggtactac atcgaggagg atgccaaggt ggccgctgcc 1140
aacaagagcc tgcccgacaa cgagaagtct ctgagcgaga aggatatctt cgtgatcaac 1200
ctgagaggct cctttaacga cgatcagaag gacgctctgt actacgatga ggccaacagg 1260
atctggagaa agctggagaa catcatgcac aacatcaagg agttccgggg aaacaagacc 1320
cgcgagtaca agaagaagga cgctccaagg ctgcctagga tcctgcctgc tggaagggac 1380
gtgagcgcct tcagcaagct gatgtacgcc ctgacaatgt ttctggacgg aaaggagatc 1440
aacgatctgc tgaccacact gatcaacaag ttcgacaaca tccagtcttt tctgaaagtg 1500
atgcctctga tcggcgtgaa cgctaagttc gtggaggagt acgccttctt taaggacagc 1560
gccaagatcg ctgatgagct gcggctgatc aagtcctttg ccaggatggg agagccaatc 1620
gctgacgcta ggagagctat gtacatcgat gccatccgga tcctgggaac caacctgtct 1680
tacgacgagc tgaaggctct ggccgacacc ttcagcctgg atgagaacgg caacaagctg 1740
aagaagggca agcacggaat gcgcaacttc atcatcaaca acgtgatcag caacaagcgg 1800
tttcactacc tgatcagata cggcgaccca gctcacctgc acgagatcgc taagaacgag 1860
gccgtggtga agttcgtgct gggacggatc gccgatatcc agaagaagca gggccagaac 1920
ggaaagaacc agatcgaccg ctactacgag acctgcatcg gcaaggataa gggaaagtcc 1980
gtgtctgaga aggtggacgc tctgaccaag atcatcacag gcatgaacta cgaccagttc 2040
gataagaaga gatctgtgat cgaggacacc ggaagggaga acgccgagag agagaagttt 2100
aagaagatca tcagcctgta cctgacagtg atctaccaca tcctgaagaa catcgtgaac 2160
atcaacgcta gatacgtgat cggcttccac tgcgtggagc gcgatgccca gctgtacaag 2220
gagaagggat acgacatcaa cctgaagaag ctggaggaga agggctttag ctccgtgacc 2280
aagctgtgcg ctggaatcga cgagacagcc cccgacaaga ggaaggatgt ggagaaggag 2340
atggccgaga gagctaagga gagcatcgac tccctggagt ctgctaaccc taagctgtac 2400
gccaactaca tcaagtactc cgatgagaag aaggccgagg agttcaccag gcagatcaac 2460
agagagaagg ccaagaccgc tctgaacgcc tacctgagga acacaaagtg gaacgtgatc 2520
atccgggagg acctgctgcg catcgataac aagacctgta cactgttccg gaacaaggct 2580
gtgcacctgg aggtggctcg ctacgtgcac gcctacatca acgacatcgc cgaggtgaac 2640
tcctactttc agctgtacca ctacatcatg cagaggatca tcatgaacga gagatacgag 2700
aagtctagcg gcaaggtgtc tgagtacttc gacgccgtga acgatgagaa gaagtacaac 2760
gatagactgc tgaagctgct gtgcgtgcct ttcggatact gtatcccacg gtttaagaac 2820
ctgagcatcg aggccctgtt cgaccgcaac gaggctgcca agtttgataa ggagaagaag 2880
aaggtgagcg gcaactcc 2898
<210> 42
<211> 3486
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
atgcccaaga agaagcggaa ggtgggatcc atgaaagtga ccaaggtcga tggcatcagc 60
cacaagaagt acatcgaaga gggcaagctc gtgaagtcca ccagcgagga aaaccggacc 120
agcgagagac tgagcgagct gctgagcatc cggctggaca tctacatcaa gaaccccgac 180
aacgcctccg aggaagagaa ccggatcaga agagagaacc tgaagaagtt ctttagcaac 240
aaggtgctgc acctgaagga cagcgtgctg tatctgaaga accggaaaga aaagaacgcc 300
gtgcaggaca agaactatag cgaagaggac atcagcgagt acgacctgaa aaacaagaac 360
agcttctccg tgctgaagaa gatcctgctg aacgaggacg tgaactctga ggaactggaa 420
atctttcgga aggacgtgga agccaagctg aacaagatca acagcctgaa gtacagcttc 480
gaagagaaca aggccaacta ccagaagatc aacgagaaca acgtggaaaa agtgggcggc 540
aagagcaagc ggaacatcat ctacgactac tacagagaga gcgccaagcg caacgactac 600
atcaacaacg tgcaggaagc cttcgacaag ctgtataaga aagaggatat cgagaaactg 660
tttttcctga tcgagaacag caagaagcac gagaagtaca agatccgcga gtactatcac 720
aagatcatcg gccggaagaa cgacaaagag aacttcgcca agattatcta cgaagagatc 780
cagaacgtga acaacatcaa agagctgatt gagaagatcc ccgacatgtc tgagctgaag 840
aaaagccagg tgttctacaa gtactacctg gacaaagagg aactgaacga caagaatatt 900
aagtacgcct tctgccactt cgtggaaatc gagatgtccc agctgctgaa aaactacgtg 960
tacaagcggc tgagcaacat cagcaacgat aagatcaagc ggatcttcga gtaccagaat 1020
ctgaaaaagc tgatcgaaaa caaactgctg aacaagctgg acacctacgt gcggaactgc 1080
ggcaagtaca actactatct gcaagtgggc gagatcgcca cctccgactt tatcgcccgg 1140
aaccggcaga acgaggcctt cctgagaaac atcatcggcg tgtccagcgt ggcctacttc 1200
agcctgagga acatcctgga aaccgagaac gagaacgata tcaccggccg gatgcggggc 1260
aagaccgtga agaacaacaa gggcgaagag aaatacgtgt ccggcgaggt ggacaagatc 1320
tacaatgaga acaagcagaa cgaagtgaaa gaaaatctga agatgttcta cagctacgac 1380
ttcaacatgg acaacaagaa cgagatcgag gacttcttcg ccaacatcga cgaggccatc 1440
agcagcatca gacacggcat cgtgcacttc aacctggaac tggaaggcaa ggacatcttc 1500
gccttcaaga atatcgcccc cagcgagatc tccaagaaga tgtttcagaa cgaaatcaac 1560
gaaaagaagc tgaagctgaa aatcttcaag cagctgaaca gcgccaacgt gttcaactac 1620
tacgagaagg atgtgatcat caagtacctg aagaatacca agttcaactt cgtgaacaaa 1680
aacatcccct tcgtgcccag cttcaccaag ctgtacaaca agattgagga cctgcggaat 1740
accctgaagt ttttttggag cgtgcccaag gacaaagaag agaaggacgc ccagatctac 1800
ctgctgaaga atatctacta cggcgagttc ctgaacaagt tcgtgaaaaa ctccaaggtg 1860
ttctttaaga tcaccaatga agtgatcaag attaacaagc agcggaacca gaaaaccggc 1920
cactacaagt atcagaagtt cgagaacatc gagaaaaccg tgcccgtgga atacctggcc 1980
atcatccaga gcagagagat gatcaacaac caggacaaag aggaaaagaa tacctacatc 2040
gactttattc agcagatttt cctgaagggc ttcatcgact acctgaacaa gaacaatctg 2100
aagtatatcg agagcaacaa caacaatgac aacaacgaca tcttctccaa gatcaagatc 2160
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ctgaagtaca ccgagaatct gaacatgttt tacctgatcc tgaagctgct gaaccacaaa 2340
gagctgacca acctgaaggg cagcctggaa aagtaccagt ccgccaacaa agaagaaacc 2400
ttcagcgacg agctggaact gatcaacctg ctgaacctgg acaacaacag agtgaccgag 2460
gacttcgagc tggaagccaa cgagatcggc aagttcctgg acttcaacga aaacaaaatc 2520
aaggaccgga aagagctgaa aaagttcgac accaacaaga tctatttcga cggcgagaac 2580
atcatcaagc accgggcctt ctacaatatc aagaaatacg gcatgctgaa tctgctggaa 2640
aagatcgccg ataaggccaa gtataagatc agcctgaaag aactgaaaga gtacagcaac 2700
aagaagaatg agattgaaaa gaactacacc atgcagcaga acctgcaccg gaagtacgcc 2760
agacccaaga aggacgaaaa gttcaacgac gaggactaca aagagtatga gaaggccatc 2820
ggcaacatcc agaagtacac ccacctgaag aacaaggtgg aattcaatga gctgaacctg 2880
ctgcagggcc tgctgctgaa gatcctgcac cggctcgtgg gctacaccag catctgggag 2940
cgggacctga gattccggct gaagggcgag tttcccgaga accactacat cgaggaaatt 3000
ttcaatttcg acaactccaa gaatgtgaag tacaaaagcg gccagatcgt ggaaaagtat 3060
atcaacttct acaaagaact gtacaaggac aatgtggaaa agcggagcat ctactccgac 3120
aagaaagtga agaaactgaa gcaggaaaaa aaggacctgt acatccggaa ctacattgcc 3180
cacttcaact acatccccca cgccgagatt agcctgctgg aagtgctgga aaacctgcgg 3240
aagctgctgt cctacgaccg gaagctgaag aacgccatca tgaagtccat cgtggacatt 3300
ctgaaagaat acggcttcgt ggccaccttc aagatcggcg ctgacaagaa gatcgaaatc 3360
cagaccctgg aatcagagaa gatcgtgcac ctgaagaatc tgaagaaaaa gaaactgatg 3420
accgaccgga acagcgagga actgtgcgaa ctcgtgaaag tcatgttcga gtacaaggcc 3480
ctggaa 3486

Claims (10)

1.一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统包含：
(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；
(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
2.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于，所述所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物通过自剪切蛋白连接。
3.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于，所述第一可检测标记物、第二可检测标记物各自独立的选自下组：荧光基团、发光标记物、量子点、或其组合。
4.如权利要求3所述的筛选系统，其特征在于，所述荧光基团选自下组：mCherry、EGFP、tdTomato、BFP、GFP、YFP、或其组合。
5.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于，所述第一可检测标记物和第二可检测标记物不相同。
6.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于，所述靶标核酸分子包括RNA、单链核苷酸。
7.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于，当第一可检测标记物的强度显著降低且靶标核酸分子(比如第二可检测标记)的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白。
8.一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选组合物，其特征在于，所述筛选组合物包含：
(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；
(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。
9.一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的方法，其特征在于，包括：
(i)将组分(a)和(b)导入细胞，其中组分(a)为待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；组分(b)为gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；
(ii)通过第一可检测标记物的强度变化，从而判断所述基因编辑蛋白是否为具有旁切效应的基因编辑蛋白。
10.一种权利要求1所述的筛选体系或权利要求8所述的筛选组合物的用途，其特征在于，用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591949A (zh) * 2020-12-04 2022-06-07 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 一种检测细胞内源性低丰度基因和lncRNA水平的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647968A (zh) * 2016-02-02 2016-06-08 浙江大学 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用
CN111471744A (zh) * 2020-05-14 2020-07-31 重庆英茂盛业生物科技有限公司 一种检测基因编辑靶点切割效率的方法
CN112410377A (zh) * 2020-02-28 2021-02-26 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647968A (zh) * 2016-02-02 2016-06-08 浙江大学 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用
CN112410377A (zh) * 2020-02-28 2021-02-26 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及用途
CN111471744A (zh) * 2020-05-14 2020-07-31 重庆英茂盛业生物科技有限公司 一种检测基因编辑靶点切割效率的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591949A (zh) * 2020-12-04 2022-06-07 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 一种检测细胞内源性低丰度基因和lncRNA水平的方法

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