JP2023516113A - 単分子イメージング - Google Patents

Abstract

単分子を検出する方法は、光透過性基板の表面に単分子を結合させるステップと、光の全反射を達成するように選択された入射角を有する光で基板の表面を照射し、それにより表面から及び表面に結合された単分子から光を散乱させるステップと、表面によって及び表面に結合された単分子によって散乱された光を収集して一連の画像を形成するステップとを含む。単分子を検出するシステムは、光透過性基板と、基板の表面上にサンプル溶液を流すための手段と、表面を照射するように構成された光源と、カメラと、表面によって及び表面上の標的分子によって散乱された光を収集してカメラにおいて一連の画像を形成するように構成された集光光学系とを含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年２月１２日出願の米国特許出願第６２／９７５４７３号及び２０２１年１月１４日出願の米国特許出願第６３／１３７６１１号の利益を主張する。

（政府利益の記載）
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＧＭ１０７１６５の下での政府支援によって行われた。

本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は内部全反射（ＴＩＦ）によって生成されるセンサ表面付近のエバネッセント場の散乱に基づく単分子イメージング及び解析のためのデバイス、システム及び方法に関する。

ラベルフリー光学検出技術は通常、２つのカテゴリ：遠方場（明視野が光波長の複数倍にわたって空間を伝搬することができる）及び近接場（明視野が空間を伝搬することができず、波長の範囲内に局所化される）に分類される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）顕微鏡検査法などの近接場法は高い空間解像度を達成するために使用されてきたが、単分子のイメージングは理解し難いものであった。従来のＳＰＲ又は内部全反射（ＴＩＦ）は反射光を検出し、これは単分子からの微弱な信号を大幅に上回る強力なバックグラウンドを生成する。さらに、それは数ミクロンのサイズの回折パターンを生成し、これは画像空間解像度を低下させる。

ここに記載する近接場システム及び方法は、それらの遠方場のものに対して種々の有利な効果を有する。第１に、エバネッセント場（近接場）の強度はセンサ表面付近に局所化されてその表面を高感度とし、これはバルク溶液中の分子による干渉を低減する。第２に、センサ表面付近には大きな場の増強（２０～３０倍）があり、これは（例えば、ＳＰＲ及びＴＩＦの）高い感度に寄与する。さらに、ＳＰＲ及びＴＩＦの共鳴条件は、多くの光を散乱させない小分子又はイオンの結合も同じ装備で測定可能となるように、センサ表面付近の屈折率に依存する。

さらに、ここに記載する方法は、表面プラズモン共鳴角のシフトを測定する必要をなくして結合反応速度の正確な測定を与えるデジタル計数手法によって分子結合反応速度を評価するのに使用可能である。ここに開示されるデジタル計数手法は、センサ表面に結合する分子の数及び分子のサイズを同時に特定するのに使用可能である。

隔離された物体（例えば、分子）から散乱される光は、その物体のサイズに対して急峻に低下する。ここで、適切なレベルの表面粗度を有するセンサは、物体から散乱された光と干渉する散乱光を生成するのに使用され、隔離された物体からの画像コントラストよりも緩やかに低下する画像コントラストを生成する。

ショットノイズは、光学イメージングにおける基本的な制約である。ショットノイズを最小化するために、１つの戦略は、入射光強度を増加させることであり、これはセンサ表面上の分子の発熱をもたらし得る。ここに記載するように、冷却機構が、流体工学において実施されて、サンプルフローを限流することによる発熱を除去する。

本開示はまた、単一タンパク質の質量の測定及び単分子レベルでの分子結合プロセスの調査を可能とするプラズモン散乱顕微鏡法（ＰＳＭ）である、プラズモン散乱イメージングを介した単一非標識化タンパク質の検出のためのプリズム系ＳＰＲシステムを説明する。アンサンブルＳＰＲと比較して、単分子ベースの測定は、個々の結合された解析対象分子の質量及び結合動力学を定量化することによって特異的及び非特異的結合プロセスを区別することができる。さらに、プリズム系ＳＰＲは、低コストでかつ機械的に安定である。

ここに記載するように、プラズモン散乱イメージング技術は、ラベルフリーの単分子イメージングのアプリケーションについての開口数及び倍率を制限するプリズム構成の物理的制約を克服することができる。イメージング装備及び検出原理を説明し、様々なサイズのナノ粒子及び様々な分子質量のタンパク質による較正を実行することによって検出原理を確認する。単一タンパク質イメージングを示して、特異的及び非特異的結合プロセスを詳細なレベルにおいて解明する。さらに、ここに記載するシステム及び方法は、様々な分子量を有する個々の結合タンパク質を区別することができ、特異的及び非特異的結合の様々な結合挙動を解明することもできる。この手法によって、血清などの複合媒体におけるラベルフリーの結合反応速度解析が可能となる。さらに、プリズム結合型ＰＳＭのプリズム構成の剛体機械的構造は、測定再現性を促進し、システム安定性を向上し、機器操作を簡素化する。

ＰＳＭは、従来のＳＰＲ技術として大きなプラズモン強化を利用し、したがって非プラズモン方法と比較して低い入射光パワー又は広い視野のいずれかにより高い信号対ノイズ比を可能とする。ＰＳＭはまた、反射光の集光を回避するので、従来のＳＰＲイメージングに対して少なくとも３つの利点を与える。それは、１）コントラストを向上する、より暗いバックグラウンドを与え、２）高い入射光強度を用いて信号対ノイズ比を向上することを可能とし、３）ＳＰＲＭ画像における放物線状テールをなくし、空間解像度を向上することである。またさらに、ＰＳＭ方式は、ＳＰＲＭにおける内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）対物レンズの代わりに、サンプルの上部に配置される対物レンズを採用して、解析対象物によって散乱される表面プラズモン波をイメージングして反射画像を生成する。これにより、より安定的なＳＰＲ励起のためにＴＩＲＦ対物レンズの代わりにプリズム構成型単分子イメージングシステムを構築することができる。なぜなら、プリズム構成は、吊下げられたカバーガラスと浸漬オイルで充填されたＴＩＲＦ対物レンズとの間の距離を正確に制御する必要がなく、したがって、環境ノイズの影響を受け易く、ＳＰＲＭに共通の１つの問題である、入射光条件及び画像の焦点の双方に大きく影響するオイルドリフトに影響されないからである。プリズム系ＰＳＭは、プリズム構成の剛体機械的構造に少なくともある程度起因して、詳細なレベルにおける生物学的プロセスを理解するための単一タンパク質イメージング能力、及び良好な測定再現性を与える。

開示される進歩的な概念は、添付の特許請求の範囲に規定されるものを含むが、進歩的な概念は以下の実施形態によっても規定され得ることが理解されるべきである。

添付の特許請求の範囲の実施形態及び上述の実施形態に加えて、以下のナンバリングされた実施形態も革新的である。

実施形態１は単分子を検出する方法であり、方法は、光透過性基板の表面に前記単分子を結合させるステップと、光の全反射を達成するように選択された入射角を有する前記光で前記基板の前記表面を照射し、それにより該表面から及び該表面に結合された前記単分子から光を散乱させるステップと、前記表面によって及び該表面に結合された前記単分子によって散乱された光を収集して一連の画像を形成するステップと、を備える。

実施形態２は実施形態１の方法であり、前記単分子によって散乱された前記光との充分な干渉のための散乱光を前記表面が生成するように該表面の粗度が選択される。

実施形態３は実施形態２の方法であり、前記表面の粗度は１ｎｍと１００ｎｍの間にある。

実施形態４は、実施形態１から３のいずれか１つの方法であり、前記一連の画像を処理するステップをさらに備える。

実施形態５は実施形態４の方法であり、前記一連の画像を処理するステップは、前記一連の画像における画像を平均化するステップと、各画像から前の画像を減じて差分画像シーケンスを形成するステップと、前記差分画像シーケンスを経時的に積分するステップと、を備える。

実施形態６は、実施形態１から５のいずれか１つの方法であり、前記表面に結合された単分子の数を経時的に計数し、結合モデルにフィッティングして反応速度定数及び親和性を特定するステップをさらに備える。

実施形態７は、実施形態１から６のいずれか１つの方法であり、機械的ドリフトを補正するステップをさらに備える。

実施形態８は実施形態７の方法であり、機械的ドリフトを補正するステップは、前記表面の１以上の特徴を識別するステップと、各画像についてドリフト変位を特定するステップと、各画像から前記ドリフト変位を減算するステップと、を備える。

実施形態９は実施形態１から８のいずれか１つの方法であり、前記光透過性基板は、サンプル溶液中の標的解析対象物の特異的結合が検出及び識別可能となるように、捕捉分子でコーティングされている。

実施形態１０は実施形態１から９のいずれか１つの方法であり、前記表面が金属層でコーティングされ、前記入射角は前記金属層上に表面プラズモン共鳴を生成するように選択される。

実施形態１１は実施形態１０の方法であり、前記金属層は金である。

実施形態１２は実施形態１から１１のいずれか１つの方法であり、前記光透過性基板は屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学対物レンズを備える。

実施形態１３は実施形態１から１２のいずれか１つの方法であり、前記光透過性基板は屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学プリズムを備える。

実施形態１４はシステムであり、システムは、光透過性固体基板と、前記基板の表面上にサンプル溶液を流すための手段と、光の全反射を達成するように選択された入射角を有する前記光で前記表面を照射するように構成された光源と、カメラと、前記表面から反射される光の収集を回避しつつ前記表面によって及び該表面上の標的分子によって散乱された光を収集して前記カメラにおいて一連の画像を形成するように構成された集光光学系と、を備える。

実施形態１５は実施形態１４のシステムであり、前記標的分子によって散乱された前記光との充分な干渉のための散乱光を前記表面が生成するように該表面の粗度が選択される。

実施形態１６は実施形態１５のシステムであり、前記表面の粗度は１ｎｍと１００ｎｍの間にある。

実施形態１７は実施形態１４から１６のいずれか１つのシステムであり、前記基板の前記表面上にサンプル溶液を流すための前記手段は、前記基板の前記表面上に入口及び出口を有する流体チャンバと、前記基板の前記表面上にサンプル溶液及び基準溶液を送出する手段と、入射光に関連する前記表面の発熱を最小化するように前記サンプル溶液及び基準溶液の流速を調整する手段と、を備える。

実施形態１８は実施形態１４から１７のいずれか１つのシステムであり、コントローラをさらに備え、該コントローラは、前記一連の画像における画像を平均化し、各画像から前の画像を減じて差分画像シーケンスを形成し、前記差分画像シーケンスを経時的に積分するように構成される。

実施形態１９は実施形態１４から１８のいずれか１つのシステムであり、前記集光光学系は前記入射光及び反射光の反対側から前記表面によって及び該表面上の前記標的分子によって散乱された光を収集するように構成される。

実施形態２０は実施形態１４から１９のいずれか１つのシステムであり、前記集光光学系は前記入射光及び反射光の同じ側において前記表面によって及び該表面上の前記標的分子によって散乱された光を収集するが、前記反射光の収集を回避するように構成される。

実施形態２１は実施形態１４から２０のいずれか１つのシステムであり、前記表面は前記標的分子に結合するように構成されたレセプターを備え、前記標的分子の結合及び解離は、前記標的分子を経時的に計数するとともに結合モデルにフィッティングして反応速度定数及び親和性を特定することによって検出される。

実施形態２２は実施形態１４から２１のいずれか１つのシステムであり、コントローラをさらに備え、該コントローラは機械的ドリフトを補正するように構成される。

実施形態２３は実施形態２２のシステムであり、機械的ドリフトを補正することは、前記表面の１以上の特徴を識別すること、各画像についてドリフト変位を特定すること、及び各画像から前記ドリフト変位を減算すること、を備える。

実施形態２４は実施形態１４から２３のいずれか１つのシステムであり、前記固体基板は、サンプル溶液中の標的解析対象物の特異的結合が検出及び識別可能となるように捕捉分子でコーティングされている。

実施形態２５は実施形態１４から２４のいずれか１つのシステムであり、前記表面が金属層でコーティングされ、前記入射角は前記金属層上に表面プラズモン共鳴を生成するように選択される。

実施形態２６は実施形態２５のシステムであり、前記金属層は金である。

実施形態２７は実施形態１４から２６のいずれか１つのシステムであり、前記光透過性固体基板は屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学対物レンズを備える。

実施形態２８は実施形態１４から２７のいずれか１つのシステムであり、前記光透過性固体基板は屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学プリズムを備える。

実施形態２９は液体サンプル中の多数の成分をイメージングする方法であり、該方法は、光透過性基板の金属コーティング表面上に前記液体サンプルを流し、それにより前記金属コーティング表面に前記成分を結合させるステップと、前記金属コーティング表面における表面プラズモン共鳴を達成するように選択された入射角で光学プリズムを介して光を前記金属コーティング表面に向けるステップと、前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された光に対応する領域を備える一連の画像をある時間長にわたって取得するステップと、時間の関数として前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光の強度を前記一連の画像から評価するステップと、を備える。

実施形態３０は実施形態２９の方法であり、各成分から散乱された前記光のピーク強度は前記成分の質量に対して増加する。

実施形態３１は、実施形態２９から３０のいずれか１つの方法であり、各成分が前記金属コーティング表面に結合される時間長を前記一連の画像から評価するステップをさらに備える。

実施形態３２は実施形態３１の方法であり、各成分が前記金属コーティング表面に結合される前記時間長は前記成分が前記金属コーティング表面に結合されるメカニズムを表すものである。

実施形態３３は実施形態２９から３２のいずれか１つの方法であり、前記多数の成分は多数の標的分子を含む。

実施形態３４は実施形態３３の方法であり、前記金属コーティング表面はレセプターを備え、各レセプターは前記多数の標的分子の１つに特異的に結合するように構成される。

実施形態３５は実施形態３４の方法であり、前記多数の成分は多数の非標的分子を含む。

実施形態３６は実施形態３５の方法であり、前記非標的分子は前記レセプターに特異的には結合しない。

実施形態３７は、実施形態３６の方法であり、前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光のピーク強度に基づいて前記非標的分子から前記標的分子を区別するステップをさらに備える。

実施形態３８は、実施形態３６又は３７の方法であり、各成分が前記金属コーティング表面に結合される時間長に基づいて前記非標的分子から前記標的分子を区別するステップをさらに備える。

実施形態３９は、実施形態３４から３８のいずれか１つの方法であり、各標的分子が前記金属コーティング表面に結合される時間長に基づいて、前記金属コーティング表面に他に結合された標的分子から、前記レセプターに結合された標的分子を区別するステップをさらに備える。

実施形態４０は、実施形態３４から３９のいずれか１つの方法であり、予め選択された時間間隔中に前記レセプターに結合する標的分子の数を評価するステップをさらに備える。

実施形態４１は、実施形態４０の方法であり、前記予め選択された時間間隔中に前記レセプターから解離する標的分子の数を評価するステップをさらに備える。

実施形態４２は、実施形態４１の方法であり、前記標的分子と前記レセプターの間の前記結合反応速度の順序を評価するステップをさらに備える。

実施形態４３は、実施形態３４から４２のいずれか１つの方法であり、前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光のピーク強度に基づいて、結合された標的分子の凝集体から、結合された標的分子を区別するステップをさらに備える。

実施形態４４は、実施形態４３の方法であり、前記標的分子の凝集体によって散乱された前記光の前記ピーク強度に基づいて、前記標的分子の凝集体中の標的分子の数を評価するステップをさらに備える。

実施形態４５は実施形態３３から４４のいずれか１つの方法であり、前記標的分子はタンパク質である。

実施形態４６は実施形態２９から４５のいずれか１つの方法であり、前記液体サンプルは緩衝溶液及び少なくとも１０重量％の血清を含む。

実施形態４７は実施形態４６の方法であり、前記金属コーティング表面上に前記液体サンプルを流すステップは前記液体サンプルをキャリア液に混合するステップを備え、前記キャリア液は前記緩衝溶液又は異なる緩衝溶液を含む。

実施形態４８は実施形態２９から４７のいずれか１つの方法であり、前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光は、前記金属コーティング表面の凹凸及び前記標的分子によって散乱される表面プラズモン波間の干渉に対応する。

実施形態４９は実施形態２９から４８のいずれか１つの方法であり、前記金属コーティング表面は金コーティング表面、銀コーティング表面又はアルミニウムコーティング表面である。

本開示の主題の１以上の実施形態の詳細を添付図面及び詳細な説明において説明する。主題の他の特徴、態様及び有利な効果は、詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。

図１Ａは、センサの表面と結合する単分子を検出するために使用され得る対物レンズ系プラズモンイメージングシステムを図示する。 図１Ｂは、センサの表面と結合する単分子を検出するために使用され得る対物レンズ系プラズモンイメージングシステムを図示する。 図２は、画像処理アルゴリズムにおけるステップを示す。 図３Ａは、プリズム結合型プラズモン散乱顕微鏡システムを図示する。 図３Ｂは、プリズム結合型プラズモン散乱顕微鏡システムを図示する。 図４は、プラズモン散乱顕微鏡画像輝度対粒子径を示す。 図５は、プラズモン散乱顕微鏡画像輝度対分子質量を示す。 図６は、単分子の結合／解離のデジタル計数によって特定された抗ＩｇＡに対するＩｇＡ結合及び抗ＩｇＡ及びＢＳＡに対するＩｇＭの非特異的結合の反応速度を示す。 図７は、単一ＩｇＡ分子の結合／解離のデジタル計数によって特定された抗ＩｇＡに対するＩｇＡ結合の反応速度、並びに同時に記録されたアンサンブルＳＰＲシグナルを示す。

ここに記載されるシステム及び方法は、近接場が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は内部全反射（ＴＩＦ）によって生成される近接場光学イメージングの実施形態を含む。ただし反射光の検出ではなく、サンプル分子及びセンサ表面からの散乱光を検出する。自由空間内の分子によって散乱された光は、分子径の６乗に対応する。この理由から、分子サイズに応じて散乱光強度は急速に減少し、単分子のイメージングが困難になる。この問題を克服するために、センサ表面が標的単分子からの散乱光と同程度の大きさで光を散乱するように、選択された粗度を有するセンサ表面を使用する。表面の粗度を定義するための様々な方法があり、そのうちの１つは、ｙ_ｉを位置ｉでの高さ、ｎを位置の数として、以下の（１）式によって与えられる。

この定義を用いると、金表面の表面粗度は約１．５ｎｍとなる。

一部の実施形態では、センサ表面の粗度は、約１ｎｍ～約１００ｎｍの範囲にある。タンパク質及びセンサ表面から散乱された光の干渉は、分子径の３乗に対応する画像コントラストを生じる。これは、分子サイズに応じて画像コントラスト内の減衰を減速させるので、小さな物体（例えば、単一タンパク質分子）のイメージングに有利である。

センサ表面の粗さの特徴及び不純物並びに不完全光学系に関連する特徴は、全て画像コントラストに寄与し、単分子の弱い画像をマスクし得る。ここに記載されるように、差分積分イメージング処理アルゴリズムは、時系列画像の各フレームから上記の画像コントラストに寄与するバックグラウンドの特徴を減じて差分画像を積分するのに使用され、センサ表面上の単一タンパク質分子の結合及び解離を復元する。ドリフト又はモーション補正アルゴリズムは、センサ表面上の１以上の特徴のドリフト又はモーションパターンを追跡して各画像フレームからドリフト又はモーションを補正するように導入され、それによりセンサ表面若しくは光学系の位置におけるドリフト又は環境の機械的振動の影響を減少する。結合反応速度は、センサ表面上の個々の標的分子を計数することによって評価される。このデジタル計数の手法によって、結合反応速度の正確な測定が可能となる。さらに、この手法は、表面プラズモン共鳴角（センサ表面と結合する分子の数だけでなく、分子のサイズによっても決定される）のシフトを直接的にも間接的にも測定する必要はない。

［ＳＰＲ系単分子解析］
実施形態は、ＳＰＲ系単分子解析のプラズモンイメージングシステム及び方法を含む。場合によっては、プラズモンイメージングシステムは、対物レンズを含む。場合によっては、プラズモンイメージングシステムは、対物レンズではなく光学プリズムを含む。

図１Ａは、センサの表面と結合する単分子を検出するのに使用され得る対物レンズ系プラズモンイメージングシステム１００の模式図である。表面プラズモン波（Ｅ_ｐ）は金コーティングガラススライドの底部からの光によって励起され、粒子又はタンパク質によるプラズモン波の散乱（Ｅ_ｓ）及び金表面によるプラズモン波の散乱（Ｅ_ｂ）は上部から収集されてプラズモン散乱顕微鏡（ＰＳＭ）画像を形成する。一例では、センサは金属（例えば、金）コーティングガラス基板１０２を含む。標的分子１０６（例えば、タンパク質）の溶液１０４は、（例えば、フローセルを介して）センシング表面に導入される。センサ表面は、標的分子又は粒子（例えば、特定のタンパク質）の検出のための撮影プローブ１０８で機能化され得る。標的分子又は粒子から散乱された光は、上部カメラ１１０から収集される。従来の表面プラズモン共鳴画像は、同時に底部カメラから取得され得る。

一部の実施形態では、図１Ａにおけるシステムの対物レンズが、光学プリズムに置き換えられる。プリズムは、センサが配置される上面を有する。プリズムは、入射光の導入のための平坦な表面及びセンサ表面から反射した光がプリズムから出射するための第２の平坦な表面も有する。

図１Ｂは、対物レンズ系プラズモンイメージングシステム１００のより詳細な図である。ＰＳＭ及びＳＰＲの同時イメージングのための光学装備であり、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）１１１からの光は６０倍対物レンズ（ＮＡ＝１．４９）１１２を介して、屈折率マッチングオイルを介して対物レンズに搭載される金コーティングガラススライド１０２上に調整され向けられる。金コーティングガラススライド１０２から反射した光は、光学減衰器１１６（ＮＤ３０Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）が装備されたカメラ１１４（Ｐｉｋｅ Ｆ－０３２Ｂ）によって検出されて露光過多を回避する。入射光の角度は表面プラズモン共鳴に調整され、そこで反射光は最小に達する。同時に、金表面から散乱された光は５０倍対物レンズ（ＮＡ＝０．４２）１１８によって収集され、金表面の上部に配置されたカメラ１０８（ＭＱ００３ＭＧ－ＣＭ、ＸＩＭＥＡ）によって検出される。入射光強度は、３ｋＷ／ｃｍ^２以下である。カメラ１１４は従来のＳＰＲを測定し、カメラ１０８はＰＳＭ画像を記録する。フローセル１２０は、金コーティングガラススライド１０２、カバーガラス１２２、入口１２４及び出口１２６を含む。一実施形態では、金コーティングガラススライド１０２とカバーガラス１２２との間の距離は約５０ミクロンである。ただし、この距離は、他の実施形態では異なり得る。システム１００は、コントローラ１２８を含み得る。コントローラ１２８は、システム１００の１以上の構成要素（例えば、カメラ１０８、１１４、ＳＬＤ１１１）を制御して、システム１００に出入する流体フローを制御するとともにシステム１００の１以上の構成要素（例えば、カメラ１０８、１１４）によって収集されたデータ又は画像を処理するように構成され得る。場合によっては、コントローラ１２８は、システム１００における機械的ドリフトを補正するのに使用され得る。

一例では、金コーティングガラススライドを、ＢＫ－７ガラススライドに２ｎｍ厚のクロムを蒸着させ、続いて４７ｎｍの金を蒸着させることで調製した。ＢＫ－７ガラススライドを、クロム及び金の蒸着のための真空チャンバに装填する前に、アセトン及び脱イオン水によって徹底的に洗浄した。金表面を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって検査すると、可変サイズのアイランドを示した。

［ＴＩＦ系単分子解析］
ＴＩＦ系分子解析のシステムは、ＳＰＲ系単分子解析と同様であってよく、金属コーティングのないセンサ表面を有する。入射角が臨界角に近い又はそれ以上である場合、それは全てセンサ表面から反射され、それは内部全反射（ＴＩＦ）といわれる。この条件下では、エバネッセント場（近接場ともいわれる）がセンサ表面に現れ、それはセンサ表面の上部の溶液内に指数関数的に減衰する。ＳＰＲの実施形態におけるように、このエバネッセント場がセンサ表面上の単分子によって散乱され、単分子によって及びセンサ表面によって散乱された干渉光が画像コントラストを生じる。

［入射光に起因する発熱の影響］
信号対ノイズ比を最大化するために高い入射光強度が好適であるが、それはセンサ表面の発熱並びに光学系及び標的分子の構造の不安定性を引き起こす。この問題は、サンプル分子の流入及び流出のための同一流体工学を用いて発熱を冷却することによって、ここに記載されるように克服され得る。

単一タンパク質は、ＳＰＲイメージングシステムで直接イメージングされ、これらのサイズ及び対応する抗体との特異的結合に基づいて検出及び識別される。タンパク質結合反応速度の定量化は、個々の分子の結合及び解離をデジタル計数及び解析することによって実証される。

ＳＰＲイメージングシステムは、幾つかの固有の特徴を有する。第１に、エバネッセント場強度はＳＰＲセンサ表面（例えば、金コーティングガラススライド）から約１００ｎｍ以内で局所化され、それはバルク溶液中の分子及び不純物の干渉に影響されなくなるため、表面結合の検討に特に適している。第２に、センサ表面近くの場における大きな増強（２０～３０倍）があり、それがＳＰＲの高い感度の原因となる。最後に、ＳＰＲの共鳴条件はセンサ表面近くの屈折率に依存するため、表面帯電、小分子又はイオン及び光を強く散乱しない生化学反応も、同時に記録された従来のＳＰＲ画像から同一の装備で測定可能となる。

図１Ａを参照すると、表面プラズモン波は対物レンズ上に配置される金コーティングガラススライド上の油浸対物レンズを介して適切な角度に光を向けることで励起される。従来のＳＰＲでは、金表面から反射される光は、ＳＰＲ画像を形成するのに収集され、Ｅ_ｐを入射光によって励起されたプラズモン波とし、Ｅ_ｓをセンサ表面上のタンパク質によるプラズモン波の散乱とし、Ｅ_ｒを金表面の裏側からの入射波の反射として、以下の（２）式で記載される。

ＳＰＲ画像コントラストは平面のプラズモン波と球状の散乱プラズモン波との間の干渉によって決定され、θを２つの波の間の位相差として、２｜Ｅ_ｐ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（θ）によって与えられ、それは放物線状テールを有するタンパク質の位置にスポットを生じる。Ｅ_ｓはタンパク質の光学分極率に比例し、それはタンパク質の質量又はｄ^３に対応し、ｄは直径である。

式（２）におけるＥ_ｒはＳＰＲ画像における大きなバックグラウンドを生じ、それは単一タンパク質からの弱い散乱波（Ｅ_ｓ）をマスクする。この困難を克服するために、タンパク質によって散乱されたプラズモン波は、底部からの従来のＳＰＲ画像を記録するのに加えて、サンプルの上部に配置される第２の対物レンズでイメージングされた。これは強い反射の収集を回避し、さらに放物線状テールを除去し、タンパク質の高いコントラストの画像を提供する。一見すると、画像コントラストは、｜Ｅ_ｓ｜^２～ｄ^６によって変化（拡縮）すべきである。これはｄの減少に対して画像コントラストにおける急速な低下を引き起こすことがあり、小タンパク質の検出が困難になる。ただし、金表面は原子的には平坦ではない。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）は、ｎｍスケールの金のアイランドを明らかとし、それは表面プラズモン波を散乱し、上部の対物レンズによっても収集されるバックグラウンド（Ｅ_ｂ）を生じる。その結果、プラズモン画像は、βをタンパク質によって及び金表面によって散乱された光の間の位相差として、以下の（３）式によって与えられる。

式（３）における干渉項の２｜Ｅ_ｂ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（β）は、ｄ^３又はタンパク質の質量に対応する画像コントラストを生じる。このプラズモンイメージング方法を従来のＳＰＲイメージングから区別するために、それをＰＳＭという。

高いコントラストのＰＳＭ画像を得るために｜Ｅ_ｂ｜^２は式（３）から除去され、それは以下のイメージング処理フローで達成される。高いフレームレートで撮影される原画像から開始して、画像フレームは（例えば、５０ｍｓにわたって）平均化され、画像におけるピクセルノイズ及び他のランダムノイズを除去する。そして、差分画像は各フレームから以前のフレームを減ずること、すなわち、Ｉ（Ｎ）－Ｉ（Ｎ－１）によって得られ、Ｉ（Ｎ）及びＩ（Ｎ－１）はＮ番目及び（Ｎ－１）番目の画像フレームである。減算はバックグラウンド特徴を除去し、タンパク質のＮ番目の画像フレーム上の表面との結合を捕捉する。Ｎ番目のフレーム上の表面上の全てのタンパク質を確認するために、差分画像は１～Ｎ番目まで積分される。光学系の熱的及び機械的ドリフトに伴い、バックグラウンドの効果的な除去を確保するようにドリフト補正機構が導入される。

図２を参照すると、ＰＳＭ画像のデータ処理プロトコル２００は、原画像を撮影するステップ２０２、高いフレームレートで撮影された画像シーケンスを平均化して、画像におけるピクセルノイズ及び他のランダムノイズを除去するステップ２０４、光学系の熱的及び機械的ドリフトを補正するドリフト補正メカニズムを導入するステップ２０６、現在のフレームから以前のフレームを減ずることによって差分画像を得るステップ２０８、ローパス空間フィルタを適用して差分画像シーケンスに対するノイズをさらに最小化するステップ２１０、フィルタリングされた差分画像シーケンスから結合又は解離イベントのない画像フレームを除去するステップ２１２、並びに１番目のフレームからＮ番目のフレームまでの画像シーケンスを積分して画像シーケンスＩ（Ｎ）を生成するステップ２１４を含む。

ＳＰＲに関連するエバネッセント場は、表面から（ｚ方向）溶液内に指数関数的に減衰する。換言すると、有限サイズの物体によるエバネッセント場の散乱は表面からの距離（ｚ）に依存し、以下の（４）式によって与えられる。

Ｅ_０は定数であり、ｚは金表面からの距離であり、Ｄは粒子径であり、ｌはエバネッセント場の減衰長であり、約２００ｎｍである。このｚ距離依存を考慮に入れると、この作業に使用される２６、４４、６５、９９、１４５及び１９４ｎｍのポリスチレンナノ粒子の有効径は、それぞれ、２５．４、４２．４、６１．６、９１．３、１２９．１及び１６６．３ｎｍとなるべきである。この補正の必要性はサイズに対して減少し、補正はタンパク質には重要ではなくなる。

［散乱強度］
波長６７０ｎｍ及び対物レンズの開口数０．４２について、エアリーディスク径は０．６７／０．４２≒１．６０μｍであることが推定され、画像における約１０画素に対応する。粒子又は分子のＰＳＭ強度は、エアリーディスク内の各画素の輝度を積分することによって特定された。

［従来のＳＰＲを用いたＩｇＡ結合測定］
２０ｎＭのＩｇＡ溶液を、抗ＩｇＡ変性表面を有するＢＩ ＳＰＲｍ ２００装置のフローセルに注入し、結合反応速度を試験した。相対的ＳＰＲ強度は、ＳＰＲ角のシフトに比例し、それは金表面上のＩｇＡ分子のサイズ及び数によって、さらには表面近傍の屈折率によって特定される。ＳＰＲデータを一次の反応速度にフィッティングすることによって、会合速度定数（ｋ_ｏｎ）及び解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）はそれぞれ１．５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１及び７．５×１０^－５ｓ^－１となることが分かった。ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆから、平衡定数（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）は、約５００ｐＭになると特定される。

ＰＳＭを、２６ｎｍ～１９４ｎｍで変化する直径のポリスチレンナノ粒子をイメージングすることによって確認した。各直径について、ＰＢＳ緩衝液に溶解されたナノ粒子を金表面上に搭載した溶液ウェルに導入し、ナノ粒子の表面への結合を経時的に記録した。個々のナノ粒子は、輝点として現れる。個々のナノ粒子の画像輝度ヒストグラムは、ガウス分布に従う。小さな第２のピークがあり、それは二量体の形成に起因し得る。ナノ粒子のサイズが増加すると、輝度ヒストグラムによって示されるように、ＰＳＭ画像コントラストが増加する。

対数目盛における平均画像輝度対ナノ粒子径をプロットすることは２つの領域を明らかとし、大きなナノ粒子及び小さなナノ粒子に対応する。大きなナノ粒子領域（直径＞９９ｎｍ）では、画像コントラストはｄ^５．６の乗則に従い、指数は６付近である。これは、ナノ粒子からの光が支配的であり、測定された画像コントラストが式（３）による｜Ｅ_ｓ｜^２に対応するために予想される。しかしながら、小さいナノ粒子領域（＜６５ｎｍ）では、画像コントラストはｄ^３に対応し、それはまた、式（３）における干渉項の２｜Ｅ_ｂ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（β）が支配的であるために予想される。タンパク質は一般的に３０ｎｍよりも小さいので、ｄ^３の３乗則はタンパク質のためのＰＳＭ画像コントラストの正しい説明を与えている。

単一タンパク質のイメージングのためのＰＳＭの能力をヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によって実証した。また、画像を、２６ｎｍポリスチレンナノ粒子のものと比較した。この検討を、表面上の個々のタンパク質分子の結合を記録しながら各タンパク質溶液をセンサ表面上に流すことによって実行した。ＩｇＭの代表的な画像では、各輝点が単一ＩｇＭ分子である。個々のタンパク質結合イベントを５分間にわたって追跡及び計数し、画像輝度ヒストグラムを複数のタンパク質分子から構成した。ヒストグラムをガウス分布にフィッティングすることによって各タンパク質の平均輝度を抽出し、そこからタンパク質の直径を、較正曲線を用いて特定した。ＩｇＭの直径は２１．９±２．２ｎｍであることが分かり、それは動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した流体力学的径２３．７±５．６ｎｍと同等である。より小さなタンパク質（３８５ｋＤａ）であるＩｇＡについて、直径が１５．５±２．１ｎｍとなることが分かり、ＤＬＳによる直径（１４．６±５．１ｎｍ）とも一致した。ＰＳＭとＤＬＳとの間のタンパク質のサイズにおける良好な一致によって、ＰＳＭにおける輝点が単一タンパク質分子であることが確認される。ＩｇＭ及びＩｇＡの画像コントラストを２６ｎｍポリスチレンナノ粒子のものと比較し、それは全て同一較正曲線上にあり、さらにＰＳＭでの単一タンパク質のイメージングを支持する。

ＰＳＭで単一タンパク質を同定するために、センサ表面を抗ＩｇＡでコーティングし、抗ＩｇＡへのＩｇＡの特異的結合を観察した。ＩｇＡに露出すると、抗ＩｇＡへの単一ＩｇＡ分子の結合が即座に起こり、それは表面上で一度に１つずつ現れる輝点として観察された。輝点の数を計数し、ヒストグラムは単一ＩｇＡ分子に起因する主要なピークを示した。コントロール実験として、ＩｇＭを抗ＩｇＡコーティングセンサ表面上に流した。輝点が表面上に現れて留まるＩｇＡの場合とは異なり、輝点（ＩｇＭ分子）は過渡的にのみ表面上に現れ、それはＩｇＭが抗ＩｇＡに特異的に結合しないために予想されることである。

抗体を使用するタンパク質のＰＳＭ同定のためのさらなる例として、カルモジュリン（ＣａＭ）コーティング表面への抗カルモジュリン（抗ＣａＭ、ＭＷ＝１５０ｋＤａ）の結合を、抗ＩｇＡへのＩｇＡの結合と同様の手順を用いて測定した。画像輝度ヒストグラムをＩｇＧのＰＳＭ画像から構成し、ヒストグラムをガウス分布にフィッティングすることによって平均輝度を取得し、そこからＩｇＧの直径は１２．９±２．５ｎｍとなることが分かった。この値は、ＤＬＳによって測定した流体力学的径（１２．０±２．０ｎｍ）と一致する。コントロール実験を、ＩｇＡをＣａＭコーティング表面に導入することによって実行した。ＣａＭへのＩｇＡの結合は観察されず、それにより、ＣａＭへの抗ＣａＭの特異的結合が確認される。

ＳＰＲの有力な適用は、分子結合反応速度を定量化することである。ここで、ＰＳＭは単分子の結合及び解離を計数することによって単分子レベルでの結合反応速度を測定できることを示す。実証として、抗ＩｇＡへのＩｇＡ結合を検討した。まず、様々な濃度のＩｇＡを抗ＩｇＡコーティングセンサ表面上に流して結合プロセスを検討し、そして、ＰＢＳ緩衝液をセンサ表面上に流して抗ＩｇＡからのＩｇＡの解離の検討を可能とした。結合及び解離のプロセスを、リアルタイムで個々のＩｇＡ分子を計数することによって追跡した。結合したＩｇＡの数対時間をプロットすることによって、結合反応速度曲線が生成される。一次の結合反応速度モデルで曲線をフィッティングすることで、会合速度定数（ｋ_ｏｎ）及び解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が決定され、それはそれぞれ２．３×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１及び１．６×１０^－４ｓ^－１となる。ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆから、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）は、６９６ｐＭであると決定される。これらの値は、従来のＳＰＲで得られる結果と良好に一致する。結合及び解離のイベントと関連する平均輝度変化はＩｇＡ分子のサイズと一致し、単分子の検出が確認される。コントロール実験を、抗ＩｇＡコーティング表面に５ｎＭのＩｇＭを導入することによって実行し、明らかな結合は観察されなかった。

反応速度の従来のＳＰＲ測定と比較して、本単分子計数方法には幾つかの明確な利点がある。第１に、ＰＳＭは、従来のＳＰＲによって測定されるＳＰＲ共鳴角のシフトであって、溶液の屈折率に依存するとともに正確な結合反応速度測定のために補正されなければならないＳＰＲ共鳴角のシフトではなく、分子の結合を直接測定する。第２に、本方法はアナログ信号（例えば、共鳴角）ではなくデジタル計数に基づき、それは、従来のＳＰＲにおける共通の問題である熱的又は機械的ドリフトに影響されなくなる。第３に、本ＰＳＭは、独立して分子の数及びサイズを特定する。これに対して、従来のＳＰＲによって測定される共鳴角は両方の量に依存し、独立してそれらを特定することを困難にする。この能力は、サイズの違いに基づいてタンパク質の発現レベルを定量化し、サンプル中の不純物分子の結合を標的タンパク質の結合と区別し得る。最後に、センサ表面上の異なるコンフォメーション、配向及び位置に起因して、単分子イメージング能力はタンパク質の不均質性のモニタリングを可能とする。個々のＩｇＡ分子の結合の３つの異なる挙動が考えられ、ＩｇＡ分子が、１）表面に衝突して留まる場合、２）表面に衝突して数秒留まり、その後表面から離れる場合、並びに３）急速に結合及び解離する場合を含む。様々なタンパク質についての滞留時間を解析することは大きな変動性を明らかとし、それはタンパク質の不均質性を示す。

ＰＳＭの画像コントラストは、物体及び基準物から散乱される光の干渉から生じる。ＳＰＲ及びＰＳＭの双方とも、２０～３０倍の強度増強で、センサ表面近くに局所化される表面プラズモン波の散乱を検出する。これらのラベルフリーのイメージング方法の基本的な検出限界は、カメラによって撮影される有限数の光子からもたらされるショットノイズに起因する。本ＰＳＭ装備では、ノイズはショットノイズによって支配される。積分時間５０ｍｓの間、ショットノイズはＰＳＭの信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）をＩｇＡで約１１に制限し、１０ｎｍ径のタンパク質で約３に制限した（入射光強度２ｋＷ／ｃｍ^２）。Ｓ／Ｎを向上する１つの手段は、入射光強度を増加することである。大きなプラズモン増強があれば、非プラズモン法と比較して弱い入射光又は広い視野のいずれかにより同一のＳ／Ｎが達成可能となる。記載される装備はＰＳＭ及びＳＰＲ測定を同時に実行可能であり、したがって、表面帯電、小分子又はイオン及び生化学反応を含む従来のＳＰＲの能力を保持することが可能となる。

単一タンパク質のＳＰＲイメージングを、プラズモン波の散乱を測定することによって実証した。大きな粒子（＞１００ｎｍ）について、画像コントラストは粒子径の６乗に対応し、それは孤立粒子からの光散乱に対して予想される。ただし、粒子サイズが減少すると、粒子によって及びセンサ表面によって散乱される光の干渉に起因して直径の３乗依存性に遷移する。さらに、それは単一タンパク質がセンサ表面上の対応する抗体へのそれらの特異的結合に基づいてイメージングされ、同定され得ることを示す。最終的に、ＰＳＭは、個々の結合イベントのデジタル計数によって単一タンパク質の結合反応速度の定量化を可能にすることを示した。従来のＳＰＲと比較して、本方法は、デジタル計数に基づく結合反応速度解析に加えて、タンパク質のサイズ及び数の情報を提供する。

［材料］
ポリスチレンナノ粒子をＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＣｏｒｎｉｎｇから購入し、０．２２μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ）で濾過した。ヒト血漿ＩｇＭ及びヒト初乳ＩｇＡをＡｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗カルモジュリン（ＩｇＧ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。カルモジュリン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｎ－エチル－Ｎ’－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｄｉｔｈｉｏｌａｌｋａｎｅａｒｏｍａｔｉｃ ＰＥＧ６－ＣＯＯＨを、Ｓｅｎｓｏｐａｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。他の化学製品は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによるものである。１８．２ＭΩ・ｃｍの低効率のＤＩ水を０．２２μｍのフィルタで濾過し、全ての実験で使用した。

［実験の装備］
中心波長６７０ｎｍの２５ｍＷスーパールミネッセント発光ダイオード（ＳＬＥＤ）（ＳＬＤ－２６０－ＵＨＰ、Ｓｕｐｅｒｌｕｍ）が、光源として使用される。ＳＬＥＤからの光は、レンズ群によって調整され、そして焦点距離４００ｍｍのチューブレンズによって６０倍対物レンズ（ＮＡ＝１．４９）の後方焦点面に合焦される。入射角を手動並進ステージによって調整して表面プラズモン共鳴に到達させた（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）。金コーティングガラススライドから反射される光も、共鳴角を求めることを補助するためにカメラ（Ｐｉｋｅ Ｆ－０３２Ｂ）によって収集される。タンパク質及び金表面からの散乱光が、５０倍対物レンズ（ＮＡ＝０．４２）によって収集されて第２のカメラ（ＭＱ００３ＭＧ－ＣＭ、ＸＩＭＥＡ）によってＰＳＭ画像を形成する。入射光強度及びカメラ露光時間は、各測定について最適化された。

［表面機能化］
熱蒸着により、ＢＫ７ガラスカバースライドを１ｎｍのＣｒでコーティングし、続いて４７ｎｍの金でコーティングすることによって、金コーティングガラススライドを製作した。コーティングの前に、金表面をエタノール及び脱イオン水によって２回リンスし、そして水素炎でアニールして表面の汚染物質を除去した。各ガラススライドの金表面を、１ｍＭのｄｉｔｈｉｏｌａｌｋａｎｅａｒｏｍａｔｉｃ ＰＥＧ６－ＣＯＯＨによる１時間のインキュベーションによってカルボキシル基で変性した。そして、表面を０．０５ＭのＮＨＳ／０．２ＭのＥＤＣ中で３０分間インキュベートしてカルボキシル基を活性化させた。ＰＢＳでのリンス後、２０ｎＭの抗ＩｇＡ又はカルモジュリンを表面に塗布し、３０分間インキュベートして不動化させた。最後に、表面を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中で１０分間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。

［ショットノイズ推定及び入射光強度］
ＩｇＡ分子の平均ＰＳＭ画像輝度は約２２８７光子であり、対応する信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は約１２であり、それは測定されるＳ／Ｎの１１に近い。これは、ショットノイズは最小の検出可能なタンパク質のサイズを特定し、Ｓ／Ｎは入射光強度及び散乱光集光効率の増加によって向上可能であることを示す。

起こり得る発熱の影響を最小化しつつ画像コントラストを最適化するために、入射光強度を粒子の様々なサイズに応じて調整した。低輝度光を通常は大きな粒子をイメージングするのに用い、高輝度光を小さな粒子をイメージングするのに用いた。

［プリズム系プラズモン散乱イメージング］
表面プラズモン波は、図３Ａ及び３Ｂに示すような通常のクレッチマンプリズム構成（システム）３００によって励起される。図３Ａに示すように、表面プラズモン波は、プリズム３０４に結合された金コーティングガラススライド３０２の底部からのｐ－偏波光によって励起される。粒子又はタンパク質によって散乱されたプラズモン波（Ｅ_ｓ）及び金表面によって散乱されたプラズモン波（Ｅ_ｂ）が、上部から収集されてＰＳＭ画像を形成する。対物レンズ３０６及びカメラ３０８がサンプルの上部に配置され、アンサンブルＳＰＲ信号がカメラ３１０を介して底部から記録される。ＰＳＭは、反射光を測定せず、したがって単一非標識化タンパク質をイメージングするために５ｋＷ／ｃｍ^２までの入射光強度を可能とする。ＰＳＭ画像は、Ｅ_ｂ及びＥ_ｓをそれぞれ表面凹凸及び解析対象物によって散乱される光とし、θを位相差として、｜Ｅ_ｂ＋Ｅ_ｓ｜^２＝｜Ｅ_ｂ｜^２＋２｜Ｅ_ｂ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（θ）＋｜Ｅ_ｓ｜^２で与えられる。熱真空蒸着された金膜については、ＰＳＭ画像輝度は、通常、ｄを解析対象物の直径として、１００ｎｍより大きな直径の解析対象物については｜Ｅ_ｓ｜^２～ｄ^６に従って増減し、｜Ｅ_ｂ｜^２＞＞｜Ｅ_ｓ｜^２の条件に起因してより小さな直径の解析対象物については２｜Ｅ_ｂ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（θ）～ｄ^３に従って増減する。タンパク質分子では、通常は直径が３０ｎｍよりも小さいので、３乗則を単一タンパク質についてのＰＳＭ画像輝度の良好な記述としてみなすことができる。

図３Ｂは、システム３００のより詳細な図を示す。レーザー３１２によって与えられる光は、対物レンズ３１４を介してプリズム３０４に、そして浸漬オイル３１６を介してフローセル３２０に伝搬する。フローセル３２０は、金コーティングガラススライド３０２、カバーガラス３２２、入口３２４及び出口３２６を含む。ナノ粒子又は分子３３０を有する流体３２８は、フローセル３２０を流通する。散乱光は、対物レンズ３０６を介してカメラ３０８へ通過する。ナノ粒子又は分子３３０を含むサンプル３３２は、緩衝液３３４に混合され、注入バルブ３３６を介してフローセル３２０に注入され得る。

プリズム系ＳＰＲイメージングシステム３００は金コーティングガラススライド３０２とプリズム３０４の間の距離を維持する必要はなく、したがって、金コーティングガラススライドは浸漬オイルの薄層によってプリズムに結合又は固定可能となる。この機械的に安定な構造は、５０ｍｓまでの平均期間のショットノイズ制限測定だけでなく、金コーティングガラススライドを変化させるだけで焦点及び入射角を再調整することなく様々な実験を行うことを可能とする。さらに、それは、スライド位置を調整するための合焦機構を不要とし、通常は短い有効距離を有する高開口数（ＮＡ）の上部対物レンズのために金コーティングガラススライド上の充分な空間を与える。０．７のＮＡ及び約２ｍｍの有効距離を有する対物レンズが使用される。より高いＮＡは、集光効率を向上し、画像の信号対ノイズ比を高める。

システム３００は、１以上のコントローラ３３８を含み得る。コントローラ３３８は、システム３００の１以上の構成要素（例えば、カメラ３０８、３１０、レーザー３１２）を制御して、システム３００に対する流体フローの出入を制御するとともにシステム３００の１以上の構成要素（例えば、カメラ３０８、３１０）によって収集されたデータ又は画像を処理するように構成され得る。場合によっては、コントローラ３３８は、システム３００内の機械的ドリフトを補正するのに使用され得る。

２５ｍｓにわたる原画像シーケンスを平均化し、｜Ｅ_ｂ｜^２を差分処理によって除去した後、ＰＳＭ画像は、表面に結合された７個の個々の２６ｎｍポリスチレンナノ粒子を示す。ＰＳＭ画像は、少なくとも２つの理由のためにＳＰＲＭ画像よりも高い画像コントラストを示す。第１に、ＰＳＭはより高い入射光強度を可能とし、これは信号対ノイズ比を向上する。２．５ｋＷ／ｃｍ^２の入射強度が達成可能であり、一方で通常のＳＰＲＭは約０．１Ｗ／ｃｍ^２の入射強度を採用する。第２に、平面の表面プラズモン波は、ＰＳＭ画像コントラストに寄与しないので、ＰＳＭ画像における放物線状テールをなくす。ＰＳＭ画像は、個々の２６ｎｍ、４４ｎｍ、６５ｎｍ、９９ｎｍ、１４５ｎｍ及び１９４ｎｍのポリスチレンナノ粒子を示す。

［表面プラズモン波の非局所化特徴の影響］
解析対象物は、通常はＰＳＭ画像のエアリー分布よりも複雑なパターンを生成する。高いＮＡの上部対物レンズによって与えられる高い空間解像度に起因して、プリズム系ＰＳＭは、対物レンズ系ＰＳＭよりも鮮明に画像特徴に表面プラズモン波の非局所化の影響を示す。パターンは主に、表面プラズモン波の散乱の特徴として実証されるように、金膜に対する表面プラズモン波の伝搬長の範囲である数ミクロン以内に、表面プラズモン波の同じ方向に位置する。パターンが表面プラズモン波の伝搬方向に沿って放物線状テールとして厳密に分布されるＳＰＲＭ画像とは異なり、ＰＳＭ画像における異なる位置でのパターンは、空間不均質性を有して伝搬方向に沿って大まかに分布されることを明らかとする。一方、解析対象物により誘発される輝度の変化とランダムな｜Ｅ_ｂ｜^２との間の解析は、それらの間の欠落した相関を明らかとする。これは、高密度ランダムナノメートルスケールの金膜表面凹凸による非局所化散乱表面プラズモン波は、更なる理論的モデル化を要する空間的に不均質な分布を有する同等の不均質な基準場を生成し得る。解析対象物により誘発される信号のほとんどのエネルギーは回折限界スポット内に集中され、かつ周辺パターンはほとんどのタンパク質よりも大きくなっている２６ｎｍの直径の粒子については明確でなくなることを考慮して、ＰＳＭ画像輝度は、現アプリケーションについてエアリーディスク内の全ての画素の輝度を積分することによって決定される。

［ポリスチレンナノ粒子による較正］
ナノ粒子の直径に対するＰＳＭ画像輝度のばらつきについて、散乱から干渉への移行を確認するために、２６ｎｍ～１９４ｎｍで変動する直径（ｄ）のポリスチレンナノ粒子を金コーティングガラススライド上にイメージングした。各サイズについて、ＰＢＳ緩衝液に溶解されたナノ粒子を露出金表面上に流し、結合イベントを経時的に記録した。入射強度を信号対ノイズ比及び発熱の影響の双方を考慮して最適化し、カメラの露光時間を、各測定について飽和を回避しつつ良好な画像コントラストとなるように最適化した。様々な位置での２６、４４、６５、９９、１４５及び１９４ｎｍのポリスチレンナノ粒子の累積結合イベントは、個々の結合ナノ粒子を輝点として明示する。較正バーは、疑似カラー処理の前のグレースケール輝度範囲を表す。これらの混合イベントを追跡してそれらの画像輝度を計算した後、輝度ヒストグラムが構築されてガウス分布にフィッティングされる。ヒストグラムにおける小さな二次ピークは、回折限界よりも短い距離で同時に付近の表面に結合する二量体又は２個の粒子の形成によって生成され得る。図４は平均画像輝度対ナノ粒子径の対数スケールでのプロットを示し、表面プラズモン波は表面から指数関数的に減衰することを考慮して有効ナノ粒子径が採用される。プロットは、２つの領域を明らかとする。より大きなナノ粒子（ｄ＞９９ｎｍ）について、画像輝度は約６乗に対応し、散乱成分｜Ｅ_ｓ｜^２が支配的となることを示す。小さなナノ粒子（ｄ＜６５ｎｍ）について、画像輝度は３乗に対応し、干渉項の２｜Ｅ_ｂ｜｜Ｅ_ｓ｜ｃｏｓ（θ）が支配的となることを示す。通常は３０ｎｍよりも小さい直径の単一タンパク質について、３乗則、すなわち、分子質量則が、ＰＳＭ画像輝度を良好に記述し得る。

［単一タンパク質の検出］
タンパク質分子質量に対するＰＳＭ画像輝度の較正曲線を得るために、分子質量３８５、６６０、９５０及び２３００ｋＤａのヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ヒトサイログロブリン（Ｔｇ）、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）をＰＢＳ緩衝液に溶解し、露出金表面上に流した。タンパク質は、非特異的相互作用によって表面に結合した。各タンパク質についての結合イベントを経時的に記録した。様々な位置での累積的なＩｇＡ、Ｔｇ、ＩｇＭ及びＬＤＬ結合イベントを追跡してそれらの画像輝度を計算した後、輝度ヒストグラムが構築される。それらのヒストグラムをフィッティングするのにガウス分布を採用した。ヒストグラムにおける小さな二次ピークは、回折限界内の隣接位置に結合する二量体又は２個のタンパク質の形成によって生成され得る。分子質量に対して平均画像輝度をプロットすることで、図５における線形の関係が明らかとなり、ＰＳＭ画像輝度はタンパク質分子質量の測定値であることが確認される。

［単分子レベルでの特異的及び非特異的結合の区別］
表面に結合するいずれの分子も信号に寄与するため、従来のＳＰＲセンサの特異性は、非特異的相互作用を防止する標的特異的分子プローブ及び最適化された表面化学作用によって決まる。これに対して、ＰＳＭは、個々の結合イベントの反応速度及び標的分子と非標的分子の間の質量の不一致を解析することによって、特異的及び非特異的に結合された分子を個々の分子レベルにおいてに区別することができる。この能力を実証するために、抗ＩｇＭ抗体コーティング表面へのＩｇＭの特異的結合及びＬＤＬの非特異的結合を検討した。全ての実験を通じて、均一なレセプター表面カバレッジ及び充分な捕捉確率を確保して結合イベントを検出するように、約１００００／μｍ^２の高い抗体カバレッジを用いた。潜在的な非特異的結合部位をブロックするように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を採用した。ＩｇＭ溶液をセンサ表面上に流すと、ほとんどのタンパク質が表面上に残留するとともに結合タンパク質の数は経時的に増加し続ける状態で、抗ＩｇＭへの単一ＩｇＭ分子の結合が即座に発生する。これに対して、ＬＤＬ溶液を抗ＩｇＭ変性面上に流すと、ＬＤＬ分子は、過渡的な結合挙動及び解離挙動を示した。これは、ＩｇＭ分子は表面上で抗ＩｇＭに対して高い親和性を有するが、ＬＤＬ分子はセンサ表面に対しては表面ブロッキングに起因して非常に低い親和性しか有さないためである。個々のＩｇＭタンパク質の特異的結合イベントを計数し、分子質量ヒストグラムを構築すると、それは単一ＩｇＭ分子に起因する主ピークを示した。単分子レベルでの特異的及び非特異的結合プロセスを明らかにするＰＳＭについての更なる例として、抗ＩｇＡ抗体変性面に対するＩｇＡの特異的結合及びＴｇの非特異的結合を測定し、同様にＢＳＡ変性面に対する抗ＢＳＡ抗体（ＩｇＧ、ＭＷ＝１５０ｋＤａ）の特異的結合及びＩｇＡの非特異的結合を測定した。それらはまた、特異的結合が非特異的結合から顕著に区別可能となる、抗ＩｇＭ／ＩｇＭ／ＬＤＬの実験と同じ傾向を示す。ＩｇＧ及びＩｇＡの特異的結合イベントによる分子質量ヒストグラムを構築すると、これも単一ＩｇＡ及びＩｇＧ分子に起因する主ピークを示した。ＰＳＭは、単分子の結合挙動によっては識別できない強い非特異的結合イベントについて、分子質量をバーコードとして用いてそれらを区別することもできる。不純物として１０ｎＭのＩｇＭと混合された５ｎＭのＩｇＡの、抗ＩｇＡコーティング表面に対する結合反応速度のＰＳＭ結果は、より大きな分子質量体による結合イベントが精製サンプルの測定と比較して増加することを示す分子質量ヒストグラムとして観察可能であり、表面に結合されたＩｇＭ分子を示す。分子質量に基づいて特異的及び非特異的結合イベントを定義した後に、それぞれＩｇＡ及びＩｇＭ結合についてのデジタル計数に基づいて会合及び解離曲線がプロットされる。図６は、単分子の結合／解離のデジタル計数によって特定された抗ＩｇＡに対するＩｇＡ結合並びに抗ＩｇＡ及びＢＳＡに対するＩｇＭの非特異的結合の反応速度を示す。挿入図における線６００は、非特異的結合曲線の線形フィッティングを示す。特異的結合曲線は、一次結合反応速度モデルにフィッティング可能である。会合速度定数（ｋ_ｏｎ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）は、それぞれ３．９×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、１．９×１０^－４ｓ^－１及び４８７ｐＭに特定される。これらの値は、アンサンブルＳＰＲによって得られた結果とよく合致する。これに対して、ＩｇＭの非特異的結合曲線は、一次結合反応速度にフィッティング可能ではない。非特異的結合の会合速度は最初に線形であり、その後に減速し、これは非特異的結合部位を飽和させていることになる。一方、解離曲線は急峻な低下の後に非常に平坦な減衰が続くことを示し、非特異的結合が弱い結合部位及び強い結合部位の双方を含むことを示す。

［ウシ胎児血清における単一非標識化タンパク質の特異的結合の測定］
図６は、ＰＳＭが弱い非特異的結合及び強い非特異的結合の双方から標的タンパク質の特異的結合を区別可能であり、複合媒体における結合反応速度を解析することを可能とすることを示す。図７は、ＰＢＳ緩衝液で希釈された１０％ウシ胎児血清における５ｎＭのＩｇＡの、抗ＩｇＡコーティング表面に対する結合反応速度のＰＳＭ結果を示す。弱い非特異的結合イベントは過渡的な結合及び解離の挙動を有することを考慮して、処理された差分フレームを、過渡的な非特異的結合イベントによって生成されたバックグラウンドを除去するように、後続のフレームによってさらに減じた。分子質量ヒストグラムは、血清中では純粋緩衝液中よりも大きな分子量でのより多くの結合イベントがあり、それらは分子質量に基づいて区別可能な強い非特異的結合であることを示す。したがって、これらの非特異的結合イベントを除去した後、特異的結合についての会合及び解離曲線は、ＩｇＡ結合イベントのデジタル計数からプロットされ、図７に示すように一次結合反応速度モデルと良好にフィッティングされる。会合速度定数（ｋ_ｏｎ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）は、それぞれ１．３×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、９．２×１０^－５ｓ^－１及び７２０ｐＭに特定される。これらの値は、ＰＳＭで達成されたものによって得られた結果と合致し、ＰＳＭによる個々の単一非標識化タンパク質のデジタル計数が血清などの複合媒体中の結合反応速度解析に適用可能であることを実証している。これに対して、同時に記録されるアンサンブルＳＰＲ測定は、特異的結合及び非特異的結合の和信号を記録する。

［ＰＳＭはバルク屈折率変化に対して感度を有さない］
デジタル計数ベースの結合反応速度測定の他の有利な効果は、アンサンブルＳＰＲに対してノイズ源となるバルク屈折率変化に対する耐性である。ランニングバッファ及びサンプルバッファは、通常、バッファとサンプルを切り換えることに応じたバルク屈折率変化により誘発される応答曲線シフトを回避するように、アンサンブルＳＰＲの含有量及び濃度について注意深く一致させる必要がある。ＰＳＭがバルク屈折率変化に感度を有さないことを実証するために、上述した血清実験において、サンプルが１０％血清中に調製される一方で、純粋ＰＢＳをランニングバッファとして用いた。図７に示すように、バッファからサンプルへの切換え又はサンプルからバッファへの切換えは、アンサンブルＳＰＲ応答曲線において、大きなバルク屈折率変化により誘発されたシフトをもたらした。一方、バルク屈折率シフトの効果は計数イベントを生じないので、この大きなバルク屈折率変化はＰＳＭ計数から生成される応答曲線に影響しない。

［測定再現性］
プリズム系ＳＰＲデバイスの１つの有利な効果は、システム安定性及び高い再現性である。プリズム系ＰＳＭも、この有利な効果を維持する。サンプル間のばらつきを試験するために、２６ｎｍのポリスチレンナノ粒子溶液を３個の同一のサンプルにアリコートし、これらのサンプルを注入バルブにより金表面上に順次流し、結合イベントを記録し、結合イベントの画像輝度を計算した。結合時間に対する結合イベントの画像輝度分布は、結合頻度が全３測定について一貫していることを明らかとする。３測定における結合イベントの画像輝度によって構築されたヒストグラムは、平均画像輝度も全３測定について一貫していることを示す。これらは、プリズム系ＰＳＭに対する測定はほとんどドリフト効果を有さず、経時的に高い測定一貫性を維持していることを示している。

チップ間の再現性を示すために、ＩｇＡタンパク質を４片の金コーティングガラススライドにおいて測定し、輝度ヒストグラムを、ガウシアンフィッティングによって特定される平均値及び標準偏差値とともに構築する。ＰＳＭ画像輝度は、様々な金コーティングガラススライド間で約３％のばらつきしか有さず、これは対物レンズで構成されるＰＳＭよりも４倍小さい。この改善は、主に、入射角がプリズム系ＰＳＭ装備において共鳴角に容易に固定可能となるが、小さなサイズの画像面及び後方焦点面に起因して対物レンズ系ＰＳＭでは同じ安定性で入射角を維持することがより困難となるためである。

ＰＳＭの画像コントラストは、２０～３０倍の輝度強化で金属膜面付近に局所化されて物体及び基準物から散乱された表面プラズモン波の干渉からもたらされ、これはＳＰＲＭと同様である。一方、ＰＳＭとＳＰＲＭとではメカニズムが異なる。ＳＰＲＭは反射光を収集して平面プラズモン波と解析対象物による散乱表面プラズモン波との間の干渉を検出する一方で、ＰＳＭは金表面凹凸及び解析対象物によって散乱された表面プラズモン波の間の干渉を検出する。ＰＳＭは、高感度イメージングに共通の問題であるカメラ信号収集効率を低下させる強い反射を回避して、単一非標識化タンパク質の検出の高コントラストのイメージングを可能とする。

ナノスケールの物体は、一部の光を常に吸収し、高い場の強度において生物学的サンプルに光傷害をもたらす。光傷害はまた、単分子イメージングの信号ノイズ比を向上する共通の手法であるように、入射光強度を増加させてショットノイズを抑制することによってＰＳＭの検出限界を押し上げる場合に究極の限界となる。３００μｍ^２の視野について、ＰＳＭは通常約６ｋＷ／ｃｍ^２までの入射強度をとることができ、より高い強度が５分以内にタンパク質分子を損傷することになる。この書類において実証した検出限界を向上する代替の手法は、集光対物レンズＮＡを増加させることであり、これは信号対ノイズ比にほぼ線形に関連する。これに起因して、プリズム結合型ＰＳＭは、通常は約１０の信号対ノイズ比を必要とする実用上の検出限界を、対物レンズ結合型ＰＳＭにおけるＩｇＡ（３８５ｋＤａ）からＩｇＧ（１５０ｋＤａ）まで押し下げる。この検出限界によって、ＰＳＭのためのあるアプリケーションは、モノクローナル抗体療法に共通の問題であるタンパク質凝集体の定量化のためのものとなり、これは癌及びＣＯＶＩＤ－１９などの感染性疾患の処置のためにますます重要となっている。

プリズム結合型ＰＳＭは、個々の解析対象物の結合イベントを認識し、アンサンブルプリズム結合型ＳＰＲシステムに対して少なくとも２つの有利な効果を与える。第１に、ＰＳＭは、アナログ信号ではなくデジタル計数に基づいて結合イベントを計数して、ラベルフリーの検出に共通の問題である熱的又は機械的ドリフトに感度を有さないようにする。第２に、ＰＳＭは、個々のイベントの特異的結合及び非特異的結合を単分子の質量又は結合反応速度の差によって区別することができ、これは測定の特異性を高め、サンプル純度及び実験条件の要件を緩和する。これに対して、アンサンブルＳＰＲは、特異的結合及び非特異的結合の双方によって誘発され得る反射強度又は共鳴角の変化並びに溶液屈折率の変化を測定する。この有利な効果によって、ＰＳＭを使用して複合媒体における特異的結合反応速度を解析することが可能となり、これにより、血液及び尿など、複合的背景での体液の使用を必要とするリキッドバイオプシーにおける診断及びバイオマーカーの発見のアプリケーションが可能となる。

プリズム結合型ＰＳＭは、安定的な実験条件のための各構成要素の容易な固定を可能とし、それにより、より良好なチップ間再現性を与える。これにより、各実験において測定結果を標準サンプルに対して正規化する必要がなくなる。この正規化は、対物レンズ系ＰＳＭでは通常必要となるものである。さらに、作業者は、プリズム結合型ＰＳＭに対して様々な実験を行う際に、焦点及び入射角を再調整することなく金コーティングガラススライドを変更するだけでよく、これは操作スキルの要件を大幅に低下させることになる。

ＰＳＭ手法はまた、サンプルの上部に乾燥対物レンズを含めることによって、市販のＳＰＲイメージングシステムの性能を補助することもできる。市販のプリズム結合型ＳＰＲイメージングデバイス（ＳＰＲｍ ２００、バイオセンシングインストゥルメント）では、有効距離３９ｍｍ及びＮＡ０．２３の上部装着型１０倍対物レンズによる１９４ｎｍポリスチレンナノ粒子の高コントラストのイメージング、並びに４０倍でＮＡ０．７５の対物レンズによる１４５ｎｍポリスチレンナノ粒子の高コントラストのイメージングを得ることができる。比較として、高コスト反転光学顕微鏡に基づいて構築されたＳＰＲＭは、通常、タンパク質相互作用解析における約１００ｎｍの金ナノ粒子の安定したイメージングを可能とする。小さな金粒子又は誘電ナノ粒子は、大きな金ナノ粒子よりも大幅に低い発熱の影響を生成して生物学的解析対象物への損傷を減少させ、セルイメージングアプリケーションにおける脂質拡散のモードに対する悪影響が小さいことが指摘されている。

したがって、プリズム結合型ＳＰＲシステムの上部においてプラズモン波の散乱を測定することによる単一非標識化タンパク質のプラズモンイメージングを実証してきた。プリズム結合型ＰＳＭは、単一非標識化タンパク質の質量を測定し、単分子レベルで特異的結合及び非特異的結合を識別することができる。従来のアンサンブルＳＰＲと比較して、プリズム結合型ＰＳＭはアンサンブル平均化信号の代わりに個々の物体の統計的分布を与え、それにより、複合媒体における結合反応速度解析を可能とする。プリズム結合型ＰＳＭは、対物レンズ構成型ＰＳＭと比較して、より簡易な操作及びより良好な測定再現性を与える。

［材料］
ポリスチレンナノ粒子をＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＣｏｒｎｉｎｇから購入し、０．２２μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ）で濾過した。ヒト血漿の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、ヒト血漿のＩｇＭ及びヒト初乳のＩｇＡをＡｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ＩｇＭ、ヒトサイログロブリン（Ｔｇ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。抗ＩｇＡをＢｉｏ－Ｒａｄから購入した。Ｎ－エチル－Ｎ’－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｄｉｔｈｉｏｌａｌｋａｎｅａｒｏｍａｔｉｃ ＰＥＧ６－ＣＯＯＨをＳｅｎｓｏｐａｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。１８．２ＭΩ・ｃｍの低効率のＤＩ水を０．２２μｍのフィルタで濾過し、全ての実験で使用した。

［実験の装備］
中心波長６６０ｎｍの８０ｍＷダイオードレーザー（ＯＢＩＳ６６０－７５ＦＰ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）が、光源として用いられる。レーザーからの光は、焦点距離１９ｍｍの一対のレンズ（ＡＣ１２７－０１９－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）によって調整され、そして焦点距離３００ｍｍのチューブレンズ（ＡＣ５０８－３００－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）によって１００倍対物レンズの後方焦点面に合焦される。その後、対物レンズの作用点に合焦したガウスビームを、レンズ群（２個のＡＣ２５４－０３０－Ａ及び１個のＡＣ２５４－１５０－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を有するプリズム面に投影した。入射角を手動並進ステージ（ＰＴ３、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）によって調整して表面プラズモン共鳴に到達させた。金コーティングガラススライドから反射される光も、共鳴角を求めることを補助するためにカメラ（Ｐｏｉｎｔ Ｇｒｅｙ ＣＭ３－Ｕ３－１３Ｙ３Ｍ－ＣＳ）によって収集される。タンパク質及び金表面からの散乱光が、最終倍率１００倍用の３００ｍｍチューブレンズが装備された上部装着型の６０倍対物レンズ（ＮＡ＝０．７）によって収集されて第２のカメラ（ＭＱ０１３ＭＧ－ＯＮ、ＸＩＭＥＡ）においてＰＳＭ画像を形成する。

［表面機能化］
熱蒸着（ＰＶＤ７５ Ｅ－ｂｅａｍ／Ｔｈｅｒｍａｌ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ、Ｋｕｒｔ Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）により、ＢＫ７カバーガラスを１ｎｍのＣｒでコーティングし、続いて４７ｎｍの金でコーティングすることによって、金コーティングガラススライドを作製した。コーティングの前に、金表面をエタノール及び脱イオン水によって２回リンスし、そして水素炎でアニールして表面汚染物を除去した。各ガラススライドの金表面を、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｌａｌｋａｎｅａｒｏｍａｔｉｃ ＰＥＧ６－ＣＯＯＨによる１時間のインキュベーションによってカルボキシル基で変性した。そして、表面を０．０５ＭのＮＨＳ／０．２ＭのＥＤＣ中で３０分間インキュベートしてカルボキシル基を活性化させた。ＰＢＳでのリンス後、２０ｎＭの抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ又はＢＳＡを表面に塗布し、３０分間インキュベートして不動化させた。最後に、表面を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中で１０分間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。

本開示は多くの特異的な実施形態の詳細を含むが、これらは主題の範囲又は特許請求されるものの範囲に対する限定として解されるべきではなく、特定の実施形態に特異的となり得る特徴の説明として解されるべきである。別個の実施形態の背景において本開示に記載される特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて実施可能でもある。逆に、単一の実施形態の背景で記載した種々の特徴は、別個に又は任意の適切な部分的組合せにおいて複数の実施形態において実施可能でもある。さらに、前述した特徴は、特定の組合せにおいて作用するものとして記載されてもよいし、最初にそのように特許請求されてもよいが、特許請求される組合せからの１以上の特徴は、場合によってはその組合せにより実施されてもよいし、特許請求される組合せは部分的組合せ又は部分的組合せの変形例に向けられ得る。

主題の特定の実施形態を説明した。他の実施形態、変形例、及び記載される実施形態の順列は、当業者には明らかとなるように、以下の特許請求の範囲内にある。動作・操作を特定の順序で図面又は特許請求の範囲に記載するが、これは、そのような動作・操作が、所望の結果を達成するのに、図示する特定の順序で若しくは順次に実行されること又は全ての記載される動作・操作が実行されることを要求するものとして理解されるべきではない（一部の動作・操作は任意選択的なものとみなされ得る）。

したがって、前述した例示の実施形態は、本開示を規定又は限定するものではない。他の変更、置換及び代替も、本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく可能である。

Claims (49)

1. 単分子を検出する方法であって、
   光透過性基板の表面に前記単分子を結合させるステップと、
   光の全反射を達成するように選択された入射角を有する前記光で前記光透過性基板の前記表面を照射し、それにより該表面から及び該表面に結合された前記単分子から光を散乱させるステップと、
   前記表面によって及び該表面に結合された前記単分子によって散乱された光を収集して一連の画像を形成するステップと、
   を備える方法。
2. 前記単分子によって散乱された前記光との充分な干渉のための散乱光を前記表面が生成するように、該表面の粗度が選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記表面の粗度は、１ｎｍと１００ｎｍの間にある、請求項２に記載の方法。
4. 前記一連の画像を処理するステップをさらに備える請求項１に記載の方法。
5. 前記一連の画像を処理するステップが、
   前記一連の画像における画像を平均化するステップと、
   各画像から前の画像を減じて差分画像シーケンスを形成するステップと、
   前記差分画像シーケンスを経時的に積分するステップと、
   を備える、請求項４に記載の方法。
6. 前記表面に結合された単分子の数を経時的に計数し、結合モデルにフィッティングして反応速度定数及び親和性を特定するステップをさらに備える請求項１に記載の方法。
7. 機械的ドリフトを補正するステップをさらに備える請求項１に記載の方法。
8. 機械的ドリフトを補正するステップは、
   前記表面の１以上の特徴を識別するステップと、
   各画像についてドリフト変位を特定するステップと、
   各画像から前記ドリフト変位を減算するステップと、
   を備える、請求項７に記載の方法。
9. 前記光透過性基板は、サンプル溶液中の標的解析対象物の特異的結合が検出及び識別可能となるように、捕捉分子でコーティングされている、請求項１に記載の方法。
10. 前記表面が金属層でコーティングされ、前記入射角が、前記金属層上に表面プラズモン共鳴を生成するように選択される、請求項１に記載の方法。
11. 前記金属層は金である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記光透過性基板は、屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学対物レンズを備える、請求項１に記載の方法。
13. 前記光透過性基板は、屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学プリズムを備える、請求項１に記載の方法。
14. 光透過性固体基板と、
    前記光透過性固体基板の表面上にサンプル溶液を流すための手段と、
    光の全反射を達成するように選択された入射角を有する前記光で前記表面を照射するように構成された光源と、
    カメラと、
    前記表面から反射される光の収集を回避しつつ前記表面によって及び該表面上の標的分子によって散乱された光を収集して前記カメラにおいて一連の画像を形成するように構成された集光光学系と、
    を備えるシステム。
15. 前記標的分子によって散乱された前記光との充分な干渉のための散乱光を前記表面が生成するように、該表面の粗度が選択される、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記表面の粗度は、１ｎｍと１００ｎｍの間にある、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記光透過性基板の前記表面上にサンプル溶液を流すための前記手段が、
    前記光透過性基板の前記表面上に入口及び出口を有する流体チャンバと、
    前記光透過性基板の前記表面上にサンプル溶液及び基準溶液を送出する手段と、
    入射光に関連する前記表面の発熱を最小化するように前記サンプル溶液及び前記基準溶液の流速を調整する手段と、
    を備える、請求項１４に記載のシステム。
18. コントローラをさらに備え、該コントローラが、
    前記一連の画像における画像を平均化し、
    各画像から前の画像を減じて差分画像シーケンスを形成し、
    前記差分画像シーケンスを経時的に積分する
    ように構成された、請求項１４に記載のシステム。
19. 前記集光光学系、入射光及び反射光の反対側から前記表面によって及び該表面上の前記標的分子によって散乱された光を収集するように構成された、請求項１４に記載のシステム。
20. 前記集光光学系が、入射光及び反射光の同じ側において前記表面によって及び該表面上の前記標的分子によって散乱された光を収集するが、前記反射光の収集を回避するように構成された、請求項１４に記載のシステム。
21. 前記表面が、前記標的分子に結合するように構成されたレセプターを備え、前記標的分子の結合及び解離が、前記標的分子を経時的に計数するとともに結合モデルにフィッティングして反応速度定数及び親和性を特定することによって検出される、請求項１４に記載のシステム。
22. コントローラをさらに備え、該コントローラが、機械的ドリフトを補正するように構成された、請求項１４に記載のシステム。
23. 機械的ドリフトを補正することは、
    前記表面の１以上の特徴を識別すること、
    各画像についてドリフト変位を特定すること、及び
    各画像から前記ドリフト変位を減算すること、
    を備える、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記光透過性固体基板は、サンプル溶液中の標的解析対象物の特異的結合が検出及び識別可能となるように、捕捉分子でコーティングされている、請求項１４に記載のシステム。
25. 前記表面が金属層でコーティングされ、前記入射角が、前記金属層上に表面プラズモン共鳴を生成するように選択される、請求項１４に記載のシステム。
26. 前記金属層が金である、請求項２５に記載のシステム。
27. 前記光透過性固体基板は、屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学対物レンズを備える、請求項１４に記載のシステム。
28. 前記光透過性固体基板は、屈折率マッチングオイルによってガラススライドに付着された光学プリズムを備える、請求項１４に記載のシステム。
29. 液体サンプル中の多数の成分をイメージングする方法であって、
    光透過性基板の金属コーティング表面上に前記液体サンプルを流し、それにより前記金属コーティング表面に前記成分を結合させるステップと、
    前記金属コーティング表面における表面プラズモン共鳴を達成するように選択された入射角で光学プリズムを介して光を前記金属コーティング表面に向けるステップと、
    前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された光に対応する領域を備える一連の画像をある時間長にわたって取得するステップと、
    時間の関数として前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光の強度を前記一連の画像から評価するステップと、
    を備える方法。
30. 各成分から散乱された前記光のピーク強度が、前記成分の質量に対して増加する、請求項２９に記載の方法。
31. 各成分が前記金属コーティング表面に結合される時間長を前記一連の画像から評価するステップをさらに備える請求項２９に記載の方法。
32. 各成分が前記金属コーティング表面に結合される前記時間長は、前記成分が前記金属コーティング表面に結合されるメカニズムを表すものである、請求項３１に記載の方法。
33. 多数の前記成分が、多数の標的分子を含む、請求項２９に記載の方法。
34. 前記金属コーティング表面はレセプターを備え、各レセプターが多数の前記標的分子の１つに特異的に結合するように構成された、請求項３３に記載の方法。
35. 前記多数の成分が、多数の非標的分子を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記非標的分子は、前記レセプターに特異的には結合しない、請求項３５に記載の方法。
37. 前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光のピーク強度に基づいて前記非標的分子から前記標的分子を区別するステップをさらに備える請求項３６に記載の方法。
38. 各成分が前記金属コーティング表面に結合される時間長に基づいて前記非標的分子から前記標的分子を区別するステップをさらに備える請求項３６に記載の方法。
39. 各標的分子が前記金属コーティング表面に結合される時間長に基づいて、前記金属コーティング表面に他に結合された標的分子から、前記レセプターに結合された標的分子を区別するステップをさらに備える請求項３４に記載の方法。
40. 予め選択された時間間隔中に前記レセプターに結合する標的分子の数を評価するステップをさらに備える請求項３４に記載の方法。
41. 前記予め選択された時間間隔中に前記レセプターから解離する標的分子の数を評価するステップをさらに備える請求項４０に記載の方法。
42. 前記標的分子と前記レセプターの間の結合反応速度の順序を評価するステップをさらに備える請求項４１に記載の方法。
43. 前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光のピーク強度に基づいて、結合された標的分子の凝集体から、結合された標的分子を区別するステップをさらに備える請求項３４に記載の方法。
44. 標的分子の前記凝集体によって散乱された前記光の前記ピーク強度に基づいて、前記標的分子の凝集体中の標的分子の数を評価するステップをさらに備える請求項４３に記載の方法。
45. 前記標的分子がタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
46. 前記液体サンプルは、緩衝溶液及び少なくとも１０重量％の血清を含む、請求項２９に記載の方法。
47. 前記金属コーティング表面上に前記液体サンプルを流すステップが、前記液体サンプルをキャリア液に混合するステップを備え、前記キャリア液は前記緩衝溶液又は異なる緩衝溶液を含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記金属コーティング表面に結合された各成分によって散乱された前記光が、前記金属コーティング表面の凹凸及び標的分子によって散乱される表面プラズモン波間の干渉に対応する、請求項２９に記載の方法。
49. 前記金属コーティング表面は、金コーティング表面、銀コーティング表面又はアルミニウムコーティング表面である、請求項２９に記載の方法。
    

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