CN115427809A - 单分子成像 - Google Patents

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Abstract

单分子检测包括将单分子结合到光学透明基板的表面，用具有选定的入射角的光照射基板的表面以实现光的全反射，从而散射来自表面和来自结合到表面的单分子的光；并收集由表面和由结合在表面上的单分子散射的光以形成系列图像。用于检测单分子的系统包括光学透明基板，用于使样品溶液流过基板表面的装置，被配置为照射表面的光源，摄像机，和被配置为收集由表面和由表面上的靶分子散射的光以在摄像机上形成系列图像的光学收集系统。

Description

单分子成像
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月12日提交的美国专利申请号62/975,473和2021年1月14日提交的美国专利申请号63/137,611的权益。
政府利益声明
这项发明是在美国国立卫生研究院授予的R01 GM107165政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及基于由表面等离子体共振(SPR)或全内反射(TIF)产生的传感器表面附近的倏逝场的散射用于单分子成像和分析的装置、系统和方法。
背景技术
无标记光学检测技术通常分为两类：远场(光场可以在超过光波长的数倍的空间中传播)和近场(光场不能在空间中传播，并且位于光波长范围内)。虽然表面等离子共振(SPR)显微镜等近场方法已被用于实现高空间分辨率，但单分子的成像一直难以捉摸。常规SPR或全内反射(TIF)检测反射光，产生强烈的背景，淹没来自单分子的微弱信号。此外，它产生几微米大小的衍射图案，降低图像的空间分辨率。
发明内容
本文所述的近场系统和方法与它们的远场对应物相比具有各种优势。首先，倏逝场(近场)强度位于传感器表面附近，使其表面敏感化，从而减少了本体溶液中分子的干扰。其次，传感器表面附近的场有大幅的增强(20-30倍)，这有助于(例如，SPR和TIF的)高灵敏度。此外，SPR和TIF的共振条件取决于传感器表面附近的折射率，因此也可以使用相同的设置测量不散射大量光的小分子或离子的结合。
此外，本文所述的方法可用于通过数字计数方法评估分子结合动力学，该方法消除了测量表面等离子共振角偏移的需要，并提供结合动力学的精确测量。此处公开的数字计数方法可用于同时确定与传感器表面结合的分子的数量和分子的大小。
从孤立物体(例如，分子)散射的光随着物体的尺寸减少而迅速下降。在这里，具有适当表面粗糙度水平的传感器用于产生散射光，该散射光干涉从物体散射的光，从而产生比孤立物体的图像对比度下降得更慢的图像对比度。
散粒噪声是光学成像中的基本限。为了最小化散粒噪声，一种策略是增加入射光强度，这会导致传感器表面上的分子发热。如本文所述，在流体中实施冷却机制以通过调节样品流量来去除热量。
本公开还描述了等离子体散射显微镜(PSM)，这是一种基于棱镜的SPR系统，其用于通过等离子体散射成像检测单个未标记的蛋白质，其允许在单分子水平上测量单个蛋白质质量和研究分子结合过程。与整体SPR相比，基于单分子的测量可通过量化单个结合分析物分子的质量和结合动力学来区分特异性和非特异性结合过程。此外，基于棱镜的SPR成本低且机械稳定。
如本文所述，等离子体散射成像技术可以克服棱镜配置的物理限制，其限制了无标记单分子成像应用的数值孔径和放大率。本文描述了成像设置和检测原理，并通过对不同尺寸的纳米粒子和不同分子质量的蛋白质进行校准来验证检测原理。示出了单蛋白成像以详细揭示特异性和非特异性结合过程。此外，本文所述的系统和方法可以区分具有不同分子量的单个结合蛋白，并且还揭示了特异性和非特异性结合的不同结合行为。这种方法允许在血清等复杂介质中进行无标记结合动力学分析。此外，棱镜耦合的PSM的棱镜配置的刚性机械结构有利于测量重现性，提高系统稳定性，并简化仪器操作。
PSM利用大等离子体增强作为常规的SPR技术，因此与非等离子体方法相比，具有更低入射光功率或更宽视场的高信噪比。PSM还避免了反射光的收集，因此与常规的SPR成像相比，至少具有三个优点：1)提供更暗的背景，从而提高对比度；2)允许使用高入射光强度来提高信噪比；3)消除了SPRM图像中的抛物线尾部，提高了空间分辨率。此外，PSM方案使用放置在样品顶部的物镜来对分析物散射的表面等离子体波进行成像，而不是使用SPRM中的全内反射荧光(TIRF)物镜来创建反射图像。可用棱镜配置而不是TIRF物镜构建单分子成像系统，以获得更稳定的SPR激发，因为棱镜配置不需要精确控制悬浮盖玻片和充满浸油的TIRF物镜之间的距离，因此不受油漂移的影响，油漂移容易受到环境噪声的影响，其对入射光条件和图像聚焦都有很大影响，这是SPRM中的一个常见问题。基于棱镜的PSM提供了用于详细了解生物过程的单个蛋白质成像能力，以及良好的测量重现性，这至少部分归功于棱镜配置的刚性机械结构。
尽管所公开的发明构思包括在所附权利要求中定义的那些，但是应该理解，本发明构思也可以根据以下实施例来定义。
除了所附权利要求的实施例和上述实施例之外，以下编号的实施例也是具有创造性的。
实施例1是一种检测单分子的方法，该方法包括：将单分子结合到光学透明基板的表面；用具有选定的入射角的光照射基板的表面以实现所述光的全反射，从而散射来自所述表面和来自结合到所述表面的单分子的光；并收集由表面和由结合在表面上的单分子散射的光以形成系列图像。
实施例2为实施例1的方法，其中选择所述表面的粗糙度，使得表面产生散射光以充分与由所述单分子散射的光相干涉。
实施例3为实施例2的方法，其中表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
实施例4为实施例1至3中任一项的方法，还包括处理系列图像。
实施例5为实施例4的方法，其中处理系列图像包括：对系列图像中的图像进行平均化；从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和随着时间的推移将差分图像序列积分。
实施例6为实施例1至5中任一项的方法，还包括计数随着时间的推移与所述表面结合的多个单分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力。
实施例7为实施例1至6中任一项的方法，还包括校正机械漂移。
实施例8为实施例7的方法，其中校正机械漂移包括：识别表面的一个或多个特征；确定每个图像的漂移位移；和从每个图像中减去所述漂移位移。
实施例9为实施例1至8中任一项的方法，其中光学透明基板涂覆有捕获分子，从而可检测和识别样品溶液中目标分析物的特异性结合。
实施例10为实施例1至9中任一项的方法，其中所述表面涂覆有金属层，并且选择入射角以在金属层上产生表面等离子体共振。
实施例11为方法实施例10，其中金属层是金。
实施例12为实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。
实施例13为实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。
实施例14为一种系统，其包括：光学透明的固体基板；用于使样品溶液流过基板表面的装置；光源，其被配置为用具有选定的入射角的光照射表面以实现光的全反射；摄像机；光学收集系统，其被配置为收集由表面和由表面上的靶分子散射的光，同时避免收集从表面反射的光，以在摄像机上形成系列图像。
实施例15为实施例14的系统，其中选择表面的粗糙度使得表面产生散射光以充分与由靶分子散射的光相干涉。
实施例16为实施例15的系统，其中表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
实施例17为实施例14至16中任一项的系统，其中用于使样品溶液流过基板表面的装置包括：在所述基板表面上具有入口和出口的流体室；将样品和参考溶液输送到基板表面的装置；以及调节样品和参考溶液流速的装置，以最小化与入射光相关的表面加热。
实施例18为根据实施例14至17中任一项所述的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为：对所述系列图像中的图像进行平均化；从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和随着时间的推移将差分图像序列积分。
实施例19为实施例14至18中任一项的系统，其中光学收集系统被配置为从入射光和反射光的相对侧收集由所述表面和由所述表面上的靶分子散射的光。
实施例20为实施例14至19中任一项所述的系统，其中所述收集光学系统被配置为收集由所述表面和由所述表面上的靶分子在入射光和反射光的同一侧上散射的光，但要避免收集反射光。
实施例21为实施例14至20中任一项所述的系统，其中所述表面包括被配置为与所述靶分子结合的受体，并且通过随时间计数所述靶分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力来检测靶分子的结合和解离。
实施例22为实施例14至21中任一项的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为校正机械漂移。
实施例23为实施例22的系统，其中校正机械漂移包括：识别表面的一个或多个特征；确定每个图像的漂移位移；和从每个图像中减去所述漂移位移。
实施例24为实施例14至23中任一项所述的系统，其中，所述固体基板涂覆有捕获分子，从而可以检测和识别样品溶液中的目标分析物的特异性结合。
实施例25为实施例14至24中任一项的系统，其中所述表面涂覆有金属层，并且选择入射角以在金属层上产生表面等离子体共振。
实施例26为实施例25的系统，其中金属层是金。
实施例27为实施例14至26中任一项所述的系统，其中所述光学透明的固体基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。
实施例28为实施例14至27中任一项所述的系统，其中所述光学透明的固体基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。
实施例29为对液体样品中的多种组分进行成像的方法，所述方法包括：使液体样品流过光学透明基板的金属涂覆表面，从而将所述组分耦合到金属涂覆表面；通过光学棱镜以选定的入射角将光引导到金属涂覆表面，以在金属涂覆表面实现表面等离子体共振；在一段时间内获得系列图像，该系列图像包括与耦合到金属涂覆表面的每种组分散射的光相对应的区域；并且根据所述系列图像，评估由耦合到金属涂覆表面的每种组分散射的光强度作为时间的函数。
实施例30为实施例29的方法，其中从每种组分散射的光的峰值强度随着所述组分的质量增加而增加。
实施例31为实施例29至30中任一项的方法，还包括从系列图像中评估每种组分耦合到所述金属涂覆表面的时间长度。
实施例32为实施例31的方法，其中每种组分耦合到所述金属涂覆表面的时间长度表示所述组分耦合到所述金属涂覆表面的机制。
实施例33为实施例29至32中任一项的方法，其中所述多种组分包括多种靶分子。
实施例34为实施例33的方法，其中所述金属涂覆表面包含受体，并且每个受体被配置为与所述多种靶分子之一特异性结合。
实施例35为实施例34的方法，其中所述多种组分包括多种非靶分子。
实施例36为实施例35的方法，其中非靶分子不与受体特异性结合。
实施例37为实施例36的方法，还包括基于由耦合到金属涂覆表面的每种组分散射的光的峰值强度来区分靶分子和非靶分子。
实施例38为实施例36或37的方法，还包括基于每种组分耦合到金属涂覆表面的时间长度来区分所述靶分子和所述非靶分子。
实施例39为实施例34至38中任一项的方法，还包括基于每种靶分子耦合到金属涂覆表面的时间长度，将结合至受体的靶分子与其他耦合至金属涂覆表面的靶分子区分开来。
实施例40为实施例34至39中任一项的方法，还包括评估在预选时间间隔内与所述受体结合的多个靶分子。
实施例41为实施例40的方法，还包括评估在预选时间间隔内与所述受体解离的多个靶分子。
实施例42为实施例41的方法，还包括评估所述靶分子和所述受体之间的结合动力学的级数。
实施例43为实施例34至42中任一项的方法，还包括基于由耦合到金属涂覆表面的每种组分散射的光的峰值强度区分结合的靶分子和靶分子的结合聚集体。
实施例44为实施例43的方法，还包括基于由靶分子的聚集体散射的光的峰值强度在靶分子的聚集体中的多个靶分子。
实施例45为实施例33至实施例44中任一项的方法，其中靶分子为蛋白质。
实施例46为实施例29至实施例45中任一项的方法，其中液体样品包含缓冲溶液和至少10wt％的血清。
实施例47为实施例46的方法，其中使液体样品流过金属涂覆表面包括将液体样品与载液混合，并且所述载液包括缓冲溶液或不同的缓冲溶液。
实施例48是实施例29至实施例47中任一项的方法，其中由耦合到金属涂覆表面的每种组分散射的光对应于由金属涂覆表面的粗糙度和靶分子散射的表面等离子体波之间的干涉。
实施例49是实施例29至实施例48中任一项的方法，其中所述金属涂覆表面为金涂覆表面、银涂覆表面或铝涂覆表面。
本公开的主题的一个或多个实施例的细节在附图和说明书中阐述。本主题的其他特征、方面和优点将从说明书、附图和权利要求中变得显而易见。
附图说明
图1A和1B描述了可用于检测与传感器表面结合的单分子的基于物镜的等离子体成像系统。
图2示出了图像处理算法中的步骤。
图3A和3B描述了棱镜耦合的等离子体散射显微系统。
图4示出了等离子体散射显微镜图像强度与粒子直径的关系。
图5示出了等离子体散射显微镜图像强度与分子质量的关系。
图6示出了IgA与抗IgA结合，以及IgM与抗IgA、IgM和BSA的非特异性结合的动力学，其通过数字计数单分子的结合/解离确定。
图7示出了通过对单个IgA分子的结合/解离的数字计数确定的IgA与抗IgA结合的动力学，并同时记录整体SPR信号。
具体实施方式
本文描述的系统和方法包括近场光学成像的实施方式，其中近场由表面等离子体共振(SPR)或全内反射(TIF)产生。然而，检测的不是反射光，而是检测来自样品分子和传感器表面的散射光。自由空间中分子散射的光与分子直径的6次方成比例。因此，散射光强度随着分子尺寸的下降而迅速减弱，从而难以对单分子进行成像。为了克服这个问题，使用了具有选定粗糙度的传感器表面，使得传感器表面散射的光的幅度与来自目标单分子的散射光的幅度相当。定义表面粗糙度的方法有很多种，其中一种由下式给出：
Figure BDA0003885086590000081
其中yi为位置i的高度，n为位置的数目。运用这个定义，金表面的表面粗糙度约为1.5nm。
在一些实施方式中，传感器表面的粗糙度在约1nm至约100nm的范围内。从蛋白质和传感器表面散射的光的干涉产生了与分子直径的3次方成比例的图像对比度。其减缓了图像对比度随分子大小的衰减，这有利于小物体(例如，单个蛋白质分子)的成像。
传感器表面的粗糙特征和杂质，以及与非完善光学相关的特征都导致了图像对比度，其可掩盖单分子的微弱成像。如本文所述，将差分-积分成像处理算法用于从时间序列图像的每一帧中减除对上述图像对比度有贡献的背景特征，并将差分图像进行积分，以还原单个蛋白质分子在传感器上的结合及解离。引入漂移或运动校正算法以跟踪传感器表面上一个或多个特征的漂移或运动模式并校正每个图像帧的漂移或运动，从而减少传感器表面、光学器件的位置漂移或环境的机械振动的影响。通过对传感器表面上的单个靶分子进行计数来评估结合动力学。这种数字计数方法可以精确测量结合动力学。此外，这种方法无需直接或间接测量表面等离子体共振角的偏移(其不仅取决于与传感器表面结合的分子数量，还取决于分子的大小)。
基于SPR的单分子分析。实施方式包括用于基于SPR的单分子分析的等离子体成像系统和方法。在某些情况下，等离子体成像系统包括物镜。在某些情况下，等离子体成像系统包括光学棱镜而不是物镜。
图1A为可用于检测与传感器表面结合的单分子的基于物镜的等离子体成像系统100的示意图。表面等离子体波(Ep)被来自镀金载玻片底部的光激发，从顶部收集粒子或蛋白质(Es)以及金表面(Eb)对等离子体波的散射以形成等离子体散射显微镜(PSM)图像。在一个示例中，传感器包括金属(例如，金)涂覆的玻璃基板102。将靶分子106(例如，蛋白质)的溶液104(例如，通过流动池)引入传感表面。传感器表面可用捕获探针108功能化，以用于检测靶分子或粒子(例如，特定的蛋白质)。由顶部摄像机110收集从靶分子或粒子散射的光。可同时从底部摄像机获得常规的表面等离子体共振图像。
在一些实施方式中，用光学棱镜代替图1A中的系统物镜。棱镜具有放置传感器的顶部表面。棱镜还具有用于引入入射光的平坦表面，以及用于从传感器表面反射以离开棱镜的光的第二平坦表面。
图1B为基于物镜的等离子体成像系统100的更详细的视图。用于PSM和SPR同步成像的光学设置，其中调整来自超发光二极管(SLD)111的光，并将其通过60x物镜(NA＝1.49)112引导到镀金载玻片102上，该载玻片通过折射率匹配油安装在物镜上。由摄像机114(Pike F-032B)检测从镀金载玻片102反射的光，该摄像机配备有光衰减器116(ND30A，Thorlabs，Newton，NJ)，以避免过度曝光。将入射光角度调整为表面等离子共振，此时反射光达到最小值。同时，由50x物镜(NA＝0.42)118收集从金表面散射的光，并由放置在金表面顶部的摄像机108(MQ003MG-CM,XIMEA)检测。入射光强度为3kW/cm2或更小。摄像机114测量常规的SPR，摄像机108记录PSM图像。流动池120包括镀金载玻片102、盖玻片122、入口124和出口126。在一个实施例中，镀金载玻片102和盖玻片122之间的距离为约50微米。然而，在其他实施例中该距离可以是不同的。系统100可包括控制器128。控制器128可被配置以控制系统100的一个或多个组件(例如，摄像机108，114、SLD 111)、控制流入和流出系统100的流体流动以及处理系统100的一个或多个组件(例如，摄像机108、114)收集到的数据或图像。在某些情况下，控制器128可用于校正系统100中的机械漂移。
在一个实施例中，通过在BK-7载玻片上蒸发2nm厚的铬，然后蒸发47nm金来制备镀金载玻片。在装入真空室进行铬和金蒸发之前，BK-7载玻片用丙酮和去离子水彻底清洁。通过原子力显微镜(AFM)检查金表面，其显示出大小不一的岛状物。
基于TIF的单分子分析。基于TIF的分子分析系统可类似于基于SPR的单分子分析系统，其传感器表面没有金属涂层。当入射角接近或大于临界角时，从传感器表面发生全反射，称为全内反射(TIF)。在这种情况下，传感器表面出现倏逝场(也称为近场)，它以指数方式衰减至传感器表面顶部的溶液中。与SPR实施方式中一样，该倏逝场被传感器表面上的单个分子散射，而干涉光被单分子和传感器表面散射，产生图像对比度。
入射光引发的加热效应。为了使信噪比最大化，优选高入射光强度，然而，这会导致传感器表面发热并导致光学系统和靶分子结构的不稳定。如本文所述，可通过使用相同的流体流入和流出样品分子以冷却发热来克服该问题。
单个蛋白质直接用SPR成像系统成像，并基于它们的大小和与相应抗体的特异性结合来进行检测和鉴定。通过数字计数和分析单个分子的结合和解离来表现蛋白质结合动力学的量化。
SPR成像系统具有几个独特的特征。首先，倏逝场强度位于距SPR传感器表面(例如镀金载玻片)约100nm的范围内，使其不受本体溶液中分子和杂质的干扰，因此特别适合研究表面结合。其次，传感器表面附近的场有很大的增强(20-30倍)，其为SPR的高灵敏度的原因。最后，SPR的共振条件取决于传感器表面附近的折射率，这样，表面电荷、小分子或离子以及不会强烈散射光的生化反应也可使用相同的设置从同时记录的常规SPR图像中进行测量。
参照图1A所示，通过油浸物镜以适当的角度将光引导到放置在物镜上的镀金载玻片上，从而激发表面等离子体波。在常规的SPR中，将从金表面反射的光收集起来以形成SPR图像，其描述为：
I～|Ep+Es+Er|2 (2)
其中Ep是由入射光激发的等离子体波，Es描述了传感器表面上的蛋白质对等离子体波的散射，Er是从金表面背面的入射波反射。SPR图像对比度由平面等离子体波和球形散射等离子体波之间的干涉决定，其由式2|Ep||Es|cos(θ)给出，其中θ是两个波之间的相位差，其在蛋白质的位置产生一个带有抛物线尾部的点。Es与蛋白质的光学极化率成正比，其与蛋白质的质量或d3成比例，其中d为直径。
式2中的Er在SPR图像中产生了一个大型的背景，其掩盖了单个蛋白质的弱散射波(Es)。为了克服这一困难，除了从底部记录常规的SPR图像外，还使用放置在样品顶部的第二物镜对蛋白质散射的等离子体波进行成像。这避免了强反射的收集，也消除了抛物线尾部，提供了蛋白质的高对比度图像。乍一看，图像对比度应该与|Es|2～d6成比例。这将导致图像对比度随着d的减小而迅速下降，从而使检测小蛋白质变得具有挑战性。然而，金表面并不是原子级的平坦。原子力显微镜(AFM)揭示了纳米尺度的金岛，这些金岛会散射表面等离子体波并产生背景(Eb)，该背景(Eb)也由顶部物镜收集。因此，等离子体图像由下式给出
I～|Eb+Es|2＝|Eb|2+2|Eb||Es|cos(β)+|Es|2 (3)
其中β为由蛋白质和由金表面散射的光之间的相位差。式3中的干涉项2|Ep||Es|cos(θ)产生的图像对比度与d3或蛋白质质量成比例。为了将这种等离子体成像方法与常规的SPR成像区分开来，其被称为PSM。
为了获得高对比度的PSM图像，从式3中移除|Eb|2，其通过以下成像处理流程实现。从以高帧率捕获的原始图像开始，对图像帧进行平均化(例如，超过50毫秒)以去除图像中的像素和其他随机噪声。然后通过从每一帧中减去前一帧或I(N)-I(N-1)来获得差分图像，其中I(N)和I(N-1)为第N和第(N-1)图像帧。该减帧法去除了背景特征并在第N个图像帧上捕获了蛋白质与表面的结合。为了在第N帧查看到表面上的所有蛋白质，将差分图像从1到N积分。由于光学系统的热和机械漂移，引入了漂移校正机制以确保有效去除背景。
参照图2所示，PSM图像的数据处理协议200包括捕获202原始图像，将高帧速率捕获的图像序列平均化204以去除图像中的像素和其他随机噪声，引入206漂移校正机制来校正光学系统的热和机械漂移，通过从当前帧中减去前一帧获得208差分图像，应用210低通空间滤波器以进一步最小化差分图像序列的噪声，从滤波后的差分图像序列中去除212没有结合或解离事件的图像帧，并将第一帧到第N帧的图像序列进行积分214以产生图像序列I(N)。
与SPR相关的倏逝场从表面(z方向)以指数方式衰减至溶液中。换句话说，有限尺寸物体对倏逝场的散射取决于与表面的距离(z)，并且由下式给出：
Figure BDA0003885086590000131
其中E0是常数，z是与金表面的距离，D是粒子的直径，l是倏逝场的衰变长度，约为200nm。考虑到这种z距离依赖性，本研究中使用的26、44、65、99、145和194nm聚苯乙烯纳米粒子的有效直径应分别为25.4、42.4、61.6、91.3、129.1和166.3nm。这种校正的需求随着粒子尺寸下降而减少，并且该校正对于蛋白质来说变得微不足道。
散射强度。对于670nm的波长和0.42的物镜数值孔径，艾里斑直径估计为0.67/0.42～1.60μm，对应于图像中的约10个像素。通过积分艾里斑内每个像素的强度来确定粒子或分子的PSM强度。
使用常规SPR进行IgA结合测量。将20nM IgA溶液注入具有抗IgA修饰表面的BISPRm 200仪器的流动池中，以测试结合动力学。SPR相对强度与SPR角度的偏移成正比，其取决于金表面上IgA分子的大小和数量以及表面附近的折射率。通过将SPR数据进行一级动力学拟合，发现结合(kon)和解离(koff)速率常数分别为1.5×105M-1s-1和7.5×10-5s-1。根据kon和koff，确定平衡常数(KD＝koff/kon)约为500pM。
PSM通过对直径从26nm变化到194nm的聚苯乙烯纳米粒子进行成像来验证。对于每种直径，将溶解在PBS缓冲液中的纳米粒子引入固定于金表面上的溶液孔中，并随时间记录纳米粒子与表面的结合。单个纳米粒子显示为亮点。单个纳米粒子的图像强度直方图遵循高斯分布。有一个小的第二峰，其可能归因于二聚体的形成。如强度直方图所示，PSM图像对比度随纳米粒子尺寸的增加而增加。
以对数标度绘制的平均图像强度与纳米粒子直径的关系图揭示了两种区域，对应于大纳米粒子和小纳米粒子。在大纳米粒子区域(直径>99nm)中，图像对比度遵循d5.6的幂律，其中指数接近6。这是可以预期的，因为来自纳米粒子的光占主导地位，因此根据式3，测量的图像对比度与|Es|2成比例。然而，在小纳米粒子区域(<65nm)中，图像对比度与d3成比例，这也是可以预期的，因为式3中的干涉项2|Eb||Es|cos(β)占主导地位。蛋白质通常小于30nm，因此d3的三次幂定律很好地描述了蛋白质的PSM图像对比度。
用人免疫球蛋白M(IgM)和人免疫球蛋白A(IgA)表现PSM对单个蛋白质成像的能力。这些图像还与26nm聚苯乙烯纳米粒子的图像进行了比较。该研究是通过将每种蛋白质溶液流过传感器表面，同时记录表面上单个蛋白质分子的结合来进行的。在IgM的代表性图像中，每个亮点都是单个IgM分子。在5分钟内跟踪和计数单个蛋白质结合事件，并自多个蛋白质分子构建图像强度直方图。通过用高斯分布拟合直方图，提取每种蛋白质的平均强度，使用校准曲线从中确定蛋白质的直径。发现IgM的直径为21.9±2.2nm，与动态光散射(DLS)测量的流体动力学直径23.7±5.6nm相当。对于较小的蛋白质(385kD)IgA，发现其直径为15.5±2.1nm，也与DLS的直径(14.6±5.1nm)一致。PSM和DLS之间蛋白质尺寸的良好一致性证实了PSM中的亮点是单个蛋白质分子。将IgM和IgA的图像对比度与26nm聚苯乙烯纳米粒子的图像对比度进行了比较，它们都落在相同的校准曲线上，进一步支持了PSM对单个蛋白质的成像。
为了运用PSM鉴定单个蛋白质，传感器表面涂覆有抗IgA，并观察到IgA与抗IgA的特异性结合。暴露于IgA后，单个IgA分子与抗IgA立即发生结合，这被观察为在表面上一次出现一个亮点。对亮点的数量进行计数，直方图示出因单个IgA分子而形成的主峰。作为对照实验，使IgM流过涂覆有抗IgA的传感器表面。与IgA亮点出现并停留在表面上的情况不同，亮点(IgM分子)只是短暂地出现在表面上，这是可以预料的，因为IgM不会与抗IgA特异性结合。
作为使用抗体对蛋白质进行PSM鉴定的另一个示例，使用类似于IgA与抗IgA结合的步骤测量抗钙调蛋白(抗CaM，MW＝150kDa)与钙调蛋白(CaM)涂覆的表面的结合。以IgG的PSM图像构建图像强度直方图，并通过用高斯函数拟合直方图获得平均强度，从中发现IgG的直径为12.9±2.5nm。该值与DLS测量的流体动力学直径(12.0±2.0nm)一致。通过将IgA引入CaM涂覆的表面进行对照实验。未观察到IgA与CaM的结合，其证实了抗CaM与CaM的特异性结合。
SPR的一个有力应用是量化分子结合动力学。其表明，PSM可通过计算单分子的结合和解离来测量单分子水平的结合动力学。作为证明，研究了IgA与抗IgA的结合。首先将不同浓度的IgA流过涂覆有抗IgA的传感器表面以研究结合过程，然后将PBS缓冲液流过传感器表面以研究IgA与抗IgA的解离。通过实时计数单个IgA分子来跟踪结合和解离过程。绘制结合的IgA数量与时间的关系图以生成结合动力学曲线。用一级结合动力学模型拟合曲线确定了结合(kon)和解离(koff)速率常数，分别为2.3×105M-1s-1和1.6×10-4s-l。根据kon和koff，平衡解离常数(KD＝koff/kon)确定为696pM。这些值与使用常规SPR获得的结果非常一致。与结合和解离事件相关的平均强度变化与IgA分子的大小相一致，其证实了单分子的检测。通过将5nM IgM引入抗IgA涂覆表面进行对照实验，未观察到明显的结合。
与常规的动力学SPR测量相比，本发明的单分子计数方法具有几个明显的优点。首先，PSM直接测量分子结合，而不是通过常规SPR测量的SPR共振角的偏移，后者取决于溶液的折射率，必须进行校正才能进行准确的结合动力学测量。其次，本方法基于数字计数，而不是模拟信号(例如，谐振角)，使其不受热或机械漂移的影响，这是常规SPR中的常见问题。第三，目前的PSM单独地确定分子的数量和大小。相比之下，常规SPR测量的共振角取决于这两个量，因此难以单独确定它们。这种功能可量化蛋白质表达水平，并根据尺寸差异区分样品中杂质分子的结合以及靶蛋白的结合。最后，由于传感器表面的构造、方向和位置不同，单分子成像能力可监测蛋白质的异质性。可考虑单个IgA分子结合的三种不同行为，包括IgA分子1)撞击并停留在表面上，2)撞击表面并停留几秒钟，然后离开表面，以及3)快速结合和解离。对不同蛋白质的停留时间分析揭示了很大的变异性，其表明了蛋白质的异质性。
PSM的图像对比度源于被物体和参照物散射的光的干涉。SPR和PSM均检测表面等离子体波的散射，这些散射位于传感器表面附近，强度增强20-30倍。这些无标记成像方法的基本检测限是由摄像机捕获的有限数量的光子产生的散粒噪声引起的。在目前的PSM设置中，噪声主要是散粒噪声。对于50ms的积分时间，对IgA而言，散粒噪声将PSM的信噪比(S/N)限制约为11，对10nm直径的蛋白质来说约为3(入射光强度为2kW/cm2)。提高S/N的一种方法是增加入射光强度。通过大幅度等离子增强，与非等离子方法相比，可通过更弱的入射光或更宽的视场达到相同的S/N。所述的设置可同时进行PSM和SPR的测量，从而允许保留常规SPR的功能，包括表面电荷、小分子或离子以及生化反应。
单个蛋白质的SPR成像是通过测量等离子体波的散射来表现的。对于大粒子(>100nm)，图像对比度与粒子直径的六次方成比例，其对于被孤立粒子的散射的光来说是可预料的。然而，粒子尺寸减小，由于粒子及传感器表面散射的光的干涉，其转变为取决于直径的三次幂。此外，研究表明，单个蛋白质可根据它们与传感器表面上相应抗体的特异性结合进行成像和识别。最后，表明了PSM可通过对单个结合事件的数字计数来量化单个蛋白质结合动力学。与常规的SPR相比，本方法除了提供基于数字计数的结合动力学分析外，还提供蛋白质尺寸大小和数量信息。
材料。聚苯乙烯纳米粒子购自Bangs Laboratories公司。磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Corning公司，并用0.22μm过滤器(Millex牌)过滤。人血浆IgM和人初乳IgA购自AthensResearch and Technology公司。抗钙调蛋白(IgG)购自Invitrogen Calmodulin，牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich。N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)购自Thermo Fisher Scientific。二硫代烷芳烃PEG6-COOH购自Sensopath Technologies公司。其他化学品购自Sigma-Aldrich。用0.22μm过滤器过滤电阻率为18.2MΩ/cm的去离子水并将其用于所有实验。
实验设置。使用中心波长为670nm的25mW超发光二极管(SLED)(SLD-260-UHP,Superlum)作为光源。由透镜组调节来自SLED的光，然后通过焦距为400mm的管状透镜聚焦到60x物镜(NA＝1.49)的后焦平面。通过手动位移台调整入射角以达到表面等离子体共振(Thorlabs，Newton，NJ)。从镀金载玻片反射的光也被摄像机(Pike F-032B)收集，以帮助找到共振角。来自蛋白质和金表面的散射光由50倍物镜(NA＝0.42)收集，以通过第二摄像机(MQ003MG CM,XIMEA)形成PSM图像。每次测量都优化了入射光强度和摄像机曝光时间。
表面功能化。通过在BK7玻璃盖玻片上涂覆1nm Cr，然后通过热蒸发涂覆47nm金来制造镀金载玻片。在镀膜之前，金表面用乙醇和去离子水冲洗两次，然后用氢火焰退火以去除表面污染物。通过在1mM二硫代烷芳烃PEG6-COOH中孵化1小时，用羧基修饰每个载玻片的金表面。然后将该表面在0.05M NHS/0.2M EDC中孵化30分钟以激活羧基。用PBS冲洗后，将20nM抗IgA或钙调蛋白应用于该表面并孵育30分钟以使其固化。最后，将该表面在1mg/mlBSA中孵化10分钟以阻断非特异性结合位点。
散粒噪声预估与入射光强度。IgA分子的平均PSM图像强度约为2287个光子，相应的信噪比(S/N)约为12，其接近于测量的S/N值11。这表明散粒噪声决定了最小可检测蛋白质的尺寸，通过增加入射光强度和散射光收集效率可以提高信噪比。
为了优化图像对比度同时使可能的加热效应最小化，针对不同尺寸的粒子调整了入射光强度。低入射光通常用于大粒子成像，高强度光用于小粒子成像。
基于棱镜的等离子体散射成像
如图3A和图3B所示，由典型的Kretschmann棱镜结构300激发表面等离子波。如图3A所示，表面等离子体波被来自耦合到棱镜304的镀金载玻片302底部的p偏振光激发。从顶部收集由粒子或蛋白质(Es)和由金表面(Eb)散射的等离子体波，以形成PSM图像。物镜306和摄像机308放置在样品顶部，通过摄像机310从底部记录整体的SPR信号。PSM不测量反射光，因此允许高达5kW/cm2的入射光强度用于对未标记的单个蛋白质成像。PSM图像由下式给出：|Eb+Es|2＝|Eb|2+2|Eb||Es|cos(θ)+|Es|2，其中Eb和Es分别为由表面粗糙度和分析物散射的光，θ为相位差。对于热真空蒸发金膜，对于直径大于100nm的分析物，PSM图像强度通常与|Es|2～d6成比例，对于直径较小的分析物，因条件|Eb|2>>|Es|2，PSM图像强度通常与2|Eb||Es|cos(θ)～d3成比例，其中d为分析物直径。蛋白质分子的直径通常小于30nm，因此三次幂定律可很好地描述单个蛋白质的PSM图像强度。
图3B示出了系统300的更详细视图。由激光器312提供的光穿过物镜314到达棱镜304，通过浸油316到达流动池320。流动池320包括镀金载玻片302、盖玻片322、入口324、和出口326。具有纳米粒子或分子330的流体328流过流动池320。散射光穿过物镜306并到达摄像机308。包括纳米粒子或分子330的样品332可与缓冲液334结合并通过注入阀336注入流动池320。
基于棱镜的SPR成像系统300不需要保持镀金载玻片302和棱镜304之间的距离，因此镀金载玻片可通过浸油薄层耦合或固定到棱镜上。这种机械稳定的结构不仅保证平均周期长达50ms的散粒噪声限制测量，而且只需更换镀金载玻片即可进行不同的实验，而无需重新调整焦点和入射角。此外，它消除了用于调整载玻片位置的聚焦机制，并在镀金载玻片上方提供了足够的空间给通常具有短工作距离的高数值孔径(NA)顶部物镜。使用NA为0.7且工作距离约为2mm的物镜。较高的NA提高了光收集效率并增强了图像的信噪比。
系统300可包括一个或多个控制器338。控制器338可以被配置为控制系统300的一个或多个组件(例如，摄像机308、310和激光器312)，以控制流入和流出系统300的流体，以及处理系统300的一个或多个组件(例如，摄像机308、310)收集到的数据或图像。在某些情况下，控制器338可用于校正系统300中的机械漂移。
在将超过25ms原始图像序列平均化，并通过差分处理去除|Eb|2之后，PSM图像示出结合到表面的七个单独的26nm聚苯乙烯纳米粒子。PSM图像示出比SPRM图像更高的图像对比度，其至少由于两个原因。首先，PSM允许更高的入射光强度，其提高了信噪比。可实现2.5kW/cm2的入射强度，而典型的SPRM采用约0.1W/cm2的入射强度。其次，平面表面等离子体波不会引起PSM图像对比度，从而消除了PSM图像中的抛物线尾部。PSM图像显示单独的26nm、44nm、65nm、99nm、145nm和194nm聚苯乙烯纳米粒子。
表面等离子体波的离域特征的影响。与PSM图像中的艾里(Airy)分布相比，分析物通常会创建更复杂的图案。由于高NA顶部物镜提供的高空间分辨率，基于棱镜的PSM比基于物镜的PSM更清楚地示出了表面等离子体波离域对图像特征的影响。这些图案主要位于表面等离子体波同一方向的几个微米以内，其为表面等离子体波对金膜的传播长度范围，表现为表面等离子体波的散射特征。与SPRM图像中图案沿表面等离子体波传播方向严格分布为抛物线尾部不同，PSM图像中不同位置的图案显示它们大致沿传播方向分布，具有空间异质性。然而，对分析物诱导的强度变化和随机|Eb|2之间的分析揭示了它们之间缺失的相关性。其表明，高密度随机纳米级金膜粗糙表面的离域散射表面等离子体波可能会产生具有空间异质分布的可比同质参考场，这需要进一步的理论建模。考虑到分析物诱导信号的大部分能量集中在衍射限制点内，并且对于直径为26nm的粒子(其比大多数蛋白质都大)，周围的图案变得不明显，当前应用通过将艾里斑内的所有像素强度积分以确定PSM图像强度。
用聚苯乙烯纳米粒子校准。为了验证PSM图像强度随纳米粒子直径的变化从散射到干涉的转变，将直径由26nm至194nm的聚苯乙烯纳米粒子在镀金载玻片上成像。对于每一种尺寸，将溶解在PBS缓冲液中的纳米粒子流过裸金表面，并随着时间的推移记录结合事件。考虑到信噪比和加热效应，将入射强度优化，并优化摄像机的曝光时间以获得良好的图像对比度，同时避免每个测量的饱和。26nm、44nm、65nm、99nm、145nm和194nm的聚苯乙烯纳米粒子在不同位置的累计结合事件显示了作为亮点的单个结合纳米粒子。校准条表示伪彩色处理之前的灰度强度范围。在跟踪这些结合事件并计算它们的图像强度之后，构建了强度直方图并将其以高斯分布拟合。直方图中的小二级峰可能是通过二聚体形成或距离小于衍射极限的两个粒子同时结合到附近表面而产生的。图4示出了以对数标度显示的平均图像强度与纳米粒子直径的关系图，其中考虑到表面等离子体波从表面呈指数衰减而采用有效纳米粒子直径。关系图揭示了两种区域。对于大纳米粒子(d>99nm)，图像强度与约6次方成比例，其表明散射成分|Es|2占主导地位。对于小纳米粒子(d<65nm)，图像强度与三次幂成比例，其表明干涉项2|Eb||Es|cos(θ)占主导地位。对于直径通常小于30nm的单个蛋白质，三次幂定律，即分子质量定律，可以很好地描述PSM图像强度。
单个蛋白质的检测。为了获得PSM图像强度对蛋白质分子质量的校准曲线，将分子质量为385、660、950和2300kDa的人免疫球蛋白A(IgA)、人甲状腺球蛋白(Tg)、人免疫球蛋白M(IgM)和低密度脂蛋白(LDL)溶解在PBS缓冲液中并流过裸金表面。蛋白质通过非特异性相互作用与表面结合。随着时间的推移记录每种蛋白质的结合事件。在跟踪不同位置的累计的IgA、Tg、IgM和LDL结合事件并计算其图像强度后，构建了强度直方图。采用高斯分布来拟合这些直方图。直方图中的小二级峰可能是通过二聚体的形成或两种蛋白质同时与衍射极限内的相邻位置结合而产生的。将平均图像强度对分子质量作图揭示了图5中的线性关系，其确认了PSM图像强度是蛋白质分子质量的量度。
在单分子水平上区分特异性和非特异性结合。常规SPR传感器的特异性依赖于目标特异性分子探针和防止非特异性相互作用的优化表面化学，因为任何与表面结合的分子都会产生信号。相反，PSM可通过分析个体结合事件的动力学以及靶分子和非靶分子之间的质量差异，在个体分子水平上区分特异性和非特异性结合的分子。为了表现这种能力，研究了IgM与抗IgM抗体包被表面的特异性结合，以及LDL与抗IgM抗体包被表面的非特异性结合。在所有实验中使用约10000/μm2的高抗体覆盖率，以确保均匀的受体表面覆盖率和足够的捕获概率来检测结合事件。牛血清白蛋白(BSA)用于阻断可能的非特异性结合位点。在将IgM溶液流到传感器表面后，单个IgM分子与抗IgM的结合立即发生，大多数蛋白质保留在表面上，结合蛋白质的数量随着时间的推移不断增加。相反地，当LDL溶液流过抗IgM修饰的表面时，LDL分子表现出短暂的结合和解离行为。这是因为IgM分子对表面的抗IgM具有很高的亲和力，但LDL分子由于表面阻塞而对传感器表面的亲和力非常低。将单个IgM蛋白的特异性结合事件计数，并构建分子质量直方图，其显示单个IgM分子的主峰。作为PSM在单分子水平上揭示特异性和非特异性结合过程的其他示例，测量了IgA与抗IgA抗体修饰表面的特异性结合，和Tg与抗IgA抗体修饰表面的非特异性结合，以及抗BSA抗体(IgG，MW＝150kDa)与BSA修饰表面的特异性结合，和IgA与BSA修饰表面的非特异性结合。它们还显示出与抗IgM/IgM/LDL实验相同的趋势，其中特异性结合可以明显区别于非特异性结合。构建了来自IgG和IgA的特异性结合事件的分子质量直方图，还显示了由于单个IgA和IgG分子导致的主要峰。对于单分子结合行为无法识别的强非特异性结合事件，PSM还可使用分子质量作为条形码来区分它们。可从分子质量直方图观察到与作为杂质的10nM IgM混合的5nM IgA与抗IgA涂覆表面的结合动力学的PSM结果，图中示出了与纯化样品的测量相比，较大分子质量的结合事件显著增加，其表明了一些IgM分子与表面结合。在根据分子质量确定特异性和非特异性结合事件后，分别根据IgA和IgM结合的数字计数绘制结合和解离曲线。图6示出了IgA与抗IgA结合，以及IgM与抗IgA、与BSA的非特异性结合的动力学，其通过单分子的结合/解离的数字计数确定。插图中的线600表示非特异性结合曲线的线性拟合。特异性结合曲线可以用一级结合动力学模型拟合。结合速率常数(kon)、解离(koff)速率常数和平衡解离常数(KD＝koff/kon)分别地确定为3.9×105M-1s-1、1.9×10-4s-1和487pM。这些值与使用整体SPR获得的结果非常吻合。相比之下，IgM的非特异性结合曲线不符合一级结合动力学。非特异性结合的结合速率最初是线性的，然后变慢，这可能是非特异性结合位点的饱和，而解离曲线显示出快速下降，随后非常平坦的衰减，表明非特异性结合包括弱结合位点和强结合位点。
胎牛血清中单个未标记蛋白质的特异性结合的测量。图6示出了PSM可区分靶蛋白的特异性结合和弱非特异性结合以及强非特异性结合，从而可以分析复杂介质中的结合动力学。图7示出了用PBS缓冲液稀释的10％胎牛血清中的5nM IgA与抗IgA包被表面的结合动力学的PSM结果。考虑到弱非特异性结合事件具有瞬时结合和解离行为，处理后的差分帧进一步减去后续帧以去除瞬时非特异性结合事件产生的背景。分子量直方图显示，与纯缓冲液相比，血清中分子量较大的结合事件更多，这些是可根据分子质量进行区分的强非特异性结合。因此，在去除这些非特异性结合事件后，从IgA结合事件的数字计数中绘制出特异性结合的结合和解离曲线，并且与一级结合动力学模型很好地拟合，如图7所示。结合(kon)速率常数和解离(koff)速率常数以及平衡解离常数(KD＝koff/kon)分别地确定为1.3×105M- 1s-1、9.2×10-5s-1和720pM。这些值与使用PSM获得的结果相一致，其表明使用PSM对单个未标记的蛋白质进行数字计数可应用于复杂介质(如血清)中的结合动力学分析。相反地，同时记录的整体SPR测量记录了特异性结合和非特异性结合的总和信号。
PSM对本体折射率的变化不敏感。基于数字计数的结合动力学测量的另一个优点是对本体折射率变化的耐受性，其为整体SPR的噪声源。对整体SPR来说，通常需要仔细匹配运行缓冲液和样品缓冲液的含量和浓度，以避免在缓冲液和样品之间切换时本体折射率变化引起响应曲线偏移。为了证明PSM对本体折射率变化不敏感，在上述血清实验中，使用纯PBS作为运行缓冲液，而样品在10％血清中制备。如图7所示，从缓冲液切换到样品或从样品切换到缓冲液会导致大的本体折射率变化，从而导致整体SPR响应曲线发生偏移。然而，这种大的本体折射率变化不会影响PSM计数产生的响应曲线，因为本体折射率偏移效应不会产生任何计数事件。
测量重现性。基于棱镜的SPR设备的一个优点是系统稳定性和高重现性。基于棱镜的PSM也保持了这一优势。为了测试样品间的差异，将26nm聚苯乙烯纳米粒子溶液等分到三个相同的样品中，然后使用进样阀将这些样品依次流过金表面，记录结合事件，并计算结合事件的图像强度。结合事件对结合时间的图像强度分布表明，结合频率对于所有三个测量值都是一致的。由三个测量中结合事件的图像强度构建的直方图表明，所有三个测量的平均图像强度也是一致的。这些表明基于棱镜的PSM测量几乎没有漂移效应，并且随着时间的推移保持高度的测量一致性。
为了显示芯片到芯片的重现性，在4片镀金载玻片上测量IgA蛋白，并构建强度直方图，以及通过高斯拟合确定的平均值和标准偏差值。PSM图像强度在不同的镀金载玻片之间只有约3％的变化，比物镜配置的PSM小4倍。这种改进主要是因为在基于棱镜的PSM设置中，入射角可以很容易地固定到共振角，但在基于物镜的PSM中，由于图像平面和后焦平面的尺寸较小，很难保持入射角具有相同的稳定性。
PSM的图像对比度是由表面等离子体波的干涉产生的，其位于金属膜表面附近，强度增强20-30倍，由物体和参照物散射，其类似于SPRM。但是，PSM和SPRM之间的机制不同。SPRM收集反射以检测平面表面等离子体波和被分析物散射的表面等离子体波之间的干涉，而PSM检测被金表面粗糙度散射的表面等离子体波和被分析物散射的表面等离子体波之间的干涉。PSM避免了降低摄像机信号收集效率的强反射，这是高灵敏度成像的常见问题，其可对单个未标记蛋白质检测进行高对比度成像。
纳米级物体总是会吸收一些光，从而在高场强下对生物样品造成光损伤。当通过增加入射光强度来抑制散粒噪声(提高单分子成像信噪比的常用方法)以推动PSM检测限时，光损伤也是极限。对于300μm2的视场，PSM通常可将入射强度提高到约6kW/cm2，更高的强度会在5分钟内破坏蛋白质分子。本文展示的提高检测限的另一种方法是增加收集物镜NA，它与信噪比几乎呈线性关系。因此，棱镜耦合的PSM推动了实际检测限，这通常要求信噪比约为10，从物镜耦合PSM中的IgA(385kDa)下降到IgG(150kDa)。有了这个检测限，PSM的一个应用是定量蛋白质的聚集，这是单克隆抗体治疗中的一个常见问题，这对于治疗癌症和传染病(如COVID-19)变得越来越重要。
棱镜耦合的PSM可识别单个分析物的结合事件，与整体棱镜耦合的SPR系统相比，提供至少两个优势。首先，PSM基于数字计数而不是模拟信号对结合事件进行计数，使其对热或机械漂移不敏感，这是无标记检测中的常见问题。其次，PSM可以通过单分子质量或结合动力学的差异来区分单个事件的特异性和非特异性结合，其提高了测量的特异性，放宽了对样品纯度和实验条件的要求。相比之下，整体SPR测量反射强度或共振角的变化，其可由特异性和非特异性结合以及溶液折射率变化引起。这一优势允许使用PSM分析复杂介质中的特异性结合动力学，其允许在需要使用具有复杂背景的体液(例如血液和尿液)的液体活检中的诊断和生物标志物发现中的应用。
棱镜耦合的PSM可轻松固定每个组件以获得稳定的实验条件，从而提供更好的芯片到芯片重现性。这使得无需在每个实验中使用标准样本对测量结果进行归一化，其在基于物镜的PSM中通常是必需的。此外，操作人员只需更换镀金载玻片即可对棱镜耦合的PSM进行不同的实验，无需重新调整焦距和入射角，这将显著降低对操作技能的要求。
PSM方法还可通过在样品顶部安装干物镜来促进商业SPR成像系统的性能。在商业棱镜耦合的SPR成像设备(SPRm 200，Biosensing Instruments)中，可获得顶部安装有10倍物镜、工作距离为39mm、NA为0.23的194nm聚苯乙烯纳米粒子的高对比度成像，以及40倍NA0.75的物镜的145nm聚苯乙烯纳米粒子的高对比度成像。作为比较，基于高成本倒置光学显微镜构建的SPRM通常可在蛋白质相互作用分析中对约100nm金纳米粒子进行稳定成像。有人指出，在细胞成像应用中，小金粒子或介电纳米粒子产生的加热效应明显低于大金纳米粒子，以减少对生物分析物的损害，并且对脂质扩散模式的负面影响更小。
因此，已经证实了通过测量棱镜耦合的SPR系统顶部的等离子体波的散射来对单个未标记蛋白质进行等离子体成像。棱镜耦合的PSM可测量单个未标记蛋白质的质量，并在单分子水平上识别特异性和非特异性结合。与常规的整体SPR相比，棱镜耦合的PSM提供单个对象的统计分布而不是整体平均信号，从而允许在复杂介质中进行结合动力学分析。与配置物镜的PSM相比，棱镜耦合的PSM提供了更简单的操作和更好的测量重现性。
材料。聚苯乙烯纳米粒子购自Bangs Laboratories。磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Corning公司，并用0.22μm过滤器(Millex)过滤。人血浆低密度脂蛋白(LDL)、人血浆IgM和人初乳IgA购自Athens Research and Technology公司。抗IgM、人甲状腺球蛋白(Tg)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich公司。抗IgA购自Bio-Rad公司。N-乙基-N'-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)购自Thermo FisherScientific公司。二硫代烷芳烃PEG6-COOH购自Sensopath Technologies公司。用0.22μm过滤器过滤电阻率为18.2MΩ/cm的去离子水并将其用于所有实验。
实验设置。使用中心波长为660nm的80mW二极管激光器(OBIS660-75FP,Coherent)作为光源。由一对焦距为19mm的透镜(AC127-019-A，Thorlabs)调节来自激光器的光，然后通过焦距为300mm的管状透镜(AC508-300-A，Thorlabs)聚焦到100倍物镜的后焦平面。然后聚焦在物镜工作点上的高斯光束通过透镜组(两个AC254-030-A和一个AC254-150-A，Thorlabs)投射到棱镜表面。通过手动平移台(PT3，Thorlabs，Newton，NJ)调整入射角以达到表面等离子体共振。从镀金载玻片反射的光也被摄像机(Point Grey CM3-U3-13Y3M CS)收集，以帮助找到共振角。来自蛋白质和金表面的散射光由顶部安装的60倍物镜(NA＝0.7)收集，该物镜配备300毫米管状透镜，最终放大100倍，以在第二摄像机(MQ013MG-ON,XIMEA)上形成PSM图像。
表面功能化。通过在BK7盖玻片上涂覆1nm Cr，然后通过热蒸发(PVD75 E-beam/热蒸镀机，Kurt J.Lesker Company)涂覆47nm金来制造镀金载玻片。在镀膜之前，金表面用乙醇和去离子水冲洗两次，然后用氢火焰退火以去除表面污染物。通过于1mM二硫代烷芳烃PEG6-COOH中孵化1小时以用羧基修饰每个载玻片的金表面。然后将该表面在0.05M NHS/0.2MEDC中孵化30分钟以激活羧基。用PBS冲洗后，将20nM抗IgA、抗IgM或BSA应用于表面并孵化30分钟以使其固定。最后，将该表面于1mg/ml BSA中孵化10分钟以阻断非特异性结合位点。
尽管本公开包含许多特定实施例细节，但这些不应被解释为对主题范围或可要求保护的范围的限制，而是对特定实施例可能特有的特征的描述。在单独实施例的上下文中本公开中描述的某些特征也可以在单个实施例中组合实施。相反地，在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以在多个实施例中、单独地或在任何合适的子组合中实施。此外，尽管先前描述的特征可能被描述为在某些组合中起作用并且甚至最初如此要求保护，但在某些情况下，来自要求保护的组合的一个或多个特征可以从组合中删除，并且要求保护的组合可以针对子组合或子组合的变体。
已经描述了本主题的特定实施例。所描述的实施例的其他实施例、改变和排列在所附权利要求的范围内，其对于本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管在附图或权利要求中以特定顺序描述了操作，但这不应理解为要求以所示特定顺序或按顺序执行此类操作，或者执行所有所示操作(某些操作可能被认为是可选的)，以达到理想的效果。
因此，先前描述的示例实施例不限定或限制本公开。在不背离本公开的精神和范围的情况下，其他改变、替换和变更也是可能的。

Claims (49)

1.一种检测单分子的方法，所述方法包括：
将所述单分子结合到光学透明基板的表面；
用具有选定的入射角的光照射所述基板的表面以实现所述光的全反射，从而散射来自所述表面和来自结合到所述表面的所述单分子的光；和
收集由所述表面和由结合到所述表面的所述单分子散射的光以形成系列图像。
2.如权利要求1所述的方法，其中选择所述表面的粗糙度，使得所述表面产生散射光以充分与由所述单分子散射的光相干涉。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
4.如权利要求1所述的方法，其中还包括处理所述系列图像。
5.如权利要求4所述的方法，其中处理所述系列图像包括：
对所述系列图像中的图像进行平均化；
从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和
随着时间的推移对所述差分图像序列进行积分。
6.如权利要求1所述的方法，还包括计数随着时间的推移与所述表面结合的多个单分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力。
7.如权利要求1所述的方法，还包括校正机械漂移。
8.如权利要求7所述的方法，其中校正机械漂移包括：
识别所述表面的一个或多个特征；
确定每个图像的漂移位移；和
从每个图像中减去所述漂移位移。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板涂覆有捕获分子，从而可以检测和识别样品溶液中目标分析物的特异性结合。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述表面涂覆有金属层，并且选择所述入射角以在所述金属层上产生表面等离子体共振。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述金属层为金。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。
14.一种系统，包括：
光学透明的固体基板；
用于使样品溶液流过基板的表面的装置；
光源，其被配置为用具有选定的入射角的光照射所述表面以实现所述光的全反射；
摄像机；和
光学收集系统，其被配置为收集由所述表面和由所述表面上的靶分子散射的光，同时避免收集从所述表面反射的光，以在所述摄像机上形成系列图像。
15.如权利要求14所述的系统，其中选择所述表面的粗糙度，使得所述表面产生散射光以充分与由所述靶分子散射的光相干涉。
16.如权利要求15所述的系统，其中所述表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
17.如权利要求14所述的系统，其中用于使样品溶液流过所述基板的表面的装置包括：
在所述基板表面上具有入口和出口的流体室；
将样品和参考溶液输送到所述基板表面的装置；和
调节所述样品和参考溶液流速的装置，以最小化与入射光相关的表面加热。
18.如权利要求14所述的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为：
对所述系列图像中的图像进行平均化；
从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和
随着时间的推移将所述差分图像序列进行积分。
19.如权利要求14所述的系统，其中所述光学收集系统被配置为从入射光和反射光的相对侧收集由所述表面和由所述表面上的所述靶分子散射的光。
20.如权利要求14所述的系统，其中所述光学收集系统被配置为从入射光和反射光的同一侧收集由所述表面和由所述表面上的所述靶分子散射的光，但避免收集所述反射光。
21.如权利要求14所述的系统，其中所述表面包括被配置为与所述靶分子结合的受体，并且通过随时间计数所述靶分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力来检测所述靶分子的结合和解离。
22.如权利要求14所述的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为校正机械漂移。
23.如权利要求22所述的系统，其中校正机械漂移包括：
识别所述表面的一个或多个特征；
确定每个图像的漂移位移；和
从每个图像中减去所述漂移位移。
24.如权利要求14所述的系统，其中所述固体基板涂覆有捕获分子，从而可以检测和识别样品溶液中目标分析物的特异性结合。
25.如权利要求14所述的系统，其中所述表面涂有金属层，并且选择所述入射角以在所述金属层上产生表面等离子体共振。
26.如权利要求25所述的系统，其中所述金属层为金。
27.如权利要求14所述的系统，其中所述光学透明的固体基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。
28.如权利要求14所述的系统，其中所述光学透明的固体基底包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。
29.一种对液体样品中的多种组分进行成像的方法，所述方法包括：
使所述液体样品流过光学透明基板的金属涂覆表面，从而将所述组分耦合到所述金属涂覆表面；
通过光学棱镜以选定的入射角将光引导到所述金属涂覆表面，以在所述金属涂覆表面实现表面等离子体共振；
在一段时间内获得系列图像，所述系列图像包括与耦合到所述金属涂覆表面的每种组分散射的光相对应的区域；和
根据所述系列图像，评估由耦合到所述金属涂覆表面的每种组分散射的光的强度作为时间的函数。
30.如权利要求29所述的方法，其中从每个组分散射的光的峰值强度随着所述组分的质量增加而增加。
31.如权利要求29所述的方法，还包括根据所述系列图像评估每种组分耦合到所述金属涂覆表面的时间长度。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述每种组分耦合到所述金属涂覆表面的时间长度表示所述组分耦合到所述金属涂覆表面的机制。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述多种组分包括多种靶分子。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述金属涂覆表面包含受体，并且每个受体被配置为与所述多种靶分子之一特异性结合。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述多种组分包括多种非靶分子。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述非靶分子不与所述受体特异性结合。
37.如权利要求36所述的方法，还包括基于由耦合到所述金属涂覆表面的每种组分散射的光的峰值强度来区分所述靶分子和所述非靶分子。
38.如权利要求36所述的方法，还包括基于每种组分耦合到所述金属涂覆表面的时间长度来区分所述靶分子和所述非靶分子。
39.如权利要求34所述的方法，还包括基于每种靶分子耦合到所述金属涂覆表面的时间长度，区分与所述受体结合的靶分子和其他耦合至所述金属涂覆表面的靶分子。
40.如权利要求34所述的方法，还包括评估在预选时间间隔内与所述受体结合的多个靶分子。
41.如权利要求40所述的方法，还包括评估在预选时间间隔内与所述受体解离的多个靶分子。
42.如权利要求41所述的方法，还包括评估所述靶分子和所述受体之间的结合动力学的级数。
43.如权利要求34所述的方法，还包括基于由耦合到所述金属涂覆表面的每种组分散射的光的峰值强度区分结合的靶分子和靶分子的结合聚集体。
44.如权利要求43所述的方法，还包括基于由靶分子的聚集体散射的光的峰值强度在所述靶分子的聚集体中的多个靶分子。
45.如权利要求33所述的方法，其中所述靶分子为蛋白质。
46.如权利要求29所述的方法，其中所述液体样品包含缓冲溶液和至少10wt％的血清。
47.如权利要求46所述的方法，其中使所述液体样品流过所述金属涂覆表面包括将所述液体样品与载液混合，并且所述载液包括所述缓冲溶液或不同的缓冲溶液。
48.如权利要求29所述的方法，其中由耦合到所述金属涂覆表面的所述每种组分散射的光对应于由所述金属涂覆表面的粗糙度和所述靶分子散射的表面等离子体波之间的干涉。
49.如权利要求29所述的方法，其中所述金属涂覆表面为金涂覆表面、银涂覆表面或铝涂覆表面。
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