CN111751372B - 单个生物分子的空间精准定位系统及定位方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物分子定位领域，具体涉及一种单个生物分子的空间精准定位系统及定位方法。本发明采用通过对单个纳米颗粒在传感芯片上的运动过程进行实时动态成像捕获，以此研究传感芯片上单个生物分子的空间位置变化的瞬态信息。所述方法步骤如下：将目标生物分子固定在传感芯片上，单个纳米颗粒表面修饰能够与传感芯片上目标分子发生特异性结合的生物分子，通过生物分子之间的亲和力相互作用，将单个纳米颗粒通过单个生物分子结合对的软链固定在传感芯片表面。实时记录单个纳米颗粒与传感芯片之间修饰的不同生物分子结合对之间运动及转换的原位动态过程，实现精准定位传感芯片表面上修饰的单个生物分子及特异性结合的细节信息。

Description

单个生物分子的空间精准定位系统及定位方法

技术领域

本发明涉及生物分子定位领域，具体涉及一种单个生物分子的空间精准定位系统及定位方法。

背景技术

目前，生命科学的研究已经进入分子层次，从单分子水平上检测生物分子以及研究生物分子之间的相互作用，有助于深入理解生物分子的异质性信息，为更好地揭示生命活动的内在规律和疾病的诊疗提供了重要的理论基础。实现单个生物分子的空间精准定位为实现单个生物分子的传感检测以及研究单个生物分子结合对之间的相互作用提供一种新的研究手段。因此，精准定位单个生物分子的空间位置信息意义重大。

目前，追踪单分子空间信息的主要检测技术有两种：一种是基于荧光标记物的单分子示踪技术，另一种是单分子超分辨成像技术。通过引入荧光标记物，单个生物分子的空间位置信息可以运用宽场接收器从荧光激发成像中提取出来。这些技术提供了解析单分子空间信息的高分辨平台，可以用于研究分子结构，功能，特异性相互作用和细胞内部过。然而，上述技术需要对成百上千条单分子踪迹进行总体平均的分析以克服光学稳定性（猝灭和闪烁等）及荧光强度较弱等缺点。

纳米材料的应用在科学研究中占据举足轻重的地位，为科技进步提供了重要基础，其中纳米颗粒更是在信息传递、能源储备及生物医疗等领域应用广泛。例如，金纳米颗粒由于具有较大的体表比、独特的光学和电磁特性、易于修饰的表面、并且有较好的生物相容性等性质，因此在生物研究和临床检测中应用广泛。利用金纳米颗粒的表面等离激元共振（SPR）成像检测生物分子和研究生物分子相互作用是一个新兴领域，寻求具有原创性的技术原理和系统方法，并将其应用至单个生物分子空间精准定位的研究中，具有重大的科学意义和应用价值。

发明内容

第一方面，本发明提供一种单个生物分子的空间精准定位的系统，该系统包括：

激光发射模块，包括用于产生单色入射激光的激光发射器、用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件、用于放大光路信号的光学显微放大物镜、折射率匹配镜油及用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片；

纳米颗粒图像记录模块，包括用于转换经由光学显微放大物镜的散射光路入射角度的反射镜以及用于获取反射镜反射光成像的图像传感器；

样品反应模块，其包括传感芯片以及用于放置样品溶液的样品池，所属样品池、传感芯片及光学显微放大物镜在自上而下同向设置，p偏振光经由半透半反镜片，以激发SPR的角度入射至光学显微放大物镜和传感芯片，固定在传感芯片上的单个纳米颗粒受激发产生局域等离激元共振效应，其散射信号通过光学显微放大物镜及反射镜的作用后，进入图像传感器，采集图像信号。

在一些实施例中，所述的光路调整组件包括准直透镜、偏振片和聚光透镜，单色入射光经由偏振片转换为p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上。

在一些实施例中，所述的光学显微放大物镜放大倍数为60X，数值孔径为1.49，在光学显微放大物镜和传感芯片之间填充匹配镜油，该折射率匹配镜油的折射率为1.51。

在一些实施例中，所述的图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器，可进行高信噪比及高速图像捕获及记录。

在一些实施例中，所述的传感芯片由基底和磁控溅射形成的金属纳米层组成，基底为BK7盖玻片（尺寸为22 mm*22 mm），金属层为2 nm的铬和47 nm的金膜，铬层介于金膜和盖玻片之间，增强两者的黏附力。

在一些实施例中，所述的PDMS所制样品池固定在传感芯片金膜表面盛放溶液，在传感芯片上形成生物分子结合对，纳米颗粒表面修饰能够与结合对发生特异性相互作用的生物分子，单个纳米颗粒通过表面修饰的分子与生物传感芯片表面上的目标生物分子相结合，从而实现将单个纳米颗粒固定在传感芯片表面且在不同目标分子之间转换的动态过程研究。

第二方面，本发明提供了一种单个生物分子空间精准定位的方法，所述测定方法采用本发明搭建的系统，具体方法包括如下步骤：步骤1）传感芯片表面修饰目标生物分子；步骤2）传感芯片表面修饰单个纳米颗粒；步骤3）采集由生物分子连接在芯片表面的单纳米颗粒等离激元图像，获得单个纳米颗粒动态运动过程和空间中的位置信息。

在一些实施例中，所述的步骤1)具体包括如下步骤：如图3，将所述的传感芯片利用 11-巯基十一烷酸单分子层修饰，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液活化芯片表面修饰的羧基，样品池固定在传感芯片表 面用以盛放反应溶液，加入降钙素原分子(Procalcitonin，PCT)的捕获抗体进行孵育，洗涤 去除过量捕获抗体后，加入牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)分子封闭空余活性位 点，抑制非特异性吸附；如图3，步骤2)中分别加入PCT标准品和生物素化的检测抗体溶 液，形成捕获抗体、降钙素原(PCT)和生物素化的检测抗体生物分子双抗夹心结合对的单 链结构，引入链霉亲和素修饰的金纳米颗粒，通过生物素和链霉亲和素之间的特异性相互作 用，纳米颗粒单个分散地结合到传感芯片表面。

在一些实施例中，通过追踪单个纳米颗粒在传感芯片表面上的运动轨迹，获取单个生物分子在传感芯片上的精确位置信息，精确度可达几个纳米。

在一些实施例中，所述的方法包括如下步骤：从图像序列中识别单个纳米颗粒的等离激元图形，确定单个纳米颗粒的大致位置（空间坐标）；选择第一帧图像作为参考图像，得到参考图像和后续图像之间的二维空间相关性，并确定单个纳米颗粒在二维方向的上光学强度从而通过滤去背景噪音达到纳米颗粒信号增强的效果；对去噪音后的纳米颗粒等离激元图形最亮点位置利用多项式函数拟合光强分布，确定单个纳米颗粒的精确位置。

如图4A所示，我们获得了单个金纳米颗粒通过生物素分子和链霉亲和素分子的相互作用与降钙素原双抗夹心构型结合，连接至传感芯片表面，获得其SPR图像（图4A）。通过扫描电子显微图像（图4B）证明，纳米颗粒在传感芯片表面呈单颗粒均匀分布。以上结果表明，通过生物素和链霉亲和素相互作用，金纳米颗粒能够单个分散地结合到传感芯片表面。

本发明的发明人评估了该系统用于传感芯片表面修饰的单个生物分子空间定位的准确性。将金纳米颗粒置于传感芯片表面，监测其在表面上的瞬态运动，获得单个纳米颗粒在表面上不同结合位点的位置变化信息。如图5，结果表明，在本发明涉及的系统和方法中，能够精准有效地测定纳米颗粒的位置变化，精确度能够达到3 nm。

依据以上实验结果，接着测试了金纳米颗粒在单个分子之间的转换运动（图6）。记录金纳米颗粒在传感芯片表面上的运动，可以精准定位传感芯片上修饰的单个分子空间位置。我们在传感芯片上修饰捕获抗体-降钙素原-检测抗体的双抗夹心构型结合对，利用该装置，我们记录纳米颗粒在传感芯片上的SPR图像序列。如图7所示，从SPR图像中，我们得到传感芯片上单个分子的位置信息。

此结果表明，该系统能够精确快速的测定单个纳米颗粒的运动，从而实现对单个生物分子空间精准定位，同时为研究单个纳米颗粒与生物分子之间相互作用提供一种重要的研究手段。

本发明的发明人发现当传感芯片表面上两个生物分子之间距离足够接近时，单个金纳米颗粒能够在不同分子之间结合运动，进一步地，通过动态监测纳米颗粒在传感芯片上的运动，能够实现同时定位多个单生物分子，测定结果精确可靠，为实现单生物分子的传感检测提供中快速、精准、动态的检测方法。

本发明不仅可以获得单个纳米颗粒在传感芯片表面上位置的微小变化，还能够实现对传感芯片上单个生物分子精确定位。同时，该发明可以拓展至单个生物分子的传感检测和单个生物分子相互作用研究，为更好地揭示生命活动的内在规律和疾病的早期诊疗提供了一种重要的工具。

附图说明

图1是本发明涉及的系统结构示意图；

图2是本发明涉及的方法流程图；

图3是本发明涉及的传感芯片上捕获抗体分步骤表面修饰方法，以及本发明涉及的传感 芯片上单个金纳米颗粒通过单个生物分子结合对的特异性相互作用固定在表面上的方法；

图4A是本发明涉及的传感芯片表面分散的单个纳米颗粒表面等离激元共振图像；

图4B是本发明涉及的传感芯片表面分散的单个纳米颗粒的扫描电子显微镜图像；

图5是本发明涉及的单个纳米颗粒光学空间定位法的精确度分析；

图6是本发明涉及的单个纳米颗粒在传感芯片表面修饰的不同分子之间发生特异性结 合、解离和重新结合的转换过程示意图；

图7是本发明涉及的传感芯片表面修饰的相邻单个生物分子精准空间定位的二维分布结 果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1搭建单个生物分子空间精准定位的系统

如图1，本实施例搭建生物分子定位系统，具体地提供一种单个生物分子空间精准定位系统，该系统包括：激光发射模块、纳米颗粒图像记录模块、样品反应模块；

激光发射模块包括以下五个部分：用于产生单色入射激光的激光发射器11，作为激发单个金属纳米颗粒产生局域等离激元共振的激发光源；用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件12；用于放大光路信号的光学显微放大物镜13，以达到对传感芯片表面的单纳米颗粒进行高倍数放大成像的要求；用于填充在高倍光学显微放大物镜和传感芯片之间的匹配镜油14，其折射率为1.51，与传感基底BK-7盖玻片接近，能够有效实现光路在传感芯片上的全反射，增加光线，提高视野度并获得清晰物象；以及用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片15作为调整优化光路结构，满足入射光成功照射到物镜及传感芯片的要求。

所述的光路调整组件12包括准直透镜121、偏振片122和聚光透镜123，单色入射光经由偏振片转换为p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上；所述的光学显微放大物镜放大倍数为60，数值孔径为1.49。

具体地，在本实施例中，选择波长为680 nm的红色激光为入射光，作为激发纳米颗粒SPR的激发光源，打开激光发生器，强度调节至105 mA，在图像传感器上接收到较强的信号。

纳米颗粒图像记录模块包括用于转换经由光学显微放大物镜的光路入射角度的反射镜21以及用于获取反射镜反射光成像的图像传感器22。

具体地，图像传感器为CMOS图像传感器，其图像记录速度为每秒100帧，记录时间为20秒。

样品反应模块包括传感芯片31、单个纳米颗粒32、生物分子结合对33以及用于放置单个纳米颗粒样品的样品池34，所属样品池、传感芯片及光学显微放大物镜自上而下同向设置，p偏振光经由半透半反镜片，以激发SPR的角度入射至光学显微放大物镜和传感芯片，固定在传感芯片上的单个纳米颗粒受激发产生局域等离激元共振效应，其散射信号通过光学显微放大物镜及反射镜的作用后，进入图像传感器，采集实时动态图像信号。

具体地，样品反应模块中传感芯片由基底和金属层组成，基底为BK7盖玻片，在该基底上镀一层厚度约为2 nm的金属铬，再镀一层厚度约为47 nm的金膜。芯片在使用前用氢火焰灼烧，然后用乙醇和去离子水冲洗干净，并用氮气迅速吹干，备用；用5 mL，1 mM的11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中浸泡修饰过夜，用乙醇冲洗表面，氮气吹干。随后用摩尔比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液活化表面羧基基团20分钟。

利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为样品池，用乙醇和去离子水冲洗干净，且用氮气吹干，置于传感芯片金膜表面，用于放置溶液。

实施例2

下面以降钙素原结合对为例探究本发明中涉及的系统和方法，如图2所示，具体实验方案为：

步骤1）评估该系统用于定位的准确性：在上述搭建的单个生物分子空间精准定位的系统中，向PDMS样品池中加入200 µL磷酸盐缓冲溶液（PBS），传感芯片不进行修饰处理，加入直径为150 nm的金纳米颗粒，金纳米颗粒落至传感芯片表面上，通过CMOS相机记录芯片表面上金纳米颗粒运动的动态SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为20秒。

如图5，将金纳米颗粒置于传感芯片表面上，通过采集传感芯片上纳米颗粒运动过程中的动态SPR图像，监测其在表面上的运动，获得纳米颗粒在表面上的位置信息。结果表明，在本发明涉及的系统和方法中，能够精准有效地测定纳米颗粒的位置变化，精确度在能够达到3 nm。基于以上实验结果，我们可以依据纳米颗粒在传感芯片上的运动测定芯片表面上的单个生物分子的位置。

步骤2）传感芯片表面修饰生物分子（以降钙素原双抗夹心构型为例）：

步骤21）样品的准备：准确称取60 mg牛血清白蛋白固体粉末，准确量取2 mL的PBS溶液，涡轮搅拌30秒，配制成质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，备用；准确量取1 mL 3%的牛血清白蛋白，准确量取2 mL的PBS溶液，配制成1%的牛血清白蛋白溶液，备用；将120 µg捕获抗体用0.5 mL PBS配制240 µg/mL的捕获抗体溶液，作为母液，分装冷藏放置；将3µg生物素化的检测抗体用1mL 1%的牛血清白蛋白溶液配制成3 µg/mL的检测抗体溶液，作为母液，分装冷藏放置；将125 ng的人体降钙素原标准品用0.5 mL 1%的牛血清白蛋白溶液配制成250 ng/mL的降钙素原溶液，作为母液，分装冷藏放置；将2 µL的链霉亲和素修饰的金纳米颗粒（直径为150 nm）与5 mL去离子水混合，涡轮搅拌1分钟，备用。

取2 µL捕获抗体母液和238 µL PBS溶液混合，在涡轮搅拌机搅拌30秒，配制成浓度为2 µg/mL的浓度，备用；将2 µL检测抗体母液和118 µL 1%的牛血清白蛋白溶液混合，在涡轮搅拌器上搅拌30秒，配制成浓度为50 ng/mL的浓度，备用；将10 µL降钙素原母液和190µL 1%的牛血清白蛋白溶液混合，在涡轮搅拌器上搅拌30秒，配制成浓度为250 ng/mL的浓度，备用。

步骤22)传感芯片表面修饰捕获抗体：如图3，芯片在使用前用氢火焰灼烧，然后用乙 醇和去离子水冲洗干净，并用氮气迅速吹干，备用；用5mL，1mM的11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中浸泡修饰过夜，用乙醇冲洗表面，氮气吹干。随后用摩尔比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液活化表面羧基 基团20分钟。利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为样品池，用乙醇和去离子水冲洗干净，且 用氮气吹干，置于传感芯片的金膜表面。将200μL捕获抗体溶液加入至样品池，静置10分 钟。随后，用200μL磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST，0.05％Tween)洗涤样品池三次。加入200μL 3％的牛血清白蛋白溶液，静置10分钟，用200μL的PBST洗涤样品池三次。

步骤23)传感芯片表面修饰纳米颗粒：如图3，加入200μL的降钙素原溶液，静置10分钟后，用200μL的PBST洗涤样品池三次。随后加入200μL的检测抗体溶液，静置10分 钟后，用200μL的PBST溶液洗涤三次。最后，加入200μL的链霉亲和素修饰的金纳米颗粒， 静置5分钟后，用200μL的PBST洗涤样品池三次。

如图4A所示，单个金纳米颗粒通过生物素和链霉亲和素相互作用结合到表面修饰捕获抗体-降钙素原-生物素化检测抗体的传感芯片表面上，我们获得了单个纳米颗粒的SPR图像。通过扫描电子显微镜图像（图4B），纳米颗粒在传感芯片表面呈单颗粒分散分布。以上结果证明，单个纳米颗粒能够通过生物分子之间的相互作用固定在传感芯片表面上。

步骤3）单个生物分子空间精准定位

步骤31）单个纳米颗粒在不同分子之间转换的SPR图像：如图6所示，金纳米颗粒在不同的分子之间运动，通过记录单个纳米颗粒在不同分子之间运动的动态过程，可以同时确定传感芯片上多个生物分子位置。相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为20秒。

步骤32）根据单个金纳米颗粒在不同分子之间转换的动态SPR图像，从图像序列中识别单个纳米颗粒的等离激元图形，确定单个纳米颗粒的大致位置（空间坐标）；选择第一帧图像作为参考图像，得到参考图像和后续图像之间的二维空间相关性，并确定单个纳米颗粒在二维方向的上光学强度从而通过滤去背景噪音达到纳米颗粒信号增强的效果；对去噪音后的纳米颗粒等离激元图形最亮点位置利用多项式函数拟合光强分布，确定单个纳米颗粒的精确位置。

如图7所示，通过测定单个金纳米颗粒的动态SPR图像，得到单个生物分子空间位置信息。利用该系统和方法，我们测定了多组纳米颗粒在不同分子之间转换的动态SPR图像，均能精确实现传感芯片上单个生物分子的空间定位。

此结果表明，该系统能够精确快速的测定单个纳米颗粒的运动，从而实现对单个生物分子空间精准定位，同时为研究单个纳米颗粒与生物分子之间相互作用提供一种重要的研究手段。该发明还可以拓展至不同生物分子特异性结合对的单个生物分子传感检测和单个生物分子动态相互作用研究，为更好地理解生命活动和疾病早期诊疗提供了一种重要的工具。

该方法具有二维方向上的高精确度，可以持续进行高时空分辨的二维空间定位成像研究。对特异性结合过程中的空间位阻效应、单生物分子的结构变化及在不同结合位点的可逆转换提供了更加深入的信息。同时，该方法相较于荧光成像法具有非常稳定地光学强度及成像质量以保证单生物分子二维空间信息的持续追踪。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围。

Claims (9)

1.一种单个生物分子空间精准定位的方法，其特征在于，该方法采用单个生物分子的空间精准定位的系统，该系统包括：

激光发射模块，包括用于产生单色入射激光的激光发射器（11）、用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件（12）、用于放大光路信号的光学显微放大物镜（13）、折射率匹配镜油（14）及用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片（15）；

纳米颗粒图像记录模块，包括用于转换经由光学显微放大物镜的散射光路入射角度的反射镜（21）以及用于获取反射镜反射光成像的图像传感器（22）；

样品反应模块，其包括传感芯片（31）以及用于放置样品溶液的样品池（34），所属样品池（34）、传感芯片（31）及光学显微放大物镜（13）在自上而下同向设置，p偏振光经由半透半反镜片，以激发SPR的角度入射至光学显微放大物镜和传感芯片，固定在传感芯片上的单个纳米颗粒受激发产生局域等离激元共振效应，其散射信号通过光学显微放大物镜及反射镜的作用后，进入图像传感器，采集图像信号；

所述的单个生物分子空间精准定位的方法包括如下步骤：步骤1）传感芯片表面修饰目标生物分子；步骤2）传感芯片表面修饰单个纳米颗粒；步骤3）采集由生物分子连接在传感芯片表面的单纳米颗粒等离激元图像，获得单个纳米颗粒动态运动过程和空间中的位置信息。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光路调整组件包括准直透镜、偏振片和聚光透镜，单色入射光经由偏振片转换为p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光学显微放大物镜放大倍数为60X，数值孔径为1.49，在光学显微放大物镜和传感芯片之间填充折射率匹配镜油，该折射率匹配镜油的折射率为1.51。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的传感芯片由基底和磁控溅射形成的金属纳米层组成，基底为BK7盖玻片，金属层为2 nm的铬和47 nm的金膜，铬层介于金膜和盖玻片之间。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品池固定在传感芯片的金膜表面供溶液盛放，所述的传感芯片形成有目标生物分子，所述的纳米颗粒表面修饰有能够与传感芯片形成的目标生物分子发生特异性相互作用的生物分子。

7.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的步骤1）具体包括如下步骤：将所述的传感芯片利用11-巯基十一烷酸单分子层修饰，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液活化芯片表面修饰的羧基，样品池固定在传感芯片表面用以盛放反应溶液，加入降钙素原分子（Procalcitonin，PCT）的捕获抗体进行孵育，洗涤去除过量捕获抗体后，加入牛血清白蛋白分子封闭空余活性位点，抑制非特异性吸附；

步骤2）中分别加入PCT标准品和生物素化的检测抗体溶液，形成捕获抗体、降钙素原和生物素化的检测抗体生物分子双抗夹心结合对的单链结构，引入链霉亲和素修饰的金纳米颗粒，通过生物素和链霉亲和素之间的特异性相互作用，纳米颗粒单个分散地结合到传感芯片表面。

8.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，通过追踪单个纳米颗粒在传感芯片表面上的运动轨迹，获取单个生物分子在传感芯片上的精确位置信息。

9.如权利要求8所述的的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：从图像序列中识别单个纳米颗粒的等离激元图形，确定单个纳米颗粒的大致位置；选择第一帧图像作为参考图像，得到参考图像和后续图像之间的二维空间相关性，并确定单个纳米颗粒在二维方向的上光学强度从而通过滤去背景噪音达到纳米颗粒信号增强的效果；对去噪音后的纳米颗粒等离激元图形最亮点位置利用多项式函数拟合光强分布，确定单个纳米颗粒的精确位置。

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