JP2023513656A - Ｐｅｇ－脂質 - Google Patents

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Abstract

ＰＥＧ－脂質は、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質を少なくとも１つのカルボニル基を含む硫酸化グリコサミノグリカンと混合してシッフ塩基中間体を形成することにより生産される。還元剤をシッフ塩基中間体に添加して、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成する。硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、血栓炎症に対する生物学的組織に使用できる。硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質での生物学的組織のコーティングは、単一の工程手順において行うことができ、顕著な細胞凝集を引き起こさない。【選択図】図１

Description

本発明は一般に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質、および特に、硫酸化グリコサミノグリカンを含むそのようなＰＥＧ－脂質、ならびにその生産および医療用途に関する。
重篤な副作用は、例えば、ランゲルハンス島、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または肝細胞の細胞移植後に報告されていないが、これらの治療用細胞の生体適合性は、未解決のままである。人体への治療用細胞の注入は、血栓炎症または瞬時の血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）と呼ばれる免疫応答の結果として移植細胞の大きな損失に関連する。血栓炎症、またはＩＢＭＩＲは、補体および凝集系により誘発される自然免疫攻撃であり、急速な血小板の結合および白血球の血餅への浸潤が続き、結果として、移植細胞の早期の喪失をもたらす。加えて、血栓炎症反応は、腎臓移植および心臓移植などの、固形臓器移植における虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）において生じる。この壊滅的な反応は、移植後に組織および臓器を破壊し、これは移植片生存率を低下させる。
そのため、成功する処置ならびに治療用細胞および固形臓器の高レベルの生着を達成するために、この血栓炎症の攻撃から細胞表面を保護することが重要である。
いくつかの研究は、初期の望ましくない反応を防止するために、トロンビン阻害剤、メラガトラン、低分子量デキストラン硫酸、および／または補体阻害剤などの、抗凝固剤の全身投与を介して血栓炎症を調節できることを示している。しかし、これらの技術のいくつかは、関連する出血のリスクの増加のために臨床の場での適用が困難である。
へパラン硫酸は、内皮細胞表面で発現され、凝集ならびに補体活性化および血小板活性化を調節することにおいて重要な役割を果たす。そのため、ヘパリンおよびヘパリン複合体を用いる表面修飾により内皮表面を模倣することは、細胞および臓器移植において生じる血栓炎症を調節するアプローチとして提案されている［１－３］。しかし、ヘパリンおよびヘパリン複合体を用いる表面修飾は、いくつかのプロセス工程；各工程の後に必要とされる洗浄プロセスを伴う細胞表面の化学的修飾およびヘパリンとの反応を必要とする。ヘパリンおよびヘパリン複合体を用いる表面修飾に関連する別の問題は、ヘパリンとの反応後の細胞凝集である。ヘパリン分子はまた、細胞間で架橋し、それにより細胞集塊を引き起こす。
そのため、血栓炎症に対する生物学的組織を保護するために使用でき、かつ従来技術の解決策に関連する短所を有しない、化合物の必要性がある。
一般的な目的は、血栓炎症に対する生物学的組織を保護するのに有用であり、かつ従来技術の解決策に関連する少なくともいくらかの短所を有しない、分子を提供することである。
この目的および他の目的は、本明細書で定義されるような本発明により満たされる。
本発明は、独立請求項において定義される。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項において定義される。
本発明の態様は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を生産する方法に関する。方法は、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質を、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む硫酸化グリコサミノグリカンと混合してシッフ塩基中間体を形成することを含む。方法はまた、還元剤をシッフ塩基中間体に添加して硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成することを含む。
本発明の別の態様は、還元剤により還元されるシッフ塩基中間体を形成するために、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質のアミノ基と、少なくとも１つのカルボニル基を含む少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基の間に形成される結合を介してＰＥＧ－脂質に付着された少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンを含むＰＥＧ－脂質に関する。
本発明のさらなる態様は、生物学的組織の細胞膜に固定された少なくとも１つのそのようなＰＥＧ－脂質およびリポソームの脂質二重層に固定された少なくとも１つのそのようなＰＥＧ－脂質を含むリポソームを含む生物学的組織に関する。
本発明の態様はまた、医薬品としての使用のため、血栓炎症の処置における使用のため、瞬時の血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の処置における使用のため、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の処置における使用のため、脳卒中の処置における使用のためおよび心筋梗塞の処置における使用のための、本発明によるＰＥＧ－脂質を定義する。
本発明の別の態様は、硫酸化グリコサミノグリカンコーティングを有する生物学的組織を提供するインビトロ方法に関する。インビトロ方法は、本発明によるＰＥＧ－脂質をインビトロで生物学的組織に添加して、生物学的組織の細胞膜にＰＥＧ－脂質を固定することを含む。
本発明のさらなる態様は、臓器または臓器の一部を処置するエクスビボ方法を定義する。方法は、本発明によるＰＥＧ－脂質を含む溶液を、臓器または臓器の一部の血管系にエクスビボ注入することを含む。方法はまた、本発明によるＰＥＧ－脂質を含む溶液を血管系でエクスビボインキュベートして、本発明によるＰＥＧ－脂質での血管系の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にすることを含む。
本発明のＰＥＧ－脂質は、細胞およびリポソームのような脂質膜構造を単一の工程手順によりコートするために使用できる。脂質膜構造のそのようなコーティングはさらに、細胞またはリポソームの有意な凝集または集塊を引き起こさない。本発明のＰＥＧ－脂質はそれにより、生物学的組織を血栓炎症に対して保護するために使用できるが、従来技術の解決策に関連する欠点がない。
実施形態は、さらなる目的およびその利点と共に、以下の説明を添付図面と共に参照することにより、最もよく理解され得る。
図１は、ヘパリン共役ＰＥＧ－脂質（ｆＨｅｐ－脂質）の概略図である。ｆＨｅｐ－脂質：ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質。 図２は、ｆＨｅｐ－脂質の合成を概略的に示す。（Ａ）Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質をＣ、Ｋ１Ｃ、Ｋ２Ｃ、Ｋ４Ｃ、またはＫ８Ｃと反応させ、続いて断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）と共役させた。（Ｂ）未分画ヘパリン（ＵＦＨ）を断片化へパリン（ｆＨｅｐ）へと断片化した。（Ｃ）ｆＨｅｐ－ＫｎＣ－脂質（ｎ＝０、１、２、４、８）。 図３は、２６０ｎｍでのｆＨｅｐおよびヘパリンの吸光度（Ｎ＝３）を示す図である。 図４は、（Ａ）ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）による分子量分析（断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）についてはＮ＝９、未分画ヘパリンについてはＮ＝８）および（Ｂ）ｆＨｅｐおよび未分画ヘパリンの抗因子Ｘａ活性（Ｎ＝４）を示す図である。 図５は、ｆＨｅｐ－脂質の（Ａ）サイズおよび（Ｂ）ゼータ電位（Ｎ＝３）を示す図である。 図６は、ｆＨｅｐ－脂質のアンチトロンビン（ＡＴ）結合活性についての散逸モニタリングを用いる水晶振動子微量天秤（ＱＣＭ－Ｄ）に基づく分析を示す。 図７は、ｆＨｅｐ－脂質およびカチオン－ＰＥＧ－脂質へのＡＴの結合量（Ｎ＝３）についての定量分析を示す図である。 図８は、ｆＨｅｐ（－）－脂質のＡＴ結合活性についてのＱＣＭ－Ｄに基づく分析を示す。 図９は、ｆＨｅｐ（－）－脂質へのＡＴおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合量（Ｎ＝３）についての定量分析を示す図である。 図１０は、ｆＨｅｐ（－）－脂質の因子Ｈ結合活性についてのＱＣＭ－Ｄに基づく分析を示す。 図１１は、（Ａ）ｆＨｅｐ（－）－脂質およびＭａｌ－ＰＥＧ－脂質への因子ＨおよびＡＴの結合量（Ｎ＝３）についての定量分析および（Ｂ）ｆＨｅｐ（－）－脂質およびＭａｌ－ＰＥＧ－脂質への固定化された因子Ｈの算出されたモル比（Ｎ＝３）を示す図である。 図１２は、ｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームの抗因子Ｘａ活性（Ｎ＝３）を示す図である。 図１３は、ｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームのサイズ（Ｎ＝３）を示す図である。 図１４は、ｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームの多分散指数（ＰＤＩ）（Ｎ＝３）を示す図である。 図１５は、ｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームのゼータ電位（Ｎ＝３）を示す図である。 図１６は、ｆＨｅｐ（－）－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびｆＨｅｐで処理されたヒト赤血球細胞の表面でのＡＴ（Ａｌｅｘａ４８８標識）の蛍光画像を示す。 図１７は、ｆＨｅｐ（－）－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびｆＨｅｐで処理された赤血球細胞の表面でのＡＴ（Ａｌｅｘａ４８８標識）の結合量についてのフローサイトメトリによる定量分析を示す図である。 図１８は、ｆＨｅｐ－脂質修飾ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の抗因子Ｘａ活性を示す図（＊：ｐ＜０.０５、Ｎ＝３）である。 図１９は、ｆＨｅｐ－脂質によるｈＭＳＣ修飾の血液適合性に対する影響を示す。（Ａ）ｆＨｅｐ－脂質およびＡｌｅｘａ４８８標識ＡＴで処理されたｈＭＳＣの共焦点画像。ここで、ｆＨｅｐ－脂質は、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質である。スケールバー：４０μｍ（Ｂ）フローサイトメトリによる修飾ｈＭＳＣに対するＡＴ結合の定量分析。エラーバーは、標準偏差（Ｎ＝５）を示す。（Ｃ）トリパンブルー色素排除法による修飾ｈＭＳＣの生存率アッセイ。エラーバーは、標準偏差（Ｎ＝５）を示す。（Ｅ）～（Ｇ）ヒト全血における修飾ｈＭＳＣのループモデルアッセイ。修飾ｈＭＳＣを、１.０×１０５細胞／ｍＬでヒト全血中（０.５ＩＵ／ｍＬ ＵＦＨ）、３７℃で２時間インキュベートした。ここで、ｈＭＳＣを、ｆＨｅｐ－ＫｎＣ（－）－脂質（ｎ＝１および８）、およびＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質で修飾した。ＰＢＳ添加全血および非処理ｈＭＳＣを、対照として使用した。図は、（Ｄ）相対血小板数ならびに（Ｅ）ＴＡＴ、（Ｆ）Ｃ３ａ、および（Ｇ）ｓＣ５ｂ－９の生成を示す。エラーバーは、標準偏差（Ｎ＝６）を示す。 図２０は、ヒト全血中の修飾ｈＭＳＣのループモデルアッセイを示す。修飾ｈＭＳＣを、１.０×１０４細胞／ｍＬでヒト全血中（０.５ＩＵ／ｍＬ ＵＦＨ）、３７℃で２時間インキュベートした。ここで、ｈＭＳＣを、ｆＨｅｐ－ＫｎＣ（－）－脂質（ｎ＝１および８）、およびＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質で修飾した。ＰＢＳ添加全血および非処理ｈＭＳＣを、対照として使用した。図は、（Ａ）相対血小板数ならびに（Ｂ）ＴＡＴ、（Ｃ）Ｃ３ａ、および（Ｄ）ｓＣ５ｂ－９の生成を示す。エラーバーは、標準偏差（Ｎ＝６）を示す。
本発明は一般に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質、特に硫酸化グリコサミノグリカンを含むそのようなＰＥＧ－脂質、ならびにその生産および医療用途に関する。
本発明のＰＥＧ－脂質は、内皮表面を模倣するための細胞および臓器移植片の表面修飾において有用であり、それにより、そのような細胞および臓器移植片を血栓炎症に対して保護する。ＰＥＧ－脂質は、ヘパリンおよびヘパリン複合体を使用する従来技術のアプローチと比較していくらかの利点を有する。第１に、本発明のＰＥＧ－脂質を用いる表面修飾は、細胞表面のあらゆる化学的修飾の必要なしに、単一の工程で実行できる。これは、ＰＥＧ－脂質を用いる細胞または臓器移植片の表面修飾プロセスが、細胞に有害な影響を引き起こす可能性がある細胞表面の化学的修飾を含むいくつかのプロセス工程を必要とする従来技術と比較して、さらに容易に実行できることを意味する。第２に、本発明のＰＥＧ－脂質は、細胞に付着される場合、架橋しない。それにより、ＰＥＧ－脂質は、ヘパリンまたはヘパリン複合体との反応後の細胞集塊および凝集を引き起こす、従来技術の短所により損なわれない。
本発明のＰＥＧ－脂質はそのため、血栓炎症に対して細胞および臓器移植片を含む生物学的組織を保護することにおいて有用である。
本発明の一態様は、ＰＥＧ－脂質を生産する方法に関する。その方法は、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質を、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む硫酸化グリコサミノグリカンと混合して、シッフ塩基中間体を形成することを含む。方法はまた、還元剤をシッフ塩基中間体に添加して、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成することも含む。
グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、ヘミアミナールを形成する求核付加と、それに続く脱水によりシッフ塩基中間体を生成することを含むシッフ塩基化学により形成される。この反応における出発物質は、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質である。この少なくとも１つのアミノ基は、硫酸化グリコサミノグリカンの少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基と反応して、還元剤の添加により還元されてＣ－Ｎ結合を通じてＰＥＧ－脂質に付着される硫酸化グリコサミノグリカンを有する硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成する、シッフ塩基中間体（硫酸化グリコサミノグリカンとカチオン－ＰＥＧ－脂質の間のＣ＝Ｎ結合）を形成する。
したがって、硫酸化グリコサミノグリカンは、共有結合、より詳細には、硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基、好ましくはアルデヒド基におけるＣとカチオン－ＰＥＧ－脂質のアミノ基におけるＮの間の共有結合、すなわち、Ｃ－Ｎ結合を通じてカチオン－ＰＥＧ－脂質に付着される。
少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質は、少なくとも１つのアミノ基を含む、ＰＥＧリン脂質を含む、任意のＰＥＧ－脂質であり得る。
ＰＥＧ－脂質は、一般構造式（ＩＩＩ）による対応するＰＥＧ－リン脂質を有する一般構造式（ＩＩ）を有してよく、式中、Ｒ１およびＲ２は、分子の脂質部分を表す。

Figure 2023513656000002
Figure 2023513656000003
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）におけるＹは、一実施形態において、Ｈ、ＣＨ３、マレイミドおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミドからなる群より選択される。
本明細書で使用されるようなＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧと、脂肪酸、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、プレノール、糖脂質（saccharolipid）、およびポリケチドを含む少なくとも１つの脂質との間の任意の複合体を含む。好ましい実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、生体材料の細胞膜などの、脂質層に固定され得るように選択される。現在好ましいＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－リン脂質である。
少なくとも１つのアミノ基は好ましくは、マレイミド共役ＰＥＧ－脂質をシステインペプチドと反応させることにより形成されるカチオン－ＰＥＧ－脂質を形成するために、ＰＥＧ－脂質に導入される。
したがって、一実施形態において、方法は、マレイミド共役ＰＥＧ－脂質を少なくとも１つのシステインペプチドと混合して、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質を形成する追加の工程を含む。一実施形態において、少なくとも１つのシステインペプチドは、少なくとも１つのＫｎＣペプチド、少なくとも１つのＣＫｎペプチドまたはそれらの組み合わせであり得、ここで、Ｃは、システインであり、Ｋは、リジンであり、ｎは、０または２０以下、好ましくは１５以下、より好ましくは１０以下の正の整数、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
ＫｎＣまたはＣＫｎペプチドにおいてｎ＝０である場合、カチオン－ＰＥＧ－脂質は、１つのアミノ基を含むであろう。ＫｎＣまたはＣＫｎペプチドにおける各リジンは、カチオン－ＰＥＧ－脂質に１つのアミノ基を加え、それはそのため、ｎ＋１のアミノ基を含む。
一実施形態において、マレイミド共役ＰＥＧ－脂質は、ジクロロメタン中でα－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－マレイミジルＰＥＧ（ＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ）、トリエチルアミンおよび１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を混合することにより形成される。マレイミド－共役ＰＥＧ－脂質をその後、ジクロロメタン中のＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ、トリエチルアミンおよびＤＰＰＥの混合物にジエチルエーテルを添加することにより、沈澱させる。
硫酸化グリコサミノグリカンは、少なくとも１つのカルボニル基を含む。現在好ましいカルボニル基は、アルデヒド基（－ＣＨＯ）である。しかし、本発明は、それに限定されないが、少なくとも１つのアルデヒド基、少なくとも１つのケトン（－Ｃ（＝Ｏ）－）、少なくとも１つのカルボキシル基（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、少なくとも１つのカルボン酸エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）および／または少なくとも１つのアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ－または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－）を含む硫酸化グリコサミノグリカンも包含する。硫酸化グリコサミノグリカンは、１つのカルボニル基、例えば、１つのアルデヒド基、または複数の、すなわち、少なくとも２つのカルボニル基、例えば、複数のアルデヒド基を含む可能性がある。
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、繰り返しの二糖類単位、すなわち、複数の二糖類単位を含む長い直鎖の多糖類である。ほとんどの場合、繰り返しの単位は、アミノ糖、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミンを、ウロン酸糖、例えば、グルクロン酸またはイズロン酸、またはガラクトースと一緒に含む。一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸からなる群より選択される。
現在の好ましい硫酸化グリコサミノグリカンは、少なくとも１つのカルボニル基を含むヘパリン、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含むヘパリンである。特定の実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカンは、少なくとも１つのカルボニル基を含む断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む断片化ヘパリンである。
そのようなヘパリンの断片化は、カルボニル基、好ましくはアルデヒド基を、ヘパリン分子に導入する。さらに、断片化は、ヘパリン鎖の長さを短くし、それにより未分画ヘパリン（ＵＦＨ）と比較して、分子量を低減する。
一実施形態において、断片化反応は、酸性溶液および亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）水溶液を混合して、混合溶液を形成することを含む。混合溶液のｐＨは、２～最大で６、好ましくは３～最大で５の区間内、より好ましくは４に調節される。好ましくはヘパリンナトリウムの形状のヘパリンが、混合溶液に添加されて、ヘパリン溶液を形成する。ヘパリン溶液のｐＨは、６～８、好ましくは６．５～７．５の区間内、より好ましくは７に調節されて、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む断片化ヘパリンを形成する。断片化反応は任意で、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む断片化ヘパリンを、水に対して透析すること、および少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む断片化ヘパリンを凍結乾燥することを含む。
酸性溶液は好ましくは、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液または酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）溶液から選択され、好ましくは硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液である。
一実施形態において、還元剤を添加することは、シアノ水素化ほう素ナトリウム（sodium cyanoboronhydride）（ＮａＢＨ３ＣＮ）をシッフ塩基中間体に添加して、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成することを含む。したがって、好ましい実施形態において、還元剤は、シアノ水素化ほう素ナトリウム（sodium cyanoboronhydride）である。しかし、実施形態は、それに限定されない。シアノ水素化ほう素ナトリウム（sodium cyanoboronhydride）以外の他の還元剤が、代替で、またはさらに、例えば、トリアセトキシ水素化ほう素ナトリウムおよび水素化ほう素ナトリウムを含み、使用できる。
図２Ａは、ｆＨｅｐ－脂質の合成の一例を概略的に示す。Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質を、Ｃペプチド（ｎ＝０）、Ｋ１Ｃペプチド（ｎ＝１）、Ｋ２Ｃペプチド（ｎ＝２）、Ｋ４Ｃペプチド（ｎ＝４）、またはＫ８Ｃペプチド（ｎ＝８）と反応させ、続いて、アルデヒド基を含むｆＨｅｐで硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質ｆＨｅｐ－ＫｎＣ－脂質と共役させた。図２Ｂは、未分画ヘパリン（ＵＨＦ）の断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）への断片化を示し、図２Ｃは、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質の一実施形態を示す。
図１は、図２Ａ～図２Ｃにしたがって合成され、脂質二重膜に固定された硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質（ｆＨｅｐ－ＫｎＣ－脂質）を概略的に示す。図１はまた、ｆＨｅｐ－ＫｎＣ－脂質あたりのｆＨｅｐ分子の最大数、すなわち、ｎ＋１のｆＨｅｐ分子を示す。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質における任意の未反応のアミノ基を、カルボン酸基に変換する。
カルボン酸基は一般に、アミノ基より反応性が低い。したがって、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質中の未反応のアミノ基をカルボン酸基に変換することは、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質をより低い毒性にし、そのため、細胞への有害性を低くする。加えて、カルボン酸基により導入された負電荷は、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質が固定される表面への非特異的タンパク質結合を阻害する（図９を参照されたい）。
特定の実施形態において、任意のそのような未反応のアミノ基は、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質に酸無水物を添加することによりカルボン酸基に変換されて、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質中の任意の未反応のアミノ基を、カルボン酸基に変換する。
任意の酸無水物が、未反応のアミノ基のカルボン酸基への変換において使用できる。非限定的ではあるが、例示的な例は、無水コハク酸（ＳＡ）、グルタル酸無水物、ジグリコール酸無水物、およびそれらの組み合わせを含み、好ましくはＳＡである。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンを含むＰＥＧ－脂質に関する。
少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンは、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質のアミノ基と、少なくとも１つのカルボニル基を含む少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基との間に形成される結合を介してＰＥＧ－脂質に付着されて、還元剤により還元されるシッフ塩基中間体を形成する。
したがって、本発明により、硫酸化グリコサミノグリカンは、共有結合、特に、硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基、好ましくはアルデヒド基のＣと、カチオン－ＰＥＧ－脂質のアミノ基のＮとの間の共有結合を通じてＰＥＧ－脂質に付着される。炭素と窒素の間のこの共有結合は、Ｃ－Ｎ結合である。
一実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンおよびＰＥＧ－脂質を相互接続するＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結を含む。この実施形態において、Ｃは、システインであり、Ｋは、リジンであり、ｎは、０または２０以下の正の整数である。一実施形態において、ｎは、０～１５の区間内、好ましくは０～１０の区間内、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０で選択される。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカンは、ＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結における任意のリジン残基のアミノ基またはＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結におけるＮ末端アミンと、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基、好ましくはアルデヒド基との間に形成される結合を介してＰＥＧ－脂質に付着される。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質のＰＥＧ－脂質部分は、式（Ｉ）を有する。

Figure 2023513656000004
式（Ｉ）において、ｐ、ｑは、１０～最大で１６の区間内で独立して選択される整数であり、好ましくはｐ、ｑは、独立して、１０、１２、１４または１６であり、より好ましくはｐ＝ｑ＝１４である。ｍは、ＰＥＧ鎖が、１ｋＤａ～最大で４０ｋＤａ、好ましくは３ｋＤａ～最大で１０ｋＤａの範囲内で選択される、より好ましくは５ｋＤａの平均分子量を有するように選択される。硫酸化グリコサミノグリカン分子はその後、Ｎ末端アミンまたはリジン残基（複数を含む）のアミノ基で式（Ｉ）によるＰＥＧ－脂質に付着され得る。
本明細書で定義されるような平均分子量は、個々のＰＥＧ鎖がこの平均分子量と異なる分子量を有する可能性があるが、平均分子量が、ＰＥＧ鎖の中央分子量を表すことを示唆する。これはさらに、ＰＥＧ鎖についてのこの平均分子量の周囲で分子量の自然分布があることを意味する。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカンは、断片化ヘパリンである。
一実施形態において、断片化ヘパリンは、２．５ｋＤａ～１５ｋＤａの区間内、好ましくは４ｋＤａ～１０ｋＤａの区間内、例えば、５ｋＤａ～１０ｋＤａの区間内、より好ましくは５ｋＤａ～８ｋＤａの区間内、または７ｋＤａ～９ｋＤａの区間内で選択される重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、未反応または遊離のアミノ基を含まない。特定の実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質における全ての未反応または遊離のアミノ基は、カルボン酸基に変換される。
本明細書で言及されるような未反応または遊離のアミノ基は、いかなる硫酸化グリコサミノグリカン分子にも結合されない、式（Ｉ）に示されるなどの、ＰＥＧ－脂質における任意のＮ末端アミンおよび任意のリジン残基中の任意のアミノ基に関する。
一実施形態において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、本明細書で開示されるような方法により、得ることができるか、得られる。
本発明の硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、アンチトロンビン（ＡＴ）（図６～図１０、図１１Ａを参照されたい）、および因子Ｈ（図１０、図１１Ａおよび図１１Ｂを参照されたい）に対する親和性を有する。
ＡＴは、凝固系のいくつかの酵素を不活性化するタンパク質分子である。その活性は、ＡＴの因子ＩＩａ（トロンビン）および因子Ｘａ（ＦＸａ）への結合を強化する、抗凝固薬ヘパリンにより何倍にも増加する。これは、本発明の硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質が、ＡＴに結合できることにより抗ＦＸａ活性を有しており、それにより凝集阻害効果を有することを意味する。
因子Ｈは、補体活性化ファミリーの調節因子のメンバーであり、補体制御タンパク質である。その主な機能は、補体系の代替経路を調節することであり、補体系が病原体または他の危険な材料に向けられ、宿主組織を損傷しないことを保証する。因子Ｈは、因子Ｉ媒介Ｃ３ｂ開裂についての補因子活性および代替経路Ｃ３－コンバターゼ、Ｃ３ｂＢｂに対する崩壊促進活性の両方を保持することにより、自己細胞および表面での補体活性化を調節する。因子Ｈは、自己細胞および自己表面で保護作用を発揮するが、細菌またはウイルスの表面では発揮しない。これは、Ｃ３開裂または崩壊促進活性についての補因子として、より低いまたはより高い活性を有する形態を採用する能力を有する因子Ｈの結果であると考えられる。より低い活性の形態が、溶液中の主要な形状であり、流体相増幅を制御するのに充分である。より活性な形態は、因子Ｈが、宿主細胞に一般的に存在するが病原体表面には通常存在しないグリコサミノグリカンおよび／またはシアル酸に結合すると誘導されると考えられ、補体が外来の表面上で衰えずに進行しながら、自己表面が保護されることを保証する。
したがって、本発明の固定された硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を含む細胞表面は、ＡＴおよび因子Ｈを引き付け結合し、それにより細胞表面を血栓炎症から保護する能力を有する。本発明の硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、細胞表面またはリポソームなどの、脂質二重膜に付着される場合であっても、この生物学的効果を有する（図１２、図１７および図１８を参照されたい）。
本明細書に提示されるような実験データはさらに、本発明の硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質で脂質二重膜を修飾することは、従来技術によるヘパリンで細胞表面を修飾する場合に一般的である、凝集または細胞集塊を全く引き起こさないことを示す（図１３を参照されたい）。
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を含む、脂質層、好ましくは脂質二重層に関する。そのような場合において、硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質は、図１に示されるようにＰＥＧ－脂質基を通じて脂質二重層に付着されるか固定される。例えば、本発明は、リポソームの脂質二重層に固定された本発明による少なくとも１つのＰＥＧ－脂質を含むリポソームに関する。
本発明のさらなる態様は、生物学的組織の細胞膜内に固定された本発明による少なくとも１つのＰＥＧ－脂質を含む生物学的組織に関する。
生物学的組織は、例えば、具体的ではあるが、限定されない例として、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）；肝細胞；内皮細胞；ベータ細胞（インスリン産生細胞）および赤血球を含む、幹細胞などの、個々の細胞または複数の細胞であり得る。生物学的組織はあるいは、ランゲルハンス島などの、細胞のクラスターであり得る。生物学的組織はまた、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、肺、子宮、膀胱、胸腺、腸および脾臓などの、組織もしくは臓器、またはそれらの一部の形状であり得る。特定の実施形態において、組織もしくは臓器、またはそれらの一部の、血管系の少なくとも一部、および任意で柔組織は、本発明による少なくとも１つのＰＥＧ脂質でコートされてよい。
本発明の別の態様は、医薬品としての使用のための本発明によるＰＥＧ－脂質に関する。
本発明のさらなる態様は、血栓炎症の処置における使用のため、瞬時の血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の処置における使用のため、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の処置における使用のため、脳卒中の処置における使用のためおよび／または心筋梗塞の処置における使用のための本発明によるＰＥＧ－脂質に関する。
本発明の関連する態様は、血栓炎症、ＩＢＭＩＲ、ＩＲＩ、脳卒中および／または心筋梗塞の処置のための医薬品の製造のための本発明によるＰＥＧ－脂質の使用を定義する。
本発明のＰＥＧ－脂質は、全身投与または局所投与により、それを必要とする対象に投与できる。全身投与経路の非限定例は、静脈内投与および皮下投与を含む。局所投与は、対象の標的臓器または組織への局所的な本発明のＰＥＧ－脂質の注射を含む。
本発明のＰＥＧ－脂質は好ましくは、ＰＥＧ－脂質溶液の形状で投与される。ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液は、例えば、生理食塩水、水性緩衝溶液または臓器保存溶液であり得る。使用できる水性緩衝溶液の具体的ではあるが、限定されない例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびクエン酸溶液を含む。
本発明の別の態様は、硫酸化グリコサミノグリカンコーティングを有する生物学的組織を提供するインビトロ方法に関する。インビトロ方法は、インビトロで生物学的組織に本発明によるＰＥＧ－脂質を添加して、生物学的組織の細胞膜にＰＥＧ－脂質を固定することを含む。
本発明の一態様は、臓器または臓器の一部を処置するエクスビボ方法に関する。方法は、本発明によるＰＥＧ－脂質を含む溶液を、臓器または臓器の一部の、血管系におよび任意で柔組織に、エクスビボ注入することを含む。方法はまた、本発明によるＰＥＧ－脂質での、血管系の、および好ましくは柔組織の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするために、本発明によるＰＥＧ－脂質を含む溶液を血管系中で、任意で柔組織中でエクスビボインキュベートすることを含む。
一実施形態において、エクスビボインキュベートするステップは、臓器または臓器の一部を臓器保存溶液、好ましくは本発明によるＰＥＧ－脂質を含む臓器保存溶液中に浸漬しておきながら、本発明によるＰＥＧ－脂質で、血管系、および好ましくは柔組織の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするために、本発明によるＰＥＧ－脂質を含む溶液を血管系、および任意で柔組織中でエクスビボインキュベートすることを含む。
したがって、エクスビボ方法は、ＰＥＧ－脂質を臓器または臓器の一部の血管系に導入することを含み、そこで、ＰＥＧ－脂質分子が内皮および柔組織の細胞膜と相互作用しかつそれに結合することを可能にする。図１は、脂質二重膜と疎水的に相互作用し、それによりリン脂質基を介して細胞膜中でＰＥＧ－脂質分子を固定または結合する、ＰＥＧ－脂質分子を用いるこの原理を概略的に示す。
ＰＥＧ－脂質分子と、内皮の、任意で、腎臓の場合には腎実質などの、柔組織の脂質二重膜との間の相互作用は好ましくは、エクスビボで生じ、一方で臓器または臓器の一部は、臓器保存溶液、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む臓器保存溶液中に置かれるか、浸漬される。
特定の実施形態において、臓器または臓器の一部は最初に、ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液を用いて臓器または臓器の一部の血管系に、および任意でその柔組織にエクスビボ注入される。このエクスビボ注入は有利には、ドナーの体内から臓器または臓器の一部を外植および除去した後に、可能な限り早く起こる。還流された臓器または臓器の一部はその後、好ましくはＰＥＧ－脂質を含む、臓器保存溶液中に浸漬され、その中で、好ましくは約４℃などの低温で維持される。
別の特定の実施形態において、臓器または臓器の一部は、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む、臓器保存溶液中に最初に浸漬され、その後ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液を、臓器または臓器の一部の血管系に、および任意でその柔組織にエクスビボ注入する。このエクスビボ注入は、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む、臓器保存溶液中に臓器または臓器の一部を浸漬しておきながら、実行できる。代わりに、臓器または臓器の一部は、臓器保存溶液から一時的に取り出されて、エクスビボ注入を実行し、その後、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む、臓器保存溶液に戻される。
一実施形態において、方法はまた、臓器保存溶液を血管系にエクスビボ注入して非結合ＰＥＧ－脂質分子を血管系から洗い流すことも含む。したがって、非結合ＰＥＧ－脂質分子は好ましくは、１回または複数回の、すなわち、少なくとも２回の、臓器保存溶液を使用する洗浄工程において洗い流される。
一実施形態において、ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液のエクスビボ注入は、血管系の動脈および静脈の１つをエクスビボクランピングすることを含む。この実施形態はまた、ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液を動脈および静脈の他方にエクスビボ注入し、動脈および静脈のその他方をエクスビボクランピングすることも含む。
別の実施形態において、ＰＥＧ－脂質分子を有する溶液は、溶液が臓器または臓器の一部の静脈（または動脈）で出現するまで、臓器または臓器の一部の血管系の動脈（または静脈）に注入される。これは、ＰＥＧ－脂質分子を有する溶液が、血管系を充填したことを確認する。その時点で、動脈および静脈をクランプする。
ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液は、静脈を通って、または動脈を通って添加できる。特定の実施形態において、溶液は、動脈に注入される。そのような特定の実施形態において、任意の初期クランピングがその後好ましくは、血管系の静脈でなされる。
ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液は好ましくは、１０分～最大で４８時間の期間、血管系中でエクスビボインキュベートされて、ＰＥＧ－脂質分子が内皮の細胞膜と疎水的に相互作用することを可能にし、それにより臓器または臓器の一部の血管系の少なくとも一部をコートする。エクスビボインキュベーションは好ましくは、２０分間～最大で３６時間、より好ましくは３０分間～最大で２４時間、例えば３０分間～最大で１２時間、最大で８時間、最大で４時間、または最大で１時間実行される。
血管系に注入されるＰＥＧ－脂質分子を含む溶液の量は、臓器の種類および臓器のサイズ（成人対小児）に依存する。一般に、溶液の体積は、臓器の血管系を満たすのに充分である必要がある。最も実用的な用途において、５ｍＬ～最大で２５０ｍＬのＰＥＧ－脂質分子を含む溶液が、血管系にエクスビボ注入される。好ましい実施形態において、５ｍＬ～最大で１００ｍＬ、好ましくは５ｍＬ～最大で５０ｍＬのＰＥＧ－脂質分子を含む溶液が、血管系にエクスビボ注入される。
一実施形態において、溶液は、０．２５ｍｇ／ｍＬ～最大で２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－脂質分子を含む。好ましい実施形態において、溶液は、０．２５ｍｇ／ｍＬ～最大で１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．２５ｍｇ／ｍＬ～最大で５ｍｇ／ｍＬ、例えば、２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－脂質分子を含む。
ＰＥＧ－脂質分子の上述した濃度はまた、ＰＥＧ－脂質分子を含む臓器保存溶液のために使用できる。
本発明により、ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液は、臓器または臓器の一部を、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む、臓器保存溶液中に置かれたまたは浸漬されたままにしながら、血管系中でエクスビボインキュベートされる。加えて、臓器または臓器の一部は好ましくはまた、０℃より高いが８℃よりも低い温度、好ましくは０℃より高いが６℃以下である温度、より好ましくは０℃より高いが４℃以下である温度で維持される。
この実施形態において、臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－脂質分子が血管系の内皮の細胞膜と相互作用しかつそれに結合させられるインキュベーション時間の間、好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む、臓器保存溶液中に浸漬される。臓器または臓器の一部はまた好ましくは、冷たくして、すなわち、０℃付近であるが０℃より高い温度で維持される。臓器保存のための理論的に完全な温度は、４℃～８℃であることが示されている。より高い温度は、代謝が効率的に低下されないので臓器の低酸素性損傷をもたらし、４℃より低い温度は、タンパク質変性を伴う低温損傷のリスクを高める。
現在、臨床臓器移植におけるドナー臓器保存のための絶対的基準は、３つのプラスチック袋およびアイスボックスを使用する。第１のプラスチック袋は、臓器保存溶液に浸漬された臓器自体を含む。この第１のプラスチック袋を、生理食塩水で満たされた第２のプラスチック袋に入れ、その後これらの２つのプラスチック袋（plastic bacs）を、生理食塩水で満たされた第３のプラスチック袋に入れ、その後それをアイスボックスに入れる。温度制御された環境で臓器を維持するためのさらに進んだ臓器保存デバイスが、利用可能であり、Ｐａｒａｇｏｎｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＳｈｅｒｐａ Ｐａｋ（商標）輸送システム、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｙｓｔｅｍｓからのＷａｖｅｓ、Ｏｒｇａｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓからのＬｉｆｅＰｏｒｔトランスポーターなどを、使用できる。
ＰＥＧ－脂質分子を含む溶液は、生理食塩水、水性緩衝溶液または臓器保存溶液であり得る。
使用できる水性緩衝溶液の具体的ではあるが、限定されない例は、ＰＢＳおよびクエン酸溶液を含む。
ＰＥＧ－脂質分子をエクスビボ注入する前またはその後にＰＥＧ－脂質分子を注入する、および／または臓器もしくは臓器の一部の血管系を洗浄するのに使用できる、および／または、臓器もしくは臓器の一部をその中に浸漬できる臓器保存溶液は、既知の臓器保存溶液から選択できる。そのような臓器保存溶液の具体的ではあるが、限定されない例は、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、クエン酸溶液、ウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液、コリンズ溶液、セルシオ溶液、京都大学溶液およびＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｌｏｐｅｚ－１（ＩＧＬ－１）溶液を含む。
対象は好ましくは、ヒト対象である。しかし、本発明はまた、対象が非ヒト対象、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびモルモットを含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物である獣医用途でも使用できる。
本発明のさらなる態様は、対象における血栓炎症、ＩＢＭＩＲ、ＩＲＩ、脳卒中および／または心筋梗塞を処置、阻害または予防するための方法に関する。方法は、本発明によるＰＥＧ－脂質を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態において、方法は、任意ではあるが好ましくは、臓器移植片を好ましくはＰＥＧ－脂質分子を含む臓器保存溶液に浸漬しておきながら、ＰＥＧ－脂質分子での血管系の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするための、本発明によるＰＥＧ－脂質分子を含む溶液を臓器移植片の血管系にエクスビボ注入するおよび血管系中でＰＥＧ－脂質分子を含む溶液をエクスビボインキュベートする、以前説明した方法ステップを含む。
本発明によるＰＥＧ－脂質は、正常な内皮細胞表面の多糖外被を模倣することにより、血栓炎症に対する局所保護を可能にする。このアプローチはまた、標的臓器における内皮細胞表面のコーティングが全身投与と比較して少量の調節因子を必要とするので、出血のリスクを回避できる。
一実施形態において、本発明のＰＥＧ－脂質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ）と類似の機能を有する、ヘパリンを含む。ヘパリンはＨＳと同じように多くの調節因子と相互作用できるので、本発明のＰＥＧ－脂質を使用して得られるｆＨｅｐ－脂質コーティングは、ＩＲＩ中の複雑な生物学的反応を調節でき、そのため、臨床試験に容易に適用できる。
ヘパリンコーティングの種々の方法は、既に当技術分野において報告されている。可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）と合わせたヘパリンの層ごとのコーティングが、マウス膵島に適用されている［７］。しかし、組換えｓＣＲ１の使用は実用的ではなく、かつ手順が複雑であるので、このアプローチは、腎臓における内皮コーティングに適用できない。また、カチオン性アビジンは、静電相互作用を介した膵島のヘパリンコーティングのために使用されている［８］。しかし、アビジンの強い抗原性のために、臨床背景でこの方法を使用することは困難である。ヘパリン結合ペプチドは、細胞表面でＰＥＧ－脂質を使用することによりヘパリンの固定化に使用されている［６，９］。しかし、このコーティング手順は依然として、いくらかの手間のかかるプロセスを必要とし、それは固形臓器の内皮表面をヘパリンでコートすることをより困難にする。
実施例
本実施例は、単一の工程プロセスにより細胞およびリポソームなどの脂質膜構造をコートできる、ヘパリン共役ＰＥＧ－脂質（ｆＨｅｐ－脂質）の生産および特徴づけを示す。
試薬および材料
以下の試薬および材料を、実施例において使用した。
ヘパリンナトリウム（ＵＦＨ、富士フィルム和光純薬株式会社、大阪、日本）
硫酸（Ｈ２ＳＯ４、富士フィルム和光純薬株式会社）
亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、富士フィルム和光純薬株式会社）
５Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、富士フィルム和光純薬株式会社）
透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：３．５～５ｋＤａ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｌａｔｉｏｎ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）
シアノ水素化ほう素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３、シグマアルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）
Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フィルム和光純薬株式会社）
Ｂｉｏｐｈｅｎヘパリン（ＡＴ＋）（コスモ・バイオ株式会社、東京、日本）
デキストラン（Ｍｗ：１０８０Ｄａ、９８９０Ｄａ、４３５００Ｄａ、１２３６００Ｄａ、シグマアルドリッチ）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、富士フィルム和光純薬株式会社）
蒸留水（富士フィルム和光純薬株式会社）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬株式会社）
α－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－マレイミジルポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ、Ｍｗ：５０００Ｄａ、日油株式会社、東京、日本）
トリエチルアミン（シグマアルドリッチ、セントルイス、ＭＯ）
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ、日油株式会社）
ジクロロメタン（シグマアルドリッチ）
１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（1,6-diphenyl-1,3,5-heatriene）（ＤＰＨ、シグマアルドリッチ）
Ｌ－システイン（Ｃ、Ｍｗ＝１２１．１６Ｄａ、富士フィルム和光純薬株式会社）
リジン－システイン（Ｋ１Ｃ、Ｍｗ＝２４９．３３５Ｄａ、株式会社ベックス、東京、日本）
リジン－リジン－システイン（Ｋ２Ｃ、Ｍｗ＝３７７．５１Ｄａ、株式会社ベックス）
リジン－リジン－リジン－リジン－システイン（Ｋ４Ｃ、Ｍｗ＝６３３．８５Ｄａ、ジェンスクリプト、東京、日本）
リジン－リジン－リジン－リジン－リジン－リジン－リジン－リジン－システイン（Ｋ８Ｃ、Ｍｗ＝１１４６．５４Ｄａ、ジェンスクリプト）
フルオレスカミン（富士フィルム和光純薬株式会社）
グリシン（富士フィルム和光純薬株式会社）
アンチトロンビン（ＡＴ、注射用献血ノンスロン５００、武田薬品工業株式会社、大阪、日本）
１－ドデカンチオール（富士フィルム和光純薬株式会社）
ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ）
コレステロール（富士フィルム和光純薬株式会社）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、ＭＣ－６０６０、日油株式会社）
ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－ｃｏ－メタクリル酸ｎ－ブチル）（ＭＰＣポリマー、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）およびメタクリル酸ｎ－ブチル（ＢＭＡ）ドメインの比３：７からなる、日油株式会社、東京、日本）
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、東京化成工業株式会社、東京、日本）
３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、調製済み溶液、東京化成工業株式会社、東京、日本）
エタノール（９９．５％、富士フィルム和光純薬株式会社）
クエン酸一水和物（ＣＡＭ、富士フィルム和光純薬株式会社）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、富士フィルム和光純薬株式会社）
コレステロール定量キット（Ｔ－Ｃｈｏ Ｅ、富士フィルム和光純薬株式会社）
ジオキサン（脱水）（関東化学株式会社）
無水コハク酸（ＳＡ、富士フィルム和光純薬株式会社）
トリパンブルー（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）
トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）
ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ、ＵＳＡ）
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ロンザ、モリスタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）
西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）
ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）
ウシ胎児血清（ＦＢＳ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）
ペニシリン－ストレプトマイシン、液体（Ｐ／Ｓ ０．８５％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬ中、ペニシリン：５０００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン：５０００μｇ／ｍＬ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８抗体ラベリングキット（重炭酸ナトリウムおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８カルボン酸、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルをキットに含む、サーモフィッシャーサイエンティフィック）
真空採血管（ＥＤＴＡ－２Ｎａ処理済み、テルモ株式会社、東京、日本）
エチレンジアミン四酢酸溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、ｐＨ８．０、インビトロジェン）
因子Ｈ（ヒト血液から精製される）
装置
以下の装置を、実施例で使用した。
ｐＨメーター（ＬＡＱＵＡ、堀場製作所、京都、日本）
Ｎａｎｏｄｒｏｐ－１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
Ｎａｎｏｄｒｏｐ－３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
エネルギー散逸を用いる水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ、ｑｓｅｎｓｅ、Ｂｉｏｌｉｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イェーテボリ、スウェーデン）
ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ、ＬＣ－２０００Ｐｌｕｓシリーズ、ＪＡＳＣＯ、東京、日本）
ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ株式会社、ウスターシャー、ＵＫ）
プレートリーダー（ＡＤ２００、ベックマン・コールター、マイアミ、ＦＬ、ＵＳＡ）
セルカウンター（ｃｏｕｎｔｅｓｓ、インビトロジェン）
エクストルーダ（アバンティポーラリピッド社、アバンティポーラリピッド社、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）
遠心分離機（ＭＸ３０１、株式会社トミー精工、東京、日本）
遠心分離機（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、ビーエム機器株式会社、東京、日本）
共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ、ＬＳＭ８８０、カール・ツァイス、イェーナ、ドイツ）
フローサイトメーター（ＦＣＭ、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ、ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）
実施例１－断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）の合成および特徴づけ
断片化ヘパリンの合成
硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液（１Ｍ）および亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）水溶液（７Ｍ）を混合し、混合溶液のｐＨを４に調節した。ヘパリンナトリウムの溶液（未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、水中で２０ｍｇ／ｍＬ、３ｍＬ）をＨ２ＳＯ４およびＮａＮＯ２の混合溶液（１１ｍＬ）と１５分間室温（ＲＴ、約２０～２５℃）で混合した。その後、１ＭのＮａＯＨ水溶液（約４ｍＬ）を添加することにより溶液のｐＨを７に調節した。透析膜（３．５～５ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）を使用して、反応物質をＭｉｌｌｉＱ水に対して１日間透析した後、溶液を凍結乾燥して断片化ヘパリン（ｆＨｅｐ）を得た。収率は、４０％であった。
ＵＶスペクトル
ｆＨｅｐのアルデヒド基を調べるために、ｆＨｅｐの溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）を紫外可視分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）により測定した。
ＧＰＣを使用するｆＨｅｐの分子量の測定
ＵＦＨおよびｆＨｅｐの分子量をＧＰＣにより測定した。カラムは、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ８０３ＨＱ（昭和電工株式会社、東京、日本）であった。溶出液は、０．１ＭのＮａＣｌ水溶液であった。流速は、０．５ｍＬ／分であり、カラムオーブンの温度は、２５℃であった。標準試薬として、デキストラン（Ｍｗ：１０８０Ｄａ、９８９０Ｄａ、４３５００Ｄａ、１２３６００Ｄａ）（シグマアルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用した。
ヘパリン活性を検査するためのＦＸａアッセイ
合成ｆＨｅｐの抗因子Ｘａ活性を、ＦＸａ活性アッセイキット（Ｂｉｏｐｈｅｎヘパリン（ＡＴ＋）、コスモ・バイオ株式会社）を使用して評価した。ｆＨｅｐの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ（ＰＢＳ中）であり、一方で標準としてのＵＦＨの濃度は、２ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ、０．５ＩＵ／ｍＬであった。
結果
アルデヒド基が２６０ｎｍで吸光度を有するので、ｆＨｅｐ溶液は、その波長で吸光度を有する（図３）。図３に示すように、元のＵＦＨについては吸光度がなかった。結果は、ｆＨｅｐがアルデヒド基を含むことを示した。
ｆＨｅｐおよびヘパリンの数平均分子量（Ｍｎ）を、デキストラン標準を使用するＧＰＣにより算出した（図４Ａ）。ｆＨｅｐは、Ｍｎ＝６．１ｋＤａを有し、一方でＵＦＨは、Ｍｎ＝２２ｋＤａを有した。結果は、ｆＨｅｐがヘパリンの断片であったことを示した。ｆＨｅｐの活性を因子Ｘａ活性アッセイにより測定した（図４Ｂ）。ｆＨｅｐの活性は、元のＵＦＨの活性の約２４％であった。
実施例２－カチオン－ＰＥＧ－脂質およびｆＨｅｐ－脂質の合成および評価
Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質の合成
Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質の合成を、以前開示されたように実行した［４］。簡潔に述べると、α－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－マレイミジルポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ、Ｍｗ：５０００Ｄａ、２００ｍｇ）、トリエチルアミン（５０μＬ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ、２０ｍｇ）を、ジクロロメタンに溶解し、４８時間、ＲＴで撹拌した。ジエチルエーテルを用いる沈殿は、白色粉末としてＭａｌ－ＰＥＧ（５ｋ）－脂質を生じた（収率：８０％）。
カチオン－ＰＥＧ－脂質の合成
ＰＥＧ鎖の末端で少なくとも１つのアミン基を導入するため、各リジン残基が１つのアミノ基を含むＭａｌ－ＰＥＧ－脂質にＣ、Ｋ１Ｃ、Ｋ２Ｃ、Ｋ４Ｃ、およびＫ８Ｃを共役させた。１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、Ｃ、Ｋ４ＣおよびＫ８ＣをＰＢＳに溶解し、Ｋ１ＣおよびＫ２ＣをＤＭＳＯに溶解した（原液）。各原液（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｃについては２１μＬ、Ｋ１Ｃについては５５μＬ、Ｋ２Ｃについては８３μＬ、Ｋ４Ｃについては１１７μＬ、またはＫ８Ｃについては２１７μＬ）を、Ｍａｌ－ＰＥＧ（５ｋ）－脂質（１０ｍｇ／ｍＬ、１０００μＬ、ＰＢＳ中）と混合した。得られた各溶液を、ＲＴで２４時間回転させた。本明細書においてＫｎＣ－ＰＥＧ－脂質（ｎ：リジン残基の数）と示される、以下のカチオン－ＰＥＧ－脂質：Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質、およびＫ８Ｃ－ＰＥＧ脂質を、生産した。
ｆＨｅｐ－脂質の合成および機能評価
各カチオン－ＰＥＧ－脂質（１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）を、ｆＨｅｐ（Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質、およびＫ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質について、それぞれ１５ｍｇ、３０ｍｇ、４５ｍｇ、７０ｍｇ、および１２０ｍｇ）と混合し、続いてＮａＣＮＢＨ３溶液（Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質、およびＫ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質について、それぞれ６μＬ、１３μＬ、１８μＬ、３０μＬ、および４９μＬ、６．４Ｍ、ＰＢＳ中）を添加した。混合溶液を、ＲＴで３日間（Ｋ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびＫ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質について）または７日間（Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびＣ－ＰＥＧ－脂質について）撹拌して、以下のｆＨｅｐ－脂質：ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質を得た。
反応後に、無水コハク酸（ＳＡ）を添加して、ｆＨｅｐ－脂質の未反応アミン基をカルボン酸基に変化させた。各ｆＨｅｐ－脂質（１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ中）を、ＳＡ溶液（ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質については、それぞれ３３μＬ、６４μＬ、９４μＬ、１５１μＬ、および２５２μＬ、ジオキサン中で０．５Ｍ）と混合し、室温で２４時間撹拌した。その後、得られた溶液を凍結乾燥し、ＧＰＣ（スピンカラム、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ポリアクリルアミドスピン脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯ、０．７ｍＬ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により精製して、ｆＨｅｐ（－）－脂質：ｆＨｅｐ－Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質を得た。
ｆＨｅｐ－脂質の直径および表面電荷の決定
各カチオン－ＰＥＧ－脂質（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）、ｆＨｅｐ－脂質（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）およびｆＨｅｐ（ＰＢＳ中で４ｍｇ／ｍＬ）の直径、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位（表面電荷）を、ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ株式会社、ウスターシャー、Ｕ．Ｋ）を使用する動的光散乱法により評価した。
ｆＨｅｐ－脂質についての臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の決定
ＤＰＨをｆＨｅｐ－脂質のＣＭＣの測定のために使用した。ｆＨｅｐ－脂質、カチオン－ＰＥＧ－脂質およびＭａｌ－ＰＥＧ－脂質（１ｍＬ、１．０×１０－１ｍｇ／ｍＬ～１．０×１０－７ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）およびＤＰＨ溶液（２μＬ、３０μＭ、ＴＨＦ中）を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた溶液の蛍光強度を、蛍光光度計（ＦＰ－６６００、ＪＡＳＣＯ、Ｅｘ：３５７ｎｍ、Ｅｍ：４３０ｎｍ）を使用して測定した。
フルオレスカミンを使用するアミン基の濃度の決定
各カチオン－ＰＥＧ－脂質およびｆＨｅｐ－脂質をＰＢＳで希釈し（０．５ｍｇ／ｍＬ）、フルオレスカミンを３ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。各カチオン－ＰＥＧ－脂質溶液（９μＬ）またはｆＨｅｐ－脂質（９μＬ）をフルオレスカミン溶液（３μＬ）とＲＴで１５分間混合し、得られた各溶液の吸光度（４８１ｎｍで）をＮａｎｏｄｒｏｐ－３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）により測定した。同じ実験を、同じ濃度を有するＣ、Ｋ１Ｃ、Ｋ２Ｃ、Ｋ４Ｃ、およびＫ８Ｃ溶液を使用して実行した。グリシンを、アミン基濃度を決定するための検量線に使用した。
結果
ｆＨｅｐ－脂質の分子設計を図１に示す。複数の断片化ヘパリンを各ＰＥＧ－脂質分子と共役させることができる（図２Ａ）。ヘパリンを化学的に修飾して、末端にアルデヒド基を有する断片化ヘパリンを得た（ｆＨｅｐ、図２Ｂ）。その後、シッフ塩基化学により、ｆＨｅｐをカチオン性ＮＨ２－ＰＥＧ－脂質（カチオン－ＰＥＧ－脂質）に共役させた（図２Ａ、図２Ｃ）。アミン基を導入するため、Ｃ、Ｋ１Ｃ、Ｋ２Ｃ、Ｋ４ＣおよびＫ８Ｃを使用し、Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質に共役させた。以下のカチオン－ＰＥＧ－脂質：Ｃ－ＰＥＧ－脂質（１つのアミン基）、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質（２つのアミン基）、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質（３つのアミン基）、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質（５つのアミン基）、Ｋ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質（９つのアミン基）を生産した。
アルデヒド基とアミン基との間のシッフ塩基化学を通じてｆＨｅｐを各カチオン－ＰＥＧ－脂質と共役させ、続いてＮａＣＮＢＨ３で還元した。フルオレスカミンを使用することによりｆＨｅｐ－脂質の未反応アミン基およびカチオン－ＰＥＧ－脂質のアミン基の両方を測定することにより、カチオン－ＰＥＧ－脂質に共役したｆＨｅｐの数を算出した。反応したアミン基の割合は、以下の表１に列記されるように、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質およびｆＨｅｐ－Ｃ－脂質について、それぞれ８９％、９０％、９１％、８８％、および６１％と算出された。その後、ＰＥＧ－脂質あたりの共役したｆＨｅｐの数は、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質およびｆＨｅｐ－Ｃ－脂質についてそれぞれ８．０、４．５、２．７、１．８、および０．６であった。
Figure 2023513656000005
各ｆＨｅｐ－脂質のミセルサイズを、ＤＬＳにより決定した（図５Ａ）。全ｆＨｅｐ－脂質は、１５ｎｍ～２０ｎｍを示したが、ｆＨｅｐは、約２ｎｍを示した。加えて、各ｆＨｅｐ－脂質のゼータ電位は、各カチオン－ＰＥＧ－脂質のゼータ電位よりもさらに負であった（図５Ｂ）。これらの結果は、ｆＨｅｐがＰＥＧ－脂質と共役したことを示唆した。
我々はまた、ＤＰＨを使用して、各ｆＨｅｐ－脂質のＣＭＣを測定した。ＣＭＣは、ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質、Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびＭａｌ－ＰＥＧ－脂質について、それぞれ０．９μＭ、１．１μＭ、１．１μＭ、１．０μＭ、０．６μＭ、１．１μＭ、１．１μＭ、１．０μＭ、１．０μＭ、０．７μＭおよび１．１μＭであり、ｆＨｅｐ－脂質が、両親媒性であり、実際にミセルを形成する可能性があることを示唆した。
実施例３－ＱＣＭ－ＤによるｆＨｅｐ－脂質の機能評価
ｆＨｅｐ－脂質の機能を、エネルギー散逸を用いる水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ－Ｄ、Ｑ－ｓｅｎｓｅ、イェーテボリ、スウェーデン）により評価した。各ｆＨｅｐ－脂質およびｆＨｅｐ（－）－ＰＥＧ－脂質に対するアンチトロンビン（ＡＴ）の結合能力を、ＱＣＭ－Ｄにより定量した。ＱＣＭ金センサチップを酸素プラズマ処理（３００Ｗ、１００ｍＬ／分のガス流、ＰＲ５００；ヤマト科学株式会社、東京、日本）により洗浄した後、センサチップを１－ドデカンチオール溶液（１．２５ｍＭ、ＥｔＯＨ中）に２４時間浸漬して、疎水性自己集合単層（ＣＨ３－ＳＡＭ）を形成した。エタノールおよび水を用いる集中的な洗浄の後、センサチップをＱＣＭ－Ｄチャンバにセットした。各ｆＨｅｐ－脂質の溶液（ＰＢＳ中で０．１ｍｇ／ｍＬ）をチャンバに３０分間流し、その後、ＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）を、ブロッキング処理のために１０分間流した。最後に、ＡＴ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）をチャンバに１０分間流した。ＰＢＳを、各試料溶液を流す前に洗浄のために２分間流した。各材料の吸着を、ソルベリー式を使用して共鳴周波数変化（第７オーバートーンでのΔｆ）から算出した［５］。
加えて、因子ＨのｆＨｅｐ（－）－脂質（ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質）またはＭａｌ－ＰＥＧ－脂質（対照として）への結合を、ＱＣＭ－Ｄで研究した。各ｆＨｅｐ（－）－脂質またはＭａｌ－ＰＥＧ－脂質の溶液（ＰＢＳ中で０．１ｍｇ／ｍＬ）をチャンバに３０分間流し、ＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）を、ブロッキング処理のために１０分間流した。その後、因子Ｈ溶液（５０μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）をチャンバに１５分間流した。ＰＢＳを、各試料溶液を流す前に洗浄のために２分間流した。その後、ＡＴ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）をチャンバに１０分間流した。ＰＢＳを、各試料溶液を流す前に洗浄のために１０分間流した。各材料の吸着を、ソルベリー式を使用して共鳴周波数変化（第７オーバートーンでのΔｆ）から算出した［５］。
結果
ＡＴのｆＨｅｐ－脂質への結合能力を、ＱＣＭ－Ｄにより評価した。図６は、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質とＡＴの間の相互作用の代表的なＱＣＭ－Ｄプロファイルを示す。ＢＳＡを用いるブロッキング処理の後、表面上でｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質へのＡＴの結合を確認できた。図７は、各ｆＨｅｐ－脂質およびカチオン－ＰＥＧ－脂質についてのＡＴ結合量のデータを要約する。ここで、ｆＨｅｐをまた対照として添加した。全ｆＨｅｐ－脂質について、ＡＴ結合を確認できたが、カチオン－ＰＥＧ－脂質およびｆＨｅｐへのＡＴの結合はなかった。
我々はまた、無水コハク酸（ＳＡ）で処理されたｆＨｅｐ－脂質、すなわちｆＨｅｐ（－）－脂質のＡＴ結合能力を調べた。ｆＨｅｐ－脂質上に未反応アミン基があるので、ＳＡを使用して、それらを細胞毒性がより低いカルボン酸基に変えた。図８は、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質とＡＴの間の相互作用の代表的なＱＣＭ－Ｄプロファイルを示す。ブロッキング処理のためにＢＳＡを添加した場合、より少ないＢＳＡの結合を確認でき、ＡＴの結合を確認できただけであった（図９）。同様な結果が、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質を使用した場合、得られた。これらの結果は、ｆＨｅｐ（－）－脂質の負電荷がＢＳＡの非特異的結合を阻害したことを示した。
我々はまた、ＱＣＭ－ＤによりｆＨｅｐ（－）－脂質への因子Ｈの結合能力を調べた。図１０は、因子Ｈとの相互作用の代表的なＱＣＭ－Ｄプロファイルを示す。ＢＳＡを用いるブロッキング処理の後、ｆＨｅｐ（－）－脂質上での因子Ｈの結合を確認できたが、結合は、対照のＭａｌ－ＰＥＧ－脂質では検出されなかった。図１１Ａおよび図１１Ｂは、各ｆＨｅｐ（－）－脂質およびＭａｌ－ＰＥＧ－脂質への因子Ｈ結合量の定量分析を要約する。全ｆＨｅｐ（－）－脂質について、因子Ｈの結合があったが、Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質への因子Ｈの結合はなかった。ｆＨｅｐ（－）－脂質分子あたりの因子Ｈの数は、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質と比較してｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質が使用された場合、最も高い数であった。この結果は、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質の高度に充填されたｆＨｅｐが、因子Ｈに対し最も高い親和性を有し、これが、因子Ｈの補充を介した補体活性化の調節にとって重要であることを示唆する。
実施例４－ＦＸａ活性アッセイによるｆＨｅｐ－脂質の機能評価
ｆＨｅｐ－脂質の機能をＦＸａ活性アッセイにより評価した。ここで、我々は、リポソームに取り込まれた各ｆＨｅｐ－脂質に対するアンチトロンビン（ＡＴ）の結合能力を評価した。
リポソームを、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびコレステロール（モル比で１：１）により調製した。コレステロール溶液（５３０μＬ、エタノール中で１０ｍｇ／ｍＬ）およびＤＰＰＣ溶液（１ｍＬ、エタノール中で１０ｍｇ／ｍＬ）を混合し、ロータリーエバポレータを使用して蒸発させて、脂質膜を形成し、続いて、真空で２４時間乾燥させた。その後、ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加し、マグネチックスターラーバーによりＲＴで１時間激しく撹拌した。得られた脂質懸濁液を、エクストルーダ（アバンティポーラリピッド社、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を使用してメンブレンフィルタ（φ１０００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍおよび１００ｎｍ）に押出成形した。脂質懸濁液を、各フィルタに２１回通した。
ｆＨｅｐ－脂質をリポソーム表面に組み込むため、ｆＨｅｐ－脂質の溶液をリポソーム懸濁液と混合した。リポソーム懸濁液（５００μＬ、製剤中で１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）を遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ３０１、２０，０００ｇ、７０分、４℃）し、その後、ｆＨｅｐ－脂質溶液（５０μＬ、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）をリポソームペレットと混合した。ＲＴで１０分間のインキュベーション後、懸濁液を、１回の遠心分離（２０，０００ｇ、７０分、４℃）によりＰＢＳ（４５０μＬ）で洗浄した。最後に、ｆＨｅｐ－脂質－修飾リポソームを得た。リポソーム中のコレステロールの濃度を、アッセイキット（Ｔ－Ｃｈｏ Ｅ、富士フィルム和光純薬株式会社）により測定した。リポソームのＦＸａ活性を、アッセイキット（Ｂｉｏｐｈｅｎヘパリン（ＡＴ＋）、コスモ・バイオ株式会社）を使用して評価した。
ＦＸａ活性アッセイ
リポソーム懸濁液（１５μＬ、ＰＢＳ中）を、９６ウェルプレート中でヒトＡＴ（１５μＬ）と混合した。ウシＦＸａ（７５μＬ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１２０秒間インキュベートした。次いで、発色試薬（７５μＬ）を９０秒間混合した後、クエン酸水溶液（１００μＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。各上清を遠心分離（２０，０００ｇ、７０分、４℃）により収集した後、吸光度（４０５ｎｍで）を測定した。
リポソームのコレステロールを、可溶化のためにリポソーム懸濁液（ＰＢＳ中で６０μＬ）をＳＤＳ（２μＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中）とＲＴで３０分間混合することにより、測定した。その後、コレステロール濃度を、会社の指示書にしたがって決定した。
結果
ｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームの抗ＦＸａ活性を評価した（図１２）。対照群として、各カチオン－ＰＥＧ－脂質修飾リポソームおよびｆＨｅｐ－処理済みリポソームを、アッセイのために使用した。抗ＦＸａ活性をリポソーム濃度により正規化した。全てのｆＨｅｐ－脂質修飾リポソームは、対照群よりも高い抗ＦＸａ活性を示した。加えて、類似の結果が、ｆＨｅｐ（－）－脂質修飾リポソームを使用した場合得られた（図１２）。これらの結果は、リポソームの表面がｆＨｅｐ－脂質およびｆＨｅｐ（－）－脂質で修飾できること、およびそのような修飾リポソームが抗ＦＸａ活性を有することを示した。
実施例５－処理済みリポソームの特徴づけ
リポソームの表面を、実施例４において説明されたように、各ｆＨｅｐ－脂質（ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質）またはカチオン－ＰＥＧ－脂質（Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ２Ｃ－ＰＥＧ－脂質、Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－脂質、およびＫ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質）で修飾した。また、ｆＨｅｐおよびＰＢＳを対照群として使用した。
ｆＨｅｐ－脂質（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）またはカチオン－ＰＥＧ－脂質（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ３０１、２０，０００ｇ、７０分、４℃）後にリポソームペレットと混合した。ＲＴで１０分間のインキュベーション後に、リポソームを１回の遠心分離（２０，０００ｇ、７０分、４℃）により、ＰＢＳ（４５０μＬ）で洗浄した。最後に、ｆＨｅｐ－脂質－修飾リポソームおよびカチオン－ＰＥＧ－脂質－修飾リポソームを得た。処理済みリポソームの直径、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位（表面電荷）を、ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ株式会社、ウスターシャー、Ｕ．Ｋ）を使用する動的光散乱法により評価した。
結果
ｆＨｅｐ－脂質またはカチオン－ＰＥＧ－脂質で修飾されたリポソームのサイズを、ＤＬＳにより測定した（図１３）。対照群として、リポソームをＰＢＳまたはｆＨｅｐのいずれかで処理した。処理の前に、リポソームのサイズは、１５０ｎｍであった。その後、ｆＨｅｐ－脂質またはカチオン－ＰＥＧ－脂質で修飾されたリポソームの平均サイズは、１５５ｎｍ～１７５ｎｍであり、一方で対照リポソームのサイズは、約２５０ｎｍであった。また、ｆＨｅｐ－脂質またはカチオン－ＰＥＧ－脂質で修飾されたリポソームの多分散指数（ＰＤＩ）は、対照リポソーム（約０．５）よりも低い値（約０．２）を示した（図１４）。これらの結果は、ｆＨｅｐ－脂質またはカチオン－ＰＥＧ－脂質で修飾されたリポソームは充分に分散し、一方で対照リポソームは凝集したことを示した。
また、全リポソームのゼータ電位を測定した（図１５）。全試料は、負電荷を示したが、各ｆＨｅｐ－脂質で修飾されたリポソームは、各カチオン－ＰＥＧ－脂質で修飾されたリポソームよりもさらに負の電荷を示した。この結果は、リポソーム表面が、負のｆＨｅｐ－脂質で修飾されたことを示した。
実施例６－ｆＨｅｐ（－）－脂質による細胞表面官能化
ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）を、真空採血管を使用して健康なドナーから収集した。アンチトロンビン（ＡＴ）のラベリングを、会社から提供されたプロトコルにしたがいＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（商標）４８８抗体ラベリングキットを使用して実行した。ＲＢＣ（１０μＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ中で７×１０９細胞／ｍＬ）を１ｍＬのＰＢＳですすぎ、遠心分離（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、ビーエム機器株式会社、１分）した。細胞ペレットを、ＲＴで３０分間ｆＨｅｐ（－）－脂質（ｆＨｅｐ－Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ２Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質、およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質）、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質（０．５ｍｇ／ｍＬ、各試料について２０μＬ）、ｆＨｅｐ（ＰＢＳ中で４ｍｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ（２０μＬ）で処理し、続いて、１ｍＬのＰＢＳで２回すすいだ。細胞ペレットを、ＲＴで１０分間Ａｌｅｘａ４８８－ＡＴ（４ｍｇ／ｍＬ）で処理し、続いて、１ｍＬのＰＢＳで２回すすぎ、遠心分離（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、１分）した。得られた細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。処理済み細胞を、共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ、ＬＳＭ８８０、カール・ツァイス、イェーナ、ドイツ）を使用して観察し、細胞をフローサイトメトリ（ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ、ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）により分析した。実験は、東京大学の倫理委員会により承認された。
ｆＨｅｐ－脂質の機能を、ＦＸａ活性アッセイにより評価した。ここで、我々は、生細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞）に組み込まれた各ｆＨｅｐ－脂質に対するアンチトロンビン（ＡＴ）の結合能力を評価した。ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の細胞表面を修飾するため、ｆＨｅｐ－脂質（ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質）を細胞と混合した。細胞懸濁液（２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で２×１０６細胞）を、２回の遠心分離（１２０ｇ、４℃、３分）によりＰＢＳで洗浄した。ｆＨｅｐ－Ｃ－脂質の溶液（１００μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬのグリシンを含むＰＢＳ中）を、細胞ペレットと混合し、１０分ごとに優しくタッピングしながらＲＴで３０分間インキュベートした。対照として、ｆＨｅｐ（１００μＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬのグリシンを含むＰＢＳ中）を使用した。その後、処理済み細胞を、２回の遠心分離（１８０ｇ、４℃、６分）によりＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ（１００μＬ）に懸濁した。細胞生存率および細胞数を、トリパンブルーおよびセルカウンターを使用して評価した。
その後、細胞懸濁液（１５μＬ）を調製し、その後、９６ウェルプレートでヒトＡＴ（１５μＬ）と混合した。ウシＦＸａ（７５μＬ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１２０秒間インキュベートした。次いで、発色試薬（７５μＬ）を９０秒間混合した後、クエン酸水溶液（１００μＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。最後に吸光度（４０５ｎｍで）を測定した。
結果
蛍光が、細胞をｆＨｅｐ（－）－脂質で処理した場合細胞膜上で観察され（図１６）、一方で蛍光は、細胞をＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質、ｆＨｅｐおよびＰＢＳで処理した場合細胞膜上で観察されず、ＡＴが細胞表面でｆＨｅｐ（－）－脂質に特異的に固定化されることを示唆した。図１７は、各細胞で固定化されたＡｌｅｘａ４８８－ＡＴの定量分析を示し、これもまた、ＡＴが細胞表面でｆＨｅｐ（－）－脂質に特異的に固定化されることを示唆した。加えて、固定化されたＡＴの数は、細胞がｆＨｅｐ－Ｋ４Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質で処理された場合に最も高く、高度に充填されたｆＨｅｐはｆＨｅｐ（－）－脂質上でＡＴを効果的に固定化できた。
ｆＨｅｐ－脂質修飾細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞）の抗ＦＸａ活性を評価した（図１８）。対照群として、非修飾細胞をアッセイのために使用した。抗ＦＸａ活性は、細胞数により補正された。ｆＨｅｐ－脂質修飾細胞は、非修飾細胞よりも高い抗ＦＸａ活性を示した（図１８）。これらの結果は、細胞の表面がｆＨｅｐ－脂質で修飾され得ることを示し、また、そのような表面修飾が抗ＦＸａ活性をもたらすことも示す。
実施例７－全血モデルを使用するｆＨｅｐ－脂質の機能評価
ｆＨｅｐ－脂質によるｈＭＳＣ表面官能化
ｈＭＳＣを、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加）を用いて５％ＣＯ２および９５％空気中、３７℃で培養した。トリプシン処理（３分、３７℃、５％ＣＯ２で）により収集したｈＭＳＣ（１ｍＬ、ＰＢＳ中で２．５×１０５細胞／ｍＬ）を、遠心分離（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、ビーエム機器株式会社、１分）した。細胞ペレットを、ＲＴで３０分間ｆＨｅｐ（－）－脂質（２０μＬ、ＰＢＳ中で１０ｍｇ／ｍＬ、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質）、ＫｎＣ－ＰＥＧ－脂質（２０μＬ、ＰＢＳ中で１０ｍｇ／ｍＬ、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質およびＫ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質）、ｆＨｅｐ（２０μＬ、ＰＢＳ中で３０ｍｇ／ｍＬおよび１２０ｍｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ（２０μＬ）で処理し、続いて、冷ＰＢＳ（１ｍＬ）で２回すすぎ、遠心分離（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、１分）した。ｆＨｅｐ（ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ（３０ｍｇ／ｍＬまたは１２０ｍｇ／ｍＬ））を含んだ試料を、４時間グリシン（ＰＢＳ中で１８ｍｇ／ｍＬ）と反応させ、続いて、スピンカラムでの精製によって溶液中の遊離ｆＨｅｐの細胞毒性アルデヒド基を不活性化した。細胞ペレットを、ＲＴで１０分間Ａｌｅｘａ４８８－ＡＴ（４ｍｇ／ｍＬ）で処理し、続いて、１ｍＬの冷ＰＢＳで１回すすぎ、遠心分離（Ｆｏｒｃｅ ｍｉｎｉ ＳＢＣ１４０－１１５、１分）した。得られた細胞ペレットを５００μＬのＰＢＳに懸濁し、細胞の生存率を、トリパンブルーおよびセルカウンター（ｃｏｕｎｔｅｓｓＩＩ、インビトロジェン）を使用して評価した。それらの処理済み細胞を、ＣＬＳＭ（ＬＳＭ８００、カール・ツァイス）を使用して評価し、また、細胞を、フローサイトメトリ（ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ、ＢＤバイオサイエンス）により分析した。
ヒト全血を使用する血液試験
ｈＭＳＣを、チャンドラーループモデルを使用してヒト全血に曝露して［６］、ｆＨｅｐ－脂質で処理されたｈＭＳＣの表面の抗血栓特性を評価した。血液試験に使用したｈＭＳＣの継代数は６～８であった。ｈＭＳＣ（１ｍＬ、ＰＢＳ中で１．０×１０６細胞／ｍＬ）を、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質およびＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質（４０μＬ、ＰＢＳ中で１０ｍｇ／ｍＬ、各試料について）で処理し、２回すすいで遊離ｆＨｅｐ－脂質を除去した。細胞の生存率および濃度を、トリパンブルーおよびセルカウンター（ｃｏｕｎｔｅｓｓＩＩ、インビトロジェン）を使用して評価し、細胞濃度を、２．５×１０６細胞／ｍＬまたは２．５×１０５細胞／ｍＬに調整した。ポリウレタンチューブ（φ６．３ｍｍ、４０ｃｍ）およびポリプロピレンコネクタ（φ６．５ｍｍ、株式会社アイシス、大阪、日本）で製造されたループを、２４時間ＭＣＰポリマー（２ｍＬ、ＥｔＯＨ中で５ｍｇ／ｍＬ）でコートし、続いて、表面誘導血液活性化を防止するために空気中で２４時間乾燥させた。ヒト全血を、献血の少なくとも１４日前に薬物治療（meditation）を受けていない健康なドナーから真空管（７ｍＬ、非処理、テルモ株式会社）に採取した。採血の直後に、ＵＦＨ（２．５μＬ／１ｍＬ血液、ＰＢＳ中で２００ＩＵ／ｍＬ）を血液と混合した。その後、ヒト全血（２．５ｍＬ、０．５ＩＵ／ｍＬのＵＦＨを有する）を、ＭＰＣポリマーコートされたループに添加し、続いて、１００μＬのＰＢＳ中のｈＭＳＣ懸濁液（２．５×１０６細胞／ｍＬまたは２．５×１０５細胞／ｍＬ、処理済みｈＭＳＣまたは非処理ｈＭＳＣ）または対照としてのＰＢＳを、添加した。管を２２ｒｐｍで２時間、３７℃のキャビネット中で回転させた。各ループからの採血（１ｍＬ）を１時間および２時間で実行し、ＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ）と混合した。血小板数を、セルカウンター（ｐｏｃＨ－８０ｉ、シスメックス株式会社、兵庫、日本）を使用して、各試料について測定した。その後、血液試料を遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ３０１、２，６００ｇ、１５分、４℃）し、各試料の血漿を収集し、ＴＡＴ、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９についての酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のために－８０℃の冷凍庫で保存した。実験は、東京大学の倫理委員会により承認された。
血漿中のＴＡＴ、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９の測定
血漿中のＴＡＴ、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９を、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、血漿を希釈緩衝液（０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ）で希釈した。血漿中のＣ３ａを、９６ウェルプレートにプレコートされている抗ヒトＣ３ａ ｍＡｂ ４ＳＤ１７．３により捕捉し、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗Ｃ３ａ抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－共役ストレプトアビジンにより検出した。ＴＭＢを固定ＨＲＰと反応させ（１５分間）、反応を１ＭのＨ２ＳＯ４ａｑ．で停止した。最後に、４５０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＡＤ２００、ベックマン・コールター、マイアミ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して検出した。精製Ｃ３ａに対して較正されたザイモサン活性化血清を、標準として使用した。ｓＣ５ｂ－９についてのＥＬＩＳＡは、Ｃ３ａ測定と同じ方法で実証された。最初に血漿を希釈緩衝液で希釈した。その後、血漿中のｓＣ５ｂ－９を、９６ウェルプレートにプレコートされている抗ｎｅｏＣ９ ｍＡｂ ａＥ１１（Ｄｉａｔｅｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ ＡＳ、オスロ、ノルウェー）により捕捉し、抗ヒトＣ５ポリクローナルウサギ抗体（Ｄａｋｏ）およびＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で検出した。ＴＭＢを固定ＨＲＰと反応させ（１５分）、反応を１ＭのＨ２ＳＯ４ａｑ．で停止し、続いて、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ザイモサン活性化血清を、標準として使用した。
ＴＡＴを、会社の指示書にしたがいＥＬＩＳＡキット（ヒトトロンビン－アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）ＡｓｓａｙＭａｘ ＥＬＩＳＡキット、Ａｓｓａｙｐｒｏ、セントチャールズ、ＭＯ、ＵＳＡ）により測定した。簡潔に述べると、血漿を希釈剤で希釈した。その後、ＴＡＴを、９６ウェルプレートにプレコートされているヒトアンチトロンビンに対するモノクローナル抗体により捕捉し、ヒトトロンビンに対するビオチン化ポリクローナル抗体、次いで、ＨＲＰ共役ストレプトアビジンで検出した。ペルオキシダーゼ色原体基質であるテトラメチルベンジジンを、２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸溶液で停止し、続いて、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ヒトＴＡＴ複合体を、標準として使用した。
結果
ｈＭＳＣの表面を、高ＡＴ結合能力および低ＡＴ結合能力を有するｆＨｅｐ－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質で修飾して、ヒト全血における抗血栓特性を比較した。ｈＭＳＣ膜上でのＡｌｅｘａ４８８－ＡＴからの強力な蛍光が、ｈＭＳＣをｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質で処理した場合に観察されたが、蛍光は、それらの細胞をＫｎＣ－ＰＥＧ脂質（ｎ＝１および８）、ｆＨｅｐおよびＰＢＳで処理した場合、細胞膜上で観察されず（図１９Ａ）、ｆＨｅｐ（－）－脂質がｈＭＳＣ表面に固定されていることを示唆した。フローサイトメトリ分析は、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ－脂質処理済みｈＭＳＣが、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ－脂質処理済みｈＭＳＣよりもＡｌｅｘａ４８８－ＡＴの多くの結合を有したことを示した（図１９Ｂ）。これはおそらく、ＡＴ結合が、ｈＭＳＣ表面上のｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質の高度に充填されたｆＨｅｐのためにｈＭＳＣ表面上のｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質で阻害され、外因性ＡＴがｆＨｅｐに完全にアクセスできなかったためであった。処理済みｈＭＳＣの生存率は、約８０％であり、これは対照群（ＵＦＨ処理済み細胞、ＰＢＳ処理済み細胞および非処理細胞）と類似であり、ｆＨｅｐ（－）－脂質修飾の非細胞毒性を示唆した（図１９Ｃ）。高い蛍光強度が、Ｋ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質処理済み細胞で観察された（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。それらの細胞が、カチオン特性のためＫ８Ｃ－ＰＥＧ－脂質修飾により破壊され、Ａｌｅｘａ４８８－ＡＴの摂取をもたらしたことが認められた。
次に、我々は、ヒト全血を、１．０×１０４細胞／ｍＬ（図２０Ａ～図２０Ｄ）または１．０×１０５細胞／ｍＬ（図１９Ｄ～図１９Ｇ）の濃度でｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質、ｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質またはＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質で処理されたｈＭＳＣとインキュベートした。ここで、非処理ｈＭＳＣおよびＰＥＧを対照として使用した。
図１９Ｄは、１時間および２時間での血中の血小板数を示す。ＰＢＳを血液に添加した場合、血小板の減少はほとんどなかった。また、血小板数は、ｈＭＳＣを添加した場合、経時的に減少し、ｈＭＳＣからのＴＦが血小板凝集を誘導したことを示唆した。同じ結果が、Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質－修飾ｈＭＳＣで観察された。ＰＥＧ層の末端での正電荷Ｋ１Ｃが、血小板活性化を誘導し、そのため、血小板が実際に凝集したように見える。他方で、ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質およびｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質で処理されたｈＭＳＣの場合、血小板数がわずかに減少するが、残りの血小板は、非修飾ｈＭＳＣの対照群よりも非常に多く、ｆＨｅｐ－脂質での表面修飾が血小板活性化を弱めることができたことを示唆した。ｆＨｅｐ－Ｋ１Ｃ（－）－脂質－修飾ｈＭＳＣとｆＨｅｐ－Ｋ８Ｃ（－）－脂質修飾ｈＭＳＣの間で血小板数における明らかな差異はなかった。ｈＭＳＣ濃度が１．０×１０４細胞／ｍＬであった場合、より高い細胞濃度で確認されるのと同様の傾向を確認できたが、血小板数に明らかな差異はなかった（図２０Ａ）。
我々は、処理済みｈＭＳＣ（［ｈＭＳＣ］＝図２０Ｂについては１．０×１０４細胞／ｍＬおよび図１９Ｅについては１．０×１０５細胞／ｍＬ）との２時間のインキュベーション中のＴＡＴ、凝集マーカーのレベルを評価した。Ｋ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質で修飾されたｈＭＳＣおよび非処理ｈＭＳＣについて経時的にＴＡＴレベルの大きな増加があった一方で、ｆＨｅｐ－脂質で修飾されたｈＭＳＣおよびＰＢＳ添加血液について、わずかな増加があった。この結果は、１．０×１０５細胞／ｍＬのｈＭＳＣの血液中で顕著であった。非処理ｈＭＳＣ群またはＫ１Ｃ－ＰＥＧ－脂質修飾ｈＭＳＣと各ｆＨｅｐ－脂質修飾ｈＭＳＣの間で有意差があった（図１９Ｅ）。ＰＢＳ混合血液と各ｆＨｅｐ－脂質修飾ｈＭＳＣ混合血液の間で有意差は確認されなかった。これらの結果は、ｈＭＳＣ表面上のｆＨｅｐ－脂質が凝集活性化を抑制できたことを示唆した。
加えて、我々は、処理済みｈＭＳＣ（［ｈＭＳＣ］＝図２０Ｃ、図２０Ｄについては１．０×１０４細胞／ｍＬおよび図１９Ｆ、図１９Ｇについては１．０×１０５細胞／ｍＬ）との２時間のインキュベーション中のＣ３ａおよびｓＣ５ｂ－９、補体マーカーの生成を評価した。基本的に、両方のマーカーのレベルは、経時的に増加した。しかし、群間のレベルにおける差異はなかった。我々は、ｆＨｅｐ－脂質での細胞表面修飾による補体活性化に対する影響をいずれも確認できなかった。
上述した実施形態は、本発明の数個の例示的な例として理解されるべきである。本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に対して種々の修正、組み合わせおよび変更がなされ得ることは、当業者により理解される。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策は、技術的に可能である他の構成において組み合わせることができる。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。
参考文献
Figure 2023513656000006

Claims (27)

  1. ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を生産する方法であって、
    シッフ塩基中間体を形成するために、少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む硫酸化グリコサミのグリカンと少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質を混合すること；および
    硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成するために前記シッフ塩基中間体に還元剤を添加すること
    を含む、方法。
  2. 少なくとも１つのアミノ基を含む前記カチオン－ＰＥＧ－脂質を形成するためにＫｎＣおよび／またはＣＫｎをマレイミド共役ＰＥＧ－脂質と混合することをさらに含み、Ｃが、システインであり、Ｋが、リジンでありかつｎが、０または２０以下の正の整数、好ましくは０または１５以下の正の整数、およびより好ましくは０または１０以下の正の整数である、請求項１に記載の方法。
  3. ジクロロメタン中でα－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－マレイミジルＰＥＧ（ＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ）、トリエチルアミンおよび１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を混合すること；ならびに
    ジクロロメタン中でＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｍａｌ、トリエチルアミンおよびＤＰＰＥの前記混合物にジエチルエーテルを添加することにより前記マレイミド共役ＰＥＧ－脂質を沈殿させること
    をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記硫酸化グリコサミノグリカンが、少なくとも１つのカルボニル基を含む断片化ヘパリン、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む断片化ヘパリンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 混合溶液を形成するために酸性溶液および亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）水溶液を混合すること；
    前記混合溶液の前記ｐＨを２～最大で６、好ましくは３～最大で５の区間内、より好ましくは４に調節すること；
    ヘパリン溶液を形成するために前記混合溶液にヘパリン、好ましくはヘパリンナトリウムを添加すること；
    少なくとも１つのカルボニル基を含む前記断片化ヘパリンを形成するために前記ヘパリン溶液の前記ｐＨを６～８、好ましくは６．５～７．５の区間内、より好ましくは７に調節すること；ならびに
    任意で少なくとも１つのカルボニル基を含む前記断片化ヘパリンを水に対し透析することおよび少なくとも１つのカルボニル基を含む前記断片化ヘパリンを凍結乾燥すること
    をさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記還元剤を添加することが、前記硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質を形成するために前記シッフ塩基中間体にシアノ水素化ほう素ナトリウム（sodium cyanoboronhydride）を添加することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質中の任意の未反応アミノ基をカルボン酸基に変換することをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質中の任意の未反応アミノ基をカルボン酸基に変換するために前記硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質に酸無水物を添加することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 還元剤の添加により還元されるシッフ塩基中間体を形成するために、少なくとも１つのアミノ基を含むカチオン－ＰＥＧ－脂質のアミノ基と少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基、好ましくはアルデヒド基の間に形成される結合を介してＰＥＧ－脂質に付着さた少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンを含むポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  10. 前記少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンおよび前記ＰＥＧ－脂質を相互接続するＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結を含み、Ｃが、システインであり、Ｋが、リジンでありかつｎが、０または２０以下の正の整数であり、好ましくはｎが、０～１５の前記区間内で選択され、かつより好ましくはｎが、０～１０の前記区間内で選択される、請求項９に記載のＰＥＧ－脂質。
  11. 前記硫酸化グリコサミノグリカンが、前記ＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結中の任意のリジン残基のアミノ基または前記ＫｎＣおよび／またはＣＫｎ連結中のＮ末端アミンおよび少なくとも１つのカルボニル基、好ましくは少なくとも１つのアルデヒド基を含む前記少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカンのカルボニル基、好ましくはアルデヒド基の間に形成される結合を介して前記ＰＥＧ－脂質に付着される、請求項１０に記載のＰＥＧ－脂質。
  12. 前記硫酸化グリコサミノグリカンが、断片化ヘパリンである、請求項９～１１のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質。
  13. 前記断片化ヘパリンが、２．５ｋＤａ～１５ｋＤａの前記区間内、好ましくは５ｋＤａ～１０ｋＤａの前記区間内で選択される重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１２に記載のＰＥＧ－脂質。
  14. 前記硫酸化グリコサミノグリカン－ＰＥＧ－脂質中の任意の遊離アミノ基が、カルボン酸基に変換される、請求項９～１３のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質。
  15. アンチトロンビンおよび因子Ｈに対する親和性を有する、請求項９～１４のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質。
  16. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を含む生物学的組織であって、前記少なくとも１つのＰＥＧ－脂質が、前記生物学的組織の細胞膜中に固定される、生物学的組織。
  17. ランゲルハンス島、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内皮細胞、ベータ細胞、赤血球、肝細胞、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、肺、子宮、膀胱、胸腺、腸および脾臓からなる群より選択される、請求項１６に記載の生物学的組織。
  18. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を含むリポソームであって、前記少なくとも１つのＰＥＧ－脂質が、前記リポソームの脂質二重層中に固定される、リポソーム。
  19. 医薬品としての使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  20. 血栓炎症の処置における使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  21. 瞬時の血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の処置における使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  22. 虚血再灌流障害（ＩＲＩ）の処置における使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  23. 脳卒中の処置における使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  24. 心筋梗塞の処置における使用のための請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）。
  25. 硫酸化グリコサミノグリカンコーティングを有する生物学的組織を提供するインビトロ方法であって、前記生物学的組織の細胞膜中に前記ＰＥＧ－脂質を固定するために請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を前記生物学的組織にインビトロで添加することを含む、インビトロ方法。
  26. 臓器または臓器の一部を処置するエクスビボ方法であって、
    前記臓器または前記臓器の前記一部の血管系中に請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ－脂質）を含む溶液をエクスビボ注入すること；および
    請求項９～１５のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質での前記血管系の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするために前記血管系中で請求項９～１５のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質を含む前記溶液をエクスビボインキュベートすること
    を含む、方法。
  27. エクスビボインキュベートすることが、好ましくは請求項９～１５のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質を含む臓器保存溶液中に前記臓器または前記臓器の前記一部を浸漬しておきながら請求項９～１５のいずれか一項に記載の前記ＰＥＧ－脂質での前記血管系の前記内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするために前記血管系中で請求項９～１５のいずれか一項に記載のＰＥＧ－脂質を含む前記溶液をエクスビボインキュベートすることを含む、請求項２６に記載のエクスビボ方法。
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