CN114761043A - Peg-脂质 - Google Patents

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Abstract

通过将包含至少一个氨基的阳离子‑PEG‑脂质与包含至少一个羰基的硫酸化糖胺聚糖混合以形成席夫碱中间体来产生PEG‑脂质。向所述席夫碱中间体中添加还原剂以形成硫酸化糖胺聚糖‑PEG‑脂质。硫酸化糖胺聚糖‑PEG‑脂质可以用于生物组织对抗血栓炎症。用所述硫酸化糖胺聚糖‑PEG‑脂质包被生物组织可以在单步骤过程中完成，并且不会引起任何显著的细胞聚集。

Description

PEG-脂质
技术领域
本发明总体上涉及聚(乙二醇)(PEG)脂质，特别是包含硫酸化糖胺聚糖的此类PEG-脂质，及其生产和医学用途。
背景技术
尽管在例如胰岛、间充质干细胞(MSC)或肝细胞的细胞移植后没有报道严重的副作用，但这些治疗性细胞的生物不相容性仍未解决。将治疗性细胞输注到人体中与称为血栓炎症或即时血液介导的炎症反应(IBMIR)的免疫反应导致的经移植细胞的大量损失相关。血栓炎症，或IBMIR，是一种由补体和凝血系统触发的先天性免疫攻击，随后是血小板的快速结合和白细胞向凝块的渗透，从而导致经移植细胞的早期损失。另外，血栓炎症反应发生在实体器官移植(如肾脏和心脏移植)中的缺血再灌注损伤(IRI)中。这种毁灭性的反应破坏移植后的组织和器官，从而降低移植物的存活。
因此，为了实现成功的治疗以及治疗性细胞和实体器官的高水平植入，保护细胞表面免受这种血栓炎症攻击是至关重要的。
一些研究已经表明，可以经由全身施用抗凝血剂(如凝血酶抑制剂、美拉加群、低分子量硫酸葡聚糖和/或补体抑制剂)来调节血栓炎症，以防止早期不利反应。然而，由于相关的出血风险增加，这些技术中的一些难以在临床环境中应用。
硫酸乙酰肝素在内皮细胞表面上表达，并在调节凝血以及补体和血小板激活方面起重要作用。因此，通过用肝素和肝素缀合物进行表面修饰来模拟内皮表面已被建议作为调节细胞和器官移植中发生的血栓炎症的方法[1-3]。然而，用肝素和肝素缀合物进行表面修饰需要几个工艺步骤；细胞表面的化学修饰和与肝素的反应，其中每个步骤后都需要洗涤过程。与用肝素和肝素缀合物进行表面修饰相关的另一个问题是与肝素反应后的细胞聚集。肝素分子还在细胞间交联，从而导致细胞凝聚(cell clumping)。
因此，需要可以用于保护生物组织对抗血栓炎症且没有现有技术解决方案相关缺点的化合物。
发明内容
总的目的是提供用于保护生物组织对抗血栓炎症且没有与现有技术解决方案相关的至少一些缺点的分子。
通过如本文所限定的本发明满足了这个目的和其他目的。
本发明在独立权利要求中限定。本发明另外的实施方案在从属权利要求中限定。
本发明的一个方面涉及一种产生聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)的方法。所述方法包括将包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质与包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的硫酸化糖胺聚糖混合，以形成席夫碱中间体。所述方法还包括向席夫碱中间体中添加还原剂以形成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。
本发明的另一方面涉及一种包含至少一种硫酸化糖胺聚糖的PEG-脂质，所述硫酸化糖胺聚糖经由在包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质的氨基和包含至少一个羰基的至少一种硫酸化糖胺聚糖的羰基之间形成的键与PEG-脂质连接，以形成被还原剂还原的席夫碱中间体。
本发明的其他方面涉及一种生物组织，其包含锚定在生物组织细胞膜中的至少一种这样的PEG-脂质；以及一种脂质体，其包含锚定在脂质体的脂质双层中的至少一种这样的PEG-脂质。
本发明的方面还定义了用作药物、用于治疗血栓炎症、用于治疗即时血液介导的反应(IBMIR)、用于治疗缺血再灌注损伤(IRI)、用于治疗中风和用于治疗心肌梗塞的根据本发明的PEG-脂质。
本发明的另一方面涉及一种为生物组织提供硫酸化糖胺聚糖包衣的体外方法。所述体外方法包括将根据本发明的体外PEG-脂质添加到生物组织中，以将PEG-脂质锚定在生物组织的细胞膜中。
本发明的其他方面限定了一种处理器官或器官的一部分的离体方法。所述方法包括将包含根据本发明的PEG-脂质的溶液离体输注到器官或器官的一部分的脉管系统中。所述方法还包括在脉管系统中离体孵育包含根据本发明的PEG-脂质的溶液，以实现用根据本发明的PEG-脂质包被脉管系统的内皮衬里的至少一部分。
本发明的PEG-脂质可以用于通过单步骤程序包被脂质膜结构，如细胞和脂质体。此外，脂质膜结构的这种包衣不会引起细胞或脂质体的任何显著聚集或凝聚。由此，本发明的PEG-脂质可以用于保护生物组织对抗血栓炎症，但没有与现有技术解决方案相关的缺点。
附图说明
可以通过参考以下结合附图的描述来最佳地理解实施方案以及它的其他目的和优点，在附图中：
图1是肝素缀合的PEG-脂质(fHep-脂质)的示意图。fHep-脂质：fHep-C-脂质、fHep-K1C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K4C-脂质和fHep-K8C-脂质。
图2示意性地示出了fHep-脂质的合成。(A)Mal-PEG-脂质与C、K1C、K2C、K4C或K8C反应，随后与片段化肝素(fHep)缀合。(B)将未分级肝素(UFH)片段化成片段化肝素(fHep)。(C)fHep-KnC-脂质(n＝0、1、2、4、8)。
图3是示出fHep和肝素在260nm处的吸光度的图(N＝3)。
图4是示出(A)通过凝胶渗透色谱(GPC)进行的分子量分析(对于片段化肝素(fHep)N＝9，对于未分级肝素N＝8)和(B)fHep和未分级肝素的抗因子Xa活性(N＝4)的图。
图5是示出fHep-脂质(N＝3)的(A)大小和(B)ζ电势的图。
图6示出了对fHep-脂质的抗凝血酶(AT)结合活性的基于带耗散监测的石英晶体微量天平(QCM-D)的分析。
图7是示出AT与fHep-脂质和阳离子-PEG-脂质的结合量的定量分析的图(N＝3)。
图8示出了对fHep(-)-脂质的AT结合活性的基于QCM-D的分析。
图9是示出AT和牛血清白蛋白(BSA)与fHep(-)-脂质的结合量的定量分析的图(N＝3)。
图10示出了对fHep(-)-脂质的因子H结合活性的基于QCM-D的分析。
图11是示出(A)因子H和AT与fHep(-)-脂质和Mal-PEG-脂质的结合量的定量分析(N＝3)和(B)固定化因子H与fHep(-)-脂质和Mal-PEG-脂质的经计算摩尔比(N＝3)的图。
图12是示出fHep-脂质修饰的脂质体的抗因子Xa活性的图(N＝3)。
图13是示出fHep-脂质修饰的脂质体的大小的图(N＝3)。
图14是示出fHep-脂质修饰的脂质体的多分散指数(PDI)的图(N＝3)。
图15是示出fHep-脂质修饰的脂质体的ζ电势的图(N＝3)。
图16示出了用fHep(-)-脂质、K1C-PEG-脂质和fHep处理的人红细胞表面上AT(Alexa488标记的)的荧光图像。
图17是示出通过流式细胞术对用fHep(-)-脂质、K1C-PEG-脂质和fHep处理的红细胞表面上AT(Alexa488标记的)的结合量进行定量分析的图。
图18是示出fHep-脂质修饰的CCRF-CEM细胞的抗因子Xa活性的图(*：p<0.05，N＝3)。
图19示出了用fHep-脂质修饰hMSC对血液相容性的影响。(A)用fHep-脂质和Alexa488标记的AT处理的hMSC的共聚焦图像。这里fHep-脂质是fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质。比例尺：40μm(B)通过流式细胞术对经修饰的hMSC上AT结合的定量分析。误差条表示标准偏差(N＝5)。(C)通过台盼蓝排除法对经修饰的hMSC进行生存力测定。误差条表示标准偏差(N＝5)。(E)-(G)人全血中经修饰的hMSC的环模型测定。在37℃下，以1.0×105个细胞/mL将经修饰的hMSC在人全血(0.5IU/mL UFH)中孵育2小时。这里，hMSC用fHep-KnC(-)-脂质(n＝1和8)和K1C-PEG-脂质修饰。将添加PBS的全血和未处理的hMSC用作对照。所述图示出了(D)相对血小板计数和(E)TAT、(F)C3a和(G)sC5b-9的产生。误差条表示标准偏差(N＝6)。
图20示出了人全血中经修饰的hMSC的环模型测定。在37℃下，以1.0×104个细胞/mL将经修饰的hMSC在人全血(0.5IU/mL UFH)中孵育2小时。这里，hMSC用fHep-KnC(-)-脂质(n＝1和8)和K1C-PEG-脂质修饰。将添加PBS的全血和未处理的hMSC用作对照。所述图示出了(A)相对血小板计数和(B)TAT、(C)C3a和(D)sC5b-9的产生。误差条表示标准偏差(N＝6)。
具体实施方式
本发明总体上涉及聚(乙二醇)(PEG)脂质，特别是包含硫酸化糖胺聚糖的此类PEG-脂质，及其生产和医学用途。
本发明的PEG-脂质可用于细胞和器官移植物的表面修饰，以模拟内皮表面，从而保护此类细胞和器官移植物对抗血栓炎症。与使用肝素和肝素缀合物的现有技术方法相比，PEG-脂质具有几个优点。首先，用本发明的PEG-脂质进行表面修饰可以在单步骤中进行，而不需要对细胞表面进行任何化学修饰。这意味着与现有技术相比，用PEG-脂质进行细胞或器官移植物的表面修饰过程可以更容易地进行，现有技术需要几个过程步骤，包括细胞表面的化学修饰，这可能对细胞造成不利影响。其次，当与细胞连接时，本发明的PEG-脂质不会交联。由此，PEG-脂质不会因现有技术的缺点而受损，现有技术的缺点会在与肝素或肝素缀合物反应后导致细胞凝聚和聚集。
因此，本发明的PEG-脂质可用于保护生物组织，包括细胞和器官移植物，对抗血栓炎症。
本发明的一个方面涉及一种产生PEG-脂质的方法。所述方法包括将包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质与包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的硫酸化糖胺聚糖混合，以形成席夫碱中间体。所述方法还包括向席夫碱中间体中添加还原剂以形成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。
糖胺聚糖-PEG-脂质由席夫碱化学形成，包括亲核加成形成半缩醛胺，随后脱水生成席夫碱中间体。此反应中的起始材料是包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质。这种至少一个氨基与硫酸化糖胺聚糖的至少一个羰基，优选至少一个醛基反应，以形成席夫碱中间体(硫酸化糖胺聚糖和阳离子-PEG-脂质之间的C＝N键)，通过添加还原剂将其还原，以形成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质，其中硫酸化糖胺聚糖通过C-N键与PEG-脂质连接。
因此，硫酸化糖胺聚糖通过共价键，更详细地说，是硫酸化糖胺聚糖的羰基(优选醛基)中的C和阳离子-PEG-脂质的氨基中的N之间的共价键(即C-N键)与阳离子-PEG-脂质连接。
包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质可以是包含至少一个氨基的任何PEG-脂质，包括PEG-磷脂。
PEG-脂质可以具有式(II)的通用结构，相应的PEG-磷脂根据式(III)的通用结构，其中R1和R2代表分子的脂质部分。
Figure BDA0003647863040000061
在一个实施方案中，式(II)和(III)中的Y选自H、CH3、马来酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
如本文所用的PEG-脂质包括PEG和至少一种脂质(包括脂肪酸、磷脂、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇、异戊二烯醇、糖脂和聚酮化合物)之间的任何缀合物。在优选的实施方案中，选择能够锚定在脂质层中，如在生物材料的细胞膜中的PEG-脂质。目前优选的PEG-脂质是PEG-磷脂。
优选地将至少一个氨基引入PEG-脂质中，以形成阳离子-PEG-脂质，其通过马来酰亚胺缀合的PEG-脂质与半胱氨酸肽反应而形成。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括将马来酰亚胺缀合的PEG-脂质与至少一种半胱氨酸肽混合以形成包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质的另外步骤。在一个实施方案中，至少一种半胱氨酸肽可以是至少一种KnC肽、至少一种CKn肽或其组合，其中C是半胱氨酸，K是赖氨酸，并且n是零或者等于或小于20，优选地等于或小于15，更优选地等于或小于10，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的正整数。
如果在KnC或CKn肽中n＝0，则阳离子-PEG-脂质将包含单个氨基。KnC或CKn肽中的每个赖氨酸给阳离子-PEG-脂质添加一个氨基，因此包含n+1个氨基。
在一个实施方案中，马来酰亚胺缀合的PEG-脂质通过在二氯甲烷中混合α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-马来酰亚胺基PEG(NHS-PEG-Mal)、三乙胺和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)形成。然后通过向NHS-PEG-Mal、三乙胺和DPPE在二氯甲烷中的混合物中添加乙醚来沉淀马来酰亚胺缀合的PEG-脂质。
硫酸化糖胺聚糖包含至少一个羰基。目前优选的羰基是醛基(-CHO)。然而，本发明不限于此，而是还包括包含至少一个醛基、至少一个酮(-C(＝O)-)、至少一个羧基(-C(＝O)OH)、至少一个羧酸酯基(-C(＝O)O-)和/或至少一个酰胺基(-C(＝O)NR-或–C(＝O)NH-)的硫酸化糖胺聚糖。硫酸化糖胺聚糖可以包含单个羰基，如单个醛基，或多个，即至少两个羰基，如多个醛基。
糖胺聚糖(GAG)是包含重复二糖单位，即多个二糖单位的长线性多糖。最常见的重复单元包括氨基糖，例如N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺，以及糖醛酸糖，例如葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸，或半乳糖。在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白和透明质酸。
目前优选的硫酸化糖胺聚糖是包含至少一个羰基的肝素，优选包含至少一个醛基的肝素。在特定的实施方案中，硫酸化糖胺聚糖是包含至少一个羰基的片段化肝素(fHep)，优选包含至少一个醛基的片段化肝素。
肝素的这种片段化向肝素分子中引入了羰基，优选醛基。此外，与未分级肝素(UFH)相比，片段化减少了肝素链的长度，从而降低了分子量。
在一个实施方案中，片段化反应包括将酸性溶液和亚硝酸钠(NaNO2)水溶液混合，以形成混合溶液。混合溶液的pH在2至6，优选3至5，更优选4的区间内调节。向混合溶液中添加肝素，优选地为肝素钠的形式，以形成肝素溶液。肝素溶液的pH在6至8、优选6.5至7.5更优选至7的区间内调节，以形成包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的片段化肝素。片段化反应可以任选地包括对水透析包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的片段化肝素，并冻干包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的片段化肝素。
酸性溶液优选地选自硫酸(H2SO4)溶液或乙酸(CH3COOH)溶液，优选硫酸(H2SO4)溶液。
在一个实施方案中，添加还原剂包括向席夫碱中间体中添加氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，以形成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。因此，在优选的实施方案中，还原剂是氰基硼氢化钠。然而，实施方案不限于此。可以替代地或另外地使用除氰基硼氢化钠之外的其他还原剂，包括例如三乙酰氧基硼氢化钠和硼氢化钠。
图2A示意性地示出了fHep-脂质合成的实例。Mal-PEG-脂质与C肽(n＝0)、K1C肽(n＝1)、K2C肽(n＝2)、K4C肽(n＝4)或K8C肽(n＝8)反应，随后与包含醛基的fHep缀合成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质fHep-KnC-脂质。图2B示出了未分级肝素(UHF)片段化成片段化肝素(fHep)，并且图2C示出了硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质的实施方案。
图1示意性地示出了根据图2A至2C合成的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质(fHep-KnC-脂质)，其锚定在脂质双层膜中。图1还指出了每个fHep-KnC-脂质的fHep分子最大数量，即n+1个fHep分子。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何未反应氨基被转化成羧基。
羧基通常不如氨基活泼。因此，将硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中未反应的氨基转化成羧基使得硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质的细胞毒性更小，因此对细胞的危害更小。另外，由羧基引入的负电荷抑制非特异性蛋白质与表面的结合，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质锚定在所述表面上，参见图9。
在特定的实施方案中，通过向硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中添加酸酐以将硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何未反应氨基转化成羧基，从而将任何此类未反应的氨基转化成羧基。
任何酸酐都可以用于将未反应的氨基转化成羧基。非限制性但例示性的实例包括琥珀酸酐(SA)、戊二酸酐、二甘醇酐及其组合，优选SA。
本发明的另一方面涉及一种包含至少一种硫酸化糖胺聚糖的PEG-脂质。
所述至少一种硫酸化糖胺聚糖经由包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质的氨基和包含至少一个羰基的至少一种硫酸化糖胺聚糖的羰基之间形成的键与PEG-脂质连接，以形成被还原剂还原的席夫碱中间体。
因此，根据本发明，硫酸化糖胺聚糖通过共价键，特别是硫酸化糖胺聚糖的羰基(优选醛基)中的C和阳离子-PEG-脂质的氨基中的N之间的共价键与PEG-脂质连接。碳和氮之间的这种共价键是C-N键。
在一个实施方案中，PEG-脂质包含将至少一种硫酸化糖胺聚糖和PEG-脂质相互连接的KnC和/或CKn连接物。在此实施方案中，C是半胱氨酸，K是赖氨酸，并且n是零或等于或小于20的正整数。在一个实施方案中，n在0至15的区间内，优选地在0至10的区间内选择，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖经由在KnC和/或CKn连接物中的任何赖氨酸残基的氨基或KnC和/或CKn连接物中的N-末端胺和包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的至少一种硫酸化糖胺聚糖的羰基，优选醛基之间形成的键与PEG-脂质连接。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质的PEG-脂质部分具有式(I)
Figure BDA0003647863040000101
在式(I)中，p、q是在10至16的区间内独立地选择的整数，优选地p、q独立地是10、12、14或16，并且更优选地p＝q＝14。m经过选择，使得PEG链的平均分子量在1kDa至40kDa、优选3kDa至10kDa的范围内选择，并且更优选地为5kDa。然后硫酸化糖胺聚糖分子可以在N-末端胺处或者在一个或多个赖氨酸残基的氨基处与根据式(I)的PEG-脂质连接。
如本文所定义的平均分子量指示，各个PEG链的分子量可与此平均分子量不同，但平均分子量表示PEG链的分子量平均值。这进一步意味，PEG链在此平均分子量附近将有分子量的自然分布。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖是片段化肝素。
在一个实施方案中，片段化肝素的重均分子量(Mw)在2.5kDa至15kDa的区间内，优选地在4kDa至10kDa的区间内，如在5kDa至10kDa的区间内，更优选地在5kDa至8kDa的区间内或在7kDa至9kDa的区间内选择。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质不包含任何未反应或游离氨基。在特定的实施方案中，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何未反应或游离氨基被转化成羧基。
如本文所提及的未反应或游离氨基涉及PEG-脂质中的任何N-末端胺和任选地任何赖氨酸残基中的氨基，如式(I)所示，其不与任何硫酸化糖胺聚糖分子结合。
在一个实施方案中，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质可通过如本文所公开的方法获得或已经获得。
本发明的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质对抗凝血酶(AT)(参见图6-10、11A)和因子H(参见图10、11A和11B)具有亲和力。
AT是一种蛋白分子，其使凝血系统的几种酶失活。其活性被抗凝血药肝素提高了许多倍，这增强了AT与因子IIa(凝血酶)和因子Xa(FXa)的结合。这意味着本发明的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质通过能够结合AT而具有抗FXa活性，从而具有凝血抑制作用。
因子H是补体激活家族调节因子的成员，并且是一种补体控制蛋白。其主要功能是调节补体系统的替代途径，从而确保补体系统针对病原体或其他危险物质，并且不损害宿主组织。因子H通过对因子I介导的C3b裂解具有辅因子活性和对替代途径C3-转化酶C3bBb具有衰变加速活性来调节自身细胞和表面的补体激活。因子H对自身细胞和自身表面发挥其保护作用，但对细菌或病毒表面不起作用。这被认为是因子H具有采用活性较低或较高的构象作为C3裂解或衰变加速活性的辅因子的能力的结果。较低活性的构象是溶液中的主要形式，并且足以控制流体相放大。当因子H与通常存在于宿主细胞上但通常不存在于病原体表面上的糖胺聚糖和/或唾液酸结合时，被认为诱导了更活跃的构象，从而确保自身表面受到保护，而补体在外来表面上有增无减。
因此，包含锚定的本发明硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质的细胞表面具有吸引和结合AT和因子H的能力，从而保护细胞表面免于血栓炎症。参见图12、17和18，本发明的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质甚至在与脂质双层膜(如细胞表面或脂质体)连接时也具有这种生物效应。
如本文所提供的实验数据进一步表明，用本发明的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质修饰脂质双层膜不会引起任何聚集或细胞凝聚(这在根据现有技术用肝素修饰细胞表面时是常见的)，参见图13。
本发明还涉及一种脂质层，优选脂质双层，其包含至少一种本发明的硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。在这种情况下，如图1所示，硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质通过PEG-脂质基团与脂质层连接或锚定到其中。例如，本发明涉及一种脂质体，其包含至少一种锚定在脂质体的脂质双层中的根据本发明的PEG-脂质。
本发明的其他方面涉及一种生物组织，其包含至少一种锚定在生物组织细胞膜中的根据本发明的PEG-脂质。
生物组织可以是单个细胞或多个细胞，如干细胞，包括间充质干细胞(MSC)和胚胎干细胞(ESC)；肝细胞；内皮细胞；β细胞(产生胰岛素的细胞)和红细胞作为例示性但非限制性的实例。可替代地，生物组织可以是细胞群，如胰岛。生物组织还可以为组织或器官或其一部分的形式，如肾、心脏、胰腺、肝、肺、子宫、膀胱、胸腺、肠和脾脏。在特定的实施方案中，组织或器官或其一部分的至少一部分脉管系统和任选地实质，可以用至少一种根据本发明的PEG脂质包衣。
本发明的另一方面涉及一种用作药物的根据本发明的PEG-脂质。
本发明的其他方面涉及一种用于治疗血栓炎症、用于治疗即时血液介导的反应(IBMIR)、用于治疗缺血再灌注损伤(IRI)、用于治疗中风和/或用于治疗心肌梗塞的根据本发明的PEG-脂质。
本发明的相关方面定义了根据本发明的PEG-脂质用于制造治疗血栓炎症、IBMIR、IRI、中风和/或心肌梗塞的药物的用途。
本发明的PEG-脂质可以通过全身施用或局部施用而施用至有需要的受试者。全身施用途径的非限制性实例包括静脉内施用和皮下施用。局部施用包括将本发明的PEG-脂质局部注射到受试者的靶器官或组织中。
本发明的PEG-脂质优选地以PEG-脂质溶液的形式施用。包含PEG-脂质分子的溶液可以是例如盐水、缓冲水溶液或器官保存溶液。可以使用的缓冲水溶液的例示性但非限制性的实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和柠檬酸盐溶液。
本发明的另一方面涉及一种为生物组织提供硫酸化糖胺聚糖包衣的体外方法。所述体外方法包括将根据本发明的体外PEG-脂质添加到生物组织中，以将PEG-脂质锚定在生物组织的细胞膜中。
本发明的一个方面涉及一种处理器官或器官的一部分的离体方法。所述方法包括将包含根据本发明的PEG-脂质的溶液离体输注到器官或器官的一部分的脉管系统和任选地实质中。所述方法还包括在脉管系统和任选地实质中离体孵育包含根据本发明的PEG-脂质的溶液，以实现用根据本发明的PEG-脂质包被脉管系统并优选实质的内皮衬里的至少一部分。
在一个实施方案中，离体孵育步骤包括在脉管系统和任选地实质中离体孵育包含根据本发明的PEG-脂质的溶液，以实现用根据本发明的PEG-脂质包被脉管系统并优选实质的内皮衬里的至少一部分，同时保持器官或器官的一部分浸没于器官保存溶液，优选包含根据本发明的PEG-脂质的器官保存溶液中。
因此，离体方法包括将PEG-脂质引入到器官或器官的一部分的脉管系统中，并在其中使PEG-脂质分子与内皮和实质的细胞膜相互作用并结合。图1示意性地示出此原理，其中PEG-脂质分子与脂质双层膜疏水相互作用，从而通过磷脂基团将PEG-脂质分子锚定或连接在细胞膜中。
当将器官或器官的一部分浸入或浸没于器官保存溶液(优选包含PEG-脂质分子的器官保存溶液)中时，PEG-脂质分子与内皮和任选地实质(如在肾脏的情况下，为肾实质)的脂质双层膜之间的相互作用优选地离体发生。
在特定的实施方案中，首先将包含PEG-脂质分子的溶液离体输注到器官或器官的一部分的脉管系统和任选地实质中。在将器官或器官的一部分从供体体内移出和取出之后尽可能早地有利地进行此离体输注。然后将灌注的器官或器官的一部分浸没于优选地包含PEG-脂质的器官保存溶液中并保持在其中，优选地处于降低的温度，如约4℃。
在另一个特定的实施方案中，首先将器官或器官的一部分浸没于优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中，然后将包含PEG-脂质分子的溶液离体输注到器官或器官的一部分的脉管系统和任选地实质中。这种离体输注可以在将器官或器官的一部分浸没于优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中的同时进行。可替代地，暂时从器官保存溶液中取出器官或器官的一部分以进行离体输注，然后放回到优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中。
在一个实施方案中，所述方法还包括将器官保存溶液离体输注到脉管系统中，以将未结合PEG-脂质分子从脉管系统冲走。因此，优选地使用器官保存溶液以一个或多个(即，至少两个)洗涤步骤洗去未结合的PEG-脂质分子。
在一个实施方案中，离体输注包含PEG-脂质分子的溶液包括离体夹紧脉管系统的动脉和静脉中的一个。这个实施方案还包括将包含PEG-脂质分子的溶液离体输注到动脉和静脉中的另一个中，以及离体夹紧动脉和静脉中的另一个。
在另一个实施方案中，将具有PEG-脂质分子的溶液输注到器官或器官的一部分的脉管系统的动脉(或静脉)中，直到溶液出现在器官或器官的一部分的静脉(或动脉)处。这证实了，具有PEG-脂质分子的溶液已经填充了脉管系统。此时，将动脉和静脉夹紧。
可以通过静脉或通过动脉添加包含PEG-脂质分子的溶液。在特定的实施方案中，将溶液输注到动脉中。在这种特定的实施方案中，然后优选地对脉管系统的静脉进行任选的初始夹紧。
包含PEG-脂质分子的溶液优选地在脉管系统中离体孵育10分钟脂直至48小时的一段时间，以使PEG-脂质分子与内皮的细胞膜疏水相互作用，从而包被器官或器官的一部分的脉管系统的至少一部分。离体孵育优选地进行20分钟至36小时、并且更优选地30分钟至24小时，如30分钟至12小时、至8小时、至4小时或至1小时。
输注到脉管系统中的包含PEG-脂质分子的溶液的量取决于器官的类型和器官的大小(成人相对于儿童)。一般来讲，溶液的体积应足以填充器官的脉管系统。在大多数实际应用中，将5mL至250mL包含PEG-脂质分子的溶液离体输注到脉管系统中。在优选的实施方案中，将5mL至100mL并且优选地5mL至50mL包含PEG-脂质分子的溶液离体输注到脉管系统中。
在一个实施方案中，溶液包含0.25mg/mL至25mg/mL的PEG-脂质分子。在优选的实施方案中，溶液包含0.25mg/mL至10mg/mL、优选地0.25mg/mL至5mg/mL，如2mg/mL的PEG-脂质分子。
上文所述的PEG-脂质分子的浓度也可以用于包含PEG-脂质分子的器官保存溶液。
根据本发明，在脉管系统中离体孵育包含PEG-脂质分子的溶液，同时保持器官或器官的一部分浸入或浸没于优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中。另外，器官或器官的一部分也优选地保持在高于0℃但低于8℃、优选地高于0℃但等于或低于6℃并且更优选高于0℃但等于或低于4℃的温度。
在此实施方案中，在孵育时间期间，当使PEG-脂质分子与脉管系统中的内皮的细胞膜相互作用并结合时，将器官或器官的一部分浸没于优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中。器官或器官的一部分优选地也保持冷，即在接近但高于0℃的温度下。已经显示，器官保存的理论完美温度为4℃-8℃。较高的温度由于新陈代谢未有效降低而导致器官的缺氧损伤，而温度低于4℃则增加伴随蛋白质变性的冷损伤的风险。
目前，在临床器官移植中供体器官保存的黄金标准使用三个塑料袋和一个冰盒。第一个塑料袋包括浸没在器官保存溶液中的器官本身。将第一个塑料袋放入填充有盐水的第二个塑料袋中，然后将这两个塑料袋放入填充有盐水的第三个塑料袋中，然后将其放入冰盒中。用于将器官保持在温度受控环境中的更先进的器官保存装置是可获得的并且可以使用，例如来自Paragonix Technologies,Inc.的Sherpa PakTM运输系统、来自WatersMedical Systems的Waves、来自Organ Recovery systems的LifePort运输器等。
包含PEG-脂质分子的溶液可以是盐水、缓冲水溶液或器官保存溶液。
可以使用的缓冲水溶液的例示性但非限制性的实例包括PBS和柠檬酸盐溶液。
可以用于输注PEG-脂质分子和/或在离体输注PEG-脂质分子之前或之后洗涤器官或器官的一部分的脉管系统并且/或者可以浸没器官或器官的一部分的器官保存溶液可以选自已知的器官保存溶液。此类器官保存溶液的例示性但非限制性的实例包括：组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(HTK)溶液、柠檬酸盐溶液、威斯康星大学(University of Wisconsin；UW)溶液、Collins溶液、Celsior溶液、京都大学(Kyoto University)溶液和InstitutGeorges Lopez-1(IGL-1)溶液。
所述受试者优选地是人类受试者。然而，本发明也可用于兽医应用，其中受试者是非人类受试者，如非人类哺乳动物，包括但不限于猫、狗、马、牛、兔、猪、绵羊、山羊和豚鼠。
本发明的其他方面涉及一种用于治疗、抑制或预防受试者的血栓炎症、IBMIR、IRI、中风和/或心肌梗塞的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用根据本发明的PEG-脂质。在另一个实施方案中，所述方法包括先前描述的方法步骤：将包含根据本发明的PEG-脂质的溶液离体输注到器官移植物的脉管系统中，并在脉管系统中离体孵育包含PEG-脂质分子的溶液，以实现用PEG-脂质分子包被脉管系统的内皮衬里的至少一部分，任选地但优选地，同时保持器官移植物浸没于优选地包含PEG-脂质分子的器官保存溶液中。
根据本发明的PEG-脂质能够通过模拟正常内皮细胞表面的糖萼而针对血栓炎症进行局部保护。这种方法还可以避免出血的风险，因为与全身施用相比，靶器官中内皮细胞表面的包被需要少量的调节剂。
在一个实施方案中，本发明的PEG-脂质包含肝素，其具有与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HS)相似的功能。由于肝素与HS一样可以与许多调节剂相互作用，因此使用本发明的PEG-脂质获得的fHep-脂质包衣可以调节IRI期间的复杂生物反应，使得其可以容易地应用于临床试验。
现有技术中已经报道了肝素包被的各种方法。肝素与可溶性补体受体1(sCR1)的逐层包被已应用于小鼠胰岛[7]。然而，由于重组sCR1的使用不实用且程序复杂，所述方法不能应用于肾脏的内皮包被。此外，阳离子亲和素已经由静电相互作用用于胰岛的肝素包被[8]。然而，由于亲和素的强抗原性，很难将这种方法用于临床环境。肝素结合肽已经用于通过使用PEG-脂质将肝素固定在细胞表面上[6、9]。然而，这种包被程序仍然需要几个繁琐的过程，这使得用肝素包被实体器官的内皮表面更加困难。
实施例
本实施例示出了肝素缀合的PEG-脂质(fHep-脂质)的生产和表征，其可以通过单步骤方法包被脂质膜结构，如细胞和脂质体。
试剂和材料
在实施例中使用了以下试剂和材料：
肝素钠(UFH，日本大阪的富士胶片和光纯药株式会社(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation,Osaka,Japan))
硫酸(H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)
亚硝酸钠(NaNO2，富士胶片和光纯药株式会社)
5M氢氧化钠(NaOH，富士胶片和光纯药株式会社)
透析膜(Spectra/Por，MWCO：3.5-5kDa，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的雷普里根公司(Repligen Corpolation,Waltham,MA,USA))
氰基硼氢化钠(NaCNBH3，美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich Chemical Co.,St.Louis,MO,USA))
D-PBS(-)(富士胶片和光纯药株式会社)
生物肝素(AT+)(日本东京(Tokyo)的COSMO BIO有限公司)
葡聚糖(Mw：1080Da、9890Da、43500Da、123600Da，西格玛奥德里奇化学公司)
氯化钠(NaCl，富士胶片和光纯药株式会社)
蒸馏水(富士胶片和光纯药株式会社)
二甲基亚砜(DMSO，富士胶片和光纯药株式会社)
α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-马来酰亚胺基聚(乙二醇)(NHS-PEG-Mal，Mw：5000Da，日本东京的NOF公司)
三乙胺(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE，NOF公司)
二氯甲烷(西格玛奥德里奇化学公司)
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH，西格玛奥德里奇化学公司)
l-半胱氨酸(C，Mw＝121.16Da，富士胶片和光纯药株式会社)
赖氨酸-半胱氨酸(K1C，Mw＝249.335Da，日本东京的BEX有限公司)
赖氨酸-赖氨酸-半胱氨酸(K2C，Mw＝377.51Da，BEX有限公司)
赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-半胱氨酸(K4C，Mw＝633.85Da，日本东京的金斯瑞公司(GenScript))
赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-半胱氨酸(K8C，Mw＝1146.54Da，金斯瑞公司)
荧光胺(富士胶片和光纯药株式会社)
甘氨酸(富士胶片和光纯药株式会社)
抗凝血酶(AT，注射用KENKETU NONTHRON 500，日本大阪的武田药品有限公司(Takeda Pharmaceutical Company limited))
1-十二烷硫醇(富士胶片和光纯药株式会社)
胎牛血清白蛋白(BSA，西格玛奥德里奇化学公司)
胆固醇(富士胶片和光纯药株式会社)
二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，MC-6060，NOF公司)
聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-共-甲基丙烯酸正丁酯)(MPC聚合物，由3:7比率的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)结构域组成，日本东京的NOF公司)
聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(
Figure BDA0003647863040000181
20，日本东京的东京化成工业株式会社(TOKYO Chemical Industry Co.,Ltd))
3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，即用型溶液，日本东京的东京化成工业株式会社)
乙醇(99.5％，富士胶片和光纯药株式会社)
柠檬酸一水合物(CAM，富士胶片和光纯药株式会社)
十二烷基硫酸钠(SDS，富士胶片和光纯药株式会社)
胆固醇定量试剂盒(T-Cho E，富士胶片和光纯药株式会社)
二噁烷(脱水)(关东化学株式会社(KANTO CHEMICAL))
琥珀酸酐(SA，富士胶片和光纯药株式会社)
台盼蓝(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))
杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)
胰蛋白酶-EDTA(0.25％，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)
CCRF CEM(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC，美国弗吉尼亚州的马纳萨斯(Manassas,VA,USA))
人类间充质干细胞(hMSC，美国新泽西州莫里斯敦的龙沙公司(Lonza,Morristown,NJ,USA))
辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司(GE healthcare,Chicago,IL,USA))
RPMI 1640培养基(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))
胎牛血清(FBS，赛默飞世尔科技公司)
青霉素-链霉素，液体(P/S青霉素：5000IU/mL，链霉素：5000g/mL，在100mL 0.85％NaCl水溶液中，赛默飞世尔科技公司)
Alexa FluorTM488抗体标记试剂盒(包括试剂盒中的碳酸氢钠和Alexa FluorTM488羧酸、四氟苯基(TFP)酯，赛默飞世尔科技公司)
真空采血管(EDTA-2Na处理的，日本东京的泰尔茂株式会社(TERUMOCorporation))
乙二胺四乙酸溶液(EDTA，0.5M，pH 8.0，英杰公司)
因子H(从人血中提纯)
设备
在实施例中使用了以下设备：
pH计(LAQUA，日本京都的堀场公司(HORIBA,Kyoto,Japan))
Nanodrop-1000(赛默飞世尔科技公司)
Nanodrop-3300(赛默飞世尔科技公司)
带能量耗散的石英晶体微量天平(QCM，瑞典哥德堡的Biolin scientific公司的qsense公司(qsense,Biolin scientific,Gothenburg,Sweden))
凝胶渗透色谱(GPC，LC-2000Plus系列，日本东京的JASCO公司)
Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡的马尔文仪器有限公司(MalvernInstruments Co.,Ltd.,Worcestershire,UK))
板读取器(AD200，美国佛罗里达州迈阿密的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Miami,FL,USA))
细胞计数器(countess，英杰公司)
挤出机(美国亚拉巴马州伯明翰的Avanti Polar Lipids公司(Avanti PolarLipids,Inc.,Birmingham,AL,USA))
离心机(MX301，日本东京的TOMY SEIKO有限公司)
离心机(Force mini SBC 140-115，日本东京的BM EQUIPMENT有限公司)
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，LSM880，德国耶拿的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss,Jena,Germany))
流式细胞仪(FCM，BD LSR II，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BDBiosciences,San Jose,CA,USA))
实施例1-片段化肝素(fHep)的合成和表征
片段化肝素的合成
将硫酸(H2SO4)溶液(1M)和亚硝酸钠(NaNO2)水溶液(7M)混合，并将混合溶液的pH调节至4。将肝素钠溶液(未分级肝素(UFH)，在水中的20mg/mL，3mL)与H2SO4和NaNO2的混合溶液(11mL)在室温(RT，约20-25℃)下混合15分钟。然后，通过添加1M NaOH水溶液(大约4mL)将溶液的pH调节至7。在使用透析膜(3.5-5kDa，Spectra/Por)对MilliQ水透析反应物1天后，将溶液冻干以获得片段化肝素(fHep)。产率是40％
UV光谱
通过紫外-可见分光光度计(Nanodrop 1000，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)测量fHep的溶液(10mg/mL，在PBS中)，以便检查fHep的醛基。
使用GPC测量fHep的分子量
通过GPC测量UFH和fHep的分子量。柱是Shodex SB803HQ(日本东京的昭和电工株式会社(Showa Denko))。洗脱剂是0.1M的NaCl水溶液。流速是0.5mL/分钟，并且柱烘箱的温度是25℃。作为标准试剂，使用葡聚糖(Mw：1080Da、9890Da、43500Da、123600Da)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇化学公司)。
FXa测定检查肝素活性
使用FXa活性测定试剂盒(Biophen肝素(AT+)，COSMO BIO有限公司)评估合成的fHep的抗因子Xa活性。fHep的浓度是0.01mg/mL(在PBS中)，而作为标准品的UFH的浓度是2、1、0.5IU/mL。
结果
因为醛基在260nm处具有吸光度，因此fHep溶液在所述波长处具有吸光度(图3)。如图3所示，原始UFH没有吸光度。结果表明fHep包含醛基。
使用葡聚糖标准品通过GPC计算fHep和肝素的数均分子量(Mn)(图4A)。fHep的Mn＝6.1kDa，而UFH的Mn＝22kDa。结果表明fHep是肝素的片段化。通过因子Xa活性测定测量fHep的活性(图4B)。fHep的活性是原始UFH活性的大约24％。
实施例2-阳离子-PEG-脂质和fHep-脂质的合成和评估
Mal-PEG-脂质的合成
如先前公开的那样进行Mal-PEG-脂质的合成[4]。简言之，将α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-马来酰亚胺基聚(乙二醇)(NHS-PEG-Mal，Mw：5000Da，200mg)、三乙胺(50μL)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE，20mg)溶解在二氯甲烷中，并在室温下搅拌48小时。用乙醚沉淀得到呈白色粉末的Mal-PEG(5k)-脂质(产率：80％)。
阳离子-PEG-脂质的合成
为了在PEG链的末端处引入至少一个胺基，我们将C、K1C、K2C、K4C和K8C与Mal-PEG-脂质缀合，其中每个赖氨酸残基含有一个氨基。将C、K4C和K8C溶解在PBS中，并将K1C和K2C溶解在DMSO中，浓度为10mg/mL(储备溶液)。将每种储备溶液(10mg/mL，对于C为21μL，对于K1C为55μL，对于K2C为83μL，对于K4C为117μL，或对于K8C为217μL)与Mal-PEG(5k)-脂质(10mg/mL，1000μL，在PBS中)混合。将每种所得溶液在室温下旋转24小时产生了以下阳离子-PEG-脂质；C-PEG-脂质、K1C-PEG-脂质、K2C-PEG-脂质、K4C-PEG-脂质和K8C-PEG-脂质，在本文中表示为KnC-PEG-脂质(n：赖氨酸残基的数量)。
fHep-脂质的合成和功能评估
将每种阳离子-PEG-脂质(1mL，10mg/mL，在PBS中)与fHep(对于C-、K1C-、K2C-、K4C-和K8C-PEG-脂质分别为15、30、45、70和120mg)混合，随后添加NaCNBH3溶液(对于C-、K1C-、K2C-、K4C-和K8C-PEG-脂质分别为6、13、18、30和49μL，6.4M，在PBS中)。将混合溶液在室温下搅拌3天(对于K8C-PEG-脂质和K4C-PEG-脂质)或7天(对于K2C-PEG-脂质、K1C-PEG-脂质和C-PEG-脂质)，以获得以下fHep-脂质：fHep-C-脂质、fHep-K1C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K4C-脂质和fHep-K8C-脂质。
在反应后，添加琥珀酸酐(SA)，以将fHep-脂质中未反应的胺基变成羧基。将每种fHep-脂质(1mL，10mg/mL，在PBS中)与SA溶液(对于fHep-C-、fHep-K1C-、fHep-K2C-、fHep-K4C-和fHep-K8C-脂质，分别为33、64、94、151和252μL，在二噁烷中的0.5M)混合，并在室温下搅拌24小时然后，将所得溶液冻干并通过GPC(spin柱，PierceTM聚丙烯酰胺旋转脱盐柱，7K MWCO，0.7mL，赛默飞世尔科技公司)纯化，以获得fHep(-)-脂质：fHep-C(-)-脂质、fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K2C(-)-脂质、fHep-K4C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质。
fHep-脂质直径和表面电荷的测定
使用Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡的马尔文仪器有限公司)，通过动态光散射评估每种阳离子-PEG-脂质(在PBS中的0.5mg/mL)、fHep-脂质(在PBS中的0.5mg/mL)和fHep(在PBS中的4mg/mL)的直径、多分散指数(PDI)和ζ电势(表面电荷)。
fHep-脂质临界胶束浓度(CMC)的测定
将DPH用于测量fHep-脂质的CMC。将fHep-脂质、阳离子-PEG-脂质和Mal-PEG-脂质(1mL，1.0×10-1-1.0×10-7mg/mL，在PBS中)和DPH溶液(2μL，30μM，在THF中)混合，并在37℃下孵育1小时。然后，使用荧光光度计(FP-6600，JASCO公司，Ex：357nm，Em：430nm)测量所得溶液的荧光强度。
使用荧光胺测定胺基的浓度
用PBS(0.5mg/mL)稀释每种阳离子-PEG-脂质和fHep-脂质，并将荧光胺以3mg/mL的浓度溶解在DMSO中。将每种阳离子-PEG-脂质溶液(9μL)或fHep-脂质(9μL)与荧光胺溶液(3μL)在室温下混合15分钟，并通过Nanodrop-3300(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)测量每种所得溶液的吸光度(在481nm处)。使用相同浓度的C、K1C、K2C、K4C和K8C溶液进行相同的实验。将甘氨酸用于校准曲线，以确定胺基浓度。
结果
fHep-脂质的分子设计在图1中示出。多个片段化肝素可以与每个PEG-脂质分子缀合(图2A)。肝素被化学修饰以获得在末端处具有醛基的片段化肝素(fHep，图2B)。然后，通过席夫碱化学将fHep与阳离子NH2-PEG-脂质(阳离子-PEG-脂质)缀合(图2A、2C)。为了引入胺基，使用了C、K1C、K2C、K4C和K8C，它们与Mal-PEG-脂质缀合。产生以下阳离子-PEG-脂质：C-PEG-脂质(一个胺基)、K1C-PEG-脂质(两个胺基)、K2C-PEG-脂质(三个胺基)、K4C-PEG-脂质(五个胺基)、K8C-PEG-脂质(九个胺基)。
fHep通过醛基和胺基之间的席夫碱化学与每种阳离子-PEG-脂质缀合，随后用NaCNBH3还原。通过使用荧光胺测量fHep-脂质的未反应胺基和阳离子-PEG-脂质的胺基，计算出与阳离子-PEG-脂质缀合的fHep的数量。对于fHep-K8C-脂质、fHep-K4C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K1C-脂质和fHep-C-脂质，反应的胺基的百分数分别计算为89％、90％、91％、88％和61％，如下表1中所列出。然后，对于fHep-K8C-脂质、fHep-K4C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K1C-脂质和fHep-C-脂质，与每PEG-脂质缀合的fHep数量分别是8.0、4.5、2.7、1.8和0.6。
表1–每PEG-脂质缀合的fHep数量
Figure BDA0003647863040000231
Figure BDA0003647863040000241
通过DLS测定每种fHep-脂质的胶束大小(图5A)。所有fHep-脂质显示在15nm和20nm之间，而fHep显示在2nm左右。另外，每种fHep-脂质的ζ电势比每种阳离子-PEG-脂质的ζ电势更负(图5B)。这些结果表明fHep与PEG-脂质缀合。
我们还使用DPH测量了每种fHep-脂质的CMC。fHep-C-脂质、fHep-K1C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K4C-脂质、fHep-K8C-脂质、C-PEG-脂质、K1C-PEG-脂质、K2C-PEG-脂质、K4C-PEG-脂质、K8C-PEG-脂质和Mal-PEG-脂质的CMC分别是0.9、1.1、1.1、1.0、0.6、1.1、1.1、1.0、1.0、0.7和1.1μM，表明fHep-脂质是两亲性的，并且实际上可以形成胶束。
实施例3-通过QCM-D对fHep-脂质的功能评估
通过带能量耗散的石英晶体微量天平(QCM-D，瑞典哥德堡的Q-sense公司)评估fHep-脂质的功能。通过QCM-D定量抗凝血酶(AT)对每种fHep-脂质和fHep(-)-PEG-脂质的结合能力。在通过氧等离子体处理(300W，100mL/分钟气流，PR500；日本东京的大和科学株式会社(Yamato Scientific Co.,Ltd.))清洗QCM金传感器芯片之后，将传感器芯片浸入1-十二烷硫醇溶液(1.25mM，在EtOH中)中24小时，以形成疏水性自组装单层(CH3-SAM)。在用乙醇和水充分洗涤后，将传感器芯片放入QCM-D室中。将每种fHep-脂质的溶液(0.1mg/mL，在PBS中)流入所述室中30分钟，然后将BSA溶液(1mg/mL，在PBS中)流入10分钟进行封闭处理。最后，将AT溶液(0.1mg/mL，在PBS中)流入所述室中10分钟。在每个样品溶液流动之前，将PBS流动2分钟用于洗涤。使用Sauerbrey方程，从共振频率变化(第7次泛音时的Δf)计算每种材料的吸附[5]。
另外，用QCM-D研究了因子H与fHep(-)-脂质(fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K4C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质)或Mal-PEG-脂质(作为对照)的结合。将每种fHep(-)-脂质或Mal-PEG-脂质的溶液(0.1mg/mL，在PBS中)流入所述室中30分钟，并将BSA溶液(1mg/mL，在PBS中)流入10分钟进行封闭处理。然后，将因子H溶液(50μg/mL，在PBS中)流入所述室中15分钟。在每个样品溶液流动之前，将PBS流动2分钟用于洗涤。之后，将AT溶液(0.1mg/mL，在PBS中)流入所述室中10分钟。在每个样品溶液流动之前，将PBS流动10分钟用于洗涤。使用Sauerbrey方程，从共振频率变化(第7次泛音时的Δf)计算每种材料的吸附[5]。
结果
通过QCM-D评估AT与fHep-脂质的结合能力。图6示出了fHep-K8C-脂质和AT之间相互作用的代表性QCM-D图谱。在用BSA封闭处理后，我们可以在表面上看到AT与fHep-K8C-脂质的结合。图7总结了每种fHep-脂质和阳离子-PEG-脂质的AT结合量的数据。这里fHep也作为对照添加。对于所有fHep-脂质，我们都可以看到AT结合，而没有AT与阳离子-PEG-脂质和fHep的结合。
我们还检查了用琥珀酸酐(SA)处理的fHep-脂质(即，fHep(-)-脂质)的AT结合能力。由于fHep-脂质上有未反应的胺基，因此将SA用于将它们改变成细胞毒性较低的羧基。图8示出了fHep-K8C(-)-脂质和AT之间相互作用的代表性QCM-D图谱。当我们添加BSA进行封闭处理时，我们可以看到较少的BSA结合，并且仅看到AT的结合(图9)。当使用fHep-K4C(-)-脂质时，获得了类似的结果。这些结果表明fHep(-)-脂质上的负电荷抑制BSA的非特异性结合。
我们还通过QCM-D检查了因子H与fHep(-)-脂质的结合能力。图10示出了与因子H相互作用的代表性QCM-D图谱。在用BSA封闭处理后，我们可以看到因子H在fHep(-)-脂质上的结合，而没有检测到在对照Mal-PEG-脂质上的结合。图11A和11B总结了对每种fHep(-)-脂质和Mal-PEG-脂质的因子H结合量的定量分析。对于所有fHep(-)-脂质，存在因子H的结合，而没有因子H与Mal-PEG-脂质的结合。与fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K4C(-)-脂质相比，当使用fHep-K8C(-)-脂质时，每fHep(-)-脂质分子的因子H数量是最高数量。此结果表明，fHep-K8C(-)-脂质的高度堆积fHep对因子H具有最高的亲和力，这对于经由募集因子H来调节补体激活是重要的。
实施例4-通过FXa活性测定对fHep-脂质的功能评估
通过FXa活性测定评估fHep-脂质的功能。这里，我们评估了抗凝血酶(AT)对每种fHep-脂质(其被掺入脂质体中)的结合能力。
脂质体由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇(摩尔比为1:1)制备。将胆固醇溶液(530μL，在乙醇中的10mg/mL)和DPPC溶液(1mL，在乙醇中的10mg/mL)混合，并使用旋转蒸发器蒸发以形成脂质膜，随后在真空中干燥24小时。然后，添加PBS(1mL)并用磁力搅拌棒在室温下剧烈搅拌1小时。使用挤出机(美国亚拉巴马州伯明翰的Avanti Polar Lipids公司)将所得脂质悬浮液挤出到膜滤器(Φ1000、400、200和100nm)中。使脂质悬浮液通过每个过滤器21次。
为了将fHep-脂质掺入脂质体表面中，将fHep-脂质溶液与脂质体悬浮液混合。将脂质体悬浮液(500μL，制剂中的1mg/mL，在PBS中)离心(TOMY MX301，20,000g，70分钟，4℃)，然后将fHep-脂质溶液(50μL，在PBS中的0.5mg/mL)与脂质体沉淀混合。在室温下孵育10分钟后，通过离心(20,000g，70分钟，4℃)用PBS(450μL)洗涤悬浮液一次。最后，获得fHep-脂质修饰的脂质体。通过测定试剂盒(T-Cho E，富士胶片和光纯药株式会社)测量脂质体中胆固醇的浓度。使用测定试剂盒(Biophen肝素(AT+)，COSMO BIO有限公司)评估脂质体的FXa活性。
FXa活性测定
将脂质体悬浮液(15μL，在PBS中)与人AT(15μL)在96孔板中混合。将牛FXa(75μL)添加到每个孔中，并在室温下孵育120秒。然后，在将显色试剂(75μL)混合90秒后，添加柠檬酸水溶液(100μL，20mg/mL)。在通过离心(20,000g，70分钟，4℃)收集每种上清液后，测量吸光度(在405nm处)。
通过将脂质体悬浮液(60μL，在PBS中)与SDS(2μL，15mg/mL，在PBS中)在室温下混合30分钟以溶解来测量脂质体的胆固醇。然后，根据公司的说明测定胆固醇浓度。
结果
评估了fHep-脂质修饰的脂质体的抗FXa活性(图12)。作为对照组，将每种阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体和fHep-处理的脂质体用于所述测定。抗FXa活性通过脂质体浓度归一化。所有fHep-脂质修饰的脂质体都显示出比对照组更高的抗FXa活性。另外，当使用fHep(-)-脂质修饰的脂质体时，获得了类似的结果(图12)。这些结果表明脂质体的表面可以用fHep-脂质和fHep(-)-脂质修饰，并且此类修饰的脂质体具有抗FXa活性。
实施例5-经处理的脂质体的表征
如实施例4中所述，用每种fHep-脂质(fHep-C-脂质、fHep-K1C-脂质、fHep-K2C-脂质、fHep-K4C-脂质和fHep-K8C-脂质)或阳离子-PEG-脂质(C-PEG-脂质、K1C-PEG-脂质、K2C-PEG-脂质、K4C-PEG-脂质和K8C-PEG-脂质)修饰脂质体的表面。此外，将fHep和PBS用作对照组。
在离心(TOMY MX301，20,000g，70分钟，4℃)后，将fHep-脂质(在PBS中的0.5mg/mL)或阳离子-PEG-脂质(在PBS中的0.5mg/mL)的溶液与脂质体沉淀混合。在室温下孵育10分钟后，通过离心(20,000g，70分钟，4℃)用PBS(450μL)洗涤脂质体一次。最后，获得fHep-脂质修饰的脂质体和阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体。使用Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡的马尔文仪器有限公司)，通过动态光散射评估经处理的脂质体的直径、多分散指数(PDI)和ζ电势(表面电荷)。
结果
通过DLS测量用fHep-脂质或阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体的大小(图13)。作为对照组，用PBS或fHep处理脂质体。在处理前，脂质体的大小是150nm。然后，用fHep-脂质或阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体的平均大小在155nm和175nm之间，而对照脂质体的大小是大约250nm。此外，用fHep-脂质或阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体的多分散指数(PDI)显示出比对照脂质体(约0.5)更低的值(约0.2)(图14)。这些结果表明，用fHep-脂质或阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体分散良好，而对照脂质体聚集。
此外，测量了所有脂质体的ζ电势(图15)。所有样品都显示负电荷，但用每种fHep-脂质修饰的脂质体比用每种阳离子-PEG-脂质修饰的脂质体显示更多的负电荷。此结果表明，脂质体表面被负性fHep-脂质修饰。
实施例6-用fHep(-)-脂质进行细胞表面功能化
使用真空采血管从健康供体收集人红细胞(RBC)。使用Alexa fluorTM 488抗体标记试剂盒，根据公司提供的方案进行抗凝血酶(AT)的标记。用1mL PBS冲洗RBC(10μL，7×109个细胞/mL，在10mM EDTA/PBS中)并离心(Force mini SBC 140-115，BM EQUIPMENT有限公司，1分钟)。在室温下，用fHep(-)-脂质(fHep-C(-)-脂质、fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K2C(-)-脂质、fHep-K4C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质)、K1C-PEG-脂质(0.5mg/mL，每个样品20μL)、fHep(在PBS中的4mg/mL)或PBS(20μL)处理细胞沉淀30分钟，随后用1mL PBS冲洗两次。将细胞沉淀用Alexa488-AT(4mg/mL)在室温下处理10分钟，随后用1mL PBS冲洗两次并离心(Force mini SBC 140-115，1分钟)。将获得的细胞沉淀悬浮在1mL PBS中。使用共聚焦显微镜(CLSM，LSM880，德国耶拿的卡尔蔡司公司)观察经处理的细胞，并通过流式细胞仪(BDLSR II，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)分析细胞。所述实验得到了东京大学(University of Tokyo)伦理委员会的批准。
通过FXa活性测定评估fHep-脂质的功能。这里，我们评估了抗凝血酶(AT)对每种fHep-脂质(其被掺入活细胞(CCRF-CEM细胞)中)的结合能力。为了修饰CCRF-CEM细胞的细胞表面，将fHep-脂质(fHep-C-脂质)与细胞混合。通过离心(120g，4℃，3分钟)用PBS洗涤细胞悬浮液(2mL RPMI 1640培养基中的2×106个细胞)两次。将fHep-C-脂质溶液(100μL，0.5mg/mL，在含有1mg/mL甘氨酸的PBS中)与细胞沉淀混合，并在室温下孵育30分钟，同时每10分钟轻轻拍打。作为对照，使用fHep(100μL，2.5mg/mL，在含有1mg/mL甘氨酸的PBS中)。然后，通过离心(180g，4℃，6分钟)用PBS洗涤经处理的细胞两次。最后，将细胞悬浮在PBS(100μL)中。使用台盼蓝和细胞计数器评估细胞生存力和细胞数量。
然后，制备细胞悬浮液(15μL)，接着在96孔板中与人AT(15μL)混合。将牛FXa(75μL)添加到每个孔中，并在室温下孵育120秒。然后，在将显色试剂(75μL)混合90秒后，添加柠檬酸水溶液(100μL，20mg/mL)。最后，测量吸光度(在405nm处)。
结果
当用fHep(-)-脂质处理细胞时，在细胞膜上观察到荧光(图16)，而当用K1C-PEG-脂质、fHep和PBS处理细胞时，在细胞膜上没有观察到荧光，这表明AT特异性地固定在细胞表面上的fHep(-)-脂质上。图17示出了固定在每个细胞上的Alexa488-AT的定量分析，这也表明AT特异性地固定在细胞表面上的fHep(-)-脂质上。另外，当用fHep-K4C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质处理细胞时，固定化AT的数量最高，其中高度堆积的fHep可以有效地将AT固定在fHep(-)-脂质上。
评估了fHep-脂质修饰的细胞(CCRF-CEM细胞)的抗FXa活性(图18)。作为对照组，将未修饰的细胞用于所述测定。细胞数量补偿了抗FXa活性。fHep-脂质修饰的细胞显示出比未修饰的细胞更高的抗FXa活性(图18)。这些结果表明细胞的表面可以用fHep-脂质修饰，并且还表明这种表面修饰导致抗FXa活性。
实施例7–使用全血模型对fHep-脂质进行功能评估
使用fHep-脂质的hMSC表面功能化
在37℃下，在5％CO2和95％空气中用DMEM(补充有10％FBS、50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素)培养hMSC。将通过胰蛋白酶消化(3分钟，在37℃下，5％CO2)收集的hMSC(1mL，在PBS中的2.5×105个细胞/mL)离心(Force mini SBC 140-115，BM EQUIPMENT有限公司，1分钟)。将细胞沉淀用fHep(-)-脂质(20μL，在PBS中的10mg/mL，fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质)、KnC-PEG-脂质(20μL，在PBS中的10mg/mL，K1C-PEG-脂质和K8C-PEG-脂质)、fHep(20μL，在PBS中的30和120mg/mL)或PBS(20μL)在室温下处理30分钟，随后用冷PBS(1mL)冲洗两次并离心(Force mini SBC 140-115，1分钟)。将包含fHep(fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K8C(-)-脂质和fHep(30或120mg/mL))的样品与甘氨酸(在PBS中的18mg/mL)反应4小时，随后用旋转柱纯化以灭活溶液中游离fHep的细胞毒性醛基。将细胞沉淀用Alexa488-AT(4mg/mL)在室温下处理10分钟，随后用1mL冷PBS冲洗一次并离心(Force mini SBC 140-115，1分钟)。将获得的细胞沉淀悬浮在500μL PBS中，并使用台盼蓝和细胞计数器(countess II，英杰公司)评估细胞的生存力。使用CLSM(LSM880，卡尔蔡司公司)观察那些经处理的细胞，并且还通过流式细胞仪(BD LSR II，BD生物科学公司)分析细胞。
使用人全血的血液测试
使用chandler环模型[6]使hMSC暴露于人全血，以评估用fHep-脂质处理的hMSC表面的抗血栓特性。用于血液测试的hMSC的传代次数是6-8次。用fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K8C(-)-脂质和K1C-PEG-脂质(40μL，在PBS中的10mg/mL，对于每个样品)处理hMSC(1mL，在PBS中的1.0×106个细胞/mL)，并冲洗两次以除去游离fHep-脂质。使用台盼蓝和细胞计数器(countess II，英杰公司)评估细胞的生存力和浓度，并将细胞浓度调节为2.5×106或2.5×105个细胞/mL。将由聚氨酯管(Φ6.3mm，40cm)和聚丙烯连接器(Φ6.5mm，日本大阪的ISIS有限公司)制成的环用MPC聚合物(2mL，在EtOH中的5mg/mL)包被24小时，随后在空气中干燥24小时以防止表面诱导的血液激活。从献血前至少14天没有接受药物的健康供体中抽取人全血到真空管(7mL，未处理，泰尔茂株式会社)中。在采血后，立即将UFH(2.5μL/1mL血液，在PBS中的200IU/mL)混合到血液中。然后，将人全血(2.5mL，含0.5IU/mL UFH)添加到MPC聚合物包被的环中，随后添加100μL在PBS中的hMSC悬浮液(2.5×106或2.5×105个细胞/mL，经处理或未处理的hMSC)或作为对照的PBS。将试管在37℃的箱中以22rpm旋转2小时。在1小时和2小时进行从每个环中采血(1mL)，并与EDTA溶液(10mM)混合。使用细胞计数器(pocH-80i，日本兵库县的SYSMEX公司)测量每个样品的血小板计数。然后，将血液样品离心(TOMY MX301，2,600g，15分钟，4℃)，并收集每个样品的血浆并且保存在-80℃冰箱中，用于TAT、C3a和sC5b-9的酶联免疫吸附测定(ELISA)。所述实验得到了东京大学伦理委员会的批准。
血浆中TAT、C3a和sC5b-9的测量
通过常规夹心ELISA测量血浆中的TAT、C3a和sC5b-9。简言之，用稀释缓冲液(含有0.05％
Figure BDA0003647863040000301
20、10mM EDTA和10mg/mL BSA的PBS)稀释血浆。通过预包被在96孔板上的抗人C3a mAb 4SD17.3捕获血浆中的C3a，并通过生物素化的多克隆兔抗C3a抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素检测。使TMB与固定的HRP反应(15分钟)，并用1M H2SO4水溶液终止反应。最后，使用板读取器(AD200，美国佛罗里达州迈阿密的贝克曼库尔特公司)检测450nm处的吸光度。将酵母多糖激活血清(针对纯化的C3a进行校准)用作标准品。以与C3a测量相同的方式证明了sC5b-9的ELISA。首先，用稀释缓冲液稀释血浆。然后，通过预包被在96孔板上的抗neoC9 mAb aE11(Diatec Monoclonals AS，挪威的奥斯陆公司(Oslo，Norway))捕获血浆中的sC5b-9，并用抗人C5多克隆兔抗体(Dako公司)和HRP缀合的抗兔IgG(Dako公司)检测。使TMB与固定的HRP反应(15分钟)，并用1M H2SO4水溶液终止反应，随后使用板读取器测量450nm处的吸光度。将酵母聚糖激活血清用作标准品。
根据公司的说明书，通过ELISA试剂盒(人凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)AssayMaxELISA试剂盒，美国密苏里州圣查尔斯的Assaypro公司(Assaypro,St Charles,MO,USA))测量TAT。简言之，用稀释剂稀释血浆。然后，通过预包被在96孔板上的抗人抗凝血酶的单克隆抗体捕获TAT，并用生物素化的抗人凝血酶的多克隆抗体检测，然后用HRP缀合的链霉亲和素检测。使过氧化物酶色原底物四甲基联苯胺反应20分钟，并用0.5N盐酸溶液终止反应，随后使用板读取器测量450nm处的吸光度。将人TAT复合物用作标准品。
结果
用具有较高和较低AT结合能力的fHep-脂质、fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质修饰hMSC的表面，以比较在人全血中的抗血栓特性。当用fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质处理hMSC时，在hMSC膜上观察到来自Alexa488-AT的强荧光，而当用KnC-PEG-脂质(n＝1和8)、fHep和PBS处理那些细胞时，在细胞膜上没有观察到荧光(图19A)，表明fHep(-)-脂质固定在hMSC表面上。流式细胞术分析显示fHep-K1C-脂质处理的hMSC比fHep-K8C-脂质处理的hMSC具有更多的Alexa488-AT结合(图19B)。这可能是因为hMSC表面上的fHep-K8C(-)-脂质上的AT结合受到抑制，这是由于hMSC表面上fHep-K8C(-)-脂质的fHep高度堆积，而外源性AT不能完全接近fHep。经处理的hMSC的生存力是大约80％，与对照组(UFH处理的、PBS处理的和未处理的细胞)相似，表明fHep(-)-脂质修饰的非细胞毒性(图19C)。对于K8C-PEG-脂质处理的细胞，观察到高荧光强度(图19B、19C)。发现这些细胞由于阳离子特性而被K8C-PEG-脂质修饰破坏，从而导致Alexa488-AT的摄取。
接下来，我们将人全血与hMSC一起孵育，所述hMSC用浓度为1.0×104(图20A-20D)或1.0×105个细胞/mL(图19D-19G)的fHep-K1C(-)-脂质、fHep-K8C(-)-脂质或K1C-PEG-脂质处理。这里，将未处理的hMSC和PBS用作对照。
图19D示出了在1小时和2小时时血液中的血小板计数。当我们向血液中添加入PBS时，血小板几乎没有减少。此外，当我们添加hMSC时，血小板计数随时间减少，表明来自hMSC的TF诱导血小板聚集。对于K1C-PEG-脂质修饰的hMSC，观察到相同的结果。似乎是PEG层的末端处带正电荷的K1C诱导了血小板激活，使得血小板实际上聚集。另一方面，在用fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质处理的hMSC的情况下，尽管血小板计数略有下降，但剩余的血小板比未修饰的hMSC的对照组高得多，这表明用fHep-脂质进行表面修饰可以减弱血小板激活。fHep-K1C(-)-脂质和fHep-K8C(-)-脂质修饰的hMSC之间的血小板计数没有明显差异。当hMSC浓度是1.0×104个细胞/mL时，血小板计数没有明显差异，尽管我们可以看到如在较高细胞浓度中所看到的类似趋势(图20A)。
我们评估了TAT的水平，TAT是在与经处理的hMSC(图20B的[hMSC]＝1.0×104个细胞/mL，且图19E的[hMSC]＝1.0×105个细胞/mL)孵育2小时期间的凝血标记物。对于用K1C-PEG-脂质修饰的hMSC和未处理的hMSC，TAT水平随时间显著增加，而对于用fHep-脂质修饰的hMSC以及添加PBS的血液，TAT水平略有增加。此结果在1.0×105个细胞/mL hMSC的血液中非常明显。在未处理的hMSC组或K1C-PEG-脂质修饰的hMSC和每种fHep-脂质修饰的hMSC之间存在显著差异(图19E)。在PBS混合血液和每种fHep-脂质修饰的hMSC混合血液之间没有观察到显著差异。这些结果表明hMSC表面上的fHep-脂质能够抑制凝血激活。
另外，我们评估了在与经处理的hMSC(图20C、20D的[hMSC]＝1.0×104个细胞/mL，且图19F、19G的[hMSC]＝1.0×105个细胞/mL)孵育2小时期间C3a和sC5b-9(补体标记物)的产生。基本上，两种标记物的水平都随时间增加。然而，各组之间的水平没有差异。我们没有观察到用fHep-脂质进行的细胞表面修饰对补体激活的任何影响。
以上所述的实施方案应被理解为是本发明的几个说明性实例。本领域的技术人员应当理解，可对实施方案做出各种修改、组合和变化，而不背离本发明的范围。具体地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可组合为其他配置。然而，本发明的范围由所附权利要求书限定。
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Claims (27)

1.一种产生聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)的方法，所述方法包括：
将包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质与包含至少一个羰基、优选至少一个醛基的硫酸化糖胺聚糖混合，以形成席夫碱中间体；以及
向所述席夫碱中间体中添加还原剂以形成硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将马来酰亚胺缀合的PEG-脂质与KnC和/或CKn混合，以形成包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质，其中C是半胱氨酸，K是赖氨酸，并且n是零或等于或小于20的正整数，优选零或等于或小于15的正整数，更优选零或等于或小于10的正整数。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括：
在二氯甲烷中混合α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-马来酰亚胺基PEG(NHS-PEG-Mal)、三乙胺和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)；以及
通过向NHS-PEG-Mal、三乙胺和DPPE在二氯甲烷中的混合物中添加乙醚来沉淀所述马来酰亚胺缀合的PEG-脂质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述硫酸化糖胺聚糖是包含至少一个羰基的片段化肝素，优选包含至少一个醛基的片段化肝素。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括：
将酸性溶液和亚硝酸钠(NaNO2)水溶液混合，以形成混合溶液；
将所述混合溶液的pH在2至6，优选3至5的区间内调节，更优选调节为4；
向所述混合溶液中添加肝素，优选肝素钠，以形成肝素溶液；
将所述肝素溶液的pH在6至8，优选6.5至7.5的区间内调节，更优选调节至7，以形成包含至少一个羰基的片段化肝素；以及
任选地对水透析包含至少一个羰基的所述片段化肝素，并冻干包含至少一个羰基的所述片段化肝素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中添加所述还原剂包括将氰基硼氢化钠添加到所述席夫碱中间体中，以形成所述硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何未反应氨基转化成羧基。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括向所述硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中添加酸酐，以将所述硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何未反应氨基转化成羧基。
9.一种包含至少一种硫酸化糖胺聚糖的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，所述硫酸化糖胺聚糖经由在包含至少一个氨基的阳离子-PEG-脂质的氨基和包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的所述至少一种硫酸化糖胺聚糖的羰基，优选醛基之间形成的键与所述PEG-脂质连接，以形成通过添加还原剂而被还原的席夫碱中间体。
10.根据权利要求9所述的PEG-脂质，其中所述PEG-脂质包含将所述至少一种硫酸化糖胺聚糖与所述PEG-脂质相互连接的的KnC和/或CKn连接物，其中C是半胱氨酸，K是赖氨酸，并且n是零或等于或小于20的正整数，优选地n在0至15的区间内选择，并且更优选地n在0至10的区间内选择。
11.根据权利要求10所述的PEG-脂质，其中所述硫酸化糖胺聚糖经由在所述KnC和/或CKn连接物中的任何赖氨酸残基的氨基或所述KnC和/或CKn连接物中的N-末端胺和包含至少一个羰基，优选至少一个醛基的所述至少一种硫酸化糖胺聚糖的羰基，优选醛基之间形成的键与所述PEG-脂质连接。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的PEG-脂质，其中所述硫酸化糖胺聚糖是片段化肝素。
13.根据权利要求12所述的PEG-脂质，其中所述片段化肝素的重均分子量(Mw)在2.5kDa至15kDa的区间内，优选地在5kDa至10kDa的区间内选择。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的PEG-脂质，其中所述硫酸化糖胺聚糖-PEG-脂质中的任何游离氨基被转化成羧基。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的PEG-脂质，其中所述PEG-脂质对抗凝血酶和因子H具有亲和力。
16.一种生物组织，其包含至少一种根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其中所述至少一种PEG-脂质锚定在所述生物组织的细胞膜中。
17.根据权利要求16所述的生物组织，其中所述生物组织选自胰岛、间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESC)、内皮细胞、β细胞、红细胞、肝细胞、肾、心脏、胰腺、肝、肺、子宫、膀胱、胸腺、肠和脾脏。
18.一种脂质体，其包含至少一种根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其中所述至少一种PEG-脂质锚定在所述脂质体的脂质双层中。
19.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其用作药物。
20.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其用于治疗血栓炎症。
21.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其用于治疗即时血液介导的反应(IBMIR)。
22.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质),其用于治疗缺血再灌注损伤(IRI)。
23.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其用于治疗中风。
24.根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，其用于治疗心肌梗塞。
25.一种向生物组织提供硫酸化糖胺聚糖包衣的体外方法，所述体外方法包括向所述生物组织体外添加根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)，以将所述PEG-脂质锚定在所述生物组织的细胞膜中。
26.一种处理器官或所述器官的一部分的离体方法，所述方法包括：
将包含根据权利要求9至15中任一项所述的聚(乙二醇)脂质(PEG-脂质)的溶液离体输注到所述器官或所述器官的所述部分的脉管系统中；以及
在所述脉管系统中离体孵育包含根据权利要求9至15中任一项所述的的PEG-脂质的溶液，以实现用根据权利要求9至15中任一项所述的PEG-脂质包被所述脉管系统的内皮衬里的至少一部分。
27.根据权利要求26所述的离体方法，其中离体孵育包括在所述脉管系统中离体孵育包含根据权利要求9至15中任一项所述的的PEG-脂质的溶液，以实现用根据权利要求9至15中任一项所述的PEG-脂质包被所述脉管系统的内皮衬里的至少一部分，同时保持所述器官或所述器官的所述部分浸没在优选地包含根据权利要求9至15中任一项所述的PEG-脂质的器官保存溶液中。
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