JP2023510600A

JP2023510600A - 対立遺伝子頻度／変異率を測定する方法、および診断方法

Info

Publication number: JP2023510600A
Application number: JP2022543400A
Authority: JP
Inventors: ボルマン，アンドレーアス; ノヴァーク，ビョルン; シュトロー，アイリーン
Original assignee: センスアイディーゲーエムベーハー
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2023-03-14
Also published as: CA3166647A1; WO2021144471A1; EP3851540A1; CN115135773A; US20230056502A1; EP4090765A1

Abstract

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）との関連における、核酸、特に腫瘍核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するための新たな方法、および、少なくとも１つの参照核酸（ＲＮ）と、この参照核酸に対する１つの変異配列とが用いられる、この目的のための診断方法に関する。この参照核酸と変異配列とにより、特に機器のパラメータおよび試料調製に基づいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を検証することが可能になる。本発明は、さらに、特に液体生検の過程での腫瘍診断のための、関連する診断方法および予後判定方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）との関連における、核酸、特に腫瘍核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するための新たな方法、および、少なくとも１つの参照核酸（ＲＮ）と、この参照核酸に対する１つの変異配列とが用いられる、この目的のための診断方法に関する。この参照核酸と変異配列とにより、特に機器のパラメータおよび試料調製に基づいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を検証することが可能になる。本発明は、さらに、特に液体生検の過程での腫瘍診断のための、関連する診断方法および予後判定方法に関する。

体液および組織試料における臨床化学検査またはイメージング法などの、腫瘍を検出するための現在の方法は、近年のすべての進歩にもかかわらず、悪性変化の検出が遅すぎる場合が多い。腫瘍患者における高い死亡率の主な原因は、原発腫瘍の発症ではなく、転移の発症である。腫瘍の転移を防ぐためには、できるだけ早く悪性変化を検出する必要がある。さらに、悪性細胞と正常細胞とを正しく区別することができる方法が必要である。偽陽性結果と偽陰性結果は、いずれも罹患した人間に致命的な結果をもたらす。腫瘍患者に、正確な予後判定を提供し、それに従って各患者に個別に合わせた治療を可能にする方法も必要である。

これまで、いわゆる腫瘍マーカ、特に癌遺伝子は、血液、尿、痰または組織試料などの体液で測定されてきた。腫瘍マーカは腫瘍細胞の成分であり、それらの形成は増加または減少し、それらの変化は血液、血漿、または血清などの体液で検出することができる。しかしながら、これらの腫瘍マーカは、診断の特異度と感度がしばしば低すぎるため、腫瘍疾患の一般的スクリーニングには使用できない。これらの腫瘍マーカは、多くの場合、イメージング法よりも早期の段階で悪性変化を示すことができるが、現在のところ、悪性変化の適切な検出を実現していない。

細胞内成分、主に核酸（リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の分離、特徴付けおよび分析は、現代の微生物学において極めて重要である。１９８３年のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明以来、多数の核酸診断法が開発されており、それらは疾患および病原体などを検出するために使用されている。

従来技術では、このような細胞物質は、試料調製、抽出、濃縮、分離、精製、逆転写、増幅、および検出などのステップにおける診断方法のために提供されている。

ＰＣＲ、特に「ｑＰＣＲ」（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）、「デジタル液滴ＰＣＲ」（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ、または「超並列シーケンシング」などの並列シーケンシング）による腫瘍ＤＮＡの極めて有効な増幅によって、試料中の循環遊離ＤＮＡが検査される、いわゆる非侵襲的液体生検が、近年、腫瘍診断において確立されている。このような循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、癌／腫瘍細胞に由来する可能性がある（いわゆるｃｔＤＮＡ）。

癌患者では、健常被験者よりも平均ｃｆＤＮＡ量が高く、特に、進行期の癌患者のｃｆＤＮＡ血漿中濃度は、軽症期／初期の癌患者よりも高い。ｃｔＤＮＡはたとえば、ｃｆＤＮＡの１％を構成する（腫瘍の病期および部位に応じて、正常なｃｆＤＮＡの０．０１～９０％）。

しかしながら、相対的な診断情報だけでなく、絶対的な診断情報を得ることができる標準試料の必要性は高い。このような標準試料の使用は、たとえば特許文献１に記載されている。同様に、関連する診断方法が開示されている（請求項１８３）。

現在、腫瘍診断のために検出が必要な変異については、市販検査薬と自家調製検査薬（ＬＤＴ：ｌａｂ‐ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｅｓｔ）の両方が利用可能である。従来技術を構成する、プラスミドＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドなどの検査室内標準試料（ｉｎ‐ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｔａｎｄａｒｄ）が、現在、検証または校正の精度管理用に使われている。

国際公開第２０１８／０９４１８３号

しかしながら、これらの検査室内標準試料は、機器または方法の検証または校正のために希釈する必要があり、これを行うための自動処理が提供されておらず、つまり、通常、標準化に誤差が生じやすいのが欠点である。さらに、このような希釈液の安定性は保証されておらず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡなどの起源に基づいて、ＲＮＡ汚染のリスクがある。したがって、ＰＣＲによって測定されたコピー数は、適切な標準化が行われていないために、相対的および絶対的に不正確な場合がある。

したがって、ヒト参照核酸に基づく標準化には、さらなる変異配列を提供することによる、さらなる改善が必要である。このヒト参照核酸と変異配列は、標準試料を構成する。

驚くべきことに、本発明者らは、このような標準試料を用いれば、ＤＮＡを含まないヒト血清または血漿試料の使用によって、検証および診断の改善が可能になることを立証することができた。

したがって、本発明が取り組む課題は、試料核酸中の対立遺伝子頻度および／または変異率を検出するための改善された方法とともに、適切な標準試料が使用される関連する診断を提供することである。

課題は、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を検証するための方法であって、
ａ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、少なくとも１つのヒト参照核酸（＝野生型）と、参照核酸に対する１つまたは複数の変異を有する１つのヒト核酸（＝変異核酸）とを提供するステップであって、該ヒト参照核酸および該ヒト核酸の特定の対立遺伝子頻度および／または変異率が所定である、提供するステップと、
任意選択で、
ｂ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、ａ．）からのヒト参照核酸（＝野生型）を提供するステップであって、該ヒト参照核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率が０％である、提供するステップと、
任意選択で、
ｃ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料を提供するステップであって、ａ．）において特定の対立遺伝子頻度が検出されており、必要に応じてｂ．）および／またはｃ．）と比較する、提供するステップと、
を含む方法によって解決される。

上記の方法は、以降、「本発明の検証方法」と呼ぶ。

図１は、ｄｄＰＣＲの検査結果を示す図である。図２－１は、実施例の検証結果を示す図である。図２－２は、実施例の検証結果を示す図である。図３は、図２－１および図２－２の結果に基づいて作成された検量線を示す図である。

前述の「特定の対立遺伝子頻度」は、０％以上であり、特に０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％およびさらに高い値をとることができる。

本発明の意味において、「参照核酸」は、対立遺伝子の任意かつ公知のヒト野生型配列を意味する。このような対立遺伝子は、
ＣＯＳＭＩＣ：ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ、
ＴａｒｇｅｔｅｄＣａｎｃｅｒＣａｒｅ：
ｈｔｔｐ：／／ｔａｒｇｅｔｅｄｃａｎｃｅｒｃａｒｅ．ｍａｓｓｇｅｎｅｒａｌ．ｏｒｇ／Ｍｙ‐Ｔｒｉａｌ‐Ｇｕｉｄｅ／Ｄｉｓｅａｓｅｓ／Ｌｕｎｇ‐Ｃａｎｃｅｒ／ＫＲＡＳ／Ｇ１２Ｃ‐（ｃ‐３４Ｇ‐Ｔ）．ａｓｐｘ、または
ＯｎｃｏＫＢ：ｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｃｏｋｂ．ｏｒｇ／、ＭｙＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｙｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ <https://www.mycancergenome.org/>
などのデータベースから抜粋することができる。

好ましい実施形態では、参照核酸含有量は、血清または血漿中に好ましくは２０～６００ｎｇのＤＮＡであり、特に４００ｎｇのＤＮＡであり、たとえば血清または血漿中に４００ｎｇ／５ｍｌのＤＮＡは、８０ｎｇ／ｍｌのＤＮＡに相当し、これは０．０８ｎｇ／μｌのＤＮＡに相当する。

さらに、参照核酸は、５０ｂｐ～５００ｂｐのサイズを有することが好ましい。

本発明の意味において、「１つまたは複数の変異を有するヒト核酸」または「変異配列または変異核酸」は、参照核酸としての対立遺伝子のヒト野生型配列と比較して１つまたは複数の変異を有する配列を意味する。ここで、ヒト野生型配列に関して公知の変異配列を用いることもできるし、または人工変異を導入することもできる。このような人工変異を作製するための方法は、従来技術に記載されている。本発明の方法において、この参照配列および変異配列が公知である（たとえば核酸配列に基づいて記載されている）ことが不可欠である。さらに、変異配列が、公知の変異を有する少なくとも１つの腫瘍マーカ、たとえば癌遺伝子を有することが好ましい。さらに、このような腫瘍マーカ配列または癌遺伝子は、さらなる人工変異を有することができる。

好ましい実施形態では、変異配列の含有量は、参照配列の含有量よりも少ない。さらに、変異配列は、５０ｂｐ～５００ｂｐのサイズを有することが好ましい。

さらに、参照核酸および変異配列は、それぞれ、特定の濃度で存在することが好ましい。

本発明によれば、対立遺伝子頻度または変異率は、たとえば、変異配列に対する参照核酸の存在コピー数、または変異配列に対する参照核酸の濃度に基づく比による、変異配列に対する参照核酸の比（ＲＮ／ＭＳ）を意味する。

たとえば、参照核酸（「野生型対立遺伝子」）４，０００コピーに対して変異配列（「変異対立遺伝子」）２００コピー（この場合：４．７６％＝（２００ｘ１００％）／（２００＋４０００））が共に存在する場合、対立遺伝子頻度または変異率は４．７６％である。対立遺伝子頻度の意味においてこれは４．７６％であり、すなわち対立遺伝子変異または変異配列の頻度は４．７６％であり、または変異率は４．７６％である。

このようにして、特定のまたは設定された対立遺伝子頻度または変異率を有する、本発明の検証試料を提供することができる。

本発明の意味において、検証とは、所定の検証試料に基づいて、特定のまたは設定された対立遺伝子頻度または変異率が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の過程で検出できることを意味する。これは、機器のパラメータおよび実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の両方に依存する可能性があり、特に試料調製に依存する可能性がある。検証試料は、キットによって提供することができる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するときに対立遺伝子頻度／変異率に関して検証試料が抽出できない場合は、感度が得られないかまたは検出限界が高すぎて検出できないことになる。さらに、ＰＣＲ用検証試料を調製するときに、抽出されるＤＮＡ物質が少な過ぎる可能性がある。したがって、抽出効率が不十分であり、試料核酸の並行した患者試料または被験者試料を用いる試料調製に派生的な影響をもたらす可能性がある。

例示的な検証は、実施例ならびに図２－１、図２－２および図３に記載されている。

他の好ましい実施形態において、検量線または検証曲線を作成することができる。

例示的な検量線は、実施例および図３に記載されている。

驚くべきことに、このようにして、有利には、適切な特異度および感度で少ない量の試料核酸を検出することができる。これにより、腫瘍活性、特に転移の可能性についての早期の情報を提供することができる。好ましい試料核酸は、患者または被験者のｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡである。

したがって、本発明は、本発明の検証方法が実施されるＰＣＲ法によって少なくとも１つの試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するための方法に関する。特に有利には、試料核酸は、校正または検証に基づいて定量的に測定することができる。

本発明の他の特定の実施形態は、腫瘍疾患の診断または予後判定のための方法であって、第１試料からの第２試料へおよび／またはさらなる試料への試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率の変化が、早期検出および検出、重症度の評価および治療に伴う経過評価を可能にする方法において、本発明の検証方法によって校正が実施される、方法に関する。

特に、第２試料またはさらなる試料は、後の時点で患者から採取することができる。

特に有利には、ＤＮＡを含まない血清または血漿試料を提供することによって、標準核酸および試料核酸の検出限界を検証することが可能になる。したがって、特に有利な用途は、本発明の方法が実施される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実施するための機器の検証に関する。

特に有利には、このようにして、本発明の標準試料の予め正確に定められたＤＮＡ物質の量または濃度を試料に導入することができ、それによってこの試料は、患者の血清または血漿試料をほぼ模擬し、腫瘍診断の実施に非常に適したものになる。

さらに、好ましくは変異核酸の濃度は４ｘ１０Ｅ－０５ｆｇ／μｌ～０．０３ｆｇ／μｌであることが好ましい。

本発明の変異配列は、好ましくは腫瘍マーカ、特にＭＴＯＲ、ＭＰＬ、ＮＲＡＳ、ＰＡＲＰ１、ＡＫＴ３、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＳＨ２、ＩＤＨ１、ＶＨＬ、ＭＬＨ１、ＭＹＤ８８、ＣＴＮＮＢ１、ＡＴＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＩＴ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＧＡＢＲＧ２、ＮＰＭ１、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＢＲＡＦ、ＥＺＨ２、ＪＡＫ２、ＧＮＡＱ、ＲＥＴ、ＰＴＥＮ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮＩＩ、ＦＬＴ３、ＲＢ１、ＰＡＲＰ２、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＫＴ１、ＲＡＤ５１、ＩＤＨ２、ＴＰ５３、ＮＦ１、ＳＭＡＤ４、ＡＫＴ２、ＥＲＣＣ１、ＧＮＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＦＯＸＬ２、ＮＯＴＣＨ１、またはＮＴＫＲの群から選択される癌遺伝子を含む。

本発明の意味において、「診断」は、変異率から腫瘍活性についての結論を得ることができることを意味する。変異率が高いほど、腫瘍活性、特に転移の可能性が高くなる。したがって、本発明は癌または腫瘍の診断に関する。「診断」という用語には、医療診断および関連する検査、特にｉｎｖｉｔｒｏ診断および検査室診断が含まれる。好ましくは、この情報は、患者の疾患または状態に関する。

本発明の文脈において、「患者」は任意の被験者と理解される。

本発明のさらなる主題は、
ａ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、少なくとも１つのヒト参照核酸と、参照配列に対して１つまたは複数の変異を有する１つの核酸とを有する部分（たとえばチューブ）であって、該ヒト参照核酸および該ヒト核酸の所定の対立遺伝子頻度が設定されている、部分と、
任意選択で、
ｂ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、ヒト参照核酸を有する部分と、
任意選択で、
ｃ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料を有する部分と、を含む、
上記の方法のうちの１つを実施するためのキット、または上記の方法のうちの１つを実施するためのこのようなキットの使用に関する。

以下、実施例を用いて本発明を説明する。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されるものではなく、原則として普遍的に適用可能である。
実施例１：
キットの提供による、本発明の方法の実施：
１）ＱＩＡａｍｐｃｃｆＤＮＡ／ＲＮＡＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））、ＰＭＥＦｒｅｅ‐ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｎａｌｙｔｉｋＪｅｎａ（登録商標））、またはＭａｇＭＡＸ（登録商標）Ｃｅｌｌ‐ＦｒｅｅＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））などの市販キットを用いる、本発明の血清または血漿参照物質からの核酸（ＤＮＡ）、特にｃｆＤＮＡの抽出。

２）たとえばＱｕｂｉｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を用いる蛍光測定法、またはＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）または他のスペクトロメータを用いる分光測定法での溶出液中の核酸、特にｃｆＤＮＡの定量化。

３）任意選択で、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））、フラグメントアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））、またはパルスフィールドゲル電気泳動を用いて、フラグメント長分析などの、核酸、特にｃｆＤＮＡの定性分析を実施することができる。

４）次いで、得られた核酸、特にｃｆＤＮＡをＰＣＲにかける。

同時に、患者からの対応する血清または血漿試料を調製することができる。
出力ｄｄＰＣＲ：
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）のＱＸ２００ｄｄＰＣＲシステムの例を用いる：
ｄｄＰＣＲによって、検査される規定量の核酸が、数千の個別の反応空間に分配される。このプロセスにおいて、検査されるＤＮＡ配列は、これらの反応空間にポアソン分布に従って分布する。核酸が存在する場合、反応空間内で核酸の増幅が起きる。変異配列は、参照配列（野生型配列）と色で区別できるＰＣＲ反応を引き起こす。

結果は、関連するソフトウェアを使用して評価し、プロット、特に２Ｄ振幅プロットに表示することができる：
ＦＡＭチャネル（青色蛍光）（チャネル１振幅）で検出された結果はｙ軸にプロットされる。

ＨＥＸ／ＶＩＣチャネル（緑色蛍光）（チャネル２振幅）で検出された結果はｘ軸にプロットされる。

プロットされた各点は、参照配列（野生型配列）との反応（Ｑ４）、変異配列との反応（Ｑ１）、両方の配列との反応（Ｑ２）または、標的核酸が存在しないために配列なしとの反応（Ｑ４）による反応空間（図１ａ）を表し、得られた点群Ｑ１～Ｑ４は図１ｂのグラフに示されている。

ソフトウェアによって測定された生データ（プロットされた点）が、参照配列および変異配列の絶対的に定量化された数値になるように評価が行われる。

対立遺伝子頻度は、これらの値から、たとえば手動またはソフトウェアで測定することができる。すなわち、対立遺伝子頻度について、参照配列と変異配列とのコピー数は、次式に従って計算される：
（ＣＮ_Ｍｕｔ ^＊１００％）／（ＣＮ_Ｍｕｔ＋ＣＮ_Ｗｔ）＝ＶＡＦまたはＭＡＦ
ＣＮ_Ｍｕｔ＝変異配列のコピー数
ＣＮ_Ｗｔ＝参照配列のコピー数
ＶＡＦ＝変異対立遺伝子頻度またはＭＡＦ＝突然変異対立遺伝子頻度。

このようにして、キットのチューブ（図２－１および図２－２における０．０、０．１、１、および５％などのプリセット対立遺伝子頻度を有する該当する標準試料）で本発明の方法を行って、有利には以下の情報が得られる：
１）定性的情報：変異は、変異配列で検出可能か？はい／いいえ
２）参照配列と変異配列とについての絶対的に定量化されたコピー数（「ＣＮ」）
３）対立遺伝子頻度の測定。

例は図２－１および図２－２に示す。

計算値（図２－１、図２－２、表）から検量線を作成し、検証を完了することができる（図３）。

各コピーが「読み取り」に対応し、参照配列と変異配列もシンプルに区別できるため、ＮＧＳによってシンプルに評価することもできる。

検量線に基づいて、患者または被験者試料（前出）を、同時にまたは異なる時間に測定することができ、診断を行うことができる。

Claims

核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を検証するための方法であって、
ａ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、少なくとも１つのヒト参照核酸と、該参照核酸に対する１つまたは複数の変異を有する１つのヒト核酸とを提供するステップであって、該ヒト参照核酸および該ヒト核酸の特定の対立遺伝子頻度および／または変異率が所定である、提供するステップと、
任意選択で、
ｂ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、ａ．）からのヒト参照核酸を提供するステップと、
任意選択で、
ｃ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料を提供するステップであって、ａ．）において前記特定の対立遺伝子頻度が検出されており、必要に応じてｂ．）および／またはｃ．）と比較する、提供するステップと、
を含む、方法。
前記方法が、ａ．）からの複数の所定の対立遺伝子頻度に対して実施されることを特徴とする、請求項１に記載の、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定することによってＰＣＲ法を検証するための方法。
検証曲線および検量線が得られることを特徴とする、請求項２に記載の、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定することによってＰＣＲ法を検証するための方法。
参照核酸および変異核酸の濃度が所定のことを特徴とする、請求項１に記載の、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するためのＰＣＲ法を検証するための方法。
前記変異核酸が、少なくとも１つの腫瘍マーカを含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するためのＰＣＲ法を検証するための方法。
ｑＰＣＲ（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）が実施されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の、核酸における対立遺伝子頻度および／または変異率を測定するためのＰＣＲ法を検証するための方法。
ＰＣＲ法によって少なくとも１つの試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率を測定する方法であって、請求項１に記載の方法によって校正が実施される、方法。
ＰＣＲ法によって少なくとも１つの試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率を測定する方法であって、前記試料核酸が定量的に測定される、方法。
患者の試料核酸がｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡであることを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の、ＰＣＲ法によって前記少なくとも１つの試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率を測定する方法。
腫瘍疾患の診断または予後判定のための方法であって、第１試料からの第２試料へおよび／またはさらなる試料への前記試料核酸の対立遺伝子頻度および／または変異率の変化が、早期検出および検出、重症度の評価および治療に伴う経過評価を可能にする方法において、請求項１に記載の方法によって校正が実施される、方法。
前記第２試料またはさらなる試料が後の時点で患者から採取される、請求項１０に記載の腫瘍疾患の診断または予後判定のための方法。
ａ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、少なくとも１つのヒト参照核酸と、該参照配列に対して１つまたは複数の変異を有する１つの核酸とを有する部分であって、該ヒト参照核酸および該ヒト核酸の所定の対立遺伝子頻度が設定されている、部分と、
任意選択で、
ｂ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料中の、ヒト参照核酸を有する部分と、
任意選択で、
ｃ．）ＤＮＡを含まない血清または血漿の試料を有する部分と、
を含む、請求項１または請求項７または請求項１０に記載の方法を実施するための、キット。
請求項１または請求項７または請求項１０の方法を実施するための、請求項１２に記載のキットの使用。