JP2023508942A

JP2023508942A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質

Info

Publication number: JP2023508942A
Application number: JP2022538765A
Authority: JP
Inventors: ヘマンタバルア，; グレゴリーピー．チャン，; アンエフ．チュン，; ダニエルファロン，; アシャグリンバーグ，; ゾンショーンジュオ，; クリストファーライアンモーガン，
Original assignee: ドラゴンフライセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2021-05-05
Publication date: 2023-03-06
Also published as: CA3177024A1; CO2022015929A2; BR112022021884A2; IL297922A; CN115836088A; MX2022013944A; AU2021268340A1; TW202208428A; CL2022003077A1; WO2021226193A1; EP4146271A1; AR122018A1; KR20230008181A; US20220119534A1

Abstract

本明細書に記載されているのは、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する多重特異性結合タンパク質、多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、及びがんの治療に有用な治療方法である。本出願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにＣＬＥＣ１２Ａに結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、２種以上のＮＫ活性化受容体に係合し得、天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することをブロックし得る。

Description

本出願は、２０２０年５月６日に出願された米国仮出願第６３／０２０，７９８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本願では、ＡＳＣＩＩテキスト形式のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表を全体として、参照することにより、援用する。配列表のテキストファイルには、「１４２４７－５４０－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」とタイトル付けされ、２０２１年５月３日に作成され、サイズは２９１，３７５バイトである。

発明の分野
本出願は、細胞上のＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する多重特異性結合タンパク質、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、及びがんの治療を含む、そのようなタンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法に関する。

かなりの研究努力にもかかわらず、がんは世界中の国々で引き続き重大な臨床的及び財政的負担となっている。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、これは２番目に多い死因である。外科、放射線療法、化学療法、生物学的療法、免疫療法、ホルモン療法、幹細胞移植、及び精密医療は、既存の治療法の中にある。これらの分野での広範な研究にもかかわらず、特に最も攻撃的ながんに対する非常に効果的で治療的な解決策はまだ特定されていない。さらに、既存の抗がん治療法の多くには、かなりの有害な副作用がある。

がん免疫療法は、特異性が高く、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進し得るので、望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。特定の腫瘍関連抗原に結合する抗体は、文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照のこと。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を占める。ＮＫ細胞は、実質上、全ての組織に浸潤し、かつもともとは、事前に感作させておく必要なく腫瘍細胞を効果的に殺滅する能力を有するものとして特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の方法で、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含む細胞溶解性顆粒、ならびにデスレセプター経路を介して標的細胞を殺滅する。活性化ＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ－γ及びケモカインなどの炎症性サイトカインも分泌する。

ＮＫ細胞は、その表面上にある様々な活性化受容体及び阻害性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、その活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらはそれらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、その表面上にあるＣＤ１６受容体を介し、一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。ＮＫ細胞の活性化に対する全体的な感受性は、刺激シグナル及び阻害性シグナルの総和に依存する。ＮＫＧ２Ｄは、本質的に全てのナチュラルキラー細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能する。ＮＫＧ２Ｄは、共刺激受容体として機能するＴ細胞にも見られる。ＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞機能を調節する能力は、悪性腫瘍を含むさまざまな治療状況で有用である。

Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）は、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）または骨髄性阻害性Ｃ型レクチン様受容体（ＭＩＣＬ）としても公知であり、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、共通のタンパク質折り畳みを共有し、かつ細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質代謝回転、ならびに炎症及び免疫応答における役割などの多様な機能を有する。タイプＩＩ膜貫通糖タンパク質であるＣＬＥＣ１２Ａは、白血病幹細胞の急性骨髄性白血病患者の９０％以上で過剰発現しているが、正常な造血細胞では過剰発現していない。
いくつかのバイオテクノロジー及び製薬会社によって行われた多くの努力にもかかわらず、特定のＣＬＥＣ１２Ａを標的とした生物製剤の開発は、優れた開発性特性を備えた抗体が存在しないせいで妨げられている。ＣＬＥＣ１２Ａ抗体を発見する際の課題は、抗原の複雑さに起因する可能性がある。ＣＬＥＣ１２Ａは、２０１個のアミノ酸を有する細胞外ドメイン内に６つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を有するモノマーの高度にグリコシル化されたタンパク質である。６つのＮ－グリコシル化部位のうち４つは、分子の膜近位ドメインにクラスター化されており、細胞表面での標的の提示に関与している可能性がある。異なる細胞型の表面でのＣＬＥＣ１２Ａのグリコシル化状態のバリエーションが報告されている（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（２００６）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９－６９）。
したがって、がんの治療に使用するためにＣＬＥＣ１２Ａに結合する新しくかつ有用なタンパク質の分野での必要性が残っている。

国際公開第２０１６／１３４３７１号国際公開第２０１５／０９５４１２号

Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（２００６）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９－６９

本出願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにＣＬＥＣ１２Ａに結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、２種以上のＮＫ活性化受容体に係合し得、天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することをブロックし得る。特定の実施形態では、このタンパク質は、ヒトのＮＫ細胞を刺激し得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、ヒト、ならびにげっ歯類及びカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を刺激し得る。本明細書に開示されるタンパク質のいずれか１つを含む製剤；タンパク質を発現する１つ以上の核酸を含む細胞、及びタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。

したがって、一態様では、本出願は、以下を含むタンパク質を提供する：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位；
ここで、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位は、以下を含む：
（ｉ）それぞれが配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびにそれぞれが配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）それぞれ配列番号２２１、１６６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４０、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）それぞれ配列番号２０６、１６６、及び２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４５、２３９、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）それぞれ配列番号２２１、２３６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１５２、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１５９、１７０、及び１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１８６、１８８、及び１８９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１９７、２０２、及び２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに配列番号２１１、２１２、及び２１４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｘ）それぞれ配列番号２２０、２２２、及び２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２２４、２２５、及び２２７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｘ）それぞれ配列番号２３０、２３１、及び２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２３３、２３４、及び２３５のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ。

いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号３３５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３３６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２７０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２７１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号１７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２８９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号３３５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３３６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２７０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２８９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、配列番号１４３及び１４４；１４７及び１４４；２４４及び１４４；１７８及び１４４；２５６及び１４４；１４３及び１６３；１４３及び１６７；１４３及び１７１；または１７４及び１７５のアミノ酸配列をそれぞれ含む。

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、一本鎖フラグメント変数（ｓｃＦｖ）として存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２７４、１４５、１４６、１４９、１５０、１５３、１５４、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７６、１７７、１８０、及び１８１から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位は、以下を含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号１９５、１９６、１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号１９８、１９９、２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ。

特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号１４８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２０３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１６２及び２０３；２１０及び２０３；１６２及び２１８；１４８及び２１８；または２１０と２１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２に、抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１８４、１８５、２０４、２０５、２０８、２０９、２１５、２１６、２５２、２５３、２５４及び２５５から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、先行する実施形態の第２の抗原結合部位は、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する。

別の態様では、本出願は、以下を含むタンパク質を提供し：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位；
ここで、第２の抗原結合部位が、前記グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＳＰＲによって測定されるように、１ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｋ２４４Ｑ置換を含むヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部を含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はＦａｂフラグメントであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位はｓｃＦｖである。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位はＦａｂフラグメントである。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれＦａｂフラグメントである。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖである。特定の実施形態では、第２の及び追加の抗原結合部位のアミノ酸配列は同一である。特定の実施形態では、第２の及び追加の抗原結合部位のアミノ酸配列は異なる。

別の態様では、本出願は、以下を含むタンパク質を提供し：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位、
ここで、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、Ｆａｂフラグメントであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位はｓｃＦｖである。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結される。特定の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖは、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結される。特定の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けされた、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間で形成される。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成され、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けされる。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結されている。特定の実施形態では、可塑性リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_４を含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結されている。特定の実施形態では、可塑性リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_４を含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置される。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置される。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置される。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置される。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂフラグメントは、抗原結合部位とＦｃまたはその部分との間には配置されない。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するＦａｂフラグメントが、抗原結合部位とＦｃまたはその部分との間に配置されることはない。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ配列番号８１、８２、及び１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、以下を含む：
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、及び９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）それぞれ配列番号８１、８２、及び８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨは、配列番号９５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、第１の抗原結合部位のＶＬは、配列番号８５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨは、配列番号９５のアミノ酸配列を含み；そして、第１の抗原結合部位のＶＬは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示されるタンパク質のいくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその部分は、配列番号１１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８と比較して、１つ以上の変異を含む。特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられたＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅから選択される１つ以上の変異を、配列番号１１８に対して、含む。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８に対して、１つ以上の変異を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられたＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１３６と比較して、１つ以上の変異を含む。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８に対してＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号が付けられた、配列番号１３６と比較して、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換を含む。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖は、配列番号１１８に対してＹ３４９Ｃ置換を含み；抗体重鎖定常領域の他のポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられた配列番号１３６と比較して、Ｓ３５４Ｃ置換を含む。

別の態様では、本出願は、以下を含むタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２５９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド。

別の態様では、本出願は、以下を含むタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド。

別の態様では、本出願は、本明細書で開示されるタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるタンパク質及びｐＨ７．０以上の緩衝液を含む医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態では、この製剤のｐＨは、７．０～８．０の間である。いくつかの実施形態では、この緩衝液はクエン酸塩を含む。特定の実施形態では、このクエン酸塩の濃度は、１０～２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、さらにリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、糖または糖アルコールをさらに含む。特定の実施形態では、この糖または糖アルコールは二糖である。特定の実施形態では、この二糖は、スクロースである。いくつかの実施形態では、医薬製剤中の糖または糖アルコールの濃度は、２００～３００ｍＭである。特定の実施形態では、医薬製剤中の糖または糖アルコールの濃度は、約２５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、非イオン性サーファクタントをさらに含む。特定の実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートを含む。特定の実施形態では、このポリソルベートは、ポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は、０．００５％～０．０５％である。特定の実施形態では、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は、約０．０１％である。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの濃度は、もしあれば、医薬製剤において約１ｍＭ以下である。いくつかの実施形態では、タンパク質の濃度は、１０～２００ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、タンパク質の濃度は約２０ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、この医薬製剤は、ｐＨ７．０で、約２０ｍＭのクエン酸塩、約２５０ｍＭのスクロース、及び約０．０１％のポリソルベート８０を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約２０ｍＭのリン酸カリウム、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び約１２５ｍＭ塩化ナトリウムをｐＨ７．８で含む。

別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供する。

別の態様では、本出願は、腫瘍細胞死を増強する方法、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を有効量のタンパク質、医薬組成物、または本明細書に開示される医薬製剤に曝露することを含む方法を提供する。

別の態様では、本出願は、がんを処置する方法を提供し、この方法は、本明細書で開示されるタンパク質、医薬組成物またはその医薬製剤の有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、そのがんは、血液学的悪性腫瘍である。特定の実施形態では、この血液学的悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び古典的ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、ＡＭＬは、未分化型急性骨髄芽球性白血病、最小分化型急性骨髄芽球性白血病、分化型急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増大症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、及び芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択される。特定の実施形態では、ＡＭＬは、ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）上のＣＬＬ－１の発現を特徴とする。特定の実施形態では、ＬＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３２、及びＣＤ９６から選択される細胞膜マーカーをさらに発現する。

いくつかの実施形態では、ＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ）である。特定の実施形態では、ＭＲＤは、ＦＬＴ３－ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）－遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオフォスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、及びＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１及びＩＤＨ２））から選択される変異の有無によって特徴付けられる。

特定の実施形態では、ＭＤＳは、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）、単一血球系統の異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、芽球増大を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）、染色体異常（ｉｓｏｌａｔｅｄｄｅｌ）（５ｑ）を伴うＭＤＳ、及びＭＤＳ、未分類型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）から選択される。特定の実施形態では、ＭＤＳは、一次ＭＤＳまたは二次ＭＤＳである。

いくつかの実施形態では、ＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＰＮは、真性赤血球増大症、本態性血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄線維症から選択される。いくつかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、及び組織球腫瘍から選択される。特定の実施形態では、がんは、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する。

ヘテロ二量体、多重特異性抗体、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の図示である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、または腫瘍関連抗原に対応する結合ドメインのいずれかを表し得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインは、共通の軽鎖を共有し得る。

多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを図示する。Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖフォーマットをとってもよい（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原を標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域／ドメイン（ＣＤ１６に結合する）を含む抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（Ｅ）。Ｂに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインの両方が、ｓｃＦｖフォーマットをとり得る。Ｃ～Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む、３つの抗原結合部位を有する抗体の図示である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位が、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｅは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上にＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；ならびに反対側の定常ドメイン上にＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメインでは三角形のロックアンドキー形状として示されている）を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖と軽鎖可変ドメインとの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表している。多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを図示する。Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖフォーマットをとってもよい（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原を標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域／ドメイン（ＣＤ１６に結合する）を含む抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（Ｅ）。Ｂに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインの両方が、ｓｃＦｖフォーマットをとり得る。Ｃ～Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む、３つの抗原結合部位を有する抗体の図示である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位が、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｅは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上にＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；ならびに反対側の定常ドメイン上にＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメインでは三角形のロックアンドキー形状として示されている）を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖と軽鎖可変ドメインとの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表している。多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを図示する。Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖフォーマットをとってもよい（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原を標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域／ドメイン（ＣＤ１６に結合する）を含む抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（Ｅ）。Ｂに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインの両方が、ｓｃＦｖフォーマットをとり得る。Ｃ～Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む、３つの抗原結合部位を有する抗体の図示である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位が、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｅは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上にＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；ならびに反対側の定常ドメイン上にＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメインでは三角形のロックアンドキー形状として示されている）を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖と軽鎖可変ドメインとの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表している。多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを図示する。Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖフォーマットをとってもよい（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原を標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域／ドメイン（ＣＤ１６に結合する）を含む抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（Ｅ）。Ｂに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインの両方が、ｓｃＦｖフォーマットをとり得る。Ｃ～Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む、３つの抗原結合部位を有する抗体の図示である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位が、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｅは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上にＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；ならびに反対側の定常ドメイン上にＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメインでは三角形のロックアンドキー形状として示されている）を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖と軽鎖可変ドメインとの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表している。多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを図示する。Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖフォーマットをとってもよい（左アーム）。ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍関連抗原を標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体は、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。腫瘍関連抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域／ドメイン（ＣＤ１６に結合する）を含む抗体は、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（Ｅ）。Ｂに示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原結合ドメインの両方が、ｓｃＦｖフォーマットをとり得る。Ｃ～Ｄは、腫瘍関連抗原に結合する２つの抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む、３つの抗原結合部位を有する抗体の図示である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、２つの腫瘍関連抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｄは、腫瘍関連抗原結合部位が、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを図示している。Ｅは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂフラグメント、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異は、１つの定常ドメイン上にＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ；ならびに反対側の定常ドメイン上にＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（ＣＤドメインでは三角形のロックアンドキー形状として示されている）を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖と軽鎖可変ドメインとの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表している。

Ｔｒｉｏｍａｂ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表したものであり、ＩｇＧのような形状を維持する３機能性の二重特異性抗体である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する、２つの半抗体からなる。トリオマブ形態は、１／２のラット抗体及び１／２のマウス抗体を含むヘテロ二量体構築物であり得る。

ＫｉＨＣｏｍｍｏｎＬｉｇｈｔＣｈａｉｎ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表したものであり、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）テクノロジーが含まれている。ＫｉＨは、標的１及び２に結合する２つのＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含むヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖及び両方の重鎖と対になる共通の軽鎖を含む、標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂフラグメントを有するヘテロ二量体構築物であり得る。

二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態のＴｒｉＮＫＥＴを表したものであり、可塑性天然リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを結合し、４価のＩｇＧ様分子を生成する。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂフラグメントの可変ドメインのＮ末端に融合されている、ホモ二量体構築物である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）形態には正常なＦｃが含まれている。

直交性Ｆａｂフラグメントインターフェース（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態のＴｒｉＮＫＥＴの提示であり、これは、Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂフラグメントを含むヘテロ二量体構築物である。軽鎖（ＬＣ）－重鎖（ＨＣ）の対合は、直交インターフェースによって保証される。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの変異によって保証される。

ツーインワン（２－ｉｎ－１）ＩｇフォーマットでのＴｒｉＮＫＥＴの提示である。

ＥＳ形態のＴｒｉＮＫＥＴの提示であり、これは、Ｆｃに融合された標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメントを含むヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの静電ステアリング変異によって保証される。

Ｆａｂアーム交換形態のＴｒｉＮＫＥＴの図示である：重鎖及び結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖－軽鎖の対と交換することによってＦａｂフラグメントアームを交換し、二重特異性をもたらす抗体。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１及び２に結合する２つのＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含むヘテロ二量体である。

標的１及び２に結合する２つのＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含むヘテロ二量体である、ＳＥＥＤＢｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの提示である。

ロイシンジッパーを使用して２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導する、ＬｕＺ－Ｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表したものである。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１及び２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含むヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって保証される。

Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの提示である。

Ａ～Ｂは、κλ－Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの提示であり、これは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂフラグメントを有するヘテロ二量体構築物である：抗原１を標的とする１つのＦａｂフラグメントにはカッパＬＣが含まれ、抗原２を標的とする第２のＦａｂフラグメントにはラムダＬＣが含まれる。Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な提示である。Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な提示である。

どちらもＦｃドメインに融合している、標的１に結合するＦａｂフラグメント及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインの変異によって保証される。

ＤｕｅｔＭａｂであり、これは、抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含むヘテロ二量体構築物である。Ｆａｂフラグメント１及び２には、軽鎖と重鎖の正しい対合を保証する示差的Ｓ－Ｓ架橋が含まれている。

ＣｒｏｓｓｍＡｂであり、これは、標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である。ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合され、ＣＬはＶＨとインラインで融合される。

Ｆｉｔ－Ｉｇであり、これは抗原２に結合するＦａｂフラグメントが、抗原１に結合するＦａｂフラグメントのＨＣのＮ末端に融合されているホモ二量体構築物である。この構築物は、野生型Ｆｃを含む。

ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するマウスハイブリドーマ上清から収集された抗体のバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－ＬａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）プロファイルを示す一連のトレースである。ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するマウスハイブリドーマ上清から収集された抗体のバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－ＬａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）プロファイルを示す一連のトレースである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１９Ａ）及びｃＣＬＥＣ１２Ａ（図１９Ｂ）に結合するマウスｍＡｂサブクローンから収集された抗体のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ＰＬ２１ＡＭＬ細胞株への精製されたＣＬＥＣ１２Ａサブクローンの結合を示す折れ線グラフである。

グリコシル化、脱グリコシル化、及び脱シアル化ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗体１６Ｂ８．Ｃ８及び９Ｆ１１．Ｂ７のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

抗体１６Ｂ８．Ｃ８に由来するＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。抗体１６Ｂ８．Ｃ８に由来するＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。抗体１６Ｂ８．Ｃ８に由来するＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。抗体１６Ｂ８．Ｃ８に由来するＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１３０４、Ｆ３’－１２９５及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴのｈＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞株ＲＭＡ－ｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合を示す折れ線グラフである。

Ｆ３’－１２９５及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＨＬ６０のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を示す折れ線グラフである。

ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５、Ｆ３’－１６０２、及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴのｈＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞株Ｂａ／Ｆ３（Ａ）、野生型Ｂａ／Ｆ３（Ｂ）、がん株ＨＬ６０（Ｃ）、及びがん株ＰＬ２１（Ｄ）への結合を示す折れ線グラフである。

Ｆ３’－１２９５、Ｆ３’－１６０２、及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１（図２８Ａ）及びＨＬ６０（図２８Ｂ）のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

Ｆ３’－１２９５（図２９Ａ）及びＦ３’－１６０２（図２９Ｂ）のキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって決定された等電点（ｐＩ）を示す折れ線グラフである。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３’－１２９５ＴｒｉＮＫＥＴのフローサイトメトリーに基づく多重特異性試薬（ＰＳＲ）分析を示す。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００１０のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３（Ａ）、がん株ＨＬ６０（Ｂ）、及び野生型Ｂａ／Ｆ３（Ｃ）に対するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００１０の結合を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００１０の存在下でのＫＨＹＧ－ＣＤ１６Ｖ細胞（Ａ）及び初代ＮＫ細胞（Ｂ）を使用したＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３（Ａ）及びがん株ＨＬ６０（Ｂ）への９Ｆ１１．Ｂ７及びｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００１０に由来するＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。

９Ｆ１１．Ｂ７に由来するＴｒｉＮＫＥＴの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＨＬ６０のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＡＢ０１９２の存在下でのＫＨＹＧ－ＣＤ１６Ｖ細胞（Ａ）及び初代ＮＫ細胞（Ｂ）を使用したＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＨＬ６０のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及び親ｍＡｂの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１（Ａ）及びＴＨＰ－１（Ｂ）のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのがん細胞株ＨＬ６０（Ａ）及びＰＬ２１（Ｂ）への結合を示す折れ線グラフである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３（Ａ）、ならびにがん細胞株ＨＬ６０（Ｂ）及びＰＬ２１（Ｃ）へのＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ、親ｍＡｂ、及びＡＢ０２３７ＮＫＧ２ＤデッドアームバリアントＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３（Ａ）、ならびにがん細胞株ＨＬ６０（Ｂ）及びＰＬ２１（Ｃ）へのＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ、親ｍＡｂ、及びＡＢ０２３７ＮＫＧ２ＤデッドアームバリアントＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３（Ａ）、ならびにがん細胞株ＨＬ６０（Ｂ）及びＰＬ２１（Ｃ）へのＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ、親ｍＡｂ、及びＡＢ０２３７ＮＫＧ２ＤデッドアームバリアントＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。

細胞株ＰＬ２１（図４０Ａ）及びＨＬ６０（図４０Ｂ）に対するＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ及び親ｍＡｂの表面保持を示す棒グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ、ＡＢ０１９２及び親ｍＡｂの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１（図４１Ａ）及びＨＬ６０（図４１Ｂ）のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１（図４２Ａ）及びＨＬ６０（図４２Ｂ）のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ、親ｍＡｂ、またはそのＮＫＧ２Ｄデッドバリアントの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１のＣＤ８－Ｔ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

血球へのｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ（灰色）、親ｍＡｂ（白色）、及び対照ＩｇＧ（黒色）の結合を示す一連のヒストグラムである。

組換えヒトＣＤ６４に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。組換えヒトＣＤ６４に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ＣＤ３２ａＨ１３１に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ＣＤ３２ａＨ１３１に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＤ３２ＡＲ１３１対立遺伝子（ＦＣγＲＩＩａＲ１３１）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ＡＲ１３１対立遺伝子（ＦＣγＲＩＩａＲ１３１）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＤ１６ａ高親和性対立遺伝子Ｖ１５８（ＦＣγＲＩＩＩａＶ１５８）に対して結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＤ１６ａ低親和性対立遺伝子Ｆ１５８（ＦＣγＲＩＩＩａＦ１５８）に対して結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ａ低親和性対立遺伝子Ｆ１５８（ＦＣγＲＩＩＩａＦ１５８）に対して結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩｂ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ｐＨ６．０で測定された、ヒトＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、ヒトＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、ヒトＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、ヒトＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ｐＨ６．０で測定された、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ｐＨ６．０で測定された、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ対照のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

ヒトＮＫＧ２Ｄに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。ヒトＮＫＧ２Ｄに結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＮＫＧ２Ｄ（ｃＮＫＧ２Ｄ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＮＫＧ２Ｄ（ｃＮＫＧ２Ｄ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合するｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＳＰＲプロファイルを示す一連のセンサーグラムである。

他方のＴｒｉＮＫＥＴアームの結合における一方のＴｒｉＮＫＥＴアームの占有についてＳＰＲによって決定された標的結合を示す折れ線グラフである。

ＮＫＧ２ＤＴｒｉＮＫＥＴアーム及びＣＤ１６ａの相乗効果についてＳＰＲによって決定された標的結合を示す折れ線グラフである。ＮＫＧ２ＤＴｒｉＮＫＥＴアーム及びＣＤ１６ａの相乗効果についてＳＰＲによって決定された標的結合を示す折れ線グラフである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞株Ｂａ／Ｆ３（図６０Ａ）、野生型Ｂａ／Ｆ３（図６０Ｂ）、がん株ＨＬ６０（図６０Ｃ）、及びがん株ＰＬ２１（図６０Ｄ）に対するｈＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５、Ｆ３’－１６０２、及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。ｈＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞株Ｂａ／Ｆ３（図６０Ａ）、野生型Ｂａ／Ｆ３（図６０Ｂ）、がん株ＨＬ６０（図６０Ｃ）、及びがん株ＰＬ２１（図６０Ｄ）に対するｈＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５、Ｆ３’－１６０２、及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。ｈＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞株Ｂａ／Ｆ３（図６０Ａ）、野生型Ｂａ／Ｆ３（図６０Ｂ）、がん株ＨＬ６０（図６０Ｃ）、及びがん株ＰＬ２１（図６０Ｄ）に対するｈＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１２９５、Ｆ３’－１６０２、及び対照ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す折れ線グラフである。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのフローサイトメトリーに基づく多重特異性試薬（ＰＳＲ）分析を示す。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのフローサイトメトリーに基づく多重特異性試薬（ＰＳＲ）分析を示す。

ヒトプロテオームマイクロアレイ全体と比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する１でのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの相対的結合（Ｚスコア）を示す棒グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＣＬＥＣ１２Ａ結合アームの疎水性パッチのモデルを示している。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＮＫＧ２Ｄ結合アームの疎水性パッチのモデルを示す。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＮＫＧ２Ｄ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＮＫＧ２Ｄ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴＮＫＧ２Ｄ結合アームのＣＤＲ長、表面疎水性、及び表面電荷のモデルに基づく棒グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析を示す折れ線グラフである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴについてｃＩＥＦによって決定されたｐＩを示す折れ線グラフである。

ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２の配列ライアビリティ修正バリアントを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２の配列ライアビリティ修正バリアントを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２の配列ライアビリティ修正バリアントを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２の配列ライアビリティ修正バリアントを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ｈＣＬＥＣ１２Ａに結合するｈＦ３’－１６０２の配列ライアビリティ修正バリアントを示す一連のフローサイトメトリープロットである。

ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びライアビリティ修正バリアントの存在下でのＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株ＰＬ２１のＮＫ細胞媒介性溶解を示す折れ線グラフである。

ＨＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２への３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）でのｈＣＬＥＣ１２Ａの結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ＨＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。ＨＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

ＨＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＣＤ１６ａＶ１５８への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。

ＨＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のストレス試料及び対照試料の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解パーセンテージを示すグラフである。

対照及びストレスのＦ３’－１６０２におけるＣＤＲＨ３ペプチドの一連の抽出イオンクロマトグラムである。

リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中でのｈＣＬＥＣ１２ＡのＦ３’－１６０２への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ｈＮＫＧ２Ｄへのリン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２の結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。ｈＮＫＧ２Ｄへのリン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２の結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

ｈＣＤ１６ａＶ１５８へのリン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中でのＦ３’－１６０２の結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。

リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２のストレス試料及び対照試料の存在下における、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解パーセンテージを示すグラフである。

ＣＳＴ製剤で４０℃で４週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２に対して３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）のｈＣＬＥＣ１２Ａが結合することを示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ＣＳＴ製剤で２～８℃で及び２５℃で４週間インキュベートした後、３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）のｈＣＬＥＣ１２ＡがＦ３’－１６０２に結合することを示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。ＣＳＴ製剤で２～８℃で及び２５℃で４週間インキュベートした後、３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）のｈＣＬＥＣ１２ＡがＦ３’－１６０２に結合することを示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ＣＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。ＣＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

ＣＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のｈＣＤ１６ａＶ１５８への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。

ＣＳＴ製剤中のＦ３’－１６０２のストレス試料及び対照試料の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解パーセンテージを示すグラフである。

ｐＨ５．０のストレス下でのインキュベーション後のＦ３’－１６０２のｃＩＥＦプロファイルである。

ｐＨ８．０のストレス下でのインキュベーション後のＦ３’－１６０２のｃＩＥＦプロファイルである。

ｐＨ５のストレス後のＦ３’－１６０２への３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）でのｈＣＬＥＣ１２Ａの結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ｐＨ８のストレス後のＦ３’－１６０２への３倍段階希釈（３００ｎＭ～０．４１ｎＭ）でのｈＣＬＥＣ１２Ａの結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

ｐＨ５のストレス後のｆ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の反応測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。ｐＨ５のストレス後のｆ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の反応測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

ｐＨ８のストレス後のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。ｐＨ８のストレス後のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

ｐＨ５ストレス後のＦ３’－１６０２の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解のパーセンテージを示すグラフである。

ｐＨ８のストレス後のＦ３’－１６０２の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解のパーセンテージを示すグラフである。

強制酸化ストレス後のｈＣＬＥＣ１２ＡのＦ３’－１６０２への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

強制酸化ストレス後のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。強制酸化ストレス後のＦ３’－１６０２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

強制酸化ストレス後のＦ３’－１６０２の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解のパーセンテージを示すグラフである。

低ｐＨ保持後のｈＣＬＥＣ１２ＡのＦ３’－１６０２への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。

低ｐＨ保持後のＨＮＫＧ２ＤへのＦ３’－１６０２の結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。低ｐＨ保持後のＨＮＫＧ２ＤへのＦ３’－１６０２の結合を示す一連のグラフである。上のパネルは、キャプチャーされたｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（９．７７ｎＭ～５μＭ）に注入されたＦ３’－１６０２の生データを表す色付きのセンサーグラムである。黒のオーバーレイは、生データの１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネルは、対応する分析対象物の濃度に対してプロットされた定常状態の応答測定値を表している。青い線は、定常状態Ｋ_Ｄ値を表す。

低ｐＨ保持後のＦ３’－１６０２のｈＣＤ１６ａＶ１５８への結合を示す一連の色付きセンサーグラムである。

低ｐＨ保持後のＦ３’－１６０２の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１細胞の溶解のパーセンテージを示すグラフである。

ＰＥＧ－６０００中の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０におけるＦ３’－１６０２の溶解度を示すグラフである。

濃度の関数としてのＦ３’－１６０２モノマー含有量のパーセンテージを示すグラフである。

熱ストレス条件後のＦ３’フォーマットのＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－１６０２（図１０２Ａ）及びＦ３フォーマットのＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００１０（図１０２Ｂ）の存在下でのＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ発現ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ－２１細胞の溶解率を示すグラフである。

酵母ディスプレイ親和性成熟ライブラリー構築の図解である。Ａ：ｐＥＴ１５９６ｓｃＦｖＣＤＲＨ３のＢａｍＨＩ制限酵素部位による置換。Ｂ：以前に導入されたＢａｍＨＩ制限部位でのＣＤＲＨ３変異ライブラリーオリゴの挿入。Ｃ：ＢａｍＨＩ線形化プラスミド及びライブラリーオリゴの酵母へのエレクトロポレーションとそれに続く酵母での相同組換え。酵母ディスプレイ親和性成熟ライブラリー構築の図解である。Ａ：ｐＥＴ１５９６ｓｃＦｖＣＤＲＨ３のＢａｍＨＩ制限酵素部位による置換。Ｂ：以前に導入されたＢａｍＨＩ制限部位でのＣＤＲＨ３変異ライブラリーオリゴの挿入。Ｃ：ＢａｍＨＩ線形化プラスミド及びライブラリーオリゴの酵母へのエレクトロポレーションとそれに続く酵母での相同組換え。酵母ディスプレイ親和性成熟ライブラリー構築の図解である。Ａ：ｐＥＴ１５９６ｓｃＦｖＣＤＲＨ３のＢａｍＨＩ制限酵素部位による置換。Ｂ：以前に導入されたＢａｍＨＩ制限部位でのＣＤＲＨ３変異ライブラリーオリゴの挿入。Ｃ：ＢａｍＨＩ線形化プラスミド及びライブラリーオリゴの酵母へのエレクトロポレーションとそれに続く酵母での相同組換え。

マウス免疫からＡＢ００８９までの発見プロセスを示している。上のパネルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。各バリアントの結合親和性及びＥＣ５０が示されている。ＢＭ、逆突然変異。マウス免疫からＡＢ００８９までの発見プロセスを示している。上のパネルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。各バリアントの結合親和性及びＥＣ５０が示されている。ＢＭ、逆突然変異。マウス免疫からＡＢ００８９までの発見プロセスを示している。上のパネルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。各バリアントの結合親和性及びＥＣ５０が示されている。ＢＭ、逆突然変異。マウス免疫からＡＢ００８９までの発見プロセスを示している。上のパネルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。各バリアントの結合親和性及びＥＣ５０が示されている。ＢＭ、逆突然変異。

ＣＤＲＨ３酵母ライブラリー１７のＦＡＣＳ分析を示している。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされたアフィニティー成熟酵母ディスプレイライブラリーの選択の最初のラウンド（Ａ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第２ラウンド（Ｂ）。０．１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第３ラウンド（Ｃ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａへの酵母細胞で提示されたライブラリー１７－Ｒ３の結合（Ｄ）。１０ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａで酵母細胞で提示された元のクローンｐＥＴ１５９６の結合（Ｅ）。ＣＤＲＨ３酵母ライブラリー１７のＦＡＣＳ分析を示している。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされたアフィニティー成熟酵母ディスプレイライブラリーの選択の最初のラウンド（Ａ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第２ラウンド（Ｂ）。０．１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第３ラウンド（Ｃ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａへの酵母細胞で提示されたライブラリー１７－Ｒ３の結合（Ｄ）。１０ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａで酵母細胞で提示された元のクローンｐＥＴ１５９６の結合（Ｅ）。ＣＤＲＨ３酵母ライブラリー１７のＦＡＣＳ分析を示している。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされたアフィニティー成熟酵母ディスプレイライブラリーの選択の最初のラウンド（Ａ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第２ラウンド（Ｂ）。０．１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓでソートされた選択の第３ラウンド（Ｃ）。１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａへの酵母細胞で提示されたライブラリー１７－Ｒ３の結合（Ｄ）。１０ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａで酵母細胞で提示された元のクローンｐＥＴ１５９６の結合（Ｅ）。

ＣＤＲＨ２酵母ライブラリー３０のＦＡＣＳ分析を示している。ライブラリー１７から同定された最良のクローンのバックグラウンド上に構築されたＣＤＲＨ２を無作為化することによって生成された開始酵母ディスプレイライブラリー（ＧＤＹＧＤＳＬＤＹ（配列番号３２２）ＣＤＲＨ３）（Ａ）。ソーティングは、両方のラウンドで１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓで実行した。それぞれ、ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓによるラウンド１（Ｂ）及びラウンド２（Ｃ）の選択後のフローサイトメトリー分析。１０ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓで酵母細胞に提示されたｐＥＴ１５９６の結合（Ｄ）。ＣＤＲＨ２酵母ライブラリー３０のＦＡＣＳ分析を示している。ライブラリー１７から同定された最良のクローンのバックグラウンド上に構築されたＣＤＲＨ２を無作為化することによって生成された開始酵母ディスプレイライブラリー（ＧＤＹＧＤＳＬＤＹ（配列番号３２２）ＣＤＲＨ３）（Ａ）。ソーティングは、両方のラウンドで１ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓで実行した。それぞれ、ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓによるラウンド１（Ｂ）及びラウンド２（Ｃ）の選択後のフローサイトメトリー分析。１０ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓで酵母細胞に提示されたｐＥＴ１５９６の結合（Ｄ）。

ライブラリー３０から特定された改良された親和性クローン（Ａ）とｐＥＴ１５９６（Ｂ）及びＡＢ０２３７（Ｃ）との比較である。ライブラリー３０から特定された改良された親和性クローン（Ａ）とｐＥＴ１５９６（Ｂ）及びＡＢ０２３７（Ｃ）との比較である。ライブラリー３０から特定された改良された親和性クローン（Ａ）とｐＥＴ１５９６（Ｂ）及びＡＢ０２３７（Ｃ）との比較である。

ＡＢ００８９の概略図である。ヘテロ二量体化変異及び操作された鎖間ジスルフィド架橋により、ＩｇＧ１Ｆｃの効率的な鎖の対合が保証される。ｓｃＦｖは、ヒト化及び配列ライアビリティが修正されたＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ１６Ｂ８．Ｃ８から誘導される。ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド架橋によって安定化される。

ＥＷ－ＲＶＴＦｃヘテロ二量体のＸ線結晶構造である。ＥＷ－ＲＶＴＦｃヘテロ二量体の全体構造とヒト野生型（ＷＴ）ＩｇＧ１Ｆｃホモ二量体（ＰＤＢＩＤ：３ＡＶＥ）との重ね合わせ（図１０９Ａ）。Ｗ－ＶＴ相互作用の対の領域の拡大図（図１０９Ｂ）。Ｅ－Ｒ相互作用の対の領域の拡大図（図１０９Ｃ）。

ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓヘテロ二量体Ｆｃの結晶構造を、３４９Ｃ（ＣＨ３Ａ）と３５４Ｃ（ＣＨ３Ｂ）の残基の間に形成された非対称ジスルフィド結合の拡大図とともに示している。

３つの異なる方向でのＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのリボン図モデル（上のパネル）と、同じ方向の対応する表面電荷分布（下のパネル）を示している。３つの方向が示されている：正面（左パネル：正面図；中央パネル：背面図）及び抗原係合表面（右パネル：上面図）の両方。

ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。矢印は、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして、ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが位置するラインを指している。内側の２本の点線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）。最も外側の２本の点線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

正（左）及び負の電荷（中央）を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性（右）を示している。ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームの表面電荷及び電荷対称性分析。矢印は、ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置するラインを指している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）が、さらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。正（左）及び負の電荷（中央）を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性（右）を示している。ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームの表面電荷及び電荷対称性分析。矢印は、ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置するラインを指している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）が、さらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

３つの異なる方向のリボン図を備えたＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂを示している。正面（左パネル：正面図、中央パネル：背面図）及び抗原結合表面（右パネル：上面図）の両方。

ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。矢印は、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして、ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームが、位置するラインを指している。内側の２本の点線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）。最も外側の２本の点線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームの表面電荷の分析及び疎水性分析を示している。矢印は、３７７の後期治療用抗体のデータベースを参照したＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームの位置を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）、がさらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームの表面電荷の分析及び疎水性分析を示している。矢印は、３７７の後期治療用抗体のデータベースを参照したＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームの位置を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）、がさらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

他の臨床段階の治療用ｍＡｂと比較したＡＢ００８９で使用されるヒトアクセプターフレームワークを示している。フェーズＩ＋由来の４００＋ｍＡｂを含む臨床段階の抗体データベースで頻繁に使用されるヒト生殖細胞系列に対するＡＢ００８９で使用されるフレームワークのベンチマーク。他の臨床段階の治療用ｍＡｂと比較したＡＢ００８９で使用されるヒトアクセプターフレームワークを示している。フェーズＩ＋由来の４００＋ｍＡｂを含む臨床段階の抗体データベースで頻繁に使用されるヒト生殖細胞系列に対するＡＢ００８９で使用されるフレームワークのベンチマーク。

分子の鎖組成（Ａ）ならびにＴｒｅｇ調整ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質免疫原性スケール（Ｂ）上のＡＢ００８９の鎖Ｈ、Ｓ、及びＬの位置を示すＡＢ００８９の漫画的表現を示す。分子の鎖組成（Ａ）ならびにＴｒｅｇ調整ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質免疫原性スケール（Ｂ）上のＡＢ００８９の鎖Ｈ、Ｓ、及びＬの位置を示すＡＢ００８９の漫画的表現を示す。

ＴｒｉＮＫＥＴ精製プロセスのフロー図を示している。

ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡキャプチャー溶出クロマトグラムを示している。

ＩＥＸローディング用にｐＨ調整及び濾過されたプロテインＡ溶出液のＳＥＣ分析を示している。

ＡＢ００８９プロテインＡのロード、フロースルー、及び溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。吸光度の読み取りに基づいて、１５μｌを「プロテインＡロード」及び「プロテインＡＦＴ」レーンにロードし、２μｇを「プロテインＡ溶出レーン」にロードした。主要なバンド約１２０ｋＤａはＡＢ００８９に対応する。

ＰｏｒｏｓＸＳ陽イオン交換クロマトグラムを示している。

ＡＢ００８９ＣＩＥＸのロード及び溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。吸光度の読み取りに基づいて、レーンには約２．０μｇのタンパク質を含む。主要なバンド約１２０ｋＤａはＡＢ００８９である。

ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の還元（「Ｒ」）及び非還元（「ＮＲ」）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示している。分子の３つの鎖（Ｓ、Ｈ、及びＬ）はＲレーンでラベル付けされている。ＮＲレーンのＦ３’はＡＢ００８９を指す。

精製されたＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２のＳＥＣ分析を示しており、積分ピーク面積によって決定される１００％モノマーを示す。

ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２のインタクトな質量分析を示している。インタクトなＡＢ００８９のＬＣ－ＭＳ分析は、１２６，１２９．１Ｄａの理論質量とよく一致する観測された質量（１２６，１３０．０Ｄａ）を示した。

ＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析、Ｒ（左パネル）及びＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析、ＮＲ（右パネル）を示している。ＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析、Ｒ（左パネル）及びＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析、ＮＲ（右パネル）を示している。

ｃＩＥＦによるＡＢ００８９の電荷プロファイルを示しており、これは、ＡＢ００８９が８．５２±０．０のｐＩで主要なピークを示したことを示している。

ＨＩＣによるＡＢ００８９の疎水性分析のクロマトグラムを示しており、これは、ＡＢ００８９が非常に純粋で均質であることを示している。

３つの異なる製剤でＤＳＣ分析によって評価されたＡＢ００８９の熱安定性を示している：ＰＢＳｐＨ７．４（Ａ）、ＨＳＴｐＨ６．０（Ａ）、及びＣＳＴ、ｐＨ７．０（Ａ）。

ＡＢ００８９の予測されたジスルフィドマップを示している。

ｓｃＦｖ（非還元及び還元）の操作されたジスルフィド対の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）、及びそのペプチド対の最も強い電荷状態を示している。

ＣＨ３－ＣＨ３分子間Ｆｃ操作ジスルフィドの同定を示している。

ＳＰＲによって試験されたＡＢ００８９へのヒトＣＬＥＣ１２Ａの結合を示している。ＳＰＲによって試験されたＡＢ００８９へのヒトＣＬＥＣ１２Ａの結合を示している。

ＣＬＥＣ１２ＡのＡＢ００８９及びテポジタマブベースの分子間結合が２状態モデルに一致していることを示している。

ＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子細胞株及びＡＭＬがん細胞株（ＰＬ－２１及びＨＬ－６０）へのＡＢ００８９の結合のＦＡＣＳ評価を示している。

ＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）ＷＴ（左パネル）及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）（右パネル）と比較した、遺伝的バリアントＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）（中央パネル）へのＡＢ００８９の結合を示している。ＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）ＷＴ（左パネル）及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）（右パネル）と比較した、遺伝的バリアントＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）（中央パネル）へのＡＢ００８９の結合を示している。

示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａ：ｈＣＬＥＣ１２Ａ未処理（左パネル）、ｈＣＬＥＣ１２Ａ脱シアル化（中央パネル）、及びｈＣＬＥＣ１２Ａ完全脱グリコシル化（右パネル）に対するＡＢ００８９結合を示している。示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａ：ｈＣＬＥＣ１２Ａ未処理（左パネル）、ｈＣＬＥＣ１２Ａ脱シアル化（中央パネル）、及びｈＣＬＥＣ１２Ａ完全脱グリコシル化（右パネル）に対するＡＢ００８９結合を示している。

ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ００８９の結合を示している。上部パネル：色付きのセンサーグラムは生データを表す。黒のオーバーレイは、１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネル：定常状態親和性適合。４つの独立したＢｉａｃｏｒｅチャネルからのデータが示される。ラインは、定常状態ＫＤ値を表す。ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ００８９の結合を示している。上部パネル：色付きのセンサーグラムは生データを表す。黒のオーバーレイは、１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネル：定常状態親和性適合。４つの独立したＢｉａｃｏｒｅチャネルからのデータが示される。ラインは、定常状態ＫＤ値を表す。ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ００８９の結合を示している。上部パネル：色付きのセンサーグラムは生データを表す。黒のオーバーレイは、１：１の反応速度論的適合を示す。下のパネル：定常状態親和性適合。４つの独立したＢｉａｃｏｒｅチャネルからのデータが示される。ラインは、定常状態ＫＤ値を表す。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブのカニクイザルＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのカニクイザルＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのカニクイザルＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのカニクイザルＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＨ１３１（ＦｃγＲＩＩａＨ１３１）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＨ１３１（ＦｃγＲＩＩａＨ１３１）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＲ１３１（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＲ１３１（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＲ１３１（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブのヒトＣＤ３２ａＲ１３１（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａＦ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａＦ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａＦ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ａＦ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩ）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。

ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。

ＡＢ００８９がＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄに同時に係合すると、強い結合が生じることを示している。

ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの結合アームのＡＢ００８９同時係合を示している。ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの結合アームのＡＢ００８９同時係合を示している。

ＳＰＲによるＡＢ０２３７、ＡＢ０１９２、及び３つのＣＬＥＣ１２Ａ結合参照ＴｒｉＮＫＥＴに関連する、ＡＢ００８９の結合エピトープの比較の要約である。ＡＢ００８９とｈＣＬＥＣ１２Ａとの相互作用は、ＡＢ０２３７、及び２つの対照分子ｃＦＡＥ－Ａ４９ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ及びｃＦＡＥ－Ａ４９テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）によってブロックされたが、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ－ｈ６Ｅ７ベースの分子によってはブロックされず、これは、ＡＢ００８９結合エピトープがＭｅｒｕｓ－ＣＬＬ１及びテポジタマブと重複することを示している。

ＨＬ６０及びＰＬ２１細胞を用いたＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを介した細胞毒性アッセイにおけるＡＢ００８９の効力を示している。

ＡＢ００８９が、がん細胞の一次ＮＫを介した細胞溶解を強力に増強し、親のｍＡｂを上回っていることを示している。

ＰＳＲアッセイ（図１５７Ａ）、ならびに既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）（図１５７Ｂ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９の概略図を示す。ＰＳＲアッセイ（図１５７Ａ）、ならびに既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）（図１５７Ｂ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９の概略図を示す。ＰＳＲアッセイ（図１５７Ａ）、ならびに既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）（図１５７Ｂ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９の概略図を示す。

ヒトプロテオームマイクロアレイ全体と比較して、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対して、１μｇ／ｍｌでのＡＢ００８９の相対結合（Ｚスコア）を示している。相対的な結合Ｚスコア（ｙ軸）とＡＢ００８９の上位２４個の識別された結合パートナー（ｘ軸）を示すプロット。ｈＣＬＥＣ１２ａは、位置１にプロットされ、Ｚスコアは１５０．６１である。

対照試料と比較したＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ００８９のＳＥＣ分析を示しており、ＡＢ００８９が高い安定性を示したことを示している。

対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。非還元（ＮＲ）（左パネル）及び還元（Ｒ）（右パネル）。対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。非還元（ＮＲ）（左パネル）及び還元（Ｒ）（右パネル）。

ＡＢ００８９がＨＳＴ中、ｐＨ６．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。ＡＢ００８９がＨＳＴ中、ｐＨ６．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。ＡＢ００８９がＨＳＴ中、ｐＨ６．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。

ＨＳＴ、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ００８９効力を示している。

ＳＥＣ分析で測定した対照試料と比較して、ＡＢ００８９がＣＳＴ、ｐＨ７．０、４０℃で４週間のインキュベーション後に高い安定性を示したことを示している。

対照試料と比較して、ＣＳＴ、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後、ＣＥ－ＳＤＳによってＡＢ００８９の断片化が観察されなかったことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。対照試料と比較して、ＣＳＴ、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後、ＣＥ－ＳＤＳによってＡＢ００８９の断片化が観察されなかったことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。

ＡＢ００８９がＣＳＴ中、ｐＨ７．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。ＡＢ００８９がＣＳＴ中、ｐＨ７．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。ＡＢ００８９がＣＳＴ中、ｐＨ７．０において４０℃で４週間後に安定であり、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１６１Ａ）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１６１Ｂ）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１６１Ｃ）への結合に影響を及ぼさないことを示す。

長期の熱ストレスが、対照と比較して、ＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後、ＡＢ００８９の効力に影響を与えなかったことを示している。

ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２ａ標的化アームのＣＤＲＨ３を含むトリプシンペプチドの抽出イオンクロマトグラムであり、これでは、ピーク形状の手動検査に基づいて、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ＣＤＲＨ３を含むペプチドのアスパラギン酸異性化の証拠は観察されなかったことが示された。

ＳＥＣ分析であって、これは強制酸化後の酸化ＡＢ００８９と対照試料との間で単量体含有量に差がないことを示している。

対照試料と比較して、強制酸化後にＣＥ－ＳＤＳによってＡＢ００８９の断片化が観察されなかったことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。対照試料と比較して、強制酸化後にＣＥ－ＳＤＳによってＡＢ００８９の断片化が観察されなかったことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。

酸化ストレスが、活性タンパク質含有量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７０Ｂ、中央パネル）、及びｈＣＤ１６Ａｖ（図１７０Ｃ、下部パネル）対する親和性に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。酸化ストレスが、活性タンパク質含有量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７０Ｂ、中央パネル）、及びｈＣＤ１６Ａｖ（図１７０Ｃ、下部パネル）対する親和性に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。酸化ストレスが、活性タンパク質含有量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７０Ｂ、中央パネル）、及びｈＣＤ１６Ａｖ（図１７０Ｃ、下部パネル）対する親和性に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。

ＡＢ００８９が強制酸化において安定していることを示している。

ＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９は高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、２週間）下で安定していることを示している。

ＣＥ－ＳＤＳ分析であり、ＡＢ００８９が長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後に低レベルの劣化ＡＢ００８９を示したことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。ＣＥ－ＳＤＳ分析であり、ＡＢ００８９が長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後に低レベルの劣化ＡＢ００８９を示したことを示している。ＮＲ（左パネル）及びＲ（右パネル）。

ｃＩＥＦであり、ＡＢ００８９が長期間の高ｐＨ曝露（ｐＨ８、４０℃、２週間）後に酸性シフトを示したことを示している。

長期間の高ｐＨ８．０のストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後のストレス試料と対照試料との間で、活性タンパク質の量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７５Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７５Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１７５Ｃ、下部パネル）の親和性に有意差がなかったことを示している。長期間の高ｐＨ８．０のストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後のストレス試料と対照試料との間で、活性タンパク質の量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７５Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７５Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１７５Ｃ、下部パネル）の親和性に有意差がなかったことを示している。長期間の高ｐＨ８．０のストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後のストレス試料と対照試料との間で、活性タンパク質の量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１７５Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１７５Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１７５Ｃ、下部パネル）の親和性に有意差がなかったことを示している。

ＡＢ００８９の効力が長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８、４０℃、２週間）後に約２分の１に減少したことを示している。

ＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９は低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、２週間）下で高度に安定していることを示している。

長期の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０４０℃、２週間）後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析であり、低レベルのＡＢ００８９分解が非還元（左パネル）及び還元（右パネル）ＣＥ－ＳＤＳによって検出されたことを示している。長期の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０４０℃、２週間）後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析であり、低レベルのＡＢ００８９分解が非還元（左パネル）及び還元（右パネル）ＣＥ－ＳＤＳによって検出されたことを示している。

ｃＩＥＦ分析であり、低ｐＨストレスに曝露されたＡＢ００８９が電荷プロファイルのわずかな酸性シフトを示すことを示している。

長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、２週間）の後、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１８０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１８０Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１８０Ｃ、下部パネル）に関して活性タンパク質含有量またはＡＢ００８９親和性に有意差がなかったことを示している。長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、２週間）の後、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１８０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１８０Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１８０Ｃ、下部パネル）に関して活性タンパク質含有量またはＡＢ００８９親和性に有意差がなかったことを示している。長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、２週間）の後、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図１８０Ａ、上部パネル）、ｈＮＫＧ２Ｄ（図１８０Ｂ、中央パネル）、またはｈＣＤ１６ａＶ（図１８０Ｃ、下部パネル）に関して活性タンパク質含有量またはＡＢ００８９親和性に有意差がなかったことを示している。

ＡＢ００８９の効力が、長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０４０℃、２週間）後も対照試料の効力と同様のままであることを示している。

ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２ａ標的化アームのＣＤＲＨ３を含むトリプシンペプチドの抽出イオンクロマトグラムであり、これでは、ピーク形状の手動検査に基づいて、低ｐＨ（ｐＨ５．０）への長期曝露後、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ＣＤＲＨ３を含むペプチド中のアスパラギン酸異性化の証拠は示されなかった。

ＡＢ００８９が６サイクルの凍結／解凍後に安定していることを示すＳＥＣ分析である。

６回の凍結／解凍サイクル後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析であり、還元（右パネル）または非還元ＣＥ－ＳＤＳ（左パネル）によって純度の低下が検出されなかったことを示す。６回の凍結／解凍サイクル後のＡＢ００８９のＣＥ－ＳＤＳ分析であり、還元（右パネル）または非還元ＣＥ－ＳＤＳ（左パネル）によって純度の低下が検出されなかったことを示す。

ＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９は攪拌ストレス（室温で３００ｒｐｍ、ディープウェルプレートで３日間）後に安定していることを示している。ＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９は攪拌ストレス（室温で３００ｒｐｍ、ディープウェルプレートで３日間）後に安定していることを示している。

ＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９が、単量体の損失パーセント損失を最小限に抑えながら１７５ｍｇ／ｍｌ超の濃縮を可能にしたことを示している。

ＡＢ００８９が、単量体を損失することなく、濃度（最大１７８ｍｇ／ｍｌ））に修正可能であることを示すグラフである。

低ｐＨ保持前後のプロテインＡ溶出液のＳＥＣ分析であり、ＡＢ００８９が生物製剤の製造に使用される低ｐＨ保持／ウイルス不活化条件で非常に安定していることを示している。

低ｐＨ保持後、ＡＢ００８９の電荷プロファイルが変化しないままであることを示している。

ｈＣＬＥＣ１２ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対するＡＢ００８９の親和性が、低ｐＨ保持の影響を受けなかったことを示している。ｈＣＬＥＣ１２ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対するＡＢ００８９の親和性が、低ｐＨ保持の影響を受けなかったことを示している。ｈＣＬＥＣ１２ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対するＡＢ００８９の親和性が、低ｐＨ保持の影響を受けなかったことを示している。

ＡＢ００８９の効力が低ｐＨ保持ステップ後に変化しなかったことを示している。

ＳＥＣ分析であって、低ｐＨ保持後に単量体％のプロファイルに変化が観察されなかったことを示す。ＳＥＣ分析であって、低ｐＨ保持後に単量体％のプロファイルに変化が観察されなかったことを示す。

低ｐＨ保持がＡＢ００８９の電荷プロファイルに有意な影響を与えなかったことを示している。

ＡＢ００８９がＰＬ２１ＡＭＬ細胞のヒトＮＫ細胞毒性を強力に増強することを示している。精製したヒトＮＫ細胞を一晩休ませ、翌日、ＤＥＬＦＩＡアッセイのために標識したＰＬ２１標的細胞と共培養した。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００８９または親ｍＡｂＡＢ０３０５の用量滴定は、１０ｎＭから開始して調製し、共培養に添加した。アッセイは、合計６人の健康なＮＫ細胞ドナーを用いて実施した。示されているのは代表的な結果である。特異的溶解を試験物質の濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ０１９２がＨＬ６０ＡＭＬ細胞のヒトＮＫ細胞毒性を強力に増強することを示している。精製したヒトＮＫ細胞を一晩休ませ、翌日、ＤＥＬＦＩＡアッセイのために標識したＨＬ６０標的細胞と共培養した。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００８９または親ｍＡｂＡＢ０３０５の用量滴定は、１０ｎＭから開始して調製し、共培養に添加した。アッセイは、合計４人の健康なＮＫ細胞ドナーを用いて実施した。示されているのは代表的な結果である。特異的溶解を試験物質の濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ０１９２がＰＬ２１ＡＭＬ細胞のヒトＮＫ細胞毒性を強力に増強することを示している。精製したヒトＮＫ細胞を一晩休ませ、翌日、ＤＥＬＦＩＡアッセイのために、標識したＰＬ２１標的細胞と共培養した。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０１９２または親ｍＡｂＡＢ０３０６の用量滴定は、１０ｎＭから開始して調製し、共培養に添加した。アッセイは、合計６人の健康なＮＫ細胞ドナーを用いて実施した。示されているのは代表的な結果である。特異的溶解を試験物質の濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ０１９２がＨＬ６０ＡＭＬ細胞のヒトＮＫ細胞毒性を強力に増強することを示している。精製したヒトＮＫ細胞を一晩休ませ、翌日、ＤＥＬＦＩＡアッセイのために標識したＨＬ６０標的細胞と共培養した。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０１９２または親ｍＡｂＡＢ０３０６の用量滴定は、１０ｎＭから開始して調製し、共培養に添加した。アッセイは、合計４人の健康なＮＫ細胞ドナーを用いて実施した。示されているのは代表的な結果である。特異的溶解を試験物質の濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ００８９活性が可溶性ＭＩＣ－Ａの存在によって影響されないことを示している。精製したヒトＮＫ細胞を一晩休ませ、翌日、ＤＥＬＦＩＡ標識ＰＬ２１標的細胞と共培養ウェル中に準備した。ＡＢ００８９及びＡＢ０３０５の用量滴定を調製し、可溶性ＭＩＣ－Ａ－Ｆｃを各試験物質の滴定シリーズに２０ｎｇ／ｍＬに添加した。用量漸増は、４パラメーターの非線形回帰モデルに適合した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ００８９はＰＬ２１ＡＭＬ細胞に対するヒトＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生及び脱顆粒を誘導することを示している。凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＡＢ００８９、ＡＢ０３０５、またはＦ３’－パリビズマブの用量滴定の存在下でＰＬ２１標的細胞と共培養した。インキュベーション後、ＣＤ１０７ａの脱顆粒及びＩＦＮγの細胞内蓄積のＦＡＣＳ分析のために細胞を調製した。示されている図は、試験された３人のＰＢＭＣドナーの代表である。誘導されたＩＦＮγ＋ＣＤ１０７＋ＮＫ細胞の割合を濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ００８９は、ＨＬ６０ＡＭＬ細胞に対するヒトＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生及び脱顆粒を誘導することを示している。凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＡＢ００８９、ＡＢ０３０５、またはＦ３’－パリビズマブの用量滴定の存在下でＨＬ６０標的細胞と共培養した。インキュベーション後、ＣＤ１０７ａの脱顆粒及びＩＦＮγの細胞内蓄積のＦＡＣＳ分析のために細胞を調製した。示されている図は、試験された３人のＰＢＭＣドナーの代表である。誘導されたＩＦＮγ＋ＣＤ１０７＋ＮＫ細胞の割合を濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴがＰＬ２１ＡＭＬ細胞に対してＭ０－マクロファージＡＤＣＰ活性を誘導することを示している。ｉｎｖｉｔｒｏで生成されたＭ０マクロファージを、細胞トレースバイオレットで標識し、細胞トレースバイオレットで標識し、細胞トレースＣＦＳＥ標識ＰＬ２１標的細胞と８：１のＥ：Ｔ比で共培養した。２時間後、フローサイトメトリー分析用に細胞を準備した。二重陽性細胞トレースバイオレット／ＣＦＳＥ細胞は食作用事象と見なされた。アッセイは、３人の独立したドナーに由来するマクロファージを用いて実施され、示された図が代表的な結果である。標的細胞の食作用のパーセンテージを、試験物質の濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＡＢ００８９がＰＬ２１ＡＭＬ細胞に対してＣＤＣを刺激しないことを示している。ＡＢ００８９は、５％のヒト血清を含む細胞培養培地でＢＡＴＤＡ標識ＰＬ２１細胞と６０分間インキュベートした。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照は陰性対照として機能したが、抗ＭＨＣクラスＩクローンＷ６／３２は、陽性対照として使用した。標的細胞の特異的溶解を濃度に対してプロットし、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させて効力値を生成した。データポイントは、平均±標準偏差を表す。

ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞株へのＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ及びそれらの親ｍＡｂの用量反応結合を、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞で分析した（Ａ）。ＣＬＥＣ１２Ａの内因性発現を伴うヒトがん細胞株（Ｂ）ＨＬ６０及び（Ｃ）ＰＬ２１を使用して、トランスフェクトされた細胞株での結果を裏付けた。示されている図は、表２０１に要約されている３つの独立した実験の結果を表している。ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞株へのＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ及びそれらの親ｍＡｂの用量反応結合を、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞で分析した（Ａ）。ＣＬＥＣ１２Ａの内因性発現を伴うヒトがん細胞株（Ｂ）ＨＬ６０及び（Ｃ）ＰＬ２１を使用して、トランスフェクトされた細胞株での結果を裏付けた。示されている図は、表２０１に要約されている３つの独立した実験の結果を表している。ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞株へのＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ及びそれらの親ｍＡｂの用量反応結合を、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞で分析した（Ａ）。ＣＬＥＣ１２Ａの内因性発現を伴うヒトがん細胞株（Ｂ）ＨＬ６０及び（Ｃ）ＰＬ２１を使用して、トランスフェクトされた細胞株での結果を裏付けた。示されている図は、表２０１に要約されている３つの独立した実験の結果を表している。

ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴに曝露されたＡＭＬ細胞株でのＣＬＥＣ１２Ａ表面保持を示している。（Ａ）ＨＬ６０及び（Ｂ）ＰＬ２１細胞上のＣＬＥＣ１２Ａ表面保持を、３７℃で２時間、４０ｎＭで試験物質に曝露した後に測定した。試験物質は飽和濃度で使用し、ヒトＩｇＧＦｃ特異的二次抗体を使用して検出した。３７℃で２時間後の染色強度を、氷上で２時間インキュベートした細胞での同じ試験物質の染色強度に正規化して、細胞表面に保持されたＣＬＥＣ１２Ａのパーセンテージを導き出した。データバーは重複ウェルの平均を表しており、エラーバーは標準偏差を表す。示されている図は、表２０２に要約されている３つの独立した実験の結果を表している。

３７℃で２時間後にＡＢ０２３７に正規化されたＡＢ００８９結合を示している。ＡＢ００８９とＡＢ０２３７の結合を、氷上または３７℃で２時間インキュベートした後のＨＬ６０細胞で比較した。ヒストグラムは以下のことを表している：（上から下に１番目）ＡＢ０２３７２時間３７℃、（上から下に２番目）ＡＢ０２３７氷上で２時間、（上から下に３番目）ＡＢ００８９３７℃で２時間、（上から下へ４番目）ＡＢ００８９氷上で２時間。全ての試験物質の結合は、抗ヒトＩｇＧＦｃフルオロフォアコンジュゲート抗体で検出した。

ＡＢ００８９が１０の一次ＡＭＬ患者試料にまたがってＣＬＥＣ１２Ａ＋芽球に結合することを示している。一次ＡＭＬ骨髄及びＰＢＭＣ試料は商業的供給業者から入手した。表３を参照のこと。試料は、表１の抗体パネルに従ってフローサイトメトリー分析用に調製した。ヒストグラムは、ＡＭＬ芽球の染色を以下のように表している：上から下に４番＝ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、上から下に３番目＝ＡＢ０３０５－ＣＦ５６８、上から下に２番目＝ＡＢ００８９－ＣＦ５６８、上から下に１番目＝抗ＣＬＥＣ１２５０Ｃ１－ＣＦ５６８。

ＡＢ００８９が、１０の一次ＡＭＬ患者試料にまたがってＣＬＥＣ１２Ａ＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞に結合することを示している。一次ＡＭＬ骨髄及びＰＢＭＣ試料は、商業的供給業者から入手した。表２００を参照のこと。表１９８の抗体パネルに従って、フローサイトメトリー分析用に試料を調製した。試料はさらにＣＤ３４＋ＣＤ３８－亜集団でゲートして、白血病幹細胞を濃縮した。ヒストグラムは以下のようにＣＤ３４＋ＣＤ３８－芽球での染色を示す：上から下へ４番目＝ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、上から下に３番目＝ＡＢ０３０５－ＣＦ５６８、上から下に２番目＝ＡＢ００８９－ＣＦ５６８、上から下に１番目＝抗ＣＬＥＣ１２５０Ｃ１－ＣＦ５６８。

免疫からＡＢ０１９２までの経路を示している。上のパネルは、ＳＰＲによるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。免疫からＡＢ０１９２までの経路を示している。上のパネルは、ＳＰＲによるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。免疫からＡＢ０１９２までの経路を示している。上のパネルは、ＳＰＲによるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。免疫からＡＢ０１９２までの経路を示している。上のパネルは、ＳＰＲによるＣＬＥＣ１２Ａ結合の結果を表している。下のパネルは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１ＡＭＬがん細胞への結合を示している。

ＡＢ０１９２の概略図を示している。専有的なヘテロ二量体化変異及び操作された鎖間ジスルフィド架橋により、ＩｇＧ１Ｆｃの効率的な鎖の対合が保証される。ｓｃＦｖは、ヒト化及び配列ライアビリティが修正されたＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ９Ｆ１１．Ｂ７から誘導される。ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド架橋によって安定化される。

ＡＢ０１９２を構成する３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列を示している。鎖Ｓ：抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖ－ＣＨ２－ＣＨ３（ヒト化配列、ＣＤＲは太字で下線なし、逆突然変異は太字で下線付き、操作されたｓｃＦｖジスルフィドはイタリック体で太字、ならびにヘテロ二量体化のＦｃ変異及び操作されたＣＨ３ジスルフィドは太字でない下線付き）。鎖Ｈ：抗ＮＫＧＤＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（完全ヒト、ＣＤＲは太字で下線が引かれておらず、ヘテロ二量体化のためのＦｃ変異、及び操作されたＣＨ３ジスルフィドは太字ではなく下線が引かれている）。鎖Ｌ：抗ＮＫＧＤＶＬ－ＣＬ（完全ヒト、ＣＤＲは太字で下線なし）。

他の臨床段階の治療用ｍＡｂと比較したＡＢ０１９２で使用されるヒトアクセプターフレームワークを示している。フェーズＩ＋由来の４００＋ｍＡｂを含む臨床段階の抗体データベースで頻繁に使用されるヒト生殖細胞系列に対するＡＢ０１９２で使用されるフレームワークのベンチマーク。他の臨床段階の治療用ｍＡｂと比較したＡＢ０１９２で使用されるヒトアクセプターフレームワークを示している。フェーズＩ＋由来の４００＋ｍＡｂを含む臨床段階の抗体データベースで頻繁に使用されるヒト生殖細胞系列に対するＡＢ０１９２で使用されるフレームワークのベンチマーク。

３つの異なる方向でのＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのリボン図モデル（上のパネル）、及び同じ方向の対応する表面電荷分布（下のパネル）を示している。抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖの電荷分布は分極化されており（「上面図」、下のパネル）、負に帯電した残基が主にＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ２内に存在する。３つの方向が示されている：正面（左パネル：正面図；中央パネル：背面図）及び抗原係合表面（右パネル：上面図）の両方。

ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。矢印は、ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置する場所を示している。内側の点線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）。最も外側の点線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

正電荷と負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。矢印は、ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置する場所を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）、がさらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。正電荷と負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。矢印は、ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置する場所を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）、がさらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

３つの異なる方向でのＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂアーム（上のパネル）、及び同じ方向のそれらの対応する表面電荷分布（下のパネル）のリボン図モデルを示している。３つの方向が示されている：正面（左パネル：正面図；中央パネル：背面図）及び抗原結合表面（右パネル：上面図）の両方。

ＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性分析のパッチを示している。矢印は、ＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂが、進行した臨床段階のｍＡｂを基準にして位置する場所を示している。内側の点線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）。最も外側の点線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

正電荷及び負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。矢印は、３７７の後期治療用抗体のデータベースを参照したＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂの位置を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）が、さらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。正電荷及び負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。矢印は、３７７の後期治療用抗体のデータベースを参照したＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂの位置を示している。各プロットには、２つの破線があり－一方は狭く、もう一方はさらに実線に近づいている。実線に近い破線は２ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９５％超）が、さらに実線に近い破線は３ＳＤを示す（この領域内の参照分子の９９．７％超）。

Ａ及びＢは、Ｔｒｅｇで調整されたＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質免疫原性スケールでのＡＢ０１９２鎖の位置を示している。Ａは、ＡＢ０１９２の漫画的表現を示している。Ｂは、Ｔｒｅｇ調整免疫原性タンパク質スケールでのＡＢ０１９２の鎖Ｈ、Ｓ、及びＬの位置を示している。Ａ及びＢは、Ｔｒｅｇで調整されたＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質免疫原性スケールでのＡＢ０１９２鎖の位置を示している。Ａは、ＡＢ０１９２の漫画的表現を示している。Ｂは、Ｔｒｅｇ調整免疫原性タンパク質スケールでのＡＢ０１９２の鎖Ｈ、Ｓ、及びＬの位置を示している。

ＡＢ０１９２の２ステッププラットフォーム精製の概略図を示している。左パネル：精製プロセスの最初のステップの前後のＡＢ０１９２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（タンパク質Ａキャプチャー）。中央のパネル：プロテインＡステップ後及びｃＩＥＸステップ後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析。右パネル：精製ＡＢ０１９２の還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ＡＢ０１９２の２ステッププラットフォーム精製の概略図を示している。左パネル：精製プロセスの最初のステップの前後のＡＢ０１９２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（タンパク質Ａキャプチャー）。中央のパネル：プロテインＡステップ後及びｃＩＥＸステップ後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析。右パネル：精製ＡＢ０１９２の還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ＡＢ０１９２の２ステッププラットフォーム精製の概略図を示している。左パネル：精製プロセスの最初のステップの前後のＡＢ０１９２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（タンパク質Ａキャプチャー）。中央のパネル：プロテインＡステップ後及びｃＩＥＸステップ後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析。右パネル：精製ＡＢ０１９２の還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ＡＢ０１９２の２ステッププラットフォーム精製の概略図を示している。左パネル：精製プロセスの最初のステップの前後のＡＢ０１９２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（タンパク質Ａキャプチャー）。中央のパネル：プロテインＡステップ後及びｃＩＥＸステップ後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析。右パネル：精製ＡＢ０１９２の還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

ＬＣ－ＭＳ分析を使用したＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のインタクト質量分析を示している。ＡＢ０１９２理論質量＝１２６，４２９．５Ｄａ．ＡＢ０１９２ロットＡＢ０１９２－００５観測質量＝１２６，４２９．９Ｄａ．

精製されたＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）分析を示しており、これによって、積分されたピーク面積によって決定して９９％超の単量体が示された。

ＣＥ－ＳＤＳによる非還元条件（「ＮＲ」；左パネル）及び還元条件（「Ｒ」；右パネル）によるＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）の純度を示している。ＣＥ－ＳＤＳによる非還元条件（「ＮＲ」；左パネル）及び還元条件（「Ｒ」；右パネル）によるＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）の純度を示している。

ＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のｃＩＥＦプロファイルを示している。

ＨＩＣによるＡＢ０１９２の疎水性分析を示している。

図２２５Ａ～図２２５Ｃは、３つの異なる緩衝系におけるＡＢ０１９２のＤＳＣ分析を示している。ＰＢＳｐＨ７．４（Ａ）、ＨＳＴ、ｐＨ６．０（Ｂ）及びＣＳＴ、ｐＨ７．０（Ｃ）。図２２５Ａ～図２２５Ｃは、３つの異なる緩衝系におけるＡＢ０１９２のＤＳＣ分析を示している。ＰＢＳｐＨ７．４（Ａ）、ＨＳＴ、ｐＨ６．０（Ｂ）及びＣＳＴ、ｐＨ７．０（Ｃ）。図２２５Ａ～図２２５Ｃは、３つの異なる緩衝系におけるＡＢ０１９２のＤＳＣ分析を示している。ＰＢＳｐＨ７．４（Ａ）、ＨＳＴ、ｐＨ６．０（Ｂ）及びＣＳＴ、ｐＨ７．０（Ｃ）。

ＡＢ０１９２の予測されるジスルフィドマップを示している。

ＣＨ３－ＣＨ３分子間Ｆｃ操作ジスルフィドの存在を示している。

ＳＰＲによって試験されたヒトＣＬＥＣ１２ＡへのＡＢ０１９２の結合を示している。ＳＰＲによって試験されたヒトＣＬＥＣ１２ＡへのＡＢ０１９２の結合を示している。

ＳＰＲによって試験されたＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）ＷＴ及びカニクイザルｃｙｎｏＣＬＥＣ１２Ａと比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）の遺伝的バリアントへのＡＢ０１９２の結合を示している。ＳＰＲによって試験されたＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）ＷＴ及びカニクイザルｃｙｎｏＣＬＥＣ１２Ａと比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）の遺伝的バリアントへのＡＢ０１９２の結合を示している。

ＳＰＲによって試験された示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２ＡへのＡＢ０１９２の結合を示している。ＳＰＲによって試験された示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２ＡへのＡＢ０１９２の結合を示している。

ＣＬＥＣ１２Ａ＋同質遺伝子、ならびにＨＬ６０及びＰＬ２１ＡＭＬ細胞へのＡＢ０１９２の結合を示している。

ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ０１９２の結合を示している。ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ０１９２の結合を示している。ＳＰＲによって試験されたヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ０１９２の結合を示している。

ｈＣＤ１６ａＶ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２の結合を示している。ｈＣＤ１６ａＶ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２の結合を示している。ｈＣＤ１６ａＶ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２の結合を示している。

ＡＢ０１９２がＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄに同時に結合し、強力な結合を生じることを示している。ＡＢ０１９２は、ＮＫＧ２Ｄ（グラフの右側に示されている中央の線）、ＣＤ１６ａ（グラフの右側に示されている下の線）、または混合されたＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄ（グラフの右側に示されている上の線）の表面に注入される。表面は最大の親和性効果のために最適化されていないことに注意のこと。

キャプチャーされたＡＢ０１９２がｈＣＬＥＣ１２Ａ及びｈＮＫＧ２Ｄで順次飽和することを示している。標的は、ＢｉａｃｏｒｅチップにキャプチャーされたＡＢ０１９２上に順次注入された。上のパネルは、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（１００ｎＭ）の結合と、それに続くキャプチャーされたＡＢ０１９２へのｈＮＫＧ２Ｄ（７μＭ）の結合を表している。下のパネルは、標的結合の逆の順序を示している（ヒトＮＫＧ２Ｄ結合とそれに続くｈＣＬＥＣ１２Ａ）。相対的結合化学量論（占有されていないキャプチャーされたＡＢ０１９２への各標的の結合と比較して）を表２１８に示す。キャプチャーされたＡＢ０１９２がｈＣＬＥＣ１２Ａ及びｈＮＫＧ２Ｄで順次飽和することを示している。標的は、ＢｉａｃｏｒｅチップにキャプチャーされたＡＢ０１９２上に順次注入された。上のパネルは、ｈＣＬＥＣ１２Ａ（１００ｎＭ）の結合と、それに続くキャプチャーされたＡＢ０１９２へのｈＮＫＧ２Ｄ（７μＭ）の結合を表している。下のパネルは、標的結合の逆の順序を示している（ヒトＮＫＧ２Ｄ結合とそれに続くｈＣＬＥＣ１２Ａ）。相対的結合化学量論（占有されていないキャプチャーされたＡＢ０１９２への各標的の結合と比較して）を表２１８に示す。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合を示している。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｈ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。

組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）Ｒ１３１対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。組換えヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２及びトラスツズマブの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）への結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えヒトＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因する。

ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。ＡＢ０１９２及びトラスツズマブの組換えカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示している。各分子の上のパネルは、生の結合センサーグラムを表しているが、下のパネルは定常状態の親和性モデルへの適合を表す。分子間の見かけの最大結合応答の相違は、分子量の相違に起因するものである。

他のＣＬＥＣ１２Ａ結合ＴｒｉＮＫＥＴに対するＡＢ０１９２のエピトープビニングを示している。

対応するｍＡｂ対照と比較した、一次ＮＫ媒介細胞毒性アッセイにおけるＡＢ０１９２の効力を示す。

Ａ及びＢは、ＰＳＲアッセイにおけるＡＢ０１９２の非特異性分析を示している。Ａ：ＰＳＲアッセイの概略図；Ｂ：既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９。Ａ及びＢは、ＰＳＲアッセイにおけるＡＢ０１９２の非特異性分析を示している。Ａ：ＰＳＲアッセイの概略図；Ｂ：既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９。Ａ及びＢは、ＰＳＲアッセイにおけるＡＢ０１９２の非特異性分析を示している。Ａ：ＰＳＲアッセイの概略図；Ｂ：既知のＰＳＲ結合を有する抗体（リツキシマブ）及び既知の非特異性を有さない抗体（トラスツズマブ）と比較したＰＳＲ結合ＡＢ００８９。

ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームマイクロアレイアッセイにおけるＡＢ００８９の相対Ｚスコアを示している。相対的な結合Ｚスコア（ｙ軸）対ＡＢ００８９の上位２４個の識別された結合パートナー（ｘ軸）を示すプロット。ｈＣＬＥＣ１２ａは、位置１にプロットされ、Ｚスコアは１５０．０６である。

対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示している。対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示している。

対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。非還元状態は左側のパネルに表示される。還元された状態が右側のパネルに表示される。対照と比較した、ＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。非還元状態は左側のパネルに表示される。還元された状態が右側のパネルに表示される。

ＡＢ０１９２がＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。ＡＢ０１９２がＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。ＡＢ０１９２がＨＳＴ中、ｐＨ６．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。

対照試料と、ＨＳＴ中で、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａを介した細胞毒性アッセイでｐＨ６．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のストレス試料との間で効力に差がなかったことを示している。

ＳＥＣ分析で測定した場合、ＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２の最小凝集を示している。ＳＥＣ分析で測定した場合、ＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２の最小凝集を示している。

ＣＥ－ＳＤＳ分析で測定した場合、対照と比較して、ＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２の最小の断片化を示している。ＣＥ－ＳＤＳ分析で測定した場合、対照と比較して、ＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２の最小の断片化を示している。

ＡＢ０１９２がＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。ＡＢ０１９２がＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。ＡＢ０１９２がＣＳＴ中、ｐＨ７．０で４週間４０℃のストレス後に安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないことを示している。

対照試料と、ＣＳＴ中で、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞毒性アッセイでｐＨ７．０で４０℃で４週間後のＡＢ０１９２のストレス試料との間で効力に差がなかったことを示している。

対照と比較した強制酸化ストレス後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、単量体含有量の有意な減少がないことが示された。対照と比較した強制酸化ストレス後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、単量体含有量の有意な減少がないことが示された。

対照と比較した強制酸化後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、純度が高いままであることが示された。対照と比較した強制酸化後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、純度が高いままであることが示された。

ＡＢ０１９２が酸化ストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。ＡＢ０１９２が酸化ストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。ＡＢ０１９２が酸化ストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。

ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａを介した細胞毒性アッセイでの強制酸化後のＡＢ０１９２の効力が対照試料と類似していたことを示している。

長期間の低ｐＨ曝露（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、単量体の損失がないことが示された。長期間の低ｐＨ曝露（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、単量体の損失がないことが示された。

長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された純度の相違が１％未満であることが示された。非還元状態が左側のパネルに表示される。還元された状態が右側のパネルに表示される。長期間の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された純度の相違が１％未満であることが示された。非還元状態が左側のパネルに表示される。還元された状態が右側のパネルに表示される。

ＡＢ０１９２が低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。ＡＢ０１９２が低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。ＡＢ０１９２が低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後に安定していること；ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がなかったことを示している。

ｃＩＥＦによる長期の低ｐＨストレス（ｐＨ５．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２の電荷分析を示しており、対照とｐＨ５のストレス試料とでは相違は見られない。

長期ｐＨ５．０のストレス後のＡＢ０１９２の効力が、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞毒性アッセイの対照と比較して変化しなかったことを示している。

長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、これは、１．６％の単量体の損失があったことを示している。長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、これは、１．６％の単量体の損失があったことを示している。

長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。純度のわずかな相違は、非還元（左）条件及び還元（右）条件で検出された。長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示している。純度のわずかな相違は、非還元（左）条件及び還元（右）条件で検出された。

ＡＢ０１９２が高ｐＨストレス後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がないことを示している。ＡＢ０１９２が高ｐＨストレス後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がないことを示している。ＡＢ０１９２が高ｐＨストレス後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響がないことを示している。

ｃＩＥＦによる長期間の高ｐＨストレス（ｐＨ８．０、４０℃、１４日）後のＡＢ０１９２の電荷分析を示しており、対照試料と比較してｐＨ８のストレス試料では酸性シフトしている。

ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞毒性アッセイによって評価されるように、高ｐＨ８．０のストレスへの長期曝露後のＡＢ０１９２の効力が有意に影響を受けなかったことを示している。

単量体の損失がないことを示した対照と比較して６サイクルの凍結／解凍後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示している。単量体の損失がないことを示した対照と比較して６サイクルの凍結／解凍後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示している。

凍結解凍ストレス後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、これによって、還元（右パネル）または非還元（左パネル）のいずれの条件でも純度が低下しないことが示された。凍結解凍ストレス後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、これによって、還元（右パネル）または非還元（左パネル）のいずれの条件でも純度が低下しないことが示された。

対照と比較した攪拌ストレス後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、これは、単量体の損失がないことを示した。対照と比較した攪拌ストレス後のＡＢ０１９２のＳＥＣ分析を示しており、これは、単量体の損失がないことを示した。

対照と比較した攪拌ストレス後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、これは、還元（右パネル）または非還元（左パネル）によって検出された断片化の増大がないことを示している。対照と比較した攪拌ストレス後のＡＢ０１９２のＣＥ－ＳＤＳ分析を示しており、これは、還元（右パネル）または非還元（左パネル）によって検出された断片化の増大がないことを示している。

ｐＨ保持試料対対照のＳＥＣ分析を示しており、これは、低ｐＨ保持後にプロファイルの変化が観察されなかったことを示していた。ｐＨ保持試料対対照のＳＥＣ分析を示しており、これは、低ｐＨ保持後にプロファイルの変化が観察されなかったことを示していた。

対照と比較した低ｐＨ保持後のＡＢ０１９２のｃＩＥＦ分析を示しており、これは、低ｐＨ保持がＡＢ０１９２の電荷プロファイルに測定可能な影響を与えなかったことを示している。

ＡＢ０１９２が低ｐＨ保持後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないこと、を示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。ＡＢ０１９２が低ｐＨ保持後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないこと、を示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。ＡＢ０１９２が低ｐＨ保持後も安定していること：ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａの結合には影響はないこと、を示している。最大結合シグナルのわずかな相違は、キャプチャーレベルの相違を反映している。

ＫＨＹＧ１－ＣＤ１６ａを介した細胞毒性アッセイで低ｐＨ保持後のＡＢ０１９２の効力を示しており、これは、低ｐＨ保持ステップ後もＡＢ０１９２の効力が変化していないことを示した。

低ｐＨ保持の前後のｈＣＬＥＣ１２ＡへのＡＢ００８９の結合を示している。絶対最大シグナルのわずかな相違は、ＡＢ００８９のキャプチャーレベルの相違を反映している。

低ｐＨ保持後にＡＢ００８９が安定していることを示している。低ｐＨ保持と対照試料の効力の間に差は観察されなかった。

本出願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原に結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本出願はまた、自己免疫疾患及びがんの治療などの目的のために、そのような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそのような多重特異性タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本出願に記載の多重特異性結合タンパク質の種々の態様が下記のセクションに記載されるが、しかしながら、１つの特定のセクションに記載される多重特異性結合タンパク質の種々の態様は、いずれの特定のセクションにも限定されるものではない。

本出願の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。

本明細書で使用される場合、用語「ａ」、及び「ａｎ」とは、「１つ以上」を意味し、文脈が不適切でない限り複数形を含む。

本明細書において用いる場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐のストレッチが、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知の、より保存された隣接ストレッチ間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン内の超可変領域間、及びそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間でお互いに対して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダ及び軟骨魚などの特定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する、単一の抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体に、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメントに、またはペプチドリンカーを使用して重鎖可変ドメインを、単一のポリペプチドの軽鎖可変ドメインに対して接続する、ｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在し得る。

本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞で、または腫瘍微小環境、例えば、腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤で発現され得る。本開示の好ましい実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語は、ＣＬＥＣ１２Ａを指す。

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される方法及び組成物によって治療される生物体を指す。そのような生物体としては、好ましくは、限定するものではないが、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が挙げられ、及び、より好ましくは、ヒトが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用または投与量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、任意の効果、例えば、病態、疾患、障害などの改善をもたらす、例えば、低下、低減、調節、改良、もしくは排除、またはそれらの症状の改良を含む。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、その組成物をｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏの治療的使用に本質的に好適にさせる不活性または活性な担体との組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、水中油型または油中水型のエマルジョン）、及びさまざまな種類の湿潤剤を指す。この組成物はまた、安定剤及び保存剤を含み得る。担体、安定化剤及びアジュバントの例に関しては、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照のこと。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、本出願に記載の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）であって、対象への投与後に本出願に記載の化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供し得る塩を指す。当業者に公知であるように、本出願に記載の化合物の「塩」は、無機または有機の酸及び塩基から誘導され得る。例示的な酸としては、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容されるものではないが、本出願に記載の化合物及びそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に採用され得る。

塩基の例としては、限定するものではないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ_４ ^＋（式中、Ｗは、Ｃ_１－４アルキルである）等の化合物等が挙げられる。

例示的な塩としては、限定するものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、例えば、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、及びＮＷ_４ ^＋（式中ＷはＣ_１－４アルキル基である）等の適切なカチオンと化合される、本出願に記載される化合物のアニオンが挙げられる。

治療用途のためには、本出願に記載の化合物の塩が薬学的に許容されるとして考慮される。しかしながら、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において、使用が認められ得る。

本明細書で使用される場合、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＬＬ－１、ＤＣＡＬ－２、ＭＩＣＬ、及びＣＤ３７１としても公知）とは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＱＧＺ９のタンパク質ならびに関連するアイソフォーム及びオルソログを指す。

説明全体を通して、組成物が特定の構成成分を有する、包含する、もしくは含むものとして記載される場合、またはプロセス及び方法が特定のステップを有する、包含する、もしくは含むものとして記載される場合、列挙される構成成分から本質的になるか、またはそれらからなる本出願に記載の組成物が存在し、列挙される処理ステップから本質的になるか、またはそれらからなる本出願によるプロセス及び方法が存在することが更に企図される。

一般的事項として、パーセンテージを明記する組成物は、特に指定がない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合には、当該変数の以前の定義が優先される。

Ｉ．タンパク質
本出願は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにＣＬＥＣ１２Ａに結合する、多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物及び治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に対する多重特異性結合タンパク質の結合は、腫瘍細胞を発現する腫瘍細胞の破壊に向かってナチュラルキラー細胞の活性を増強する。腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞への多重特異性結合タンパク質の結合は、これらの細胞をナチュラルキラー細胞に近接させ、ナチュラルキラー細胞による腫瘍細胞の直接的及び間接的な破壊を促進する。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、及び別の標的に結合する多重特異性結合タンパク質は、国際出願公開番号ＷＯ２０１８１４８４４５及びＷＯ２０１９１５７３６６（参照により本明細書に組み込まれていない）に開示されている。いくつかの例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明は、以下に提供される。

多重特異性結合タンパク質の最初の成分は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する抗原結合部位であり、この細胞としては、限定するものではないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、及びＣＤ８^＋αβ Ｔ細胞が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄが結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化することをブロックし得る。

多重特異性結合タンパク質の第２の構成要素は、腫瘍関連抗原であるＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗原結合部位である。腫瘍関連抗原発現細胞は、例えば、胃癌、食道癌、肺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、結腸直腸癌、卵巣癌、食道癌、子宮癌、子宮頸癌、頭頸部癌、神経膠腫、及び膵臓癌、または急性骨髄性白血病などの特定の血液悪性腫瘍などの固形腫瘍の適応症に見出され得る。

多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞及び濾胞樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する抗体Ｆｃドメインまたはその一部または抗原結合部位である。

多重特異性結合タンパク質の追加の抗原結合部位は、同じ腫瘍関連抗原に結合し得る。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれＦａｂフラグメントである。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はＦａｂフラグメントであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位はＦａｂであり、腫瘍関連抗原に結合する第２の及び追加の抗原結合部位はそれぞれＦａｂフラグメントである。

この抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配置されるか、または一緒に融合されてｓｃＦｖを形成する）を組み込んでもよく、または１つ以上の抗原結合部位は、ラクダ抗体のようなＶ_ＨＨ抗体もしくは軟骨魚に見られる抗体のようなＶ_ＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとり得る。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体である（図１）。この第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、及び任意選択で第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。この第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメイン及び任意選択で第１の軽鎖定常ドメインを含む。この第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。この第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意選択で第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。この第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメイン及び任意選択で第２の軽鎖定常ドメインを含む。この第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、この第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合し得る（図１）。いくつかの実施形態では、この第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を含む（例えば、図２Ａ）。いくつかの実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（対になってＮＫＧ２Ｄを結合するか、またはＣＬＥＣ１２Ａを結合する）から構成される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。この第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及びＣＨ１重鎖ドメインを含む。この免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対になり、ＮＫＧ２Ｄに結合するか、または腫瘍関連抗原に結合し、ただし、第１のＦｃドメインが、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖに融合されると、免疫グロブリン軽鎖と対になった第２の免疫グロブリン重鎖は、腫瘍関連抗原に結合するが、ＮＫＧ２Ｄには結合せず、その逆も同様であるという条件である。いくつかの実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖結合におけるｓｃＦｖはＣＬＥＣ１２Ａに結合し；そして、第２の免疫グロブリン重鎖の重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖の軽鎖可変ドメインは、対になると、ＮＫＧ２Ｄに結合する（例えば、図２Ｅ）。いくつかの実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖のｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄに結合し；そして、第２の免疫グロブリン重鎖の重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖の軽鎖可変ドメインは、対になると、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合し得る（例えば、図２Ａ）。

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、及び第２の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を含む（例えば、図２Ｂ）。いくつかの実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（対になってＮＫＧ２Ｄを結合するか、またはＣＬＥＣ１２Ａを結合する）から構成される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（対になってＮＫＧ２Ｄを結合するか、または腫瘍関連抗原を結合する）から構成される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に融合した第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含み、ただし、第１のＦｃドメインがＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖに融合すると、ｓｃＦｖに融合した第２のＦｃドメインが腫瘍関連抗原に結合するが、ＮＫＧ２Ｄには結合せず、その逆も同様であるという条件である。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合し得る（例えば、図２Ｂ）。

いくつかの実施形態では、上記の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結されている。いくつかの実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジは、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖを接続し、抗体重鎖定常ドメインは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジは、腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖを接続し、抗体重鎖定常ドメインは、アミノ酸Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む。いくつかの他の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒ及びＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の可塑性を提供し、可塑性と最適な形状との間のバランスをとり得る。

いくつかの実施形態では、上記の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得る（アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔの下で番号付けした）。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結されている。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（配列番号１１９））が用いられ得る。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置されている。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置されている。

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、１つ以上の追加の抗原結合部位をさらに含み得る。追加の抗原結合部位（複数可）は、任意選択でリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ２ドメインのＮ末端または定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。特定の実施形態では、追加の抗原結合部位（複数可）は、必要に応じてジスルフィド安定化され、四価または三価の多重特異性結合タンパク質をもたらす一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の形態をとる。例えば、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位、腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位、及び抗体定常領域またはその一部（ＣＤ１６またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位に結合するのに十分である）を含む。これらの抗原結合部位のいずれかは、Ｆａｂフラグメントまたは上記のｓｃＦｖなどのｓｃＦｖのいずれかの形態をとり得る。

いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位とは異なる腫瘍関連抗原のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じ重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同じアミノ酸配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列とは異なる重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位及び追加の抗原結合部位は、異なる腫瘍関連抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位及び追加の抗原結合部位は、異なる抗原に結合する。例示的なフォーマットが図２Ｃ及び図２Ｄに示されている。したがって、多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原の二価の係合を提供し得る。多重特異性タンパク質による腫瘍関連抗原の二価の係合は、腫瘍細胞表面上の腫瘍関連抗原を安定化し、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を増強し得る。多重特異性タンパク質による腫瘍関連抗原の二価の係合は、腫瘍細胞への多重特異性タンパク質のより強力な結合を付与し得、それにより、腫瘍細胞に向かう、特に低レベルの腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞に向かうＮＫ細胞のより強力な細胞毒性応答を促進する。

多重特異性結合タンパク質は、追加のフォーマットを取り得る。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧのような形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるトリオマブ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する、２つの半抗体からなる。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＫｉＨ形態であり、これは、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術を含む。ＫｉＨには、Ｃ_Ｈ３ドメインを操作して、各重鎖に「ノブ」または「ホール」を作成し、ヘテロ二量体化を促進することを含む。「ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にあるコンセプトは、小さな残基をかさばる残基（例えば、ＥＵ番号付けのＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）で置き換えることにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入することであった。「ノブ」に対応するために、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）で置き換えることによって他のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上で相補性「ホール」表面を作成した。「ホール」変異は、構造化ガイドファージライブラリースクリーニング（ＡｔｗｅｌｌＳ、ＲｉｄｇｗａｙＪＢ、ＷｅｌｌｓＪＡ、ＣａｒｔｅｒＰ．、Ｓｔａｂｌｅｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓｆｒｏｍｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｔｈｅｄｏｍａｉｎｉｎｔｅｒｆａｃｅｏｆａｈｏｍｏｄｉｍｅｒｕｓｉｎｇａｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７０（１）：２６－３５）によって最適化された。ＫｉＨＦｃバリアントのＸ線結晶構造（ＥｌｌｉｏｔｔＪＭ、ＵｌｔｓｃｈＭ、ＬｅｅＪ、ＴｏｎｇＲ、ＴａｋｅｄａＫ、ＳｐｉｅｓｓＣ、ｅｔａｌ．、Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｋｎｏｂａｎｄｈｏｌｅａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａＣＨ２－ＣＨ３ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）４２６（９）：１９４７－５７；ＭｉｍｏｔｏＦ、ＫａｄｏｎｏＳ、ＫａｔａｄａＨ、ＩｇａｗａＴ、ＫａｍｉｋａｗａＴ、ＨａｔｔｏｒｉＫ．ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎｏｖｅｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＦｃｖａｒｉａｎｔｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒＦｃγＲｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）５８（１）：１３２－８）によって、ヘテロ二量体化は、ＣＨ３ドメイン間コア界面での立体相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的に有利であり、一方でノブ－ノブ及びホール－ホール界面は、それぞれ、立体障害及び好ましい相互作用の破壊に起因してホモ二量体化を支持しないことが実証された。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態であり、これは、可塑性の天然に存在するリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、４価のＩｇＧ様分子を生じる。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交Ｆａｂインターフェース（オルソＦａｂ）形態である。オルトＦａｂＩｇＧアプローチ（ＬｅｗｉｓＳＭ、ＷｕＸ、ＰｕｓｔｉｌｎｉｋＡ、ＳｅｒｅｎｏＡ、ＨｕａｎｇＦ、ＲｉｃｋＨＬ、ｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｄｅｓｉｇｎｏｆａｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌＦａｂｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（２）：１９１－８）では、構造ベースの領域設計では、他のＦａｂフラグメントに変更を加えることなく、１つのＦａｂフラグメントのみでＬＣ及びＨＣ_{ＶＨ－ＣＨ１}インターフェイスに相補的な変異が導入される。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２－イン－１のＩｇフォーマットである。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＥＳ形態であり、これは、Ｆｃに融合された標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメントを含むヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの静電ステアリング変異によって保証される。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合された２つの異なるＦａｂフラグメントを有するヘテロ二量体構築物である、κλ－Ｂｏｄｙ形態である：抗原１を標的するＦａｂフラグメント１は、カッパＬＣを含み、そして抗原２を標的するＦａｂフラグメント２は、ラムダＬＣを含む。図１３Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な表現である。図１３Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な表現である。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態である（重鎖及び付着した軽鎖（半分子）を別の分子由来の重鎖－軽鎖対と交換することによって、Ｆａｂフラグメントアームを交換する抗体であり、その結果、二重特異性抗体をもたらす）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤＢｏｄｙ形態である。鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、非対称で二重特異性の抗体様分子を生成するように設計されている（天然抗体の治療の治療適用を拡大する能力）。このタンパク質工学プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連する配列の交換に基づいている。ＳＥＥＤ設計により、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成が可能になるが、一方でＡＧ及びＧＡＳＥＥＤＣＨ３ドメインのホモ二量体化は嫌う。（ＭｕｄａＭ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１１，２４（５）：４４７－５４））。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＬｕＺ－Ｙ形態であり、ロイシンジッパーを使用して、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導する。（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２），２８７：４３３３１－９）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態である。二重特異性ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙでは、２つの異なるペプチドが分岐アゼチジノンリンカーを使用して結合され、穏やかな条件下で部位特異的に足場抗体に融合される。ファーマコフォアが機能的活動を担うのに対し、抗体足場は長い半減期及びＩｇのような分布を付与する。ファーマコフォアは、化学的に最適化されるか、または他のファーマコフォアで置き換えられて、最適化されたか、または固有の二重特異性抗体を生成し得る。（ＤｏｐｐａｌａｐｕｄｉＶＲｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１０），１０７（５２）；２２６１１－２２６１６）。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、標的１に結合するＦａｂフラグメント、及びＦｃに融合された標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体形態である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの変異によって保証される。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＤｕｅｔＭａｂ形態であり、これは、抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメント、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含むヘテロ二量体構築物である。Ｆａｂフラグメント１及び２には、ＬＣ及びＨＣの正しい対合を保証する示差的Ｓ－Ｓ架橋が含まれている。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、クロスｍＡｂ形態であり、これは、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合された、標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂフラグメントを有するヘテロ二量体構築物である。ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインフレームで融合され、ＣＬはＶＨとインフレームで融合される。

いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂフラグメントが、抗原１に結合するＦａｂフラグメントのＨＣのＮ末端に融合される、ホモ二量体構築物であるＦｉｔ－Ｉｇ形態である。この構築物は、野性型Ｆｃを含む。

多重特異性結合タンパク質の個々の構成要素は、以下でより詳細に説明されている。

ＮＫＧ２Ｄ－結合部位
ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにＣＬＥＣ１２Ａに結合する際に、多重特異性結合タンパク質は、２種以上のＮＫ活性化受容体と係合し、ＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合をブロックし得る。特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトのＮＫ細胞を刺激し得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、ヒト、ならびにげっ歯類及びカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を刺激し得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、ヒト、ならびにカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を刺激し得る。

表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄに結合し得る、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂフォーマットで配置される。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、一緒に融合されて、ｓｃＦｖを形成する。

表１に列挙されているＮＫＧ２Ｄ結合部位は、ＮＫＧ２Ｄへの結合親和性が異なり得るが、それにもかかわらず、それらは全てヒトＮＫ細胞を活性化する。

特に指示がない限り、表１に記載されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って決定される。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ヒトＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位は、表１に開示された抗体のＶＨに対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び表１に開示された同じ抗体のＶＬに対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、Ｋａｂａｔの下で決定された重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、ＣｈｏｔｈｉａＣ＆ＬｅｓｋＡＭ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍＲＭｅｔａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５を参照）を含み、または当該技術分野で公知の任意の他のＣＤＲの決定方法は、抗体のＶＨ及びＶＬ配列を表１に開示する。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有すること、及び／または配列番号１のＣＤＲ１（配列番号２）、ＣＤＲ２（配列番号３）、及びＣＤＲ３（配列番号４）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことなどによって、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを含む。配列番号１に関して重鎖可変ドメインは、さまざまな軽鎖可変ドメインと結合して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成し得る。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んだ第１の抗原結合部位は、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び４６に由来する配列から選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込みこんでもよい。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び４６から選択された配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）と同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２７または２８、２９、及び３０または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号２７、２９、及び３０、またはそれぞれ配列番号２８、２９、及び３１）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号３３、３４、及び３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２７または２８、２９、及び３０または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号２７、２９、及び３０、またはそれぞれ配列番号２８、２９、及び３１）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号３３、３４、及び３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号３７または３８、３９、及び４０または４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号３７、３９、及び４０、またはそれぞれ配列番号３８、３９、及び４１）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４３、４４、及び４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号３７または３８、３９、及び４０または４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号３７、３９及び４０、またはそれぞれ配列番号３８、３９及び４１）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号４３、４４、及び４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２７、２９、及び４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号５０、３４、及び５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２７、２９、及び４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号５０、３４、及び５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号５２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号５８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号５３または５４、５５、及び５６または５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５、及び５６、またはそれぞれ配列番号５４、５５、及び５７）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号５９、６０、及び６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号５３または５４、５５、及び５６または５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号５３、５５及び５６、またはそれぞれ配列番号５４、５５及び５７）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号５９、６０、及び６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号６２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号６８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６３または６４、６５、及び６６または６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号６３、６５、及び６６、またはそれぞれ配列番号６４、６５、及び６７）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号５９、６０、及び６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６３または６４、５５、及び６６または６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号６３、６５及び６６、またはそれぞれ配列番号６４、６５及び６７）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号５９、６０、及び６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号８９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号９２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号５３または５４、５５、及び９０または９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号５３、５５、及び９０、またはそれぞれ配列番号５４、５５、及び９１）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号９３、４４、及び９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号５３または５４、５５、及び９０または９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号５３、５５及び９０、またはそれぞれ配列番号５４、５５及び９１）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号９３、４４、及び９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号７５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号７１または１１５、７２、及び７３または７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号７１、７２、及び７３、またはそれぞれ、配列番号１１５、７２、及び７４）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号７６、７７、及び７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号７１または１１５、７２、及び７３または７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号７１、７２及び７３、またはそれぞれ配列番号１１５、７２及び７４）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号７６、７７、及び７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号７９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び８３または８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び８３、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び８４）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び８３または８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び８３、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び８４）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び９６または９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び９６、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び９７）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び９６または９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び９６、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び９７）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号９８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び９９または１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び９９、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び１００）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び９６または９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び９９、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び１００）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０２または１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び１０２、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び１０３）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０２または１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び１０２、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び１０３）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０５または１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び１０５、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び１０６）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０５または１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び１０５、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び１０６）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１０７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０８または１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び１０８、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び１０９）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１０８または１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び１０８、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び１０９）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号８５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１１１または１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む（例えば、それぞれ、配列番号８０、８２、及び１１１、またはそれぞれ、配列番号８１、８２、及び１１２）。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８０または８１、８２、及び１１１または１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ（例えば、それぞれ配列番号８０、８２及び１１１、またはそれぞれ配列番号８１、８２及び１１２）；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１１４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。

多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞、γδ Ｔ細胞及びＣＤ８^＋αβＴ細胞を含むがこれらに限定されないＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合し得る。ＮＫＧ２Ｄが結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化することをブロックし得る。

多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、及び濾胞樹状細胞などの白血球の表面にあるＦｃ受容体である、ＣＤ１６を発現する細胞に結合する。本開示のタンパク質は、２ｎＭ～１２０ｎＭ、例えば、２ｎＭ～１１０ｎＭ、２ｎＭ～１００ｎＭ、２ｎＭ～９０ｎＭ、２ｎＭ～８０ｎＭ、２ｎＭ～７０ｎＭ、２ｎＭ～６０ｎＭ、２ｎＭ～５０ｎＭ、２ｎＭ～４０ｎＭ、２ｎＭ～３０ｎＭ、２ｎＭ～２０ｎＭ、２ｎＭ～１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～３ｎＭ、約３ｎＭ～４ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、約９ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、または約８ｎＭ～約１０ｎＭというＫ_Ｄの親和性でＮＫＧ２Ｄに結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、１０～６２ｎＭというＫ_ＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
ＣＬＥＣ１２Ａ結合部位

本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の腫瘍関連抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。表２は、組み合わせて、これらの腫瘍関連抗原に結合し得る重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的な配列を列挙している。

一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＣＬＥＣ１２Ａに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせてＣＬＥＣ１２Ａに結合し得る、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的な配列を列挙している。ＣＤＲ配列は、示されているようにＫａｂａｔ番号付けで識別される。

特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ（例えば、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ）に結合する第２の抗原結合部位は、表２に開示された抗体のＶＨに対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び表２に開示された同じ抗体のＶＬに対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示される抗原結合部位のＶＨ及びＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、ＣｈｏｔｈｉａＣ＆ＬｅｓｋＡＭ，（１９８７），ＪＭｏｌＢｉｏｌ１９６：９０１－９１７を参照）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍＲＭｅｔａｌ．，（１９９６）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２６２：７３２－７４５を参照）、または当該技術分野で公知の任意の他のＣＤＲの決定方法の下で決定された重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、この第２の抗原結合部位は、表２に開示される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

特定の実施形態では、この第２の抗原結合部位は、１６Ｂ８．Ｃ８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１３６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９２またはｓｃＦｖ－１３０１に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１４５または１４６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９３またはｓｃＦｖ－１３０２に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１４９または１５０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９４またはｓｃＦｖ－１３０３に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１５３または１５４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９５またはｓｃＦｖ－１３０４に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１７８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１５６または１５７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９６またはｓｃＦｖ－１３０５に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２５６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１６０または１６１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９７またはｓｃＦｖ－１３０６に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１６３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１６４または１６５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９８またはｓｃＦｖ－１３０７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１６７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１６８または１６９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１２９９またはｓｃＦｖ－１３０８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１７１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１７２または１７３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１３００またはｓｃＦｖ－１３０９に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１７５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１７６または１７７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ－１６０２またはｓｃＦｖ－２０６１に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１７８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２８９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１８０または１８１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１６Ｂ．Ｃ８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１５１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０３０５またはＡＢ５０３０に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２７１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号３３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３３６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬを含み、それぞれが、システインヘテロ二量体化変異を含む。このようなヘテロ二量体化変異は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進し得る。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２７４または２７５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１４７またはＡＢ７４１０に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２９５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３７、２９６、及び２７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３７、２９６、及び２７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２８０または２００と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、９Ｆ１１．Ｂ７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１９３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１９４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９１またはＡＢ０１８５に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１６２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２０３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号１８４または１８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９２またはＡＢ０１８６に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２０３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９５、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９５、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２０４または２０５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９３またはＡＢ０１８７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２０３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２０８または２０９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９４またはＡＢ０１８８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１６２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２１８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２１５または２１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９５またはＡＢ０１８９に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２１８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９５、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９５、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２５２または２５３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＢ０１９６またはＡＢ０１９０に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２１８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、このｓｃＦｖは、配列番号２５４または２５５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化９Ｆ１１．Ｂ７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２５０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、３０Ａ９．Ｅ９に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２４８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２２１、１６６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２４０、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２２１、１６６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号２４０、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、２３Ａ５．Ｈ８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２４２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２４３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２０６、１６６、及び２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２４５、２３９、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２０６、１６６、及び２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号２４５、２３９、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、２０Ｄ６．Ｈ８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２３８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２３７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２２１、２３６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１５２、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２２１、２３６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１５２、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１５Ａ１０．Ｇ８に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１５５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１５８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１５９、１７０、及び１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１８６、１８８、及び１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１５９、１７０、及び１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号１８６、１８８、及び１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１３Ｅ１．Ａ４に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１９０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１９１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９７、２０２、及び２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２１１、２１２、及び２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９７、２０２、及び２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号２１１、２１２、及び２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１２Ｆ８．Ｈ７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２１９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２２０、２２２、及び２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２２４、２２５、及び２２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２２０、２２２、及び２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号２２４、２２５、及び２２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、９Ｅ４．Ｂ７に由来する。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号２２９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２３０、２３１、及び２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２３３、２３４、及び２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２３０、２３１、及び２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）それぞれ配列番号２３３、２３４、及び２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。

特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位はｓｃＦｖである。例えば、特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４５、１４６、１４９、１５０、１５３、１５４、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７６、１７７、１８０、１８１、１８４、１８５、２０４、２０５、２０８、２０９、２１５、２１６、２５２、２５３、２５４、２５５、２７４、２７５、２８０、または２８１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。

あるいは、ＣＬＥＣ１２Ａに結合し得る新規の抗原結合部位は、配列番号２５８によって定義されるアミノ酸配列、そのバリアント、その成熟細胞外フラグメント、またはＣＬＥＣ１２Ａのドメインを含むフラグメントへの結合についてスクリーニングすることによって特定され得る。
配列番号２５８
MSEEVTYADLQFQNSSEMEKIPEIGKFGEKAPPAPSHVWRPAALFLTLLCLLLLIGLGVL
ASMFHVTLKIEMKKMNKLQNISEELQRNISLQLMSNMNISNKIRNLSTTLQTIATKLCRE
LYSKEQEHKCKPCPRRWIWHKDSCYFLSDDVQTWQESKMACAAQNASLLKINNKNALEFIKSQSRSYDYWLGLSPEEDSTRGMRVDNIINSSAWVIRNAPDLNNMYCGYINRLYVQYYHCTYKKRMICEKMANPVQLGSTYFREA（Uniprot ID番号Q5QGZ9)

ｓｃＦｖでは、ＶＨ及びＶＬは、リンカー、例えば、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４すなわち、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号１１９）によって接続され得ることが企図される。当業者は、他の開示されたリンカー（例えば、表１０を参照）のいずれかが、本明細書に（例えば、表２に）開示されたＶＨ及びＶＬ配列を有するｓｃＦｖで使用され得ることを理解するであろう。

前述の実施形態のそれぞれにおいて、本明細書では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するｓｃＦｖ、ＶＨ及び／またはＶＬ配列が、ＣＬＥＣ１２Ａへの能力に影響を与えることなくＶＨ及び／またはＶＬのフレームワーク領域にアミノ酸の変化（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、欠失、または付加）を含み得ることが企図される。例えば、本明細書では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するｓｃＦｖ、ＶＨ及び／またはＶＬ配列には、システインヘテロ二量体化変異が含まれている場合があり、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進することが企図される。

特定の実施形態では、本明細書に開示される第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、実施例１２に記載の方法を使用）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定した場合、１ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下というＫ_Ｄ（すなわち、解離定数）でヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合するか、ならびに／あるいは対象の体液、組織及び／または細胞由来のＣＬＥＣ１２Ａに結合する。特定の実施形態では、本明細書に開示される第二抗原結合部位は、ＳＰＲ（例えば、実施例１２に記載の方法を使用して）またはＢＬＩによって測定した場合、１ × １０^－５、１ × １０^－４、１ × １０^－３、５ × １０^－３、０．０１、０．０２、または０．０５１／ｓ以下のＫ_ｄ（すなわち、オフレート、Ｋ_オフとも呼ばれる）を有する。

特定の実施形態では、１５Ａ１０．Ｇ８または２０Ｄ６．Ａ８由来の第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、実施例１２に記載の方法を使用）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定された場合、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または３０ｎＭ以下というＫ_Ｄ（すなわち、解離定数）でカニクイザルＣＬＥＣ１２Ａに結合するか、ならびに／あるいは対象の体液、組織及び／もしく細胞由来のＣＬＥＣ１２Ａに結合する。特定の実施形態では、本明細書に開示の第二抗原結合部位は、ＳＰＲ（例えば、実施例１２に記載の方法を使用して）またはＢＬＩによって測定した場合、１ × １０^－３、５ × １０^－３、０．０１、０．０２、または０．０３１／ｓ以下のＫ_ｄ（すなわち、オフレート、Ｋ_オフとも呼ばれる）を有する。

異なる細胞型の表面でのＣＬＥＣ１２Ａのグリコシル化状態のバリエーションは、報告されている（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（２００６）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９－６９）。異なる患者のＡＭＬ細胞の表面に発現するＣＬＥＣ１２Ａは同様に異なるグリコシル化パターンを有する場合がある。さらに、分岐グリカンはＣＬＥＣ１２Ａのタンパク質成分へのアクセスを制限し得、利用可能なエピトープの多様性を制限し得る。本出願の特定の抗原結合部位は、グリコシル化の変動を克服し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される第２の抗原結合部位、例えば、１６Ｂ８．Ｃ８、ヒト化１６Ｂ８．Ｃ８、９Ｆ１１．Ｂ７、またはヒト化９Ｆ１１．Ｂ７由来の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａ（例えば、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ）に、グリコシル化に依存しない方法で結合し、すなわち、グリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａ及び脱グリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａの両方に結合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位が脱グリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａに結合するＫ_Ｄと、第２の抗原結合部位がグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａに結合するＫ_Ｄとの比率は、１：１０～１０：１の範囲内（例えば、１：５～５：１，１：３～３：１、または１：２～２：１の範囲内）である。特定の実施形態では、この比率は約１：５、約１：３、約１：２、約１：１．５、約１：１、約１．５：１、約２：１、約３：１、または約５：１である。特定の実施形態では、この比率は約１：１である。別の態様では、本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位、を含む多重特異性結合タンパク質を提供し、ここで、第２の抗原結合部位は、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する。

Ｋ２４４Ｑ置換を含むＣＬＥＣ１２Ａは、人口の約３０％に蔓延している多型バリアントである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質の第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｋ２４４Ｑに結合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位がＣＬＥＣ１２Ａ－Ｋ２４４Ｑに結合するＫ_Ｄと、第２の抗原結合部位が野性型ＣＬＥＣ１２Ａに結合するＫ_Ｄとの比率は、１：２～２：１の範囲内である。特定の実施形態では、この比率は約１：２、約１：１．５、約１：１、約１．５：１、または約２：１である。特定の実施形態では、この比率は約１：１である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、約８～約９の等電点（ｐＩ）でＣＬＥＣ１２Ａに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、約８．５～約８．９のｐＩでＣＬＥＣ１２Ａに結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、約８．７のｐＩでＣＬＥＣ１２Ａに結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴのＦ３’フォーマット（例えば、ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ）は、細胞、例えばがん細胞の表面上のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合において、対応するＦ３フォーマットＴｒｉＮＫＥＴ、例えば、ＡＢ００１０のものよりも約２倍低い（例えば、約１倍低い、約２倍低い、約３倍低い、約４倍低い、約５倍低い、約６倍低い）ＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴのＦ３’フォーマット（例えば、ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ）は、細胞、例えば、がん細胞の表面上のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合において、対応するＦ３フォーマットＴｒｉＮＫＥＴ、例えば、ＡＢ００１０のＥＣ５０よりも約５０％低い（例えば、約２５％低い、約３０％低い、約４０％低い、約５０％低い、約５５％低い、約６０％低い、約７０％低い、約７５％低い）ＥＣ５０を有する。

特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について、上記の対応する抗原結合部位と競合する。一態様では、本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位、を含む多重特異性結合タンパク質を提供し、ここで、第２の抗原結合部位は、本明細書に開示されるように、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗原結合部位と競合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について上に開示された１６Ｂ８．Ｃ８に由来する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について１６Ｂ８．Ｃ８と競合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について上に開示されたヒト化１６Ｂ８．Ｃ８に由来する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合についてヒト化１６Ｂ８．Ｃ８と競合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について上に開示された９Ｆ１１．Ｂ７に由来する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について９Ｆ１１．Ｂ７と競合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について上に開示されたヒト化９Ｆ１１．Ｂ７に由来する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合についてヒト化９Ｆ１１．Ｂ７と競合する。特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について上に開示された１２Ｆ８．Ｈ７、１３Ｅ１．Ａ４、１５Ａ１０．Ｅ８、２０Ｄ６．Ｈ８、または２３Ａ５．Ｈ８に由来する抗原結合部位と競合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合について、１２Ｆ８．Ｈ７、１３Ｅ１．Ａ４、１５Ａ１０．Ｅ８、２０Ｄ６．Ｈ８、または２３Ａ５．Ｈ８と競合する。
Ｆｃドメイン

Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合はヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は主に、ＣＨ２ドメイン中のアミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、及び炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに焦点を当てている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照のこと）。公知のドメインに基づいて、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用するなどして、ＣＤ１６への結合親和性を増強もしくは低減する変異を選択してもよいし、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて設計してもよい。したがって、特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその一部は、ヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む。

ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリは、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成され得、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリ及びヘテロ二量体のアセンブリがもたらされ得る。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリの促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、及びＵＳ１４／８３０３３６に示すように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに異なる変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、変異は、ヒトＩｇＧ１に基づいてＣＨ３ドメインで行われてもよく、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の別個の対を組み込む。以下に図示するアミノ酸置換の位置は全て、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従って番号付けされている。

ある状況では、第１のポリペプチドのアミノ酸置換により、元のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸に置き換えられ、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択された、より小さなアミノ酸に置き換え、その結果より大きいアミノ酸置換（隆起）は、小さいアミノ酸置換（空洞）の表面に適合する。例えば、１つのポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込み得、もう１つはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込み得る。

本出願に記載の抗体重鎖可変ドメインは、任意選択で、ＣＨ１ドメインを伴うかまたは伴わないヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部は、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１１８）に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントに連結された抗体定常ドメインは、ＣＤ１６に結合し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体Ｆｃドメインの一部（例えば、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部）を組み込み、ここでこの抗体Ｆｃドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメイン（例えば、ヒンジ及びヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン）、及び／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

１つ以上の変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して定常領域に組み込まれ得る、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ，Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｒ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。

特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。

あるいは、アミノ酸置換は、表３に示される以下の置換のセットから選択され得る。

あるいは、アミノ酸置換は、表４に示される以下の置換のセットから選択され得る。

あるいは、アミノ酸置換は、表５に示される以下の置換のセットから選択され得る。

あるいは、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は表６から選択してもよい。

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７の以下の置換のセットから選択され得、ここで、第１のポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、そして第２のポリペプチド列に示されているその位置（複数可）は、公知の正に帯電したアミノ酸に置き換えられる。

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表８の以下の置換のセットから選択され得、ここで、第１のポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、そして第２のポリペプチド列に示されているその位置（複数可）は、公知の負に帯電したアミノ酸に置き換えられる。

あるいは、アミノ酸置換は、表９に示される以下の置換のセットから選択され得る。

あるいは、またはさらに、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増大され得、これは、２つのポリペプチドの境界で人工的ジスルフィド架橋を形成する。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

いくつかの実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

例示的な多重特異性結合タンパク質
以下に列挙されているのは、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗原結合部位、及びそれぞれ抗体定常領域に連結されたＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を含むＴｒｉＮＫＥＴの例であり、抗体定常領域には、２つのＦｃ鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異が含まれる。

例示的なＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’及びＦ３フォーマットで企図されている。上記のように、Ｆ３’フォーマットでは、腫瘍関連抗原に結合する抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位はＦａｂである。Ｆ３フォーマットでは、腫瘍関連抗原に結合する抗原結合部位は、Ｆａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位はｓｃＦｖである。各ＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬ領域のＣｙｓの置換を含み、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。

ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して接続され得る。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、可塑性リンカーである。リンカーのアミノ酸組成に関して、ペプチドは、可塑性を付与し、本出願に記載のタンパク質の他のドメインの構造及び機能を妨害せず、プロテアーゼからの切断に抵抗する特性を有するように選択される。例えば、グリシン及びセリン残基は一般にプロテアーゼ耐性を提供する。特定の実施形態では、ＶＬは、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（（Ｇ_４Ｓ）_４）リンカー（配列番号１１９）を介してＶＨに対してＮ末端またはＣ末端に連結される。

リンカー（例えば、可塑性リンカー）の長さは、「短い」、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２アミノ酸残基であっても、または「長い」、例えば、少なくとも１３アミノ酸残基であってもよい。特定の実施形態では、リンカーは、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、または２０～２５アミノ酸残基の長さである。

特定の実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）_ｎ（配列番号１２０）、（ＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２１）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２２）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（配列番号１２３）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（配列番号１２４）、及び（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１２５）配列を含むか、またはそれらからなり、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。特定の実施形態では、リンカーは、表１０に列挙されるように、配列番号１１９及び配列番号１２６～１３４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴでは、腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結されている。Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、可塑性と最適な形状との間のバランスをとるために、肘のヒンジ領域の配列に含まれている。特定の実施形態では、追加の配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙは、ヒンジで、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒ配列のＮ末端またはＣ末端に付加され得る。

これらの例示的なＴｒｉＮＫＥＴを説明するために本明細書で使用される場合、Ｆｃは抗体ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各々の例示的なＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔの変異を含み、Ｆａｂに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するための一致する変異Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含む。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインはさらに、ＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ置換を含み、Ｆａｂに連結されたＦｃ上のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。これらの置換は、このサブセクションで説明されている配列では太字である。

例えば、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴであり、本明細書では「ｈＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ」及び「ＡＢ０２３７」とも呼ばれる。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のｓｃＦｖ－１６０２に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２５９）（「鎖Ｓ」）
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGLHWIRQPPGKCLEWIGVIWSGGKTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVQAADTAVYYCAKYDYDDSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINFWLSWYQQKPGKAPKLLIYEASNLHTGVPSRFSGSGSGTRFTLTISSLQPEDIATYYCQQSHSYPLTFGCGTKLEIK
GS
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI－VH－CH1－Fc（配列番号:260)（「鎖H」）
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI－VL－CL（配列番号261)（「鎖L」）
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたｃｌＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびに以下に説明するようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が含まれる。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ－１６０２のアミノ酸配列を有し、これは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してｓｃＦｖ－１６０２の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたｓｃＦｖ－１６０２の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇ４４及びＳ１００のＶＨ及びＶＬ領域のＣｙｓの置換を含み、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換が含まれ、ｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩ（配列番号８５）の軽鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含むＦａｂフラグメントの軽鎖部分を表す。

ポリペプチドｓｃＦｖ－１６０２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬをコードするＤＮＡ配列を表２６０に示す。

別の例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ｈＦ３’－２０６１ＴｒｉＮＫＥＴであり、本明細書ではＦ３’２０６１ＴｒｉＮＫＥＴとも呼ばれる。Ｆ３’－２０６１ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のｓｃＦｖ－１６０２に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＣ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。Ｆ３’－２０６１ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ（配列番号２６２）

ｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結された腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が以下に説明するように含まれる。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ－２０６１のアミノ酸配列を有し、これには（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してｓｃＦｖ－２０６１の軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続されたｓｃＦｖ－２０６１の重鎖可変ドメインが含まれる。ｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、ＳｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進する、ＶＨ及びＶＬ領域におけるＣｙｓの置換を含み得ることが企図される。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換が含まれ、ｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－ＦｃのＦｃのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ｓｃＦｖ－２０６１－ＶＬ－ＶＨ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

別の実施例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＡＢ００８９ＴｒｉＮＫＥＴである。ＡＢ００８９ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のＡＢ０３０５に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。ＡＢ００８９ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２７６）

ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結された腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が以下に説明するように含まれる。ｓｃＦｖには、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してＡＢ０３０５の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたＡＢ０３０５の重鎖可変ドメインが含まれている。ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇ４４及びＳ１００のＶＨ及びＶＬ領域のＣｙｓの置換を含み、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換が含まれる。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

別の例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＡＢ０１４７ＴｒｉＮＫＥＴである。ＡＢ０１４７ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のＡＢ０３０４に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。ＡＢ０１４７ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドＡＢ０３０４－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ＡＢ０３０４－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２７７）

ＡＢ０３０４－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結された腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が以下に説明するように含まれる。ｓｃＦｖには、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してＡＢ０３０４の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたＡＢ０３０４の重鎖可変ドメインが含まれている。ＡＢ０３０４－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、ＳｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進する、ＶＨ及びＶＬ領域におけるＧ４４及びＳ１００でのＣｙｓの置換を含む。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＡＢ００３７－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換が含まれる。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ＡＢ０３０５－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

別の実施例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＡＢ０１９２ＴｒｉＮＫＥＴである。ＡＢ０１９２ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のＡＢ０１９２に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。ＡＢ０１９２ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２７８）

ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結された腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が以下に説明するように含まれる。ｓｃＦｖには、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してＡＢ０１９２の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたＡＢ０１９２の重鎖可変ドメインが含まれている。ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、ＳｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド架橋の形成を促進する、ＶＨ及びＶＬ領域におけるＧ４４及びＳ１００でのＣｙｓの置換を含む。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換が含まれる。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

別の実施例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ｈＦ３’－１２９５ＴｒｉＮＫＥＴであり、本また明細書ではＦ３’－１２９５ＴｒｉＮＫＥＴとも呼ばれる。Ｆ３’－１２９５ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表２のｓｃＦｖ－１２９５に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）Ａ４９ＭＩ由来のＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。Ｆ３’－１２９５ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドｓｃＦｖ－１２９５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及びＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ｓｃＦｖ－１２９５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２８１）

ｓｃＦｖ－１２９５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結された腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が以下に説明するように含まれる。ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してｓｃＦｖ－１２９５の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたｓｃＦｖ－１２９５の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ－１２９５－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、ＶＨ及びＶＬ領域のＧ４４及びＳ１００でＣｙｓの置換を含み、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。

Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＮＫＧ２Ｄ結合Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号９５）及びＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＡＢ０１９２－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換が含まれる。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ｓｃＦｖ－１２９５－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

別の例では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３１６０２ＴｒｉＮＫＥＴであり、本明細書ではＡＢ００１０とも呼ばれる。Ｆ３１６０２ＴｒｉＮＫＥＴには、（ａ）表１のｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ配列を、ＶＨに位置するＮ末端からＶＬの方向に、Ｆｃドメインに連結されて、及び（ｂ）ｓｃＦｖ－１６０２由来のＣＬＥＣ１２Ａ結合Ｆａｂフラグメントを含み、これには、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、ここでこのＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。Ｆ３１６０２ＴｒｉＮＫＥＴには、３つのポリペプチドｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、１６０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及び１６０２－ＶＬ－ＣＬが含まれている。
ｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ（配列番号２８６）

1602-VH-CH1-Fc（配列番号287)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGLHWIRQPPGKGLEWIGVIWSGGKTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVQAADTAVYYCAKYDYDDSLDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
1602－VL－CL（配列番号288)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINFWLSWYQQKPGKAPKLLIYEASNLHTGVPSRFSGSGSGTRFTLTISSLQPEDIATYYCQQSHSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖＡ４９ＭＩの完全な配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ヘテロ二量体化のためのＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換、ならびに以下に説明するようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃでＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためのＳ３５４Ｃ置換が含まれる。ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを介してｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩの軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続されたｓｃＦｖ－１２９５の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、ＶＨ及びＶＬ領域のＧ４４及びＳ１００でＣｙｓの置換を含み、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進する。

１６０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分を表し、ＣＬＥＣ１２Ａ結合１６０２の重鎖可変ドメインとＦｃドメインに接続されたＣＨ１ドメインを含む。１６０２－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＦｃドメインには、ＣＨ３ドメインのＹ３４９Ｃ置換が含まれ、ｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。１６０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインには、ｓｃＦｖ－Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＶＬ－ＦｃのＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も含まれている。

１６０２－ＶＬ－ＣＬは、ＣＬＥＣ１２Ａ結合１６０２の軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインを含むＦａｂフラグメントの軽鎖部分を表す。

特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントに連結されたＦｃドメインがＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔの置換を含み、ならびに腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインが、ヘテロ二量体を形成するための一致する置換Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含むことを除いて、ＥＷ－ＲＶＴＦｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴの１つに対して同一である。特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントに連結されたＦｃドメインがＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、ならびに腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインが、ヘテロ二量体を形成するためのＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むことを除いて、ＫｉＨＦｃ変異を含む上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴの１つに対して同一である。

特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂフラグメントに連結されたＦｃドメインがＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換を含み、そして腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインには、ジスルフィド結合を形成するためのＣＨ３ドメイン中の一致するＹ３４９Ｃ置換が含まれていることを除いて、上記の例示的なＴｒｉＮＫＥＴの１つに対して同一である。

当業者は、タンパク質の生産および／または貯蔵中に、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）を（例えば、産生及び／または貯蔵中に、自発的にか、または存在する酵素によって触媒され）環化して、ラクタムを形成し得ることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥまたはＱであるいくつかの実施形態では、ＥまたはＱがピログルタミン酸で置き換えられた対応するアミノ酸配列も本明細書で企図される。

当業者はまた、タンパク質の生産および／または貯蔵中に、タンパク質のＣ末端リジン（Ｋ）が除去され得ることを理解するであろう（例えば、自発的にか、または生産および／もしくは貯蔵中に存在する酵素によって触媒されるか）。このようなＫの除去は、Ｃ末端にＦｃドメインを含むタンパク質で観察される場合が多い。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃドメイン配列）のＣ末端残基がＫであるいくつかの実施形態では、Ｋが除去された対応するアミノ酸配列も本明細書で企図される。

上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローニングしてもよく；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローニングしてもよく；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローニングしてもよく；そして、第１、第２、及び第３の発現ベクターは、宿主細胞に一緒に安定的にトランスフェクトして、多量体タンパク質を産生してもよい。

多重特異性タンパク質の最高の収量を達成するために、第１、第２、及び第３の発現ベクターの異なる比率を調べて、宿主細胞へのトランスフェクションに最適な比率を決定し得る。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当該技術分野で公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離し得る。

本出願はまた、本明細書で提供される多重特異性タンパク質の一部であるポリペプチドをコードする核酸も提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、３つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、（ａ）配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；及び（ｃ）配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本出願は、多重特異性タンパク質の一部である３つのポリペプチドのそれぞれをコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする核酸である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする核酸である。

別の態様では、本出願は、本明細書で提供される多重特異性タンパク質の一部であるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、それぞれが多重特異性タンパク質の一部である３つのポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。

本明細書で提供される多重特異性タンパク質を産生または作製する方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、以下を含む：（ａ）タンパク質の発現に適した条件下で宿主細胞を培養することであって、ここで、この宿主細胞は、多重特異性タンパク質の一部である１つ以上のポリペプチドをそれぞれコードする１つ以上の核酸を含むこと（ｂ）タンパク質を単離及び精製すること。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）タンパク質の発現に適した条件下で宿主細胞を培養することであって、この宿主細胞が、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含むこと；ならびに（ｂ）タンパク質を単離及び精製すること、を含む。

クローンは、バイオリアクターのスケールアップ及び多重特異性タンパク質の発現の維持に適した条件下で培養され得る。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結－解凍、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で公知の方法を使用して単離及び精製され得る。

ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
本明細書に記載の多重特異性タンパク質には、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する腫瘍関連抗原結合部位、及びＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する抗原結合部位が含まれる。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴフォーマット（例えば、図２Ｃ及び２Ｄ）に例示されるように、同じ腫瘍関連抗原（ＣＬＥＣ１２Ａ）に結合する追加の抗原結合部位を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体、すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれたものと同じ腫瘍関連抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と同様の熱安定性を示す。

いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ及び／またはＣＤ１６を発現する細胞、例えば、ＮＫ細胞、ならびにＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞、例えば、特定の腫瘍細胞に対して同時に結合する。多重特異性タンパク質のＮＫ細胞への結合は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に向けてＮＫ細胞の活性を増強し得る。ＮＫ細胞は、ストレスを受けた標的細胞に対してより強力な細胞毒性を示すことが報告されている（Ｃｈａｎｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ２１（１）：５－１４を参照のこと）。理論に拘束されることを望まないが、ＮＫ細胞がＴｒｉＮＫＥＴによって細胞の集団に係合されるとき、ＮＫ細胞はストレスを受けた標的細胞（例えば、悪性細胞及び腫瘍微小環境内の細胞）を選択的に殺滅し得ると仮定される。この機構は、ＴｒｉＮＫＥＴの特異性の増大及び毒性の低下に寄与する可能性があり、腫瘍関連抗原の発現が所望の標的細胞に限定されない場合でも、ストレスを受けた細胞を選択的に除去することを可能にする。

いくつかの実施形態では、この多重特異性タンパク質は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘導する。いくつかの実施形態では、この多重特異性タンパク質は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）様活性を誘導する。いくつかの実施形態では、この多重特異性タンパク質は、ＡＤＣＣ活性を誘導する。いくつかの実施形態では、この多重特異性タンパク質は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない。

いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応する抗腫瘍関連抗原モノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じ腫瘍関連抗原結合部位を含むモノクローナル抗体）と同様の親和性で腫瘍関連抗原に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体よりも、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を殺滅するのにより効果的である。

特定の実施形態では、腫瘍関連抗原の結合部位を含む、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、その腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養する場合、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａの脱顆粒及びＩＦＮ－γサイトカイン産生の増大によって特徴付けられる。さらに、対応する抗腫瘍関連抗原モノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。

いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原の結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養する場合、休止及びＩＬ－２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。

いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中及び低レベルの腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を標的化することにおいて利点を提供する。

いくつかの実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４フォーマット（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴが腫瘍関連抗原に結合する結合力を改善し、それは事実上、腫瘍細胞の表面での高レベルの腫瘍関連抗原の発現及び維持を安定化する。いくつかの実施形態では、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴまたはＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴよりも強力な腫瘍細胞の殺滅を媒介する。

ＩＩＩ．医薬製剤
本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質（例えば、Ｆ３’－１６０２）を含む医薬製剤を提供する。この医薬製剤は、１つ以上の賦形剤を含み、特定のｐＨに維持される。本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、所望の物理的または化学的特性、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を提供するためにこの製剤に添加される任意の非治療剤を意味する。

賦形剤及びｐＨ
本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の医薬製剤中の１つ以上の賦形剤は、緩衝剤を含む。本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、水溶液に添加されると、酸もしくはアルカリを添加するとき、または溶媒で希釈するときにｐＨの変動から溶液を保護し得る１つ以上の成分を指す。リン酸緩衝液に加えて、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン緩衝液などを使用してもよく、その場合、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

特定の実施形態では、緩衝液または緩衝液システムは、ｐＨ７．０～９．０の範囲と完全にまたは部分的に重複する緩衝範囲を有する少なくとも１つの緩衝液を含む。特定の実施形態では、緩衝液は、約７．０±０．５のｐＫａを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、約７．５±０．５のｐＫａを有する。

特定の実施形態では、緩衝液はクエン酸緩衝液を含む。特定の実施形態では、クエン酸塩は、５～１００ｍＭ、１０～１００ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～５０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２５ｍＭ、１５～２５ｍＭ、２０～２５ｍＭ、５～２０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または１５～２０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、クエン酸塩は、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、クエン酸塩は、２０ｍＭの濃度で存在する。

特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液を含むか、またはさらに含む。特定の実施形態では、リン酸塩は、５～１００ｍＭ、１０～１００ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～５０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～１００ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２５ｍＭ、１５～２５ｍＭ、２０～２５ｍＭ、５～２０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、または１５～２０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、リン酸塩は、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、リン酸塩は、１０ｍＭの濃度で存在する。リン酸塩は凍結乾燥された提示と容易に適合しないことが理解される。したがって、特定の実施形態では、医薬製剤中のリン酸塩の濃度は、もしあれば、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、５０μＭ、１０μＭ、５ μＭ、または１ μＭ以下である。特定の実施形態では、医薬製剤中のリン酸塩の濃度は、検出限界未満である。特定の実施形態では、医薬製剤を調製するときにリン酸塩は添加されない。

本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の医薬製剤は、７．０を超えるｐＨを有し得る。例えば、特定の実施形態では、医薬製剤は、７．０～８．０（すなわち、７．５±０．５）、７．０～７．８（すなわち、７．４±０．４）、７．０～７．６（すなわち、７．３±０．３）、７．０～７．４（すなわち、７．２±０．２）、７．０～７．２（すなわち、７．１±０．１）、７．１～７．３（すなわち、７．２±０．１）、７．２～７．４（すなわち、７．３±０．１）、７．３～７．５（すなわち、７．４±０．１）、７．４～７．６（すなわち、７．５±０．１）、７．５～７．７（すなわち、７．６±０．１）、７．６～７．８（すなわち、７．７±０．１）、７．７～７．９（すなわち、７．８±０．１）、または７．８～８．０（すなわち、７．９±０．１）というｐＨを有する。特定の実施形態では、医薬製剤は、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、医薬製剤は、７．０のｐＨを有する。科学的な四捨五入の規則では、６．９５以上かつ７．０５以下のｐＨは７．０として丸められる。

本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の医薬製剤中の１つ以上の賦形剤はさらに、糖及び糖アルコールを含む。糖及び糖アルコールは、熱安定剤として医薬製剤に有用である。特定の実施形態では、医薬製剤は、糖、例えば、単糖（グルコース、キシロース、またはエリスリトール）、二糖（例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、またはガラクトース）、またはオリゴ糖（例えば、スタキオース）を含む。特定の実施形態では、医薬製剤はスクロースを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、糖アルコール、例えば、単糖（例えば、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトール）に由来する糖アルコール、二糖（例えば、ラクチトールまたはマルチトール）に由来する糖アルコール、またはオリゴ糖由来の糖アルコールを含む。特定の実施形態では、医薬製剤はソルビトールを含む。

この製剤中に含まれる糖または糖アルコールの量は、この製剤が使用される特定の状況及び意図された目的に応じて変化し得る。特定の実施形態では、医薬製剤は、５０～３００ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、１００～２５０ｍＭ、１５０～３００ｍＭ、１５０～２５０ｍＭ、２００～３００ｍＭ、２００～２５０ｍＭ、または２５０～３００ｍＭの糖または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、または３００ｍＭの糖または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロースまたはソルビトール）を含む。

本明細書に開示される医薬製剤中の１つ以上の賦形剤は、サーファクタントをさらに含む。本明細書で使用される「サーファクタント」という用語は、疎水性部分（例えば、アルキル鎖）及び親水性部分（例えば、カルボキシル基及びカルボキシレート基）の両方を含む表面活性分子を指す。サーファクタントは、治療用タンパク質の凝集を低減するために医薬製剤に有用である。医薬製剤に使用するために適したサーファクタントは一般に、非イオン性サーファクタントであり、これには限定するものではないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；ソルビタンエステル及び誘導体；トリトン；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウムまたはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）が挙げられる。特定の実施形態では、サーファクタントはポリソルベートである。特定の実施形態では、サーファクタントは、ポリソルベート８０である。

本出願に記載される多重特異性結合タンパク質の医薬製剤内に含まれる非イオン性サーファクタントの量は、製剤に望まれる特定の特性、ならびにその製剤が使用を意図する特定の状況及び目的に応じて変化し得る。特定の実施形態では、製剤は、０．００５％～０．５％、０．００５％～０．２％、０．００５％～０．１％、０．００５％～０．０５％、０．００５％～０．０２％、０．００５％～０．０１％、０．０１％～０．５％、０．０１％～０．２％、０．０１％～０．１％、０．０１％～０．０５％、または０．０１％～０．０２％の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベート８０）を含む。特定の実施形態では、医薬製剤は、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベート８０）を含む。

特定の実施形態では、医薬製剤は、等張性である。「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有する製剤である。等張製剤は一般に約２５０～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＨ_２Ｏの浸透圧を有する。等張性は、蒸気圧または氷結型浸透圧計を使用して測定され得る。特定の実施形態では、医薬製剤の浸透圧は、２５０～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＨ_２Ｏである。特定の実施形態では、医薬製剤の浸透圧は３００～３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇＨ_２Ｏである。

糖、糖アルコール、及びＮａＣｌなどの物質を、望ましい浸透圧のために医薬製剤に含んでもよい。ＮａＣｌは凍結乾燥された提示と容易に適合しないことが理解される。したがって、特定の実施形態では、医薬製剤中のＮａＣｌの濃度は、もしあれば、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、または１μＭ以下である。特定の実施形態では、医薬製剤中のＮａＣｌの濃度は、検出限界未満である。特定の実施形態では、医薬製剤を調製するときにＮａＣｌ塩は添加されない。

本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の医薬製剤は、増量剤または防腐剤などの１つ以上の他の物質をさらに含み得る。「増量剤」とは、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが挙げられる。本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含み得る。防腐剤は細菌の作用を低減し、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。

例示的な製剤
特定の実施形態では、本出願に記載される多重特異性結合タンパク質の医薬製剤は、ｐＨ７．０以上（例えば、ｐＨ７．０～８．０）の緩衝液中の多重特異性結合タンパク質を含む。

特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０～２５ｍＭのクエン酸塩、２００～３００ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．００５％～０．０５％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、ｐＨ７．０～８．０を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を、ｐＨ７．０～７．５（例えば、ｐＨ７．０）で含む。

特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０～２５ｍＭのクエン酸塩、２００～３００ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．００５％～０．０５％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、２５０ｍＭの糖または糖アルコール（例えば、スクロース）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を、ｐＨ７．０～７．５（例えば、ｐｈ７．０）で含む。

特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、５～２０ｍＭのクエン酸塩、５～２０ｍＭのリン酸塩、及び１００～１５０ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０ｍＭのクエン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、及び１２５ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０ｍＭのクエン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、及び１２５ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．５～８．０（例えば、ｐＨ７．８）で含む。

特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、５～２０ｍＭのクエン酸塩、５～２０ｍＭのリン酸塩、及び１００～１５０ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０ｍＭのクエン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、及び１２５ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．０～８．０で含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍＬの多重特異性結合タンパク質、１０ｍＭのクエン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、及び１２５ｍＭのＮａＣｌを、ｐＨ７．５～８．０（例えば、ｐＨ７．８）で含む。

多重特異性結合タンパク質の安定性
本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の医薬製剤は、高レベルの安定性を示す。医薬製剤内の多重特異性結合タンパク質が、定義された条件下での保管後、許容可能な程度の物理的特性、化学構造及び／または生物学的機能を保持している場合、その製剤は安定している。

この医薬製剤の製造、保管、及び使用中のストレスには、限定するものではないが、熱ストレス（例えば、４０℃で４週間のインキュベーション）、凍結／解凍ストレス（例えば、６回の凍結／解凍サイクル）、攪拌ストレス（例えば、６０ｒｐｍ、４℃で１８時間の攪拌）、低ｐＨストレス（例えば、ｐＨ５．０、４０℃で２週間のインキュベーション）、高ｐＨストレス（例えば、ｐＨ８．０、４０℃で２週間のインキュベーション）、酸化ストレス（例えば、０．０２％過酸化水素で室温で２４時間の強制酸化）、または低ｐＨ保持（例えば、ｐＨ３．３で室温で１．５時間のインキュベーション）が挙げられる。特定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、これらのストレスのうちの１つ以上への曝露後に安定である。

安定性は、定義された温度で定義された時間保存した後、天然の高次構造のままである製剤中の多重特異性結合タンパク質のパーセンテージを決定することによって測定し得る。天然高次構造のタンパク質のパーセンテージは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）によって決定され得、ここで、天然高次構造のタンパク質は凝集されず（高分子量画分に溶出される）、または分解もされない（低分子量画分に溶出されることもない）。特定の実施形態では、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満の多重特異性結合タンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後に、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように、高分子量複合体（すなわち、天然タンパク質よりも高分子量を有する）を形成する。特定の実施形態では、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満の多重特異性結合タンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後に、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように、分解される（すなわち、天然タンパク質よりも低分子量を有する）。

安定性は、タンパク質の主要な画分（「主要な電荷形態」）と比較して、より酸性の画分（「酸性形態」）に存在する多重特異性結合タンパク質のパーセンテージを決定することによっても測定され得る。理論に拘束されることを望まないが、タンパク質の脱アミド化は、それをより負に帯電させ、したがって、脱アミド化されていないタンパク質と比較してより酸性にし得る（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＰｒｏｔｅｉｎＤｅａｍｉｄａｔｉｏｎ，（２００２）ＰＮＡＳ９９（８）：５２８３－８８を参照のこと）。タンパク質の酸性形態のパーセンテージは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー）または画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって決定され得る。特定の実施形態では、この医薬製剤中の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の多重特異性結合タンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後、主電荷形態である。特定の実施形態では、この医薬製剤中の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下の多重特異性結合タンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後、酸性型である。

安定性は、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性させた後、電気泳動によって多重特異性結合タンパク質の純度を測定することによっても測定され得る。タンパク質試料は、タンパク質のジスルフィド結合を還元する薬剤（例えば、β－メルカプトエタノール）の存在下で変性されても、または非存在下で変性されてもよい。特定の実施形態では、還元条件下（例えば、β－メルカプトエタノールの存在下）でタンパク質試料を変性させた後、キャピラリー電気泳動によって測定される、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。特定の実施形態では、還元条件下（例えば、β－メルカプトエタノールの存在下）でタンパク質試料を変性させた後、キャピラリー電気泳動によって測定される、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。特定の実施形態では、非還元条件下でタンパク質試料を変性させた後、キャピラリー電気泳動によって測定される、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。特定の実施形態では、還元条件下でタンパク質試料を変性させた後、キャピラリー電気泳動によって測定される、医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の純度は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。

安定性は、動的光散乱によってタンパク質溶液のパラメーターを決定することによっても測定され得る。Ｚ平均及び多分散度指数（ＰＤＩ）値は、溶液中の粒子の平均直径を示し、これらの測定値は、凝集体が溶液中に存在する場合に増大する。単量体％Ｐｄ値は、検出されたさまざまな単量体の広がりを示し、値が小さいほど、好ましい単分散溶液を示す。ＤＬＳによって検出された単量体サイズは、主要な母集団が単量体であることを確認し、存在し得る高次の凝集体を特徴付けるのに有用である。特定の実施形態では、医薬製剤のＺ平均値は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、５％、１０％、または１５％を超えて増大しない。特定の実施形態では、医薬製剤のＺ平均値は、本明細書に開示された１つ以上のストレスの後、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％を超えて増大しない。

上記のパラメーターの評価に加えて、タンパク質の機能特性を決定することによって安定性を測定し得る。本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６に結合する。従って、特定の実施形態によれば、解離定数（Ｋ_Ｄ）または最大結合応答（キャプチャーレベル）によって測定される、本明細書に開示される１つ以上のストレス後のＣＬＥＣ１２Ａ（例えば、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ）への多重特異性結合タンパク質の結合親和性は、対照試料（ストレスにさらされていない）の結合親和性よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％を超えて低くない。特定の実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）または最大結合応答（キャプチャーレベル）によって測定される、本明細書に開示される１つ以上のストレス後のＮＫＧ２Ｄ（例えば、ヒトＮＫＧ２Ｄ）への多重特異性結合タンパク質の結合親和性は、対照試料（ストレスにさらされていない）の結合親和性よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％を超えて低くない。特定の実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）または最大結合応答（キャプチャーレベル）によって測定される、本明細書に開示される１つ以上のストレス後のＣＤ１６（例えば、ヒトＣＤ１６ａＶ１５８）への多重特異性結合タンパク質の結合親和性は、対照試料（ストレスにさらされていない）の結合親和性よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％を超えて低くない。

本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ発現腫瘍細胞に対する細胞毒性を媒介する能力を有する。特定の実施形態では、混合培養細胞毒性アッセイにおいて多重特異性結合タンパク質のＥＣ５０によって測定される場合、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後にそのような細胞毒性を媒介する多重特異性結合タンパク質の能力は、対照試料（ストレスにさらされていない）における能力よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％を超えて大きくない。特定の実施形態では、混合培養細胞毒性アッセイにおいて標的細胞の最大溶解によって測定される場合、本明細書に開示される１つ以上のストレスの後にそのような細胞毒性を媒介する多重特異性結合タンパク質の能力は、対照試料（ストレスにさらされていない）における能力よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、または３０％を超えて大きくない。

医薬製剤中の多重特異性結合タンパク質の安定性を決定するための例示的な方法は、本開示の実施例１３及び１４に記載されている。さらに、タンパク質の安定性は、その標的に対する多重特異性結合タンパク質の結合親和性、またはＷＯ２０１８／１５２５１８に記載されているＮＫ細胞活性化アッセイ及び細胞毒性アッセイなどの特定のインビトロアッセイにおける多重特異性結合タンパク質の生物学的活性を測定することによって評価し得る。

剤形
医薬製剤は、液体製剤または凍結乾燥形態として調製及び保存され得る。特定の実施形態では、医薬製剤は、２～８℃（例えば、４℃）で貯蔵するための液体製剤、または－２０℃以下で貯蔵するための凍結製剤である。製剤中の糖または糖アルコールは、凍結防止剤として使用される。

医薬品を使用する前に、医薬製剤を、投与経路に適切な水性担体で希釈してもよいし、再構成してもよい。他の例示的な担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。例えば、医薬製剤が静脈内投与用に調製される場合、その医薬製剤は、０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で希釈してもよい。特定の実施形態では、希釈された医薬製剤は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。

この医薬製剤は、貯蔵に適した濃度の多重特異性結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０～２００ｍｇ／ｍＬ、１０～１５０ｍｇ／ｍＬ、１０～１００ｍｇ／ｍＬ、１０～５０ｍｇ／ｍＬ、１０～４０ｍｇ／ｍＬ、１０～３０ｍｇ／ｍＬ、１０～２５ｍｇ／ｍＬ、１０～２０ｍｇ／ｍＬ、１０～１５ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、２０～１５０ｍｇ／ｍＬ、２０～１００ｍｇ／ｍＬ、２０～５０ｍｇ／ｍＬ、２０～４０ｍｇ／ｍＬ、２０～３０ｍｇ／ｍＬ、２０～２５ｍｇ／ｍＬ、５０～２００ｍｇ／ｍＬ、５０～１５０ｍｇ／ｍＬ、５０～１００ｍｇ／ｍＬ、１００～２００ｍｇ／ｍＬ、１００～１５０ｍｇ／ｍＬ、または１５０～２００ｍｇ／ｍＬの濃度で多重特異性結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、または２００ｍｇ／ｍＬの濃度で多重特異性結合タンパク質を含む。

特定の実施形態では、この医薬製剤は、容器（例えば、バイアル、バッグ、ペン、または注射器）に包装される。特定の実施形態では、この製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。特定の実施形態では、容器中の多重特異性結合タンパク質の量は、単回投与としての投与に適している。特定の実施形態では、容器中の多重特異性結合タンパク質の量は、複数回投与としての投与に適している。特定の実施形態では、この医薬製剤は、０．１～２０００ｍｇの量の多重特異性結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、１～２０００ｍｇ、１０～２０００ｍｇ、２０～２０００ｍｇ、５０～２０００ｍｇ、１００～２０００ｍｇ、２００～２０００ｍｇ、５００～２０００ｍｇ、１０００～２０００ｍｇ、０．１～１０００ｍｇ、１～１０００ｍｇ、１０～１０００ｍｇ、２０～１０００ｍｇ、５０～１０００ｍｇ、１００～１０００ｍｇ、２００～１０００ｍｇ、５００～１０００ｍｇ、０．１～５００ｍｇ、１～５００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、２０～５００ｍｇ、５０～５００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、０．１～２００ｍｇ、１～２００ｍｇ、１０～２００ｍｇ、２０～２００ｍｇ、５０～２００ｍｇ、１００～２００ｍｇ、０．１～１００ｍｇ、１～１００ｍｇ、１０～１００ｍｇ、２０～１００ｍｇ、５０～１００ｍｇ、０．１～５０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１０～５０ｍｇ、２０～５０ｍｇ、０．１～２０ｍｇ、１～２０ｍｇ、１０～２０ｍｇ、０．１～１０ｍｇ、１～１０ｍｇ、または０．１～１ｍｇの量の多重特異性結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、この医薬製剤は、０．１ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇの量の多重特異性結合タンパク質を含む。

ＩＶ．治療適用
本出願は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を使用して自己免疫疾患またはがんを治療するための方法、及び／または本明細書に記載の医薬組成物（例えば、医薬製剤）を提供する。この方法は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する様々ながんを治療するために使用され得る。

治療法は、治療されるがんに応じて特徴付けられ得る。治療されるがんは、がん細胞の表面に発現される特定の抗原の存在に従って特徴付けられ得る。

ＣＬＥＣ１２Ａの発現を特徴とするがんとしては、限定するものではないが、胃癌、食道癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、結腸直腸癌、及び頭頸部癌などの固形腫瘍の適応が挙げられる。

本開示のタンパク質、コンジュゲート、細胞、及び／または医薬組成物は、がん細胞またはがん微小環境内の細胞がＣＬＥＣ１２Ａを発現するがんに限定されない、様々ながんを治療するために使用され得る。

治療法は、治療されるがんに応じて特徴付けされ得る。例えば、特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胸腺腫、腺嚢胞癌、胃腸癌、腎癌、乳癌、神経膠芽腫、肺癌、卵巣癌、脳癌、前立腺癌、膵臓癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態では、そのがんは、血液学的悪性腫瘍または白血病である。特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、急性Ｔリンパ芽球性白血病、または急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、または慢性骨髄性白血病の骨髄性芽球性発症である。

特定の実施形態では、ＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ）である。特定の実施形態では、ＭＲＤは、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）－遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオフォスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、及びＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１及びＩＤＨ２））から選択される変異の有無によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ＭＤＳは、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）、単一血球系統の異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、芽球増大を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）、染色体異常（ｉｓｏｌａｔｅｄｄｅｌ）（５ｑ）を伴うＭＤＳ、及び未分類型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）から選択される。特定の実施形態では、ＭＤＳは、一次ＭＤＳまたは二次ＭＤＳである。

特定の実施形態では、ＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）から選択される。特定の実施形態では、ＭＰＮは、真性赤血球増大症、本態性血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄線維症から選択される。特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫から選択される。特定の実施形態では、リンパ腫は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、及び組織球腫瘍から選択される。

ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。特定の他の実施形態では、この癌は、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態では、がんは、血管新生腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、先端レンチギン性黒色腫、化学線角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルシノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／脈絡叢癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、胆嚢癌、胃洞癌、胃眼底癌、ガストリノーマ、神経膠芽細胞腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮内扁平上皮細胞腫瘍、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽細胞腫、髄上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈｃａｎｃｅｒ）、粘膜類表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻道癌癌、神経系癌、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠癌、口腔癌（ｏｒａｌｃａｖｉｔｙｃａｎｃｅｒ）、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、線条体筋癌、中皮下癌、表在性転移性黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、尿路癌、子宮頸部癌、子宮体癌、子宮黒色腫、膣癌、疣贅癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。

特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫である。

ＩＶ．併用療法
本出願の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、自己免疫疾患を治療するため、またはがんを治療するために、追加の治療薬と組み合わせて使用され得る。

自己免疫性炎症性疾患を治療する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤は、Ｌｉｅｔａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８：４６０，に記載されており、これには、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、ＣＯＸ－２阻害剤）、グルココルチコイド（例えば、、プレドニゾン／プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びフッ素化グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン及びベータメタゾン）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、メトトレキサート、レフルノミド、金化合物、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗マラリア薬、Ｄ－ペニシラミン、及びシクロスポリン）、高ＴＮＦ生物学的製剤（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びそれらのバイオ後続品）、ならびにＣＴＬＡ－４を標的とする他の生物学的製剤（例えば、アバタセプト）、ＩＬ－６受容体（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ－１（例えば、アナキンラ）、Ｔｈ１免疫応答（ＩＬ－１２／ＩＬ－２３）（例えば、ウステキヌマブ）、Ｔｈ１７免疫応答（ＩＬ－１７）（例えば、セクキヌマブ）及びＣＤ２０（例えば、リツキシマブ）が挙げられる。

がんの治療における併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボクオン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリックス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチネート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフル、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニル、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、フォルメスタン、インターフェロンアルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ディフチトックス、インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子、及び同族受容体への異なる結合、または血清半減期の増減を示し得る前述の薬剤のバリエーションが挙げられる。

がんの治療における併用療法の一部として使用され得る追加のクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３の１つ以上を阻害する薬剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫の治療について米国食品医薬品局（ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。

がんの治療における併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的（例えば、ハーセプチン）を標的とするモノクローナル抗体薬剤及び非細胞毒性剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

さらに他のカテゴリーの抗癌剤としては、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基切除修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルートンのチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤に加えて２－クロロデオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが挙げられる。

本出願のタンパク質はまた、原発巣の外科的除去の補助としても使用され得る。

多重特異性結合タンパク質及び追加の治療薬の量、ならびに投与の相対的なタイミングは、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択され得る。例えば、そのような投与を必要とする患者に併用療法を施す場合、組み合わせの治療剤、または治療剤を含む医薬組成物（複数可）は、任意の順序で、例えば、連続して、一時に、一緒に、同時になどで投与されてもよい。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮する時間中に投与されてもよく、またはその逆であってもよい。

Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を含む医薬組成物を特徴とする。この組成物は、様々な薬物送達システムで使用するために製剤化されてもよい。１つ以上の生理学的に許容される賦形剤または担体もまた、適切な処方のために組成物に含まれてもよい。本開示で使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈｅｄ．，１９８５に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な論評については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照のこと。

本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含まれてもよい。特定の実施形態では、このバッグは、チューブ及び／またはニードルを含むチャネルに接続されてもよい。特定の実施形態では、この製剤は、凍結乾燥製剤であっても、または液体製剤であってもよい。特定の実施形態では、この製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）されて約１２～６０個のバイアルに含まれてもよい。特定の実施形態では、この製剤は、凍結乾燥されて４５ｍｇの凍結乾燥された製剤は、１つのバイアルに含まれてもよい。特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇの凍結乾燥製剤は、１つのバイアルに含まれてもよい。特定の実施形態では、１２、２７、または４５バイアルからの凍結乾燥製剤は、静脈内薬物製剤中でタンパク質の治療用量を得るために組み合わされる。特定の実施形態では、この製剤は、液体製剤であってもよく、そして約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。特定の実施形態では、この製剤は液体製剤であり得、約６００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。特定の実施形態では、この製剤は、液体製剤であり得、そして約２５０ｍｇ／バイアルとして保存され得る。

タンパク質は、製剤を形成する緩衝液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性製剤中に存在し得る。

これらの組成物は、従来の殺菌技法によって殺菌されてもよいし、または無菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのままで使用するために包装されてもよいし、または凍結乾燥させられてもよく、この凍結乾燥調製品は、投与の前に無菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１の間であり、より好ましくは５～９の間または６～８の間であり、最も好ましくは７～８の間、例えば７～７．５である。固体形態で得られた組成物は、固定量の上記の剤（複数可）をそれぞれ含有する、複数の単回用量単位で包装されてもよい。固体形態の組成物はまた、可塑性量のために容器に包装されてもよい。

特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて、本開示のタンパク質を含む延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。

特定の実施形態では、ｐＨ緩衝液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。緩衝液は、約４～約８の範囲、例えば、約４．５～約６．０、もしくは約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有してもよいし、または約５．０～約５．２のｐＨを有してもよい。上記のｐＨの中間の範囲もまた、本開示の一部であるものとする。例えば、任意の上記の値の組み合わせを上限及び／または下限として使用する値の範囲は、含まれるものとする。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸塩ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。

特定の実施形態では、この製剤は、ｐＨを約４～約８の範囲に維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含む緩衝系を含む。特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０、もしくは約ｐＨ４．８～約ｐＨ５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲であってもよい。特定の実施形態では、この緩衝系としては、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が挙げられる。特定の実施形態では、この緩衝系としては約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）、および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）が挙げられる。特定の実施形態では、この緩衝系は、約１～約１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５～約０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５～約１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７～約１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び約６．０～約６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。

等張化剤として作用し、抗体を安定化し得るポリオールもまた、この製剤に含まれてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に関して変更されてもよい。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少量の単糖（例えば、マンニトール）を添加してもよい。特定の実施形態では、等張化剤として製剤において使用され得るポリオールは、マンニトールである。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５～約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０～約１４ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、ポリオールソルビトールが、製剤に含まれてもよい。

界面活性剤またはサーファクタントも配合物に添加されてもよい。例示の界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８等）が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させるか、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑えるか、及び／または吸着を低減させるような量である。特定の実施形態では、この製剤は、ポリソルベートであるサーファクタントを含み得る。特定の実施形態では、この製剤は、界面活性剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含み得る。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０とは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記述するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，ＬｅｘｉｋｏｎｄｅｒＨｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，ＥｄｉｔｉｏＣａｎｔｏｒＶｅｒｌａｇＡｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈｅｄ．，１９９６を参照のこと）。特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬを含み得る。特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０を製剤に添加し得る。

実施形態では、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＵＳＰ／ＰｈＥｕｒタイプＩ５０Ｒバイアル（ゴム栓で閉じられ、アルミニウムクリンプシールクロージャーで密封されている）のいずれかで提供され得る。ストッパーは、ＵＳＰ及びＰｈＥｕｒに準拠したエラストマーでできている場合がある。特定の実施形態では、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な容積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液で満たされ得る。特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。

特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液として、安定化レベルの糖と組み合わせて、調製され得る。特定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、サーファクタント、及び防腐剤のうちの１つ以上も含んでもよい。

特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容可能な酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であってもよい。特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、収集／細胞清澄化、精製、薬物／薬物生成物の保管中及び試料分析中に発生し得るペプチド及びタンパク質の一般的な生成物のバリアントである。脱アミド化は、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ_３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解により、１８ダルトンの質量が増大する。水性条件下では不安定であるため、スクシンイミド中間体の単離は困難である。そのため、脱アミド化は通常、１ダルトンの質量増大として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響を与えるパラメーターとしては、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド高次構造及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化率に影響する。タンパク質配列のＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化に対する感受性を高くする。

特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノ化を防ぐために、ｐＨ及び湿度の条件下で保存され得る。

本明細書における目的の水性担体とは、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

細菌の作用を低減するために、防腐剤を本明細書の製剤に任意選択で添加してもよい。防腐剤の添加によって、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の生成が容易になり得る。

静脈内（ＩＶ）製剤は、ＩＶ経路を介して全ての薬剤を投与された移植後に患者が入院している場合など、特定の場合に好ましい投与経路であり得る。特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈される。特定の実施形態では、注射用の希釈された薬物生成物は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。

特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを含むさまざまな公知の酸（無機及び有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であってもよい。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンは、対イオンとして役立ち得る。

細菌の作用を低減するために、防腐剤を本明細書の製剤に任意選択で添加してもよい。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の生成を容易にし得る。

本明細書における目的の水性担体とは、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

本開示のタンパク質は、タンパク質及び凍結保護剤を含む凍結乾燥製剤中に存在してもよい。凍結保護剤は、糖、例えば、二糖であってもよい。特定の実施形態では、凍結保護剤は、スクロースであっても、またはマルトースであってもよい。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、サーファクタント、増量剤及び／または防腐剤のうちの１つ以上を含んでもよい。

凍結乾燥された医薬品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２というタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は、１：２～１：５であり得る。

特定の実施形態では、この製剤のｐＨは、凍結乾燥前に、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。特定の実施形態では、この薬学的に許容される酸は塩酸であってもよい。特定の実施形態では、この薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであってもよい。

凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含む溶液のｐＨは、６から８の間で調整され得る。特定の実施形態では、凍結乾燥された医薬品のｐＨ範囲は、７～８の間であり得る。

特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は薬学的に許容され、かつ「塩基形成」金属またはアミンを含むさまざまな公知の酸（無機及び有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であってもよい。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンは、対イオンとして役立ち得る。

特定の実施形態では、「増量剤」を添加してもよい。「増量剤」とは、凍結乾燥混合物に質量を加え、かつ凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが挙げられる。本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含み得る。

特定の実施形態では、凍結乾燥された医薬品は、水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体とは、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、かつ凍結乾燥後に液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。

特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥医薬品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中に、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。

特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質生成物は、注射用の約４．５ｍＬの水で構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。

本出願に記載される多重特異性結合タンパク質の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変化されてもよい。

特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせて調整され得る。適切な投与量を決定する際の他の要因としては、治療または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、及び病状が挙げられ得る。治療のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に本明細書に開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によって慣用的に行われる。投与量はまた、適切な用量反応データと併せて使用される投与量を決定するための既知のアッセイを使用することによっても決定され得る。個々の患者の投与量は、疾患の進行をモニターしながら調整し得る。患者の標的化可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に到達または維持するために投与量を調整する必要があるか否かを確認し得る。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的可能な構築物及び／または複合体、ならびにその投与量が、所与の個体に最も効果的である可能性が高いかを決定し得る（Ｓｃｈｍｉｔｚｅｔａｌ．、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ３０８：４３－５３，２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒｅｔａｌ．、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ３０８：３３－４１，２００１）。

一般に、体重に基づく投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ（体重）、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ（体重）、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ（体重）、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ（体重）、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ（体重）、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ（体重）、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。

用量は、１日１回以上、毎週、毎月または毎年で与えられても、あるいは２～２０年に１回でも与えられてもよい。当業者は、測定された滞留時間及び体液または組織中の標的可能な構築物または複合体の濃度に基づいて、投薬の反復率を容易に推定し得る。本出願に記載の多重特異性結合タンパク質の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを通じた灌流によって、または直接的病巣内注射によってであってもよい。これは、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、及び年１回以上投与されてもよい。

上記の説明は、本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の複数の態様及び実施形態を提供する。本特許出願は、態様及び実施形態の全ての組み合わせ及び順列を明確に企図する。任意のかつ全ての例、または本明細書の例示的な言語、例えば、「など」または「含む」の使用は、本出願に記載の多重特異性結合タンパク質をよりよく説明することを単に意図し、特に明記されていない限り、本開示の範囲に制限をもたらさない。いかなる本明細書の表現も、なんらかの非請求要素を本出願に記載される多重特異性結合タンパク質の実践に必須であるとして示すと解釈されるべきではない。

以下の例は、単に例示的なものであり、本出願に記載されている多重特異性結合タンパク質の範囲または内容を決して制限することを意図するものではない。

実施例１．選択されたハイブリドーマクローンの上清の特性評価
ＣＬＥＣ１２Ａ特異的抗体は、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ融合タンパク質を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することによって生成された。１６個のハイブリドーマの上清を、ＯｃｔｅｔＲｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したＢｉｏ－ｌａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）結合によってＣＬＥＣ１２Ａ結合について評価した。これらの１６のハイブリドーマを、同質遺伝子ＲＭＡ細胞の細胞表面に発現するヒト及びカニクイザルＣＬＥＣ１２Ａへの結合についてさらに分析した；カニクイザルＣＬＥＣ１２Ａへの結合は観察されなかった。推定された反応速度論的パラメーターを表１１に示しており、結合トレースを図１８に示す。さらなる研究のために９つのクローンを選択した。これらの９つのクローンがｈＣＬＥＣ１２Ａ－ＨｉｓＲＭＡ及びＣＬＥＣ１２Ａ発現がん細胞株Ｕ９３７及びＰＬ２１に結合する能力を、高分解能表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってさらに分析した。この実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して、生理学的温度を模倣するために３７℃で実行した。

参照ｍＡｂと比較したハイブリドーマ融合のビニングは、ＯｃｔｅｔＲｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してＢＬＩによって実行した。簡単に説明すると、ハイブリドーマの上清を抗マウスＩｇＧキャプチャーセンサーチップに１５分間ロードし、ＰＢＳＦで５分間平衡化した。センサーを２００ｎＭｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓに浸し、１８０秒間結合させた後、１００ｎＭの参照ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂに浸した。応答単位の増大は、ハイブリドーマが参照ｍＡｂと競合しないことを示したが、シグナルの増大がないことは、ハイブリドーマが参照ｍＡｂと競合したことを示した。これらの参照抗体のＶＨ及びＶＬ配列を表１２に示す。

ビニング分析によって、ハイブリドーマの５つ、すなわち１２Ｆ８．Ｇ３、１３Ｅ０１、１５Ａ１０．Ｇ８、２０Ｄ６．Ａ８、及び２３Ａ５．Ｄ４から産生された抗体が、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓへの結合について参照抗体と競合しなかったことが実証された。ハイブリドーマの同質遺伝子型ヒトＣＬＥＣ１２Ａ（ｈＣＬＥＣ１２Ａ）への結合、及びカニクイザルＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）との交差反応性も、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＵ９３７ＡＭＬがん細胞株を発現する同質遺伝子型ＲＭＡ細胞への抗体の結合を測定することによって評価した。

簡単に説明すると、ＲＭＡ細胞にｃＣＬＥＣ１２ＡまたはｈＣＬＥＣ１２Ａをコードするレトロウイルスベクターを形質導入した。粗ハイブリドーマ収穫物由来のα－ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂのｈＣＬＥＣ１２ＡまたはｃＣＬＥＣ１２Ａ同質遺伝子細胞株への、ならびにＣＬＥＣ１２Ａ＋Ｕ９３７（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９３．２）がん細胞株への結合を、以下のように実施した。９６ウェル丸底プレートの１ウェルあたり１００，０００個のＲＭＡ、ＲＥＨ、またはＳＥＭ細胞を追加した。細胞をスピンダウンし、ボルテックスによりペレットを穏やかに解離させた。１００μＬのＺｏｍｂｉｅ生／死（ライブ／デッド）色素（ＰＢＳ＋１：２０００色素）を１ウェルごとに加え、暗所で室温で２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ））で洗浄した。この洗浄した細胞にハイブリドーマ上清５０μＬを添加し、その混合物を暗所の氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５０μＬの抗マウスＦｃ－ＰＥ二次試薬（１：２００希釈）を加え、暗所で氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで５０μＬの４％パラホルムアルデヒドで氷上で１５分間固定した。固定した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、取得の準備ができるまで４℃で保存した。ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した細胞の試料を、ＨＴＳ（ハイスループットサンプラー）を備えたＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで実行し、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＵ９３７ＡＭＬがん細胞株を発現する同質遺伝子ＲＭＡ細胞に対する抗体の結合親和性を測定した。

ＣＬＥＣ１２Ａを発現すると報告されているヒトＡＭＬ細胞株であるＰＬ２１ＡＭＬがん細胞（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ５３６）に対するハイブリドーマ上清の結合親和性も測定した。表１１に示すように、９つのクローンがｈＣＬＥＣ１２Ａを発現するがん細胞への結合親和性を示した。ｃＣＬＥＣ１２Ａへの結合は観察されなかった。
実施例２．精製された抗ＣＬＥＣ１２Ａマウス抗体の分析

この実施例では、精製された抗ＣＬＥＣ１２Ａマウス抗体の反応速度論的パラメーター及び結合親和性が分析された。実施例１に記載の分析に基づいて、８つのハイブリドーマ（９Ｆ１１．Ｂ７、１２Ｆ８．Ｇ３、１６Ｂ８．Ｃ８、１５Ａ１０．Ｇ８、２０Ｄ６．Ａ８、９Ｅ４．Ｂ７、１３Ｅ１．Ａ４、及び２３Ａ５．Ｄ４）を、サブクローニング及び配列決定のために選択した。各サブクローンをハイブリドーマ培養物から精製し、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ及びｃＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓへの結合を、図１９に示すようにＳＰＲによって評価した。これらの実験からのデータを図１９Ａに示す。抗体９Ｅ４．Ｂ７、９Ｆ１１．Ｂ７、１２Ｆ８．Ｇ３、及び１６Ｂ８．Ｃ８は、ｈＣＬＥＣ１２Ａのみに結合した（図１９Ａ）；一方、抗体１３Ｅ１．Ａ４、１５Ａ１０．Ｇ８、２０Ｄ６．Ａ８、及び２３Ａ５．Ｄ４は、ｈＣＬＥＣ１２Ａ及びｃＣＬＥＣ１２Ａの両方に結合した（図１９Ｂ）。精製されたマウスサブクローニングｍＡｂに対するｈＣＬＥＣ１２Ａ及びｃＣＬＥＣ１２Ａの反応速度論定数及び結合親和性を表１３に示す。

ＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞に結合する８つの精製されたサブクローンｍＡｂの能力を、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ陽性ＰＬ２１がん細胞株を用いたＦＡＣＳ分析によって評価した。図２０に示すように、９Ｅ４．Ｂ７、９Ｆ１１．Ｂ７及び１６Ｂ８．Ｃ８は全てサブナノモルのＥＣ５０値でＰＬ２１細胞株に結合した；ただし、９Ｅ４．Ｂ７は組換えｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓへの低親和性の不均一結合を示したため、９Ｆ１１．Ｂ７及び１６Ｂ８．Ｃ８のみが組換えタンパク質結合及び細胞結合の両方の基準を満たした（表１４）。１５Ａ１０．Ｇ８、１３Ｅ１．Ａ４、２０Ｄ６．Ａ８、及び２３Ａ５．Ｄ４は、ＳＰＲアッセイで組換えヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＬＥＣ１２Ａへの結合を示したが、これらのｍＡｂは、がん細胞を認識できず、組換えＣＬＥＣ１２Ａと細胞表面発現ＣＬＥＣ１２Ａとの間の結合エピトープの高次構造の相違を示唆している。示されているように、Ｍｅｒｕｓ－ＣＬＬ１とＧｅｎｅｎｔｅｃｈ－ｈ６Ｅ７ｍＡｂの両方がＰＬ２１に結合し、新規ＣＬＥＣ１２Ａハイブリドーマクローンと比較してＥＣ５０値が有意に劣っていた。

ｍＡｂがグリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合するか否かを評価するために、グリコシル化、脱シアル化、及びＰＮＧａｓｅ処理ｈＣＬＥＣ１２Ａへの、クローン１６Ｂ８．Ｃ８及び９Ｆ１１．Ｂ７の結合をＳＰＲで評価した（図２１）。センサーグラム及び表１５に示されているように、１６Ｂ８．Ｃ８と９Ｆ１１．Ｂ７の両方が、親和性を失うことなくｈＣＬＥＣ１２Ａの脱シアル化及び脱グリコシル化バージョンに結合し、このことは、ｈＣＬＥＣ１２Ａとの抗体相互作用が標的のグリコシル化状態の影響を受けないことを示唆している。

実施例３．推定配列ライアビリティ分析
１６Ｂ８．Ｃ８及び９Ｆ１１．Ｂ７抗体のＣＤＲ（Ｃｈｏｔｈｉａで識別）の潜在的な配列ライアビリティを調べた。以下の潜在的なライアビリティを考慮した。Ｍ（潜在的な酸化部位）；ＮＧ、ＮＳ及びＮＴ配列モチーフ（潜在的な脱アミド化部位）；ＤＧ、ＤＳ及びＤＴ配列モチーフ（潜在的な異性化部位）；ＤＰ配列モチーフ（潜在的な化学加水分解の部位）。結果を表１６に要約する。

これらの抗体のバリアントは、推定上の配列ライアビリティモチーフを除去するように設計された。

実施例４．サブクローンのヒト化
組換えｈＣＬＥＣ１２Ａタンパク質の動態及び親和性、細胞表面発現ｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合、ならびにＡＭＬがん細胞株への結合に関して収集されたデータに基づいて、２つのマウスハイブリドーマサブクローン、すなわち１６Ｂ８．Ｃ８及び９Ｆ１１．Ｂ７をヒト化のために選択した。

１６Ｂ８．Ｃ８抗体をヒト化した。逆突然変異をフレームワーク領域に導入し、ｓｃＦｖ－１２９２～ｓｃＦｖ－１３０９、ならびにｓｃＦｖ－１６０２及びｓｃＦｖ－２０６１のＶＨ及びＶＬ配列を有するバリアントを作成した。

９Ｆ１１．Ｂ７抗体をヒト化した。フレームワーク領域に逆突然変異を導入し、バリアントＡＢ０１８６～ＡＢ０１９６を作成した。

実施例５．ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴの選択
最適なＴｒｉＮＫＥＴ候補を選択する際に以下の基準を適用し、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴをリード候補として選択した。
－ＡＭＬがん細胞に対するＮＫ活性の強力な増強
－対応するモノクローナル抗体よりも高い効力
－複数のＡＭＬ細胞株への結合
－組換えｈＣＬＥＣ１２Ａに対する高い親和性
－ヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性が低い
－カニクイザル（ｃｙｎｏ）標的との交差反応性
－良好な開発可能性プロファイル：
－６５℃以上のｓｃＦｖの熱安定性
－８～９の等電点（ｐＩ）
－正常に挙動する治療用ｍＡｂと同様である、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の保持時間。
－ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する高い特異性
－クリーンな多重特異性試薬（ＰＳＲ）プロファイル
－ｍＡｂと同様の一時的な発現力価

クローン１６Ｂ８．Ｃ８の１８個のヒト化ｓｃＦｖバリアント全てを、Ａ４９ＭＩＮＫＧ２ＤＦａｂアームと組み合わせて、ヒト化Ｆ３’ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴを作成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａに対する１８の半精製ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性は、スクリーニングのＳＰＲによって評価した。８つのＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴの結合シグナルは、５ＲＵ未満であり（このアッセイで実行された予想シグナルの約１５％）、したがって、これらのＴｒｉＮＫＥＴは、ｈＣＬＥＣ１２Ａへの非バインダーと見なされた。残りの１０個のＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、図２２及び表１７に示されるように、１０ｎＭ未満の親和性でｈＣＬＥＣ１２Ａに結合した。しかし、潜在的なＮ－グリコシル化部位を、Ｈ８５位にマウスの逆突然変異Ｎを導入することにより、１０個のＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴのうち８個に意図せず導入した。構築物Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１３０４（位置Ｈ８５にＡを含む）のみがＮ－グリコシル化配列のライアビリティを示さなかった；したがって、これら２つの構築物のみを、さらなる特性評価のために繰り越した。

Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１３０４ＴｒｉＮＫＥＴを、図２３に示されるように、ｈＣＬＥＣ１２Ａ＋ＲＭＡ細胞への同質遺伝子の結合について、及び実施例５または６に記載の方法を用いて試験した。細胞表面に発現されたｈＣＬＥＣ１２ＡへのＦ３’－１２９５の結合は、実施例１に上記したＭｅｒｕｓ抗体由来のｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ対照ＴｒｉＮＫＥＴに匹敵し、一方、細胞表面発現ｈＣＬＥＣ１２ＡへのＦ３’－１３０４の結合は、ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ対照の多重特異性結合タンパク質と比較して劣っていた。

Ｆ３’－１２９５の効力は、図２４に示すように、ＨＬ－６０ＡＭＬ細胞を用いた一次ＮＫ細胞媒介細胞毒性アッセイで、及び実施例８に記載の方法を使用して、評価した。Ｆ３’－１２９５は、ＨＬ６０ＡＭＬ細胞の強力な溶解を誘導した。細胞殺滅ＥＣ５０は同様であり、細胞溶解の最大パーセンテージは対照ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－ＭｅｒｕｓＴｒｉＮＫＥＴよりも高かった（表１８）。

Ｆ３’－１２９５の熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した。ＤＳＣを実行するために、簡単に言えば、ＴｒｉＮＫＥＴを、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。３２５μＬを、適合する緩衝液ブランクとともに９６ウェルディープウェルプレートに添加した。サーモグラムは、ＭｉｃｒｏＣａｌＰＥＡＱＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を使用して生成した。温度は９０℃／時間で、２０～１００℃に上昇した。生のサーモグラムをバックグラウンドで差し引き、ベースラインモデルをスプライン処理し、非二状態（ｎｏｎ－ｔｗｏｓｔａｔｅ）モデルを使用してデータを適合した。

Ｆ３’－１２９５の最初の遷移の溶融温度（Ｔ_ｍ１）は、６０．９℃であり、第１のＴｒｉＮＫＥＴ遷移のＴ_ｍに対する６５℃以上という事前定義された基準より４℃低かった。ヒト化の過程で、ヒトのフレームワークへのマウス残基の導入（逆突然変異）が熱安定性に影響を及ぼした可能性がある。したがって、逆突然変異をヒト残基に戻すことにより、Ｆ３’－１２９５の熱安定性が改善する可能性がある。したがって、表１９に示すように、１０個のＦ３’バリアントの熱安定性は、Ｎ－グリコシル化配列のライアビリティの有無に関係なく、ＤＳＣによって評価された。Ｆ３’－１２９７及びＦ３’－１３０６ＴｒｉＮＫＥＴの（ｓｃＦｖのドメインに起因する）第一遷移Ｔ_ｍは、他のＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴより有意に高かった（６６．５℃～６７．５℃）。さらに、これら２つの分子のＴ_{オンセット}は、試験した他のＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴと比較して有意に優れていた。これら２つのＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴの間の唯一の相違は、ｓｃＦｖの方向である。Ｆ３’－１２９７（ＶＨ－ＶＬ方向）及びＦ３’－１３０６（ＶＬ－ＶＨ方向）。

位置（Ｌ４３）のヒト残基が熱安定性の増大の原因であるか否かを判断するために、Ｆ３’－１３０６及びＦ３’－１２９７の両方で、マウス残基Ｉ（Ｌ４３）を元のヒトフレームワーク残基Ａ（Ｌ４３）に戻した。さらに、Ｆ３’－１２９５の位置Ｌ４３にあるマウスＩｌｅをヒトＡｌａに置き換え、次いで組換えにより作製した。Ｆ３’－１２９５から派生した新しい第２世代のヒト化ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－１６０２またはＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴと名付けた。

Ｆ３’－１２９５及び第２世代Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの熱安定性は、ＰＢＳ中でのＤＳＣによって評価した（図２５）。最初の遷移のＴ_ｍに基づいて、Ｆ３’－１６０２のｓｃＦｖは表２０に示される、Ｆ３’－１２９５と比較して７．５℃で熱安定化された。この安定化は、Ｉｌｅ／Ａｌａ変異に起因する。したがって、Ｆ３’－１６０２は、６５℃以上でＴ_ｍ１カットオフを満たした。

Ｉ（Ｌ４３）Ａ置換がｈＣＬＥＣ１２Ａに対するＴｒｉＮＫＥＴ親和性に影響を及ぼしたか否かを理解するために、ｈＣＬＥＣ１２ＡのＦ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２への結合を、３７℃でＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって（図２６）、及び実施例１に記載の方法を使用して決定した。反応速度論的定数及び平衡結合親和性を表２１に列挙する。両方のＴｒｉＮＫＥＴとも非常に似たオフレートを有するが、Ｆ３’－１６０２は、その速いオンレートに起因して約２倍低いＫ_Ｄを示す。したがって、Ｉ（Ｌ４３）置換がＫ_Ｄに影響を与えた。

Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２は、親のＢａ／Ｆ３細胞と比較して、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子Ｂａ／Ｆ３細胞に結合する能力について（図２７Ａに示されるように、及び表２２に列挙されるデータ）、実施例５または６に記載の方法を使用して試験した。Ｆ３’－１６０２は、Ｆ３’－１２９５と比較して、ｈＣＬＥＣ１２Ａ＋Ｂａ／Ｆ３に対して、約２分の１のＥＣ５０値で結合し得、ただし最大結合ＭＦＩは同様であった。ＣＬＥＣ１２Ａの発現を欠く親Ｂａ／Ｆ３細胞への結合がＦ３’－１２９５またはＦ３’－１６０２のいずれかによって検出され（図２７Ｂ）、ｈＣＬＥＣ１２ＡへのＴｒｉＮＫＥＴ結合の高い特異性が示唆されている。

Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２は、ＨＬ６０（図２７Ｃ）及びＰＬ２１（図２７Ｄ）ＡＭＬがん細胞株に結合するそれらの能力について、実施例５または６に記載の方法を使用してさらに試験された。表２３に示すように、Ｆ３’－１６０２は、Ｆ３’－１２９５と比較して低いＥＣ５０値で、両方の細胞株に結合し得、最大結合ＭＦＩは類似していた。

Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの効力は、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを介した細胞毒性アッセイで評価された。その結果を図２８に示す。Ｆ３’－１６０２及びＦ３’－１２９５の両方がＰＬ２１（図２８Ａ）及びＨＬ６０（図２８Ｂ）ＡＭＬがん細胞の強力な溶解を誘導し、両方とも表２３に示すように同様のＥＣ５０及び最大溶解％を示す。

Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの疎水性特性は、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって評価され、その結果が表２４に示されている。トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）は、治療用抗体の代表的な対照として使用された。両方のＴｒｉＮＫＥＴの保持時間（ＲＴ）は、トラスツズマブのＲＴと同様であり、両方のＴｒｉＮＫＥＴの予測される凝集傾向が低いことを示唆している。

Ｆ３’－１２９５（図２９Ａ）及びＦ３’－１６０２（図２９Ｂ）の実験的等電点（ｐＩ）は、実施例１５に記載されるように、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって評価された。両方の構築物はほぼ同一のｐＩを示した。Ｆ３’－１２９５の主要なピークのｐＩは８．７３であり、Ｆ３’－１６０２の主要なピークのｐＩは８．８１である（表２５）。

タンパク質治療薬を開発する際には、薬物のオフターゲット効果を評価する必要がある。フローサイトメトリーベースの多重特異性試薬（ＰＳＲ）アッセイにより、非特異的に結合する可能性が高い抗体の測定が可能になる。Ｆ３’－１２９５及びＦ３’－１６０２を、実施例１２に記載の方法を使用して、ＰＳＲアッセイにおいて界面活性剤可溶化ＣＨＯ細胞膜タンパク質の調製物への非特異的結合について試験した。ヒト化Ｆ３’－１６０２及びＦ３’－１２９５の両方とも、ＰＳＲに結合せず（右へのシグナルシフトなし）、図３０に示されるように、ＰＳＲ対照トラスツズマブと非常に類似したプロファイルを示し、ＴｒｉＮＫＥＴの高い特異性を示唆している。このアッセイでは、リツキシマブを陽性対照として使用した。Ｆ３’－１６０２を、記載されている追加のＴｒｉＮＫＥＴとさらに比較するために選択した。

異なるＴｒｉＮＫＥＴフォーマットの効果を、有効性の変化について実験的に試験した。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴをＦ３フォーマットで取得するために、ヒト化１６Ｂ８．Ｃ８は、Ｆ３’－１６０２で使用されたものと同じヒト化バリアントを使用して、鎖ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ及びＶＬ－ＣＬに変換されたが、ＮＫＧ２ＤＡ４９Ｍ－ＩｍＡｂはＶＨ－ＶＬ－Ｆｃに変換された。このタンパク質は、ＡＢ００１０またはＦ３－１６０２と呼ばれた。

ＡＢ００１０（Ｆ３ＴｒｉＮＫＥＴフォーマット）及びＦ３’－１６０２（Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴフォーマット）に対するヒトＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓの結合親和性を、３７℃でＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって評価した。反応速度論的定数及び平衡結合親和性を、表２６に示し、生のデータ及び適合を図３１に示す。Ｋ_Ｄによって証明されるように、両方の構築物の全体的な結合親和性は２倍以内の差であり、ＡＢ００１０はＦ３’－１６０２と比較してＣＬＥＣ１２Ａとわずかに強い複合体を形成した。

異なるフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ３’－１６０２（Ｆ３’）及びＡＢ００１０（Ｆ３）を、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現するＢａ／Ｆ３細胞（図３２Ａ）及びＡＭＬがん細胞株（図３２Ｂ）に結合する能力について試験した。Ｆ３’－１６０２のＥＣ５０値は、ＨＬ－６０細胞ではＡＢ００１０よりも優れており、約２分の１に減少した（表２７）。ＡＢ００１０もＦ３’－１６０２も親Ｂａ／Ｆ３細胞への結合を示さず、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合の高い特異性を示している（図３２Ｃ）。

ＡＢ００１０及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの効力は、図３３Ａに示す、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを介した細胞毒性アッセイで評価された。Ｆ３’－１６０２は、ＨＬ６０及びＰＬ２１ＡＭＬがん細胞の溶解を誘導し、ＥＣ５０値はＡＢ００１０より２倍優れていた（表２８）。Ｆ３（ＡＢ００１０）及びＦ３’（Ｆ３’－１６０２）ＴｒｉＮＫＥＴの両方とも、対応するヒト化親ｍＡｂ（ＡＢ００３７－００１）よりも優れていることを示した。

ＡＢ００１０及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの効力は、ヒト初代ＮＫ細胞を介した細胞毒性アッセイで評価された（図３３Ｂ）。Ｆ３’－１６０２（Ｆ３’フォーマット）は、ＡＢ００１０（Ｆ３フォーマット）よりも２倍低いＥＣ５０値でＰＬ２１ＡＭＬがん細胞の溶解を誘導した（表２９）。

ＫＨＹＧ－１を介した細胞毒性アッセイと初代ＮＫ細胞を介した細胞毒性アッセイの両方で、Ｆ３’－１６０２（Ｆ３’フォーマット）がＡＢ００１０（Ｆ３フォーマット）よりも約２倍優れたＥＣ５０を示したのに対し、全体的な最大殺滅率は影響を受けなかったことが観察された。加速安定性及び強制分解の研究では、ＡＢ００１０はＦ３’－１６０２（Ｆ３’－１６０２）と比較して構造的に安定していなかった（実施例１６を参照のこと）。したがって、Ｆ３’フォーマット（Ｆ３’－１６０２）のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴを選択し、さらなる研究を進めた。

９Ｆ１１．Ｂ７ＴｒｉＮＫＥＴを生成するために、９Ｆ１１．Ｂ７の１２個のｓｃＦｖバリアント全てをＡ４９Ｍ－ＩＮＫＧ２ＤＦａｂアームと組み合わせて、ヒト化Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴを作成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａに対する１０個の半精製（タンパク質Ａ）ＴｒｉＮＫＥＴの親和性は、表３０に示すスクリーニングモードでＳＰＲによって評価された。３つの（ＡＢ０１９０、ＡＢ０１９３、及びＡＢ０１９６）９Ｆ１１．Ｂ７ベースのＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、不均一な結合を示し、信頼性の高い１：１の反応速度論的モデルには適合し得ない。残りの７つのＴｒｉＮＫＥＴの結合反応速度論は、キメラ親マウス９Ｆ１１．Ｂ７ｍＡｂと同様であり、ヒト化もＦａｂからｓｃＦｖへの変換もｈＣＬＥＣ１２Ａへの親和性に影響を与えなかったことを示唆している。

図３４Ａ及び図３４Ｂに示される、ｈＣＬＥＣ１２Ａ＋Ｂａ／Ｆ３及びＨＬ６０ＡＭＬがん細胞株に対する９つの完全に精製されたヒト化９Ｆ１１．Ｂ７ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、ＦＡＣＳによって試験した。ＡＢ０１９０、ＡＢ０１９３、及びＡＢ０１９６は、両方の細胞株で劣った結合ＥＣ５０値を示し（表３１）、これは、表３０で説明されているＳＰＲの挙動不良と相関している。残りの６つのクローンのＥＣ５０値は類似しており、ＳＰＲデータとの相関を示している。

９Ｆ１１．Ｂ７ベースのＴｒｉＮＫＥＴの効力は、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞媒介性細胞傷害アッセイで評価された（図３５及び表３２）。ＡＢ０１９０、ＡＢ０１９３、及びＡＢ０１９６は最小限の活性を表した。ＡＢ０１８９及びＡＢ０１９２は、他のＴｒｉＮＫＥＴ候補の中で最も高い効力を示した。ＡＢ０１９２ＴｒｉＮＫＥＴは、９Ｆ１１．Ｂ７のヒト化の労力によってリードＴｒｉＮＫＥＴとして登場した。

ＡＢ０１９２の効力は、Ｆ３’－１６０２と比較して、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞媒介性細胞傷害アッセイにおいて評価された（図３６Ａ）。Ｆ３’－１６０２は、ＥＣ５０（それぞれ０．４ｎＭ及び１．３ｎＭ）及び最大ＨＬ－６０細胞溶解率（それぞれ、４１％及び２２％）の両方でＡＢ０１９２を超える有効性の改善を示した。

ＡＢ０１９２及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの効力は、ヒト初代ＮＫ細胞を介した細胞毒性アッセイでさらに評価した（図３６Ｂ）。Ｆ３’－１６０２及びＡＢ０１９２は、同様のＥＣ５０及び最大細胞殺滅％でＨＬ６０ＡＭＬの溶解を誘発した（表３３）。

ＡＢ０１９２は、ＴｒｉＮＫＥＴのプレ開発可能性基準を満たす：ｈＣＬＥＣ１２Ａに対する高い親和性、効率的なＡＭＬ細胞に対する結合、初代ＮＫ細胞媒介細胞毒性アッセイにおけるＡＭＬ細胞殺滅の高い効力、高い熱安定性、Ｔ_ｍ１が６５℃以上、低い疎水性、８．０＜ＰＩ＜９．０、モノクローナル抗体と同様の一過性トランスフェクションにおける発現レベル、クリーンなＰＳＲ（表３３）。

Ｆ３’－１６０２は、ＡＢ０１９２と比較して、より優れた効力、より高いヒトらしさ、及びより少ない潜在的な配列ライアビリティを示した。Ｆ３’－１６０２の構造安定性は、実施例１５に記載されている加速安定性及び強制分解研究の広範なパネルで確認された。したがって、Ｆ３’－１６０２がさらなる開発のために選択された。

Ｆ３’－１６０２及びそれに対応するヒト化ｍＡｂ（ｈ１６Ｂ８．Ｃ８）は、初代ＮＫ細胞を介した細胞毒性による細胞殺滅について評価された。Ｆ３’－１６０２は、ＰＬ２１（図３７Ａ）及びＴＨＰ－１（図３７Ｂ）ＡＭＬがん細胞株の強力な殺滅を示したが、対応するモノクローナル抗体は効力を著しく低下させた（表３４）。

実施例６．細胞発現ヒトがん抗原へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価

ｈＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子Ｂａ／Ｆ３細胞、及びヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞株ＨＬ６０及びＰＬ２１を使用して、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ及びｍＡｂの腫瘍抗原結合を評価した。

ＡＢ００８９は、親ｍＡｂＡＢ０３０５と同じ結合ドメインに由来するＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴである。ＡＢ０１９２は、親ｍＡｂＡＢ０１９２と同じ結合ドメインに由来するＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴである。ＡＢ０２３７はＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴであり、本明細書ではｈＦ３’－１６０２またはＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴとも呼ばれ、ｓｃＦｖ－１６０２に由来する。ＡＢ０３００（Ｆ３’－１６０２ｓｉまたはＡＢ０２３７ｓｉとも呼ばれる）も、ＡＢ０２３７と同じ配列のＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴであるが、ＣＨ２ドメインに変異があり、Ｆｃ－γ受容体の結合を排除する。Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴは一般に、親ｍＡｂと比較して弱い結合を示した。

ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位及びＦｃのエフェクター機能がＡＢ０２３７の細胞毒性に寄与するか否かを評価するために、２つのＴｒｉＮＫＥＴバリアントを構築した。第１のバリアントには、ＮＫＧ２Ｄに結合するＡ４９抗原結合部位の軽鎖可変ドメインに変異が含まれている。結果として、このバリアントはヒトＮＫＧ２Ｄに結合しない。変異軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＮＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＳＴＫＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＤＬＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２８２）である。この第１のバリアントのアミノ酸配列は、それ以外はＡＢ０２３７のアミノ酸配列と同一である。第２のバリアントには、Ｆｃドメインに変異が含まれている。具体的には、Ｆｃドメインの各ポリペプチド鎖には、ＦｃのＦｃγ受容体への結合を低減させることが報告されたＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ置換（ＥＵ番号付けシステムの下で番号付け）を含む。この第２のバリアントのアミノ酸配列は、それ以外はＡＢ０２３７のアミノ酸配列と同一である。Ｆ３’－パリビズマブには、Ｆ３’－１６０２と同じＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６バインダー配列と、試験した２つのがん細胞株のいずれにも発現していない無関係な標的に結合するｓｃＦｖが含まれている。ＥＣ５０値を表３５に示す。

次に、この細胞をフルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、二次抗体のみの対照に対して正規化して、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）値を得た。

ＡＢ０２３７は、試験された２つのＡＭＬ細胞株、すなわち、ＨＬ６０（図３８Ａ）及びＰＬ２１（図３８Ｂ）への高親和性結合を示す。ＨＬ６０のＥＣ５０は２．２ｎＭで、ＰＬ２１のＥＣ５０は１．２ｎＭであった。

３つのバインダーのうち２つについて、Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴは、その親のｍＡｂと比較して標的細胞への負荷が高いことを示した。ＡＢ０２３７、ＡＢ０３００、及びＡＢ０２３７ＮＫＧ２Ｄデッドアームの変異バリアントは、Ｂａ／Ｆ３－ｈＣＬＥＣ１２Ａ（図３９Ａ）、ＨＬ－６０（図３９Ｂ）、及びＰＬ－２１（図３９Ｃ）に対してそれらの親のＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０２３７と同様の結合を示した。
実施例７．細胞発現ヒトがん抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴ表面保持の評価

ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞株ＨＬ６０及びＰＬ２１を使用して、細胞とのインキュベーション後のＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴの表面保持を評価した。複製プレート内のＰＬ２１またはＨＬ６０細胞を、示されているようにＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂとともにインキュベートした。第１のプレートを３７℃に２時間移動し、第２のプレートを氷上で２０分間インキュベートした。それぞれのインキュベーション時間の後、細胞を洗浄した。表面結合ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂは、フローサイトメトリー用の蛍光二次抗体を使用して検出された。
表面保持は次のように計算された。
％表面保持＝（試料ＭＦＩ２時間／試料ＭＦＩ２０分）） ^＊１００％

図４０Ａ及び図４０Ｂは、ＣＬＥＣ１２Ａ＋細胞株、ＰＬ２１及びＨＬ６０にそれぞれ結合したＴｒｉＮＫＥＴの細胞表面保持を示している。一価結合ＴｒｉＮＫＥＴ、ＡＢ００８９、ＡＢ０１４７、ＡＢ０１９２、及びＡＢ０２３７は、ＰＬ２１及びＨＬ６０細胞株の両方で２時間で高い表面保持を示した。ＰＬ２１及びＨＬ６０の両方で、二価結合ｍＡｂＡＢ００３７は、ＴｒｉＮＫＥＴと比較して２時間で低い表面保持を示した。
実施例８．ヒトＮＫ細胞細胞毒性アッセイ

標的細胞の溶解は、ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイによって測定された。簡潔に述べると、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞株を、培養物から回収し、ＨＢＳで洗浄し、そして増殖培地中で、１０^６／ｍＬで、ＢＡＴＤＡ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡＤ０１１６）で標識するために再懸濁した。標的細胞の標識については、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、そして０．５－１．０ｘ１０^５／ｍＬで培地中で再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＣＬＥＣ１２Ａに対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈し、５０μｌの希釈ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。

ＮＫ細胞を調製するために、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離し、洗浄し、そしてＮＫ細胞単離のために調製した。ＮＫ細胞は、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用して単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は、通常ＣＤ３－ＣＤ５６＋が９０％超であった。単離されたＮＫ細胞を一晩休ませ、培養物から回収した。次いで、細胞を洗浄して、培養培地中で１０^５－２．０ｘ１０^６／ｍＬの濃度で、５：１というエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率に再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに加え、合計２００μｌの培養容積にした。このプレートを、５％のＣＯ_２を用いて３７℃で２～３時間インキュベートした。

インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００ｘｇで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を、清浄なマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣ１３５－１００）を各ウェルに加えた。そのプレートは光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘ機器を使用して読み取った。

ユーロピウムと蛍光キレートを形成し得る物質の自発的放出を、ＮＫ細胞の非存在下でインキュベートした標的細胞で測定した。そのような物質の最大放出は、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘで溶解された標的細胞で測定された。特異的溶解％は以下のように計算された：
特異的溶解％＝（（実験的放出－自発的放出）／
（最大放出－自発的放出）） ^＊１００％。

図４１Ａ及び図４１Ｂは、それぞれ休止状態のヒトＮＫ細胞によるＰＬ２１及びＨＬ６０標的細胞のＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴを介した殺滅を示している。ＡＢ００３７ＣＬＥＣ１２Ａを標的としたモノクローナル抗体は、ＰＬ２１及びＨＬ６０標的細胞のＮＫ細胞を介した溶解の増強をほとんど示さなかった。３つ全てのＣＬＥＣ１２Ａ標的ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＢ０２３７、ＡＢ０１９２、及びＡＢ００８９）は、ＣＬＥＣ１２Ａ標的モノクローナル抗体と比較して標的細胞の優れた溶解を示した。ＥＣ５０値は表３６に示す。

細胞毒性の所見を確認するために、第２のＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを操作してＣＤ１６ａＶ及びＮＫＧ２Ｄを安定して発現させ、上記のようにアッセイを行った。ＰＬ２１の細胞毒性を図４２Ａに示す；ＨＬ６０の細胞毒性を図４２Ｂに示す。ＥＣ５０値と最大溶解値は、４つのパラメーターのロジスティック非線形回帰曲線適合モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアによって細胞溶解曲線から導き出された（表３７）。Ｆ３’－１６０２は、ＫＨＹＧ－１ＣＤ１６Ａを介した細胞毒性アッセイで、サブナノモルのＥＣ５０及び高効率の最大溶解を示す。

実施例９．初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ

標的細胞の溶解は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を免疫エフェクター細胞として使用したことを除いて、実施例８に記載されているようにＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイによって測定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は次のように調製した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ及びＳｅｐＭａｔｅ５０を使用した密度勾配遠心分離を、製造業者の指示に従って使用して、ヒト末梢血バフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣは、１μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ（ＩＬ－２培養サプリメント）で培養培地中で３７℃で１８時間刺激した。次に、ＣｏｎＡを除去し、ＰＢＭＣを２５単位／ｍＬＩＬ－２で３７℃で４日間で培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット）を使用して、製造業者の指示に従って精製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む培地中で３７℃で６～１３日間、培養した後、細胞溶解アッセイで使用した。

図４３に示すように、ＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴは、親のＡＢ００３７ｍＡｂではなく、ＣＤ８Ｔ細胞が標的細胞を溶解する能力を有意に増強した。ＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を介した細胞溶解を用量依存的に増大させた。

ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位及びＦｃのエフェクター機能がＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴの細胞毒性に寄与するか否かを評価するために、ＴｒｉＮＫＥＴバリアントを構築した。このバリアントには、ＮＫＧ２Ｄに結合するＡ４９抗原結合部位の軽鎖可変ドメインに変異が含まれている。結果として、このバリアントはヒトＮＫＧ２Ｄに結合しない。変異軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＮＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＳＴＫＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＤＬＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２８２）である。この第１のバリアントのアミノ酸配列は、それ以外はＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴのアミノ酸配列と同一である。

標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘導するバリアントの能力は、上記のＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイを使用して評価された。図４３に示すように、ＮＫＧ２Ｄ標的化ドメインの変異は細胞毒性を有意に低下させた。この結果は、ＮＫＧ２Ｄへの結合及びＦｃγ受容体への結合の両方が、ＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴの細胞毒性活性に寄与していることを示唆した。

実施例１０．ヒト全血へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ結合の評価
異なるタイプの血球に結合するＡＢ０２３７及びｍＡｂＡＢ００３７の能力を評価した。簡単に説明すると、ヒト全血をＡＢ０２３７（灰色）、ｍＡｂＡＢ００３７（白色）、またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（黒色）とともにインキュベートした。血球をフローサイトメトリー及びＡＢ０２３７の結合によって分析し、ｍＡｂＡＢ００３７、またはアイソタイプ対照抗体を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、検出した。

図４４に示すように、ＡＢ０２３７及びその親ｍＡｂＡＢ００３７について、全血中の単球、顆粒球、及び樹状細胞の割合に対して染色を観察した。
実施例１１．Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＦｃ受容体への結合：ラベルのない表面プラズモン共鳴の特性評価

組換えヒト及びカニクイザルＦｃγ受容体に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性を決定し、ＩｇＧ１アイソタイプ対照であるトラスツズマブの結合親和性を比較した。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎに対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性も決定された。

ＦｃγＲ結合
ヒト及びカニクイザルＣＤ６４、ＣＤ１６ａの高親和性対立遺伝子及び低親和性対立遺伝子（それぞれＶ１５８及びＦ１５８）、ＣＤ３２ａの２つの対立遺伝子（Ｈ１３１及びＲ１３１）、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ｂ及びカニクイザルＣＤ１６は、製造業者の指示によって調製した、プライミングされたＢｉａｃｏｒｅチップ上でビオチンを介してキャプチャーされた。高い開始濃度のＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブを必要とするＦｃγＲ結合実験の前に、試料を、０．５ｍＬ濃縮ユニットを使用した３回の連続希釈及び濃縮サイクルによって１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋ＳＰＲ泳動緩衝液に緩衝液交換し、高濃度のタンパク質を維持しながら、元の緩衝液成分を３００倍を超えて希釈した。タンパク質濃度は、試料の適切な理論モル吸光係数（Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの場合は１９８４０５Ｍ^－１ｃｍ^－１、及びトラスツズマブの場合は標準ＩｇＧ設定）を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置でＡ２８０の吸光度で測定した。

各ＦｃγＲ結合実験は、２倍段階希釈されたＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブを利用した複数のサイクルで実施した。シグナルなしの参照として、各濃度シリーズの開始時の０ｎＭブランクサイクル及び受容体のないチップ表面を使用した。各実験サイクルには、会合、解離、及び再生のステップが含まれていた。全てのステップは３０μＬ／分の流量で、及び２５℃で実行した。分析対象物（Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブ）濃度、会合及び解離時間、ならびに再生パラメーターはＦｃγＲ特異的であった（表３８）。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブ結合組換えヒトＣＤ６４を表す生のセンサーグラムの形状により、データは１：１の反応速度論的適合モデルと適合可能になった。１：１の反応速度論的適合を表す黒いトレースは、図４５にカラーで示されている実際のセンサーグラムに厳密に従う。

Ｂｉａｃｏｒｅインサイトの評価ソフトウェアによって計算したχ^２エラー値は、優れた適合を表す、算出されたＲ_ｍａｘの１．９％以下であった。表３９は、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブの運動速度及びヒトＣＤ６４親和性値をまとめたものである。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＣＤ３２ａＨ１３１への結合は、上記のように決定され、図４６に示されている。このデータは定常状態の親和性適合モデルに適合した。親和性値は表４０にまとめられている。

ヒトＣＤ３２ＡＲ１３１対立遺伝子（ＦＣγＲＩＩａＲ１３１）へのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合は、上述のように決定され、図４７に示される。このデータは定常状態の親和性適合モデルに適合した；親和性値は表４１にまとめられている。

ヒトＣＤ１６Ａ高親和性対立遺伝子Ｖ１５８（ＦＣγＲＩＩＩａＶ１５８）に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、上記にように決定して、図４８に示す。このデータは、１：１の反応速度論的適合モデルに適合された；反応速度論的パラメーター及び親和性値を表４２に要約する。両方の対立遺伝子に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの親和性は、同じ受容体に対するトラスツズマブの親和性に匹敵する（３倍以下の相違）。

ヒトＣＤ１６Ａ低親和性対立遺伝子Ｆ１５８（ＦＣγＲＩＩＩａＦ１５８）に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、上記にように決定して、図４９に示す。データは定常状態の親和性適合モデルに適合した；親和性値は表４３にまとめられている。

ヒトＣＤ３２ｂ（ＦＣγＲＩＩＢ）へのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、上記のように測定し、図５０に示す。データは定常状態の親和性適合モデルに適合した；親和性値は表４４にまとめられている。

ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲＩＩＩＢ）へのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、上記のように測定し、図５１に示す。データは定常状態の親和性適合モデルに適合した。親和性値は表４５にまとめられている。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６への結合を、上記のように測定し、図５２に示す。データは定常状態の親和性適合モデルに適合させた；親和性値は表４６にまとめられている。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのヒトＦｃＲｎへの結合は、上記のようにｐＨ６．０で測定され、図５３に示されている。このデータは定常状態の親和性適合モデルに適合された。親和性値は表４７にまとめられている。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎへの結合は、上記のようにｐＨ６．０で測定され、図５４に示されている。このデータは定常状態の親和性適合モデルに適合した。親和性値は表４８にまとめられている。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦｃＲｎへの結合は、上記のようにｐＨ７．４で測定した。定量可能な結合は観察されなかった。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＩｇＧ１アイソタイプ対照トラスツズマブは、生理学的に意味のある差異は示しておらず（３倍の差よりも小さい）、試験したヒト及びカニクイザルのＣＤ６４（ＦＣγＲＩ）、ＣＤ１６（ＦＣγＲＩＩＩ）組換えレセプターに対するそれらの結合に匹敵する（表４９）。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブは、それらのヒトＣＤ３２（ＦＣγＲＩＩ）受容体への結合に類似している（１．２倍の差よりも小さい）（表４９）。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、ｐＨ６．０でのヒト及びカニクイザルＦｃＲｎに対する親和性においてトラスツズマブに類似している。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブは、ｐＨ７．４で試験した濃度で検出可能な結合を示さなかった（表５０）。

ＦｃＲｎ結合
組換えのヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎは、１６９～２１６ＲＵの密度でアミンカップリングを介して直接固定された。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＩｇＧ１アッセイ対照としての市販のトラスツズマブを、ＳＰＲ結合実験前、上記のようにＭＢＳ－ＥＰ＋，ｐＨ６．０に緩衝液交換した。各ＦｃＲｎ結合実験は、さまざまな濃度の分析対象物を利用する複数のサイクルで構成されていた。２倍希釈系列（１２μＭ－０．０２３μＭ）のＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブを用いた。シグナルなし、陰性対照として、各濃度シリーズの開始時に０ｎＭのブランクサイクルを配置し、ＦｃＲｎを欠くブランクアミンカップリング修飾チップ表面を使用した。各実験サイクルには、会合、解離、及び再生のステップが含まれていた。この会合ステップは、６０秒の分析対象物の注入で構成され、その後に６０秒の解離ステップが続いた。表面再生（ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液、ｐＨ７．４の６０秒注入）は、各反応速度論サイクルを完了した。全てのステップは３０μＬ／分の流速及び２５℃で実行された。ＭＢＳ－ＥＰ＋緩衝液、ｐＨ６．０を、泳動緩衝液として使用した。このデータは、ＢｉａｃｏｒｅＩｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用して定常状態のアフィニティモデルに適合させた。算出したＲ_ｍａｘに関連するカイ^２（ソフトウェアによって計算）を使用して、適合度を評価した。

実施例１２．Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの分子フォーマット及びデザイン、構造、親和性、効力、特異性、交差反応性分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａ（ｈＣＬＥＣ１２Ａ）またはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性は、３７℃の生理学的温度でＢｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用してＳＰＲによって測定された。簡単に説明すると、ヒトＦｃ特異的抗体を、ＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に約８０００～１００００レゾナンスユニット（ＲＵ）の密度で共有結合的に固定して、抗ｈＦｃＩｇＧチップを作成した。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ試料を抗ｈＦｃＩｇＧチップに１０μＬ／分の流速で６０秒間注入して、約２５０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－ＨｉｓまたはｃＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを泳動緩衝液で３倍希釈で段階希釈（１００ｎＭ～０．１４ｎＭ）し、３０μｌ／分の流速で、キャプチャーされた試験物質の上に注入された。会合を３００秒間モニターし、解離は９００秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．７）の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生した。

反応速度論的定数及び平衡結合親和性を表５１に示しており、生のデータ及び適合を図５５に示す。この分子はＣＬＥＣ１２Ａに強く結合し、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａには弱く結合する。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴとヒトＣＬＥＣ１２Ａとの間の複合体は、遅い速度の解離定数４．９４±０．０９ｘ１０^－４ｓ^－１から明らかなように強力である。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの平衡結合親和性Ｋ_Ｄは０．５９±０．０１ｎＭであった。

さらに、多型バリアントＣＬＥＣ１２Ａ－Ｋ２４４Ｑは人口の約３０％に蔓延している。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｋ２４４Ｑへの結合を、ＳＰＲによって調べ、野生型ＣＬＥＣ１２Ａとのその親和性を比較した。表５２に示すように、ＣＬＥＣ１２Ａの野生型及びＫ２４４Ｑバリアントに対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合の反応速度論は類似している。

組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの結合親和性は、３７℃の生理学的温度でＢｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用したＳＰＲによって測定された。簡単に説明すると、マウス（ｍＦｃ）特異的抗体を、ＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に約８０００～１００００ＲＵの密度で共有結合で固定化し、抗ｍＦｃＩｇＧチップを作成した。ｍＦｃタグ付きヒトＮＫＧ２Ｄを、６０秒間、１０μＬ／分の流速で抗ｍＦｃＩｇＧチップにキャプチャーして、約３５ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴを、泳動緩衝液に緩衝液交換し、１×ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いる２倍希釈で段階希釈（５０００ｎＭ～９．７８ｎＭ）した。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、キャプチャーされた試験物質の上に３０μｌ／分の流量で注入した。会合を６０秒間モニターし、解離は６０秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．７）の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生した。

図５６は、ヒトＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ結合センサーグラムを示している。平衡親和性データを取得するために、定常状態の親和性適合及び反応速度論的適合という２つの異なる適合を利用した。反応速度論定数及び平衡親和性定数を表５４に示す。解離速度定数は（１．３０±０．０３）ｘ１０^－１ｓ^－１であった。反応速度論的適合及び定常状態親和性適合によって得られた平衡親和性定数（Ｋ_Ｄ）は、それぞれ、７２１±２１ｎＭ及び７２７±２２ｎＭであった。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴとカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＮＫＧ２Ｄとの交差反応性は、実施例５または６に記載されているようにＳＰＲによってさらに調査された。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＮＫＧ２Ｄ（ｃＮＫＧ２Ｄ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合について３７℃で試験された（図５７）。ＮＫＧ２Ｄは本質的に二量体であるため、この実験には組換えｍＦｃタグ付きカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＮＫＧ２Ｄ二量体を使用した。結合親和性を、表５５に示す。結合親和性は、反応速度論的適合（Ｋ_Ｄ８３９±６７ｎＭ）及び定常適合（Ｋ_Ｄ８２８±８８ｎＭ）から得て、ｈＣＬＥＣ１２Ａで観察された結合親和性と同様であった（反応速度論的適合で得られたＫ_Ｄ７２１±２１ｎＭ）。

ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの同時係合
Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で希釈し、ＣＭ５チップの抗ヒトＦｃ表面に流速５μＬ／分で６０秒間キャプチャーして、１５０～２５０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ベースラインシグナルと、キャプチャーされたＦ３’－１６０２の量を表すＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ注入の完了後のシグナルとの間の正味の差を記録した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（１００ｎＭ）またはｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（７μＭ）を、キャプチャーしたＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴに、飽和状態に達するまで９０秒間、３０μＬ／分で注入した。この注入の直後に、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（１００ｎＭ）とｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（７μＭ）のプレインキュベートした混合物を３０μＬ／分の流速で９０秒間注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ制御ソフトウェアのＡ－Ｂ－Ａインジェクションコマンドを使用した（最初の標的の全ての結合部位が確実に占有されるように、第２の標的を第１の標的と事前に混合した）。チップは、１００μＬ／分で１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）の２つの２０秒パルスによって再生した。この実験は、生理学的温度を模倣するために３７℃で実施した。他の標的ですでに飽和している（２番目に注入された）キャプチャーされたＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴに結合した各標的の平均の相対結合化学量論は、占有されていないＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴに結合する全容量の割合として表された。

図５８に示されるような標的結合センサーグラムでは、ＣＬＥＣ１２Ａドメインの占有状態がＮＫＧ２Ｄ結合を妨害せず、ＮＫＧ２Ｄドメインの占有状態がＣＬＥＣ１２Ａ結合を妨害しないことが示される。他の標的で飽和されている遊離Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴへの各標的の結合を示すそれぞれのセンサーグラムセグメントの形状の類似性によって、反応速度論的パラメーターがＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ分子の標的占有状態によって有意に影響されないことが示唆される。例えば、センサーグラムのＣＬＥＣ１２Ａ結合セグメントの形状は、両方のパネルで類似している。ＮＫＧ２Ｄの飽和濃度は、実験全体を通して維持され、これは、標的の解離速度が速いので、下のパネルに示されている。さらに、各標的結合の相対的な化学量論への影響がないこと（占有されていないＦ３’－１６０２への結合と比較した場合）は、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ上のＮＫＧ２Ｄ及びＣＬＥＣ１２Ａ結合部位が完全に独立していることを意味する（表５６）。

ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ１６ａの相乗効果
相乗的なＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａの結合はＳＰＲによって評価された。２３３ＲＵのｈＮＫＧ２Ｄのみ、６１８ＲＵのＣＤ１６ａＦ１５８対立遺伝子のみ、及び７９７ＲＵのｈＮＫＧ２ＤとＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）の混合物がＣＭ５シリーズＳＢｉａｃｏｒｅチップの表面にアミノカップリングされた。２．８μＭＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴまたはトラスツズマブは、１０μＬ／分で１５０秒間注入した。解離段階は、再生が不要な場合は１８０秒間、同じ流速でのサイクル間で表面の自然再生（分析対象物のほぼ完全な解離）が必要な場合は１５００秒間観察した。

図５９に示すように、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴはＣＤ１６ａまたはＮＫＧ２Ｄのみに低い親和性で結合するが、混合表面に注入されたＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、はるかに遅いオフレートでＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄの同時結合の結合力として現れる（図５９Ａ）。実験対照トラスツズマブは、固定化ＮＫＧ２Ｄに結合せず、両方の混合物（ＣＤ１６ａ＋ＮＫＧ２Ｄ）及びＣＤ１６ａのみの表面に注入した場合に同じ見かけのオフレートを示す（図５９Ｂ）。このデータによって、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴがＣＤ１６ａとＮＫＧ２Ｄの両方に強く係合することが示される。

無関係な組換えタンパク質の結合及び細胞結合特異性
ＣＬＥＣ１２Ａに対する特異性は、５００ｎＭもの高濃度で５つの異なる無関係のタンパク質に対してＳＰＲによって試験され、図６０に示されている。陽性対照（ＣＬＥＣ１２Ａ）は１００ｎＭの濃度で、５０ＲＵ（図６０Ａ）の結合を示したのに対し、非特異的結合は、無関係の組換え標的（図６０Ｂ、図６０Ｃ）のいずれに対しても観察されなかった。特異性は、Ｂａ／Ｆ３細胞株の表面に発現するタンパク質に対しても試験された。Ｂａ／Ｆ３親細胞株に対するＦ３’－１６０２の非特異的結合は３３３ｎＭの濃度では観察されなかったが（図６０Ｅ）、陽性対照として使用される、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するように操作されたＢａ／Ｆ３細胞株は、フローサイトメトリーによって有意なシフトを示した（図６０Ｄ）。

多重特異性試薬（ＰＳＲ）への非特異的結合
フローサイトメトリーベースのＰＳＲアッセイにより、無関係のタンパク質に非特異的に結合する可能性が高い抗体を除外可能である。開発性評価の一部として、ＰＳＲアッセイで界面活性剤可溶化膜タンパク質の調製物への非特異的結合についてＦ３’－１６０２を試験した（図６１）。ＰＳＲアッセイは、相互作用（ｃｒｏｓｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー、抗体の溶解性の代用、ならびにバキュロウイルス粒子、酵素結合免疫吸着アッセイ、インビボクリアランスでの代用とよく相関する（Ｘｕｅｔａｌ．，（２０１３）．Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍａｎｉｎｖｉｔｒｏｙｅａｓｔｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ：ａＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｔｉｃａｌｔｏｏｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２６，６６３－６７０）。

ＰＢＳＦ中の５０μＬの１００ｎＭＴｒｉＮＫＥＴまたは対照ｍＡｂを、事前に洗浄した５μＬのプロテインＡダイナビーズスラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００１Ｄ）とともに室温で３０分間）インキュベートした。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂに結合した磁気ビーズを磁気ラック上に６０秒間放置し、上清を廃棄した。結合したビーズを１００μＬのＰＢＳＦで洗浄した。ビーズは、ストックから２５倍に希釈された５０μＬのビオチン化ＰＳＲ試薬とともに氷上で２０分間インキュベートした（Ｘｕｅｔ．ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２６，６６３－６７０）。試料を磁気ラックに置き、上清を廃棄し、１００μＬのＰＢＳＦで洗浄した。ＴｒｉＮＫＥＴまたは対照ｍＡｂへのビオチン化ＰＳＲ試薬の結合を検出するための二次ＦＡＣＳ試薬は、次のように作成された：１：２５０μＬのストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ、カタログ番号４０５２０４）及び１：１００のロバの抗ヒトＦｃを、ＰＢＳＦで組み合わせた。各試料に１００μＬの二次試薬を加え、氷上で２０分間インキュベートさせた。そのビーズを１００μＬのＰＢＳＦで２回洗浄し、試料をＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ）で分析した。２つのＰＳＲ対照、リツキシマブ（ＰＳＲ陽性）及びトラスツズマブ（ＰＳＲクリーン）をアッセイに使用した。
ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームアッセイでのＨｉｇｈ－Ｓｐｅｃ（登録商標）

交差反応性アッセイ
Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの特異性を調べるために、タンパク質アレイ技術を使用した。ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームマイクロアレイは、単一の顕微鏡スライド上に個別に精製されたヒト全長タンパク質の最大のデータベースを提供する。２２，０００の全長ヒトタンパク質からなるアレイは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現され、精製された後、マイクロアレイスライドガラスに２重にプリントされ、何千もの相互作用をハイスループットでプロファイリングすることが可能になる。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの特異性は、標準的な手順に従って、ＣＤＩｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）のマイクロスライドに埋め込まれたネイティブＨｕｐｒｏｔヒトプロテオームアレイに対して、０．１μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの濃度で試験された。

図６２は、ヒトプロテオームマイクロアレイ全体と比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの相対的結合（Ｚスコア）を１μｇ／ｍＬで示す。Ｚスコアは、所定のタンパク質の２つの複製の平均結合スコアである。比較の目的で、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴに結合するバックグラウンドが残っている上位２４個のタンパク質も図６２に提供されている。表５７は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ及びマイクロアレイの上位６つのタンパク質に対するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＺスコア及びＳスコアを示している。Ｓスコアは、所定のタンパク質のＺスコアとその隣の１つのランクとの差である。トップのヒットのＳスコアが３を超える抗体は、その標的に非常に特異的であると考えられている。Ｚ及びＳスコア基準に基づいて、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームアッセイにおいて、ヒトに対する高い特異性及びオフターゲット結合の欠如を示した。

分子モデリング
Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの抗ＣＬＥＣ１２Ａ及び抗ＮＫＧ２Ｄ結合アームを、ＳＡｂＰｒｅｄＷｅｂサイトで入手可能なＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｆｉｌｅｒ（ＴＡＰ）を使用して、３７７のフェーズＩ後の生物療法分子と比較した。ＴＡＰは、ＡＢｏｄｙＢｕｉｌｄｅｒを使用して、ＰＥＡＲＳによって側鎖を有するＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのモデルを生成した。ＣＤＲＨ３は、その多様性に起因してＭＯＤＥＬＬＥＲによって構築された。

５つの異なるパラメーターが評価された。
ＣＤＲの全長
ＣＤＲ付近の表面疎水性（ＰＳＨ）のパッチ
ＣＤＲ付近の正電荷（ＰＰＣ）のパッチ
ＣＤＲ付近の負電荷（ＰＮＣ）のパッチ
構造的Ｆｖ電荷対称パラメーター（ｓＦｖＣＳＰ）

次に、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのこれらのパラメーターを治療用抗体のプロファイル分布と比較して、開発可能性、及び下流の課題を引き起こし得る潜在的な問題を予測した。

図６３は、３つの異なる方向でのＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのリボン図モデル（上のパネル）、及び同じ方向の対応する表面電荷分布（下のパネル）を示している。抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖの電荷分布は分極化されており（「上面図」、下のパネル）、負に帯電した残基が主にＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ２内に存在する。パラトープ上の静電パッチの不均一な分布は、標的に関連している可能性が高く、同族のエピトープ上の電荷分布の相補性を反映している可能性があり、これは、ＣＬＥＣ１２ＡとＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのｓｃＦｖとの間の高親和性相互作用に寄与する可能性がある。

図６４は、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのアームを標的とするｓｃＦｖＣＬＥＣ１２ＡのＣＤＲ長及び表面疎水性分析を示している。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲの長さは、後期治療用抗体に典型的である。

モノクローナル抗体の疎水性は、治療薬への開発可能性に関連する重要な生物物理学的特性である。抗体のＣＤＲの疎水性パッチ分析は、その挙動を予測する。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＣＬＥＣ１２Ａアームは、他の参照分子と比較して疎水性がはるかに低くなっている。モデリングに基づけば、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＣＬＥＣ１２Ａ結合アームの表面に有意なサイズの疎水性パッチはない。

抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖの電荷分布は分極化されており、負に帯電した残基が主にＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ２内に存在する（図６４に示されるとおり）。正に帯電したパッチと電荷の対称性は標準の範囲内であるが、理論に拘束されることは望まないが、パラトープ上の明確な負に帯電したパッチは標的に関連しており、ＣＬＥＣ１２Ａとの高親和性相互作用に寄与し得る、同族のエピトープ上の電荷分布の相補性を反映していると仮定される。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂアームは、３つの異なる方向のリボン図に示され（図６５）、同じ方向のそれらの対応する表面電荷分布が図６５に示されている（下のパネル）。ＣＬＥＣ１２Ａ結合アームとは対照的に、ＮＫＧ２ＤＡ４９Ｍ－Ｉアームの表面電荷分布は、より均一に分布している。

図６６は、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性分析のパッチを示している。分析はＴＡＰを使用して実行され、３７７の後期治療用抗体を評価した。ＣＤＲの長さ、疎水性、正／負電荷分布、及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＦｃ電荷対称性は、既存の治療用抗体の基準の範囲内であるように思われる。このモデリングによって、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴが製造プロセス中に開発可能性の問題を起こさないことが示唆される。

疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性予測データは、分析的な疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用してＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの挙動を調査することで確認され、これは、露出した疎水性パッチの重要なパッチが凝集しやすいタンパク質に依存する技術である。ＨＩＣを実行するために、簡単に言うと、ＴｒｉＮＫＥＴ（５μｇのタンパク質）の注入を高塩緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）対、試料が、５：４という比率で調製した。試料は、２５℃に保持されたＳｅｐａｘＰｒｏｔｅｏｍｉｘＨＩＣブチル－ＮＰ５５ｕＭカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩＨＰＬＣを使用して分析した。この勾配は、０％の低塩緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）から１００％の低塩緩衝液まで流速１．０ＭＬ／分で６．５分かけて泳動した。クロマトグラムは、２８０ｎｍでモニターした。分析用ＨＩＣカラムでのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの保持時間は、表５８に、ＨＩＣプロファイルは図６７に示されている。市販のトラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）は、正常に挙動する生物学的製剤の例として使用され、アッセイの内部対照として機能した。トラスツズマブの保持時間が９．６分なのと比較して、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの保持時間は９．８分である。したがって、実験的な疎水性分析では、Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの疎水性がさらなる開発に受け入れられることが示唆されている。

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
Ｆ３’－１６０２の実験的ｐＩは、実施例１５（図６８）に記載されているように、ｃＩＥＦによって得られた。市販等級のトラスツズマブは、内部対照としてアッセイに含まれていた。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴのｃＩＥＦプロファイルは、モノクローナル抗体に典型的であり、主要ピークはｐＩ８．８０であった（表５９）。少量の酸性及び塩基性種の存在も観察された。

免疫原性評価
以下に記載されているように、ＥｐｉＶａｘのＥｐｉＭａｔｒｉｘアルゴリズムを使用して免疫原性評価を実施した：Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．（２０１０）Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄＴｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｍｅａｓｕｒｅ（ｉＴＥＭ）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９６１７５２。ｓｃＦｖ－１６０２Ｆ３’の３つの鎖の配列について、－８０（免疫原性なし）から８０（高度に免疫原性）の範囲のＴ_ｒｅｇ調節Ｅｐｉｍａｔｒｉｘタンパク質スコアは、ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ：－３３．３９，ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ：－２６．４及びＶＬ－ＣＬ：－２７．４である。したがって、ｓｃＦｖ－１６０２Ｆ３’の免疫原性の予測リスクは低いようである。

実施例１３．推定配列ライアビリティのＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ分析
Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列を、実施例３に記載されているように推定配列ライアビリティについて分析した。推定配列ライアビリティを表６０に示す。

ライアビリティを調べるために、加速安定性（４０℃で４週間）及び強制分解の研究を行った。ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃのＣＤＲＨ３のＤＰは、加速安定性研究または強制分解研究では変更されなかったため、これ以上の分析は必要なかった。しかしながら、実施例１４に記載されるように、加速安定性研究において、ｓｃＦｖのＣＤＲＨ３におけるＤＳの改変が、ＣＬＥＣ１２Ａ結合の減少及びＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの効力の減少をもたらすことが観察された。

ＣＤＲＨ３のＤＳを置き換えるために、酵母ディスプレイを実行して、ＤＳ部位のない代替配列モチーフを特定した。３つのバリアント、すなわち

（配列番号２８３）

（配列番号２８４）及び

（配列番号２８５）は、親ｓｃＦｖ

（配列番号１３９）と比較して結合シグナルが弱いにもかかわらず、ｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合を示したことが特定され、一方、バリアント

（配列番号２９０）、

（配列番号２９１）、及び

（配列番号２９２）が非バインダーとして特定された。結合分析に基づいて、バリアント

（（配列番号２８３）、ＡＢ００５３）及び

（（配列番号２８４）、ＡＢ００８５）のみを、哺乳動物の生成及びさらなる特性評価のために検討した。ＡＢ００５３及びＡＢ００８５のｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓへの結合は、３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して特徴付けた。ＤＳ配列のライアビリティを取り除くために導入された両方の変異は、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓへの結合に影響を及ぼした（表６１）。図６９は、ＣＤＲＨ３の配列ライアビリティを取り除くために生成された酵母ライブラリーを使用したｈＣＬＥＣ１２Ａ－ｈｉｓへの結合のＦＡＣＳ分析を示している。このデータによって、ＤＳからＤＩ操作されたバリアント（ＡＢ００８５）の結合が完全に失われたことが示された。ＤＳ（ＡＢ００５３）の代わりにＤＡを導入しても、結合は完全には排除されなかったが、結合センサーグラムに明らかな不均一性が生じた。ＳＰＲ分析に続いて、ライアビリティを修復したバリアント（ＡＢ００５３及びＡＢ００８５）の効力を、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを介した細胞毒性アッセイで試験した（図７０、表６２）。ＡＢ００８５は、最大殺滅率の大幅な低下によって決定されるように、ＡＭＬ細胞を殺す能力を失った。ＡＢ００５３構築物のＥＣ５０がＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＢ０２３７）対照と比較して約３倍に増大したが、最大殺滅の割合は影響を受けなかった。この知見は、ＳＰＲ実験で確立されたｈＣＬＥＣ１２Ａに対する全体的な親和性の３倍の変化と一致している（表６１）。

Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴの組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して３７℃でＳＰＲによって測定された。簡単に言えば、ヒトＦｃ特異的抗体は、アミンカップリング化学によりＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に密度約８０００～１００００のレゾナンスユニット（ＲＵ）で共有結合的に固定化して、抗ｈＦｃＩｇＧチップを作成した。Ｆ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴ試料は、１．５μｇ／ｍＬの濃度で１０μＬ／分の流量で６０秒間、抗ｈＦｃＩｇＧチップ上にキャプチャーして、約１５０～２５０ＲＵキャプチャーレベルを達成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１Ｘ；１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ２０ｐＨ７．４）で３倍希釈で段階希釈（１００ｎＭ～０．０４６ｎＭ）して、３０μｌ／分の流量でキャプチャーされた試験物質の上に注入した。会合を３００秒間モニターし、解離は６００秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．７の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生された。０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ緩衝液を含むＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）を実験全体を通して使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析された。

ライブラリーアプローチが唯一のヒットとしてＡＢ００５３を生成し、そのヒットがＦ３’－１６０２ＴｒｉＮＫＥＴとは有意に異なるｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合の反応速度論及び細胞毒性アッセイにおける劣った効力を示したので、ＤＳモチーフはＣＤＲＨ３の構造を維持するために必要であり、したがって、効果的に除去することはできないと結論付けられた。代わりに、ＤＳのライアビリティは、実施例１４で説明されているように、式によって制御された。

実施例１４．Ｆ３’－１６０２の製剤
実施例１３では、配列ライアビリティ部位は、Ｆ３’－１６０２がＣＬＥＣ１２Ａに結合する能力にとって重要であることが見出されたため、除去することができない。この実施例は、配列のライアビリティが存在するにもかかわらず、Ｆ３’－１６０２の安定性を維持し得る製剤を評価するために設計された。

簡単に説明すると、Ｆ３’－１６０２について次の３つの製剤を試験した。
（１）２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、及び０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（本明細書では「ＨＳＴ製剤」と呼ばれる）。Ｆ３’－１６０２をＨＳＴ緩衝液に透析濾過し、回収した試料を０．２ μｍフィルターに通した。Ｆ３’－１６０２の最終濃度は、２８０ｎＭでの吸光度（Ａ２８０）で測定して１９．７ｍｇ／ｍＬであった。
（２）２０ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８（本明細書では「リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤」と呼ばれる）。Ｆ３’－１６０２は、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ３０Ｋデバイス及びＺｅｂａＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎｓを使用して、リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤緩衝液へ緩衝液スイッチされ、回収した試料は、０．２ μｍフィルターに通された。Ｆ３’－１６０２の最終濃度は、Ａ２８０で測定して２０．６ｍｇ／ｍＬであった。
（３）２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、及び０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０（本明細書では「ＣＳＴ製剤」と呼ばれる）。Ｆ３’－１６０２をＣＳＴ製剤緩衝液に透析濾過し、回収した試料を０．２ μｍフィルターに通した。Ｆ３’－１６０２の最終濃度は、Ａ２８０で測定して、２０ｍｇ／ｍＬであった。

ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性
加速安定性研究は、ＨＳＴ緩衝液で４０℃で４週間実行した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、保管条件の関数として高分子量種（ＨＭＷＳ）及び低分子量種（ＬＭＷＳ）の形成をモニターした。簡単に説明すると、５０μｇの試験物質を、１２６０ＱｕａｔＰｕｍｐ、１２６０Ｖｉａｌｓａｍｐｌｅｒ、１２６０ＶＷＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）機器に注入した。その試料は、東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ、内径７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、５μｍカラムで分離した。ＳＥＣ泳動緩衝液は、ＰＢＳ、ｐＨ７．０、０．５０ｍｌ／分の流動であった。吸光度は２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの両方でモニターして、ピーク面積は手作業で積分し、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ、及び単量体のパーセントを報告した。

研究の開始時に、Ｆ３’－１６０２をＳＥＣによって分析し、９９．６％の単量体であった。４０℃で４週間後、単量体は９３．１％に減少した。ＬＭＷＳは対照では検出されず、４０℃で４週間後に５．４％に増大した。ＨＭＷＳは０．４％で対照に存在し、４０℃で４週間後に１．５％に増大した（表６３）。これらのデータは、Ｆ３’－１６０２が主にＬＭＷ種の形成（断片化）によって分解することを示唆している。

Ｆ３’－１６０２試料の組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して３７℃でＳＰＲによって測定した。簡単に説明すると、ヒトＦｃ特異的抗体を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に、約８０００～１００００レゾナンスユニット（ＲＵ）の密度で共有結合的に固定して、抗ｈＦｃＩｇＧチップを作成した。Ｆ３’－１６０２試料は、１．５μｇ／ｍＬの濃度で、１０μＬ／分の流量で６０秒間、抗ｈＦｃＩｇＧチップ上にキャプチャーして、約１５０～２５０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを、０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）緩衝液を含むＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）での３倍希釈で、段階希釈（１００ｎＭ～０．０４６ｎＭ）して、キャプチャーされた試験物質の上に３０μｌ／分の流量で注入した。会合を３００秒間モニターし、解離は６００秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．７の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生された。０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ緩衝液を含むＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）を実験全体を通して使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析された。運動速度定数及び全体的な親和性は、１：１の反応速度論的適合結合モデルを使用して得た。

ＨＳＴ製剤中で４０℃で４週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合が減少した（図７１）。対照と４０℃のストレスを受けた試料と間の会合及び解離速度定数の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内である（表６４）；しかし、レゾナンスユニット（ＲＵ）で表される最大結合応答は、４０℃でのインキュベーション後に５分の１以上減少した（図７１）。Ｆ３’－１６０２タンパク質の名目上のキャプチャーは、ストレスを受けた試料と対照の試料の両方で同じであった。このような状況下では、Ｒ_ｍａｘは、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上にキャプチャーされたＦ３’－１６０２の活性濃度にほぼ比例する。この結果は、今度は、ＨＳＴ製剤の熱ストレス後、Ｆ３’－１６０２分子の８０％超がＣＬＥＣ１２Ａに結合する能力を失ったことを示している（表６４）。

Ｆ３’－１６０２試料の組換えヒトＮＫＧ２Ｄへの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して３７℃でＳＰＲによって測定した。簡単に説明すると、ｍＦｃ特異的抗体を、アミンカップリング化学を介して、ＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に約８０００～１００００ＲＵの密度で共有結合で固定化し、抗ｍＦｃＩｇＧチップを作成した。ｍＦｃタグ付きヒトＮＫＧ２Ｄを、０．２μｇ／ｍＬの濃度で、６０秒間、１０μＬ／分の流速で抗ｍＦｃＩｇＧチップにキャプチャーして、約３５ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。Ｆ３’－１６０２を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）緩衝液に緩衝液交換し、ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いた２倍希釈で段階希釈（５０００ｎＭ～９．７８ｎＭ）した。分析対象物（Ｆ３’－１６０２）は、キャプチャーされた試験物質の上に３０μｌ／分の流量で注入した。会合を６０秒間モニターし、解離は６０秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．７の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生した。ＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）緩衝液を、実験全体を通して使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。結合親和性及び運動速度は、１：１の反応速度論的及び定常状態の親和性モデル適合の両方を使用して得られた。

ＨＳＴ製剤中で４０℃で４週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＮＫＧ２Ｄへの結合は変化しなかった（図７２、表６５）。対照と４０℃のストレス試料との間の会合及び解離速度定数、ならびにＮＫＧ２Ｄに対する全体的な親和性の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。最大結合応答は有意に変化しなかった。この結果、Ｆ３’－１６０２がこれらの熱ストレス条件下でＮＫＧ２Ｄに結合する能力を維持したことが示されている。

ビオチン化された組換えＣＤ１６ａＶ１５８（ＦＣγ ＲＩＩＩａＶ１５８）受容体へのＦ３’－１６０２試料の結合親和性をＳＰＲにより測定した。簡単に言えば、Ｆｃγ ＲＩＩＩａＶ１５８は、反応速度論評価実験の前にＳＡシリーズＳＢｉａｃｏｒｅチップ上でキャプチャーして、キャプチャー約１０～２５ＲＵを達成した。よく特徴付けられたＩｇＧ１生物学的薬剤であるトラスツズマブを実験対照として使用した。この評価では、キャプチャーされた受容体（１：１段階希釈中で１５００ｎＭ～１１．７ｎＭ及び０ｎＭ）で滴定されたさまざまな濃度のリガンド（Ｆ３’－１６０２またはトラスツズマブ）の注射を使用した。各注入サイクルは、会合、解離、及び再生のステップで構成されていた。会合は、１５０秒間のリガンド注入で構成され、解離は３００秒間モニターされ、その後、２ｍＭ水酸化ナトリウムを５秒間注入してサイクル間で表面を再生した。全てのステップは、３０μＬ／分の流速で実行された。１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を、泳動／希釈緩衝液として用いた。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。このデータは１：１の反応速度論モデルと適合された。

２０ｍｇ／ｍＬで、ＨＳＴ製剤中で４０℃４週間のインキュベーション後、ヒトＣＤ１６ａＶ１５８へのＦ３’－１６０２の結合は変化しなかった（図７３及び表６６）。対照と４０℃ストレス試料との間の結合親和性の相違、及び最大結合応答（Ｒ_ｍａｘ）は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。この結果は、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＣＤ１６ａに対する親和性を保持したことを示している。

Ｆ３’－１６０２機能に対する加速安定性の効果は、ＮＫＧ２Ｄに加えてＣＤ１６ａを発現するように設計されたＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞を使用した細胞毒性アッセイでも評価された。ＣＬＥＣ１２Ａ^＋ヒトがん細胞株（ＰＬ－２１）をＢＡＴＤＡ試薬で標識した。標識後、細胞を洗浄し、初代細胞培養培地に再懸濁した。ＢＡＴＤＡ標識細胞、Ｆ３’－１６０２、及び休止ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６Ｖ細胞を、９６ウェルプレートのウェルに添加した。追加のウェルは、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘの追加によって標的細胞の最大の溶解のために準備した。ＢＡＴＤＡ標識細胞のみを含むウェルからの自発的放出をモニターした。３時間の培養後、細胞をペレット化し、培養上清を清浄なマイクロプレートに移し、室温のユーロピウム溶液を各ウェルに加えた。そのプレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘ装置を使用してプレートを読み取った。特異性溶解％は、以下のように算出した：
特異性溶解％＝（（実験的放出－自発的放出）／（最大放出－自発的放出））^＊１００％

図７４及び表６７に示すように、ＰＬ２１ＣＬＥＣ１２Ａ^＋がん細胞を殺滅するＦ３’－１６０２の能力は、ＨＳＴ製剤では４０℃で４週間後に約７倍低下したが、最大溶解率％の減少はわずかであった（５％）。

４０℃のインキュベーション後のｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合の有意な喪失及びそれに対応する効力の喪失により、この挙動の根本原因を調査した。ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピングによって、抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖ（ＣＤＲ－Ｈ３）中のアスパラギン酸が異性化を受けていることが明らかになった（図７５）。

Ｃｈｏｔｈｉａで定義されているＦ３’－１６０２ＣＤＲＨ３には、４つのアスパラギン酸を含む（ＤＹＤＤＳＬＤＹ［配列番号２９３］）。ＭＳ／ＭＳを使用して、スクシンイミド中間体をモニターすることにより、それらのどれが異性化を受けているかを決定した。イソアスパラギン酸への変換は質量差を生じないが、スクシンイミド中間体は水分の損失（約１８Ｄａ）に対応する。この質量シフトは、異性化するアスパラギン酸を特定するために使用され得る。未修飾のキモトリプシンペプチド及び対応するスクシンイミドバリアントのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｓｃＦｖＶＨの位置Ｈ９９（Ｃｈｏｔｈｉａ）のアスパラギン酸（ＤＹＤＤＳＬＤＹ［配列番号２９３］）が異性化の原因であったことを示した。

リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２の安定性
突然変異誘発によってライアビリティを取り除く試みによって、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖの位置Ｈ９９のアスパラギン酸がＣＤＲ構造の重要な決定因子であり、標的への結合を失うことなく容易に置き換えられ得ないことが明らかになった。したがって、異性化速度はｐＨに依存するので、より塩基性のｐＨを持つ製剤を特定するために、限られた前製剤化開発を行った。ｐＨ依存性は、ｐＨ５．５～７．５をカバーするクエン酸及びリン酸緩衝液中でＦ３’－１６０２を強調することによって確認された。リン酸緩衝液（ｐＨ６．５／７．０／７．５）中４０℃で４週間後、Ｆ３’－１６０２は、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合のｐＨ依存性の喪失を示した。興味深いことに、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５／６．０／６．５）中で観察される傾向はなかった。これらの結果に基づいて追加の製剤を設計し、一般的な賦形剤（ＮａＣｌ、スクロース、ＥＤＴＡ）を、ＣＬＥＣ１２Ａ結合を安定化する能力についてスクリーニングした（表６８）。このスクリーニングは、高ｐＨ及びＮａＣｌがＣＬＥＣ１２Ａ結合に対して保護効果を有することを示した。

これらの結果に基づいて、Ｆ３’－１６０２は、２０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８中で製剤化される（リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤）。

ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳの形成は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションで説明されているようにＳＥＣによって評価した。Ｆ３’－１６０２を４０℃で４週間インキュベートした。研究の開始時に、Ｆ３’－１６０２をＳＥＣによって分析し、９７．９％の単量体であった。４０℃で４週間後、単量体は９１．４％に減少した。ＬＭＷＳは、４０℃で４週間後に１．８％から５．０％に増大した。ＨＭＷＳは０．３％で対照に存在し、４０℃で４週間後に３．６％に増大した（表６９）。これらのデータによって、リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中で、Ｆ３’－１６０２は凝集（ＨＭＷＳ）と断片化（ＬＭＷＳ）の両方で分解されたことが示唆される。

インタクトなＦ３’－１６０２の断片化及び凝集は、非還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＳＤＳ－ＣＥ）による加速安定性研究で評価された。簡単に説明すると、Ｆ３’－１６０２を、１Ｘ試料緩衝液を使用して０．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、５０μＬの最終試料量を達成した。内部標準及びヨードアセトアミドを試料に添加し、次いでこれをヒートブロック内で７０℃で１０分間インキュベートした後、氷浴で５分間インキュベートした。試料を９６ウェルプレートに移し、遠心分離し、機器にロードした。個々の試料をキャピラリーに４６００ボルトで４０秒間ロードし、モーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で５７５０ボルトで３５分間分離した。

Ｆ３’－１６０２の主要ピークの純度は、４週間のインキュベーションの終わりまでに９７．０％から９１．２％に低下した。ＬＭＷＳは、３．０％から８．４％に対応して増大した（表７０）。非還元ＳＤＳ－ＣＥによって決定された研究期間中、ＨＭＷＳはわずかに増大した（不検出から０．４％まで）。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

Ｆ３’－１６０２の３つの個々のポリペプチド鎖の断片化は、ＳＤＳ－ＣＥの減少による加速安定性研究の各時点で評価した。このアッセイでは、純度は３つの鎖の合計によって決定された。研究の過程で、純度は９７．４％から９５．２％に低下した（表７１）。この純度の低下は、ＬＭＷＳの増大の結果であり、ＳＥＣ及び非還元ＳＤＳ－ＣＥの結果と一致している。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションに記載されているようにＳＰＲによって測定された。リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中での４週間のインキュベーション後、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ結合はある程度減少した（図７６）。対照と４０℃のストレス試料との間の会合及び解離速度定数の差は、アッセイの実験的変動の範囲内であったが（表７２）、キャプチャーの差を調整した最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）は、４０℃でのインキュベーション後に約１０％低下した。このような損失は、ＨＳＴ製剤での４週間のインキュベーション後に観察された８０％を大幅に下回り、リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤は、加速（４０℃）条件下でＦ３’－１６０２を安定化させることができたことが示される。したがって、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションで説明されているように、Ｈ９９の異性化は、製剤開発によって大幅に減少した。

組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションに記載されているようにＳＰＲによって測定された。リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中で、２０ｍｇ／ｍＬで４０℃で、４週間のインキュベーション後、Ｆ３’－１６０２のヒトＮＫＧ２Ｄへの結合は変化しなかった（図７７及び表７３）。対照と４０℃のストレスを受けた試料との間の平衡結合親和性及びＲｍａｘの相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持したことが示されている。

「ＨＳＴ製剤中Ｆ３’－１６０２の安定性」のサブセクションに記載されているように、ビオチン化組換えＣＤ１６ａＶ１５８（ＦＣγ ＲＩＩＩａＶ１５８）受容体へのＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、ＳＰＲにより測定した。リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中で、２０ｍｇ／ｍＬで４０℃で、４週間のインキュベーション後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＤ１６ａＶ１５８への結合は変化しなかった（図７８及び表７４）。対照と４０℃のストレス試料との間の結合親和性の相違、及び最大結合レスポンスは、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持することが示されている。

「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションで説明されているように、Ｆ３’－１６０２機能に対する加速された安定性の影響は、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａを発現するＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞を使用した細胞毒性アッセイでも評価された。ＰＬ－２１ＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞を殺滅するＦ３’－１６０２の能力は、リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中で２０ｍｇ／ｍＬの濃度で４０℃で４週間のインキュベーション後も変化しなかった（図７９及び表７５）。この結果は、ＨＳＴ製剤でのインキュベーション後に観察された結果とはまったく対照的であり、Ｆ３’－１６０２が２０ｍＭリン酸塩、１０ｍＭのクエン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８で安定化されたことを示している。

ＣＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性
リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中の安定性データに基づいて、４０℃での活性の損失は液体製剤で最小限に抑えることができると結論付けられた。Ｆ３’－１６０２の安定性は、凍結防止剤としてスクロースを含む凍結乾燥適合性液体製剤でさらに分析した。

２０ｍｇ／ｍＬでの加速安定性研究は、２０ｍＭのクエン酸塩、２５０ｍＭのスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０（ＣＳＴ製剤）で、冷蔵（２～８℃）及び加速（２５及び４０℃）の条件で４週間実施した。ＣＬＥＣ１２Ａ（ＳＰＲ）への結合及び効力を、２～８℃及び２５℃のアームでモニターしながら、４０℃のストレスを受けた試料に対して一連の分析を実行した。

ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳの形成は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性（ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＦ３’－１６０２ｉｎｔｈｅＨＳＴｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」のサブセクションで説明されているようにＳＥＣによって評価した。この研究の開始時に、Ｆ３’－１６０２をＳＥＣによって分析し、９９．６％の単量体であった。４０℃で４週間後、単量体は９８．６％に減少した。ＬＭＷＳは対照では検出されず、４０℃で４週間後に０．５％に増大した。ＨＭＷＳは０．４％で対照に存在し、４０℃で４週間後に１．０％に増大した（表７６）。これらのデータによって、Ｆ３’－１６０２がＣＳＴ製剤の加速条件下で凝集及び断片化の両方に耐性があったことが示唆される。

インタクトなＦ３’－１６０２の断片化は、「リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２の安定性（ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＦ３’－１６０２ｉｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｃｉｔｒａｔｅ／ＮａＣｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」のサブセクションに記載されているように、非還元ＳＤＳ－ＣＥによる加速安定性研究の各時点で評価された。Ｆ３’－１６０２の主要ピークの純度は、４週間のインキュベーションの終わりまでに９６．１％から９１．０％に低下した。ＬＭＷＳは、３．９％から９．０％に対応して増大した（表７７）。非還元ＳＤＳ－ＣＥによって決定されたように、研究期間を通してＨＭＷＳの増大はなかった。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

Ｆ３’－１６０２の３つの個々のポリペプチド鎖の断片化は、「リン酸塩／クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤中のＦ３’－１６０２の安定性（ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＦ３’－１６０２ｉｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｃｉｔｒａｔｅ／ＮａＣｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」のサブセクションに記載されているように、還元ＳＤＳ－ＣＥによる加速安定性研究の各時点で評価された。このアッセイでは、純度は３つの鎖の合計によって決定された。研究の過程で、純度は９８．３％から９７．７％に低下した（表７８）。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性（ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＦ３’－１６０２ｉｎｔｈｅＨＳＴｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」のサブセクションに記載されているようにＳＰＲによって測定された。ＣＳＴ製剤中で、２０ｍｇ／ｍＬで４０℃で４週間のインキュベーション後、ヒトＣＬＥＣ１２Ａの結合が減少した（図８０及び表７９）。対照と４０℃のストレスを受けた試料との間の会合及び解離速度定数の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であるが、見かけの結合応答は、４０℃でのストレス後に約１５～１７％減少した。これは、Ｆ３’－１６０２の１５～１７％が、これらの熱ストレス条件下で４週間後にＣＬＥＣ１２Ａに結合する能力を失ったことを示している。古典的なＳＰＲ結合アッセイは、結合の著しい相違（２０％以上）がある場合には、潜在的な活性喪失の良い指標であるが、試料の活性の小さな変化の影響に対処するには十分な信頼性がない（特に低い複製数で）；必要に応じて、他の分析方法を使用して、より科学的な確実性で変化を解明する。

より低い温度（冷蔵及び２５℃）では、ｃＳＴ製剤で４週間後に、ｈＣＬＥＣ１２Ａに対する親和性の相違またはキャプチャーレベルの相違を調整した見かけの結合は観察されなかった（図８１、表８０、及び表８１）。

組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性は、「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションに記載されているようにＳＰＲによって測定された。ＣＳＴ製剤中で、２０ｍｇ／ｍＬで４０℃４週間のインキュベーション後、ヒトＮＫＧ２ＤへのＦ３’－１６０２の結合は変化しなかった（図８２及び表８２）。対照と４０℃のストレスを受けた試料との間の平衡結合親和性及びみかけのＲｍａｘの相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持したことが示されている。

「ＨＳＴ製剤中Ｆ３’－１６０２の安定性」のサブセクションに記載されているように、ビオチン化組換えＣＤ１６ａＶ１５８（ＦＣγ ＲＩＩＩａＶ１５８）受容体へのＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、ＳＰＲにより測定した。ＣＳＴ製剤中で、２０ｍｇ／ｍＬで４０℃４週間のインキュベーション後、ヒトＣＤ１６ａＶ１５８へのＦ３’－１６０２の結合は変化しなかった（図８３及び表８３）。対照と４０℃のストレスを受けた試料との間の平衡結合親和性及びみかけのＲ_ｍａｘの相違は、アッセイの実験的変動の範囲内である。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＣＤ１６ａに対する親和性を保持したことが示されている。

「ＨＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性」のサブセクションで説明されているように、Ｆ３’－１６０２機能に対する加速された安定性の影響は、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａを発現するＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞を使用した細胞毒性アッセイでも評価された。ＰＬ－２１ＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞を殺滅するＦ３’－１６０２の能力は、ＣＳＴ製剤中で２０ｍｇ／ｍＬの濃度で４０℃で４週間のインキュベーション後も変化しなかった（図８４及び表８４）。

実施例１５．ＣＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の製造可能性
Ｆ３’－１６０２の製造中のさまざまな条件が、その安定性に影響し得る。この実施例は、凍結／解凍、攪拌、低及び高ｐＨ、強制酸化、及び低ｐＨ保持を通じてＣＳＴ製剤におけるＦ３’－１６０２の安定性を評価するために設計された。実施例１４に提供されている場合、タンパク質の完全性及び機能を測定する方法は、この実施例では繰り返されない。

凍結／解凍
プロセス中間体及びバルク製剤原料がプロセスステップ間の安定性を確保するために凍結され得るので、凍結／解凍サイクル中の安定性は、生物療法にとって重要である。凍結／解凍ストレスを作成するには、８．０ｍｇのＦ３’－１６０２を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ｍｌ３０Ｋデバイスを使用して２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０に緩衝液スイッチし、同じ緩衝液で４００μＬにさせた（約２０ｍｇ／ｍＬのＦ３’－１６０２、濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅ分光光度計を用いてＡ２８０によって確認した）。濃縮した試料を４ｘ１００μＬのアリコートに分けた。対照はすぐに－８０℃で保存した。残りの３つのアリコートは、発泡スチロールの容器内で－８０℃で凍結／解凍サイクルに供して、凍結プロセスを遅くする。サイクル２、４、及び６で、アリコートを取り出し、分析まで－８０℃の保管場所に移した。

Ｆ３’－１６０２の凍結／解凍安定性は、研究の完了時にＡ２８０によりタンパク質濃度を測定することによって評価した。Ｆ３’－１６０２の濃度は、対照中では２０．４ｍｇ／ｍＬで、６回の凍結／解凍サイクル後は、２０．２ｍｇ／ｍＬであって、凍結／解凍ストレスに起因する対立遺伝子の損失はなかったことが示される。

Ｆ３’－１６０２が凍結／解凍サイクルを通じて安定しているか否かを評価するには、試験物質を６回凍結及び解凍し、サイクル２、４、及び６の後にＳＥＣで分析した。時間０のＦ３’－１６０２は、９９．５％の単量体であり、単量体の％は６つ全ての凍結／解凍サイクルを通して変化しなかった（表８５）。この結果によって、Ｆ３’－１６０２が凍結／解凍ストレスの間、凝集及び断片化の両方に耐性であったことが示される。

インタクトなＦ３’－１６０２の断片化は、非還元ＳＤＳ－ＣＥによる凍結／解凍安定性研究で評価した。Ｆ３’－１６０２の主要ピーク純度は、６回の凍結／解凍サイクルの後、最小限に低下した（９６．１％～９５．５％）。ＬＭＷＳは、３．９％から４．５％に対応して増大した（表８６）。研究期間中、ＨＭＷＳは検出されなかった。これらの結果、Ｆ３’－１６０２が２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０での断片化に耐性があることが示される。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

Ｆ３’－１６０２の３つの個々のポリペプチド鎖の断片化は、還元ＳＤＳ－ＣＥによって、凍結／解凍安定性研究で評価した。このアッセイでは、純度は３つの鎖の合計によって決定された。Ｆ３’－１６０２の純度は、６回の凍結／解凍サイクル後も変化しなかった（表８７）。これらの結果、Ｆ３’－１６０２が２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０での断片化に耐性があったことが示される。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

攪拌
プロセス中間体及びバルク原薬は、処理ステップ中にせん断ストレスを受ける可能性があるため、攪拌中の安定性は生物療法にとって重要である。撹拌ストレスを作成するには、８．０ｍｇのＦ３’－１６０２を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ｍＬ３０Ｋデバイスを使用して２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０に緩衝液スイッチし、同じ緩衝液で４００μＬにさせた（約２０ｍｇ／ｍＬのＦ３’－１６０２、濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅ分光光度計を用いてＡ２８０によって確認した）。濃縮した試料を、攪拌棒付きのガラスバイアルに移し、攪拌プレートに置き、６０ｒｐｍ、４℃で１８時間攪拌した。攪拌後、試料は分析まで－８０℃で保存した。

Ｆ３’－１６０２の攪拌安定性を評価した。攪拌後、目に見えるタンパク質の沈殿があった。その試料をスピンダウンし、全ての特性評価アッセイで上清を使用した。上清中のタンパク質濃度はＡ２８０によって評価した。Ｆ３’－１６０２の濃度は対照では２０．４ｍｇ／ｍＬであり、攪拌ストレス後は１６．８ｍｇ／ｍＬであった。

Ｆ３’－１６０２が攪拌ストレス中に安定しているか否かを判断するために、攪拌の前後にＳＥＣによって試験物質を分析した。Ｆ３’－１６０２対照は、９９．５％の単量体であり、単量体％は攪拌後も変化しなかった（表８８）。これは、Ｆ３’－１６０２が攪拌中の凝集と断片化の両方に耐性があったことを示している。

インタクトなＦ３’－１６０２の断片化は、非還元ＳＤＳ－ＣＥによる攪拌後に評価された。Ｆ３’－１６０２の主要ピーク純度は、撹拌後、最小限に低下した（９６．１％～９５．５％）。ＬＭＷＳは、３．９％から４．５％に対応して増大した（表８９）。研究期間にわたって、ＨＭＷＳは検出されなかった。これらの結果、Ｆ３’－１６０２が２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０での断片化に耐性があったことが示される。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

Ｆ３’－１６０２の３つの個々のポリペプチド鎖の断片化は、還元ＳＤＳ－ＣＥによる攪拌研究で評価された。このアッセイでは、純度は３つの鎖の合計によって決定された。Ｆ３’－１６０２の純度は、攪拌ストレス後も変化しなかった（表９０）。これらの結果、Ｆ３’－１６０２が２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０での断片化に耐性があったことが示される。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

低ｐＨ及び高ｐＨ
低ｐＨストレスを作り出すために、１．０ｍｇのＦ３’－１６０２を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ１０Ｋデバイスを使用して２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に緩衝液スイッチし、同じ緩衝液で１．０ｍＬにした（約１ｍｇ／ｍＬのＦ３’－１６０２、濃度はＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅ分光光度計を用いてＡ２８０によって確認された）。試料は分割された。半分は対照として－８０℃で保存し、残りの半分は４０℃で２週間インキュベートした。攪拌後、試料は分析まで－８０℃で保存した。

高ｐＨストレスを発生させるために、１．０ｍｇのＦ３’－１６０２をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ１０Ｋデバイスを使用して２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３に緩衝液スイッチし、同じ緩衝液で１．０ｍＬにした。（約１ｍｇ／ｍＬのＦ３’－１６０２、濃度はＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅのＡ２８０によって確認された）。試料は分割された。半分は対照として－８０℃で保存し、残りの半分は４０℃で２週間インキュベートした。攪拌後、試料は分析まで－８０℃で保存した。ＴｒｉｓのｐＫａは温度の結果として変化する。４０℃では、ｐＨ８．３の緩衝液は、約ｐＨ８．０であった。

Ｆ３’－１６０２の化学的安定性を評価するために、試験物質を、ｐＨ５．０及びｐＨ８．０で２週間４０℃で保持した。低ｐＨでは、典型的な化学修飾は、アスパラギン酸の異性化及び断片化であるが、高ｐＨでは、主要な分解経路は脱アミド化及び酸化である。インキュベーション後のＦ３’－１６０２の完全性を確認するために、対照試料とストレス試料をＳＥＣで分析した（表９１）。この結果、Ｆ３’－１６０２が、これらの過酷な条件下で予想されるように、低レベルの断片化でほとんどインタクトなままであったことが示される。

アミノ酸側鎖の化学修飾は、通常、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用して全体規模で観察され得る。低ｐＨ及び高ｐＨに保持されたＦ３’－１６０２試料の修飾を評価するために、Ｆ３’－１６０２を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１５μＬの試料を、６０μＬのマスターミックス（水、メチルセルロース、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０、アルギニン、ｐＩマーカー４．０５及び９．９９）に加え、ボルテックスし、短時間遠心分離した。６０μＬの試料を、溶液の上部から吸引し、９６ウェルプレートに加え、遠心分離した後に試験した。実験中、その試料をモーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で１５００ボルトで１分間、続いて３０００ボルトで８分間分離した。

ｐＨ５．０で２週間保持した後のＦ３’－１６０２のｃＩＥＦプロファイルは、塩基性種の８．９から３９．１％への増大を示した（図８５及び表９２）。Ｆ３’－１６０２をｐＨ８．０に保持した後、ｃＩＥＦによって酸性種の同様の増大が検出された。主要ピーク強度の対応する減少（５１．４～２９．０％）も観察された（図８６及び表９２）。理論に縛られることを望まないが、Ｆ３’－１６０２配列全体の脱アミド化がこの酸性シフトにつながる可能性がある。

ｃＩＥＦによって観察されたｐＨストレス誘発性変化が、相補性決定領域（ＣＤＲ）の変更に起因するか否かを判断するために、同じｐＨ５及びｐＨ８のストレス試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマップによって分析した。簡単に説明すると、５０μｇのＦ３’－１６０２を、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中の６Ｍ塩酸グアニジンで希釈し、ジスルフィド結合を、２５ｍＭジチオスレイトールで４０℃、サーモミキサー中で３０分間還元した。次に、還元されたシステインを、暗所で室温で６０分間、５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。還元及びアルキル化されたタンパク質を、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液スイッチし、トリプシンを使用して３７℃で１時間消化した（１：２５の酵素：基質）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ＋質量分析計にカップリングされたＴｈｅｒｍｏＶａｎｑｕｉｓｈＵＨＰＬＣで実行した。簡単に説明すると、５μｇのタンパク質消化物を、０．３ｍＬ／分で２％～４０％のアセトニトリル勾配を使用して、ＷａｔｅｒｓＵＰＬＣＢＥＨペプチドＣ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍＭ）で１５０分かけて分離した。質量スペクトルは、フルＭＳスキャンの場合は３５，０００の解像度で、及びＴｏｐ１０のＭＳ／ＭＳスキャンの場合は１７，５００の解像度で、ポジティブモードで、２３０－２０００ｍ／ｚから取得した。ＢｙｏｓＰＴＭワークフロー（ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｒｉｃｓ）を使用してＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳファイルを分析した。ペプチドは、正確な質量、及びＭＳ／ＭＳ（Ｆ３’－１６０２配列を検索する）を用いて特定した。

ペプチドマップデータに基づくと、Ｆ３’－１６０２のＣＤＲの１つを除く全てが、低及び高ｐＨストレス中の修飾に耐性があった。ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖のＣＤＲＨ３のみが、ｐＨ５のストレス後に修飾（異性化）の証拠を示した（表９３）。この修飾は、加速（４０℃）安定性研究で特定されたものと同じである。

組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、実施例１４に記載されているようにＳＰＲによって測定した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で４０℃で２週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合が低下した（図８７及び表９４）。対照と低ｐＨ４０℃のストレス試料との間の会合及び解離速度定数の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であったが、ストレス試料の見かけの最大結合レスポンスは、ｐＨ５のストレス後の対照の約半分であった。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの条件下でＣＬＥＣ１２Ａに結合する能力が低下したことが示されている。２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で４０℃で２週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合は変化しなかった（図８８及び表９４）。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速されたｐＨストレス条件下でＣＬＥＣ１２Ａに対する親和性を保持したことが示されている。

組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、実施例１４に記載されているようにＳＰＲによって測定した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で４０℃で２週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＮＫＧ２Ｄへの結合は変化しなかった（図８９及び表９５）。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速されたｐＨストレス条件下でＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持したことが示されている。２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で４０℃で２週間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＮＫＧ２Ｄへの結合は変化しなかった（図９０及び表９５）。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速されたｐＨストレス条件下でＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持したことが示されている。

Ｆ３’－１６０２機能に対する低及び高ｐＨストレスの影響を、実施例１４に記載されているように、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａを発現するＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞を使用する細胞毒性アッセイで評価した。ｐＨ５．０及び８．０のストレス後、ＥＣ５０及び最大溶解によって反映されたＰＬ－２１ＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞に対するＦ３’－１６０２の効力は、ｐＨ５のストレス後、約２倍低下し（図９１及び表９６）、ｐＨ８のストレス後は変化しなかった（図９２及び表９６）。理論に拘束されることを望まないが、ｐＨ５のストレス後の効力の喪失は、最初の加速安定性研究で同定されたｓｃＦｖＣＤＲ－Ｈ３アスパラギン酸の同じ異性化に起因したものであった可能性がある。ｐＨ５とｐＨ８との結果の相違によって、Ｆ３’－１６０２が高いｐＨでより安定していたことがさらに示されている。

強制酸化
タンパク質の修飾を示す最も一般的な安定性の１つは、メチオニン残基の酸化である。酸化のホットスポットを特定するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、１．０ｍｇのＦ３’－１６０２を１ｍｇ／ｍＬに希釈した。３．３ μＬの３％過酸化水素を、Ｆ３’－１６０２の０．５ｍＬアリコート（０．０２％過酸化水素）に加えた。Ｆ３’－１６０２の酸化は、暗所で、室温で２４時間進行させた。２４時間後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ１０ＫＭＷＣＯデバイスを製造業者の指示に従って使用して、試料をＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液スイッチした。酸化されていない対照（０．５ｍＬ）は－８０℃で保存した。

強制酸化後、Ｆ３’－１６０２において、単量体％、ＨＭＷＳまたはＬＭＷＳに有意な差はなかった（表９７）。

強制酸化後、非還元ＳＤＳ－ＣＥによるＦ３’－１６０２の純度は１％未満まで低下した（表９８）。これは、Ｆ３’－１６０２が強制酸化の間の断片化に耐性があったことを示している。強制酸化後に新しいフラグメントは検出されなかった。酸化された試料のピーク形状は、酸化ストレス後に変化した。理論に拘束されることを望まないが、これは、もはや均一な集団が存在しないこと、及び高レベルの酸化が、Ｆ３’－１６０２の対照試料には存在しない高次構造変化をもたらしたことを示し得る。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

強制酸化後、還元ＳＤＳ－ＣＥによるＦ３’－１６０２の純度は変化しなかった（表９９）。これは、Ｆ３’－１６０２が強制酸化中の断片化に耐性があったことを示している。強制酸化後に新しいフラグメントは検出されなかった。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

ＳＥＣによる強制酸化の生物物理学的効果を決定することに加えて、どのアミノ酸が最も酸化を受けやすいかを理解することが重要である。Ｆ３’－１６０２ＣＤＲにはメチオニン残基はないが、フレームワーク及び定常ドメインにはいくつかのメチオニンが見られる。酸化レベルは、対照の全ての部位で低く、過酸化水素への曝露後に酸化の有意な増大を示したのは２つの部位のみであった（表１００）。他の治療用ｍＡｂでは低レベルの酸化が観察されている。

組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する強制酸化ストレスのＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、実施例１４に記載されているようにＳＰＲによって測定した。０．０２％過酸化水素の存在下で室温で２４時間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合の反応速度論及び親和性、ならびに見かけのＲ_ｍａｘは変化しなかった（図９３及び表１０１）。これによって、Ｆ３’－１６０２が強制酸化ならびに定常領域及びフレームワークでのメチオニンの修飾後にＣＬＥＣ１２Ａへの結合を保持したが、ｈＣＬＥＣ１２Ａに対するＦ３’－１６０２の親和性に影響を与えなかったことが示されている。

組換えヒトＮＫＧ２Ｄに対する強制酸化ストレスのＦ３’－１６０２試料の結合親和性を、実施例１４に記載されているようにＳＰＲによって測定した。０．０２％の過酸化水素の存在下で室温で２４時間インキュベートした後、Ｆ３’－１６０２のヒトＮＫＧ２Ｄへの結合の反応速度論及び親和性は変化しなかった（図９４及び表１０２）。これによって、Ｆ３’－１６０２が強制酸化ならびに定常領域及びフレームワークでのメチオニンの修飾後にＮＫＧ２Ｄへの結合を保持し、ｈＮＫＧ２Ｄに対するＦ３’－１６０２の親和性に影響を与えないことが示されている。

Ｆ３’－１６０２機能に対する強制酸化ストレスの影響を、実施例１４に記載されているように、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａを発現するＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞を使用する細胞毒性アッセイで評価した。図９５及び表１０３に示すように、酸化ストレス後、Ｆ３’－１６０２の効力（ＥＣ５０及び最大溶解）は変化しなかった。

低ｐＨ保持
低ｐＨ保持によるウイルスの不活化は、生物製剤製造における重要なステップである。低ｐＨ保持でのＦ３’－１６０２の安定性を評価するために、Ｆ３’－１６０２を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＰｒｏｔｅｉｎＡカラムでキャプチャーし、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。ピーク画分をプールし、プロテインＡ溶出液１２ｍＬを、追加の１００ｍＭグリシンｐＨ３．０緩衝液でｐＨを、ｐＨ３．３に調整した。ｐＨを調整した溶出液を、室温で保持した。１．５時間後、その溶出液を１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．３を使用して中性ｐＨにした。ｐＨ保持試料は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製された。最終生成物は、分析のためにＰＢＳｐＨ７．４に緩衝液交換した。

低ｐＨでのインキュベーション後、Ｆ３’－１６０２をＳＥＣで分析し、保持が凝集を引き起こしたか否かを判断した。低ｐＨ保持ステップに起因して、Ｆ３’－１６０２ではＨＭＷ及びＬＭＷ含有量の増大はなかった（表１０４）。

低ｐＨ保持後、非還元ＳＤＳ－ＣＥによるＦ３’－１６０２の純度は変化しなかった（表１０５）。これは、Ｆ３’－１６０２が低ｐＨ保持中の断片化に耐性であったことを示している。低ｐＨ保持後、新しいフラグメントは検出されなかった。オーバーレイの主要ピークの移動時間の相違は、このアッセイの実験的変動の範囲内であった。

低ｐＨ保持後、還元ＳＤＳ－ＣＥによるＦ３’－１６０２の純度は変化しなかった（表１０６）。これは、Ｆ３’－１６０２が低ｐＨ保持中の断片化に耐性であったことを示している。低ｐＨ保持後、新しいフラグメントは検出されなかった。

アミノ酸側鎖の化学修飾は、通常、ｃＩＥＦを使用して全体規模で観察され得る。Ｆ３’－１６０２対照と低ｐＨ保持ロットのｃＩＥＦプロファイルは、視覚的に非常に類似しており、酸性種、主要種、及び塩基性種の相対的な定量は全て互いの１％範囲内であり、これは、低ｐＨ保持が、Ｆ３’－１６０２の電荷プロファイルに測定可能な影響を与えなかったことを示している（表１０７）。

Ｆ３’－１６０２試料を、インタクトな質量で分析し、低ｐＨ保持の結果としての修飾及び断片化をモニターした。対照と低ｐＨ保持試料の両方で観察された質量は、互いに、及び理論上のＦ３’－１６０２質量（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ糖型：１２６，３６０．４Ｄａ）と一致した。低ｐＨ保持は、Ｆ３’－１６０２の質量に影響を与えず（表１０８）、断片化は観察されなかった。

低ｐＨ保持は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合するＦ３’－１６０２の反応速度論または親和性の変化を誘発しなかった（図９６及び表１０９）。会合及び解離速度定数の相違、ならびに対照試料と低ｐＨ保持試料との間の見かけの最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）は、アッセイの実験的変動性の範囲内であった。これは、Ｆ３’－１６０２が生物療法製造の低ｐＨ保持ステップ後にＣＬＥＣ１２Ａに対する親和性を保持したことを示している。

低ｐＨ保持後、ヒトＮＫＧ２Ｄ結合は変化しなかった（図９７及び表１１０）。対照と４０℃ストレス試料との間の定常状態親和性と見かけの最大結合レスポンス親和性の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これは、Ｆ３’－１６０２が低ｐＨ保持後もヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性を保持したことを示している。

低ｐＨ保持後、Ｆ３’－１６０２のヒトＣＤ１６ａＶ１５８への結合は変化しなかった（図９８及び表１１１）。対照試料と低ｐＨ保持試料との間の結合親和性及び最大結合応答の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これによって、Ｆ３’－１６０２がこれらの加速された貯蔵条件下でヒトＣＤ１６ａに対する親和性を保持したことが示されている。

生物物理学的安定性及び完全性を損なうことに加えて、低ｐＨはアミノ酸側鎖の化学的分解、特にアスパラギン酸の異性化を引き起こし得る。機能に重要な領域でのＦ３’－１６０２の化学的分解は、もしあれば、効力アッセイでの効力の低下として現れるはずである。したがって、ＣＬＥＣ１２Ａ^＋ＰＬ－２１がん細胞に対するＦ３’－１６０２の効力を、ＫＨＹＧ１－ＣＤ１６Ｖバイオアッセイで低ｐＨ保持後に試験した。Ｆ３’－１６０２の効力は、低ｐＨ保持によって変化しなかった（図９９及び表１１２）。

コロイド安定性
ＰＥＧ沈殿を使用して、Ｆ３’－１６０２のコロイド安定性を評価した。簡単に言えば、濃縮されたＦ３’－１６０２（約２０ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬのアリコート（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＰＥＧ６０００の最終濃度は０～３０％（ｗ／ｖ）の範囲であった。アリコートを完全に混合し、２～８℃で一晩置いた。翌日、チューブを遠心分離して沈殿物をペレット化し、Ｌｕｎａｔｉｃ（ＵｎｃｈａｉｎｅｄＬａｂｓ）でＡ２８０によって上清の濃度を測定した。

ＰＥＧ６０００の濃度を増大させた場合の酢酸緩衝液ｐＨ５．０中のＦ３’－１６０２の溶解度（０％～３０％）を、Ａ２８０によってモニターした。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０における中点遷移（Ｃｍ）は２４．５％であり、Ｆ３’－１６０２がこの緩衝液に高い溶解度を有することを示している（図１００）。コンパレーターとして、トラスツズマブ及びアダリムマブも１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０でのＰＥＧ沈殿アッセイで評価した。アッセイ対照として使用されたトラスツズマブ及びアダリムマブの中点遷移は、それぞれ３０％超及び１１．７％のＰＥＧ－６０００であった。

次に、Ｆ３’－１６０２を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３０ｋＤａの分子量カットオフデバイスを使用して濃縮した。濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ上のＡ２８０によって決定して、製品の品質はＳＥＣによってモニターした。試験物質を、１２６０ＱｕａｔＰｕｍｐ、１２６０Ｖｉａｌｓａｍｐｌｅｒ、１２６０ＶＷＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ高圧液体クロマトグラフィー機器に注入した。試料は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラムで分離した。ＳＥＣ泳動緩衝液は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、流速０．６０ｍＬ／分であった。吸光度は２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの両方でモニターして、ピーク面積は手作業で積分し、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ、及び単量体のパーセントを報告した。

Ｆ３’－１６０２は、約２５、５０、１００、及び１５０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４に濃縮し、回復は目視検査、濃度（Ａ２８０）、及びＳＥＣによってモニターした。Ｆ３’－１６０２は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、単量体パーセントの損失が最小限で、目に見える沈殿なしで１５０ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮可能であった（図１０１及び表１１３）。

実施例１６．Ｆ３’－１６０２及びＡＢ００１０の安定性及び製造可能性
Ｆ３’－１６０２及びＡＢ００１０は、それぞれＦ３’及びＦ３フォーマットのＴｒｉＮＫＥＴであり、同じヒト化抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体に由来するＣＬＥＣ１２Ａ結合部位を有する。実施例５または６に記載されているように、これら２つのＴｒｉＮＫＥＴはＣＬＥＣ１２Ａと同様の結合親和性を有する。この実施例は、Ｆ３’－１６０２及びＡＢ００１０の安定性及び製造可能性を比較するために設計された。

簡単に説明すると、Ｆ３’－１６０２及びＡＢ００１０は、実施例１４に記載されているように、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭＮａＣｌ、及び０．０１％ＰＳ－８０中でｐＨ７．８で製剤化した。製剤化しタンパク質は、４０℃で４週間熱ストレスに供して、それらの安定性は、実施例１４に記載されているように、非還元ＳＤＳ－ＣＥ、還元ＳＤＳ－ＣＥ、ＳＥＣ、及び細胞毒性アッセイによって評価された。

表１１４に示されているデータは、ストレスを受けたＡＢ００１０試料のＬＭＷ画分が、ストレスを受けたＦ３’－１６０２試料のＬＭＷ画分よりも有意に増大したことを示している。表１１５に示されているデータは、ストレスを受けたＡＢ００１０試料の純度が、ストレスを受けたＦ３’－１６０２試料の純度よりも有意に低下したことを示している。これらの結果は、ＡＢ００１０が熱ストレス条件下でＦ３’－１６０２よりも有意に劣化したことを示している。

表１１６に示すように、ストレスを受けたＡＢ００１０試料のＨＭＷＳの量は、ストレスを受けたＦ３’－１６０２試料の量よりも大幅に増大した。この結果は、ＡＢ００１０が熱ストレス条件下でＦ３’－１６０２よりも大幅に多く凝集したことを示唆している。

実施例１４に記載されているように、スクロースは、ＮａＣｌよりも凍結乾燥された提示とより適合性がある。したがって、Ｆ３’－１６０２及びＡＢ００１０をまた、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、及び０．０１％ポリソルベート８０中で、ｐＨ７．８でも製剤化した。次いで、各製剤中のＴｒｉＮＫＥＴタンパク質を、４０℃で４週間熱ストレスにさらし、ＮＫ細胞を介した細胞傷害を媒介する能力を、実施例１４に記載されている細胞毒性アッセイによって評価した。図１０２Ａ及び１０２Ｂならびに表１１７に示されるように、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａを発現するＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａ細胞によるＰＬ２１ＣＬＥＣ１２Ａ^＋がん細胞の殺滅を媒介するＦ３’－１６０２及びＡＢ００１０の能力は、熱ストレスによって有意に影響されなかった。

実施例１７．ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００８９の分子フォーマット、デザイン、構造、及び特徴
目的
本研究の目的は、ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００８９の分子フォーマット、設計、構造、及び特性を説明することである。ＡＢ００８９は、ＡＢ０２３７の改良版であり、ＣＬＥＣ１２Ａとの親和性及びＣＬＥＣ１２Ａ＋ＡＭＬ細胞の細胞毒性溶解の効力を維持しながら、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ＶＨの一次配列が異性化配列のライアビリティを取り除くように最適化されている。さらに、本発明者らは、分子のヒトらしさを高めたフレームワーク領域でのマウスの逆突然変異の数を減らすことを目指した。特に、この報告では、本発明者らは、ａ）ＡＢ００８９の分子フォーマット及び設計について説明する；ｂ）ＣＤＲＨ３の配列ライアビリティを取り除くためのタンパク質工学の取り組みを概説する；ｃ）マウスの逆突然変異の数を減らすためのタンパク質工学の取り組みについて説明する；ｄ）ＡＢ００８９の発現及び精製に関する情報を提供する；ｅ）分子の基本的な生化学的及び生物物理学的特性評価を説明する；ｆ）組換えヒト標的（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ）に対するＡＢ００８９の親和性を決定する；ｇ）ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現するＡＭＬがん細胞株へのＡＢ００８９の結合を示す；ｈ）ＡＢ００８９の選択性を実証する；ｉ）ＡＭＬがん細胞の殺滅におけるＡＢ００８９の効力を決定する；ｊ）結合エピトープを評価する；ｋ）ＦｃγＲ及びＦｃＲへの結合を評価し、ＩｇＧ１ｍＡｂ対照と比較する；ならびにｌ）加速安定性、強制分解、及び製造可能性などの開発可能性研究におけるＡＢ００８９の挙動を説明する。

試験デザイン
ＣＬＥＣ１２Ａ特異的ＡＢ０２３７ＴｒｉＮＫＥＴの開発可能性評価中に、ＣＤＲＨ３の異性化のライアビリティを特定し、ＣＬＥＣ１２Ａへの結合及び過酷なストレス下での効力の低下につながった。酵母ディスプレイを使用して、配列のライアビリティを取り除き、分子のＣＭＣ特性を最適化した。さらに、分子のフレームワークは、マウスの逆突然変異を除去し、それらを対応するヒト残基で置き換えるようにさらに最適化されたため、分子のヒトらしさが向上した。ＡＢ００８９の特性は、組換えｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子細胞及びがん細胞への結合、ならびにＣＬＥＣ１２Ａ＋ＡＭＬがん細胞に対する分子の効力によって評価した。熱安定性（ＤＳＣ）、疎水性（ＨＩＣ）、及びｐＩ（ｃＩＥＦ）を含むＡＢ００８９の生物物理学的及び生化学的特性を決定した。分子モデリングを使用して、ＡＢ００８９の表面の電荷及び疎水性パッチの分布を評価し、臨床段階のモノクローナル抗体でベンチマークを行った。結合の特異性は、ＰＳＲ、目的の標的を発現していない細胞への結合、及びＨｕＰｒｏｔ（商標）アレイによって評価した。ＡＢ００８９は、２つの異なる哺乳類細胞株（Ｅｘｐｉ２９３及びＥｘｐｉＣＨＯ）で発現され、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘ２ステッププラットフォーム精製法を使用して精製された。ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６ａ（Ｖ１５８及びＦ１５８）、Ｆｃγ受容体の拡張パネル（ＣＤ３２ａ（Ｈ１３１及びＲ１３１）、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ｂ、カニクイザルＣＤ１６、ヒト及びカニクイザルＣＤ６４）、及びＦｃＲｎ（ヒト及びカニクイザル）などのＡＢ００８９の結合特性は完全に特徴付けられた。最後に、ＡＢ００８９は、プラットフォーム製剤（２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ６．０）及び２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０緩衝液中での加速（４０℃）安定性、強制分解（長期ｐＨ５、ｐＨ８のストレス、強制酸化）、及び製造可能性（凍結／解凍，攪拌、低ｐＨ保持）を含む、アッセイの全開発可能性パネルで評価した。
材料及び方法
材料
試験物質

タンパク質試薬

方法
フローサイトメトリーによる細胞結合
同質遺伝子ＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞及びＰＬ－２１がん細胞へのＡＢ００８９の結合は、実施例１９に詳細に記載されているように実施した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（４パラメーターロジスティック非線形回帰曲線適合モデル）を使用して細胞結合曲線から導き出された。

酵母ライブラリーの構築及び評価
ウォーキング突然変異誘発戦略を採用して、合成ＣＤＲＨ３オリゴヌクレオチドプールを使用し、酵母ディスプレイアフィニティライブラリー（ライブラリー１７と呼ばれる）を構築して、ＡＢ０２３７ＣＤＲＨ３（ＹＤＹＤＤＳＬＤＹ、配列番号１３９）の各残基を、単一部位として、または対で、２０個のアミノ酸全ての無作為化で置換した（図１０３）。

最初に、合成ｓｃＦｖ二本鎖ＤＮＡは、ＣＤＲＨ３を固有のＢａｍＨ１制限部位に置き換えることによって設計した。次いで、ｓｃＦｖを、Ｈｉｆｉクローニング法により酵母ディスプレイプラスミド（ｐＹＥＳ－Ａｇａ２ベクター）にクローニングし、ｐＹＥＳ－Ａｇａ２－ｓｃＦｖ－ＢａｍＨ１プラスミドを得た。ベクターと相同な領域を有するＤＮＡオリゴは、元のＣＤＲＨ３（ＹＤＹＤＤＳＬＤＹ、配列番号１３９）に導入された以下の無作為化によってＸＤＹＤＤＳＬＤＹ（配列番号３０５）、ＹＸＹＤＤＳＬＤＹ（配列番号３０６）、ＹＤＸＤＤＳＬＤＹ（配列番号３０７）、ＹＤＹＸＤＳＬＤＹ（配列番号３０８）、ＹＤＹＤＸＳＬＤＹ（配列番号３０９）、ＹＤＹＤＤＸＬＤＹ（配列番号３１０）、ＹＤＹＤＤＳＸＤＹ（配列番号３１１）、ＹＤＹＤＤＳＬＸＹ（配列番号３１２）、ＹＤＹＤＤＳＬＤＸ（配列番号３１３）、ＸＸＹＤＤＳＬＤＹ（配列番号３１４）、ＸＤＸＤＤＳＬＤＹ（配列番号３１５）、ＸＤＹＸＤＳＬＤＹ（配列番号３１６）、ＸＤＹＤＸＳＬＤＹ（配列番号３１７）、ＸＤＹＤＤＸＬＤＹ（配列番号３１８）、ＸＤＹＤＤＳＸＤＹ（配列番号３１９）、ＸＤＹＤＤＳＬＸＹ（配列番号３２０）、ＸＤＹＤＤＳＬＤＸ（配列番号３２１）（ここでＸ＝任意のアミノ酸である）に設計され、一緒にプールされた。次に、ｐＹＥＳ－Ａｇａ２－ｓｃＦｖ－ＢａｍＨＩベクターをＢａｍＨＩで消化し、この消化されたプラスミドを、ＤＮＡオリゴプールでエレクトロポレーションして、完成した酵母ディスプレイライブラリー１７を得た。相同組換えのプロセスを通じて、酵母はライブラリーオリゴを、線形化されたプラスミドと内部でライゲーションし、結果として各酵母細胞は１つのＣＤＲＨ３変異オリゴを有する１つのプラスミドを含む。ライブラリー１７の出力の選択及び特性評価に続いて、単一の最適化されたＣＤＲＨ３のバックグラウンドでのウォーキング突然変異誘発のためにＣＤＲＨ２を標的とする同様の親和性成熟戦略を採用した。この第２ラウンドの親和性成熟のためのライブラリーは、本明細書ではライブラリー３０と呼ばれる。

ライブラリーは、Ｄ－ＵＴ培地で増殖させた後、ＦＡＣＳソーティングによって評価した。ソーティングの２４時間前に、酵母を最終濃度０．５Ｏ．Ｄ．／ｍｌ（可視光分光光度計で測定）に再播種し、スピンダウンし、ＧＲ－ＵＴ培地で２回洗浄した後、同じ培地で一晩インキュベートさせた。実験の日に、３Ｏ．Ｄ．の細胞を採取して試験し、９６ウェルＵ底プレートのウェルに配置した。これは、試験が望まれる抗原の数まで繰り返された。次に細胞を、ＰＢＳ－Ｆ（ＰＢＳ＋０．２５％のＢＳＡ）で２回洗浄し、次に様々な濃度のビオチン化ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを３０分間インキュベートした。次に、酵母細胞をＦＩＴＣ標識抗Ｆｌａｇ及びストレプトアビジンＰＥで染色し、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａを使用して最も親和性の高いバインダーを選別した。

最終的な酵母ライブラリーは、フローサイトメトリーによって分析された。酵母ライブラリーは、特性評価の２４時間前に最初にＤ－ＵＴ培地に播種した。フローサイトメトリーの２４時間前に、酵母を最終濃度０．５Ｏ．Ｄ．／ｍＬに再播種し、スピンダウンし、ＧＲ－ＵＴ培地で２回洗浄した後、同じ培地で一晩インキュベートした。実験の日に、試験する抗原１つあたり０．２Ｏ．Ｄ．の細胞をとって、９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに入れた。その細胞をＰＢＳ－Ｆ（ＰＢＳ＋０．２５％ＢＳＡ）で洗浄し、次にビオチン化ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを最終濃度１０ｎＭになるまで３０分間添加した。その細胞を再度洗浄し、ビオチン化されていないＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（最終濃度１μＭ）をさらに４０分間添加し、試料は２０分ごとに取り出した。抗Ｆｌａｇ－ＦＩＴＣ及びストレプトアビジンＰＥを添加し、暗所、氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、ＰＢＳ－Ｆに再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａを使用して分析した。

部位特異的変異誘発
ＣＬＥＣ１２Ａアームを標的とするＡＢ００８９ｓｃＦｖをコードするＤＳからＤＴへの変異を有するｇＢｌｏｃｋ（二本鎖ＤＮＡフラグメント）は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から注文された。以下に説明するプロトコルに従って、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングした。

コドン最適化
ＡＢ００８９のＳ鎖のｓｃＦｖ部分のＤＮＡコドン最適化は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）のＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＴｏｏｌを介して実行し、リンカー及びＦｃ部分は、ＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＴｏｏｌを使用して、コドン最適化された（ベクター骨格の一部として）。ＡＢ００８９のＨ鎖及びＬ鎖の発現のためのＤＮＡコドン最適化は、ＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のコドン最適化ツールを使用して実行された。目標は、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で高い発現レベルを達成することであった。

一過性発現のためのベクターへのクローニング
ＡＢ００８９Ｈ鎖及びＬ鎖は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成プラットフォームを使用して合成して、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングした。ＡＢ００８９鎖Ｓをクローニングするためのベクター骨格は、最初にｐｃＤＮＡ３．４ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用し、直線化のためにＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を作成すること、ならびにＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いてクローニングすることによって調製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用したクローニングの一般的なプロトコルに従った。簡単に説明すると、目的の遺伝子を発現するｇＢｌｏｃｋ（二本鎖ＤＮＡフラグメント）をベクター骨格にクローニングし、ＴＧ－１細菌細胞を使用して形質転換し、ＺｙｐｐｙＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを回収し、そのプラスミド配列は、サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ，ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって確認された。一旦、配列が確認されたら、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄＸｔｒａＭａｘｉＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ）を使用して、マキシ－プレップを実行してプラスミドＤＮＡを単離した。

発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞における一過性発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、ＰＥＩ試薬をトランスフェクションに使用したことを除いて、製造業者（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が提供する一般的なプロトコルに従って実行した。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、プラスミド比４：１：１を使用してＡＢ００８９：ｐＥＴｓｅｑ０８５４（鎖Ｈ）、ｐＥＴｓｅｑ０４２４（鎖Ｌ）及びｐＥＴｓｅｑ１７３９（鎖Ｓ）を構成する３つのポリペプチドの一過性発現のために作成された３つのＤＮＡ鎖でトランスフェクトして、高い割合のヘテロ二量体を達成した。簡単に説明すると、ＤＮＡとＰＥＩｐｒｏ試薬（ＰｏｌｙｐｌｕｓＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ；Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を最初にＯｐｔｉＭＥＭメディア（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で別々に混合し、続いて混合してＥｘｐｉ２９３細胞に添加することにより、ＤＮＡ－ＰＥＩ複合体を作成した（＞９５％実行可能性；２．５×１０^６／ｍＬのＶＣＤ）。トランスフェクション後、細胞を加湿シェーカーインキュベーター内で３７℃及び８％ＣＯ_２で培養した。５日後に細胞上清を回収した。

ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションは、製造業者（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が概説した一般的なプロトコルに従って実施した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、プラスミド比４：１：１を使用してＡＢ００８９：ｐＥＴｓｅｑ０８５４（鎖Ｈ）、ｐＥＴｓｅｑ０４２４（鎖Ｌ）及びｐＥＴｓｅｑ１７３９（鎖Ｓ）を構成する３つのポリペプチドの発現のために作成された３つのＤＮＡ鎖でトランスフェクトして、高い割合のヘテロ二量体を達成する。簡単に説明すると、ＤＮＡ－Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体は、最初にＯｐｔｉＰｒｏ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＤＮＡ及びＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を別々に混合し、次に混合してＥｘｐｉＣＨＯ細胞に添加することによって作成した。（９５％超の生存度；６ｘ１０６／ｍＬのＶＣＤ）。トランスフェクション後、細胞を加湿シェーカーインキュベーター内で３７℃及び８％ＣＯ_２で培養した。プロトコルに従って、タンパク質発現をブーストするために、ＥｘｐｉＣＨＯフィード及びエンハンサーを１８～２０時間後に追加した。細胞の生存率に応じて、９～１１日後に細胞上清を回収した（＞７０％）。

採取
ＡＢ００８９を回収するために、細胞培養上清を５００ｍＬまたは１Ｌのポリカーボネート遠心分離ボトルに移し、７５００ｒｐｍで３５分間、４℃で回転させた後、０．２ミクロンの濾過ボトルを使用して濾過した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●Ｖｉ－ＣＥＬＬＸＲセルカウンター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）
●Ｖｉ－ＣＥＬＬ４ｍＬ試料カップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ；０８２２９ＮＴ２）
●Ｖｉ－Ｃｅｌｌ試薬パック（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ；Ｂ９４９８７）
●１Ｌポリカーボネート遠心分離ボトル（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ；３６６７５１）
●５００ｍＬポリカーボネート遠心分離ボトル（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ；３５５６４９）
●Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ（商標）フィルターユニット及びボトルトップフィルター、ＰＥＳメンブレン、滅菌、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１Ｌ（ＶＷＲ；７３５２０－９８６）
●Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ（商標）フィルターユニット及びボトルトップフィルター、ＰＥＳメンブレン、滅菌、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５００ｍＬ（ＶＷＲ；７３５２０－９８４）

精製
プロテインＡキャプチャークロマトグラフィー
直径５．０ｃｍのＳＮＡＰカラムを、プロテインＡＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅゲルを使用してベッドの高さ５．６ｃｍに充填し、カラム容量を約１１０ｍｌにした。プロテインＡメソッドのステップ及び緩衝液を表１２１に示す。溶出画分は、１．０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（溶出量の５～１０％）を使用して約ｐＨ７．０に中和した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●ＳＮＡＰコラム（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＬｉｆｅＳｏｌｕｔｉｏｎｓ；Ｓ－５０／１２５－ＰＡＳＳ－ＯＥ－ＦＰ１０）
●ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＰｒｏｔｅｉｎＡＧｅｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７５－４３－８０２）
●５ｘプロテインＡ結合緩衝液（５００ｍＭリン酸ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．２）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃ－６３３２）
●１ｘプロテインＡ結合緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）（５ｘストック希釈）
●１００ｍＭグリシンｐＨ３．０（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＢＢ－９５－１００ｍＭ）
●１．０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＬＴ－７８３）
●１０．０Ｎ水酸化ナトリウム（ＶＷＲ；ＢＤＨ７２４７－４）
●０．１Ｎ水酸化ナトリウム（１０．０Ｎ希釈ストック）

陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）は、ＸＫ－２６カラム本体にベッドの高さ約２４．５ｃｍに充填されたＰｏｒｏｓＸＳ樹脂を使用して、最終カラム容量１３０ｍｌで実施した。平衡化及び洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）は、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０であった。溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）は、１．０Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０であった。

プロテインＡカラムからの溶出液は、緩衝液Ａで少なくとも５倍に希釈することにより、ｐＨ及び導電率を調整した。ロードしたカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を上げるステップでタンパク質を溶出した。ＩＥＸクロマトグラフィー法のステップを表１２２に示す。

Ｇ２５クロマトグラフィー及び透析濾過による緩衝液交換
ＩＥＸ生成物を、ベッドの高さ３０ｃｍ（カラム容量１６０ｍｌ）までＸＫ－２６カラムに詰めたＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ２５Ｆｉｎｅ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐ／Ｎ１７－００３２－０１）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって、ＰＢＳｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ／Ｎ１００１００２３）に緩衝液交換した。あるいは、生成物を緩衝液交換し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐ／Ｎ：ＵＦＣ９０３０２４）を用いる不連続ダイアフィルトレーションによって濃縮した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルは、ＭＥＳ泳動緩衝液で泳動した。非還元調製物と還元調製物の両方について、ウェルに２～３μｇの試料をロードした。還元された試料は、２０ｍＭＤＴＴで処理して、７０℃で１０分間加熱した。ゲル電源の設定は、５０分間２００Ｖで一定であった。タンパク質バンドは、製造業者の指示に従ってＮｏｖｅｘＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＳａｆｅＳｔａｉｎで染色することにより視覚化した。ゲルは、ＡｚｕｒｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣ６００イメージャでスキャンした。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●ＸＣｅｌｌＳｕｒｅＬｏｃｋＭｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＥＩ０００１）
●ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）３００Ｗ電源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＰＳ０３０１）
●ＩｓｏｔｅｍｐＤｉｇｉｔａｌＨｅａｔＢｌｏｃｋ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；８８－８６０－０２２）
●ＮｕＰＡＧＥＭＥＳＳＤＳ泳動緩衝液（２０Ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＮＰ０００２）
●ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＳａｆｅＳｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＬＣ６０６５）
●ＮｕＰＡＧＥＬＤＳ試料緩衝液（４Ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＮＰ０００７）
●ＮｏｖｅｘＳｈａｒｐＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＬＣ５８００）
●２－メルカプトエタノール（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ；１９４７０５）
●Ａｚｕｒｅｃ６００イメージャ（ＡｚｕｒｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）

分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）
分析サイズ排除クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラムを使用して実施した。移動相はＰＢＳｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ／Ｎ１００１００２３）であった。流速は、０．５ｍｌ／分で、実行時間は４５分であった。吸光度は２１４ｎｍと２８０ｎｍで測定した。ピークは、ＧＣ／ＬＣ面積パーセント法を使用して、ＯｐｅｎＬａｂＣＤＳデータ分析ソフトウェアバージョン２．３によって積分した。検出の閾値を下回るピークは、ベースラインを手作業で定義することによって積分した。

インタクトな質量
１０μｇのＡＢ００８９を、０．１％ギ酸を用いて０．２５μｇ／μＬに希釈し、１μｇを、ＭａｂＰａｃ２．１ｘ１００ｍＭカラムに注入し、Ｂｉｏｐｈａｒｍａオプションを備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅ＋質量分析計にカップリングされたＴｈｅｒｍｏＶａｎｑｕｉｓｈＵＨＰＬＣを使用して分析した。スペクトルは、１７，５００の分解能で高質量範囲モードで取得した。データは、ＢｉｏＰｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒデータ分析ソフトウェアパッケージのＳｌｉｄｉｎｇＷｉｎｄｏｗＲｅＳｐｅｃｔアルゴリズムを使用して分析された。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：水中の０．１％ギ酸（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；ＬＣ４５２－２．５）及びＭＡｂＰａｃＲＰ２．１ｘ１００ｍＭ、４μｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；０８８６４７）。

エンドトキシン（内毒素）
エンドトキシンの読み取りは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ｎｅｘｇｅｎＭＣＳカートリッジリーダー（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びカートリッジ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＰ／ＮＰＴＳ２００１Ｆ）で実行した。試料は、エンドトキシンフリーの水または滅菌ＰＢＳｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ／Ｎ１００１００２３）のいずれかに希釈することによってアッセイ用に調製した。全てのアッセイ性能パラメーター及び対照が明細書の範囲内である場合、アッセイは有効であると見なされた。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＡＢ００８９（５μｇ）の注射液は、高塩緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）対試料が５：４の比率で調製した。試料は、２５℃に保持されたＳｅｐａｘＰｒｏｔｅｏｍｉｘＨＩＣブチル－ＮＰ５５ｕＭカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩＨＰＬＣを使用して分析した。この勾配は、０％の低塩緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）から１００％の低塩緩衝液まで流速１．０ＭＬ／分で６．５分かけて泳動した。クロマトグラムは、２８０ｎｍでモニターした。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＨＩＣブチル－ＮＰ５５ｕＭカラム、４．６ｘ３５ｍＭ（Ｓｅｐａｘ；４３１ＮＰ５－４６０３）
●リン酸二水素ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；ＲＥＳ２０９０６－Ａ７０２Ｘ）
●リン酸水素二ナトリウム（ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ；ＢＢ３３２－５００）
●硫酸アンモニウム、＞９９．０％（Ｓｉｇｍａ；Ａ４４１８－５００Ｇ）
●水酸化ナトリウム、１０．０Ｎ（ＡｖａｎｔｏｒＭａｔｅｒｉａｌｓ；５０００－０３）
●塩酸、１０．０Ｎ（ＲｉｃｃａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ；３７７０－３２）

非還元ＣＥ－ＳＤＳ
ＡＢ００８９は、１Ｘ試料緩衝液を使用して０．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、５０μＬの最終試料量を達成した。内部標準及びヨードアセトアミドを試料に添加し、これをヒートブロック内で７０℃で１０分間インキュベートした後、氷浴で５分間インキュベートした。試料を９６ウェルプレートに移し、遠心分離し、機器にロードした。個々の試料をキャピラリーに４６００ボルトで４０秒間ロードし、モーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で５７５０ボルトで３５分間分離した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●２５ｘ内部標準（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０１６）
●ＣＥ－ＳＤＳＰｌｕｓカートリッジ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０９０－１５７）
●ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；１６１２５－５Ｇ）
●ＭａｕｒｉｃｅＣＥ－ＳＤＳＰＬＵＳＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＲｅａｇｅｎｔｓ（ＢｏｔｔｏｍＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭａｔｒｉｘ，ＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ，ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ１＆２，１ＸＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－５７１）
●トップ泳動緩衝液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－３８４）

還元されたＣＥ－ＳＤＳ
ＡＢ００８９を、１Ｘ試料緩衝液を使用して、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、５０μＬの最終試料量を達成した。内部標準及びベータメルカプトエタノール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１－０７１０）を試料に加え、ヒートブロック内で７０℃で１０分間インキュベートした後、氷浴で５分間インキュベートした。試料を９６ウェルプレートに移し、遠心分離し、機器にロードした。個々の試料をキャピラリーに４６００ボルトで４０秒間ロードし、モーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で５７５０ボルトで３１．２分間分離した。

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
ＡＢ００８９を、ＭｉｌｌｉＱ水を使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１５μＬの試料を、６０μＬのマスターミックス（水、メチルセルロース、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０、アルギニン、ｐＩマーカー４．０５及び９．９９）に加え、ボルテックスし、短時間遠心分離した。６０μＬの試料を、溶液の上部から吸引し、９６ウェルプレートに加え、遠心分離した後に試験した。その試料をモーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で１５００ボルトで１分間、続いて３０００ボルトで８分間分離した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●０．５％メチルセルロース（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；１０２７３０）
●１％メチルセルロース（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；１０１８７６）
●５００ｍＭアルギニン（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４２－６９１）
●陽極液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；１０２７２７）
●陰極液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；１０２７２８）
●ｃＩＥＦカートリッジ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０９０－１０１）
●蛍光キャリブレーション標準（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０２５）
●ファルマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）３－１０（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１５２２－２５ＭＬ）
●ｐＩマーカー４．０５（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０２９）
●ｐＩマーカー９．９９（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０３４）
●システム適合性ミックス（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０２７）
●システム適合性ペプチドパネル（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ；０４６－０２６）

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＡＢ００８９は、１ＸＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１００１０－０３１）または代替製剤中で０．５ｍｇ／ｍＬで調製した。３２５μＬを、適合する緩衝液ブランクとともに９６ウェルディープウェルプレートに添加した。サーモグラムは、ＭｉｃｒｏＣａｌＰＥＡＱＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を使用して生成した。温度は、６０℃／時間で、２０～１００℃に上昇した。生のサーモグラムを、バックグラウンドで差し引き、ベースラインモデルをスプライン処理し、非二状態（ｎｏｎ－ｔｗｏｓｔａｔｅ）モデルを使用してデータを適合した。

ＳＰＲ装置及び試薬
Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＩＤ：２２２２２５１、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、反応速度論測定を実行し、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅを使用して実験データを分析した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ１００３５１）
●１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ；ＢＢ－２４１３Ｄ）
●１０ｘＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ１００６－６９）
●１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋１０ｘストック溶液から社内で調製
●１ｘＭＢＳ－ＥＰ＋，ｐＨ６．０（自社製）
●ＢＳＡ画分Ｖ（７．５％）（Ｇｉｂｃｏ；１５２６０－０３７）
●ＮａＣｌ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓ２７１－１）
●ＮａＯＨ（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ１００３５８）
●アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ－１０００－５０）
●マウス抗体キャプチャーキット（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ１００８３８）
●ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ；２９－１４９６－０３）
●シリーズＳセンサーチップＳＡ（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ－１００５－３１）
●ＳＡチップ（Ｃｙｔｉｖａ；ＢＲ１００５３１）
●ビオチンキャプチャーキット（Ｃｙｔｉｖａ；２８－９２０２－３４）
●ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ交差吸収二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；３１１２５）
●ＭｉｃｒｏＢｉｏ－Ｓｐｉｎ３０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；７３２－６２２３）
●ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ遠心分離フィルター１０，０００ＮＭＷＬ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；ＵＦＣ５０１０９６）

ＳＰＲによるＣＬＥＣ１２Ａ親和性
組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａ（ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘ）へのＡＢ００８９の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用したＳＰＲによって測定した。簡単に説明すると、ヒトＦｃ特異的抗体を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に、約８０００～１００００レゾナンスユニット（ＲＵ）の密度で共有結合的に固定して、抗ｈＦｃＩｇＧチップを作成した。ＡＢ００８９試料を、１．５μｇ／ｍＬの濃度で１０μＬ／分の流速で６０秒間、抗ｈＦｃＩｇＧチップにキャプチャーして、約１５０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを、３倍希釈ＳＰＲ泳動緩衝液で段階希釈（１００ｎＭ～０．１４ｎＭ）し、このキャプチャーされた試験物質上に３０μｌ／分の流速で注入した。会合は３００秒間モニターして、解離は６００秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．７の３つのパルスを１００μｌ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生された。０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）を、実験全体を通して泳動緩衝液として使用した。実験は３７℃の生理学的温度で実施された。運動速度定数及び全体的な結合親和性を取得するために、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、二重参照データを、２状態反応速度論モデルに適合させた。二状態モデルを使用するための正当化を下に示す。近似曲線と実験データとの間の適合の良好性を、カイ^２として評価ソフトウェアにより表現した。

ＳＰＲによるＮＫＧ２Ｄ親和性
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ（ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘ）に対するＡＢ００８９の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用したＳＰＲによって測定した。簡単に説明すると、ｍＦｃ特異的抗体を、アミンカップリング化学を介して、ＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチルデキストランマトリックス上に約８０００～１００００ＲＵの密度で共有結合で固定化し、抗ｍＦｃＩｇＧチップを作成した。ｍＦｃタグ付きヒトＮＫＧ２Ｄを、０．２μｇ／ｍＬの濃度で、６０秒間、１０μＬ／分の流速で抗ｍＦｃＩｇＧチップにキャプチャーして、約３０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ＡＢ００８９を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）緩衝液に緩衝液交換し、ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いた２倍希釈で段階希釈（５０００ｎＭ～９．７７ｎＭ）した。分析対象物（ＡＢ００８９）は、３０μｌ／分の流量で，キャプチャーされた試験物質の上に注入した。会合は６０秒間モニターして、解離は６０秒間モニターした。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．７の３つのパルスを１００μＬ／分で２０秒間注入して、サイクル間で再生された。ＨＢＳ－ＥＰ＋（１Ｘ）を、実験全体を通して泳動緩衝液として使用した。実験は３７℃の生理学的温度で実施した。二重参照データは、Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した１：１の反応速度論的及び定常状態の相互作用モデルと、１：１の反応速度論的適合モデルでの全体的適合分析によって適合された。この試料は各実験の前に泳動緩衝液に緩衝液交換されていたため、定常状態適合のオフセットは一定（０）に設定された。フィット感の良さはＲ_ｍａｘ値の文脈で検討されたカイ^２として評価ソフトウェアで表現された。

ＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄの同時結合の相乗効果
相乗的なＮＫＧ２ＤとＣＤ１６ａとの結合はＳＰＲによって評価された。ｈＮＫＧ２Ｄのみ（１２．３μｇ／ｍＬ）、ＣＤ１６ａＦ１５８対立遺伝子のみ（９μｇ／ｍＬ）、及び同じ濃度のｈＮＫＧ２ＤとＣＤ１６ａＦ１５８との混合物を、それぞれＣＭ５シリーズＳＢｉａｃｏｒｅチップの表面に１分間アミンカップリング合させた。１．８μＭのＡＢ００８９またはトラスツズマブは、１０μＬ／分で１５０秒間注入した。解離段階は、再生が不要な場合は１８０秒間、同じ流量のサイクル間で表面の自然再生（分析対象物のほぼ完全な解離）が必要な場合は１８００秒間観察された。１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を泳動及び試料希釈緩衝液として使用した。

共係合（ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄ）
ＡＢ００８９は、０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で希釈し、ＣＭ５チップの抗ヒトＦｃ表面に流速５μＬ／分で６０秒間キャプチャーして、１５０～２５０ＲＵのキャプチャーレベルを達成した。ベースラインシグナルと、キャプチャーされたＡＢ００８９の量を表すＡＢ００８９注入の完了後のシグナルとの間の正味の差を記録した。ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（２００ｎＭ）またはｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（７ μＭ）を、キャプチャーしたＡＢ００８９に２０μｌ／分で飽和状態に達するまで９０秒間、注入した。この注入の直後に、ｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（２００ｎＭ）とｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ（７μＭ）のプレインキュベートした混合物を２０μＬ／分の流速で９０秒間注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ制御ソフトウェアのＡ－Ｂ－Ａインジェクションコマンドを使用した（最初の標的の全ての結合部位が確実に占有されるように、第２の標的を第１の標的と事前に混合した）。チップは、１００μＬ／分で１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）の２つの２０秒パルスによって再生された。この実験は３７℃で実施し、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を泳動緩衝液として使用した。ＲＵで表される各抗原の結合は、個々の抗原の注入前後のベースラインシグナル間の正味の差として記録した。別の標的（最初に注入された）で占有されていないＡＢ００８９に結合された各標的の平均相対結合率には、１．０の値が割り当てられた。他の標的ですでに飽和している（２番目に注入された）キャプチャーされたＡＢ００８９に結合した各標的の平均相対結合化学量論は、占有されていないＡＢ００８９に結合する全能力の割合として表された。

エピトープビニング
抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体またはＴｒｉＮＫＥＴは、３７０－１０７０ＲＵの最終密度について３μｇ／ｍＬの濃度でアミノカップリングを介してシリーズＳＣＭ５センサーチップのアクティブフローセルに直接固定した。エピトープビニングには、２５℃で実行される古典的なサンドイッチアッセイを使用した。最初の注入は、２００ｎＭのＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓの１２０秒の会合であり、その後に２００ｎＭのサンドイッチ抗体／ＴｒｉＮＫＥＴが直接続いた。サンドイッチ抗体／ＴｒｉＮＫＥＴには、１２０秒の会合時間及び１２０秒の解離時間があった。分析対象物とサンドイッチ分子の両方の注入は、３０μＬ／分で行った。１００μＬ／分で注入された１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の２０秒パルスを使用して、解離後のチップ表面の再生に使用した。最初のサイクルには、分析対象物とサンドイッチ分子の両方に対する緩衝液注入が含まれていた。第２のサイクルには、２００ｎＭｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ分析対象物と、それに続くサンドイッチ分子のための緩衝液注入が含まれていた。その後のサイクルには、２００ｎＭのｈＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ分析対象物の注入とそれに続く２００ｎＭのサンドイッチ分子が含まれていた。実験全体を通して、１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液を使用した。センサーグラムは、ＢｉａｃｏｒｅＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して視覚化された。

ＦｃγＲ結合
ヒト及びカニクイザルＣＤ６４、ＣＤ１６ａの高親和性対立遺伝子及び低親和性対立遺伝子（それぞれＶ１５８及びＦ１５８）、ＣＤ３２ａの２つの対立遺伝子（Ｈ１３１及びＲ１３１）、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ｂ及びカニクイザルＣＤ１６は、プライミングされた（製造業者の指示によって）Ｂｉａｃｏｒｅチップ上でビオチンを介してキャプチャーされた。表１２３は、使用されているＢｉａｃｏｒｅチップのそれぞれのキャプチャーレベルと種類をまとめたものである。ストレプトアビジンとビオチンの相互作用は不可逆的であるので、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）を除く全ての受容体のキャプチャーステップは、結合実験の開始前に１回だけ行った。ＣＡＰチップ表面でのｈＣＤ６４及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ６４のキャプチャーは、ＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅキットの製造業者の指示に従って、各サイクル中に実行した。

高い開始濃度、ＡＢ００８９及びトラスツズマブを必要とするＦｃγＲ結合実験の前に、試料を、０．５ｍＬ濃縮ユニットを使用した３回の連続希釈／濃縮サイクルによって１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋ＳＰＲ泳動緩衝液に緩衝液交換して、高濃度のタンパク質を維持しながら、元の緩衝液成分を３００倍を超えて希釈した。タンパク質濃度は、試料の適切な理論モル吸光係数（ＡＢ００８９の場合は１９６７９０Ｍ^－１ｃｍ^－１、及びトラスツズマブの場合は標準ＩｇＧ設定）を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置でＡ２８０で測定した。

各ＦＣγＲ結合実験は、２倍段階希釈したＡＢ００８９またはトラスツズマブを利用する複数のサイクルからなった。各濃度シリーズの開始時に配置された０ｎＭのブランクサイクル及び受容体のないチップ表面を参照に使用した。各実験サイクルには、会合、解離、及び再生のステップが含まれていた。分析対象物（ＡＢ００８９またはトラスツズマブ）濃度、会合及び解離時間、及び再生パラメーターは、ＦｃγＲ特異的（表１２３）であった。全てのステップは３０μＬ／分の流速及び２５℃で実行した。

チップ表面を安定させるために、試料分析の前に、分析対象物の代わりに実験に適した泳動緩衝液を使用した一連の２～５回のブランク実験サイクルを実行した。生データは、ＢｉａｃｏｒｅＩｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用した１：１の反応速度論モデルまたは定常状態親和性モデルのいずれかに適合した。どちらかの計算Ｒ_Ｍａｘまたは見かけ最大結合応答に関連するカイ^２（ソフトウェアによって計算）のを使用して、適合度を評価した。報告された値は全て、計算後に小数点以下第１位に四捨五入した。

ＦｃＲｎ結合
組換えヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎは、０．２５μｇ／ｍＬの濃度で１分間ＳＡシリーズＳチップの表面にキャプチャーされた。ＡＢ００８９及び市販のトラスツズマブ（ＩｇＧ１アッセイ対照）を、ＳＰＲ結合実験前に、ＭＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ６．０に緩衝液交換した。各ＦｃＲｎ結合実験は、さまざまな濃度の分析対象物を利用する複数のサイクルで構成されていた。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの２倍希釈系列（１２μＭ－０．０２３μＭ）を使用した。各濃度シリーズの開始時に配置された０ｎＭのブランクサイクル、及びＦｃＲｎを欠く修飾されたチップ表面をカップリングするブランクアミンを参照に使用した。各実験サイクルには、会合、解離、及び再生のステップが含まれていた。この会合ステップは、６０秒の分析対象物の注入で構成され、その後に６０秒の解離ステップが続いた。表面再生（ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液、ｐＨ７．４の６０秒注入）は、各反応速度論サイクルを完了した。全てのステップは、３０μＬ／分の流速及び２５℃で実行された。ＭＢＳ－ＥＰ＋緩衝液、ｐＨ６．０を、泳動緩衝液として使用した。このデータは、ＢｉａｃｏｒｅＩｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用して定常状態のアフィニティモデルに適合させた。算出したＲ_ｍａｘに関連するカイ^２（ソフトウェアによって計算）を使用して、適合度を評価した。報告された値は全て小数点第１位を四捨五入している。
ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶを介した細胞毒性アッセイ

ＡＢ００８９の効力は、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞で試験された。ＥＣ５０値と最大溶解値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（４つのパラメーターのロジスティック非線形回帰曲線適合モデル）を使用して細胞溶解曲線から導き出された。

初代ＮＫ細胞を介した細胞毒性アッセイ
ＡＢ００８９の効力は初代ＮＫ細胞で試験された。ＥＣ５０値及び最大溶解値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（４つのパラメーターのロジスティック非線形回帰曲線適合モデル）を使用して細胞溶解曲線から導き出された。
多重特異性試薬（ＰＳＲ）への非特異的結合

ＰＢＳＦ中の５０μＬの１００ｎＭＴｒｉＮＫＥＴまたは対照ｍＡｂを、事前に洗浄した５μＬのプロテインＡダイナビーズスラリーとともに室温で３０分間インキュベートした。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂに結合した磁気ビーズを磁気ラック上に６０秒間放置し、上清を廃棄した。結合したビーズを１００μＬＰＢＳＦで洗浄した。ビーズは、ストックから２５倍に希釈された５０μＬのビオチン化ＰＳＲ試薬とともに氷上で２０分間インキュベートした（Ｘｕｅｔ．ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２６，６６３－６７０）。試料を磁気ラックに置き、上清を廃棄し、１００μＬのＰＢＳＦで洗浄した。ＴｒｉＮＫＥＴまたは対照ｍＡｂへのビオチン化ＰＳＲ試薬の結合を検出するための二次ＦＡＣＳ試薬は、次のように作成された：１：２５０μＬのストレプトアビジン－ＰＥ及び１：１００のロバの抗ヒトＦｃを、ＰＢＳＦ中で組み合わせた。各試料に１００μＬの二次試薬を加え、氷上で２０分間インキュベートさせた。ビーズを１００μＬＰＢＳＦで２回洗浄した。試料はＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで分析した。２つのＰＳＲ対照、リツキシマブ（ＰＳＲ陽性）及びトラスツズマブ（ＰＳＲ陰性）をアッセイに使用した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：ＰＢＳＦ（１ＸＰＢＳｐＨ７．４＋０．２５％ＢＳＡ）（ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘ）、Ｄｙｎａビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０００１Ｄ）、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；４０５２０４）、及びロバ抗ヒトＦｃＡｂ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；７０９－０９６－１４９）。
ＨｕＰｒｏｔ商標アレイを用いたＨｉｇｈ－Ｓｐｅｃ（登録商標）交差反応性アッセイ

ＡＢ００８９の特異性は、マイクロスライドに固定化されたネイティブＨｕＰｒｏｔヒトプロテオームアレイに対して０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度で試験した。アッセイは、ＣＤＩ研究所（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で実施された。

免疫原性評価
Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，１２，２７４８－５９に記載されているように、ＥｐｉＶａｘのＥｐｉＭａｔｒｉｘプログラムを全ての計算に使用した。

分子モデリング
分子モデリングは、ＳＡｂＰｒｅｄＷｅｂサイトを使用して実行された（ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｎｅｗｓａｂｄａｂ／ｓａｂｐｒｅｄ／）．ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄ結合アームは、ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｆｉｌｅｒ（ＴＡＰ）を使用して、３７７のフェーズＩ後の生物療法分子と比較した。ＴＡＰは、ＡＢｏｄｙＢｕｉｌｄｅｒを使用して、ＰＥＡＲＳによる側鎖を有するＡＢ００８９のモデルを生成した。このループは全てのＣＤＲの中で最も多様であるので、ＣＤＲＨ３はＭＯＤＥＬＬＥＲによって構築した。

５つの異なるパラメーターを評価した：
１．ＣＤＲの全長
２．ＣＤＲ付近の表面疎水性（ＰＳＨ）のパッチ
３．ＣＤＲ付近の正電荷（ＰＰＣ）のパッチ
４．ＣＤＲ付近の負電荷（ＰＮＣ）のパッチ
５．ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ及びＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂの構造Ｆｖ電荷対称パラメーター（ｓＦｖＣＳＰ）

開発可能性
ＨＳＴ、ｐＨ６．０での加速（４０℃）安定性
ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２を濃縮し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５３０Ｋデバイスを使用して、２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ６．０（ＨＳＴ、ｐＨ６．０）に透析濾過した。回収された試料の濃度は、Ａ２８０によって決定され、試料はＨＳＴ緩衝液を用いて２０ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．２ｍｌのアリコートを対照として－８０℃ですぐに凍結し、２つの０．１５ｍｌのアリコートを４０℃で暗所に保管した。２週間後と４週間後にアリコートを取り出し、分析まで－８０℃で直ちに凍結した。下の材料／試薬を使用した：
●ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５遠心分離フィルター（３０ＫＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＵＦＣ９０３０２４）
●塩酸、１０Ｎ（ＲＩＣＣＡ；３７７０－３２）
●Ｌ－ヒスチジン（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；１０１９５４）
●水酸化ナトリウム、１０Ｎ（ＪＴＢａｋｅｒ；５０００－０３）
●スクロース（ＶＷＲ；Ｍ１１７－５００Ｇ）
●Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０（ＶＷＲ；０４４２－１Ｌ）

ＣＳＴ、ｐＨ７．０での加速（４０℃）安定性
ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２を濃縮し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５３０Ｋデバイスを使用して、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０に透析濾過した。回収された試料の濃度は、Ａ２８０によって決定され、その試料はＣＳＴ緩衝液を用いて２０ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．４ｍｌのアリコートを、対照として－８０℃で直ちに凍結し、４つの０．１５ｍｌのアリコートを４０℃で暗所に保管した。アリコートを毎週取り出し、直ちに－８０℃で分析まで凍結した。下の材料／試薬を使用した：
●ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５遠心分離フィルター（３０ＫＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＵＦＣ９０３０２４）
●塩酸、１０Ｎ（ＲＩＣＣＡ；３７７０－３２）
●クエン酸ナトリウム二水和物（ＦｉｓｈｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ；Ｓ４６６）
●水酸化ナトリウム、１０Ｎ（ＪＴＢａｋｅｒ；５０００－０３）
●スクロース（ＶＷＲ；Ｍ１１７－５００Ｇ）
●Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０溶液（１０％）（Ｓｉｇｍａ：ＰＢ１９２－１０ＭＬ）

強制酸化
ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈した。６．７μＬの３％過酸化水素を、ＡＢ００８９の１．０ｍｌアリコートに添加して、０．０２％過酸化水素という最終濃度を得た。ＡＢ００８９の酸化は、暗所で、室温で２４時間進行させた。２４時間後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ１０ＫＭＷＣＯデバイスを製造業者の指示に従って使用して、試料をＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液スイッチした。酸化されていない対照（０．５ｍＬ）は－８０℃で保存した。下の材料／試薬を使用した：３０％過酸化水素（ＶＷＲ；ＢＤＨ７６９０－１）、ＧｉｂｃｏＰＢＳｐＨ７．４（１ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１００１０－０３１）、及びＺｅｂａ脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｃ；８９８９０）。

ｐＨ５のストレス
濃縮ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を使用して１．０ｍｇ／ｍｌに希釈した。濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅ分光光度計を備えたＡ２８０によって確認された。試料は分割された。半分は対照として－８０℃で保存し、残りの半分は４０℃で２週間インキュベートした。インキュベーション後、試料は分析まで－８０℃で保存した。酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍ、ｐＨ５．０）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＢＢ－６０）を使用した。

ｐＨ８のストレス
濃縮ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２を、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３を使用して１．０ｍｇ／ｍｌに希釈した。濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅ分光光度計を備えたＡ２８０によって確認された。試料は分割された。半分は対照として－８０℃で保存し、残りの半分は４０℃で２週間インキュベートした。インキュベーション後、試料は分析まで－８０℃で保存した。ＴｒｉｓのｐＫａは温度に依存する。２５℃で測定されたＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）は、４０℃で約８．０のｐＨを有すると予想される。トリス緩衝液（１ｍ、ｐＨ８．３）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＬＴ－７８３）を使用した。

凍結／解凍
ＣＳＴ、ｐＨ７．０緩衝液中の２０ｍｇ／ｍｌのＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の３つの０．１ｍｌアリコートを、発泡スチロールの容器内で－８０℃で凍結／解凍のサイクルに供して、凍結プロセスを遅くした。サイクル２、４、及び６で、アリコートを取り出し、分析まで－８０℃の保管場所に移した。

攪拌
２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ７．０または２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０中の１０ｍｇ／ｍｌのＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の０．５ｍｌのアリコートをディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、＃２７８７５２）に加え、その場所を密閉し、ホイルで覆い、室温で３００ｒｐｍで３日間振とうした。３日後、プレートをスピンダウンし、Ａ２８０（濃度）、Ａ３４０（濁度）、及びＳＥＣ（凝集）で分析した。

低ｐＨ保持
ＡＢ００８９を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＰｒｏｔｅｉｎＡカラムでキャプチャーし、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。ピーク画分をプールし、１２ｍｌのプロテインＡ溶出液を、１００ｍＭグリシンｐＨ３．０緩衝液でｐＨ３．３に調整した。ｐＨを調整した溶出液を、室温で保持した。１．５時間後、その溶出液を１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．３を使用して中性ｐＨにした。ｐＨ保持試料は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。最終生成物は、分析のためにＰＢＳｐＨ７．４に緩衝液交換して、指定ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００３を受けた。

高濃度
ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３０ｋＤａの分子量カットオフデバイスを使用して濃縮した。濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ上のＡ２８０によって決定し、製品の品質は上記のようにＳＥＣによってモニターした。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ）
開発可能性試料の評価には、以下の方法を使用した。５０μｇの試験物質を１２６０ＱｕａｔＰｕｍｐ、１２６０Ｖｉａｌｓａｍｐｌｅｒ、１２６０ＶＷＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）機器に注入した。その試料は、東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ、内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍカラムで分離した。ＳＥＣ泳動緩衝液は、ＰＢＳ、ｐＨ７．０で、０．５０ｍｌ／分で流動した。吸光度は２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの両方でモニターして、ピーク面積は手作業で積分し、高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び単量体のパーセントを報告した。下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：ゲル濾過標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；１５１１９０１）、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム一水和物／二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、０．３ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃ－５１９４Ｄ）、及びＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、５μｍカラム（東ソー；０８５４１）。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳトリプシンペプチドマッピング
簡単に説明すると、５０μｇのＡＢ００８９を、２５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中の６Ｍ塩酸グアニジンで希釈し、ジスルフィド結合を、２５ｍＭジチオスレイトールを用いて４０℃、サーモミキサー中で３０分間還元した。次に、還元されたシステインを、暗所で室温で６０分間、５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。還元及びアルキル化されたタンパク質を、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液スイッチし、トリプシンを使用して（１：２５の酵素：基質）３７℃で１時間消化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ＋質量分析計にカップリングされたＴｈｅｒｍｏＶａｎｑｕｉｓｈＵＨＰＬＣで実行した。簡単に説明すると、５μｇのタンパク質消化物を、０．３ｍｌ／分で２％～４０％のアセトニトリル勾配を使用して、ＷａｔｅｒｓＵＰＬＣＢＥＨペプチドＣ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍＭ）で１５０分かけて分離した。質量スペクトルは、フルＭＳスキャンの場合は３５，０００の解像度で、及びＴｏｐ１０のＭＳ／ＭＳスキャンの場合は１７，５００の解像度で、ポジティブモードで、２３０－２０００ｍ／ｚから取得した。ＢｙｏｓＰＴＭワークフロー（ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｒｉｃｓ）を使用してＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳファイルを分析した。ペプチドは、正確な質量、及びＡＢ００８９配列を検索するＭＳ／ＭＳを用いて特定した。ペプチド同定の設定は次のとおりであった。
●前駆体の質量誤差範囲６．００ｐｐｍ
●フラグメントの質量誤差範囲２０．００ｐｐｍ
●切断部位（複数可）ＲＫ、Ｃ末端
●消化特異性完全に特異的
●逃した開裂２
●修飾カルバミドメチル／＋５７．０２１４６４＠Ｃ、修正済み
●ＤＴＴ／＋１５１．９９４９１５＠Ｃ
●酸化／１５．９９４９１５＠Ｍ、Ｗ
●デチオメチル／－４８．００３３７１＠Ｍ
●脱アミド化／＋０．９８４０１６＠Ｎ、Ｑ
●パイロ－Ｇｌｕ／－１７．０２６５４９＠ＮＴｅｒｍＱ
●パイロ－Ｇｌｕ／－１８．０１０５６５＠ＮＴｅｒｍＥ
●カルバミル／＋４３．００５８１４＠ＮＴｅｒｍ、Ｋ、Ｒ
●アセチル／＋４２．０１０５６５＠プロテインＮＴｅｒｍ
●アンモニア損失／－１７．０２６５４９＠Ｎ
●二酸化／＋３１．９８９８２９＠Ｗ
●キヌレニン／＋３．９９４９１５＠Ｗ
●Ｎ－グリカン５０共通

以下の材料／試薬（供給業者；カタログ番号）を使用した：
●アセトニトリル中の０．１％ギ酸（ＪＴＢａｋｅｒ；ＬＣ４４１－２．５）
●水中の０．１％ギ酸（ＪＴＢａｋｅｒ；ＬＣ４５２－２．５）
●ギ酸（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；２８９０５）
●グアニジンＨＣｌ（ＡｌｆａＡｅｓａｒ；Ａ１３５４３）
●塩酸、６Ｎ（Ａｖａｎｔｏｒ；４１０３－０１）
●計量しないジチオスレイトール（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；２０２９１）
●計量しないヨードアセトアミド（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；９００３４）
●水酸化ナトリウム、６Ｎ（Ａｖａｎｔｏｒ；５６７２－０２）
●ＴｒｉｓＢａｓｅ（Ａｖａｎｔｏｒ；４１０９－０１）
●トリプシン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；９００５７）
●ＵＰＬＣＢＥＨペプチドＣ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍＭ）（Ｗａｔｅｒｓ；１８６００３５５６）
●Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；８９８８２）

結果
発見
ハイブリドーマサブクローン１６Ｂ８．Ｃ８（配列最適化ＡＢ００８９及びその前駆体ＡＢ０２３７が由来）は、組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓタンパク質によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化を通じて開発した（図１０４）。免疫化プロセス、抗体スクリーニング、組換え及び細胞表面で発現したＣＬＥＣ１２Ａ結合の評価、及びエピトープビニングの詳細な説明が記載されている。

ＡＢ０２３７の開発可能性評価中に、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのＣＤＲＨ３でアスパラギン酸異性化のライアビリティを確認した。単一アミノ酸置換によって、または標的酵母ディスプレイアプローチ（「ＤＳ」または「Ｓ」の無作為化）によってこのライアビリティを取り除く試みは、低い発現収量及びＣＬＥＣ１２Ａへの結合の有意な喪失をもたらし、これによって、このモチーフがＣＤＲ構造を維持するために重要であり得ることが示唆される。従って、ＣＬＥＣ１２Ａの親和性をさらに向上させるために、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＨ２の最適化に焦点を当てた親和性成熟の取り組みを行い、最適化されたＣＤＲＨ３のバックグラウンドでＤＳ配列をＤＴに置き換えた。さらに、フレームワーク内のマウスの逆突然変異の数を減らすことにより、分子のヒトらしさを改善しようとした。ＣＤＲアーキテクチャを維持するために他の逆突然変異が必須ではないのに対し、位置Ｈ８３で１つの逆突然変異だけが必要であると本発明者らは、仮定した。単一の逆突然変異を含む最適化されたｓｃＦｖフレームワークは、ｐＥＴ１５９６という名前にして、全ての追加遺伝子操作のバックグラウンドとして使用した。その後、（Ｈ９４）Ｋの逆突然変異が復活し、分子の安定化がさらに促進された。これらの工学的努力の結果、異性化のライアビリティを取り除き、ヒトらしさを向上させながら、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する高い親和性及びＡＭＬがん細胞株に対する効力を保持するＡＢ００８９分子の発見がもたらされた。

配列の最適化
ＣＤＲＨ３に焦点を当てた無作為化された親和性成熟ライブラリー
酵母ディスプレイ親和性成熟ライブラリー（ライブラリー１７と呼ばれる）は、上記のように、一度に１つずつ、各位置でｐＥＴ１５９６のＣＤＲＨ３残基（ＹＤＹＤＤＳＬＤＹ、配列番号１３９）を変異することによって、または２つのアミノ酸残基を全ての２０アミノ酸に変更することによって、首尾よく生成された。ライブラリー１７においてｈＣＬＥＣ１２Ａに向かってより高い親和性を有するｓｃＦｖを濃縮するために、３ラウンドの選択を、ビオチン化ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓを１ｎＭで（第１及び第２ラウンドの選択、図１０５Ａ、Ｂ）及び０．１ｎＭで（第３ラウンドの選択；図１０５Ｃ）用いて行った。親クローンｐＥＴ１５９６とライブラリークローンの間の親和性を比較し、正確に区別することが可能で、これによってリアルタイムでの定量的選択が可能になった（図１０５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。クローンを単離するための３ラウンドのＦＡＣＳソーティングの後、親クローン

（配列番号３２２）と比較して２つのアミノ酸の相違を含む１つのクローンは、親クローンよりもＣＬＥＣ１２Ａに対して高い結合親和性を示した（図１０５Ｄ、Ｅ）。

ＣＤＲＨ３に焦点を当てた組み合わせ親和性成熟ライブラリー
ＣＤＲＨ３に焦点を当てたライブラリーからの結果は、親和性の改善を示したが、さらなる改善が非常に望まれていた。したがって、ライブラリー３０は、ＣＤＲＨ２組み合わせライブラリー（ＷＳＧＧＫ（配列番号１３８）を、

（配列番号３２３），

（配列番号３２４）、

（配列番号３２５）、

（配列番号３２６）、

（配列番号３２７）、

（配列番号３２８）、

（配列番号３２９）、

（配列番号３３０）、

（配列番号３３１）、

（配列番号３３２）、

（配列番号３３３）、

（配列番号３３４）（ここでＸ＝任意のアミノ酸）に、最適化されたＣＤＲＨ３骨格中に組み込むことによって作成された。目標は、親クローン（ｐＥＴ１５９６）またはＣＤＲＨ３最適化バリアントよりも親和性の優れたバインダーを設計及び選択することであった。これにより、固定ＣＤＲＨ３を保持しながら、無作為化されたＣＤＲＨ２を使用してライブラリーを作成した。この親和性成熟酵母ディスプレイライブラリー（ライブラリー３０）で２ラウンドのＦＡＣＳソーティングを実施して、高親和性バインダーを濃縮した（図１０６）。

２ラウンドのＦＡＣＳソーティング後、

（配列番号３２２）ＣＤＲＨ３バックグラウンド上のＣＤＲＨ２におけるＷＳＧＧＫ（配列番号１３８）から

（配列番号２７２）への変化を有する１つのクローンは、ＣＬＥＣ１２Ａに対して最も高い親和性を示した（図１０７）。このクローンは、親のｐＥＴ１５９６及びＡＢ０２３７と比較してＣＬＥＣ１２Ａ親和性の有意な改善を示した。

ＤＳ配列ライアビリティの修復
親和性成熟クローンが同定されたら、部位特異的変異誘発を使用して、合理的なバリアント（ＣＤＲＨ３：

（配列番号３２２）から

（配列番号２７３））を生成して、その結果、標的への高親和性結合を維持しながら、異性化のライアビリティを含まないＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖを得る。最適化されたＡＢ００８９分子とＡＢ０２３７のＣＤＲの比較を表１２４に示す。

親和性成熟の結果として得られた配列の相違には下線が引かれている。部位特異的変異誘発（ＤＳからＤＴ）によって得られた異性化ライアビリティの補正は緑色で示されている。

構造モデリングに基づいて、ＣＤＲ構造の追加サポートを提供するために、位置Ｈ９４にマウス残基を再導入することにした。ＡＢ００８９には、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのＶＨのＨ８３及びＨ９４の位置に２つのマウス残基しか含まれていないが、ＡＢ０２３７には５つのマウスの逆突然変異がある。残りの逆突然変異はヒトの生殖細胞系列に戻され、これによってＡＢ００８９のヒトらしさが向上した（表１２５）。

分子フォーマット及びデザイン
ＡＢ００８９は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するがん細胞に対してＮＫ細胞とＴ細胞の活性をリダイレクトするヘテロ二量体の三機能性抗体である。ＡＢ００８９は、３つの鎖：鎖Ｈ、鎖Ｌ、及び鎖Ｓを含む。ＡＢ００８９分子の概略図は、図１０８に示されている。鎖Ｈは、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の強力なアゴニストでありながら、親和性が低いために選択されたＡ４９Ｍ－ＩＮＫＧ２Ｄ標的抗体の重鎖である。Ｍ－Ｉ変異は、酸化に敏感であり、そのため潜在的なライアビリティを示し得るＣＤＲＨ３のＭｅｔ１０２残基を排除するために導入された。鎖Ｌは、ＮＫＧ２Ｄを標的とする抗体Ａ４９Ｍ－Ｉの軽鎖である。鎖Ｓには、ＡＭＬがん細胞上のＣＬＥＣ１２Ａに高い親和性で結合するｓｃＦｖが含まれている。ｓｃＦｖドメインとＦａｂドメインの両方がヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合している。両方の鎖は、２つのＦｃ単量体の安定したヘテロ二量体化を確実にするために導入されたＣＨ３ドメインにいくつかの変異を有する。ＡＢ００８９のＩｇＧ１Ｆｃには７つのそのような変異がある：鎖Ｈの３つの変異及び鎖Ｓの４つの突然変異。これらの変異のうち２つは鎖Ｈと鎖Ｓとの間の安定化Ｓ－Ｓ架橋（Ｙ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃ）の形成に関与している（ＥＵの命名法）。鎖ＳのｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬ方向）は、Ｓ－Ｓ架橋（（Ｈ４４）Ｃ及び（Ｌ１００）Ｃ、Ｃｈｏｔｈｉａ命名法）を導入する２つの変異によって安定化される。鎖Ｓには、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間に（Ｇ_４Ｓ）_４非免疫原性リンカーも含まれている。ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするｓｃＦｖのアミノ酸配列は、ハイブリドーマ（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）から得られたヒト化１６Ｂ８．Ｃ８抗体の配列に基づいている。ＮＫＧ２ＤＦａｂのアミノ酸配列は、ヒト酵母ディスプレイ技術（Ａｄｉｍａｂ）を使用して得られた完全ヒト抗体Ａ４９Ｍ－Ｉに基づいている。

アミノ酸配列
ＡＢ００８９を構成する３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列を以下に示す。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの命名法を使用して定義され、表１２６に示されている。ＩｇＧ１で一般的に処理及び切断されるＣ末端Ｋは、不均一性を防ぐために鎖Ｓ及び鎖Ｈでは欠失される。

鎖Ｓ：ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖ－ＣＨ２－ＣＨ３（ヒト化配列、ＣＤＲはイタリック体、逆突然変異は二重下線、操作されたｓｃＦｖジスルフィドは小文字、ならびにヘテロ二量体化及び操作されたＣＨ３ジスルフィドのＦｃ変異は単一下線）。

（配列番号２７６）

鎖Ｈ：ＮＫＧ２Ｄ標的化ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（完全ヒト、ＣＤＲはイタリック体、ヘテロ二量体化のためのＦｃ変異、及び操作されたＣＨ３ジスルフィドには下線が引かれている）。

（配列番号２６０）

鎖Ｌ：ＮＫＧ２Ｄ標的化ＶＬ－ＣＬ（完全ヒト、ＣＤＲはイタリック体で示されている）。

（配列番号２６１）

ＣＤＲの潜在的な配列ライアビリティの分析
鎖Ｌ（ＮＫＧ２Ｄ結合軽鎖）には予測されるライアビリティはない。鎖Ｈ（ＮＫＧ２Ｄ結合重鎖）はＣＤＲＨ３にＤＰを有する。このモチーフは、強制分解の影響を受けない（他の構築物と同様に、データは示していない）。そのため、この配列はＡＢ００８９では変更されていない。鎖Ｓ（ＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖）には予測されるライアビリティはない。

ヘテロ二量体化変異の説明
ＥＵの番号付け規則を使用して、Ｆｃのアミノ酸残基に注釈を付けた。
鎖Ｈには、以下の変異が含まれている。
Ｋ３６０Ｅ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｋ４０９Ｗ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｙ３４９Ｃ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるサブユニット間ジスルフィド安定化変異。

鎖ＨのＦｃ領域のＫ３６０Ｅ／Ｋ４０９Ｗ変異は、疎水性／立体構造相補性に加えて長距離静電相互作用に起因して、鎖Ｓとのヘテロ二量体に有利な相互作用をもたらすように設計されている（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，１２，２７４８－５９；Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，６５，３７７－８３）。変異Ｙ３４９Ｃは、追加の鎖間ジスルフィド結合Ｙ３４９Ｃ－（ＣＨ３－鎖Ｈ）－Ｓ３５４Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｓ）対を生成するために導入された（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，６５，３７７－８３）。
鎖Ｓには、以下の変異が含まれている。
Ｇ４４Ｃ－ｓｃＦｖのＶ_Ｈ領域におけるジスルフィド安定化変異。
Ｓ１００Ｃ－ｓｃＦｖのＶ_Ｌ領域におけるジスルフィド安定化変異。
Ｑ３４７Ｒ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｄ３９９Ｖ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｆ４０５Ｔ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｓ３５４Ｃ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるサブユニット間ジスルフィド安定化変異。

変異Ｇ４４Ｃ及びＳ１００Ｃは、ＶＨとＶＬの間の操作されたジスルフィド結合によってｓｃＦｖを安定化するために導入された。ジスルフィド安定化は、ｓｃＦｖの構造的及び熱的な安定性を改善する。鎖ＳのＦｃ領域のＱ３４７Ｒ／Ｄ３９９Ｖ／Ｆ４０５Ｔ変異は、疎水性／立体構造相補性に加えて長距離静電相互作用に起因して、鎖Ｈとのヘテロ二量体に有利な相互作用をもたらすように設計された（Ｃｈｏｉｅｔａｌ，（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，１２，２７４８－５９）。変異Ｓ３５４Ｃは、Ｙ３４９Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｈ）－Ｓ３５４Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｓ）対との追加の鎖間ＣＨ３ジスルフィド結合を生成するために導入した（Ｃｈｏｉｅｔａｌ，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，６５，３７７－８３）。

鎖Ｈと鎖Ｓのヘテロ二量体化は、相互作用の対Ｋ４０９Ｗ（ＣＨ３Ａ）－Ｄ３９９Ｖ／Ｆ４０５Ｔ（ＣＨ３Ｂ）（Ｗ－ＶＴ対と呼ばれる）及びＫ３６０Ｅ（ＣＨ３Ａ）－Ｑ３４７Ｒ（ＣＨ３Ｂ）（ＥＲ対と呼ばれる）を有する、いわゆるＥＷ－ＲＶＴと呼ばれる５つの変異に基づいており、これは、保存された静電相互作用を非対称の疎水性相互作用に置き換え、それぞれ、ヘテロ二量体ＣＨ３インターフェースのリムに非対称の長距離静電相互作用を追加するように設計された（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，１２，２７４８－５９）。ヘテロ二量体のＣＨ３Ａ－ＣＨ３Ｂ界面の詳細な分析により、天然のＩｇＧ１Ｆｃと比較して、界面での変異に起因する構造的摂動がほとんどないことが明らかになった（図１０９）。Ｆｃ－ＥＷ－ＲＶＴの界面変異に隣接する残基の主鎖及び側鎖の高次構造は、変異した残基の側鎖置換を除いて、Ｆｃ－ＷＴの高次構造とほぼ同じである（図１０９Ａ）。Ｗ－ＶＴ変異対の残基、すなわち、Ｋ４０９Ｗ（ＣＨ３Ａ）－Ｄ３９９Ｖ（ＣＨ３Ｂ）／Ｆ４０５Ｔ（ＣＨ３Ｂ）は、ほとんど埋もれたＣＨ３Ａ－ＣＨ３Ｂ界面で相補的接触を形成するために近接しており（図１０９Ｂ）、これによってＷ－ＶＴ対が最適な疎水性相互作用を形成することによってＣＨ３Ａ－ＣＨ３Ｂ間の疎水性界面を強化することが示唆される。ＥＲ変異対の残基Ｋ３６０ＥＣＨ３Ａ－Ｑ３４７ＲＣＨ３Ｂは、野生型ＫＱ対（４．６１Å）とは異なり、塩橋を形成するために３．４５Åに十分に接近して配置され（図１０９Ｃ）、強い静電相互作用によるヘテロ二量体の優先的形成に寄与する。したがって、Ｆｃ－ＥＷ－ＲＶＴに導入された変異残基は、ＣＨ３Ａ－ＣＨ３Ｂ界面で非共有相互作用を形成し、ＣＨ３ドメイン構造全体に大きな構造的摂動を与えることなくヘテロ二量体形成を促進する。

設計により、Ｗ－ＶＴ対残基（Ｋ４０９Ｗ（ＣＨ３Ａ）－Ｄ３９９Ｖ（ＣＨ３Ｂ）／Ｆ４０５Ｔ（ＣＨ３Ｂ））及びＥＲ対残基（Ｋ３６０Ｅ（ＣＨ３Ａ）－Ｑ３４７Ｒ（ＣＨ３Ｂ））は、ヘテロ二量体ＣＨ３界面にあり、それぞれ３．４５Åで非対称の相補的疎水性相互作用及び静電相互作用を形成し、これはヘテロ二量体を優先する。一方、それぞれのホモ二量体の形成は、４０９ＷＣＨ３ＡとＦ４０５ＣＨ３Ａ残基との間の立体衝突、及び３４７Ｒ（ＣＨ３Ｂ）とＫ３６０（ＣＨ３Ｂ）残基との間の反発静電相互作用に起因して、熱力学的に不利であった。Ｋ４０９ＷＴ－Ｄ３９ＷＴの野生型静電相互作用残基が失われると、ホモ二量体の形成も抑制される。ヘテロ二量体のさらなる安定化は、Ｙ３４９Ｃ（ＣＨ３Ａ）及びＳ３５４Ｃ（ＣＨ３Ｂ）変異を有するＣＨ３間ジスルフィド結合ＥＷ－ＲＶＴ（Ｓ－Ｓ）バリアントによってもたらされる（図１１０）。Ｆｃ－ＥＷ－ＲＶＴ（Ｓ－Ｓ）のＸ線構造は、２．５Åの分解能で描写されており（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，６５，３７７－８３）、既知のＩｇＧ１構造と極めて類似していた。

構造モデリング
結晶構造がない場合、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄ結合アームの可変セグメントの構造モデルを比較のために生成した。分子モデリングは、ＳＡｂＰｒｅｄウェブサイト（ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｎｅｗｓａｂｄａｂ／ｓａｂｐｒｅｄ／）を使用して実行された。

ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームの表面電荷分布及び疎水性パッチ分析
図１１１は、３つの異なる方向でのＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのリボン図モデル（上のパネル）、及び同じ方向のそれらの対応する表面電荷分布（下のパネル）を示している。抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖの電荷分布は分極化されており（「上面図」、下のパネル）、負に帯電した残基が主にＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ２内に存在する。パラトープ上の静電パッチの不均一な分布は、標的に関連している可能性が高く、同族のエピトープ上の電荷分布の相補性を反映している可能性があり、これは、ＣＬＥＣ１２ＡとＡＢ００８９のｓｃＦｖとの間の高親和性相互作用に寄与し得る。

図１１２は、ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。分析は、治療用抗体プロファイル（ＴＡＰ）：ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｎｅｗｓａｂｄａｂ／ｓａｂｐｒｅｄ／ｔａｐを使用して実行された。３７７の後期治療用抗体を参照して候補を比較する。ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲの長さは、後期治療用抗体の正常範囲内である。抗体のＣＤＲの疎水性パッチ分析によって、その開発可能性が予測される。ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームの理論的な疎水性特性は、商業化された生物療法薬及び後期治療用抗体候補の基準の十分に範囲内である。

図１１３は、正電荷及び負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。３つのチャートは全て、電荷分布が治療用抗体の母集団と比較して標準内にあることを示している。

ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ結合アームの表面電荷分布及び疎水性パッチ分析
ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂは、３つの異なる配向を有するリボン図に示され（図１１４、上部パネル）、同じ配向での対応する表面電荷分布が示される（図１１４、下部パネル）。ＮＫＧ２Ｄ結合アームの表面電荷は、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームの電荷よりも均一に分布している。

図１１５は、ＡＢ００８９のＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。ＣＤＲの長さ、疎水性、及び正／負の電荷分布は、既存の治療用抗体の基準の範囲内であると思われる。

図１１６は、正電荷及び負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。３つのチャートは全て、この電荷分布が治療用抗体の母集団と比較して標準内にあることを示している。

フレームワーク評価
ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームは、マウスの免疫化によって発見された。ＣＤＲグラフト化のために選択されたフレームワークは、臨床段階の治療用モノクローナル抗体で頻繁に使用される（図１１７）。ＮＫＧ２Ｄ結合アームは完全ヒトであり、進行期のｍＡｂで頻繁に使用されるフレームワークに基づいており、異常な残基も生殖細胞系列からの逸脱も含まれていない。

免疫原性の予測
ＡＢ００８９の３つの鎖のタンパク質配列を、潜在的に免疫原性のＴ細胞エピトープの存在について調べ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘアルゴリズムを使用して免疫原性の可能性をランク付けした（図１１８）。ＡＢ００８９は、Ｔｒｅｇ調整免疫原性タンパク質スケールで良好なスコアを示す。ＡＢ００８９の３つの鎖の配列のＴｒｅｇ調整ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは、－３３．３９（鎖Ｈ）、－２７．１３（鎖Ｓ）、及び－２３．４９（鎖Ｌ）である（表１２７）。ＡＢ００８９の免疫原性の予測リスクは低いようである。

発現
ＡＢ００８９の発現は、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴプラットフォーム精製法を使用して達成された。簡単に説明すると、ＡＢ００８９は、ＮＫＧ２Ｄ標的化軽鎖（鎖Ｌ）、ＮＫＧ２Ｄ標的化ＩｇＧ重鎖（鎖Ｈ）、及びＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合（鎖Ｓ）をコードする３つのプラスミドによるＥｘｐｉ２９３及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。Ｅｘｐｉ２９３とＥｘｐｉＣＨＯの両方の発現について、鎖Ｓ：鎖Ｈ：鎖Ｌは、所望のヘテロ二量体生成物の割合を最大化するためプラスミド比４：１：１でトランスフェクトした。この比率は、以前のヒト化ＴｒｉＮＫＥＴに基づいて経験的に得られたものであり、ＡＢ００８９用に特別に最適化されたものではない。

精製
ＡＢ００８９の精製は、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴプラットフォーム精製法を使用して実行された（図１１９）。この精製プロセスは、多くの異なるＴｒｉＮＫＥＴのＥｘｐｉ２９３、ＥｘｐｉＣＨＯ、及びＣＨＯ－Ｍ細胞培養で発現される材料に以前から適用されている。ＡＢ００８９精製のための最適化または広範なプロセス開発は実施しなかった。２段階の精製プロセスを採用した。

一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞で２ロットのＡＢ００８９を生成した。表１２８は、両方のロットの力価及び最終製品の純度をまとめたものである。ＥｘｐｉＣＨＯで発現されたＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の精製は、以下に詳細に説明する。

プロテインＡキャプチャー
ＡＢ００８９は上記のようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞株で発現された。約５．７リットルの濾過された上清を、プロテインＡカラムにロードした。ロード流量は１０ｍｌ／分であった（２９８ｃｍ／ｈ；３．３分の滞留時間）。キャプチャーステップの収量は、約７５２ｍｇであった。図１２０は、キャプチャーステップのクロマトグラムを示している。

ＳＥＣ分析によると、プロテインＡ溶出液は、２３．４分で溶出する主に望ましいヘテロ二量体ＡＢ００８９種（約８８．８％）を含んでいる（図１２１）。不純物には、ＨＭＷ凝集物及びごく少量のＬＭＷが含まれる。

プロテインＡのロード、フロースルー、及び溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、フロースルー試料にＡＢ００８９バンドがないことに基づいて、ＡＢ００８９のキャプチャーが完了したことを示している。プロテインＡ溶出レーンは主にＴｒｉＮＫＥＴを示し、ＳＥＣによって観察されたＨＭＷ及びＬＭＷピークに対応する追加のバンドがある（図１２２）。

陽イオン交換クロマトグラフィー
プロテインＡ溶出液は、７ｍｌ／分の流速で操作される（３７１ｃｍ／ｈ；３．２分の滞留時間）ＰｏｒｏｓＸＳカラム（１．２ｃｍＤｘ２０ｃｍＨ）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製された。導電率が約２０ｍＳ／ｃｍに達したとき、生成物は１５％Ｂ溶出ステップで溶出し始めた（図１２３）。溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、最初の５つの画分に高純度の生成物を示している（図１２４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、混入している生成物関連タンパク質の存在を示しているので、ピークのテール画分は、ＩＥＸ生成物プールから除外した。

ＩＥＸ画分を濃縮すると、約４０１ｍｇの精製ＡＢ００８９が得られた。プールした画分を透析によりＰＢＳｐＨ７．４に緩衝液交換した。緩衝液交換後のＡＢ００８９収量は、最終濃度９．６６ｍｇ／ｍｌで約３９１ｍｇであった（ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２）。ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２生産の収量及び回収率を表１２９にまとめている。

ｃｙｎｏ（カニクイザル）研究で使用されるＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の特性評価
ｃｙｎｏ研究での使用を目的としたＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２は、純度、同一性、標的への結合、及び効力について広範囲に特徴付けられた。試験された全ての基準は仕様を満たしていた。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度
最終試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、主要なバンドが、還元されたＡＢ００８９と還元されていないＡＢ００８９の両方で予想される分子量と一致することが示された（図１２５）。

分析ＳＥＣによる純度（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）
精製されたＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２のＳＥＣ分析は、積分されたピーク面積によって決定されるように１００％の単量体を示した（図１２６）。

インタクトな質量分析による同一性
ＡＢ００８９（ロットＡＢ００８９－００２）の同一性は、質量分析によって裏付けられた（図１２７）。インタクトなＡＢ００８９のＬＣ－ＭＳ分析は、１２６，１２９．１Ｄａの理論質量とよく一致する観測された質量（１２６，１３０．０Ｄａ）を示した。観察された主なグリコシル化パターン（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ）は、ＣＨＯ細胞で発現されるＦｃ含有分子に典型的である。

エンドトキシン
最終的なＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２のエンドトキシンレベルは、０．２５９ＥＵ／ｍｇであった。全てのアッセイパラメーターは仕様を満たしていた。

生化学的及び生物物理学的特性
ＡＢ００８９は、ＳＥＣ、ＣＥ、ｃＩＥＦ、ＨＩＣ、及びＤＳＣによって特徴付けられ、優れた生物学的治療薬の適切な純度及びプレ開発可能性の特性を備えていることを裏付けている。

純度
ＡＢ００８９の精製は、ＣＥ－ＳＤＳによって決定された（図１２８）。非還元条件下では、主要な不純物は方法によって誘導される（遊離軽鎖及びＴｒｉＮＫＥＴ－ＬＣ）。還元条件下では、３つの予想される鎖（ＬＣ、ＨＣ、及びｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖）が観察される。ＳＥＣ、ＮＲ、及びＲＣＥ－ＳＤＳによって決定されたＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２の純度を表１３０に要約する。

ｃＩＥＦによる実験的なｐＩ及び電荷プロファイル
ＡＢ００８９の電荷プロファイルをｃＩＥＦで分析した（図１２９）。ＡＢ００８９は、８．５２±０．０のｐＩで主要なピークを示した。いくつかのより少量の、重複する酸性ピーク及びマイナーな塩基性ピークも観察される。

ＨＩＣによって評価された疎水性。
ＡＢ００８９の疎水性は、ＨＩＣによって評価した（図１３０、表１３１）。クロマトグラムは単一の狭いピークを表し、この分子が非常に純粋で均質であることを示していた。ＨＩＣの保持時間は１０．２分で、市販されているモノクローナル抗体の正常な挙動の範囲内である（８．９～１３．５分、データは示していない）。

ＤＳＣによる熱安定性
ＡＢ００８９の熱安定性は、いくつかの緩衝液（ＰＢＳｐＨ７．４、ＨＳＴｐＨ６．０、ＣＳＴｐＨ７．０）でＤＳＣによって評価された。ＡＢ００８９は、試験した全ての緩衝液で高い熱安定性を示した（図１３１）。ｓｃＦｖの展開に対応するＴ_ｍ１は熱安定性の評価（表１３２）に利用される６５℃以上の基準を満たしていた。

ジスルフィド結合の割り当て
ＡＢ００８９は、モノクローナルＩｇＧ１抗体の主鎖に基づいて操作された分子である。典型的なＩｇＧ１には１６個のジスルフィド結合が含まれているが、ＡＢ００８９のＦ３’フォーマットには１５個のジスルフィド結合しかない。ＡＢ００８９の半分は抗ＮＫＧ２Ｄの半分の抗体であり、したがって、予想される７つのジスルフィド結合（各ＩｇＧドメインに１つ、及びＬＣをＨＣに接続する分子間ジスルフィド）が含まれている。ＡＢ００８９の残りの半分は、抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物である。ｓｃＦｖには３つのジスルフィド結合（各抗ＣＬＥＣ１２ＡＶＨ及びＶＬドメインに１つ、及び可変ドメインを架橋する操作された安定化ジスルフィド）が含まれ、ＦｃにはＩｇＧドメインに２つの予想されるジスルフィドが含まれる。ヘテロ二量体は、２つのネイティブＩｇＧ１ヒンジジスルフィド、及びＦａｂ－ＦｃをＣＨ３ドメインのｓｃＦｖ－Ｆｃに接続する１つの追加の分子間操作ジスルフィドと共有結合している。まとめると、これはＡＢ００８９で１５の予想されるジスルフィド結合をもたらす。ＡＢ００８９の予測されるジスルフィドマップを図１３２に示す。

ＡＢ００８９のジスルフィド結合の接続性は、非還元消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング分析によって確認した。ジスルフィド結合ペプチドは、ＭＳ／ＭＳデータベース検索と、ネイティブ消化と縮小消化での強度を比較することで確認された。トリプシン消化では、ＶＬ及び操作されたジスルフィド対は、ＬＣ－ＭＳＭＳデータでは観察されない、２つのシステインを含む長いペプチド（２つのジスルフィド結合によって接続された３つのペプチド、Ｓ７：Ｓ３６：Ｓ２２）によって接続される。操作されたｓｃＦｖ安定化ジスルフィドを検出するために、ＡＢ００８９をトリプシンとキモトリプシンの両方で消化した。図１３３は、ｓｃＦｖ（非還元及び還元）の操作されたジスルフィド対の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）、及びそのペプチド対の最も強い電荷状態を示している。ＶＬジスルフィド対は、おそらくカラムに保持するには小さすぎ、かつ親水性であるのでトリプシン／キモトリプシン二重消化では観察されなかった。他の全てのジスルフィドは、トリプシンのみで消化した後に同定され、Ｆｃヘテロ二量体化を安定化するために導入された、操作されたＳ－Ｓ架橋を含んだ（図１３４）。

ＡＢ００８９で観察されたジスルフィド結合ペプチドのまとめを表１３３に示す。観察された全てのジスルフィド連結ペプチドは、高い質量精度を有し（＜４ｐｐｍ）、還元可能であり、ＭＳ／ＭＳ断片化により配列確認された。

結合特徴
ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する結合親和性
ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ００８９の親和性は、３７℃でのＳＰＲによって決定された。ＡＢ００８９は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに高い親和性で結合する（図１３５及び表１３４）。ただし、結合は不均一性を示し、通常の１：１の結合反応速度論には従わない。以下及び図１３６に記載の実験によって、２状態結合機構が確立され、データを適合するために２状態モデルを使用することが正当化された。テポジタマブ（Ｍｅｒｕｓ）のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームでも、同様の２状態反応速度が観察された。

２状態結合モデルは、２セットの速度定数によって定義される２つの結合段階を想定している。
１．最初のＣＬＥＣ１２Ａ－ＡＢ００８９複合体の形成
２．最初の複合体からより安定した最終的な複合体への移行

この機構は、ＳＰＲ実験での会合時間が長くなると、表面でより安定した複合体の比率が高くなり、見かけの解離速度が遅くなることを意味する。ＡＢ００８９及びテポジタマブベースの分子の両方が、会合時間依存の見かけの解離速度を有し、したがって、二状態相互作用モデルを裏付ける（図１３６）。

ＣＬＥＣ１２Ａ＋同質遺伝子及びがん細胞株への結合
ＣＬＥＣ１２Ａ及びＡＭＬがん細胞を発現する同質遺伝子細胞株へのＡＢ００８９結合の評価は、ＦＡＣＳによってモニターされた（図１３７、表１３５）。ＡＢ００８９は、細胞表面に発現したＣＬＥＣ１２Ａに対して高い親和性を示し、ＡＭＬ細胞株ＰＬ－２１及びＨＬ－６０に１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。ＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ００８９の特異性は、標的を発現しない親Ｂａ／Ｆ３細胞への結合の欠如によって実証された。

ヒトＣＬＥＣ１２Ａの多型バリアントに対する結合親和性（Ｑ２４４）
多型バリアントＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）は、人口の３０％に蔓延している。本発明者らは、ＳＰＲによりこの遺伝子バリアントへのＡＢ００８９の結合を試験し、その親和性をＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）の主要な形態と比較した（図１３８）。ＣＬＥＣ１２ＡのＷＴ及びＱ２４４バリアントに対するＡＢ００８９の結合親和性は類似していた（表１３６）。カニクイザルＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）へのＡＢ００８９の結合も試験した。１００ｎＭの濃度では結合は観察されず、ＡＢ００８９がカニクイザルＣＬＥＣ１２Ａと交差反応性がないことが示された。

示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａへの結合
ヒトＣＬＥＣ１２Ａは、高度にグリコシル化されたタンパク質である（２０１アミノ酸を損なう細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する６つの潜在的なＮ－グリコシル化部位）。異なる細胞型の表面でのＣＬＥＣ１２Ａのグリコシル化状態のバリエーションは、文献に記載されている（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：２１５９－２１６９）。異なる患者由来のＡＭＬ細胞の表面に発現するＣＬＥＣ１２Ａは、異なるグリコシル化パターンを同様に有し得る。ＡＢ００８９が、ヒトＣＬＥＣ１２Ａの異なる糖バリアントに結合するか否かを決定するために、抗原をノイラミニダーゼで（末端シアル酸を除去するため）またはＰＮＧａｓｅＦで（Ｎ－結合型グリカンを除去するため）処理して、ＳＰＲによって親和性を未処理のＣＬＥＣ１２Ａと比較した（図１３９及び表１３７）。ＡＢ００８９は、完全にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａと脱グリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａの両方に結合し、標的グリカン組成の不均一性の影響を受けないと予想される。

ヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性
ＡＢ００８９は、３７℃でＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によってヒトＮＫＧ２ＤＥＣＤへの結合について試験された（図１４０）。ＮＫＧ２Ｄは本質的に二量体であるため、この実験には組換えｍＦｃタグ付きＮＫＧ２Ｄ二量体を使用した。図１４０に示される結合センサーグラムの形状により、２つの異なる適合モデルで親和性と運動速度のデータが計算可能になった：定常状態の親和性適合及び１：１の反応速度論的適合。速度定数及び平衡親和性の値を表１３８に示す。ＡＢ００８９は、低い親和性で、最も重要なことに速い解離速度でヒトＮＫＧ２Ｄに結合するように設計された。解離速度定数は、１．４３±０．０３ｘ１０^－１ｓ^－１であった。データを１：１の反応速度論的及び定常状態の親和性モデルに適合することによって得られた親和性値（Ｋ_Ｄ）は、極めて類似しており、それぞれ８８１ ±１０ｎＭ及び８８４±１１ｎＭであり、測定されたパラメーターの信頼性が高いことが示唆される。

ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する結合親和性
ＡＢ００８９作用機序の様式の１つは、そのＦｃを介してＮＫ細胞上に発現されるヒトＣＤ１６ａ（ＦＣγＲＩＩＩａ）係合によるものである。ＡＢ００８９のＣＤ１６ａ（Ｖ１５８対立遺伝子）への結合を、ＳＰＲによって評価し、同じＩｇＧ１アイソタイプの承認及び市販されているモノクローナル抗体治療薬であるトラスツズマブに対するＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）親和性と比較した（図１４１、表１３９）。ＡＢ００８９のＣＤ１６ａへの結合は、トラスツズマブの結合に匹敵する。ＡＢ００８９治療効果は、ＮＫ細胞上の２つの標的、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの同時係合の相乗効果に依存しているため、親和性の３．８倍の相違は、生理学的結果をもたらす可能性は低く、ＡＢ００８９治療効果に影響を与える可能性も低い。さらに、ＣＤ１６ａへの結合がわずかに弱いことも、薬剤の安全性に役立つ可能性がある。

Ｆｃγ受容体への結合
ＡＢ００８９はＩｇＧ１由来の生物学的薬剤候補であるため、適切なＦｃ受容体結合特性を維持することが重要である。ＳＰＲデータは、ＡＢ００８９がヒト及びカニクイザルのＦｃγ受容体に、実験的対照として役立つ市販のＩｇＧ１生物製剤であるトラスツズマブに匹敵する親和性で結合することを示唆している（表１４０）。各々の個々の受容体結合の詳細な説明を以下に示す。

組換えヒト及びカニクイザルＣＤ６４に対するＡＢ００８９の結合（ＦＣγＲＩ）
図１４２及び図１４３は、ＡＢ００８９のヒト及びカニクイザルＣＤ６４への結合をそれぞれ示している。表１４１は、ＡＢ００８９が、トラスツズマブに匹敵する（２倍未満の相違）親和性で組換えのヒト及びカニクイザルのＣＤ６４に結合することを示している。

組換えヒトＣＤ３２Ａに対するＡＢ００８９の結合（ＦＣγＲＩＩａ）
図１４４及び図１４５は、ＳＰＲによって試験された、それぞれ、ＣＤ３２ａ（Ｈ１３１及びＲ１３１対立遺伝子）へのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。ＡＢ００８９及びトラスツズマブの両方の対立遺伝子の親和性の間に意味のある相違はない（表１４２）。

ヒトＣＤ１６ａ（ＦＣγＲ３ａ）及びカニクイザルＣＤ１６（ＦＣγＲ３）に対するＡＢ００８９の結合
高親和性ＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）へのＡＢ００８９結合の詳細な説明は本明細書に提供されている。ヒトＣＤ１６ａ及びカニクイザルＣＤ１６のＦ１５８対立遺伝子に対するＡＢ００８９の結合を表１４３、図１４６及び図１４７に示す。組換えヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１５８及びＦ１５８対立遺伝子）及びカニクイザルＣＤ１６に対するＡＢ００８９の結合は、市販のＩｇＧ１生物学的薬物トラスツズマブに匹敵する。ＡＢ００８９とトラスツズマブの間のＣＤ１６タンパク質に対する親和性の２．３～３．８の相違は、生理学的結果をもたらす可能性は低く、治療効果に影響を与える可能性も低い。なぜなら治療効果は、ＮＫ細胞上の２つの標的（ＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄ）の係合の相乗効果に依拠するからである。トラスツズマブとＡＢ００８９との間の見かけの最大結合応答のわずかな相違は、分子量の相違に起因する。さらに、一部の複製は、受容体キャプチャーレベルのわずかな変動によって引き起こされる見かけの最大結合応答にわずかな変動を示す場合がある。ヒトＣＤ１６ａＦ１５８対立遺伝子への結合を表すセンサーグラムの形状により、相互作用を定常状態及び１：１の反応速度論モデルの両方に適合されるが、親和性適合（定常状態）モデルが、歴史的な理由で使用されたことに注意のこと。

ヒトＣＤ３２Ｂに対するＡＢ００８９の結合（ＦＣγＲ２ｂ）
図１４８は、ＳＰＲによって試験されたＣＤ３２ｂへのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。ＡＢ００８９とトラスツズマブに対するＣＤ３２ｂの親和性の間に意味のある相違はない（表１４４）。

ヒトＣＤ１６Ｂに対するＡＢ００８９の結合（ＦＣγＲ３ｂ）
図１４９は、ＳＰＲによって試験されたＣＤ１６ｂへのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。ＡＢ００８９は、ヒトＣＤ１６ｂ（ＦＣγＲ３ｂ）をトラスツズマブと同等に結合する（表１４５）。受容体に対する親和性の２．３倍の相違が生理学的に重要である可能性は低い。

ＦｃＲｎへの結合
図１５０及び図１５１は、ＳＰＲによって試験されたＡＢ００８９のヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃＲｎへの結合をそれぞれ示している。ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎに対するＡＢ００８９の親和性は、実験対照として機能した市販のＩｇＧ１生物製剤であるトラスツズマブの親和性と類似している（表１４６）。

ＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２ＤへのＡＢ００８９の同時係合
ＡＢ００８９は、ＮＫ細胞に２つの結合様式を有する３機能性ＩｇＧベースの生物学的製剤である。ＣＤ１６ａ結合は、Ｆｃを介して達成され、ＮＫＧ２Ｄ結合はＡ４９Ｍ－ＩＦａｂを介して達成される。両方の相互作用は、ＡＢ００８９の最適な細胞毒性活性にとって重要である。ヒトＣＤ１６ａ及びヒトＮＫＧ２Ｄ結合の共結合の相乗効果を実証するために、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６ａ、及び混合ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ１６ａＢｉａｃｏｒｅチップ表面へのＡＢ００８９の結合を定性的に比較するＳＰＲ実験を行った。ヒトＮＫＧ２Ｄ及びヒトＣＤ１６ａに対するＡＢ００８９の親和性は両方とも低いが、両方の標的に同時に結合すると、より遅いオフレートとして現れる親和性効果が生じる。したがって、ＡＢ００８９は、ＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄに強力に係合し得る（図１５２）。

ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの共係合
一方の標的の結合が他方の標的のＡＢ００８９への結合を妨害するか否かを決定するために、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄを、抗ｈＦｃＩｇＧＳＰＲチップ上にキャプチャーされたＡＢ００８９上に連続的に注入した（図１５３）。標的結合センサーグラムは、ＣＬＥＣ１２Ａドメインの占有状態がＮＫＧ２Ｄ結合を妨害しないこと（図１５３、上のパネル）及びその逆（図１５３、下のパネル）を示している。他の標的で飽和されている遊離ＡＢ００８９及びＡＢ００８９への各標的の結合を示すそれぞれのセンサーグラムセグメントの形状の類似性によって、反応速度論的パラメーターがＡＢ００８９分子の標的占有状態によって有意に影響されないことが示唆される。例えば、センサーグラムのＣＬＥＣ１２Ａ結合セグメントの形状は、両方のパネルで類似している。ＮＫＧ２Ｄの飽和濃度は、標的の解離速度が速いことに起因して、下のパネルに示されている、実験全体を通して維持されなければならないことに注意のこと。さらに、各標的結合の相対的な化学量論への影響がないこと（占有されていないＡＢ００８９への結合と比較した場合）は、ＡＢ００８９上のＮＫＧ２Ｄ及びＣＬＥＣ１２Ａ結合部位が完全に独立していることを意味する（表１４７）。したがって、ＡＢ００８９は、腫瘍抗原とＮＫＧ２Ｄ標的化アームの同時の共結合を成功裏に達成し得る。

エピトープビニング
本発明者らは、ＡＢ０２３７、ＡＢ０１９２、及び３つのＣＬＥＣ１２Ａ結合参照ＴｒｉＮＫＥＴに関連するＡＢ００８９の結合エピトープをＳＰＲによって比較した。ｃＦＡＥ－Ａ４９。テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）は、Ｍｅｒｕｓの分子のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームに基づいている。（ＷＯ＿２０１４＿０５１４３３＿Ａ１）、ｃＦＡＥ－Ａ４９。ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓは、Ｍｅｒｕｓのクローン４３３１（ＷＯ＿２０１４＿０５１４３３＿Ａ１）及びｃＦＡＥ－Ａ４９に基づいている。ｈ６Ｅ７は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（ｈ６Ｅ７）のｈ６Ｅ７ｍＡｂに基づいている。（米国特許出願公開第２０１６＿００７５７８７＿Ａ１号）。ＡＢ００８９とｈＣＬＥＣ１２Ａとの相互作用は、ＡＢ０２３７と２つの対照分子ｃＦＡＥ－Ａ４９によってブロックされた。ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ及びｃＦＡＥ－Ａ４９。テポジタマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ－ｈ６Ｅ７ベースの分子ではなく（図１５４）、ＡＢ００８９の結合エピトープがテポジタマブのエピトープと重複することが示唆されている。結果は、ＡＢ００８９とＡＢ０２３７の両方が同じエピトープを共有することを示した。このフットプリントは、ｃＦＡＥ－Ａ４９．ｈ６Ｅ７でさらに交差ブロックするＡＢ０１９２とは異なる。

効力
ＡＢ００８９の効力は、ＣＤ１６ａＶ及びＮＫＧ２Ｄを安定して発現するように設計されたＮＫ細胞株を用いたＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞毒性アッセイを使用して試験された（図１５５及び表１４８）。ＡＢ００８９は、ＨＬ６０及びＰＬ－２１ＡＭＬ細胞の溶解を促進するのにおいてサブナノモルの効力を示した。さらに、ＡＢ００８９は、対応するモノクローナル抗体を大幅に上回って、精製されたヒト初代ＮＫ細胞によって媒介されるＰＬ２１ＡＭＬ細胞の細胞毒性溶解を強力に増強する（図１５６及び表１４９）。ＡＢ００８９の追加の細胞毒性評価は、実施例１８に詳細に記載されている。

特異性
ＰＳＲによって評価された非特異的結合
ＡＢ００８９の特異性を評価するために、界面活性剤で可溶化されたＣＨＯ細胞膜タンパク質の調製物への結合を測定するフローサイトメトリーベースのＰＳＲアッセイを実施した（図１５７）。ＰＳＲアッセイは、交差相互作用クロマトグラフィーなどの直交特異性アッセイ、及びバキュロウイルス粒子酵素結合免疫吸着アッセイと相関することが実証されている。これらのアッセイでの挙動は、抗体の溶解性及びｉｎｖｉｖｏのクリアランスと強く関連しているため、優れた開発可能性予測因子として機能する（Ｘｕｅｔａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２６，６６３－６７０）。ＡＢ００８９は、低ＰＳＲ対照（トラスツズマブ）と極めて類似したプロファイルを示し、これによって高い特異性及び無関係のタンパク質への非特異的結合の欠如が示唆される（図１５７Ｂ）。リツキシマブをＰＳＲ結合の陽性対照として使用した。

ＨｕＰｒｏｔ（商標）アレイにおけるＡＢ００８９の特異性評価
ＡＢ００８９の特異性を直接調べるために、タンパク質アレイ技術を検討した。ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームマイクロアレイは、単一の顕微鏡スライド上で個々に精製されたヒト全長タンパク質の最大データベースを提供する。２２，０００の全長ヒトタンパク質からなるアレイは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現され、精製された後、何千もの相互作用をハイスループット方式でプロファイリングすることを可能にする、マイクロアレイスライドガラスに２重にプリントされる。図１５８は、ヒトプロテオームマイクロアレイ全体と比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する１μｇ／ｍｌでのＡＢ００８９の相対的結合（Ｚスコア）を示す。比較の目的で、ＡＢ００８９へのバックグラウンド結合が残っている上位２４のタンパク質も提供された。表１５０は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ００８９のＺスコア及びＳスコア、ならびにマイクロアレイの上位６つのタンパク質を示している。Ｓスコアは、所定のタンパク質のＺスコアとその隣の１つのランクとの差である。Ｚ及びＳスコア基準に基づいて、ＡＢ００８９は、ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームアッセイにおいて、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する高い特異性及びオフターゲット結合の欠如を示した。

開発可能性評価
ＡＢ００８９の安定性及び強制分解は、以下の条件下で評価された。
●加速（４０℃）安定性
－製剤ＨＳＴ、ｐＨ６．０中の２０ｍｇ／ｍｌＡＢ００８９（２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ６．０）、４０℃、４週間（ＳＥＣ、ＳＰＲ、効力、ＣＥ－ＳＤＳ、ペプチドマップ）。
－ＣＳＴ、ｐＨ７．０中の２０ｍｇ／ｍｌＡＢ００８９（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０）、４０℃、４週間（ＳＥＣ、ＳＰＲ、効力、ＣＥ－ＳＤＳ、ペプチドマップ）。
●化学的安定性
－酸化：０．０２％過酸化水素を含むＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのＡＢ００８９、室温、２４時間（ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）。
－ｐＨ８．０：２０ｍＭＴｒｉｓ、４０℃、２週間の１ｍｇ／ｍｌＡＢ００８９（ｃＩＥＦ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）。
－ｐＨ５．０：２０ｍＭ酢酸ナトリウム中の１ｍｇ／ｍｌのＡＢ００８９、４０℃、２週間（ｃＩＥＦ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）。
●製造可能性
－凍結／解凍：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０（ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＣＥ）中の２０ｍｇ／ｍｌＡＢ００８９
－撹拌：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０（ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＣＥ）中の１０ｍｇ／ｍｌＡＢ００８９
－高濃度：＞１５０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（ＳＥＣ、Ａ２８０）
－低ｐＨ保持（製造プロセスのウイルスクリアランスステップの条件を模倣）：ｐＨ３．３、１．５時間、ＰｒｏＡ溶出液（ＳＥＣ）；完全に精製されたＡＢ００８９（ｃＩＥＦ、ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＰＲ、効力）
－低ｐＨ保持（異性化を調査するため）：完全に精製されたＡＢ００８９を、ＰｒｏＡ溶出緩衝液で希釈し、ｐＨを３．５に調整した。試料を室温で１時間保持し、Ｔｒｉｓ緩衝液で中和し、緩衝液をＰＢＳ、ｐＨ７．４に交換した後、追加の分析をした（ＳＥＣ、ｃＩＥＦ、ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）。

加速（４０℃）安定性
ＡＢ００８９の安定性を評価するために、この分子を、（１）２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％ＰＳ－８０、ｐＨ６．０（ＨＳＴ）、及び（２）２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％ＰＳ－８０、ｐＨ７．０（ＣＳＴ）の２つの異なる緩衝液条件下で、４０℃で４週間。２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でステージングした。両方の緩衝液の安定性は、ＳＥＣ、ＣＥ、ＳＰＲ及び効力によって評価した。

ＨＳＴ、ｐＨ６．０での安定性
ＡＢ００８９は、ＨＳＴ、ｐＨ６．０、４０℃で４週間インキュベートした後、高い安定性を示した。凝集がなく、単量体の損失が最小限であることが（１．６％）ＳＥＣによって観察された（図１５９及び表１５１）。最小限の断片化が、ＲＣＥ－ＳＤＳによって検出された（図１６０及び表１５２）。さらに、対照試料とストレス試料との間で、ｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びｈＣＤ１６ａに対する、活性種の量、結合反応速度論、または親和性に有意差は観察されなかった（図１６１及び表１５３）。最後に、対照試料とストレスを受けた試料との間の効力の差は検出されなかった（図１６２及び表１５４）。

ＣＳＴｐＨ７．０での安定性
ＡＢ００８９は、ＣＳＴ、ｐＨ７．０、４０℃で４週間インキュベートした後、高い安定性を示した。単量体含有量の最小損失（１．６％）がＳＥＣによって観察された（図１６３及び表１５５）。ＣＥ－ＳＤＳではＡＢ００８９の断片化は観察されなかった（図１６４及び表１５６）。さらに、対照試料とストレス試料との間で、活性タンパク質含有量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びｈＣＤ１６ａに対する結合親和性に有意差はなかった（図１６５及び表１５７）。最後に、長期の熱ストレスは、ＡＢ００８９の効力に影響を与えなかった（図１６６及び表１５８）。

加速安定性試料のペプチドマップ分析
４０℃のストレスが相補性決定領域（ＣＤＲ）の修飾（改変）を誘発したか否かを判断するために、対照及び４週間のストレス試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピングによって分析した。ペプチドマップデータに基づくと、ＡＢ００８９の全てのＣＤＲは、高温ストレス時の修飾に耐性がある（表１５９）。ピーク形状の手動検査に基づいて、ＣＬＥＣ１２Ａ結合ＣＤＲＨ３を含むペプチドにおけるアスパラギン酸異性化の証拠は観察されなかった（図１６７）。

化学的安定性
強制酸化
酸化ストレス下でのＡＢ００８９の安定性を評価するために、ＡＢ００８９を０．０２％過酸化水素とともにＰＢＳ中で室温で２４時間インキュベートした。ＳＥＣ分析は、酸化されたＡＢ００８９と対照試料との間で単量体含有量に差がないことを示した（図１６８及び表１６０）。還元及び非還元ＣＥ－ＳＤＳの両方によってＡＢ００８９で断片化の増大は検出されなかった（図１６９及び表１６１）。

メチオニンの部位特異的酸化は、強制酸化後のトリプシンペプチドマッピングによってモニターされた。有意なレベルの酸化は、Ｆｃの２つのメチオニンでのみ検出された（表１６２）。我々の歴史的データでは、同じ残基が同じ条件下で、トラスツズマブ６１．６％及び３９．１％で修飾されていることが示されている。

ＡＢ００８９ＣＤＲのトリプトファン残基の酸化も同じ実験でモニターされた。ストレス後の酸化が有意に増大したトリプトファン残基はなかった（表１６３）。

酸化ストレスは、活性タンパク質含有量またはｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びｈＣＤ１６ａＶに対する親和性に有意な影響を及ぼさなかった（図１７０及び表１６４）。ＡＢ００８９の効力に対する酸化の有意な影響は観察されなかった（図１７１及び表１６５）。

ｐＨ８のストレス
ＡＢ００８９の化学的安定性は、高ｐＨ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、４０℃、２週間）での長期インキュベーションによって評価された。ＡＢ００８９は非常に安定しているようである：わずか１．２％単量体の喪失はＳＥＣによって検出された（図１７２及び表１６６）。

還元及び非還元ＣＥ－ＳＤＳは、それぞれ１．７％及び３．９％という低レベルの分解を示した（図１７３及び表１６７）。

長期間の高ｐＨストレスの後、ｃＩＥＦによって検出された全体的な電荷プロファイルに酸性シフトがあった（図１７４及び表１６８）。この酸性シフトは、ＡＢ００８９配列全体の脱アミド化に起因し得る。同じストレス条件の後、トラスツズマブでも同様の酸性シフトが観察された（データは示していない）。

ストレスを受けた試料と対照試料との間で、ｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、もしくはｈＣＤ１６ａＶに対する活性タンパク質の量または親和性に有意差はなかった（図１７５及び表１６９）。

長期間の高ｐＨ曝露後、ＡＢ００８９の効力は約２分の１に減少した（図１７６及び表１７０）。直交分析法が、結合または事実上の種の含有量に相違を示さなかったことを考慮すると（図１７５）、これらの相違は効力アッセイの変動性に起因し得ると思われる。

ｐＨ５のストレス
ＡＢ００８９の化学的安定性は、低ｐＨ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、４０℃、２週間）での長期インキュベーションによっても評価された。ＤＦは非常に安定しているように見える：ＳＥＣによって検出された単量体の損失はわずか０．３％であった（図１７７及び表１７１）。

長期間のｐＨ５のストレスの後、低レベルのＡＢ００８９分解が非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された：単量体含有量のそれぞれ１．０％及び０．３％の損失（図１７８及び表１７２）。

長期間のｐＨ５のストレスの後、ｃＩＥＦによって検出された全体的な電荷プロファイルに小さな酸性シフトがあり（図１７８及び表１７２）、特に１つの酸性バリアントが有意に増大した。

長期間の低ｐＨ曝露後、ｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、またはｈＣＤ１６ａＶに対する活性タンパク質含有量またはＡＢ００８９親和性に有意差はなかった（図１８０及び表１７４）。

長期のｐＨ５曝露後のＡＢ００８９の効力は、対照試料の効力と同様のままであった（図１８１及び表１７５）。

ｐＨ５及びｐＨ８のストレスを受けた物質のペプチドマッピング分析
ｃＩＥＦによって観察されたｐＨストレス誘発性変化が、相補性決定領域（ＣＤＲ）の修飾（改変）に起因するか否かを判断するために、ｐＨ５及びｐＨ８のストレス試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマップによって分析した。ペプチドマップデータに基づくと、ＡＢ００８９の全てのＣＤＲは、低及び高ｐＨストレス時の修飾に耐性がある（表１７６）。ピーク形状の手動検査に基づいて、ＡＢ００８９のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームのＣＤＲＨ３を含むペプチドにおけるアスパラギン酸異性化の証拠は観察されなかった（図１８２）。

製造可能性
凍結／解凍安定性
ＡＢ００８９のアリコート（ＣＳＴｐＨ７．０中で２０ｍｇ／ｍｌ）を、バイアルを発泡スチロール容器に入れ（凍結速度を遅くするため）、その容器を－８０℃に置くことにより、６回凍結及び解凍した。６サイクルの凍結／解凍の後、ＳＥＣによって、ＡＢ００８９は単量体の損失を示さなかった。Ａ２８０によって測定されたタンパク質濃度は同じままであった（図１８３及び表１７７）。

６回の凍結／解凍サイクル後、還元または非還元のＣＥ－ＳＤＳによって純度の損失は検出されなかった（図１８４及び表１７８）。

攪拌
ＡＢ００８９（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ７．０、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０の有無における１０ｍｇ／ｍｌ）は、ディープウェルプレート内で室温で３００ｒｐｍで３日間、振とうした。攪拌ストレス後、ＳＥＣによって検出された単量体の損失はなく（図１８５及び表１７９）、タンパク質濃度の損失（Ａ２８０）、及び濁度（Ａ３４０）の増大は観察されなかった。

高濃度
ＡＢ００８９は、ＰＢＳ中で約１０、１５、２５、５０、１００、１５０及び１７５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ７．４）に濃縮し、回収は目視検査、濃度（Ａ２８０）、及びＳＥＣによってモニターした。ＳＥＣ分析では、試料を希釈せずに注入した（注入容積は濃度に対して正規化された）。ＡＢ００８９は、単量体パーセントの損失が最小限で（図１８６、図１８７、表１８０）、目に見える沈殿なく、１７５ｍｇ／ｍｌ超に濃縮可能であった。

低ｐＨ保持
２つの異なる方法を使用して、低ｐＨ保持（模擬ウイルス不活化）中のＡＢ００８９の挙動を評価した。第１の方法は、最初のクロマトグラフィーステップからの溶出液（タンパク質Ａ）を追加の精製前に低ｐＨに保持する製造プロセスを模倣した。第２の方法では、完全に精製されたＡＢ００８９を低ｐＨ条件下でインキュベートした。この方法を使用して、ＣＤＲの潜在的な低ｐＨ誘発化学修飾を評価した。

プロテインＡ溶出液の低ｐＨ保持での曝露
ＡＢ００８９が低ｐＨ保持に耐性があるか否かを判断するために、ＡＢ００８９プロテインＡ溶出液を、ｐＨ３．５に調整し、室温で２時間保持した。保持期間の後、プロテインＡ溶出液を１．０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３で中和して、中性ｐＨを達成した。分析ＳＥＣを実施して、低ｐＨ曝露の前後でプロファイルまたは凝集体含有量に変化があったか否かを確認した（図１８８）。「保持なし」の対照試料と比較して、低ｐＨ保持後、ＡＢ００８９のＳＥＣプロファイルに変化は観察されず、これによって、ＡＢ００８９が、生物製剤の製造に使用される低ｐＨ保持／ウイルス不活化条件の間、非常に安定していることが示唆される。

タンパク質は、ＤＦプラットフォーム精製法の第２ステップでさらに処理して、低ｐＨ保持にさらされなかった精製タンパク質と比較して、追加のアッセイのパネルを使用して分析した。アミノ酸側鎖の化学修飾は、通常、ｃＩＥＦを使用して全体規模で観察され得る。ＡＢ００８９対照と低ｐＨ保持ロットのｃＩＥＦプロファイルは、視覚的に非常に類似しており、酸性、主要、及び塩基性種の相対的な定量は、全てお互いの５％の範囲内である。これによって、低ｐＨ保持がＡＢ００８９の電荷プロファイルに測定可能な影響を及ぼさなかったことが示される（図１８９及び表１８１）。

ｈＣＬＥＣ１２ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対するＡＢ００８９の親和性は、低ｐＨ保持の影響を受けなかった（図１９０及び表１８２）。活性タンパク質含有量の相違は観察されなかった。対照試料と低ｐＨ保持試料との間の結合親和性及び最大結合応答の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内であった。これは、ＡＢ００８９が低ｐＨ保持後も３つの標的全てに対して親和性を保持していることを示している。

低ｐＨ保持に供されたＡＢ００８９の効力及び対照試料の効力は、ＫＨＹＧ１－ＣＤ１６ａＶバイオアッセイでＣＬＥＣ１２Ａ＋ＨＬ－６０がん細胞に対して試験した。ＡＢ００８９の効力は、低ｐＨ保持ステップ後も変化しなかった（図１９１及び表１８３）。

完全に精製されたタンパク質の低ｐＨ保持曝露
ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖのＣＤＲＨ３

のＤＴモチーフがウイルス不活化ステップの間に異性化するか否かを調査するために、追加の低ｐＨ保持研究を実施した。次の手順を使用して、完全に精製されたＡＢ００８９材料から低ｐＨ保持材料を調製した。
１．ＡＢ００８９は、ＰｒｏＡ溶出を模倣するために０．１ｍグリシン、ｐＨ３．０を使用して１：１に希釈した
２．２ｍ酢酸でｐＨを３．５±０．１に調整した（低ｐＨ保持条件を模倣するため）
３．低ｐＨ保持は室温で６０分間行った。
４．１ｍのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いてｐＨを約７．５に中和した
５．ＡＢ００８９をＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液交換した

最終的な低ｐＨ保持材料（ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００４）を、生物学的アッセイのパネル：ＳＥＣ、ｃＩＥＦ、ＣＬＥＣ１２ＡへのＳＰＲ結合、ペプチドマップ、及び効力を使用して、対照（ＡＢ００８９ロットＡＢ００８９－００２）と比較した。分析ＳＥＣを実施して、低ｐＨ曝露の前後で、プロファイルまたは凝集体含有量に変化があったか否かを判断した（図１９２及び表１８４）。低ｐＨ保持後に、単量体％のプロファイルに変化は観察されなかった。

第１の低ｐＨ保持研究で分かるとおり、ＡＢ００８９対照と低ｐＨ保持ロットのｃＩＥＦプロファイルは、視覚的に非常に類似しており、酸性、主要、及び塩基性種の相対的な定量は、全てお互いの６％の範囲内である。したがって、低ｐＨ保持は、ＡＢ００８９の電荷プロファイルに有意な影響を及ぼさなかった（図１９３及び表１８５）。

ｈＣＬＥＣ１２ａに対するＡＢ００８９の親和性は、対照と比較して変化しなかった（図２８１及び表１８６）。対照試料と低ｐＨ保持試料との間の結合親和性及び最大結合応答の相違は、アッセイの実験的変動の範囲内である。これは、ＣＬＥＣ１２Ａ結合アームと標的抗原との結合に低ｐＨインキュベーションの影響がなかったことを示している。

ＣＬＥＣ１２Ａ＋ＨＬ－６０がん細胞に対する低ｐＨ保持後のＡＢ００８９の効力は、ＫＨＹＧ１－ＣＤ１６Ｖバイオアッセイで評価された。低ｐＨ保持と対照試料の効力との間に差は観察されなかった（図２８２及び表１８７）。

低ｐＨ保持がＣＤＲの修飾（改変）に変化を誘導したか否かを判断するために、対照試料と低ｐＨ保持試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピングによって分析した。ペプチドマップデータに基づくと、ＡＢ００８９の全てのＣＤＲは、低ｐＨ保持の間の修飾（改変）に耐性である（表１８８）。ピーク形状の手動検査に基づいて、アスパラギン酸の異性化の証拠は観察されなかった。

まとめると、これらの結果は、ＡＢ００８９が最適化されたＣＭＣプロファイルを備えたＡＢ０１９２の改良バージョンであることを示している。ＡＢ００８９の分子フォーマット及び構造は、ＡＭＬを治療するためにＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａを同時に係合する新しい多重特異性治療法の概念的要件を満たしている。ＡＢ００８９は強力であり、かついかなるストレス下でも観察される配列のライアビリティまたは重要な翻訳後修飾のない、好ましい開発可能性プロファイルを有する。ＡＢ００８９は、テポジタマブ（Ｍｅｒｕｓ）と同様にＣＬＥＣ１２ａのエピトープに結合する。

実施例１８．ＡＢ００８９細胞毒性及び作用機序
目的
ＡＢ００８９の作用機序を特徴付けるために、生理学的に関連する条件を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞ベースのアッセイでＡＢ００８９の活性を測定する。

試験デザイン
ＡＢ００８９の主要な作用機序は、ヒトＮＫ細胞及びＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞を用いたｉｎｖｉｔｒｏアッセイシステムを使用して試験された。ＮＫ細胞を介した細胞溶解以外の他のエフェクター機能もＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞と組み合わせて、ＡＢ００８９の追加の作用機序を試験した。マクロファージは、ＡＤＣＰアッセイのエフェクター細胞であり、ＣＤＣ活性を試験するための補体の供給源としてヒト血清を使用した。

材料及び方法
初代細胞及び細胞株
ヒトがん細胞株は、研究用セルバンクから入手した。以下の細胞株（品目番号；供給業者）を使用した：ＰＬ２１（ＡＣＣ－５３６；ＤＳＭＺ）及びＨＬ６０（ＣＣＬ－２４０；ＡＴＣＣ）。

ヒトの血液は、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｐｅｃｉａｌｔｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２２５－１１－０４）から入手した。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によって単離し、ＮＫ細胞は磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌカタログ番号１７９５５）による負の枯渇を使用して精製した。ＰＢＭＣからのＮＫ細胞の精製については、製造業者の指示に従った。凍結ＮＫ細胞は、ＢｉｏＩＶＴＨＵＭＡＮ－ＨＬ６５－Ｕ－２００４２９から購入し、ＣＤ１４＋単球は、ＢｉｏＩＶＴ（ＨＭＮ３７０６５２、ＨＭＮ３７０６５３、ＨＭＮ３７０６５４）から入手し、凍結ＰＢＭＣは社内で精製し（上記を参照）、後で使用するために凍結した。

細胞培養材料
以下の品目（供給業者；品目番号）を使用した：ＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ；１００４０ＣＶ）、ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；１００３１ＣＶ）、熱不活性化ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１６１４０－０７１）、ＧｌｕｔａＭａｘＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；３５０５０－０６１）、ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１５１４５０－１２２）、２－メルカプトエタノール（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；０２１９４７０５）、ＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；２００－０２）、ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｃ３４５５４）、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｃ３４５５７）、ｒｈＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；２１６－ＭＣ／ＣＦ），ＴｒｙｐＬＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１２６０４－０１３）、ＢＦＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；４２０６０１）、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；４２０７０１）、及びヒト血清（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；Ｓ１７６４－５Ｘ１ＭＬ）。

アッセイ材料
以下の品目（供給業者；品目番号）を使用した：Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＡｌｆａＡｅｓａｒ；Ｊ６７５０２）、ＢＡＴＤＡ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｃ１３６－１００）、ＴＣ丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３７９９）、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｃ１３５－１００）、ＤＥＬＦＩＡイエローマイクロプレート９６ウェル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ＡＡＡＮＤ－０００１）、固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；４２０８０１）、ＺｏｍｂｉｅＮＩＲ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；７７１８４）、及び抗ＭＨＣクラスＩクローンＷ６／３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＨＬＡ－Ｃ１）。

以下の試験物質（説明）を使用した：ＡＢ０２３７（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を有するＣＬＥＣ１２Ａ標的ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びｓｃＦｖＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１６０２））、ＡＢ０３００（ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡＰＧ変異を有するＡＢ０２３７）、ＡＢ００３７ｍＡｂ（ヒト化１６０２抗－ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、ＡＢ００８９（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣｌＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）及びｓｃＦｖＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１７３９））、ＡＢ０３０５ｍＡｂ（ヒト化１７３９抗ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、ＡＢ０１９２（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びｓｃＦｖＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１７９７））、ＡＢ０３０６ｍＡｂ（ヒト化１７９７抗ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、及びＦ３’－パリビズマブ（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴う非標的ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びパリビズマブからのｓｃＦｖ結合ドメイン）。

以下の機器（シリアル番号）を使用した：ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ（２ＡＦＣ２２８２７１１１９）、ＢＤＣｅｌｅｓｔａ（Ｈ６６０３４４０００８５）、ＢＤＣｅｌｅｓｔａ（Ｈ６６０３４４００１６０）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘｉ３ｘ（３６３７０４２２６）、及びＳｐｅｃｔｒａｍａｘｉ３ｘ（３６３７０３６３８）。

試薬の調製
ＲＰＭＩ初代細胞培養培地は、ＲＰＭＩ－１６４０から開始して調製した。１０％ＨＩ－ＦＢＳ、１ｘＧｌｕｔａＭａｘ、１ｘｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、及び５０μＭの２－メルカプトエタノールを完全培地用に添加した。ＲＰＭＩ細胞培養培地は、ＲＰＭＩ－１６４０から始めて調製した。１０％ＨＩ－ＦＢＳ、１ｘＧｌｕｔａＭａｘ、及び１ｘｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）を、完全培地用に追加した。１ｘＨＢＳは、１部の５ｘＨＢＳを４部のＤＩ水に希釈することによって調製した。溶液は使用前に滅菌濾過した。

ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイ
標的細胞の標識：
簡単に説明すると、ＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞をペレット化し、１ｘＨＢＳで洗浄した。標的細胞は、予熱したＲＰＭＩ初代細胞培養培地に、１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＢＡＴＤＡ試薬（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’－テルピリジン－６，６’’－ジカルボキシレート）を細胞懸濁液に１：４００希釈した。細胞を混合し、５％ＣＯ_２を用いて３７℃で１５分間インキュベートした。標識された標的細胞を１ｘＨＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ初代細胞培養培地中で５ｘ１０^４細胞／ｍＬで再懸濁した。

アッセイプレートの準備：
休止したヒトＮＫ細胞を培養物から除去し、ペレット化し、細胞をＲＰＭＩ初代細胞培養培地中に０．５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。４倍の試験物質を、ＲＰＭＩ初代細胞培養培地で調製した。丸底ＴＣ９６ウェルプレートに、１００μｌの標識された標的細胞、５０μｌの４ｘＴｒｉＮＫＥＴ／ｍＡｂ、及び５０μｌのエフェクター細胞を加えた。バックグラウンド用の対照ウェルは、標識された標的細胞をペレット化することによって調製し、１００μｌのＲＰＭＩ初代細胞培養培地を含む１００μｌの上清を、バックグラウンドウェルに添加した。自発的放出ウェルは、１００μｌのＲＰＭＩ初代細胞培養培地を含むウェルに１００μｌの標識された標的細胞を加えることによって調製した。最大放出ウェルは、８０μｌのＲＰＭＩ初代細胞培養培地及び２０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶液を含むウェルに１００μｌの標識標的細胞を加えることによって調製した。アッセイプレートを３７℃で、５％ＣＯ_２で２～３時間インキュベートした。

アッセイプレートの読み取り：
アッセイプレートをインキュベーターから取り外し、プレートを遠心分離して細胞をペレット化した。２０μｌの上清を各ウェルから取り出し、清浄な９６ウェル黄色のＤＥＬＦＩＡアッセイプレートに移した。２００μｌの室温ユーロピウム溶液を、各ウェルに加え、そのプレートをプレートシェーカー上に２５０ＲＰＭで１５分間置いた。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘのＨＴＲＦカートリッジを使用して、次のＰＭＴ及び光学設定で読み取った。
●積分時間０．４ｍｓ
●励起時間０．０５ｍｓ
●パルス数１００
●測定遅延０．２５ｍｓ
●読み取り高さ２．３６ｍｍ

データ分析：
バックグラウンド試料の平均を計算して、全ての試料から差し引いた。特異的溶解は以下のように計算された：
特異的溶解％＝（試料－自発）／（最大－自発）＊１００％

ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈＰａｄ７．０または８．０を使用して、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させた。

ＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａ活性化アッセイ
プレートのセットアップ：
ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞株を、培養物から収穫し、そして細胞を２×１０^６細胞／ｍＬに調整した。試験物質は培養培地で希釈した。休息ＮＫ細胞またはＰＢＭＣを培養物から回収し、細胞を洗浄し、そして２－４ｘ１０^６細胞／ｍＬで培養培地中に再懸濁した。ＩＬ－２及びフルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａを、活性化培養のためにＮＫ細胞またはＰＢＭＣに添加した。ブレフェルジン－Ａ（ＢＦＡ）及びモネンシンを培養培地に希釈して、細胞内サイトカイン染色のために細胞からのタンパク質輸送をブロックした。９６ウェルプレートに、５０μｌの腫瘍標的、ｍＡｂｓ／ＴｒｉＮＫＥＴｓ、ＢＦＡ／モネンシン、及びＮＫ細胞を加えて総培養量を２００μｌにした。プレートを４時間培養した後、ＦＡＣＳ分析用に試料を調製した。

ＦＡＣＳ用の試料の調製：
４時間の活性化培養後、表１８９に記載されているフルオロフォア結合抗体を使用したフローサイトメトリーによる分析のために細胞を調製した。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ染色は、ＮＫ細胞の活性化を評価するために、ＣＤ３－ＣＤ５６＋集団で分析した。

目的の細胞は、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットを使用して特定し適切な形状のゲートを、細胞の周囲に描画した。ゲーティング細胞内で、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａプロットを表示することにより、ダブレット細胞を除去した。単一細胞集団内で、生細胞をゲーティングした。生細胞内では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－として特定された。ＣＤ１０７ａの脱顆粒及び細胞内（ＩＣ）ＩＦＮγは、ＮＫ細胞集団内で分析された。

ＡＤＣＰアッセイ
初代ヒトＣＤ１４＋単球はＢｉｏＩＶＴから入手する。単球は、陰性選択により末梢血から単離し、収率は９３％超の純度であった。単球を５０ｎｇ／ｍｌｒｈＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステム）で６日間培養し、２日ごとにｒｈＭ－ＣＳＦを補充する。６日後、マクロファージを、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）で培養フラスコ（複数可）から取り外し、ＣｅｌｌｔｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（２μＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。標的細胞を、ＣＦＳＥ（２μＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。丸底９６ウェルプレートで、標的細胞（１ｘ１０^４細胞／ウェル）を最初に、示された濃度の各試験物質と３０分間インキュベートする。表示したマクロファージ（８ｘ１０^４細胞／ウェル）を次に、適切なウェルに加え、プレートをさらに２時間インキュベートした。細胞は、ライブ／デッド（生／死）の識別のためにＺｏｍｂｉｅＮＩＲ色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、固定した。食作用は、ＦｌｏｗＪｏ１０．５．３のデータ分析を使用して、ＣｅｌｅｓｔａＨＴＳ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量する。データは、単一の生細胞でゲーディングして、食作用％は次のように計算した：食作用％＝１００ｘ（ＣＦＳＥ＋，ＣｅｌｌｔｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ＋細胞のカウント）／（ＣＦＳＥ＋細胞のカウント）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して、データをグラフ化して分析した。

ＣＤＣアッセイ
ＣＤＣは、ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイで測定した。ＰＬ２１がん細胞標的は、ＢＡＴＤＡ標識試薬で標識した。次に、標識された標的細胞を、示された濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂとともに３０分間インキュベートして、オプソニン化を可能にした。ヒト血清を、５％の最終濃度に添加した。次に、プレートを６０分間インキュベートした後、アッセイを終了した。２０μｌの培養上清をＤＥＬＦＩＡイエロープレートに移した。１ウェルあたり２００μｌのユーロピウム溶液を加え、暗所で振とうしながら室温で１５分間インキュベートした。次に、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで蛍光を測定した。

結果及び考察
ＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞の休止ヒトＮＫ細胞溶解
ＡＢ００８９及びＡＢ０１９２の活性は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａ＋ＡＭＬ株ＰＬ２１またはＨＬ６０のいずれかとの共培養において、健康なドナー由来の休止した初代ヒトＮＫ細胞を使用して特徴付けられた。ＡＢ００８９及びＡＢ０１９２は、それぞれ親のｈＩｇＧ１ｍＡｂＡＢ０３０５及びＡＢ０３０６と比較した。図１９４は、ＡＢ００８９の存在下での休止ヒトＮＫ細胞によるＰＬ２１白血病標的細胞溶解の代表的なプロットを示している。ＡＢ００８９は、親ｍＡｂＡＢ０３０５よりも強力で、かつより高い最大溶解に達した、用量依存的な細胞溶解増強活性を示した。合計６人のドナーに由来するＮＫ細胞を使用した同様の細胞毒性アッセイの結果を、表１９０にまとめている。アッセイ全体で、ＰＬ２１標的細胞のＮＫ細胞溶解を増強するＡＢ００８９の効力は、平均ＥＣ５０値０．２５±０．２４ｎＭであった。

図１９５は、ＡＢ００８９の存在下での休止初代ヒトＮＫ細胞によるＨＬ６０白血病標的細胞溶解の代表的なプロットを示している。この場合も、ＡＢ００８９は、その親ｍＡｂＡＢ０３０５よりも、全体としてより強力な用量依存的溶解、及びより高い特異的溶解を示した。４人の健康なドナーに由来するＮＫ細胞を使用したアッセイの結果は、表１９１に要約されているように、０．０９±０．０５ｎＭという平均ＥＣ５０をもたらした。

図１９６は、ＡＢ０１９２の存在下での休止ヒトＮＫ細胞によるＰＬ２１白血病標的細胞溶解の代表的なプロットを示している。ＡＢ０１９２は、親ｍＡｂＡＢ０３０６よりも強力で、かつより高い最大溶解に達した、用量依存的な細胞溶解増強活性を示した。合計６人の健康なドナーに由来するＮＫ細胞を使用した同様の細胞毒性アッセイの結果を、表１９２にまとめている。アッセイ全体で、ＰＬ２１標的細胞のＮＫ細胞溶解を増強するＡＢ０１９２の効力は、平均ＥＣ５０値０．６１±０．６０ｎＭであった。

図１９７は、ＡＢ０１９２の存在下での休止ヒトＮＫ細胞によるＨＬ６０白血病標的細胞溶解の代表的なプロットを示している。この場合も、ＡＢ０１９２は、その親ｍＡｂよりも、全体としてより強力な用量依存的溶解、及びより高い特異的溶解を示した。４人の健康なドナーに由来するＮＫ細胞を使用したアッセイの結果、表１９３に要約されているように、０．３０±０．２７ｎＭという平均ＥＣ５０がもたらされた。

可溶性ＭＩＣ－Ａの存在下でのＡＢ００８９活性
本発明者らは、また、可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの存在下でＡＢ００８９の活性を試験した。これらのアッセイでは、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣ－Ａの組換えバージョンを使用することを選択した。ＭＩＣ－Ａは、がんの適応症全体で幅広い発現を示し、細胞表面から脱落して患者の血清に蓄積することが公知である。可溶性ＭＩＣ－Ａ－Ｆｃを、がん患者に見られる生理学的に関連する血清濃度である２０ｎｇ／ｍＬでＮＫ細胞細胞溶解アッセイシステムに添加した。図１９８は、可溶性ＭＩＣ－Ａの非存在下及び存在下でのＰＬ２１標的細胞に対する初代ＮＫ細胞細胞溶解アッセイにおけるＡＢ００８９及びその親ｍＡｂＡＢ０３０５の用量反応曲線を示している。ＭＩＣ－Ａの添加は、ＡＢ００８９によって達成される効力または最大溶解に影響を与えなかった（ＥＣ５０及び最大溶解値については表１９４を参照）。

ＮＫ細胞ＩＦＮγ 産生及び脱顆粒のＡＢ００８９刺激
標的細胞の直接溶解に加えて、ＮＫ細胞はまた、活性化時にサイトカインも産生する。したがって、本発明者らは、標的細胞の溶解に加えて、ＮＫ活性化の代替の読み出しを調べたかった。本発明者らは、ＡＢ００８９の存在下でＣＬＥＣ１２Ａ＋ＡＭＬ細胞と共培養したＮＫ細胞からのＩＦＮγ産生及びＣＤ１０７ａの脱顆粒を分析することを選んだ。ＰＬ２１及びＨＬ６０標的細胞との共培養におけるＰＢＭＣ内の休止ＮＫ細胞は、４時間後にＣＤ１０７ａ脱顆粒または細胞内ＩＦＮγ蓄積の基本的な誘導をほとんど示さなかった（それぞれ図１９９及び図２００）。共培養へのＡＢ００８９の添加は、用量反応的に脱顆粒及びＩＦＮγ産生の強力な誘導をもたらした。対照的に、親ｍＡｂＡＢ０３０５もＣＬＥＣ１２Ａを標的としないＴｒｉＮＫＥＴＦ３’－パリビズマブも、ＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮγ＋ＮＫ細胞の堅調な増大を示さなかった。ＰＬ２１またはＨＬ６０標的細胞との共培養において、３人の独立したＰＢＭＣドナーを用いてアッセイを実施した；その結果はそれぞれ表１９５と１９６にまとめられている。

ＡＢ００８９はＡＤＣＰ活性を誘発する
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃドメインは、３つの異なるタイプのエフェクター機能を媒介し得る。

Ｆｃを介したエフェクター機能のタイプの１つはＡＤＣＣであり、これはＮＫ細胞へのＣＤ１６の係合によって実行される；ＮＫ細胞刺激は、ＡＢ００８９について広く特徴付けられている。第２のＦｃを介したエフェクター機能はＡＤＣＰであり、マクロファージが抗体でコーティングされた細胞を攻撃して飲み込む。ＡＢ００８９及び代替のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴについて、本発明者らは、オプソニン化された標的細胞のＡＤＣＰを誘導する能力を評価したかった。エフェクター細胞として、精製されたＣＤ１４＋単球をＭ－ＣＳＦとともに培養することから得られたＭ０マクロファージを用いたｉｎｖｉｔｒｏアッセイシステムを利用した。ＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥ色素で標識し、試験物質でオプソニン化して、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔで標識されたＭ０マクロファージと共培養した。食作用は、フローサイトメトリーによって、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ＋ＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥ＋（二重陽性）事象として分析された。

ＡＢ００８９及びその他のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０２３７及びＡＢ０１９２は全て、Ｍ０マクロファージによるＰＬ２１ＡＭＬ細胞の食作用を増強した。各ＴｒｉＮＫＥＴの親ｍＡｂも全て、オプソニン化された標的細胞のＭ０マクロファージ食作用を誘導する能力を示したが、それぞれの対応するＴｒｉＮＫＥＴと比較して最大レベルは低くなった（図２０１）。サイレンスＦｃγ受容体結合へのＣＨ２ドメインにおける変異を保持するＡＢ０２３７ｓｉは、陰性対照として機能した予想通り、ＡＢ０２３７ｓｉは、オプソニン化された標的細胞のＡＤＣＰを媒介できなかった。３人の異なるドナーに由来するＭ０マクロファージを使用した結果を、表１９７に要約する。

ＡＢ００８９にはＣＤＣ活性がない
ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体の第３のエフェクター機能は、補体カスケードの開始であり、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を引き起こす。ＡＢ００８９はヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを使用して構築されている；したがって、本発明者らは、ＣＤＣ活動を刺激するＡＢ００８９の能力を理解したかった。ＰＬ２１細胞を標的として、及び５％ヒト血清を補体因子の供給源として使用した。ＡＢ００８９もその親ｍＡｂＡＢ０３０５も、補体を介したＰＬ２１ＡＭＬ細胞の殺滅を刺激しなかった（図２０２）。対照的に、ＭＨＣクラスＩ（クローンＷ６／３２））に対する陽性対照抗体は、ヒト血清の存在下でＰＬ２１標的細胞の用量依存的な溶解を示し、血清が活性な補体因子を有することを裏付けている。細胞の特性評価分析によって、ＰＬ２１標的細胞上のＣＬＥＣ１２Ａ及びＭＨＣクラスＩの同様の発現レベルが示された。

ＡＢ００８９は、生理学的に関連するさまざまな状況で強力な活性を示した。ＡＢ００８９は、休止状態の初代ヒトＮＫ細胞を使用したＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞殺滅アッセイで最初に試験した。本発明者らは、臨床でＣＬＥＣ１２Ａを過剰発現していることを示している、ＡＭＬ由来のＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞の殺滅を試験することを選択した。これらの実験では、代表的なＡＭＬ細胞株としてＨＬ６０及びＰＬ２１を選択した。

ＡＢ００８９は、両方の標的細胞株の初代ＮＫ細胞細胞溶解を増強し、細胞溶解の増強においてその親ｈＩｇＧ１抗体を上回って機能した。また、ＡＢ００８９の活性に対する可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの影響を調べ、生理学的レベルの可溶性ＭＩＣ－Ａ－Ｆｃが細胞溶解においてＡＢ００８９の活性を変化させないことを発見した。

細胞溶解に加えて、ＡＢ００８９はまた、ＣＬＥＣ１２Ａ＋標的細胞と共培養されたＮＫ細胞からのサイトカイン産生も刺激した。ＡＢ００８９は、ヒトＰＢＭＣとＰＬ２１及びＨＬ６０ＡＭＬ細胞との共培養において、ＩＦＮγの細胞内蓄積及びＮＫ細胞の脱顆粒を増強した。ＡＢ００８９によるＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａ誘導のＥＣ５０値は、細胞溶解アッセイで生成されたＥＣ５０値と一致していた。

最後に、ＡＢ００８９の追加の作用機序を調査した。ＡＢ００８９は、マクロファージと係合してＡＢ００８９オプソニン化標的細胞のＡＤＣＰを媒介することが実証された。対照的に、ＡＢ００８９は、ＡＢ００８９オプソニン化標的細胞のＣＤＣを媒介しない。

ＡＢ００８９は、ＮＫ細胞及びマクロファージなどのさまざまなエフェクターを介してＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞に対して強力な活性を有することが実証された。さらに、ＡＢ００８９の活性は、生理学的に関連する濃度の可溶性ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣ－Ａの存在下で維持された。

実施例１９．ＣＬＥＣ１２Ａ＋細胞株及び初代ＡＭＬへのＡＢ００８９結合
目的
ヒトＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞へのＡＢ００８９の結合を測定する。ＡＢ００８９とのインキュベーション後のＣＬＥＣ１２Ａ表面保持を定量する。初代ＡＭＬ患者試料へのＡＢ００８９の結合を示し、ＣＬＥＣ１２Ａ発現パターンと比較する。

試験デザイン
ＣＬＥＣ１２Ａ表面発現が陽性の代表的な細胞株をＡＢ００８９細胞結合の特性評価に使用した。初代ＡＭＬ患者試料は、ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏａｒｒａｙ及びＢｉｏＩＶＴから入手した。ＡＢ００８９及び親ｍＡｂＡＢ０３０５の結合を、市販のＣＬＥＣ１２Ａ抗体と比較した。

材料及び方法
初代細胞及び細胞株
ヒトがん細胞株は、研究用セルバンクから入手した。以下の細胞株（品目番号；供給業者）を使用した：ＰＬ２１（ＡＣＣ－５３６；ＤＳＭＺ）、ＨＬ６０（ＣＣＬ－２４０；ＡＴＣＣ）、Ｂａ／Ｆ３－ｈＣＬＥＣ１２Ａ（自社製）及びＢａ／Ｆ３（ＤＳＭＺＡＣＣ－３００から入手可能）。

ヒトＣＬＥＣ１２Ａは、レトロウイルス形質導入によってＢａ／Ｆ３親細胞に導入した。

細胞培養材料
以下の品目（供給業者；品目番号）を使用した：ＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ；１００４０ＣＶ）、ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；１００３１ＣＶ）、熱不活性化ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１６１４０－０７１）、ＧｌｕｔａＭａｘＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；３５０５０－０６１）、ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１５１４５０－１２２）、及び２－メルカプトエタノール（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；０２１９４７０５）。

アッセイ材料
以下の品目（供給業者；品目番号）を使用した：Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＡｌｆａＡｅｓａｒ；Ｊ６７５０２）、ＢＡＴＤＡ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｃ１３６－１００）、ＴＣ丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３７９９）、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｃ１３５－１００）、及びＤＥＬＦＩＡイエローマイクロプレート９６ウェル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ＡＡＡＮＤ－０００１）。

以下の試験物質（説明）を使用した：ＡＢ０２３７（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣｌＥＣ１２Ａ－標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びｓｃＦｖＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１６０２））、ＡＢ０３００（ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡＰＧ変異を伴うＡＢ０２３７）、ＡＢ０２３７－デッド（Ｄｅａｄ）－２Ｄ（ＡＢ０２３７、結合を除去するためにＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが変異）、ＡＢ００３７ｍＡｂ（ヒト化１６０２抗ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、ＡＢ００８９（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）及びｓｃＦｖＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１７３９））、ＡＢ０３０５ｍＡｂ（ヒト化１７３９抗ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、ＡＢ０１９２（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣｌＥＣ１２Ａ－標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びｓｃＦｖのＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（１７９７））、ＡＢ０３０６ｍＡｂ（ヒト化１７９７抗ＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ）、ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ｈ６Ｅ７（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を伴うＣＬＥＣ１２Ａ－標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、ならびにＦａｂＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ６Ｅ７））及びｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ（ＦａｂＮＫＧ２Ｄ結合を備えたＣｌＥＣ１２Ａ－標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９）、及びＦａｂＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン（ＭｅｒｕｓＣＬＬ－１バインダー））。

以下の機器（シリアル番号）を使用した：ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ（２ＡＦＣ２２８２７１１１９）、ＢＤＣｅｌｅｓｔａ（Ｈ６６０３４４０００８５）、及びＢＤＣｅｌｅｓｔａ（Ｈ６６０３４４００１６０）。

結合及び表面結合の検出ｍＡｂ／ＴｒｉＮＫＥＴ
ＦＡＣＳ染色のために、１ウェルあたり１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中で１：２０００希釈のライブ／デッド（生／死）色素中で１５分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈し、希釈したＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを含む５０μｌを細胞に添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、結合したＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを検出するために１ウェルあたり５０μｌを添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。５０μｌの固定緩衝液を各ウェルに加え、細胞を室温で１０分間インキュベートした。細胞を、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＳＮ＃Ｈ６６０３４４０００８５またはＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＳＮ＃Ｈ６６０３４４００１６０で分析するために、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。目的の細胞を、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットを使用して識別して適切な形状のゲートを、細胞の周囲に描画した。ゲーティングされた細胞内で、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａプロットを表示することにより、ダブレット細胞を除去した。単一細胞集団内で、生細胞をゲーティングした。ライブゲート内で、各試料と二次のみの対照の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。バックグラウンド倍数（ＦＯＢ）は、二次のみのバックグラウンドＭＦＩに対する試験物質ＭＦＩの比率として計算した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０を使用して、データを４パラメーターの非線形回帰モデルに適合させた。

表面保持アッセイ
ＦＡＣＳ染色のために、１ウェルあたり１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに重複して播種した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。試験物質を４０ｎＭに希釈し、重複したプレートのそれぞれに加えた。最初のプレートを氷上で２時間インキュベートし、第２のプレートを３７℃に２時間移動した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞をＰＢＳ中で１：２０００希釈のライブ／デッド色素中で１５分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、結合したＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを検出するために１ウェルあたり５０μｌを添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。５０μｌの固定緩衝液を各ウェルに加え、細胞を室温で１０分間インキュベートした。細胞を、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＳＮ＃Ｈ６６０３４４０００８５またはＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＳＮ＃Ｈ６６０３４４００１６０で分析するために、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。目的の細胞は、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットを使用して識別して、適切な形状のゲートを、細胞の周囲に描画した。ゲート細胞内で、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａプロットを表示することにより、ダブレット細胞を削除した。単一細胞集団内で、生細胞をゲーティングした。ライブゲート内で、各試料のＭＦＩを計算した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ＭＦＩは、全ての試験物質ＭＦＩから差し引いた。次いで、表面保持は次のように計算した：
表面保持％＝（２時間３７℃ ＭＦＩ／２時間の氷ＭＦＩ）＊１００

初代ＡＭＬ試料におけるＡＢ００８９結合の分析
凍結したＡＭＬ患者試料を３７℃で解凍し、結合アッセイで直ちに使用した。試験物質、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照及び市販試薬の抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体クローン５０Ｃ１は、ＢｉｏｔｉｕｍＭｉｘ－ｎ－ＳｔａｉｎＣＦ５６８ラベリングキットを使用してラベリングした。製造業者の指示に従った。表１９８及び１９９に記載されているように、ＡＭＬ試料を抗体のカクテルで染色した。ＣｙｔＫｉｃｋＭａｘオートサンプラーを備えたＡｔｔｕｎｅＮｘＴサイトメーターを使用して試料を分析した。ＦｌｏｗＪｏＸソフトウェアを使用して生データを分析した。

結果及び考察
ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞株に結合する
ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ及びその親ｍＡｂの結合は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現する３つの細胞株を使用して試験した（図２０３）。ＰＬ２１及びＨＬ６０は内因性ＣＬＥＣ１２Ａ発現を伴うヒトＡＭＬ細胞株であるのに対し、マウスＢａ／Ｆ３細胞はヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現するように設計されている。

コンパレーターとして、パブリックドメインで知られているＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（ｈ６Ｅ７）及びＭｅｒｕｓ（ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓ）のＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインを使用して２つのツールＴｒｉＮＫＥＴを生成した。ＦａｂＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメインを有するデュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦａｂＮＫＧ２ＤバインダーＡ４９と対になった。デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）ＴｒｉＮＫＥＴｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ｈ６Ｅ７は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈバインダーから誘導され、ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓは、Ｍｅｒｕｓバインダーから誘導される。

リードＴｒｉＮＫＥＴＡＢ００８９及び代替ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０２３７及びＡＢ０１９２は全て、ナノモルの効力でＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞に結合した（表４）。ＡＢ００８９は効力が低下したが、試験した３つの細胞株で親ｍＡｂＡＢ０３０５と比較して最大ＦＯＢに達した。ＡＢ０２３７は、その親ｍＡｂＡＢ００３７と匹敵する結合を示し、３つの細胞株全てで互いに２倍以内の効力値を示した。ＡＢ０２３７のバリアントＡＢ０２３７－Ｄｅａｄ２ＤならびにＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６結合ドメインにそれぞれ変異を有するＡＢ０３００は、ＡＢ０２３７と比較して同様の細胞結合を示した。対照的に、ＡＢ０１９２は、その親ｍＡｂＡＢ０３０６と比較して、効力の低下及び最大ＦＯＢを示した。

ツールＴｒｉＮＫＥＴと比較して、ＡＢ００８９は、ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓに匹敵する細胞負荷、及びｈｃＦＡＥ－Ａ４０．ｈ６Ｅ７よりも高い細胞負荷を示した。さらに、ＣＬＥＣ１２Ａ細胞株に結合するＡＢ０２３７は、ｈｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓよりも強力であり、効力はｈｃＦＡＥ－ｈ６Ｅ７と同等であった。全てのＥＣ５０結合効力及び最大ＦＯＢ結合を表２０１にまとめている。

ＣＬＥＣ１２Ａ－ＴｒｉＮＫＥＴ表面保持
抗体ライゲーション後のＣＬＥＣ１２Ａの内在化は文献に記載されている。この現象を利用して、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とする抗体薬物コンジュゲートが開発され、これは、標的細胞を殺滅するためにコンジュゲートされた薬物の内在化に依存している。ただし、ＴｒｉＮＫＥＴ活性には、ＣＬＥＣ１２Ａ＋がん細胞に対するＮＫ細胞の係合及びエフェクター活性を可能にするために、ＴｒｉＮＫＥＴとの複合体であるＣＬＥＣ１２Ａの細胞表面保持が必要である。ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴの存在下での細胞表面上のＣＬＥＣ１２Ａの保持をよりよく理解するために、本発明者らは、氷上でのインキュベーションと比較して、３７℃で２時間のインキュベーション後のＣＬＥＣ１２Ａ＋細胞株への各ＴｒｉＮＫＥＴ及び親ｍＡｂの飽和濃度の結合を調べた。

３７℃で２時間細胞に結合させた場合、細胞表面ＣＬＥＣ１２Ａの９０％以上が各ＴｒｉＮＫＥＴで保持された。図２０４は、ＨＬ６０及びＰＬ２１ＡＭＬ株におけるＡＢ００８９、ＡＢ０１９２、ＡＢ０２３７、及びそれらの親抗体の表面保持の例を示している。３つの独立した実験からのデータを表２０２に要約する。ＡＢ００８９は、他のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ及びそれらの親ｍＡｂと比較して、優れた表面保持を示すように見えた。

しかしながら、ＡＢ００８９は、ＡＢ０２３７と比較して氷上でのインキュベーション後に低い結合シグナルを示したが、３７℃で２時間のインキュベーション後に同様のシグナルを示し、ＡＢ００８９の表面保持値が膨らんだ可能性がある（図２０５）。それにもかかわらず、これらのデータは、平衡に達するためのＡＢ００８９の温度依存性結合を示唆しており、これは、反応速度論的結合データによって示唆される２段階結合機構に起因する可能性がある（実施例１７）。

対照的に、ＡＢ０１９２及びその親ｍＡｂＡＢ０３０６は、異なる親マウスｍＡｂに由来し、ＨＬ６０細胞及びＰＬ２１細胞で同様の表面保持を示した。これらのデータによって、ＣＬＥＣ１２Ａの表面保持が、一価に結合するか（Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴの場合のように）、二価に結合するか（ｍＡｂのように）、及び特定のバインダーのエピトープに依存し得ることが示される。

ＡＢ００８９は、ヒトＡＭＬ患者試料のＣＬＥＣ１２Ａに結合する
合計１０人のＡＭＬ患者由来の初代骨髄及びＰＢＭＣ試料を取得し（試料情報については表２００を参照）、初代ＡＭＬ細胞へのＡＢ００８９及びその親ｍＡｂＡＢ０３０５の結合を調べた。フルオロフォア標識試験物質ＡＢ００８９及びＡＢ０３０５の結合パターンを、市販の抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体クローン５０Ｃ１と比較した（Ｌａｈｏｕｄｅｔａｌ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１８２：７５８７－７５９４）。１０人のドナーのうちで、ＡＭＬ芽球ゲート内のＣＬＥＣ１２Ａ＋細胞の割合は約４０～９５％と広く変化した。ＣＬＥＣ１２Ａの発現及び観察された割合の変動に寄与し得る、さまざまなＦＡＢサブタイプからのＡＭＬ患者試料を分析した。

ＡＢ００８９及びＡＢ０３０５は、試験した１０例のＡＭＬ患者試料全体で抗ＣＬＥＣ１２Ａクローン５０Ｃ１に匹敵する結合パターンを示している（図２０６）。さらに芽球をゲーティングして、各試料からの白血病幹細胞が豊富なＣＤ３４＋ＣＤ３８－亜集団を検査した。繰り返すと、ＡＢ００８９及びＡＢ０３０５は、クローン５０Ｃ１としてＣＤ３４＋ＣＤ３８－芽球で同様に染色された（図２０７）。全体として、これらのデータは、ＡＢ００８９が初代ＡＭＬ芽球及びＬＳＣ用に強化されたＣＤ３４＋ＣＤ３８－サブセット上でＣＬＥＣ１２Ａに結合し得ることを裏付けた。

ＡＢ００８９及びその他のＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを異所的に発現するＢａ／Ｆ３細胞、ならびに内因性ＣＬＥＣ１２Ａを発現するＰＬ２１及びＨＬ６０ＡＭＬ細胞に対して、株をまたいで同様のナノモル効力で用量反応的に結合した。抗体ライゲーション後のＣＬＥＣ１２Ａ内在化に関する文献の報告にもかかわらず、ＡＢ００８９及び代替ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０２３７及びＡＢ０１９２は両方とも、ＨＬ６０及びＰＬ２１ＣＬＥＣ１２Ａ＋細胞株との２時間のインキュベーション後にＣＬＥＣ１２Ａの高い細胞表面保持を示した。最後に、ＡＢ００８９及びその親ｍＡｂＡＢ０３０５は、市販の試薬抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体クローン５０Ｃ１にバルクで、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８－芽球に対して、１０人のドナー由来の初代ＡＭＬ患者試料をまたいで同様に結合した。まとめると、これらのデータは、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞へのＡＢ００８９の強力な結合を支持しており、ＡＢ００８９が初代ＡＭＬ芽球に結合することを示している。

実施例２０．ＡＢ００８９ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴ
目的
この研究の目的は、ＣＬＥＣ１２ＡＴｒｉＮＫＥＴＡＢ０１９２の分子フォーマット、設計、構造、及び特性評価を説明することである。特に、この報告では、本発明者らは、ａ）ＡＢ０１９２の分子フォーマット及び設計について説明し、ｂ）ＡＢ０１９２の発現及び精製に関する情報を提供し、ｃ）分子の基本的な生化学的及び生物物理学的特性を説明し、ｄ）組換えヒト標的体に対するＡＢ０１９２の親和性を決定し（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａ）、ｅ）ヒトＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子及びＡＭＬがん細胞株へのＡＢ０１９２の結合を示し、ｆ）ＡＢ０１９２の選択性を示し、ｇ）ＡＭＬがん細胞の殺滅におけるＡＢ０１９２の効力を決定し、ｈ）結合エピトープを評価し、ｉ）ＦｃγＲ及びＦｃＲｎへの結合を評価し、ＩｇＧ１ｍＡｂ対照と比較し、ｊ）加速安定性、強制分解、及び製造可能性を含む開発可能性研究におけるＡＢ０１９２の挙動を説明する。

研究デザイン
マウスの抗ヒトＣＬＥＣ１２ＡｍＡｂ（９Ｆ１１．Ｂ７）は、マウスの免疫化によって発見された。９Ｆ１１．Ｂ７をヒト化し、ｓｃＦｖに変換し、Ａ４９Ｍ－ＩＮＫＧ２ＤＦａｂ結合アームと組み合わせてＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＢ０１９２）を生成した。ＡＢ０１９２は、組換えのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）のｈＣＬＥＣ１２Ａへの結合、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する同質遺伝子細胞及びがん細胞への結合、ならびにＣＬＥＣ１２Ａ＋ＡＭＬがん細胞に対する分子の効力によって評価した。熱安定性（ＤＳＣ）、疎水性（ＨＩＣ）、及びｐＩ（ｃＩＥＦ）を含むＡＢ０１９２の生物物理学的及び生化学的特性を決定した。結合の特異性は、ＰＳＲ、目的の標的を発現していない細胞への結合、及びＨｕＰｒｏｔ（商標）アレイによって評価した。ＡＢ０１９２は、２つの異なる哺乳類細胞株（Ｅｘｐｉ２９３及びＥｘｐｉＣＨＯ）で発現して、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘ２ステッププラットフォーム精製法を使用して精製した。ＡＢ０１９２、例としてはＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６ａ（Ｖ１５８及びＦ１５８）、Ｆｃγ受容体の拡張パネル（ＣＤ３２ａ（Ｈ１３１及びＲ１３１）、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ｂ、カニクイザルＣＤ１６、ヒト及びカニクイザルのＣＤ６４）、及びＦｃＲｎ（ヒト及びカニクイザル）の結合特性は完全に特徴付けられた。結合エピトープは、Ｍｅｒｕｓ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＣＬＥＣ１２Ａ結合分子を用いたビニング実験で特徴付けた。最後に、ＡＢ０１９２は、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘプラットフォーム製剤（２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ６．０）及び２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０緩衝液中での加速（４０℃）安定性、強制分解（長期ｐＨ５、ｐＨ８のストレス、強制酸化）、及び製造可能性（凍結／解凍，攪拌、低ｐＨ保持）を含む、フルの開発可能性パネルで評価した。

材料及び方法
ＡＢ０１９２の作成及び特性評価に使用される方法は、実施例１７で使用される方法と同様である。

試験物質
ＡＢ０１９２－００２、（ベンチリングレコード名ＡＢ０１９２）、Ｅｘｐｉ２９３（ロットＡＢ０１９２－００２）で発現されたヒト化ＴｒｉＮＫＥＴ。

ＡＢ０１９２－００５、（ベンチリングレコード名ＡＢ０１９２）、ＥｘｐｉＣＨＯ（ロットＡＢ０１９２－００５）で発現されたヒト化ＴｒｉＮＫＥＴ。
タンパク質試薬

結果
ＡＢ０１９２ＴｒｉＮＫＥＴの発見
ハイブリドーマサブクローン９Ｆ１１．Ｂ７は、ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ）で実施した、組換えヒトＣＬＥＣ１２Ａ－ｈｉｓを用いたＢＡＬＢ／ｃマウス系統の免疫を通じて発見した。

マウス９Ｆ１１．Ｂ７は、組換えＣＬＥＣ１２Ａまたは細胞表面発現標的に対する親和性を失うことなく、マウスＣＤＲを適切なヒトフレームワーク（ＶＨ３－３０＊０２及びＶＫ１－３３）に移植することによってヒト化された（図２０８）。ＣＤＲアーキテクチャを維持するために、７つのマウス逆突然変異を導入した。ヒト化９Ｆ１１．Ｂ７ｍＡｂをｓｃＦｖに変換し、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ａ４９Ｍ－ＩＦａｂと対合させて、Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＢ００１９２）を生成した。このＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＬＥＣ１２ＡプログラムＡＢ０１９２の候補として広く特徴付けられ、指定された。

分子フォーマット及びデザイン
ＡＢ０１９２は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するがん細胞に対してＮＫ細胞及びＴ細胞の活性をリダイレクトするヘテロ二量体の三機能性抗体である。ＡＢ０１９２は、３つの鎖：鎖Ｈ、鎖Ｌ、及び鎖Ｓを含む。ＡＢ０１９２分子の概略図は、図２０９に示されている。鎖Ｈは、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の強力なアゴニストでありながら、親和性が低いために選択されたＡ４９Ｍ－Ｉの重鎖である。Ｍ－Ｉ変異は、酸化に敏感であり、そのためライアビリティを示し得るＣＤＲＨ３のＭｅｔ１０２残基を置き換えるために導入された。鎖Ｌは、抗ＮＫＧ２Ｄ標的化抗体Ａ４９Ｍ－Ｉの軽鎖である。鎖Ｓには、ＡＭＬがん細胞上のＣＬＥＣ１２Ａに高い親和性で結合するｓｃＦｖが含まれている。ｓｃＦｖドメインとＦａｂドメインはどちらも、ＣＨ２ドメインにネイティブの未修飾配列を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合しており、抗体はＦｃ受容体に結合する。両方の鎖は、２つのＦｃ単量体の安定したヘテロ二量体化を確実にするために導入されたＣＨ３ドメインにいくつかの変異を有する。ＡＢ０１９２のＩｇＧ１Ｆｃには、このような変異が７つある：鎖Ｈに３つの変異（Ｋ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、Ｙ３４９Ｃ）、鎖Ｓに４つの変異（Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ及びＳ３５４Ｃ）。これらの変異のうちの２つは、鎖Ｈと鎖Ｓ（ＥＵの命名法）の間の安定化Ｓ－Ｓ架橋（Ｙ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃ）の形成に関与している。鎖ＳのｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬ配向）は、Ｓ－Ｓ架橋（（Ｈ４４）Ｃ及び（Ｌ１００）Ｃ、Ｃｈｏｔｈｉａ命名法）を導入する２つの変異によって安定化される。鎖Ｓには、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間に（Ｇ４Ｓ）４非免疫原性リンカーも含まれている。ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするｓｃＦｖのアミノ酸配列は、ハイブリドーマ（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ）から得られたヒト化９Ｆ１１．Ｂ７抗体の配列に基づいている。ＮＫＧ２ＤＦａｂのアミノ酸配列は、ヒト酵母ディスプレイ技術（Ａｄｉｍａｂ，Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）を使用して得られた完全ヒト抗体Ａ４９Ｍ－Ｉに基づいている。

ヘテロ二量体化変異の説明
ＥＵの番号付け規則を使用して、Ｆｃのアミノ酸残基に注釈を付けた。

鎖Ｈには、以下の変異が含まれている。
Ｋ３６０Ｅ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｋ４０９Ｗ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｙ３４９Ｃ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるサブユニット間ジスルフィド安定化変異。

鎖ＨのＦｃ領域のＫ３６０Ｅ／Ｋ４０９Ｗ変異は、疎水性／立体構造相補性に加えて長距離静電相互作用に起因して、鎖Ｓとのヘテロ二量体に有利な相互作用をもたらすように設計されている（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ１２（１２）：２７４８－５９；Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ６５（２）：３７７－８３）。変異Ｙ３４９Ｃは、追加の鎖間ジスルフィド結合Ｙ３４９Ｃ－（ＣＨ３－鎖Ｈ）－Ｓ３５４Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｓ）対を生成するために導入された（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ６５（２）：３７７－８３．）。

鎖Ｓには、以下の変異が含まれている。
Ｇ４４Ｃ－ｓｃＦｖのＶＨ領域におけるジスルフィド安定化変異。
Ｑ１００Ｃ－ｓｃＦｖのＶＬ領域におけるジスルフィド安定化変異。
Ｑ３４７Ｒ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｄ３９９ｖ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｆ４０５Ｔ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるヘテロ二量体化変異。
Ｓ３５４Ｃ－Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおけるサブユニット間ジスルフィド安定化変異。

変異Ｇ（Ｈ４４）Ｃ及びＱ（Ｌ１００）Ｃは、ＶＨとＶＬの間の操作されたジスルフィド結合によってｓｃＦｖを安定化するために導入された。ジスルフィド安定化は、ｓｃＦｖの構造的及び熱的な安定性を改善する。鎖ＳのＦｃ領域のＱ３４７Ｒ／Ｄ３９９Ｖ／Ｆ４０５Ｔ変異は、疎水性／立体構造相補性に加えて長距離静電相互作用に起因して、鎖Ｈとのヘテロ二量体に有利な相互作用をもたらすように設計した（Ｃｈｏｉｅｔａｌ，（２０１３）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ１２（１２）：２７４８－５９）。変異Ｓ３５４Ｃは、Ｙ３４９Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｈ）－Ｓ３５４Ｃ（ＣＨ３－鎖Ｓ）対との追加の鎖間ＣＨ３ジスルフィド結合を生成するために導入した（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ６５（２）：３７７－８３）。

アミノ酸配列
ＡＢ０１９２を構成する３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列を図２１０に示す。ＣＤＲの概要を表２０４に示す。

潜在的な配列ライアビリティの分析
鎖Ｌ（ＮＫＧ２Ｄ結合軽鎖）には予測されるライアビリティはない。鎖Ｈ（ＮＫＧ２Ｄ結合重鎖）はＣＤＲＨ３にＤＰを有する。このモチーフは強制分解の影響を受けない。そのため、この配列はＡＢ００８９では変更されていなかった。鎖Ｓには、ＣＤＲＨ３にＭｅｔ（潜在的な酸化部位）及びＤＧ（潜在的な異性化部位）が含まれている。ＣＤＲＨ３のＭまたはＤＧの先制的な除去は試行されなかった。加速安定性及び強制分解の研究中に、これらの残留物の修飾を注意深くモニターした。以下に示すように、試験したどのストレスでも、ＭｅｔまたはＤＧの変更は観察されなかった。

フレームワーク評価
ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームは、マウスの免疫化によって発見された。ヒト化のために選択されたフレームワークは、臨床段階の治療用モノクローナル抗体で頻繁に使用される（図２１１）。ＮＫＧ２Ｄ結合アームは完全ヒトであり、進行期のｍＡｂで頻繁に使用されるフレームワークに基づいており、異常な残基も生殖細胞系列からの逸脱も含まれていない。

逆突然変異
分子モデリングを使用して、ＣＤＲアーキテクチャの維持に役立つマウスの逆突然変異を選択した（表２０５）。７つの逆突然変異：ＨＣで３つ、ＬＣで４つが導入された。

ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームの表面電荷分布及び疎水性パッチ分析
図２１２は、３つの異なる方向でのＣＬＥＣ１２Ａ結合ｓｃＦｖのリボン図モデル（上のパネル）、及び同じ方向の対応する表面電荷分布（下のパネル）を示している。抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖの電荷分布は分極化されており（「上面図」、下のパネル）、負に帯電した残基が主にＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ２内に存在する。パラトープ上の静電パッチの不均一な分布は、標的に関連している可能性が高く、同族のエピトープ上の電荷分布の相補性を反映している可能性があり、これは、ＣＬＥＣ１２ＡとＡＢ０１９２のｓｃＦｖとの間の高親和性相互作用に寄与し得る。

図２１３は、ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性パッチの分析を示している。分析は、治療用抗体プロファイル（ＴＡＰ）：ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｎｅｗｓａｂｄａｂ／ｓａｂｐｒｅｄ／ｔａｐを使用して実行した。３７７の後期治療用抗体を参照して候補を比較する。ＡＢ０１９２のＣＬＥＣ１２Ａ結合アームのＣＤＲの長さは、後期治療用抗体の典型的な範囲内である。抗体のＣＤＲの疎水性パッチ分析によって、その開発性が予測される。ＡＢ０１９２のＴＡＡアームの理論的な疎水性特性は、商業化された生物療法薬及び後期治療用抗体候補の基準の十分に範囲内である。

図２１４は、正電荷と負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。３つのチャートは全て、電荷分布が進行期の治療用抗体と比較して標準内にあることを示している。

ＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ結合アームの表面電荷分布及び疎水性パッチ分析
ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂは、３つの異なる配向を有するリボン図に示され（図２１５、上部パネル）、同じ配向での対応する表面電荷分布が提供される（図２１５、下部パネル）。ＮＫＧ２ＤＡ４９Ｍ－Ｉアームの表面電荷分布は、分子のＣＬＥＣ１２Ａ標的化アームの電荷よりも均一に分布している。

図２１６は、ＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲ長及び表面疎水性分析のパッチを示している。ＡＢ０１９２のＮＫＧ２Ｄ標的化アームのＣＤＲの長、疎水性、正／負の電荷分布は、既存の治療用抗体の基準の十分に範囲内であるようである。

図２１７は、正電荷及び負電荷を含むパッチの分析、ならびにＣＤＲ領域周辺のこれらの電荷の対称性を示している。３つのチャートは全て、電荷分布が治療用抗体の母集団と比較して標準内にあることを示している。

免疫原性の予測
ＡＢ０１９２の３つの鎖のタンパク質配列を、ＥｐｉＭａｔｒｉｘアルゴリズムを使用して、潜在的に免疫原性のＴ細胞エピトープの存在について調べ、免疫原性の可能性をランク付けした（図２１８）。ＡＢ０１９２は、Ｔｒｅｇ調節免疫原性タンパク質スケールでスコアが好適である。ＡＢ０１９２の３つの鎖の配列のＴｒｅｇ調整Ｅｐｉｍａｔｒｉｘタンパク質スコアは、鎖Ｈ：－３３．３９、鎖Ｓ：－１９．９４及び鎖Ｌ：－２３．４９である（表２０６）。ＡＢ０１９２の免疫原性の予測リスクは低いようである。

発現
ＡＢ０１９２の発現は、ＤｒａｇｏｎｆｌｙＴｘＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴプラットフォーム精製法を使用して達成された。簡単に説明すると、ＡＢ０１９２は、ＮＫＧ２Ｄ標的化軽鎖（鎖Ｌ）、ＮＫＧ２Ｄ標的化ＩｇＧ重鎖（鎖Ｈ）、及びＣＬＥＣ１２Ａ標的化ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合（鎖Ｓ）をコードする３つのプラスミドによるＥｘｐｉ２９３及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。Ｅｘｐｉ２９３とＥｘｐｉＣＨＯの両方の発現について、鎖Ｓ：鎖Ｈ：鎖Ｌは、プラスミド比４：１：１でトランスフェクトして、所望のヘテロ二量体生成物の割合を最大化した。この比率は、以前開発されたヒト化ＴｒｉＮＫＥＴに基づいて経験的に得られたものであり、ＡＢ０１９２用に特別に最適化されたものではない。

精製
ＡＢ０１９２の精製は、２ステップのＦ３’ＴｒｉＮＫＥＴプラットフォーム精製法を使用して行った。ＡＢ０１９２精製のための最適化または広範なプロセス開発は実施しなかった。ＥｘｐｉＣＨＯで発現されたＡＢ０１９２精製（ロットＡＢ０１９２－００５）の概略図を図２１９に示す。

一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞で２ロットのＡＢ０１９２を生成した。表２０７は、両方のロットの力価及び最終製品の純度をまとめたものである。

ＡＢ０１９２の正体は、質量分析によって確認された。インタクトなＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のＬＣ－ＭＳ分析は、１２６，４２９．５Ｄａの理論質量とよく一致する観察された質量（１２６，４２９．９Ｄａ）（図２２０）を示した。観察された主なグリコシル化パターン（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ）は、ＣＨＯ細胞で発現するＦｃ含有分子に典型的である。

生化学的及び生物物理学的特性
ＡＢ０１９２は、ＳＥＣ、ＣＥ、ｃＩＥＦ、ＨＩＣ、及びＤＳＣによって特徴付け、優れた生物学的治療薬の適切な純度及び開発前の特性を備えていることが確認された。

純度
ＳＥＣによって評価されたＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）の純度、非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳを表２０８に要約する。

サイズ排除クロマトグラフィー
精製されたＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のＳＥＣ分析によって、積分されたピーク面積で単量体が９９％を超えると確認されたことが示された（図２２１）。

非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳ
ＡＢ０１９２はＣＥ－ＳＤＳによって高純度である（図２２２）。非還元条件下では（左パネル）、主要な不純物は方法によって誘導される（遊離軽鎖及びＴｒｉＮＫＥＴ－ＬＣ）。還元条件下（右パネル）では、３つの予想される鎖（軽鎖（Ｌ）、重鎖（Ｈ）、及びｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖（Ｓ））が観察される。

ｃＩＥＦによる実験的なｐＩ及び電荷プロファイル
ＡＢ０１９２（ロットＡＢ０１９２－００５）のｃＩＥＦプロファイルを（図２２３）に示す。ＡＢ０１９２には、８．９±０．０のｐＩに主要なピークがある。いくつかのより少量の、重複する酸性ピーク及びマイナーな塩基性ピークも観察される。

ＨＩＣによって評価された疎水性
ＡＢ０１９２の疎水性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して評価された（図２２４及び表２０９）。クロマトグラムは単一の狭いピークを表し、分子が非常に純粋で均質であることを示している。ＡＢ０１９２の保持時間は、Ｈｕｍｉｒａ（正常に機能する治療用モノクローナル抗体）の保持時間に匹敵する。

ＤＳＣによる熱安定性
ＡＢ０１９２の熱安定性は、いくつかの緩衝液（ＰＢＳｐＨ７．４、ＨＳＴｐＨ６．０、ＣＳＴｐＨ７．０）でＤＳＣによって評価された。ＡＢ０１９２は、試験した全ての緩衝液で高い熱安定性を示した（図２２５、表２１０）。ｓｃＦｖの展開に対応するＴｍ１は、熱安定性評価で想定されている６５℃以上の基準を満たしていた。

ジスルフィド結合の割り当て
ＡＢ０１９２は、モノクローナルＩｇＧ１抗体の骨格に基づいて操作された分子である。典型的なＩｇＧ１には１６個のジスルフィド結合が含まれているが、ＡＢ０１９２のＦ３’フォーマットには１５個のジスルフィド結合しかない。ＡＢ０１９２の半分は抗ＮＫＧ２Ｄの半分の抗体であり、したがって、予想される７つのジスルフィド結合（各ＩｇＧドメインに１つ、及びＬＣをＨＣに接続する分子間ジスルフィド）が含まれている。ＡＢ０１９２の残りの半分は、抗ＣＬＥＣ１２ＡｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物である。ｓｃＦｖには３つのジスルフィド結合（各抗ＣＬＥＣ１２ＡＶＨ及びＶＬドメインに１つ、及び可変ドメインを架橋する操作された安定化ジスルフィド）を含み、ＦｃにはＩｇＧドメインに２つの予想されるジスルフィドが含まれる。ヘテロ二量体は、２つのヒンジジスルフィド、及びＦａｂ－ＦｃをＣＨ３ドメインのｓｃＦｖ－Ｆｃに接続する１つの追加の分子間操作ジスルフィドと一緒に保持されている。まとめると、これはＡＢ０１９２で１５の予想されるジスルフィド結合をもたらす。ＡＢ０１９２の予測されるジスルフィドマップを図２２６に示す。

ＡＢ０１９２のジスルフィド結合の接続性は、非還元消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング分析によって確認した。ジスルフィド結合ペプチドは、ＭＳ／ＭＳデータベース検索によって特定し、ネイティブ及び還元の消化での強度を比較することで確認した。操作されたｓｃＦｖ安定化ジスルフィドを観察するために、ＡＢ０１９２をトリプシンとキモトリプシンの両方で消化した。図２２７は、ｓｃＦｖ（非還元及び還元）の操作されたジスルフィド対の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）、及びそのペプチド対の最も強い電荷状態を示している。他の全てのジスルフィドは、トリプシンのみで消化した後に同定した。図２２８のＸＩＣは、Ｆｃヘテロ二量体化を安定化するために導入された操作されたＳ－Ｓ架橋の存在を裏付けている。ＡＢ０１９２で観察されたジスルフィド連結ペプチドのまとめを表２１１に示す。観察された全てのジスルフィド連結ペプチドを、高い質量精度（５ｐｐｍ未満）で観察し、これは還元可能であり、ＭＳ／ＭＳ断片化によって配列を確認した。

結合特性評価
ヒトＣＬＥＣ１２Ａへの結合
ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ００８９の親和性は、３７℃でのＳＰＲによって決定された。ＡＢ００８９はヒトＣＬＥＣ１２Ａに高い親和性で結合する（図２２９、表２１２）。ＴｒｉＮＫＥＴＭＯＡによると、分子はＴＡＡに強く結合し、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６ａに弱く結合するように設計されている。ＡＢ０１９２とヒトＣＬＥＣ１２Ａとの間の複合体は、遅い速度の解離定数１．４０±０．０９ｘ１０^－３ｓ^－１から明らかなように強力である。ＡＢ０１９２の平衡結合親和性Ｋ_Ｄは１．８１±０．１６ｎＭである。

ヒトＣＬＥＣ１２Ａの多型バリアントに対する結合（Ｑ２４４）
多型バリアントＣＬＥＣ１２Ａ（Ｑ２４４）は、人口の３０％に蔓延している。本発明者らは、ＳＰＲによるこの遺伝子バリアントへのＡＢ０１９２の結合を試験し、ＣＬＥＣ１２Ａ（Ｋ２４４）ＷＴに対するその親和性を比較した（図２３０）。ＣＬＥＣ１２ＡのＷＴ及び（Ｋ２４４Ｑ）バリアントに対するＡＢ０１９２の結合親和性は、２．５倍以内である（表２１３）。ＡＢ０１９２のカニクイザルＣＬＥＣ１２Ａ（ｃＣＬＥＣ１２Ａ）への結合も試験した。１００ｎＭの濃度では定量可能な結合は観察されなかった。

示差的にグリコシル化されたＣＬＥＣ１２Ａへの結合
ヒトＣＬＥＣ１２Ａは、高度にグリコシル化されたタンパク質である（２０１アミノ酸を損なうＥＣＤを有する６つの潜在的なＮ－グリコシル化部位）。異なる細胞型の表面でのＣＬＥＣ１２Ａのグリコシル化状態のバリエーションは、文献に記載されている（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：２１５９－２１６９）。異なる患者由来のＡＭＬ細胞の表面に発現するＣＬＥＣ１２Ａは、異なるグリコシル化パターンを同様に有し得る。ＡＢ００８９が、ヒトＣＬＥＣ１２Ａの異なる糖バリアントに結合することを確認するために、抗原をノイラミニダーゼで（末端シアル酸を除去するため）またはＰＮＧａｓｅＦで（Ｎ－結合型グリカンを除去するため）処理して、ＳＰＲによって親和性を未処理のＣＬＥＣ１２Ａと比較した。ＡＢ０１９２は、ＣＬＥＣ１２Ａのグリコシル化及び脱グリコシル化バリアントの両方に結合し（図２３１及び表２１４）、標的グリカン組成の不均一性の影響を受けないと予想される。

ＣＬＥＣ１２Ａ＋同質遺伝子及びがん細胞株への結合
ＣＬＥＣ１２Ａ及びＡＭＬがん細胞を発現する両方の同質遺伝子細胞株へのＡＢ０１９２結合の評価は、ＦＡＣＳによってモニターした（図２３２、及び表２１５）。ＡＢ０１９２は、同質遺伝子Ｂａ／Ｆ３－ＣＬＥＣ１２Ａ細胞上で細胞表面に発現したＣＬＥＣ１２Ａに対して高い親和性を示し、ＡＭＬ細胞株ＰＬ－２１及びＨＬ－６０にＥＣ５０が１ｎＭ未満で結合する。ＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ００８９の特異性は、標的を発現しない親Ｂａ／Ｆ３細胞への結合の欠如によって実証された。

ヒトＮＫＧ２Ｄへの結合
３７℃でのＳＰＲによるヒトＮＫＧ２ＤＥＣＤへのＡＢ０１９２の結合（Ｂｉａｃｏｒｅ）（図２３３）。ＮＫＧ２Ｄは本質的に二量体であるため、この実験には組換えｍＦｃタグ付きＮＫＧ２Ｄ二量体を使用した。親和性はＡＢ０１９２を使用して決定された。図２３３は、ヒトＮＫＧ２ＤへのＡＢ０１９２の結合センサーグラムを示している。平衡親和性データを取得するために、定常状態の親和性適合及び反応速度論的適合という２つの異なる適合を利用した。反応速度論定数及び平衡親和性定数を表２１６に示す。ＡＢ０１９２は、低い親和性で、最も重要なことに速い解離速度でヒトＮＫＧ２Ｄに結合するように設計された。解離速度定数は、（１．４６±０．０６ｘ１０－１ｓ－１）であった。反応速度論的適合及び定常状態親和性適合によって得られた平衡親和性定数（ＫＤ）は極めて類似しており、それぞれ７７９±１０ｎＭ及び７８１±９ｎＭであり、測定されたパラメーターの信頼性が高いことを示唆している。

ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１５８対立遺伝子）への結合
ＡＢ０１９２作用機序の様式の１つは、そのＦｃを介してＮＫ細胞上に発現されるヒトＣＤ１６ａ係合（ＦＣγＲＩＩＩａ）によるものである。ヒトＣＤ１６ａへのＡＢ０１９２の結合をＳＰＲによって試験した（図２３４、表２１７）。この実験には、ＣＤ１６ａ高親和性Ｖ１５８対立遺伝子を使用した。文献によると、ＩｇＧ１のＦｃ受容体親和性値は、実験計画及び受容体の調達によって異なるため、トラスツズマブ（ハーセプチン）をヒトＩｇＧ１対照として含めた。両方の対立遺伝子に対するＡＢ０１９２の親和性は、同じ受容体に対するトラスツズマブの親和性に匹敵する（約２倍異なる）。この相違が意味のある生理学的重要性を有するとは本発明者らは、期待していない。

ＣＤ１６ａ－ＮＫＧ２Ｄの相乗効果の試験
ＡＢ０１９２は、ＮＫ細胞に２つの結合様式を有する３機能性ＩｇＧベースの生物学的製剤である。ＣＤ１６ａ結合は、Ｆｃを介して達成され、ＮＫＧ２Ｄ結合はＡ４９Ｍ－ＩＦａｂを介して達成される。両方の相互作用は、ＡＢ０１９２の最適な細胞毒性活性にとって重要である。ヒトＣＤ１６ａ及びヒトＮＫＧ２Ｄ結合の共結合の相乗効果を実証するために、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６ａ、及び混合ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ１６ａＢｉａｃｏｒｅチップ表面へのＡＢ０１９２の結合を定性的に比較するＳＰＲ実験を行った。ヒトＮＫＧ２Ｄ及びヒトＣＤ１６ａに対するＡＢ０１９２の親和性は両方とも低いが、両方の標的に同時に結合すると、より遅いオフレートとして現れる親和性効果が生じる（図２３５）。したがって、ＡＢ０１９２は、ＣＤ１６ａ及びＮＫＧ２Ｄに強力に係合し得る。

ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの共係合
一方の標的の結合が他方の標的のＡＢ０１９２への結合を妨害するか否かを決定するために、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＮＫＧ２Ｄを、抗ｈＦｃＩｇＧＳＰＲチップにキャプチャーされたＡＢ０１９２上に連続的に注入した（図２３６）。標的結合センサーグラムは、ＣＬＥＣ１２Ａの占有状態がＮＫＧ２Ｄ結合を妨害しないこと（図２３６、上のパネル）及びその逆（図２３６、下のパネル）を示している。他の標的で飽和されている遊離ＡＢ０１９２及びＡＢ０１９２への各標的の結合を示すそれぞれのセンサーグラムセグメントの形状の類似性によって、反応速度論的パラメーターがＡＢ０１９２分子の標的占有状態によって有意に影響されないことが示唆される。例えば、センサーグラムのＣＬＥＣ１２Ａ結合セグメントの形状は、両方のパネルで類似している。さらに、各標的結合の相対的な化学量論への影響がないこと（占有されていないＡＢ０１９２への結合と比較した場合）は、ＡＢ０１９２上のＮＫＧ２Ｄ及びＣＬＥＣ１２Ａ結合部位が完全に独立していることを意味する（表２１８）。したがって、ＡＢ０１９２は、腫瘍抗原とＮＫＧ２Ｄ標的化アームの同時共結合を成功裏に達成する。

Ｆｃγ受容体への結合
ＡＢ０１９２はＩｇＧ１由来の生物学的薬剤候補であるため、適切なＦｃ受容体結合特性を維持することが重要である。ＳＰＲデータは、ＡＢ００８９がヒト及びカニクイザルのＦｃγ受容体に、実験的対照として役立つ市販のＩｇＧ１生物製剤であるトラスツズマブに匹敵する親和性で結合することを示唆している（表２１９）。各々の個々の受容体結合の詳細な説明を以下に示す。

ヒト及びカニクイザルＣＤ６４への結合（ＦｃγＲＩ）
表２２０は、ＡＢ００８９が、トラスツズマブに匹敵する（２倍未満の相違）親和性で組換えヒト及びカニクイザルのＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に結合することを示している。図２３７及び図２３８は、ＡＢ００８９のヒト及びカニクイザルＣＤ６４への結合をそれぞれ示している。

ヒトＣＤ３２ａへの結合（ＦｃγＲＩＩａ）
ＡＢ００８９とトラスツズマブに関してヒトＣＤ３２ａの両方の対立遺伝子の親和性の間に意味のある相違はない（表２２１）。図２３９及び図２４０は、ＳＰＲによって試験された、それぞれ、ＣＤ３２ａ（Ｈ１３１及びＲ１３１対立遺伝子）へのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。

ヒトＣＤ１６ａＦ１５８（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１６への結合
ＣＤ１６ａＶ１５８を結合するＡＢ０１９２の詳細な説明は、セクション６．９．６に記載されている。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ及びカニクイザルＦｃγＲＩＩＩの低親和性Ｆ１５８対立遺伝子へのＡＢ０１９２の結合を、表２２２、図２４１及び図２４２に示す。組換えヒトＣＤ１６ａ（Ｆ１５８対立遺伝子）及びカニクイザルＣＤ１６のＡＢ０１９２結合親和性値は、トラスツズマブの値に匹敵しており、親和性の相違は２倍未満である（表２２２）。

ヒトＣＤ３２ｂへの結合（ＦｃγＲＩＩｂ）
ＡＢ００８９及びトラスツズマブに対するＣＤ３２ｂの親和性の間に意味のある相違はない（表２２３）。図２４３は、ＳＰＲによって試験されたＣＤ３２ｂへのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。

ヒトＣＤ１６ｂへの結合（ＦｃγＲＩＩｂ）
ＡＢ００８９は、１つのトラスツズマブと匹敵する親和性（差が２倍未満）でヒトＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲ３ｂ）に結合する（表２２４）。図２４４は、ＳＰＲによって試験されたＣＤ１６ｂへのＡＢ００８９及びトラスツズマブの結合を示している。

ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへの結合
図２４５及び図２４６は、ＳＰＲによって試験された、それぞれ、ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへのＡＢ０１９２の結合を示している。ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎに対するＡＢ０１９２の親和性は、実験対照として機能した市販のＩｇＧ１生物製剤であるトラスツズマブの親和性と類似している（表２２５）。

エピトープビニング
本発明者らは、ＳＰＲによって、ＡＢ０２３７、ＡＢ００８９、及び３つの参照対照ＴｒｉＮＫＥＴに関連するＡＢ０１９２の結合エピトープを比較した（図２４７）。ｃＦＡＥ－Ａ４９。テポジタマブは、ＭｅｒｕｓのテポジタマブのＣＬＥＣ１２Ａ結合アームに基づいている（ＷＯ＿２０１４＿０５１４３３＿Ａ１）、ｃＦＡＥ－Ａ４９。ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓは、Ｍｅｒｕｓのクローン４３３１（ＷＯ＿２０１４＿０５１４３３＿Ａ１）及びｃＦＡＥ－Ａ４９に基づいている。ｈ６Ｅ７は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（ｈ６Ｅ７）のｈ６Ｅ７ｍＡｂに基づいている（ＵＳ＿２０１６＿００７５７８７＿Ａ１）ＡＢ０１９２とｈＣＬＥＣ１２Ａの相互作用は、３つ全ての対照分子ｃＦＡＥ－Ａ４９によってブロックされた。テポジタマブ、ｃＦＡＥ．Ａ４９．ｈ６Ｅ７、及びｃＦＡＥ－Ａ４９．ＣＬＬ１－Ｍｅｒｕｓによって、ＡＢ０１９２結合エピトープが広く、Ｍｅｒｕｓ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ分子の両方と重複していることが示唆されている。このフットプリントは、Ｍｅｒｕｓ分子とのみ交差ブロックするＡＢ０２３７及びＡＢ００８９とは異なる。したがって、ＡＢ０１９２の結合エピトープはＡＢ００８９及びＡＢ０２３７とは異なる。

効力
ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞を溶解するＡＢ０１９２の能力を、ヒトＮＫ細胞を介した細胞毒性アッセイで決定した。ＡＢ０１９２は、ＰＬ２１ＡＭＬ細胞を殺滅するのに高い効力を示し、対応するモノクローナル抗体を大幅に上回った（図２４８及び表２２６）。

特異性
ＰＳＲによって評価された非特異的結合
ＡＢ０１９２の非特異的結合は、界面活性剤で可溶化されたＣＨＯ細胞膜タンパク質の調製物への結合を測定するフローサイトメトリーベースのＰＳＲアッセイによって評価された（図２４９）。ＰＳＲアッセイは、抗体溶解性の代用である交差相互作用クロマトグラフィーと、及びｉｎｖｉｖｏクリアランスの代用であるバキュロウイルス粒子酵素結合免疫吸着アッセイとよく相関し、したがって、優れた開発可能性予測因子として機能することが公知である。ＡＢ０１９２は、低ＰＳＲ対照（トラスツズマブ）と同様に非特異的結合を示さず、高い特異性及び無関係のタンパク質への非特異的結合の欠如を示唆している。

ＨｕＰｒｏｔ（商標）マイクロアレイアッセイにおけるＡＢ０１９２の特異性評価
ＡＢ０１９２の特異性を調べるために、本発明者らは、タンパク質アレイ技術を検討した。ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームマイクロアレイは、単一の顕微鏡スライド上で個々に精製されたヒト全長タンパク質の最大データベースを提供する。２２，０００の全長ヒトタンパク質からなるアレイは、酵母Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現され、精製された後、何千もの相互作用をハイスループット方式でプロファイリングすることを可能にする、マイクロアレイスライドガラスに２重にプリントされる。図２５０は、ヒトプロテオームマイクロアレイ全体と比較した、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対する１μｇ／ｍｌでのＡＢ０１９２の相対的結合（Ｚスコア）を示す。Ｚスコアは、所定のタンパク質の２つの複製の平均結合スコアである。比較の目的で、ＡＢ０１９２へのバックグラウンド結合が残っている上位２４のタンパク質も図２５０に示した。表２２７は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに対するＡＢ０１９２のＺスコア及びＳスコア、ならびにマイクロアレイの上位６つのタンパク質を示している。Ｓスコアは、所定のタンパク質のＺスコアとその隣の１つのランクとの差である。Ｚ及びＳスコア基準に基づいて、ＡＢ０１９２は、ＨｕＰｒｏｔ（商標）ヒトプロテオームアッセイにおいて、ヒトに対する高い特異性及びオフターゲット結合の欠如を示した。

開発可能性評価
ＡＢ０１９２の安定性及び強制分解は、以下の条件下で評価された。

加速（４０℃）安定性
－２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０（ｐＨ６．０）中で２０ｍｇ／ｍｌ、４０℃、４週間（ＳＥＣ、ＳＰＲ、効力、ＳＤＳ－ＣＥ）
－２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０（ｐＨ７．０）中で、４０℃、４週間（ＳＥＣ、ＳＰＲ、効力、ＳＤＳ－ＣＥ）

化学的安定性
－酸化：０．０２％過酸化水素、ＰＢＳ（室温）中で１ｍｇ／ｍｌ、２４時間（ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）
－ｐＨ８．０：１ｍｇ／ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ、４０℃、２週間（ｃＩＥＦ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）
－ｐＨ５．０：１ｍｇ／ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウム、４０℃、２週間（ｃＩＥＦ、ＳＰＲ、効力、ペプチドマップ）。

製造可能性
－凍結／解凍：２０ｍｇ／ｍｌ６サイクルの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、ｐＨ７．０（ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＣＥ）
－撹拌：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０（ｐＨ７．０）中で２０ｍｇ／ｍｌ（ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＣＥ）
－高濃度：＞１５０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（ＳＥＣ、Ａ２８０）
－低ｐＨ保持：ｐＨ３．３、１．０時間、ＰｒｏＡ溶出緩衝液（ＳＥＣ、ｃＩＥＦ、ＳＤＳ－ＣＥ、インタクトな質量、ＳＰＲ、効力）

加速（４０℃）安定性
ＡＢ０１９２の安定性を評価するために、この分子を、（１）２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０１％ＰＳ－８０、ｐＨ６．０（ＨＳＴ）中２０ｍｇ／ｍｌ、及び（２）２０ｍＭクエン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０１％ＰＳ－８０、ｐＨ７．０（ＣＳＴ）中２０ｍｇ／ｍｌという２つの異なる緩衝液条件下で、４０℃で４週間、ステージングした。両方の緩衝液の安定性は、ＳＥＣ、ＣＥ、ＳＰＲ及び効力によって評価した。

ＨＳＴ、ｐＨ６．０での安定性
４０℃、ＨＳＴ中のＡＢ０１９２、ｐＨ６．０で４週間後、ＳＥＣ（図２５１、表２２８）またはＣＥ－ＳＤＳ（図２５２、表２２９）による最小の凝集または断片化を示した。単量体の損失は、ＳＥＣによれば１．６％であり、非還元ＣＥによれば１％であった。対照試料とストレス試料の間で、ｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びｈＣＤ１６ａの活性種含有量または親和性に意味のある相違はない（図２５３及び表２３０）。最後に、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞毒性アッセイで試験した対照試料とストレス試料との間で効力に差はなかった（図２５４及び表２３１）。

ＣＳＴｐＨ７．０での安定性
４０℃で４週間後、ＣＳＴ、ｐＨ７．０のＡＢ０１９２は、最小限の凝集（図２５５及び表２３２）及び断片化（図２５６及び表２３３）を示した。単量体の１．６％及び０．８％の損失が、ＳＥＣ及び非還元ＣＥ－ＳＤＳによってそれぞれ観察された。対照試料とストレス試料との間で、ｈＣＬＥＣ１２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びｈＣＤ１６ａの活性種含有量または親和性に意味のある相違はない（図２５７及び表２３４）。最後に、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６ａＶ細胞毒性アッセイで、対照試料とストレス試料との間で効力に差はなかった（図２５８及び表２３５）。

化学的安定性
強制酸化
０．０２％過酸化水素中の２４時間の酸化ストレス後、ＡＢ０１９２は単量体含有量の有意な減少を示さなかった（図２５９及び表２３６）。ＣＥによって評価された純度は高いままであった（図２６０及び表２３７）。ＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対する活性種の量及び親和性は変化せず（図２６１及び表２３８）、効力は対照試料と同様であった（図２６２及び表２３９）。

メチオニンの部位特異的酸化は、トリプシンペプチドマッピングによって強制酸化後モニターした。ＩｇＧ１で予想されたように、予想どおり（表２４０）、Ｆｃの２つのメチオニンでのみ有意なレベルの酸化が検出された。我々の歴史的データでは、同じ残基が同じ条件下で、トラスツズマブ６１．６％及び３９．１％で修飾されていることが示されている。

ＡＢ０１９２ＣＤＲのトリプトファン残基の酸化も同じ実験でモニターした。ストレス後の酸化が有意に増大したトリプトファン残基はなかった（表２４１）。

ｐＨ５のストレス
ＡＢ０１９２の化学的安定性は、低ｐＨ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、４０℃、２週間）で評価された。ｐＨ５で２週間後、ＳＥＣでは単量体の損失（図２６３及び表２４２）は観察されなかった。非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された純度の差は１％未満であった（図２６４及び表２４３）。観察された活性種の量のＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａＶ親和性に意味のある差はなかった（図２６５及び表２４４）。全体的な電荷プロファイルの小さな酸性シフトがｃＩＥＦによって検出されたが（図２６６及び表２４５）、この酸性シフトはＡＢ０１９２の効力に影響を与えなかった（図２６７及び表２４６）。

ｐＨ８のストレス
ＡＢ０１９２の化学的安定性は、高ｐＨ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、４０℃、２週間）でのインキュベーションによっても評価した。ｐＨ８で２週間後、ＳＥＣによれば単量体の１．６％の損失があった（図２６８及び表２４７）。純度のわずかな相違は、非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された（図２６９及び表２４８）。観察された活性種のＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６ａＶの親和性または量に意味のある差はなかった（図２７０及び表２４９）。ｃＩＥＦによって検出された全体的な電荷プロファイルの有意な酸性シフトが検出され（図２７１及び表２５０）、これは、分子全体の脱アミド化に起因し得る。しかしながら、この酸性シフトは、ＡＢ０１９２の効力に有意な影響を及ぼさなかった（図２７２及び表２５１）。

ｐＨ５及びｐＨ８のストレスを受けた物質のペプチドマッピング分析

ｃＩＥＦによって観察されたｐＨストレス誘発性変化が、相補性決定領域（ＣＤＲ）の修飾（改変）に起因するか否かを判断するために、同じｐＨ５及びｐＨ８のストレス試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマップによって分析した。ペプチドマップデータに基づくと、ＡＢ０１９２の全てのＣＤＲは、低及び高ｐＨストレス時の修飾に耐性がある（表２５２）。ピーク形状の手動検査に基づいて、アスパラギン酸の異性化の証拠は観察されなかった。

製造可能性
凍結／解凍安定性
ＡＢ０１９２のアリコート（ＣＳＴｐＨ７．０中で２０ｍｇ／ｍｌ）を、バイアルを発泡スチロール容器に入れ（凍結速度を遅くするため）、その容器を－８０℃に置くことにより、６回凍結及び解凍した。一旦凍結すれば、容器を実験台に置き、アリコートを解凍させた。６サイクルの凍結／解凍後、ＡＢ０１９２は、ＳＥＣによる単量体の損失を示さず、タンパク質濃度は同じままであった（図２７３及び表２５３）。

６回の凍結／解凍サイクル後、還元または非還元のＣＥ－ＳＤＳによって純度の低下は検出されなかった（図２７４及び表２５４）。

攪拌

攪拌研究は、ＣＳＴ、ｐＨ７．０緩衝液で実施した。ＡＢ０１９２は、マイクロ撹拌バーを備えたガラスバイアル内で一定のステアリング（６０ｒｐｍ）で２４時間インキュベートされた。対照試料と比較して、ＳＥＣによって単量体の損失は検出されなかった（図２７５及び表２５５）。

２４時間の攪拌後、還元または非還元ＣＥ－ＳＤＳによって検出された断片化の増大はなかった（図２７６及び表２５６）。

低ｐＨ保持
ＡＢ０１９２が、生物製剤製造におけるウイルス不活化に使用される一般的に使用される低ｐＨ保持プロトコルに修正可能か否かを判断するために、低ｐＨ保持研究を実施した。低ｐＨでのインキュベーションは、分子の生物物理学的安定性及び完全性を損なう場合があり、アミノ酸側鎖の化学的分解、特にアスパラギン酸の異性化を引き起こす場合がある。鎖ＳのＣＤＲＨ３には潜在的な配列ライアビリティＤＳがある。したがって、低ｐＨ保持後のタンパク質の品質を評価するために、本発明者らは、広範なアッセイを適用した。ＡＢ０１９２プロテインＡ溶出液の大部分はすぐに中性ｐＨに調整して、少量の試料はｐＨ３．７に調整し、室温で１時間保持して、典型的なウイルス不活化ステップを模倣した。保持期間の後、プロテインＡ溶出液を１．０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３で中和して、中性ｐＨを達成した。分析的サイズ排除クロマトグラフィーを実施して、低ｐＨ曝露の前後でプロファイルまたは凝集体含有量に変化があったか否かを決定した（図２７７）。低ｐＨ保持後、プロファイルの変化は観察されなかった。両方のアリコートを２回目のイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製し、特性評価アッセイのパネルにかけた。

アミノ酸側鎖の化学修飾は、通常、ｃＩＥＦを使用して全体規模で観察され得る。ＡＢ０１９２対照及び低ｐＨ保持ロットのｃＩＥＦプロファイルは、視覚的に非常に類似しており、酸性、主要、及び塩基性種の相対的な定量は、全てお互いの２％の範囲内である。低ｐＨ保持がＡＢ０１９２の電荷プロファイルに測定可能な影響を及ぼさなかったことを示している（図２７８及び表２５７）。

低ｐＨ保持ステップの後、ｈＣＬＥＣ１２ａ、ｈＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａＶに対する親和性は変化しなかった（図２７９及び表２５８）。これは、ＡＢ０１９２が、生物製剤製造におけるウイルス不活化ステップとして使用される低ｐＨ保持条件下で３つの標的全てに対する親和性を保持していることを示している。

低ｐＨ保持試料の効力は、ＫＨＹＧ１－ＣＤ１６ａＶ細胞毒性バイオアッセイでＣＬＥＣ１２Ａ＋ＰＬ－２１がん細胞に対してさらに試験した。ＡＢ０１９２の効力は、低ｐＨ保持ステップ後も変化しなかった（図２８０及び表２５９）。

まとめると、これらの結果によって、ＡＢ０１９２の分子フォーマット及び構造は、ＡＭＬを治療するためにＣＬＥＣ１２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６ａを同時に係合する新しい多重特異性治療法の概念的要件を満たしていることが実証される。ＡＢ０１９２は強力であり、かついかなるストレス下でも配列のライアビリティも有意な翻訳後修飾も観察されない、好ましい開発可能性プロファイルを有する。ＡＢ０１９２は、ＡＢ０２３７及びＡＢ００８９ＴｒｉＮＫＥＴとは異なるエピトープに結合する。

参照による援用
反対の言及がない限り、本明細書において参照される特許資料及び科学論文の各々の全ての開示は、あらゆる目的のために参照により援用される。

等価物
本出願は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に説明される本出願を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本出願の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入る全ての変更は、その中に含まれることが意図される。
配列

いくつかの実施形態では、ＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＰＮは、真性赤血球増大症、本態性血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄線維症から選択される。いくつかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、及び組織球腫瘍から選択される。特定の実施形態では、がんは、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み；
ここで、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位は、以下：
（ｉ）それぞれが配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびにそれぞれが配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２２１、１６６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４０、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）それぞれ配列番号２０６、１６６、及び２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４５、２３９、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）それぞれ配列番号２２１、２３６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１５２、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１５９、１７０、及び１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１８６、１８８、及び１８９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１９７、２０２、及び２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに配列番号２１１、２１２、及び２１４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｘ）それぞれ配列番号２２０、２２２、及び２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２２４、２２５、及び２２７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｘ）それぞれ配列番号２３０、２３１、及び２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２３３、２３４、及び２３５のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。
（項目２）
項目１のタンパク質であって、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、前記タンパク質。
（項目３）
項目１または２に記載のタンパク質であって、ここで、
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３３５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号３３６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２７０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２７１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；または
（ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２８９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
（項目４）
項目１～３のいずれか１項に記載のタンパク質であって、
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３３５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号３３６のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２７０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２７１のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２８９のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
（項目５）
前記ＶＨ及びＶＬが、配列番号１４３及び１４４；１４７及び１４４；２４４及び１４４；１７８及び１４４；２５６及び１４４；１４３及び１６３；１４３及び１６７；１４３及び１７１；または１７４及び１７５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、項目１または２に記載のタンパク質。
（項目６）
前記第２の抗原結合部位が、一本鎖フラグメント変数（ｓｃＦｖ）として存在し、ここで、前記ｓｃＦｖが、配列番号２７４、１４５、１４６、１４９、１５０、１５３、１５４、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７６、１７７、１８０、及び１８１から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目７）
前記ｓｃＦｖが、配列番号２７４または項目１８０のアミノ酸配列を含む、項目６に記載のタンパク質。
（項目８）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む、項目１に記載のタンパク質。
（項目９）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、以下：
（ｉ）それぞれ、配列番号１９５、１９６、１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号１９８、１９９、２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む項目１に記載のタンパク質。
（項目１０）
前記ＶＨが、配列番号１４８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２０３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１及び８～９のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１１）
前記ＶＨが、配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２０３のアミノ酸配列を含む、項目１及び８～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１２）
前記ＶＨ及びＶＬが、配列番号１６２及び２０３；２１０及び２０３；１６２及び２１８；１４８及び２１８；または２１０及び２１８のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１３）
前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、前記ｓｃＦｖが、配列番号１８４、１８５、２０４、２０５、２０８、２０９、２１５、２１６、２５２、２５３、２５４、及び２５５から選択されるアミノ酸配列を含む、項目８～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１４）
前記ｓｃＦｖが配列番号２０４のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１５）
前記第２の抗原結合部位が、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する、先行項目のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１６）
タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み、
ここで、前記第２の抗原結合部位が、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する、前記タンパク質。
（項目１７）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、前記第二抗原結合部位がヒトＣＬＥＣ１２Ａに、２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋ _Ｄ）で結合する、項目１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１８）
前記第２の抗原結合部位が、ＳＰＲによって測定される場合、１ｎＭ以下のＫ _ＤでヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する、項目１～７及び１６～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１９）
前記第２の抗原結合部位が、Ｋ２４４Ｑ置換を含むヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する、項目１～７及び１５～１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２０）
前記タンパク質が抗体Ｆｃドメイン、またはＣＤ１６を結合するのに十分なその一部を含む、項目１～１９のいずれかに記載のタンパク質。
（項目２１）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がＦａｂフラグメントであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、項目１～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２２）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がＦａｂフラグメントである、項目１～５、８～１２及び１５～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２３）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む、項目１～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２４）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の及び前記追加の抗原結合部位がそれぞれＦａｂフラグメントである、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２５）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、かつＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の及び前記追加の抗原結合部位がそれぞれｓｃＦｖである、項目２３に記載のタンパク質。
（項目２６）
前記第２の及び前記追加の抗原結合部位のアミノ酸配列が同一である、項目２３～２５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２７）
タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み、
ここで、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントであり、かつＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、前記タンパク質。
（項目２８）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結されている、項目２２、２４～２６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目２９）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結されている、項目２１、及び２５～２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３０）
前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、項目２８または２９に記載のタンパク質。
（項目３１）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目２２、２４～２６、２８、及び３０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３２）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目２１、２５～２７、及び３０～３１のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３３）
前記ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けされた、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前期軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、項目３１または３２に記載のタンパク質。
（項目３４）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが可塑性リンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結される、項目２２、２４～２６、２８、３０～３１、及び３３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３５）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが可塑性リンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結されている、項目２１、２５～２７、２９～３０、及び３２～３４のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３６）
前記可塑性リンカーが、（Ｇ _４Ｓ） _４を含む、項目３４または３５に記載のタンパク質。
（項目３７）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、項目２２、２４～２６、２８、３０～３１、３３～３４、及び３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３８）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、項目２１、２５～２７、２９～３０、３２～３３、及び３５～３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３９）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、項目２２、２４～２６、２８、３０～３１、３３～３４、及び３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４０）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、項目２１、２５～２７、２９～３０、３２～３３、３５～３６、及び３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４１）
ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂフラグメントが抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその一部との間に配置されていない、項目２１、２７、２９～３０、３２～３３、３５～３６、３８及び４０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４２）
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するＦａｂフラグメントが抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその一部との間に配置されていない、項目２２、２４、２６、２８、３０～３１、３３～３４、３６～３７、及び３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４３）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ配列番号８１、８２、及び１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む、項目１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４４）
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、及び９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）それぞれ配列番号８１、８２、及び８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、項目１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４５）
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが、配列番号９５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記第１の抗原結合部位のＶＬが、配列番号８５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４３または４４のいずれかに記載のタンパク質。
（項目４６）
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５の前記アミノ酸配列を含み、かつ前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが、配列番号８５の前記アミノ酸配列を含む、項目４３～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４７）
前記抗体ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである、項目１～４６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４８）
前記抗体Ｆｃドメインまたはその一部が、配列番号１１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４７に記載のタンパク質。
（項目４９）
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８と比較して、１つ以上の変異を含む、項目４７または４８に記載のタンパク質。
（項目５０）
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けされたＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅから選択される１つ以上の変異を、配列番号１１８に対して含む、項目４７～４９のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目５１）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８に対して、１つ以上の変異を含み；かつ前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられたＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８と比較して、１つ以上の変異を含む、項目４７～５０のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目５２）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８に対してＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を含み；かつ前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号が付けられた、配列番号１１８と比較して、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換を含む、項目５１に記載のタンパク質。
（項目５３）
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８に対してＹ３４９Ｃ置換を含み；前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号が付けられた、配列番号１１８と比較して、Ｓ３５４Ｃ置換を含む、項目５１または５２に記載のタンパク質。
（項目５４）
タンパク質であって：
（ａ）配列番号２５９または配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む、
前記タンパク質。
（項目５５）
項目１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目５６）
項目１～５４のいずれか１項に記載の前記タンパク質及びｐＨ７．０以上の緩衝液を含む医薬製剤。
（項目５７）
前記製剤のｐＨが７．０～８．０の間である、項目５６に記載の医薬製剤。
（項目５８）
前記緩衝液がクエン酸塩を含む、項目５６または５７に記載の医薬製剤。
（項目５９）
前記クエン酸塩の濃度が１０～２０ｍＭである、項目５８に記載の医薬製剤。
（項目６０）
前記緩衝液がリン酸塩をさらに含む、項目５６～５９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目６１）
糖または糖アルコールをさらに含む、項目５６～５９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目６２）
前記糖または糖アルコールが二糖である、項目６１に記載の医薬製剤。
（項目６３）
前記二糖がスクロースである、項目６２に記載の医薬製剤。
（項目６４）
前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの前記濃度が２００～３００ｍＭである、項目６１～６３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目６５）
前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの前記濃度が約２５０ｍＭである、項目６４に記載の医薬製剤。
（項目６６）
非イオン性サーファクタントをさらに含む、項目５６～６５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目６７）
前記非イオン性サーファクタントがポリソルベートを含む、項目６６に記載の医薬製剤。
（項目６８）
前記ポリソルベートがポリソルベート８０である、項目６７に記載の医薬製剤。
（項目６９）
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の前記濃度が０．００５％～０．０５％である、項目６８に記載の医薬製剤。
（項目７０）
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の前記濃度が約０．０１％である、項目６９に記載の医薬製剤。
（項目７１）
ＮａＣｌの濃度が、存在する場合は、前記医薬製剤中で約１ｍＭ以下である、項目５６～７０のいずれかに記載の医薬製剤。
（項目７２）
前記タンパク質の濃度が１０～２００ｍｇ／ｍＬである、項目５６～７１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目７３）
前記タンパク質の濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬである、項目７２に記載の医薬製剤。
（項目７４）
約２０ｍＭのクエン酸塩、約２５０ｍＭのスクロース、及び約０．０１％のポリソルベート８０を、ｐＨ７．０で含む、項目５６～５９及び６１～７３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目７５）
約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約２０ｍＭのリン酸カリウム、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び約１２５ｍＭの塩化ナトリウムをｐＨ７．８で含む、項目５６～６０及び７２～７３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
（項目７６）
項目１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞。
（項目７７）
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を、有効量の項目１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質、項目５５に記載の医薬組成物、または項目５６～７５のいずれか１つに記載の医薬製剤に曝露することを含む方法。
（項目７８）
がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の項目１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質、項目５５の医薬組成物、又は項目５６～７５のいずれか１項に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
（項目７９）
前記がんが、血液学的悪性腫瘍である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記血液学的悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び古典的ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ＡＭＬが、未分化型急性骨髄芽球性白血病、最小分化型急性骨髄芽球性白血病、分化型急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増大症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、及び芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ＡＭＬが、ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）上のＣＬＬ－１の発現を特徴とする、項目８０または８１のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
前記ＬＳＣが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３２、及びＣＤ９６から選択される細胞膜マーカーを更に発現する、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記ＡＭＬが最小残存疾患（ＭＲＤ）である、項目８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記ＭＲＤが、ＦＬＴ３－ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）－遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオフォスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、及びＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１及びＩＤＨ２））から選択される変異の有無によって特徴付けられる、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ＭＤＳが、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）、単一血球系統の異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、芽球増大を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）、染色体異常（ｉｓｏｌａｔｅｄｄｅｌ）（５ｑ）を伴うＭＤＳ、及び未分類型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８７）
前記ＭＤＳが一次ＭＤＳまたは二次ＭＤＳである、項目８０に記載の方法。
（項目８８）
前記ＡＬＬが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８９）
前記ＭＰＮが、真性赤血球増大症、本態性血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄線維症から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目９０）
前記非ホジキンリンパ腫が、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目９１）
前記リンパ腫が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、及び組織球腫瘍から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目９２）
前記がんがＣＬＥＣ１２Ａを発現する、項目７８～９１のいずれか１項に記載の方法。

Claims

タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み；
ここで、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位は、以下：
（ｉ）それぞれが配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびにそれぞれが配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２２１、１６６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４０、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）それぞれ配列番号２０６、１６６、及び２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２４５、２３９、及び１７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）それぞれ配列番号２２１、２３６、及び２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１５２、２２６、及び１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１５９、１７０、及び１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１８６、１８８、及び１８９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１９７、２０２、及び２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに配列番号２１１、２１２、及び２１４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｘ）それぞれ配列番号２２０、２２２、及び２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２２４、２２５、及び２２７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｘ）それぞれ配列番号２３０、２３１、及び２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号２３３、２３４、及び２３５のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。
請求項１のタンパク質であって、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号１３７、２７２、及び２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４０、１４１、及び１４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、前記タンパク質。
請求項１または２に記載のタンパク質であって、ここで、
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３３５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号３３６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２７０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２７１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；または
（ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２８９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質であって、
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３３５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号３３６のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２７０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２７１のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２８９のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
前記ＶＨ及びＶＬが、配列番号１４３及び１４４；１４７及び１４４；２４４及び１４４；１７８及び１４４；２５６及び１４４；１４３及び１６３；１４３及び１６７；１４３及び１７１；または１７４及び１７５のアミノ酸配列をそれぞれ含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
前記第２の抗原結合部位が、一本鎖フラグメント変数（ｓｃＦｖ）として存在し、ここで、前記ｓｃＦｖが、配列番号２７４、１４５、１４６、１４９、１５０、１５３、１５４、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６５、１６８、１６９、１７２、１７３、１７６、１７７、１８０、及び１８１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２７４または請求項１８０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号２５１、１９６、及び２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位が、以下：
（ｉ）それぞれ、配列番号１９５、１９６、１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号１９８、１９９、２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９２、１９６、及び２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号１９８、１９９、及び２０１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む請求項１に記載のタンパク質。
前記ＶＨが、配列番号１４８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号２０３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１及び８～９のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ＶＨが、配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号２０３のアミノ酸配列を含む、請求項１及び８～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ＶＨ及びＶＬが、配列番号１６２及び２０３；２１０及び２０３；１６２及び２１８；１４８及び２１８；または２１０及び２１８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のタンパク質。
前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖとして存在し、ここで、前記ｓｃＦｖが、配列番号１８４、１８５、２０４、２０５、２０８、２０９、２１５、２１６、２５２、２５３、２５４、及び２５５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ｓｃＦｖが配列番号２０４のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
前記第２の抗原結合部位が、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み、
ここで、前記第２の抗原結合部位が、グリコシル化に依存しない方法でＣＬＥＣ１２Ａに結合する、前記タンパク質。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、前記第二抗原結合部位がヒトＣＬＥＣ１２Ａに、２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記第２の抗原結合部位が、ＳＰＲによって測定される場合、１ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する、請求項１～７及び１６～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記第２の抗原結合部位が、Ｋ２４４Ｑ置換を含むヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する、請求項１～７及び１５～１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記タンパク質が抗体Ｆｃドメイン、またはＣＤ１６を結合するのに十分なその一部を含む、請求項１～１９のいずれかに記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がＦａｂフラグメントであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、請求項１～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がＦａｂフラグメントである、請求項１～５、８～１２及び１５～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合する追加の抗原結合部位をさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の及び前記追加の抗原結合部位がそれぞれＦａｂフラグメントである、請求項２３に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、かつＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の及び前記追加の抗原結合部位がそれぞれｓｃＦｖである、請求項２３に記載のタンパク質。
前記第２の及び前記追加の抗原結合部位のアミノ酸配列が同一である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載のタンパク質。
タンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；
（ｂ）ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位；及び
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位を含み、
ここで、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、Ｆａｂフラグメントであり、かつＣＬＥＣ１２Ａに結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、前記タンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結されている、請求項２２、２４～２６のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部に連結されている、請求項２１、及び２５～２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、請求項２８または２９に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項２２、２４～２６、２８、及び３０のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項２１、２５～２７、及び３０～３１のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けされた、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前期軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項３１または３２に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが可塑性リンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結される、請求項２２、２４～２６、２８、３０～３１、及び３３のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが可塑性リンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結されている、請求項２１、２５～２７、２９～３０、及び３２～３４のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記可塑性リンカーが、（Ｇ_４Ｓ）_４を含む、請求項３４または３５に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、請求項２２、２４～２６、２８、３０～３１、３３～３４、及び３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、請求項２１、２５～２７、２９～３０、３２～３３、及び３５～３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項２２、２４～２６、２８、３０～３１、３３～３４、及び３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するそれぞれのｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項２１、２５～２７、２９～３０、３２～３３、３５～３６、及び３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂフラグメントが抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその一部との間に配置されていない、請求項２１、２７、２９～３０、３２～３３、３５～３６、３８及び４０のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＣＬＥＣ１２Ａに結合するＦａｂフラグメントが抗原結合部位と前記Ｆｃまたはその一部との間に配置されていない、請求項２２、２４、２６、２８、３０～３１、３３～３４、３６～３７、及び３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、それぞれ配列番号８１、８２、及び１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびにそれぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、及び９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｉｉ）それぞれ配列番号８１、８２、及び８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、それぞれ、配列番号８６、７７、及び８７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが、配列番号９５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記第１の抗原結合部位のＶＬが、配列番号８５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４３または４４のいずれかに記載のタンパク質。
前記第１の抗原結合部位の前記ＶＨが配列番号９５の前記アミノ酸配列を含み、かつ前記第１の抗原結合部位の前記ＶＬが、配列番号８５の前記アミノ酸配列を含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである、請求項１～４６のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体Ｆｃドメインまたはその一部が、配列番号１１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８と比較して、１つ以上の変異を含む、請求項４７または４８に記載のタンパク質。
前記抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けされたＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅから選択される１つ以上の変異を、配列番号１１８に対して含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８に対して、１つ以上の変異を含み；かつ前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号付けられたＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から選択された１つ以上の位置で、配列番号１１８と比較して、１つ以上の変異を含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８に対してＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を含み；かつ前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖は、ＥＵの番号付けシステムに従って番号が付けられた、配列番号１１８と比較して、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換を含む、請求項５１に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域の１つのポリペプチド鎖が、配列番号１１８に対してＹ３４９Ｃ置換を含み；前記抗体重鎖定常領域の前記他のポリペプチド鎖が、ＥＵの番号付けシステムに従って番号が付けられた、配列番号１１８と比較して、Ｓ３５４Ｃ置換を含む、請求項５１または５２に記載のタンパク質。
タンパク質であって：
（ａ）配列番号２５９または配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号２６１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む、
前記タンパク質。
請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
請求項１～５４のいずれか１項に記載の前記タンパク質及びｐＨ７．０以上の緩衝液を含む医薬製剤。
前記製剤のｐＨが７．０～８．０の間である、請求項５６に記載の医薬製剤。
前記緩衝液がクエン酸塩を含む、請求項５６または５７に記載の医薬製剤。
前記クエン酸塩の濃度が１０～２０ｍＭである、請求項５８に記載の医薬製剤。
前記緩衝液がリン酸塩をさらに含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
糖または糖アルコールをさらに含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記糖または糖アルコールが二糖である、請求項６１に記載の医薬製剤。
前記二糖がスクロースである、請求項６２に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの前記濃度が２００～３００ｍＭである、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖または糖アルコールの前記濃度が約２５０ｍＭである、請求項６４に記載の医薬製剤。
非イオン性サーファクタントをさらに含む、請求項５６～６５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記非イオン性サーファクタントがポリソルベートを含む、請求項６６に記載の医薬製剤。
前記ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項６７に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の前記濃度が０．００５％～０．０５％である、請求項６８に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の前記濃度が約０．０１％である、請求項６９に記載の医薬製剤。
ＮａＣｌの濃度が、存在する場合は、前記医薬製剤中で約１ｍＭ以下である、請求項５６～７０のいずれかに記載の医薬製剤。
前記タンパク質の濃度が１０～２００ｍｇ／ｍＬである、請求項５６～７１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記タンパク質の濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項７２に記載の医薬製剤。
約２０ｍＭのクエン酸塩、約２５０ｍＭのスクロース、及び約０．０１％のポリソルベート８０を、ｐＨ７．０で含む、請求項５６～５９及び６１～７３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約２０ｍＭのリン酸カリウム、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び約１２５ｍＭの塩化ナトリウムをｐＨ７．８で含む、請求項５６～６０及び７２～７３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞。
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を、有効量の請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５５に記載の医薬組成物、または請求項５６～７５のいずれか１つに記載の医薬製剤に曝露することを含む方法。
がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５５の医薬組成物、又は請求項５６～７５のいずれか１項に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
前記がんが、血液学的悪性腫瘍である、請求項７８に記載の方法。
前記血液学的悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び古典的ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
前記ＡＭＬが、未分化型急性骨髄芽球性白血病、最小分化型急性骨髄芽球性白血病、分化型急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増大症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、及び芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記ＡＭＬが、ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）上のＣＬＬ－１の発現を特徴とする、請求項８０または８１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＬＳＣが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３２、及びＣＤ９６から選択される細胞膜マーカーを更に発現する、請求項８２に記載の方法。
前記ＡＭＬが最小残存疾患（ＭＲＤ）である、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＲＤが、ＦＬＴ３－ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）－遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオフォスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、及びＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１及びＩＤＨ２））から選択される変異の有無によって特徴付けられる、請求項８４に記載の方法。
前記ＭＤＳが、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）、単一血球系統の異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、芽球増大を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）、染色体異常（ｉｓｏｌａｔｅｄｄｅｌ）（５ｑ）を伴うＭＤＳ、及び未分類型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記ＭＤＳが一次ＭＤＳまたは二次ＭＤＳである、請求項８０に記載の方法。
前記ＡＬＬが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記ＭＰＮが、真性赤血球増大症、本態性血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄線維症から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記非ホジキンリンパ腫が、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記リンパ腫が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、及び組織球腫瘍から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記がんがＣＬＥＣ１２Ａを発現する、請求項７８～９１のいずれか１項に記載の方法。