JP2023507201A - トロンビン由来ペプチドを含む組成物およびその使用 - Google Patents

トロンビン由来ペプチドを含む組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ａ）トロンビン由来ペプチドと、ｂ）ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、ｃ）水性溶液、を含む組成物に関する。本発明はまた、ａ）トロンビン由来ペプチドと、ｂ）ＥＤＴＡと、ｃ）水性バッファー、を含む組成物を提供する。本発明はまた、ａ）高濃度のトロンビン由来ペプチド、を含む組成物を提供する。組成物を含む製品、および処置の方法における使用のための組成物または製品もまた、開示される。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、障害の局所処置の分野に関し、詳細には感染および／または炎症に関連する障害、または関連するようになるリスクがある障害の外用薬処置（ｔｏｐｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の分野に関する。本発明はまた、そのような処置に有用な組成物の分野に関する。一実施形態において、本発明は、抗菌および抗炎症機能を有するトロンビン由来ペプチドを含有する非イオン性ハイドロゲルポリマーを基にした組成物に関する。
発明の背景
様々な型の創傷は、患者、ヘルスケアおよび社会に対して甚大で有意義な影響を有する。創傷のタイプとしては、急性術後創傷および熱傷が挙げられ、大きな患者群は、糖尿病または循環器障害から生じた非治癒性潰瘍を有する。１０００例あたりおよそ２例の点有病率を有する慢性創傷のためのコストは、実質的であり、先進国における総医療制度コストの１～３％を占める。熱傷を考慮すると、６７００００００例の傷害が２０１５年に報告され、約２９０００００例の入院および１７６．０００例の死亡をもたらした。２０１４年に発表された試験では、高所得国における熱傷治癒のための平均総コストは、患者あたりおよそ８８０００米ドルと推定された。
生理学的観点から、創傷治癒は、生物学的に連結された事象の進化的に保存された生理学的連鎖である。ホメオスタシスの初期相に炎症、増殖、および組織リモデリングの相が続く。ヒト自然免疫により媒介される初期サーベランスは、創傷形成の間の細菌制御の助けになり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によるリポ多糖感知は、感染への早期応答に不可欠である。しかし、過剰なＴＬＲ応答は、術後感染、感染した熱傷創、または非治癒性潰瘍で観察される通り、局在化されかつ時には過剰な炎症を引き起こす。これらの創傷合併症は全て、適正な治癒を遅延させ、重度感染のリスクを増加させ、潜在的に瘢痕形成に導く。全身抗生物質の防護的使用は、創傷および外科的感染の発生率を低減し得る。しかしこの抗生物質使用は、耐性の発症と、術後感染、ならびに慢性創傷および熱傷における感染を引き起こす細菌である黄色ブドウ球菌および緑膿菌の抗生物質耐性株により引き起こされる感染とを駆動し、大きな課題を提起する。例えば欧州の病院では、手術部位感染（ＳＳＩ）の全比率は、手術を受けた患者の３％～４％の間の範囲である。問題となる手術の性質に応じて、ＳＳＩの発生率は、＜１％～＞１０％の範囲である。ＳＳＩの発生率は年齢に関連し、６４歳より高齢の患者では割合が倍増するため、将来は、人口の高齢化に伴い、ＳＳＩの発生率が急激に増加すると予期される。抗生物質処置の他に、創傷感染を妨げる今日の方策は、様々な抗感染成分を有するゲル、ドレッシング、または生物材料の機能化を含む。医院で共通して用いられる添加剤としては、急性創傷および熱傷、ならびに非治癒性潰瘍に用いられる銀およびポリヘキサニド（ポリヘキサメチレンビグアニド、ＰＨＭＢ）が挙げられる。そのような処置は細菌を殺傷し得るが、それらは、関連の炎症成分に対処しない。反対に、炎症に対処する処置は主に、ゼラチンを基にした創傷ドレッシングなどのプロテアーゼを不活性化およびスカベンジすることを目的とする。したがって今日の創傷治癒は、１つの問題（感染またはプロテアーゼ作用）にしか対処せず、創傷または外科的環境において細菌を制御すること、ならびに過剰な感染、つまり炎症の起源および原因を標的とすることの両方に現在利用可能な治療モダリティーはない。
創傷治癒は生存にとって重要であるため、複数の自然な宿主防御システムが初期ホメオスタシスおよび血栓形成を含む傷害の間に活性化されること、ならびにタンパク質およびペプチドが我々の自然免疫系で活性化されることは、驚くことではない。ヒトにおいて、そのような宿主防御システムの例としては、好中球由来α－ディフェンシンおよびカテリシジンＬＬ－３７およびトロンビンなどの血漿タンパク質のタンパク質分解産物が挙げられる。トロンビンは、第Ｘ凝固因子による選択的タンパク質分解により最初に形成され、急性創傷相においてフィブリノーゲン分解および血栓形成を媒介する。しかし、次のタンパク質分解は、リポ多糖（ＬＰＳ）および細菌の凝集を媒介してエンドトキシンクリアランスおよび微生物殺傷を容易にする、約１１ｋＤａの断片の形成をもたらす。さらなるタンパク質分解は、ヒト創傷液中に存在し、インビトロおよびインビボにおいて抗エンドトキシン機能を発揮することが実証されているＦＹＴ２１（ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）およびＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４）などの、およそ２ｋＤａのより小さなトロンビン由来Ｃ末端ペプチド（ＴＣＰ）の形成をもたらす。これらの内在性配列を含むペプチドＴＣＰ－２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、抗微生物性であり、細菌ＬＰＳに結合しそれを中和し、実験動物モデルにおいて、主に全身サイトカイン応答の低減を介して、緑膿菌誘導性敗血症およびＬＰＳ介在性ショックから保護する。その上、ペプチドは、単球およびマクロファージと直接相互作用し、複数の微生物由来アゴニストに応答してＴＬＲ４－およびＴＬＲ２－誘導性ＮＦ－ｋＢ活性化を阻害する。加えてペプチドは、食作用の間に無傷の細菌への炎症応答を低減し、インビトロおよびインビボでのＬＰＳへの好中球応答を阻害する。
欧州特許第１９８７０５６号は、ＴＣＰ－２５ペプチドおよびその様々な変異体が開示される。
欧州特許第２４８０５６７号は、ＴＣＰ－２５ペプチドおよびその様々な変異体の使用が開示される。
発明の概要
しかし、ＴＣＰ－２５ペプチドおよび類似のペプチドの送達のための適切で安定で効果的な配合剤および組成物が、必要とされている。詳細には、局所処置、例えば外用薬処置に有用である医薬配合剤が、必要とされている。高い安定性を有するＴＣＰ－２５ペプチドを含む医薬配合剤もまた、必要とされている。高い有効性、詳細には高い抗菌有効性および／または抗炎症有効性を有するＴＣＰ－２５ペプチドを含む医薬配合剤もまた、必要とされている。
興味深いことに本発明は、局所適用の部位でかなりの量のＴＣＰペプチドを保持でき、同時にＴＣＰペプチドの抗炎症および抗菌効果とネガティブに干渉しない、ＴＣＰペプチドを含む医薬配合剤を提供する。
ＴＣＰ－２５および他のＴＣＰペプチドの作用は、ＬＳＰ結合時のＣ形ターンおよびヘリックス構造の形成などの構造転移を含み、細菌膜とＣＤ１４相互作用のの両方のための能力にある程度依存する。残念ながら、幾つかの配合剤は、ＴＣＰ－２５の構造変化を誘導して、活性損失をもたらす。興味深いことに、本発明により提供される配合剤は、ＴＣＰペプチド構造と干渉せず、ＴＣＰペプチドの機能を支援する。
本発明はまた、高い安定性を有するＴＣＰペプチドを含む医薬配合剤を提供する。興味深いことに本発明は、高濃度のＴＣＰペプチドを含む組成物がより安定であることを示す。そのような組成物は、例えば変性に対してより耐性である。本発明は、ＴＣＰペプチドが可逆的様式で高濃度にてオリゴマー化することを示す。理論に結び付けるわけではないが、オリゴマー化は、ＴＣＰペプチドの安定化を援助し得ると考えられる。
本発明はまた、高い抗菌有効性を有するＴＣＰペプチドを含む医薬配合剤を提供する。興味深いことに本発明は、ＴＣＰペプチドの抗菌有効性がＥＤＴＡの存在下で有意に増加され得ることを示す。
したがって、ＴＣＰ－２５ペプチドおよび／または他のＴＣＰペプチドを含有するのに適する組成物を提供することが、本発明の目的である。ＴＣＰ－２５ペプチドおよび／または他のＴＣＰペプチドを含有する安定した組成物を提供することもまた、本発明の目的である。高い抗菌活性を有するＴＣＰ－２５ペプチドおよび／または他のＴＣＰペプチドを含有する組成物を提供することもまた、本発明の目的である。
上記の目的および他のそれぞれを完遂する手段は、本明細書の以後に示される本発明の記載から明白となろう。
本発明は、ＴＣＰペプチドを含む非イオン性ハイドロゲルが、フィブリンなどの生物学的マトリックス中に見出される創傷由来の宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）の内因作用を模倣し得る局所送達スカフォールドを提供することを開示する。実施例の節にさらに示される通り、本発明者らは、ＴＣＰペプチドを含むハイドロゲルが、実験的創傷モデルにおいて細菌とそれに伴う炎症応答の両方を標的とする「二重機能」の局所治療薬として作用し得ることを示す。しかしこれらの治療効果は、ハイドロゲルの適正な組成を条件とし、詳細にはハイドロゲルは、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含むことを条件とする。そのようなハイドロゲルは、治療効果を支援する局所環境を有するＴＣＰペプチドを提供すると考えられる。本明細書で示される通り、本発明による配合剤は、抗菌活性を有する。
加えて、本発明による配合剤が炎症を低減できることが、示される。
したがって本発明は、
ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｂ）水性溶液と混合されるとハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、
水性溶液、
を含む組成物を提供する。
ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含む配合剤は、ＴＣＰペプチドの抗菌および／または抗炎症活性を支援する。理論に結び付けるのを望むものではないが、これは、ＬＰＳ結合時のＣ形ターンおよびヘリックス構造の形成などの構造転移を含むＴＣＰペプチドの作用に結び付けられられることが企図され、それは、細菌膜およびＣＤ１４相互作用の両方のための能力を必要とすることが企図される。

ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｂ）ＥＤＴＡと、
ｃ）水性バッファー、
を含み、多くとも７のｐＨを有する、組成物を提供することもまた、本発明の態様である。
ＥＤＴＡを含む配合剤は、ＴＣＰペプチドの抗菌活性を支援する。
アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物を含む組成物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有し、
組成物のペプチドの濃度が、少なくとも０．０１ｗｔ％、好ましくは少なくとも０．０８ｗｔ％、少なくとも０．１ｗｔ％など、例えば０．０８～３ｗｔ％の範囲である、
組成物を提供することもまた、本発明の態様である。
そのような組成物は概して、高い安定性を有し、それに含有されるＴＣＰペプチドは、概して変性に対してより耐性である。
本発明の組成物を含む製品を提供することもまた、本発明の態様である。
加えて、局所投与のために調製される、それを必要とする個体における障害の処置の方法における使用のための本発明の組成物、を提供することが、態様である。
図１Ａ～Ｄは、様々な配合剤でのＴＣＰ－２５の抗菌効果および抗エンドトキシン効果を示す。図１Ａは、ＴＣＰ－２５配合剤のペプチド活性および放出プロファイルを示す。様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の活性が、ＲＤＡを用いて大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。これらは、放出されたペプチドの阻害効果に対応する。データは、平均として表される（ｎ＝３）。図１Ｂは、生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）により評定された、様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示す棒グラフを示す。大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有さない配合物質と共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均として表される（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤がエンドトキシン誘導性炎症促進反応を遮断するかどうかを検査するために、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。図１Ｃの棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。値は、平均値を表す（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤の細胞生存能を評定するために、ＭＴＴアッセイが用いられた。図１Ｄの棒グラフは、ＭＴＴアッセイを用いて定量された、生存可能細胞のパーセント値を示す。値は、非処置の生存細胞（１００％、点線）に比較して示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定の後に、ダンの事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。 図１Ａ～Ｄは、様々な配合剤でのＴＣＰ－２５の抗菌効果および抗エンドトキシン効果を示す。図１Ａは、ＴＣＰ－２５配合剤のペプチド活性および放出プロファイルを示す。様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の活性が、ＲＤＡを用いて大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。これらは、放出されたペプチドの阻害効果に対応する。データは、平均として表される（ｎ＝３）。図１Ｂは、生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）により評定された、様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示す棒グラフを示す。大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合物質と共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均として表される（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤が、エンドトキシン誘導性炎症促進反応を遮断するかどうかを検査するために、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激された。図１Ｃの棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。値は、平均値を表す（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤の細胞生存能を評定するために、ＭＴＴアッセイが用いられた。図１Ｄの棒グラフは、ＭＴＴアッセイを用いて定量された、生存可能細胞のパーセント値を示す。値は、非処置の生存細胞（１００％、点線）に比較して示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定の後に、ダンの事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。 図１Ａ～Ｄは、様々な配合剤でのＴＣＰ－２５の抗菌効果および抗エンドトキシン効果を示す。図１Ａは、ＴＣＰ－２５配合剤のペプチド活性および放出プロファイルを示す。様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の活性が、ＲＤＡを用いて大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。これらは、放出されたペプチドの阻害効果に対応する。データは、平均として表される（ｎ＝３）。図１Ｂは、生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）により評定された、様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示す棒グラフを示す。大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合物質と共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均として表される（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤が、エンドトキシン誘導性炎症促進反応を遮断するかどうかを検査するために、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激された。図１Ｃの棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。値は、平均値を表す（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤の細胞生存能を評定するために、ＭＴＴアッセイが用いられた。図１Ｄの棒グラフは、ＭＴＴアッセイを用いて定量された、生存可能細胞のパーセント値を示す。値は、非処置の生存細胞（１００％、点線）に比較して示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定の後に、ダンの事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。 図１Ａ～Ｄは、様々な配合剤でのＴＣＰ－２５の抗菌効果および抗エンドトキシン効果を示す。図１Ａは、ＴＣＰ－２５配合剤のペプチド活性および放出プロファイルを示す。様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の活性が、ＲＤＡを用いて大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。これらは、放出されたペプチドの阻害効果に対応する。データは、平均として表される（ｎ＝３）。図１Ｂは、生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）により評定された、様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）中のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示す棒グラフを示す。大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合物質と共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均として表される（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤が、エンドトキシン誘導性炎症促進反応を遮断するかどうかを検査するために、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤（ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ）の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激された。図１Ｃの棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。値は、平均値を表す（ｎ＝３）。ＴＣＰ－２５配合剤の細胞生存能を評定するために、ＭＴＴアッセイが用いられた。図１Ｄの棒グラフは、ＭＴＴアッセイを用いて定量された、生存可能細胞のパーセント値を示す。値は、非処置の生存細胞（１００％、点線）に比較して示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定の後に、ダンの事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。 さらに図１Ｅ～Ｈは、関係するポリマーヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）とのＨＰＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の比較を示す。図Ｅは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５のペプチド活性および放出プロファイルを示す。ＴＣＰ－２５の放出および活性は、ＲＤＡ中の大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。この図は、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図１Ｆは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。大腸菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合剤ゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。図１Ｇは、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激される、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗エンドトキシン効果の比較を示す。棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図１Ｈは、配合剤成分単独およびＴＣＰ－２５との組み合わせでの毒性効果の同時分析が実施されたことを示す。ヒストグラムは、ＭＴＴアッセイを利用して定量された生存可能細胞のパーセント値を示す。溶解された細胞が、陽性対照として用いられた。値は、非処置の生存細胞（１００％）との比較で示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 さらに図１Ｅ～Ｈは、関係するポリマーヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）とのＨＰＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の比較を示す。図Ｅは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５のペプチド活性および放出プロファイルを示す。ＴＣＰ－２５の放出および活性は、ＲＤＡ中の大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。この図は、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図１Ｆは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。大腸菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合剤ゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。図１Ｇは、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激される、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗エンドトキシン効果の比較を示す。棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図１Ｈは、配合剤成分単独およびＴＣＰ－２５との組み合わせでの毒性効果の同時分析が実施されたことを示す。ヒストグラムは、ＭＴＴアッセイを利用して定量された生存可能細胞のパーセント値を示す。溶解された細胞が、陽性対照として用いられた。値は、非処置の生存細胞（１００％）との比較で示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 さらに図１Ｅ～Ｈは、関係するポリマーヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）とのＨＰＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の比較を示す。図Ｅは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５のペプチド活性および放出プロファイルを示す。ＴＣＰ－２５の放出および活性は、ＲＤＡ中の大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。この図は、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図１Ｆは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。大腸菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合剤ゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。図１Ｇは、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激される、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗エンドトキシン効果の比較を示す。棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図１Ｈは、配合剤成分単独およびＴＣＰ－２５との組み合わせでの毒性効果の同時分析が実施されたことを示す。ヒストグラムは、ＭＴＴアッセイを利用して定量された生存可能細胞のパーセント値を示す。溶解された細胞が、陽性対照として用いられた。値は、非処置の生存細胞（１００％）との比較で示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 さらに図１Ｅ～Ｈは、関係するポリマーヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）とのＨＰＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の比較を示す。図Ｅは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５のペプチド活性および放出プロファイルを示す。ＴＣＰ－２５の放出および活性は、ＲＤＡ中の大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定された。この図は、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図１Ｆは、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。大腸菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しない配合剤ゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。図１Ｇは、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞が、ＴＣＰ－２５を有する、および有しない様々な配合剤の存在下で大腸菌ＬＰＳで刺激される、ＨＰＣおよびＨＥＣ中のＴＣＰ－２５配合剤の抗エンドトキシン効果の比較を示す。棒グラフは、ＳＥＡＰの生成を測定することにより決定されたＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図１Ｈは、配合剤成分単独およびＴＣＰ－２５との組み合わせでの毒性効果の同時分析が実施されたことを示す。ヒストグラムは、ＭＴＴアッセイを利用して定量された生存可能細胞のパーセント値を示す。溶解された細胞が、陽性対照として用いられた。値は、非処置の生存細胞（１００％）との比較で示される。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図２Ａ～Ｃは、ＣＤ分光法により決定されたＴＣＰ－２５の二次構造変化を示す。図２Ａは、トリスバッファー、ＬＰＳ、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＣＭＣ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（１：１および１：５のＴＣＰ－２５対ポリマー比）とのインキュベーション後に測定されたＴＣＰ－２５のＣＤスペクトルを示す。図２Ｂは、トリスバッファー、ＬＰＳ、およびポリマー（１：５の比）の存在下の２２２ｎｍでのモルエリプソメトリーから計算されたＴＣＰ－２５のα－ヘリックス含量を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。図２Ｃは、ＨＥＣゲル配合剤中の種々の濃度のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。黄色ブドウ球菌および緑膿菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないハイドロゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図２Ａ～Ｃは、ＣＤ分光法により決定されたＴＣＰ－２５の二次構造変化を示す。図２Ａは、トリスバッファー、ＬＰＳ、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＣＭＣ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（１：１および１：５のＴＣＰ－２５対ポリマー比）とのインキュベーション後に測定されたＴＣＰ－２５のＣＤスペクトルを示す。図２Ｂは、トリスバッファー、ＬＰＳ、およびポリマー（１：５の比）の存在下の２２２ｎｍでのモルエリプソメトリーから計算されたＴＣＰ－２５のα－ヘリックス含量を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。図２Ｃは、ＨＥＣゲル配合剤中の種々の濃度のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。黄色ブドウ球菌および緑膿菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないハイドロゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図２Ａ～Ｃは、ＣＤ分光法により決定されたＴＣＰ－２５の二次構造変化を示す。図２Ａは、トリスバッファー、ＬＰＳ、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＣＭＣ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（１：１および１：５のＴＣＰ－２５対ポリマー比）とのインキュベーション後に測定されたＴＣＰ－２５のＣＤスペクトルを示す。図２Ｂは、トリスバッファー、ＬＰＳ、およびポリマー（１：５の比）の存在下の２２２ｎｍでのモルエリプソメトリーから計算されたＴＣＰ－２５のα－ヘリックス含量を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；ＮＳ 有意でない。図２Ｃは、ＨＥＣゲル配合剤中の種々の濃度のＴＣＰ－２５の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。黄色ブドウ球菌および緑膿菌が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないハイドロゲルと共にインキュベートされた。抗微生物活性を定量するために、反応混合物の適当な希釈物が、ＴＨブロス寒天上に播種された後、３７℃で一晩インキュベートされ、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図３Ａ～Ｂは、ＨＥＣゲル中で配合されたＴＣＰ－２５（ＴＣＰ－２５ゲル＃１）のインビトロ抗菌効果を示す。図３Ａは、ＴＣＰ－２５ゲル＃１での処置後の細菌バイオルミネッセンス測定を示す。バイオルミネッセンス性の黄色ブドウ球菌または緑膿菌（１０７／ｍＬ ＣＦＵ）が、ＴＣＰ－２５ゲル＃１で処置された。細菌から放出されたバイオルミネッセンスが、ルミネッセンスプレートリーダーを用いて測定された。折れ線グラフは、示された時点での総バイオルミネッセンスカウントを示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図３Ｂは、黄色ブドウ球菌または緑膿菌に対するＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。Ｐ値は、対応のないｔ検定を用いて決定された。比較が、それぞれのゲル対照で行われた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図３Ａ～Ｂは、ＨＥＣゲル中で配合されたＴＣＰ－２５（ＴＣＰ－２５ゲル＃１）のインビトロ抗菌効果を示す。図３Ａは、ＴＣＰ－２５ゲル＃１での処置後の細菌バイオルミネッセンス測定を示す。バイオルミネッセンス性の黄色ブドウ球菌または緑膿菌（１０７／ｍＬ ＣＦＵ）が、ＴＣＰ－２５ゲル＃１で処置された。細菌から放出されたバイオルミネッセンスが、ルミネッセンスプレートリーダーを用いて測定された。折れ線グラフは、示された時点での総バイオルミネッセンスカウントを示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図３Ｂは、黄色ブドウ球菌または緑膿菌に対するＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤の抗微生物効果を示すＶＣＡを示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。Ｐ値は、対応のないｔ検定を用いて決定された。比較が、それぞれのゲル対照で行われた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図４Ａ～Ｅは、皮下感染および炎症のマウスモデルにおけるＴＣＰ－２５ゲル＃１配合剤の抗菌効果および抗炎症効果を示す。図４Ａは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。対照ＨＥＣゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＳＫＨ１マウスの背中において１０６ＣＦＵのバイオルミネッセンス性緑膿菌または黄色ブドウ球菌での接種後に皮下に沈着された。インビボ薬物局在化を視覚化するために、配合剤中で用いられたＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。異なる時点で、細菌バイオルミネッセンス強度およびＴＣＰ－２５Ｃｙ５蛍光が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムを用いて非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染６時間後の細菌ルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、感染後６時間で細菌により放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各細菌感染でゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｂは、ゲル沈着の部位からのマウス皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の代表的画像を示す。矢印は、組織破壊および組織の過炎症状態を示す。図４Ｃは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＨＥＣゲルまたはＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤中のＬＰＳが、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＴｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部に皮下沈着された（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｐｏｓｉｔ）。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボバイオイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルシステムを用いて実施された。インビボ薬物局在化を撮像するために、ＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。代表的な画像は、６時間目のバイオルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、これらのレポータマウスから放出された、測定された光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝５匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｄは、植え込まれたＰＵディスクから抽出された創傷液からのサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝４匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝４匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図４Ｅはさらに、感染後２４時間の組織の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１。 図４Ａ～Ｅは、皮下感染および炎症のマウスモデルにおけるＴＣＰ－２５ゲル＃１配合剤の抗菌効果および抗炎症効果を示す。図４Ａは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。対照ＨＥＣゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＳＫＨ１マウスの背中において１０６ＣＦＵのバイオルミネッセンス性緑膿菌または黄色ブドウ球菌での接種後に皮下に沈着された。インビボ薬物局在化を視覚化するために、配合剤中で用いられたＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。異なる時点で、細菌バイオルミネッセンス強度およびＴＣＰ－２５Ｃｙ５蛍光が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムを用いて非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染６時間後の細菌ルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、感染後６時間で細菌により放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各細菌感染でゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｂは、ゲル沈着の部位からのマウス皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の代表的画像を示す。矢印は、組織破壊および組織の過炎症状態を示す。図４Ｃは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＨＥＣゲルまたはＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤中のＬＰＳが、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＴｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部に皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボバイオイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルシステムを用いて実施された。インビボ薬物局在化を撮像するために、ＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。代表的な画像は、６時間目のバイオルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、これらのレポータマウスから放出された、測定された光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝５匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｄは、植え込まれたＰＵディスクから抽出された創傷液からのサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝４匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝４匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図４Ｅはさらに、感染後２４時間の組織の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１。 図４Ａ～Ｅは、皮下感染および炎症のマウスモデルにおけるＴＣＰ－２５ゲル＃１配合剤の抗菌効果および抗炎症効果を示す。図４Ａは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。対照ＨＥＣゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＳＫＨ１マウスの背中において１０６ＣＦＵのバイオルミネッセンス性緑膿菌または黄色ブドウ球菌での接種後に皮下に沈着された。インビボ薬物局在化を視覚化するために、配合剤中で用いられたＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。異なる時点で、細菌バイオルミネッセンス強度およびＴＣＰ－２５Ｃｙ５蛍光が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムを用いて非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染６時間後の細菌ルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、感染後６時間で細菌により放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各細菌感染でゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｂは、ゲル沈着の部位からのマウス皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の代表的画像を示す。矢印は、組織破壊および組織の過炎症状態を示す。図４Ｃは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＨＥＣゲルまたはＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤中のＬＰＳが、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＴｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部に皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボバイオイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルシステムを用いて実施された。インビボ薬物局在化を撮像するために、ＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。代表的な画像は、６時間目のバイオルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、これらのレポータマウスから放出された、測定された光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝５匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｄは、植え込まれたＰＵディスクから抽出された創傷液からのサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝４匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝４匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図４Ｅはさらに、感染後２４時間の組織の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１。 図４Ａ～Ｅは、皮下感染および炎症のマウスモデルにおけるＴＣＰ－２５ゲル＃１配合剤の抗菌効果および抗炎症効果を示す。図４Ａは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。対照ＨＥＣゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＳＫＨ１マウスの背中において１０６ＣＦＵのバイオルミネッセンス性緑膿菌または黄色ブドウ球菌での接種後に皮下に沈着された。インビボ薬物局在化を視覚化するために、配合剤中で用いられたＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。異なる時点で、細菌バイオルミネッセンス強度およびＴＣＰ－２５Ｃｙ５蛍光が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムを用いて非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染６時間後の細菌ルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、感染後６時間で細菌により放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各細菌感染でゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｂは、ゲル沈着の部位からのマウス皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の代表的画像を示す。矢印は、組織破壊および組織の過炎症状態を示す。図４Ｃは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＨＥＣゲルまたはＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤中のＬＰＳが、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＴｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部に皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボバイオイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルシステムを用いて実施された。インビボ薬物局在化を撮像するために、ＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。代表的な画像は、６時間目のバイオルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、これらのレポータマウスから放出された、測定された光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝５匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｄは、植え込まれたＰＵディスクから抽出された創傷液からのサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝４匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝４匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図４Ｅはさらに、感染後２４時間の組織の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１。 図４Ａ～Ｅは、皮下感染および炎症のマウスモデルにおけるＴＣＰ－２５ゲル＃１配合剤の抗菌効果および抗炎症効果を示す。図４Ａは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。対照ＨＥＣゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＳＫＨ１マウスの背中において１０６ＣＦＵのバイオルミネッセンス性緑膿菌または黄色ブドウ球菌での接種後に皮下に沈着された。インビボ薬物局在化を視覚化するために、配合剤中で用いられたＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。異なる時点で、細菌バイオルミネッセンス強度およびＴＣＰ－２５Ｃｙ５蛍光が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムを用いて非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染６時間後の細菌ルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、感染後６時間で細菌により放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各細菌感染でゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｂは、ゲル沈着の部位からのマウス皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の代表的画像を示す。矢印は、組織破壊および組織の過炎症状態を示す。図４Ｃは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＨＥＣゲルまたはＴＣＰ－２５ ＨＥＣ配合剤中のＬＰＳが、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＴｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部に皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボバイオイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルシステムを用いて実施された。インビボ薬物局在化を撮像するために、ＴＣＰ－２５が、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされた。代表的な画像は、６時間目のバイオルミネッセンス（ｌｕｍ）およびＴＣＰ－２５ Ｃｙ５蛍光（ｆｌｕ）を示す。棒グラフは、これらのレポータマウスから放出された、測定された光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、およびＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝５匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図４Ｄは、植え込まれたＰＵディスクから抽出された創傷液からのサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝４匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝４匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図４Ｅはさらに、感染後２４時間の組織の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲル群ｎ＝７匹マウス、ＴＣＰ－２５ゲル＃１群ｎ＝７匹マウス）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図５Ａ～Ｈは、ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果を示す。図５Ａは、ミニブタにおける創傷形成計画を示す。各側に６箇所ずつ１２箇所の部分層創傷が、ゲッチンゲン系ミニブタの背部に電動デルマトームを用いて作製され、黄色ブドウ球菌で感染された。各創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染された。この図はまた、創傷ドレッシングのプランを示す。手短に述べると、感染およびゲル塗布の後、創傷が一次ポリウレタンドレッシングで覆われ、その後に透明の呼吸可能な固定ドレッシングで覆われた。より良好な固定のために、ドレッシングはその後、皮膚用ステープルで固着された。創傷領域はその後、二層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、一層の可撓性自己接着バンデージが、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。加えてこれらの図は、ミニブタ試験で用いられた、短期および長期の２つの治療的アプローチを記載する。図５Ｂは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。黄色ブドウ球菌または混合感染（黄色ブドウ球菌、および緑膿菌の重感染）のどちらかを有する創傷が、ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲルで毎日処置された。非感染の対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図５Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｄは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｅは、２、３、および４日目に回収された創傷液サイトカインの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（黄色ブドウ球菌感染群では、ブタ４匹から、ゲルでｎ＝８～１０の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７～９の創傷、および非感染対照ではｎ＝３の創傷、混合感染群では、ブタ２匹から、ゲルでｎ＝４の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝５の創傷、および非感染対照でｎ＝３の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図５Ｆは、処置４日後の創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷の複数の組織破壊および過炎症状態を示す。矢じりは、創傷の再上皮化を示す。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝１２、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１２）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｇは、長期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲルで１、２、３、５、７および９日目に処置された。下のパネルでは画像は、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す。ドットプロットは、２、５、および７日目の創傷の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝１０）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図５Ｈは、ミニブタの創傷治癒（非感染創傷）に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル処置の効果を示す。部分層創傷は、ミニブタで作製され、ＴＣＰ－２５ゲルで処置された。創傷およびＨ＆Ｅ染色された創傷生検の代表的な写真画像が、示される。棒グラフは、創傷組織の組織学的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ４匹から、ゲルでｎ＝１０、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝９）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図６Ａ～Ｄは、インビトロでのヒト好中球エラスターゼによるＴＣＰ－２５の分解、ならびにインビトロおよびインビボで作製されたタンパク質分解性トロンビン断片との比較を示す。図６Ａは、ＨＮＥでの処置後のＴＣＰ－２５の消化パターンを示す。酵素での消化が、異なる期間で実施され、質量分析により分析された。表は、主要なペプチドの配列、ならびに１０、３０、６０および１８０分目の質量分析による同定に成功した数を示す。図６Ｂは、消化後に得られた主要なペプチドのグラフ表示およびトロンビン消化後に見出されたペプチドとの比較、ならびにインビボで創傷中に検出されたペプチドを示す。＊抗菌効果を示すことが報告されたペプチド。図６Ｃは、ＨＮＥ消化ＴＣＰ－２５の代表的な高分解能ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。同じペプチド断片が、バッファー溶液およびゲルの中で検出された。１８０分後に、インタクトＴＣＰ－２５は、溶液またはゲル試料から検出され得なかった。同定されたペプチド配列が、下のパネルに示される。図６Ｄは、ＴＣＰ－２５分解産物の放出および活性が、０．１５Ｍ ＮａＣＩを有する、または有しない１０ｍＭトリスｐＨ７．４中のＲＤＡにより大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定されたことを示す。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図６Ａ～Ｄは、インビトロでのヒト好中球エラスターゼによるＴＣＰ－２５の分解、ならびにインビトロおよびインビボで作製されたタンパク質分解性トロンビン断片との比較を示す。図６Ａは、ＨＮＥでの処置後のＴＣＰ－２５の消化パターンを示す。酵素での消化が、異なる期間で実施され、質量分析により分析された。表は、主要なペプチドの配列、ならびに１０、３０、６０および１８０分目の質量分析による同定に成功した数を示す。図６Ｂは、消化後に得られた主要なペプチドのグラフ表示およびトロンビン消化後に見出されたペプチドとの比較、ならびにインビボで創傷中に検出されたペプチドを示す。＊抗菌効果を示すことが報告されたペプチド。図６Ｃは、ＨＮＥ消化ＴＣＰ－２５の代表的な高分解能ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。同じペプチド断片が、バッファー溶液およびゲルの中で検出された。１８０分後に、インタクトＴＣＰ－２５は、溶液またはゲル試料から検出され得なかった。同定されたペプチド配列が、下のパネルに示される。図６Ｄは、ＴＣＰ－２５分解産物の放出および活性が、０．１５Ｍ ＮａＣＩを有する、または有しない１０ｍＭトリスｐＨ７．４中のＲＤＡにより大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定されたことを示す。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図６Ａ～Ｄは、インビトロでのヒト好中球エラスターゼによるＴＣＰ－２５の分解、ならびにインビトロおよびインビボで作製されたタンパク質分解性トロンビン断片との比較を示す。図６Ａは、ＨＮＥでの処置後のＴＣＰ－２５の消化パターンを示す。酵素での消化が、異なる期間で実施され、質量分析により分析された。表は、主要なペプチドの配列、ならびに１０、３０、６０および１８０分目の質量分析による同定に成功した数を示す。図６Ｂは、消化後に得られた主要なペプチドのグラフ表示およびトロンビン消化後に見出されたペプチドとの比較、ならびにインビボで創傷中に検出されたペプチドを示す。＊抗菌効果を示すことが報告されたペプチド。図６Ｃは、ＨＮＥ消化ＴＣＰ－２５の代表的な高分解能ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。同じペプチド断片が、バッファー溶液およびゲルの中で検出された。１８０分後に、インタクトＴＣＰ－２５は、溶液またはゲル試料から検出され得なかった。同定されたペプチド配列が、下のパネルに示される。図６Ｄは、ＴＣＰ－２５分解産物の放出および活性が、０．１５Ｍ ＮａＣｌを有する、または有しない１０ｍＭトリスｐＨ７．４中のＲＤＡにより大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定されたことを示す。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図６Ａ～Ｄは、インビトロでのヒト好中球エラスターゼによるＴＣＰ－２５の分解、ならびにインビトロおよびインビボで作製されたタンパク質分解性トロンビン断片との比較を示す。図６Ａは、ＨＮＥでの処置後のＴＣＰ－２５の消化パターンを示す。酵素での消化が、異なる期間で実施され、質量分析により分析された。表は、主要なペプチドの配列、ならびに１０、３０、６０および１８０分目の質量分析による同定に成功した数を示す。図６Ｂは、消化後に得られた主要なペプチドのグラフ表示およびトロンビン消化後に見出されたペプチドとの比較、ならびにインビボで創傷中に検出されたペプチドを示す。＊抗菌効果を示すことが報告されたペプチド。図６Ｃは、ＨＮＥ消化ＴＣＰ－２５の代表的な高分解能ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。同じペプチド断片が、バッファー溶液およびゲルの中で検出された。１８０分後に、インタクトＴＣＰ－２５は、溶液またはゲル試料から検出され得なかった。同定されたペプチド配列が、下のパネルに示される。図６Ｄは、ＴＣＰ－２５分解産物の放出および活性が、０．１５Ｍ ＮａＣＩを有する、または有しない１０ｍＭトリスｐＨ７．４中のＲＤＡにより大腸菌に対する抗微生物活性を評価することにより決定されたことを示す。棒グラフは、得られたクリアランスのゾーンの測定を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合され、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着後６時間のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎ Ａｇでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確立後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確定された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、ＭｅｐｉｌｅｘＡｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図７Ａ～Ｍは、ＴＣＰ－２５ゲルと創傷処置ベンチマークの比較を示す。ＴＣＰ－２５ゲルは、創傷治癒における２種の現行の標準ベンチマークであるＭｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎと比較された。図７Ａは、短期処置レジメン後のミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、１０７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌で感染され、ＴＣＰ－２５ゲル、Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇまたはＰｒｏｎｔｏｓａｎで１日１回処置された。図７Ｂは、２、３および４日目からの創傷の微生物分析を示す。スワブ試料が創傷から回収され、適当な希釈物がＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵの数が決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。比較が、「ゲル」群に対して示され、Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｃは、短期処置レジメン後の創傷の臨床スコア付けを示す。データは、９５％信頼区間でのメディアンとして表される（ブタ３匹から、ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｄは、創傷生検のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な画像を示す。矢印は、創傷中の重度の組織破壊および炎症浸潤を示す。矢じりは、創傷の再上皮化のエリアを示す。図７Ｅは、ミニブタの確立された感染モデル実験計画を示す。図７Ｆは、確立された感染処置レジメンの２および１０日目でのミニブタ創傷の代表的な写真画像を示す。創傷は、黄色ブドウ球菌で感染され、感染の確定後、２、３、５、７および９日目に対照ゲル、ＴＣＰ－２５、またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（スケールバー １ｃｍ）。図７Ｇは、２、３、５、９および１０日目からの創傷（確立された感染モデルのもの）の微生物分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｈは、２、３および５日目に採取された創傷液中のＴＮＦ－αの分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ブタ２匹から、ゲルでｎ＝７の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝７の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝７の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図７Ｉは、皮下感染のマウスモデルにおけるＩＶＩＳによるインビボ感染撮像を示す。ＴＣＰ－２５ゲル配合剤が、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌または緑膿菌を添加した後のＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。異なる時点で細菌バイオルミネッセンス強度が、ＩＶＩＳバイオイメージングシステムで非侵襲的に分析された。代表的な画像は、感染後６時間での細菌ルミネッセンスを示す（各群でｎ＝６）。図７Ｊは、ＮＦ－ｋＢレポータマウスにおけるＩＶＩＳによるインビボ炎症撮像を示す。ＰｒｏｎｔｏｓａｎまたはＴＣＰ－２５ゲルが、ＬＰＳと混合されて、トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウスの背部のそれぞれ左および右側のに皮下沈着された。ＮＦ－ｋＢレポータ遺伝子発現のインビボ撮像が、ＩＶＩＳスペクトルバイオイメージングシステムを用いて実現された。代表的な画像は、皮下沈着の６時間後のバイオルミネッセンスを示す。棒グラフは、これらのマウスから放出された、測定されたバイオルミネッセンス強度を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（各群ｎ＝５）。Ｐ値は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて決定された。図７Ｋは、ＴＣＰ－２５と、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎの抗敗血症成分であるＰＨＭＢとの抗炎症能の比較を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＰＨＭＢおよびＴＣＰ－２５の存在下で、大腸菌ＬＰＳで刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＮＳ 有意でない。図７Ｌはさらに、２および３日目に採取された創傷液のサイトカイン分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。図７Ｍはさらに、２、３および５日目に確立された感染モデルから採取された創傷液のＩＬ－１β分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ゲルでｎ＝６の創傷、ＴＣＰ－２５ゲルでｎ＝６の創傷、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎでｎ＝６の創傷）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。＊＊Ｐ≦０．０１；ＮＳ 有意でない。 図８Ａ～Ｃは、ＴＣＰ－２５が創傷中の炎症を標的にすることを示す。図８Ａは、感染されたミニブタの創傷およびＴＣＰ－２５ゲルで処置されたミニブタの創傷からの創傷液での刺激に応答したＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞におけるＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図８Ｂは、炎症を活性化するミニブタ創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で１、２および３日目からのミニブタ感染創傷からの創傷液により刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝４）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図８Ｃは、炎症を活性化するヒト創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で患者の感染創傷からの慢性創傷液（ＣＷＦ）により刺激された。ＣＷＦ１～５は、５名のヒト患者を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図８Ａ～Ｃは、ＴＣＰ－２５が創傷中の炎症を標的にすることを示す。図８Ａは、感染されたミニブタの創傷およびＴＣＰ－２５ゲルで処置されたミニブタの創傷からの創傷液での刺激に応答したＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞におけるＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図８Ｂは、炎症を活性化するミニブタ創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で１、２および３日目からのミニブタ感染創傷からの創傷液により刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝４）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図８Ｃは、炎症を活性化するヒト創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で患者の感染創傷からの慢性創傷液（ＣＷＦ）により刺激された。ＣＷＦ１～５は、５名のヒト患者を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図８Ａ～Ｃは、ＴＣＰ－２５が創傷中の炎症を標的にすることを示す。図８Ａは、感染されたミニブタの創傷およびＴＣＰ－２５ゲルで処置されたミニブタの創傷からの創傷液での刺激に応答したＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞におけるＮＦ－ｋＢ活性化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定に続いてダン事後検定を用いて決定された。図８Ｂは、炎症を活性化するミニブタ創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で１、２および３日目からのミニブタ感染創傷からの創傷液により刺激された。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝４）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。図８Ｃは、炎症を活性化するヒト創傷液の能力をＴＣＰ－２５が減少させるという実証を示す。ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞が、ＴＣＰ－２５の存在下で患者の感染創傷からの慢性創傷液（ＣＷＦ）により刺激された。ＣＷＦ１～５は、５名のヒト患者を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝６）。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；ＮＳ 有意でない。 図９Ａ～Ｂは、ＴＣＰ－２５ゲルの流動学的性質を示す。０．１％または１％ ＴＣＰ－２５を有しない、または有する２％ＨＥＣゲルのゲル強度が、Ｋｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータで分析された。図９Ａは、ゲル強度の尺度としての流動点（歪）を示す。データは、９５％信頼区間での平均として表される（ｎ＝３）。ＮＳ 有意でない。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。図９Ｂは、歪に対してプロットされた代表的な弾性率（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）（ｎ＝３）を示す。 図９Ａ～Ｂは、ＴＣＰ－２５ゲルの流動学的性質を示す。０．１％または１％ ＴＣＰ－２５を有しない、または有する２％ＨＥＣゲルのゲル強度が、Ｋｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータで分析された。図９Ａは、ゲル強度の尺度としての流動点（歪）を示す。データは、９５％信頼区間での平均として表される（ｎ＝３）。ＮＳ 有意でない。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。図９Ｂは、歪に対してプロットされた代表的な弾性率（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）（ｎ＝３）を示す。 図１０Ａ～Ｅは、ＴＣＰ－２５ゲルのインビトロ放出およびインビボ薬物動態を示す。（Ａ）ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５のインビトロ拡散。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５を用いて調製され、ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの頂上区分にロードされた。側底区分からのバッファーが、様々な時点で採取され、累積蛍光が、ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５の拡散を評定するために測定された。対照は、ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５の０．１％溶液を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた皮下沈着ＴＣＰ－２５ゲル＃１の薬物動態およびＬＰＳの効果。ゲルのインビボ薬物動態を撮像するために、ＴＣＰ－２５がＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ＳＫＨ１無毛マウスの背部に皮下沈着された。幾つかのマウスにおいて、ＬＰＳが注射前のゲルに添加された。インビボ蛍光撮像が、ＩＶＩＳスペクトルを用いて実施された。代表的な画像は、ゲル沈着後の１、６および２４時間のＴＣＰ－２５ Ｃｙ５の分布を示す。色が明るいほど、シグナル強度が高い。棒グラフは、ゲル沈着部位周辺で局所的に測定された蛍光（局所）および体全体の蛍光（体）を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｃ）ミニブタにおけるＴＣＰ－２５のインビボ組織取り込み。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２または＃３が、部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに外用で塗布された。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色 矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｄ）ミニブタエクスビボ皮膚モデルにおけるＴＣＰ－２５の取り込み。Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、無傷または創傷のどちらかのエクスビボ皮膚に外用で塗布された（２および２４時間）。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色、矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｅ）ミニブタ創傷へのＴＣＰ－２５ゲルの外用での塗布後の創傷ドレッシング中のＴＣＰ－２５インビボ安定性および全身取り込み。部分層創傷のミニブタモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、外用で塗布され、ドレッシングからの創傷液が、塗布２４時間後に採取され、質量分析を用いて分析された。対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された。創傷への外用での塗布後のＴＣＰ－２５の全身取り込みを試験するために、ミニブタからの血漿が採取され、質量分析により分析された（ｎ＝４～５）。アッセイのためのＬＯＱは、１００ｎＭであった。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。 図１０Ａ～Ｅは、ＴＣＰ－２５ゲルのインビトロ放出およびインビボ薬物動態を示す。（Ａ）ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５のインビトロ拡散。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５を用いて調製され、ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの頂上区分にロードされた。側底区分からのバッファーが、様々な時点で採取され、累積蛍光が、ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５の拡散を評定するために測定された。対照は、ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５の０．１％溶液を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた皮下沈着ＴＣＰ－２５ゲル＃１の薬物動態およびＬＰＳの効果。ゲルのインビボ薬物動態を撮像するために、ＴＣＰ－２５がＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ＳＫＨ１無毛マウスの背部に皮下沈着された。幾つかのマウスにおいて、ＬＰＳが注射前のゲルに添加された。インビボ蛍光撮像が、ＩＶＩＳスペクトルを用いて実施された。代表的な画像は、ゲル沈着後の１、６および２４時間のＴＣＰ－２５ Ｃｙ５の分布を示す。色が明るいほど、シグナル強度が高い。棒グラフは、ゲル沈着部位周辺で局所的に測定された蛍光（局所）および全身の蛍光（体）を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｃ）ミニブタにおけるＴＣＰ－２５のインビボ組織取り込み。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２または＃３が、部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに外用で塗布された。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｄ）ミニブタエクスビボ皮膚モデルにおけるＴＣＰ－２５の取り込み。Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、無傷または創傷のどちらかのエクスビボ皮膚に外用で塗布された（２および２４時間）。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色、矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｅ）ミニブタ創傷へのＴＣＰ－２５ゲルの外用での塗布後の創傷ドレッシング中のＴＣＰ－２５インビボ安定性および全身取り込み。部分層創傷のミニブタモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、外用で塗布され、ドレッシングからの創傷液が、塗布２４時間後に採取され、質量分析を用いて分析された。対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された。創傷への外用での塗布後のＴＣＰ－２５の全身取り込みを試験するために、ミニブタからの血漿が採取され、質量分析により分析された（ｎ＝４～５）。アッセイのためのＬＯＱは、１００ｎＭであった。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。 図１０Ａ～Ｅは、ＴＣＰ－２５ゲルのインビトロ放出およびインビボ薬物動態を示す。（Ａ）ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５のインビトロ拡散。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５を用いて調製され、ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの頂上区分にロードされた。側底区分からのバッファーが、様々な時点で採取され、累積蛍光が、ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５の拡散を評定するために測定された。対照は、ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５の０．１％溶液を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた皮下沈着ＴＣＰ－２５ゲル＃１の薬物動態およびＬＰＳの効果。ゲルのインビボ薬物動態を撮像するために、ＴＣＰ－２５がＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ＳＫＨ１無毛マウスの背部に皮下沈着された。幾つかのマウスにおいて、ＬＰＳが注射前のゲルに添加された。インビボ蛍光撮像が、ＩＶＩＳスペクトルを用いて実施された。代表的な画像は、ゲル沈着後の１、６および２４時間のＴＣＰ－２５ Ｃｙ５の分布を示す。色が明るいほど、シグナル強度が高い。棒グラフは、ゲル沈着部位周辺で局所的に測定された蛍光（局所）および体全体の蛍光（体）を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｃ）ミニブタにおけるＴＣＰ－２５のインビボ組織取り込み。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２または＃３が、部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに外用で塗布された。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｄ）ミニブタエクスビボ皮膚モデルにおけるＴＣＰ－２５の取り込み。Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、無傷または創傷のどちらかのエクスビボ皮膚に外用で塗布された（２および２４時間）。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色、矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｅ）ミニブタ創傷へのＴＣＰ－２５ゲルの外用での塗布後の創傷ドレッシング中のＴＣＰ－２５インビボ安定性および全身取り込み。部分層創傷のミニブタモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、外用で塗布され、ドレッシングからの創傷液が、塗布２４時間後に採取され、質量分析を用いて分析された。対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された。創傷への外用での塗布後のＴＣＰ－２５の全身取り込みを試験するために、ミニブタからの血漿が採取され、質量分析により分析された（ｎ＝４～５）。アッセイのためのＬＯＱは、１００ｎＭであった。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。 図１０Ａ～Ｅは、ＴＣＰ－２５ゲルのインビトロ放出およびインビボ薬物動態を示す。（Ａ）ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５のインビトロ拡散。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５を用いて調製され、ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの頂上区分にロードされた。側底区分からのバッファーが、様々な時点で採取され、累積蛍光が、ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５の拡散を評定するために測定された。対照は、ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５の０．１％溶液を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた皮下沈着ＴＣＰ－２５ゲル＃１の薬物動態およびＬＰＳの効果。ゲルのインビボ薬物動態を撮像するために、ＴＣＰ－２５がＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ＳＫＨ１無毛マウスの背部に皮下沈着された。幾つかのマウスにおいて、ＬＰＳが注射前のゲルに添加された。インビボ蛍光撮像が、ＩＶＩＳスペクトルを用いて実施された。代表的な画像は、ゲル沈着後の１、６および２４時間のＴＣＰ－２５ Ｃｙ５の分布を示す。色が明るいほど、シグナル強度が高い。棒グラフは、ゲル沈着部位周辺で局所的に測定された蛍光（局所）および体全体の蛍光（体）を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｃ）ミニブタにおけるＴＣＰ－２５のインビボ組織取り込み。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２または＃３が、部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに外用で塗布された。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｄ）ミニブタエクスビボ皮膚モデルにおけるＴＣＰ－２５の取り込み。Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、無傷または創傷のどちらかのエクスビボ皮膚に外用で塗布された（２および２４時間）。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色、矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｅ）ミニブタ創傷へのＴＣＰ－２５ゲルの外用での塗布後の創傷ドレッシング中のＴＣＰ－２５インビボ安定性および全身取り込み。部分層創傷のミニブタモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、外用で塗布され、ドレッシングからの創傷液が、塗布２４時間後に採取され、質量分析を用いて分析された。対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された。創傷への外用での塗布後のＴＣＰ－２５の全身取り込みを試験するために、ミニブタからの血漿が採取され、質量分析により分析された（ｎ＝４～５）。アッセイのためのＬＯＱは、１００ｎＭであった。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。 図１０Ａ～Ｅは、ＴＣＰ－２５ゲルのインビトロ放出およびインビボ薬物動態を示す。（Ａ）ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５のインビトロ拡散。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、ＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５を用いて調製され、ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの頂上区分にロードされた。側底区分からのバッファーが、様々な時点で採取され、累積蛍光が、ゲルからバッファーへのＴＣＰ－２５の拡散を評定するために測定された。対照は、ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５の０．１％溶液を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた皮下沈着ＴＣＰ－２５ゲル＃１の薬物動態およびＬＰＳの効果。ゲルのインビボ薬物動態を撮像するために、ＴＣＰ－２５がＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ＳＫＨ１無毛マウスの背部に皮下沈着された。幾つかのマウスにおいて、ＬＰＳが注射前のゲルに添加された。インビボ蛍光撮像が、ＩＶＩＳスペクトルを用いて実施された。代表的な画像は、ゲル沈着後の１、６および２４時間のＴＣＰ－２５ Ｃｙ５の分布を示す。色が明るいほど、シグナル強度が高い。棒グラフは、ゲル沈着部位周辺で局所的に測定された蛍光（局所）および体全体の蛍光（体）を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝３）。（Ｃ）ミニブタにおけるＴＣＰ－２５のインビボ組織取り込み。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２または＃３が、部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに外用で塗布された。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｄ）ミニブタエクスビボ皮膚モデルにおけるＴＣＰ－２５の取り込み。Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、無傷または創傷のどちらかのエクスビボ皮膚に外用で塗布された（２および２４時間）。低温切片の蛍光撮像が、Ｃｙ３－ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた（白色、矢印により特定された特異的染色の例）。核（灰色）が、ＤＡＰＩ核染色で対比染色された（ｎ＝３）。（Ｅ）ミニブタ創傷へのＴＣＰ－２５ゲルの外用での塗布後の創傷ドレッシング中のＴＣＰ－２５インビボ安定性および全身取り込み。部分層創傷のミニブタモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、外用で塗布され、ドレッシングからの創傷液が、塗布２４時間後に採取され、質量分析を用いて分析された。対照創傷は、ＴＣＰ－２５を有しないゲルで処置された。創傷への外用での塗布後のＴＣＰ－２５の全身取り込みを試験するために、ミニブタからの血漿が採取され、質量分析により分析された（ｎ＝４～５）。アッセイのためのＬＯＱは、１００ｎＭであった。Ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定とダン事後検定を用いて決定された。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。 図１１Ａ～Ｂは、ｐＨ７．４とｐＨ５を比較するＴＣＰ－２５の溶解度を示す。評定されたのは、２％または１．９％グリセロールおよびＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリスバッファー（１０ｍＭまたは２５ｍＭトリス）中の０．１％ＴＣＰ－２５の溶解度（Ａ）と、２％および１．９％グリセロール、ならびに２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む酢酸バッファー（１０ｍＭまたは２５ｍＭ）中の０．１％ＴＣＰ－２５の溶解度（Ｂ）である。比較のために、ＴＣＰ－２５を有しない各々のバッファーの写真が示される。 図１１Ａ～Ｂは、ｐＨ７．４とｐＨ５を比較するＴＣＰ－２５の溶解度を示す。評定されたのは、２％または１．９％グリセロールおよびＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリスバッファー（１０ｍＭまたは２５ｍＭトリス）中の０．１％ＴＣＰ－２５の溶解度（Ａ）と、２％および１．９％グリセロール、ならびに２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む酢酸バッファー（１０ｍＭまたは２５ｍＭ）中の０．１％ＴＣＰ－２５の溶解度（Ｂ）である。比較のために、ＴＣＰ－２５を有しない各々のバッファーの写真が示される。 図１２は、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対する０．１％ＴＣＰ－２５および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリスおよび酢酸を基にしたゲルの有効性を示す。Ａ）は、ＴＣＰ－２５単独またはＥＤＴＡと組み合わせたＴＣＰ－２５を含むトリスバッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭトリス）のバイオフィルムに及ぼす効果を示す。Ｂ）は、ＴＣＰ－２５単独または２．５ｍＭ ＥＤＴＡと組み合わせたＴＣＰ－２５を含む酢酸バッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭ酢酸）のバイオフィルムに及ぼす効果を示す。 図１２は、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対する０．１％ＴＣＰ－２５および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリスおよび酢酸を基にしたゲルの有効性を示す。Ａ）は、ＴＣＰ－２５単独またはＥＤＴＡと組み合わせたＴＣＰ－２５を含むトリスバッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭトリス）のバイオフィルムに及ぼす効果を示す。Ｂ）は、ＴＣＰ－２５単独または２．５ｍＭ ＥＤＴＡと組み合わせたＴＣＰ－２５を含む酢酸バッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭ酢酸）のバイオフィルムに及ぼす効果を示す。 図１３は、緑膿菌バイオフィルムに対するトリスおよび酢酸を基にしたゲル中の０．１％ＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせの有効性を示す。Ａ）は、トリスバッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭトリス）によるおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡとＴＣＰ－２５の組み合わせでのバイオフィルムに及ぼす効果を実証する。Ｂ）は、酢酸バッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭ酢酸）によるおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡとＴＣＰ－２５の組み合わせでのバイオフィルムに及ぼす効果を実証する。 図１３は、緑膿菌バイオフィルムに対するトリスおよび酢酸を基にしたゲル中の０．１％ＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせの有効性を示す。Ａ）は、トリスバッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭトリス）によるおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡとＴＣＰ－２５の組み合わせでのバイオフィルムに及ぼす効果を実証する。Ｂ）は、酢酸バッファーを基にしたゲル配合剤（１０ｍＭおよび２５ｍＭ酢酸）によるおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡとＴＣＰ－２５の組み合わせでのバイオフィルムに及ぼす効果を実証する。 図１４は、ブタ皮膚エクスビボモデルにおけるＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせを含むゲルの抗菌効果を示す。Ａ）は、熱傷創の表面の細菌数（ＣＦＵ）を示す。Ｂ）は、処置後に組織中で見出された細菌の数（ＣＦＵ）を示す。 図１４は、ブタ皮膚エクスビボモデルにおけるＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせを含むゲルの抗菌効果を示す。Ａ）は、熱傷創の表面の細菌数（ＣＦＵ）を示す。Ｂ）は、処置後に組織中で見出された細菌の数（ＣＦＵ）を示す。 図１５は、ＴＣＰ－２５オリゴマー化に及ぼすｐＨおよび濃度の効果を示す。図Ａ）は、４℃での貯蔵直後（０分）およびＲＴでのインキュベーション後の示された時点での１０ｍＭトリスｐＨ７，４または１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５に溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５を含有するキュベットの代表的写真を示す。Ｂ）は、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解された１０～３００μＭ ＴＣＰ－２５についての４０５ｎｍでの吸収および透過率値を示す。Ｃ）には、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解され、遠心分離された３００μＭ ＴＣＰ－２５、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたペレットおよび上清がある。グラフは、遠心分離後のＴＣＰ－２５濃度±ＳＤを示す。Ｄ）オリゴマー化がｐＨおよび濃度依存性であることを示すＴＥＭ画像。ＴＣＰ－２５が、示された濃度でｐＨ７．４および５．０バッファーに溶解され、ＴＥＭにより分析された。実験は全て、３回実施された（ｎ＝３）。＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて決定された。 図１５は、ＴＣＰ－２５オリゴマー化に及ぼすｐＨおよび濃度の効果を示す。図Ａ）は、４℃での貯蔵直後（０分）およびＲＴでのインキュベーション後の示された時点での１０ｍＭトリスｐＨ７，４または１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５に溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５を含有するキュベットの代表的写真を示す。Ｂ）は、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解された１０～３００μＭ ＴＣＰ－２５についての４０５ｎｍでの吸収および透過率値を示す。Ｃ）には、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解され、遠心分離された３００μＭ ＴＣＰ－２５、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたペレットおよび上清がある。グラフは、遠心分離後のＴＣＰ－２５濃度±ＳＤを示す。Ｄ）オリゴマー化がｐＨおよび濃度依存性であることを示すＴＥＭ画像。ＴＣＰ－２５が、示された濃度でｐＨ７．４および５．０バッファーに溶解され、ＴＥＭにより分析された。実験は全て、３回実施された（ｎ＝３）。＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて決定された。 図１５は、ＴＣＰ－２５オリゴマー化に及ぼすｐＨおよび濃度の効果を示す。図Ａ）は、４℃での貯蔵直後（０分）およびＲＴでのインキュベーション後の示された時点での１０ｍＭトリスｐＨ７，４または１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５に溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５を含有するキュベットの代表的写真を示す。Ｂ）は、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解された１０～３００μＭ ＴＣＰ－２５についての４０５ｎｍでの吸収および透過率値を示す。Ｃ）には、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解され、遠心分離された３００μＭ ＴＣＰ－２５、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたペレットおよび上清がある。グラフは、遠心分離後のＴＣＰ－２５濃度±ＳＤを示す。Ｄ）オリゴマー化がｐＨおよび濃度依存性であることを示すＴＥＭ画像。ＴＣＰ－２５が、示された濃度でｐＨ７．４および５．０バッファーに溶解され、ＴＥＭにより分析された。実験は全て、３回実施された（ｎ＝３）。＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて決定された。 図１５は、ＴＣＰ－２５オリゴマー化に及ぼすｐＨおよび濃度の効果を示す。図Ａ）は、４℃での貯蔵直後（０分）およびＲＴでのインキュベーション後の示された時点での１０ｍＭトリスｐＨ７，４または１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５に溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５を含有するキュベットの代表的写真を示す。Ｂ）は、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解された１０～３００μＭ ＴＣＰ－２５についての４０５ｎｍでの吸収および透過率値を示す。Ｃ）には、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．８および５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解され、遠心分離された３００μＭ ＴＣＰ－２５、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたペレットおよび上清がある。グラフは、遠心分離後のＴＣＰ－２５濃度±ＳＤを示す。Ｄ）オリゴマー化がｐＨおよび濃度依存性であることを示すＴＥＭ画像。ＴＣＰ－２５が、示された濃度でｐＨ７．４および５．０バッファーに溶解され、ＴＥＭにより分析された。実験は全て、３回実施された（ｎ＝３）。＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて決定された。 図１６は、ＴＣＰ－２５オリゴマーの構造分析を示す。図Ａ）は、α－ヘリックス含量±ＳＤを示し、２２２ｎｍで得られたＣＤスペクトルから計算された。α－ヘリックス含量の有意な増加が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス中の３００μＭ ＴＣＰ－２５で観察された。＊は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて計算されたＰ＜０．０５を示す（ｎ＝３）。図Ｂ）は、４～１６％（ｗ／ｖ）ＢＮ－ＰＡＧＥでの分離と続くウェスタンブロット分析が、より高い濃度でのＴＣＰ－２５のオリゴマー化増加を示すことを示す。３回の独立した実験の１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。図Ｃ）において、ＴＣＰ－２５は、異なる濃度のＢＳ３で３０分間架橋され、その後、１０～２０％トリス－トリシンゲルと、続いてクーマシー染色で分析された。より高濃度の架橋剤が、より高分子のＴＣＰ－２５オリゴマーを生じた。３回の独立した実験のうちの１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。Ｄ）ＢＳ３の非存在下（黒色）、または１４５μＭ（黒色の破線）もしくは５４０μＭ（灰色の線）のＢＳ３の存在下でのＴＣＰ－２５の逆相Ｃ１８クロマトグラフィーは、溶出プロファイルの改変を示す。 図１６は、ＴＣＰ－２５オリゴマーの構造分析を示す。図Ａ）は、α－ヘリックス含量±ＳＤを示し、２２２ｎｍで得られたＣＤスペクトルから計算された。α－ヘリックス含量の有意な増加が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス中の３００μＭ ＴＣＰ－２５で観察された。＊は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて計算されたＰ＜０．０５を示す（ｎ＝３）。図Ｂ）は、４～１６％（ｗ／ｖ）ＢＮ－ＰＡＧＥでの分離と続くウェスタンブロット分析が、より高い濃度でのＴＣＰ－２５のオリゴマー化増加を示すことを示す。３回の独立した実験の１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。図Ｃ）において、ＴＣＰ－２５は、異なる濃度のＢＳ３で３０分間架橋され、その後、１０～２０％トリス－トリシンゲルと、続いてクーマシー染色で分析された。より高濃度の架橋剤が、より高分子のＴＣＰ－２５オリゴマーを生じた。３回の独立した実験のうちの１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。Ｄ）ＢＳ３の非存在下（黒色）、または１４５μＭ（黒色の破線）もしくは５４０μＭ（灰色の線）のＢＳ３の存在下でのＴＣＰ－２５の逆相Ｃ１８クロマトグラフィーは、溶出プロファイルの改変を示す。 図１６は、ＴＣＰ－２５オリゴマーの構造分析を示す。図Ａ）は、α－ヘリックス含量±ＳＤを示し、２２２ｎｍで得られたＣＤスペクトルから計算された。α－ヘリックス含量の有意な増加が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス中の３００μＭ ＴＣＰ－２５で観察された。＊は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて計算されたＰ＜０．０５を示す（ｎ＝３）。図Ｂ）は、４～１６％（ｗ／ｖ）ＢＮ－ＰＡＧＥでの分離と続くウェスタンブロット分析が、より高い濃度でのＴＣＰ－２５のオリゴマー化増加を示すことを示す。３回の独立した実験の１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。図Ｃ）において、ＴＣＰ－２５は、異なる濃度のＢＳ３で３０分間架橋され、その後、１０～２０％トリス－トリシンゲルと、続いてクーマシー染色で分析された。より高濃度の架橋剤が、より高分子のＴＣＰ－２５オリゴマーを生じた。３回の独立した実験のうちの１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。Ｄ）ＢＳ３の非存在下（黒色）、または１４５μＭ（黒色の破線）もしくは５４０μＭ（灰色の線）のＢＳ３の存在下でのＴＣＰ－２５の逆相Ｃ１８クロマトグラフィーは、溶出プロファイルの改変を示す。 図１６は、ＴＣＰ－２５オリゴマーの構造分析を示す。図Ａ）は、α－ヘリックス含量±ＳＤを示し、２２２ｎｍで得られたＣＤスペクトルから計算された。α－ヘリックス含量の有意な増加が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス中の３００μＭ ＴＣＰ－２５で観察された。＊は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を用いて計算されたＰ＜０．０５を示す（ｎ＝３）。図Ｂ）は、４～１６％（ｗ／ｖ）ＢＮ－ＰＡＧＥでの分離と続くウェスタンブロット分析が、より高い濃度でのＴＣＰ－２５のオリゴマー化増加を示すことを示す。３回の独立した実験の１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。図Ｃ）において、ＴＣＰ－２５は、異なる濃度のＢＳ３で３０分間架橋され、その後、１０～２０％トリス－トリシンゲルと、続いてクーマシー染色で分析された。より高濃度の架橋剤が、より高分子のＴＣＰ－２５オリゴマーを生じた。３回の独立した実験のうちの１つの代表的画像が、示される（ｎ＝３）。Ｄ）ＢＳ３の非存在下（黒色）、または１４５μＭ（黒色の破線）もしくは５４０μＭ（灰色の線）のＢＳ３の存在下でのＴＣＰ－２５の逆相Ｃ１８クロマトグラフィーは、溶出プロファイルの改変を示す。 図１７は、ＴＣＰ－２５の熱的および化学的変性を示す。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中のＴＣＰ－２５（１０および３００μＭ）は、温度の上昇（Ａ）により、または増加量の尿素（Ｂ）もしくはＧｄｎ－ＨＣＩ（Ｃ）の添加により変性された。アンフォールディング工程が、２８０ｎｍでの励起による３００～４５０ｎｍの間の発光スペクトルを記録することにより分析された。代表的な発光スペクトルが、異なる変性方法でｐＨ７．４または５．０で溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５について示される（ｎ＝３）。下に、変性曲線が報告される。熱的変性の場合、データは、正規化された最大放出蛍光を温度の関数としてフィットさせることにより得られた。化学変性の場合、結果は、化学剤の濃度の関数として蛍光比（Ｆ３３７／Ｆ３５０）を用いて得られた。各データポイントは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。（Ｄ）二重測定で実行された３回の独立した実験から得られた変性曲線から計算されたＴｍおよびＣｍ±ＳＥＭを示す表（ｎ＝３）。→は、最大蛍光強度のシフトを示し（λｍａｘ）、↑Ｉｍａｘおよび↓Ｉｍａｘは、それぞれ最大蛍光強度の増加および減少を示す。 図１７は、ＴＣＰ－２５の熱的および化学的変性を示す。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中のＴＣＰ－２５（１０および３００μＭ）は、温度の上昇（Ａ）により、または増加量の尿素（Ｂ）もしくはＧｄｎ－ＨＣｌ（Ｃ）の添加により変性された。アンフォールディング工程が、２８０ｎｍでの励起による３００～４５０ｎｍの間の発光スペクトルを記録することにより分析された。代表的な発光スペクトルが、異なる変性方法でｐＨ７．４または５．０で溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５について示される（ｎ＝３）。下に、変性曲線が報告される。熱的変性の場合、データは、正規化された最大放出蛍光を温度の関数としてフィットさせることにより得られた。化学変性の場合、結果は、化学剤の濃度の関数として蛍光比（Ｆ３３７／Ｆ３５０）を用いて得られた。各データポイントは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。（Ｄ）二重測定で実行された３回の独立した実験から得られた変性曲線から計算されたＴｍおよびＣｍ±ＳＥＭを示す表（ｎ＝３）。→は、最大蛍光強度のシフトを示し（λｍａｘ）、↑Ｉｍａｘおよび↓Ｉｍａｘは、それぞれ最大蛍光強度の増加および減少を示す。 図１７は、ＴＣＰ－２５の熱的および化学的変性を示す。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中のＴＣＰ－２５（１０および３００μＭ）は、温度の上昇（Ａ）により、または増加量の尿素（Ｂ）もしくはＧｄｎ－ＨＣｌ（Ｃ）の添加により変性された。アンフォールディング工程が、２８０ｎｍでの励起による３００～４５０ｎｍの間の発光スペクトルを記録することにより分析された。代表的な発光スペクトルが、異なる変性方法でｐＨ７．４または５．０で溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５について示される（ｎ＝３）。下に、変性曲線が報告される。熱的変性の場合、データは、正規化された最大放出蛍光を温度の関数としてフィットさせることにより得られた。化学変性の場合、結果は、化学剤の濃度の関数として蛍光比（Ｆ３３７／Ｆ３５０）を用いて得られた。各データポイントは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。（Ｄ）二重測定で実行された３回の独立した実験から得られた変性曲線から計算されたＴｍおよびＣｍ±ＳＥＭを示す表（ｎ＝３）。→は、最大蛍光強度のシフトを示し（λｍａｘ）、↑Ｉｍａｘおよび↓Ｉｍａｘは、それぞれ最大蛍光強度の増加および減少を示す。 図１７は、ＴＣＰ－２５の熱的および化学的変性を示す。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中のＴＣＰ－２５（１０および３００μＭ）は、温度の上昇（Ａ）により、または増加量の尿素（Ｂ）もしくはＧｄｎ－ＨＣｌ（Ｃ）の添加により変性された。アンフォールディング工程が、２８０ｎｍでの励起による３００～４５０ｎｍの間の発光スペクトルを記録することにより分析された。代表的な発光スペクトルが、異なる変性方法でｐＨ７．４または５．０で溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５について示される（ｎ＝３）。下に、変性曲線が報告される。熱的変性の場合、データは、正規化された最大放出蛍光を温度の関数としてフィットさせることにより得られた。化学変性の場合、結果は、化学剤の濃度の関数として蛍光比（Ｆ３３７／Ｆ３５０）を用いて得られた。各データポイントは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。（Ｄ）二重測定で実行された３回の独立した実験から得られた変性曲線から計算されたＴｍおよびＣｍ±ＳＥＭを示す表（ｎ＝３）。→は、最大蛍光強度のシフトを示し（λｍａｘ）、↑Ｉｍａｘおよび↓Ｉｍａｘは、それぞれ最大蛍光強度の増加および減少を示す。 図１８は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０でのＴＣＰ－２５の熱的変性の可逆性を示す。ペプチドを１００℃に暴露し温度を２０℃に戻すことによる、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス（Ａ）または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（Ｂ）中の１０および３００μＭ ＴＣＰ－２５。リフォールディングが、ペプチドの内部蛍光を記録することにより分析された。スペクトルが、２０（黒色線）、１００（破線）、および１００℃での変性後の２０℃（点線）で採取された。各グラフは、３回の独立した実験の代表的結果である（ｎ＝３）。 図１８は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０のＴＣＰ－２５の熱的変性の可逆性を示す。ペプチドを１００℃に暴露し、温度を２０℃に戻すことによる、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス（Ａ）または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（Ｂ）中の１０および３００μＭ ＴＣＰ－２５。リフォールディングが、ペプチドの内部蛍光を記録することにより分析された。スペクトルが、２０（黒色線）、１００（破線）、および１００℃での変性後の２０℃（点線）で採取された。各グラフは、３回の独立した実験の代表的結果である（ｎ＝３）。 図１９は、オリゴマーのサイズおよびそれらの分布を示す。（Ａ～Ｂ）１０ｍＭトリスｐＨ７．４中または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０中の３００μＭ ＴＣＰ－２５のＤＬＳ分析から得られた代表的グラフ。ｐＨ７．４（Ｃ）およびｐＨ５．０（Ｄ）でのオリゴマーのサイズ、ならびに最大２４時間のＲＴ、４もしくは－２０℃での貯蔵後（Ｃ～Ｄ）または１週間の貯蔵後（Ｅ）の分布が示される。オリゴマーが、４つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ、黒色のバー）、中（２０～１５０ｎｍ、淡灰色のバー）、大（２００～９５０ｎｍ、濃灰色のバー）、および巨大（１×１０３～５×１０３ｎｍ、白色のバー）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを用いて、１１のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される（ｎ＝２）。 図１９は、オリゴマーのサイズおよびそれらの分布を示す。（Ａ～Ｂ）１０ｍＭトリスｐＨ７．４中または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０中の３００μＭ ＴＣＰ－２５のＤＬＳ分析から得られた代表的グラフ。ｐＨ７．４（Ｃ）およびｐＨ５．０（Ｄ）でのオリゴマーのサイズ、ならびに最大２４時間のＲＴ、４もしくは－２０℃での貯蔵後（Ｃ～Ｄ）または１週間の貯蔵後（Ｅ）の分布が示される。オリゴマーが、４つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ、黒色のバー）、中（２０～１５０ｎｍ、淡灰色のバー）、大（２００～９５０ｎｍ、濃灰色のバー）、および巨大（１×１０３～５×１０３ｎｍ、白色のバー）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを用いて、１１のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される（ｎ＝２）。 図１９は、オリゴマーのサイズおよびそれらの分布を示す。（Ａ～Ｂ）１０ｍＭトリスｐＨ７．４中または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０中の３００μＭ ＴＣＰ－２５のＤＬＳ分析から得られた代表的グラフ。ｐＨ７．４（Ｃ）およびｐＨ５．０（Ｄ）でのオリゴマーのサイズ、ならびに最大２４時間のＲＴ、４もしくは－２０℃での貯蔵後（Ｃ～Ｄ）または１週間の貯蔵後（Ｅ）の分布が示される。オリゴマーが、４つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ、黒色のバー）、中（２０～１５０ｎｍ、淡灰色のバー）、大（２００～９５０ｎｍ、濃灰色のバー）、および巨大（１×１０３～５×１０３ｎｍ、白色のバー）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを用いて、１１のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される（ｎ＝２）。 図１９は、オリゴマーのサイズおよびそれらの分布を示す。（Ａ～Ｂ）１０ｍＭトリスｐＨ７．４中または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０中の３００μＭ ＴＣＰ－２５のＤＬＳ分析から得られた代表的グラフ。ｐＨ７．４（Ｃ）およびｐＨ５．０（Ｄ）でのオリゴマーのサイズ、ならびに最大２４時間のＲＴ、４もしくは－２０℃での貯蔵後（Ｃ～Ｄ）または１週間の貯蔵後（Ｅ）の分布が示される。オリゴマーが、４つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ、黒色のバー）、中（２０～１５０ｎｍ、淡灰色のバー）、大（２００～９５０ｎｍ、濃灰色のバー）、および巨大（１×１０３～５×１０３ｎｍ、白色のバー）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを用いて、１１のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される（ｎ＝２）。 図１９は、オリゴマーのサイズおよびそれらの分布を示す。（Ａ～Ｂ）１０ｍＭトリスｐＨ７．４中または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０中の３００μＭ ＴＣＰ－２５のＤＬＳ分析から得られた代表的グラフ。ｐＨ７．４（Ｃ）およびｐＨ５．０（Ｄ）でのオリゴマーのサイズ、ならびに最大２４時間のＲＴ、４もしくは－２０℃での貯蔵後（Ｃ～Ｄ）または１週間の貯蔵後（Ｅ）の分布が示される。オリゴマーが、４つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ、黒色のバー）、中（２０～１５０ｎｍ、淡灰色のバー）、大（２００～９５０ｎｍ、濃灰色のバー）、および巨大（１×１０３～５×１０３ｎｍ、白色のバー）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを用いて、１１のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される（ｎ＝２）。 図２０．様々な配合剤中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の阻害効果および殺菌効果。（Ａ）１％ＴＣＰ－２５および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸バッファー（それぞれ等張にするために２または１．９％グリセロールを補充）中で作製された１．５％ＨＥＣゲル配合剤を含有する試験管の代表的写真。（Ｂ～Ｃ）様々な濃度のＥＤＴＡを補充されたトリスまたは酢酸バッファー中のＴＣＰ－２５での処置後の黄色ブドウ球菌、緑膿菌および大腸菌について得られたＭＩＣ（Ｂ）およびＭＢＣ（Ｃ）値の略図。 図２０．様々な配合剤中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の阻害効果および殺菌効果。（Ａ）１％ＴＣＰ－２５および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸バッファー（それぞれ等張にするために２または１．９％グリセロールを補充）中で作製された１．５％ＨＥＣゲル配合剤を含有する試験管の代表的写真。（Ｂ～Ｃ）様々な濃度のＥＤＴＡを補充されたトリスまたは酢酸バッファー中のＴＣＰ－２５での処置後の黄色ブドウ球菌、緑膿菌および大腸菌について得られたＭＩＣ（Ｂ）およびＭＢＣ（Ｃ）値の略図。 図２０．様々な配合剤中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の阻害効果および殺菌効果。（Ａ）１％ＴＣＰ－２５および２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸バッファー（それぞれ等張にするために２または１．９％グリセロールを補充）中で作製された１．５％ＨＥＣゲル配合剤を含有する試験管の代表的写真。（Ｂ～Ｃ）様々な濃度のＥＤＴＡを補充されたトリスまたは酢酸バッファー中のＴＣＰ－２５での処置後の黄色ブドウ球菌、緑膿菌および大腸菌について得られたＭＩＣ（Ｂ）およびＭＢＣ（Ｃ）値の略図。 図２１．様々な配合剤中のＴＣＰ－２５の抗菌効果。トリスまたは酢酸のどちらかのバッファー中での単独で、または２．５ｍＭ ＥＤＴＡと組み合わせた８０μＭ ＴＣＰ－２５の殺菌効果を実証する棒グラフ。緑膿菌のＣＦＵ／ｍｌは、ＶＣＡアッセイおよび１時間の処置時間を用いて決定された（ｎ＝４）。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析と多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２２．ＴＣＰ－２５および／またはＥＤＴＡで処置された場合の細菌細胞の凝集。エリアに応じて凝集された細菌細胞の分布を実証するヒートマップ。分布は、総凝集量に対するパーセント値として表される。単一細胞または２０μｍ２未満の凝集体は、ここでは表されない。ｎ＝３。各反復測定での各処置からの１０の画像。 図２３．タイム・キルアッセイでの黄色ブドウ球菌に対するＴＣＰ－２５の抗菌効果。Ａ）グラフは、２４時間の期間での細菌増殖を示す。配合剤は、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸のどちらかのバッファー中の８０μＭ ＴＣＰ－２５を含有した。試料は、５、１５、３０分および１、３、６および２４時間目に採取された。結果は、ＣＦＵ／ｍｌとして表される。Ｂ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにおける細菌凝集体のサイズが、ヒートマップとして表される。各々のサイズ分類についての凝集体の相対的存在度が、凝集体の総数に対するパーセント値として表される。単一細胞または２０μｍより小さな凝集体は、除外された。凝集体は、各反復測定試料から撮影された１０の画像の代表である（ｎ＝３）。 図２３．タイム・キルアッセイでの黄色ブドウ球菌に対するＴＣＰ－２５の抗菌効果。Ａ）グラフは、２４時間の期間での細菌増殖を示す。配合剤は、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸のどちらかのバッファー中の８０μＭ ＴＣＰ－２５を含有した。試料は、５、１５、３０分および１、３、６および２４時間目に採取された。結果は、ＣＦＵ／ｍｌとして表される。Ｂ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにおける細菌凝集体のサイズが、ヒートマップとして表される。各々のサイズ分類についての凝集体の相対的存在度が、凝集体の総数に対するパーセント値として表される。単一細胞または２０μｍより小さな凝集体は、除外された。凝集体は、各反復測定試料から撮影された１０の画像の代表である（ｎ＝３）。 図２４は、タイム・キルアッセイでの緑膿菌に対するＴＣＰ－２５の抗菌効果。Ａ）グラフは、２４時間の期間での細菌増殖を示す。配合剤は、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸のどちらかのバッファー中の８０μＭ ＴＣＰ－２５を含有した。試料は、５、１５、３０分目ならびに１、３、６および２４時間目に採取された。結果は、ＣＦＵ／ｍｌとして表される。Ｂ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにおいて撮像された細菌凝集体が、試料中で見出された特定サイズの凝集体のパーセント値を示すヒートマップに表される。単一細胞または２０μｍより小さな凝集体は、表されていない。凝集体は、各反復測定試料から撮影された１０の画像の代表である（ｎ＝３）。 図２４は、タイム・キルアッセイでの緑膿菌に対するＴＣＰ－２５の抗菌効果。Ａ）グラフは、２４時間の期間での細菌増殖を示す。配合剤は、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないトリスまたは酢酸のどちらかのバッファー中の８０μＭ ＴＣＰ－２５を含有した。試料は、５、１５、３０分目ならびに１、３、６および２４時間目に採取された。結果は、ＣＦＵ／ｍｌとして表される。Ｂ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにおいて撮像された細菌凝集体が、試料中で見出された特定サイズの凝集体のパーセント値を示すヒートマップに表される。単一細胞または２０μｍより小さな凝集体は、表されていない。凝集体は、各反復測定試料から撮影された１０の画像の代表である（ｎ＝３）。 図２５．ＥＤＴＡはバイオフィルム関連細菌のＴＣＰ－２５介在性低減を増強する。Ａ～Ｂ）４８時間成熟バイオフィルム内部の細菌量の低減を実証する棒グラフ。バイオフィルムは、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５の１０ｍＭ中の０．１％ＴＣＰ－２５を含有する溶液（Ａ）またはゲル配合剤（Ｂ）に暴露された。Ｃ）４８時間の成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌが、溶液形態の配合剤での処置後にカウントされた。Ｄ）１．９％グリセロールを有する２５ｍＭトリスまたは２５ｍＭ酢酸塩のどちらかの中の１．５％ＨＥＣゲル中のＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡで処置された４８時間成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２５．ＥＤＴＡはバイオフィルム関連細菌のＴＣＰ－２５介在性低減を増強する。Ａ～Ｂ）４８時間成熟バイオフィルム内部の細菌量の低減を実証する棒グラフ。バイオフィルムは、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ中の０．１％ＴＣＰ－２５を含有する溶液（Ａ）またはゲル配合剤（Ｂ）に暴露された。Ｃ）４８時間の成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌが、溶液形態の配合剤での処置後にカウントされた。Ｄ）１．９％グリセロールを有する２５ｍＭトリスまたは２５ｍＭ酢酸塩のどちらかの中の１．５％ＨＥＣゲル中のＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡで処置された４８時間成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２５．ＥＤＴＡはバイオフィルム関連細菌のＴＣＰ－２５介在性低減を増強する。Ａ～Ｂ）４８時間成熟バイオフィルム内部の細菌量の低減を実証する棒グラフ。バイオフィルムは、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ中の０．１％ＴＣＰ－２５を含有する溶液（Ａ）またはゲル配合剤（Ｂ）に暴露された。Ｃ）４８時間の成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌが、溶液形態の配合剤での処置後にカウントされた。Ｄ）１．９％グリセロールを有する２５ｍＭトリスまたは２５ｍＭ酢酸塩のどちらかの中の１．５％ＨＥＣゲル中のＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡで処置された４８時間成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２５．ＥＤＴＡはバイオフィルム関連細菌のＴＣＰ－２５介在性低減を増強する。Ａ～Ｂ）４８時間成熟バイオフィルム内部の細菌量の低減を実証する棒グラフ。バイオフィルムは、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ中の０．１％ＴＣＰ－２５を含有する溶液（Ａ）またはゲル配合剤（Ｂ）に暴露された。Ｃ）４８時間の成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌが、溶液形態の配合剤での処置後にカウントされた。Ｄ）１．９％グリセロールを有する２５ｍＭトリスまたは２５ｍＭ酢酸塩のどちらかの中の１．５％ＨＥＣゲル中のＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡで処置された４８時間成熟バイオフィルムからのＣＦＵ／ｍｌ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２６．ブタ皮膚創傷感染モデルにおけるＴＣＰ－２５配合剤の効果。Ａ）トリスを基にしたハイドロゲル（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中の増加用量（０．１、０．５または１％）のＴＣＰ－２５での処置後の創傷表面でのおよび組織中の感染されたエクスビボブタ皮膚緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌに及ぼすＴＣＰ－２５の用量依存的抗微生物効果。Ｂ）示された濃度のＥＤＴＡが、ｐＨ５．０の酢酸バッファー（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中に配合された０．１％ＴＣＰ－２５に添加された。処置後の表面上のおよび組織中の緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌが、決定された。ｐＨ７．４の０．１％ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが、比較に用いられた。Ｃ）１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下のＴＣＰ－２５の用量依存性。処置２時間後の表面および組織試料からの緑膿菌および黄色ブドウ球菌のＣＦＵ／ｍｌが、決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２６．ブタ皮膚創傷感染モデルにおけるＴＣＰ－２５配合剤の効果。Ａ）トリスを基にしたハイドロゲル（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中の増加用量（０．１、０．５または１％）のＴＣＰ－２５での処置後の創傷表面でのおよび組織中の感染されたエクスビボブタ皮膚緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌに及ぼすＴＣＰ－２５の用量依存的抗微生物効果。Ｂ）示された濃度のＥＤＴＡが、ｐＨ５．０の酢酸バッファー（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中に配合された０．１％ＴＣＰ－２５に添加された。処置後の表面および組織中の緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌが、決定された。ｐＨ７．４の０．１％ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが、比較に用いられた。Ｃ）１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下のＴＣＰ－２５の用量依存性。処置２時間後の表面上のおよび組織試料からの緑膿菌および黄色ブドウ球菌のＣＦＵ／ｍｌが、決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２６．ブタ皮膚創傷感染モデルにおけるＴＣＰ－２５配合剤の効果。Ａ）トリスを基にしたハイドロゲル（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中の増加用量（０．１、０．５または１％）のＴＣＰ－２５での処置後の創傷表面でのおよび組織中の感染されたエクスビボブタ皮膚緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌに及ぼすＴＣＰ－２５の用量依存的抗微生物効果。Ｂ）示された濃度のＥＤＴＡが、ｐＨ５．０の酢酸バッファー（１．５％ＨＥＣおよび２％グリセロール）中に配合された０．１％ＴＣＰ－２５に添加された。処置後の表面および組織中の緑膿菌ＣＦＵ／ｍｌが、決定された。ｐＨ７．４の０．１％ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが、比較に用いられた。Ｃ）１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下のＴＣＰ－２５の用量依存性。処置２時間後の表面上のおよび組織試料からの緑膿菌および黄色ブドウ球菌のＣＦＵ／ｍｌが、決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析とテューキー事後多重比較が、ｐ値を決定するために用いられた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 図２７．ＥＤＴＡを有する、または有しない酢酸バッファー中のＴＣＰ－２５の安定性。ペプチドは、ＥＤＴＡを有する、または有しない酢酸バッファー（ｐＨ５）に０．１％で溶解され、ＲＴ、４または３７℃で貯蔵された後に、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより分析された。データは、溶出されたピーク全ての面積の合計に対応する総面積（１００％）に対するパーセント値として表される。貯蔵後のＴＣＰ－２５の量は黒色のバーで表され、分解産物は白色のバーで表される。ｎａ 分析されない；ｗ 週数；ｍｓ 月数。 図２８．異なるｐＨでのＴＣＰ－２５の安定性。ペプチドは、蒸留水に０．１％で溶解され、その後ｐＨが、示されたｐＨに達するようにＮａＯＨまたはＨＣＩを添加することにより修正された。試料がその後、ＲＴ、４、３７または７０℃で貯蔵された後に、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより分析された。データは、溶出されたピーク全ての面積の合計に対応する総面積（１００％）に対するパーセント値として表される。貯蔵後のＴＣＰ－２５の量は、黒色のバーで表され、分解産物は、白色のバーで表される。ｄ 日数；ｗ 週数；ｍｓ 月数。 図２９は、ＥＤＴＡの存在下および非存在下での異なるｐＨおよび濃度でのＴＣＰ－２５の安定性および抗微生物活性の概要を示す。ｐＨ７．４では、０．１％を超えるＴＣＰ－２５の濃度は、おそらくオリゴマー化により、安定性を上昇させる。ｐＨ５では、ＥＤＴＡが、抗微生物活性を有意に増幅させる。ｐＨ５では、ＥＤＴＡが、おそらくＥＤＴＡでのオリゴマー形成により、安定性を上昇させる。
発明の詳細な記載
定義
本明細書では、他に断りがなければ、「ａ」または「ａｎ」は、「１つまたは複数」を意味する。
本明細書で用いられる用語「およそ」は、数値に関連して用いられる場合、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％を指す。
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、２０種の標準的アミノ酸および「Ｄ」形態（天然の「Ｌ」形態に比較して）の対応する立体異性体、オメガアミノ酸の他の天然由来アミノ酸、非従来のアミノ酸（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸ほか）、および化学的に誘導体化されたアミノ酸を包含する（以下参照）。
用語「標準アミノ酸」は、天然由来ペプチド中で共通して見出される２０種の遺伝子コードされたアミノ酸のいずれかを指す。標準アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣの一文字コードおよび三文字コードの両方で参照される。用語「標準アミノ酸」は、遊離の標準アミノ酸およびペプチドに組み入れられた標準アミノ酸の両方を指すために用いられる。示されるペプチドの場合、各コードされたアミノ酸残基は適宜、一文字の称号により表される。
本明細書で用いられる用語「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。
本明細書で用いられる用語「流動点」は、クロスオーバーポイントＧ’＝Ｇ”（ここでＧ’は、貯蔵弾性率であり、Ｇ”は、１Ｈｚ周波数および２５℃での損失弾性率である）での剪断応力の値を指す。例えば流動点は、プレート／プレートの配置（ｐｌａｔｅ－ｐｌａｔｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）および１ｍｍのギャップを備えたＫｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，英国マルバーン）を用いて決定され得る。０．００１～１０の歪の剪断歪が、線形粘弾性領域（ＬＶＲ）、ならびに１Ｈｚおよび２５Ｃでの流動点（Ｇ’およびＧ”クロスオーバーでの剪断応力）を決定するために適用される。流動点は、直接レオメータにより決定される。幾つかの例において、流動点は、Ｇ’およびＧ”クロスオーバーで歪として提供されるが、他に示されなければ、流動点は、典型的にはＰａでの、Ｇ’およびＧ”クロスオーバーでの剪断応力である。
本明細書で用いられる用語「ハイドロゲル」は、水性溶液と、水と接触すると膨潤し得る親水性ポリマーとの連続相を指す。「ハイドロゲル」は、上記ポリマーおよび水で形成されたナノ構造を含み、典型的には９０％を超える水を含有する。ハイドロゲルは、典型的には水和度にかかわらず透明または半透明である。ハイドロゲルは一般に、典型的には分散された親水性粒子を含有する疎水性マトリックスを含む、ハイドロコロイドと識別可能である。ハイドロゲルは典型的には、少なくとも１０Ｐａ、少なくとも１５Ｐａなど、例えば１０～８０Ｐａの範囲内、４０～６０Ｐａの範囲内などの流動点を有する。
本明細書で用いられる用語「親水性ポリマー」は、水に可溶性および相溶性であることを特徴とするポリマーを指す。典型的には親水性ポリマーは、炭素および水素で構成されたポリマーバックボーンを保有し、一般には主鎖のポリマーバックボーンまたはポリマーバックボーンに沿って置換されたペンダント基のどちらかの中で高いパーセント値の酸素を保有する。
本明細書で用いられる用語「局所投与」は、処置される身体の意図する領域への直接の、本発明の組成物の任意の投与形態を指す。多くの場合、上記局所投与は、障害の部位への直接の外用薬投与であろう。例として、障害が創傷である場合、局所投与は、組成物が創傷に直接塗布されることを暗示する。
本明細書で用いられる用語「非イオン性ポリマー」は、室温および１ａｔｍの圧力の下のプロトン性溶媒中で、電気的中性を維持するために対イオンにより相殺される必要がある陽イオン基または陰イオン基を有する構造単位を実質的に担わないポリマーを指す。詳細には、本発明による「非イオン性ポリマー」は、酸性または塩基性基などのイオン化可能な官能基を有するモノマー単位を含まない親水性ポリマーであってよい。そのようなポリマーは、水性溶液中で帯電されないであろう。
本明細書で用いられる用語「ハイドロゲルを形成し得るポリマー」は、水との接触により膨潤し得る親水性ポリマーを指す。有用なポリマーは、無水状態のポリマーの重量に比較して、水の量を少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、５０～２００倍の範囲でなど、吸収するであろう。
本明細書で用いられる用語「配列同一性」は、アライメント後の候補配列と参照配列間の同一アミノ酸またはヌクレオチドの％を指す。したがって参照配列と８０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アライメント後に、候補配列中のアミノ酸の８０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一である必要がある。本発明による同一性は、非限定的に、ポリペプチド配列のアライメントのためのＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａコンピュータアライメントプログラム（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１ Ｏｃｔｏｂｅｒ １１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：５３９， ＰＭＩＤ：２１９８８８３５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５ Ａｐｒｉｌ ０６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３（Ｗ１）：Ｗ５８０－４ ＰＭＩＤ： ２５８４５５９６；ＭｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１３ Ｍａｙ １３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７－６００ ＰＭＩＤ：２３６７１３３８）およびその中で示唆されたデフォルトパラメータなどのコンピュータ解析の助力により決定される。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａソフトウエアは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩから、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で入手可能である。このプログラムをデフォルト設定で用いて、クエリーの成熟（生物活性）部分と参照ポリペプチドが、アライメントされる。完全に保存された残基の数がカウントされ、参照ポリペプチドの長さで割り算される。ＭＵＳＣＬＥまたはＭＡＦＦＴアルゴリズムが、ヌクレオチド配列のアライメントのために用いられてもよい。配列同一性は、アミノ酸配列に示されたものと類似の方法で計算されてもよい。本明細書で提供される配列同一性は、したがって参照配列の長さ全体にわたって計算される。
本明細書で用いられる用語「外用薬投与」または「外用で投与すること」は、患者の外部表面への、特に皮膚または粘膜への組成物の塗布を指す。望ましくは、外部表面は、皮膚であり、外用薬投与は、無傷の皮膚、破壊された皮膚、皮の剥けた皮膚、または切開された皮膚創傷への組成物の塗布を含む。
本明細書で用いられる用語「処置」は、対象の障害（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、障害進行の遅延、症状発症の遅延、または症状進行の緩徐化を含む、障害の処置または予防の任意のタイプを指す。処置はまた、好転的または治癒的処置であってもよい。そのため用語「処置」または、症状の発症を予防するための個体の防護的処置を包含する。
本明細書で用いられる用語「変性」は、生物活性の損失をもたらすタンパク質または核酸の自然な二次、および／または三次、および／または四次構造の部分的または全体的改変の工程を指す。変性は、複数の要因により、例えば外部応力の適用により、例えば加熱もしくは放射線により、および／または強酸もしくは塩基、濃縮無機塩、有機溶媒（例えば、アルコールまたはクロロホルム）などの化学的変性剤（複数可）とのインキュベーションにより、誘導され得る。化学的変性剤の例としては、尿素または塩化グアニジニウム（Ｇｎｄ－ＨＣＩ）が挙げられる。用語「熱的変性」は、温度を上昇させることにより誘導される変性を指す。化学的変性は、ペプチドを高濃度の尿素または塩化グアニジニウム（Ｇｎｄ－ＨＣＩ）などの化学的変性剤と共にインキュベートすることを指す。
本明細書で用いられる用語「Ｔｍ」および「Ｃｍ」は、所与のペプチドの変性中点を指す。それは、フォールディング状態とアンフォールディング状態の両方が、平衡して等しく存在する温度（Ｔｍ）または化学的変性剤濃度（Ｃｍ）と定義される。ＴｍおよびＣｍは、例えば実施例７に記載された通り決定されてよい。
組成物
本発明は、ＴＣＰペプチドを含む化合物と、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、水性溶液とを含む組成物に関連する。有用な、ＴＣＰペプチドを含む化合物、非イオン性ポリマーおよび水性溶液の例は、本明細書の以下に記載される。
組成物は、好ましくはハイドロゲルまたは粘性溶液の形態であってよい。組成物の形態は、意図する用途または適用エリアに依存する。好ましくは組成物は、ハイドロゲルである。ハイドロゲルは、局所投与に有用であり、外用薬投与に直ちに有用であってよい。さらにハイドロゲルは、高い水分量により、本発明の処置方法における使用に特に適する。組成物が粘性溶液である場合、組成物は、目、耳または鼻の点滴薬またはスプレーに適し得る。組成物が、粘性溶液ならば、それは、例えば製品に適用されても、または製品により吸収されてもよい。
本発明の実施形態において、組成物が、ハイドロゲルである場合、上記ハイドロゲルは、好ましくは少なくとも１５Ｐａ、より好ましくは少なくとも２５Ｐａ、４０～６０Ｐａの範囲でなどの流動点を有する。ハイドロゲルが、局所投与に特に有用であるために適切な流動点を有することが、有利である。したがって多くの場合、ハイドロゲルが投与部位に大部分残留するように充分に濃厚であることが、好ましい。
ＴＣＰペプチドが本発明の組成物から非常に緩徐にしか拡散されないことが、好ましい。例えば、本発明の組成物から隣接するバッファー溶液へのＴＣＰペプチドの拡散速度が非常に緩徐であるため、ＴＣＰペプチドの多くとも２０％、例えば多くとも１０％が２時間以内にバッファー溶液に拡散されることが、好ましい。これは、組成物がハイドロゲルである本発明の実施形態に、特に当てはまり得る。拡散速度は、例えば以下の実施例１の「ＴＣＰ－２５ゲル拡散」の節に記載された通り決定されてよい。
ＴＣＰペプチドが、個体に投与される時に、本発明の組成物から緩徐にしか拡散されないことも、好ましい。したがって、例えば創傷への、組成物の外用薬投与の際、１００ｎＭ未満のＴＣＰペプチドが上記個体の血漿中で検出され得ることが、好ましい。これは、組成物がハイドロゲルである本発明の実施形態に、特に当てはまり得る。さらにこれは、組成物が０．１～２％の範囲でなどの、０．０８～３ｗｔ％の範囲でＴＣＰペプチドを含む本発明の実施形態に、特に当てはまり得る。
組成物は、そのまま使用されてよく、例えば処置される障害の部位に直接、局所投与されてよい。詳細には組成物は、外用で投与されてよい。組成物は、あるいは製品と共に用いられてもよい。
組成物は、好ましくは医薬的に許容できなければならず、即ち毒性でなく、したがって、医薬組成物として提供されてよい。しかし、組成物が物体を消毒するためなどの、ヒトまたは動物組織と接触しないやり方で用いられる場合には、組成物が医薬的に許容できないことも企図される。
組成物は、滅菌などの従来の医薬操作に供されてよく、かつ／または、例えば本明細書の他の箇所に開示される通り、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、充填剤などの従来のアジュバントを含有してよい。
本発明の組成物が局所的に投与されてもよいことは、当業者に察知されよう。投与経路としては、外用、眼科、鼻内、口腔、経口、腟および直腸投与が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、外用薬投与による処置の方法における使用のためである。
組成物は好ましくは、医薬的に有効な量で患者に投与される。「医薬的に有効な量」は、投与される状態に関連して所望の効果を生じるのに充分である量、即ち、所望の創傷治癒、抗菌効果および／または抗炎症効果を提供するのに充分である量を意味する。
典型的にはＴＣＰペプチドは、少なくとも０．０１ｗｔ％の濃度で、より好ましくは０．０１～５ｗｔ％、０．０８～３ｗｔ％など、例えば０．１～２％の範囲の濃度で、上記組成物中に存在する。
本発明の組成物は、例えばｐＨ４～ｐＨ８の範囲で、ｐＨ５～ｐＨ８の範囲などの、例えば７～８の範囲で任意の所望のｐＨを有してもよい。６を超えるｐＨ、７を超えるｐＨなど、６～８の範囲のｐＨなど、例えば７～８の範囲のｐＨを有する組成物は、ＥＤＴＡの非存在下であっても特に安定であり得る。組成物は、単回投与または反復投与により投与されてよい。組成物は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与されてよい。
ＥＤＴＡを含む組成物
一実施形態において、本発明は、ＴＣＰペプチドを含む化合物、ＥＤＴＡ、かつ好ましくは水性バッファーも含む組成物を提供する。有用なＴＣＰペプチドおよび水性バッファーは、以下に記載される。
幾つかの実施形態において、ＴＣＰペプチドおよびＥＤＴＡを含む組成物は、高くても７のｐＨを有することが好ましいが、他の実施形態において、ＴＣＰペプチドおよびＥＤＴＡを含む組成物は、任意の有用なｐＨ、例えば高くても８のｐＨ、または３～１０の範囲で、３～８の範囲でなど、３．５～８の範囲でなど、例えば５～８の範囲のｐＨを有してよい。
上記組成物はまた、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含んでもよい。有用な非イオン性ポリマーは、以下に記載される。そのような実施形態において、組成物は、典型的にはハイドロゲルの形態であろう。
幾つかの実施形態において、ＥＤＴＡを含む組成物はまた、高濃度で、即ち少なくとも０．０８ｗｔ％の濃度、少なくとも０．１ｗｔ％の濃度など、０．０８～３ｗｔ％の範囲の濃度などのＴＣＰペプチドを含有することが、好ましい。
組成物は、任意の有用な量のＥＤＴＡを含んでよい。好ましくは組成物は、少なくとも１ｍＭ、１～１００ｍＭの範囲でなど、好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭなど、例えば２～１００ｍＭの範囲で、２～５０ｍｍの範囲でなど、２～２５ｍＭの範囲でなどの濃度でＥＤＴＡを含んでよい。
組成物が、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含む本発明の実施形態において、上記組成物は、少なくとも２ｍＭ、少なくとも１０ｍＭなど、例えば少なくとも１５ｍＭ、１５～１００ｍＭの範囲でなど、例えば１５～５０ｍＭの範囲でなどのＥＤＴＡを含んでよい。好ましくは組成物は、少なくとも２ｍＭ、２～１００ｍＭの範囲でなど、例えば２～５０ｍＭの範囲で含む。
このことは有利であり、なぜなら、それ自体では本質的に全く抗菌効果を有しない、または非常に限定的な抗菌効果を有するＥＤＴＡが、ＴＣＰペプチドを含む組成物の抗菌効果を有意に改善することにおいて相乗効果を提供することが驚くべきことに示されたためである。したがって、ＴＣＰペプチドを含む組成物にＥＤＴＡを添加することは、改善された抗微生物活性、詳細には異なる型の細菌に対する改善された抗菌効果、およびバイオフィルムに対する改善された抗菌効果をもたらす。例えば上記細菌は、グラム陰性菌であってよい。
幾つかの実施形態において、相乗的抗菌効果は低いｐＨでより顕著であり得るため、ＥＤＴＡを含む組成物が相対的に低いｐＨを有することが、好ましい。
一実施形態において、ＥＤＴＡおよびＴＣＰペプチドを含む組成物のｐＨは、７より低い、好ましくは６より低い、５．５以下であることが、好ましい。上記ｐＨはまた、好ましくは３より高くても、少なくとも３．５などであってもよい。したがってｐＨは、およそ５などの、３～６の範囲であってよい。所望のｐＨは、以下に議論される通り、所望のｐＨを有する適切な水性バッファー、例えば酢酸バッファーを用いることにより得られてよい。
幾つかの実施形態において、ＥＤＴＡを含む組成物が高濃度、例えば少なくとも０．０８ｗｔ％の濃度のＴＣＰ－２５ペプチドを有することが、好ましく、なぜなら相乗的抗菌効果がそのような組成物中でより顕著であり得るためである。
先に注記された通り、ＴＣＰペプチドを含む組成物へのＥＤＴＡの添加は、相乗的に改善された抗微生物活性をもたらす。しかしＥＤＴＡの添加はまた、他の有益効果を有し得る。例えばＥＤＴＡの添加は、特に低いｐＨで、ＴＣＰペプチドの安定性を有意に改善し得る。
したがって本発明の幾つかの実施形態において、組成物が以下に記載されるＴＣＰペプチドを含む化合物と、少なくとも１ｍＭ、１～１００ｍＭの範囲でなど、好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭなど、例えば２～１００ｍＭの範囲で、２～５０ｍｍの範囲でなど、２～２５ｍＭの範囲などの濃度でＥＤＴＡを含むことが、好ましい。上記配合剤は、高くても８のｐＨなど、例えば高くても７のｐＨ、６より低いｐＨなど、５．５より低いｐＨなどの任意の有用なｐＨを有してよい。上記ｐＨはまた、好ましくは３より高くても、少なくとも３．５であってよい。そのような組成物は、特に安定である。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は３７℃で２か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は、３７℃で４か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも７５％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は、３７℃で６か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも７０％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は、室温で８か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
高濃度のＴＣＰペプチドを含む組成物
一実施形態において、本発明は、高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物を含む組成物を提供する。有用な化合物および有用なＴＣＰペプチドは、以下に記載される。
上記高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物は、詳細には少なくとも０．０８ｗｔ％の濃度、例えば少なくとも０．１ｗｔ％の濃度の上記化合物または上記ＴＣＰペプチドを含むことであってよい。したがってＴＣＰペプチドは、０．０８～３ｗｔ％の範囲で、例えば０．１～２％の範囲の濃度で上記組成物中に存在してよい。
ＴＣＰペプチドの濃度はまた、モル濃度として提供されてよい。ｗｔ％濃度からモル濃度への変換は、具体的組成物および具体的ＴＣＰペプチドに依存する。０．１ｗｔ％のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５ペプチドの濃度は、ほとんどの水性の溶液中での３００μＭの濃度に対応する。したがって上記高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物は、詳細には、上記組成物が少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．２５ｍＭなど、少なくとも０．３ｍＭなどの濃度の上記化合物または上記ＴＣＰペプチドを含むことであってよい。したがって本発明の組成物は、０．２ｍＭ～１００ｍＭの範囲で、０．２５ｍＭ～１００ｍＭの範囲でなど、０．３ｍＭ～１００ｍＭの範囲でなどのＴＣＰペプチドを含む化合物を含んでよい。
興味深いことに、本発明は、高濃度のＴＣＰペプチドがより安定であり得ることを示す。理論に結び付けるわけではないが、ＴＣＰペプチドが、高濃度、例えば少なくとも０．０８ｗｔ％、少なくとも０．１ｗｔ％など、例えば少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．２５ｍＭなど、少なくとも０．３ｍＭなどのＴＣＰペプチド濃度でオリゴマー化し、これがより高い安定性をもたらし得ると考えられる。上記ＴＣＰペプチドオリゴマーは、例えば０．２ｎｍ～１００００ｎｍの範囲で、０．４ｎｍ～８０００ｎｍの範囲でなど、５ｎｍ～６０００ｎｍの範囲でなど、２０ｎｍ～５０００ｎｍの範囲でなど、０．４ｎｍ～２０００ｎｍの範囲でなどの流体力学的径を有してよい。上記ＴＣＰペプチドのオリゴマーは、α－ヘリックス構造における増加を有してよい。
ＴＣＰペプチドのオリゴマー化は、組成物の抗菌活性および／または抗炎症活性を増加させ得る。
興味深いことに、ＴＣＰペプチド、またはＴＣＰペプチドを含む化合物は、より高い濃度でより安定であり得る。詳細にはそれらは、変性に対してより安定であり得、例えばそれらは、２０～１００℃の範囲の、例えば３０～５０℃の範囲の温度への暴露などの、高温への暴露および／または高濃度の変性剤でのインキュベーションに対してより安定であり得る。
ＴＣＰペプチドの安定性は、任意の有用な方法により決定されてよく、例えばＴＣＰペプチドの安定性は、トリプトファンの内部蛍光を測定することによるＴＣＰペプチドのＴｍを決定することにより測定されてよい。これは例えば、本明細書の以下の実施例７に記載される通り実施されてよい。あるいはＴＣＰペプチドの安定性は、トリプトファンの内部蛍光を測定することによる１種または複数の化学的変性剤に関するＴＣＰペプチドのＣｍを決定することにより決定されてよい。上記化学的変性剤は、例えば尿素および／または塩化グアジニウム（Ｇｎｄ－ＨＣＩ）であってよい。これは、例えば本明細書の以下の実施例７に記載される通り実施されてよい。
高いＴｍおよび／または高いＣｍは、高い安定性を示す。したがって幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも３０℃、好ましくは少なくとも３５℃、より好ましくは少なくとも４０℃の、ＴＣＰペプチドに関するＴｍを有し、上記Ｔｍは好ましくは、以下の実施例７に記載される通り決定される。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも１．０Ｍ、より好ましくは少なくとも１．１Ｍの、ＴＣＰペプチドに関するＣｍ ｕｒｅａを有し、上記Ｃｍ ｕｒｅａは、以下の実施例７に記載される通り決定される。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも０．９Ｍの、ＴＣＰペプチドに関するＣｍ Ｇｎｄ－ＨＣＩを有し、上記Ｃｍ Ｇｎｄ－ＨＣＩは、以下の実施例７に記載される通り決定される。
一実施形態において、本発明の組成物は、３７℃で２か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
一実施形態において、本発明の組成物は、３７℃で４か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも７５％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％を依然として含む。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は、３７℃で６か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも７０％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも８５％を依然として含む。
したがって一実施形態において、本発明の組成物は、室温で８か月間の貯蔵後に、ＴＣＰペプチド化合物の元の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを依然として含む。
高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物を含む組成物はまた、例えば本明細書の先の「ＥＤＴＡを含む組成物」の節に記載された通り、ＥＤＴＡも、かつ好ましくは水性バッファーも含んでよい。
高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物を含む組成物は、任意の適切なｐＨ、例えばｐＨ４～ｐＨ８の範囲、ｐＨ５～ｐＨ８の範囲、例えば７～８の範囲のｐＨを有してよい。高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物を含み、６を超えるｐＨ、７を超えるｐＨなど、６～８の範囲のｐＨなど、例えば７～８の範囲のｐＨを有する組成物は、ＥＤＴＡの非存在下であっても、特に安定であり得る。
高濃度のＴＣＰペプチドを含む化合物を含む組成物はまた、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含んでもよい。有用な非イオン性ポリマーは、以下に記載される。幾つかの実施形態において、組成物は、典型的にはハイドロゲルの形態であろう。
ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマー
本発明は、ハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーを含む組成物を提供する。
本発明の状況において、非イオン性ポリマーは、室温および１ａｔｍの圧力の下のプロトン性溶媒中で、電気的中性を維持するために対イオンにより相殺される必要がある陰イオンまたは陽イオン基を有する構造単位を実質的に担わないポリマーを包含すると理解される。陽イオン基としては、例えば第四級アンモニウム基およびプロトン化アミンが挙げられる。陰イオン基としては、例えばカルボキシルおよびスルホン酸基が挙げられる。
非イオン性ハイドロゲルポリマーとも称される非イオン性ポリマーは、水性溶液または水性バッファーと混合されるとハイドロゲルを形成し得るポリマーである。組成物は、ポリマーの濃度に応じて粘性液またはハイドロゲル、即ちゲルの形態であってよい。
非イオン性ポリマーは、親水性でなければならず、したがって非イオン性ポリマーは、好ましくはヒドロキシル化される。
本発明の方法における使用のための適切な非イオン性ポリマーの例は、ポリアリルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、コーンスターチおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、メチルセルロース、エチルセルロースおよびｎ－プロピルセルロースを含むＣ１～Ｃ６－アルキルセルロースなどのアルキルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびエチルヒドロキシエチルセルロースなどの、ヒドロキシアルキルセルロース、好ましくはヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースおよびヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキル－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースを含む置換されたアルキルセルロースである。前述の混合物も、用いられてよい。
一実施形態において、非イオン性ポリマーは、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（ビニル）アルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
一実施形態において、非イオン性ポリマーは、ヒドロキシアルキルセルロース、好ましくはヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースまたはヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキル－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースからなる群から選択される。
非イオン性ポリマーのうち、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）が、好ましい。
好ましい実施形態において、本発明の組成物中の非イオン性ポリマーの濃度は、少なくとも１０Ｐａ、少なくとも１５Ｐａなど、例えば１０～８０Ｐａの範囲内、４０～６０Ｐａの範囲内などの流動点を有する組成物を得るのに充分である。
流動点は、例えば実施例の節に詳述される通り測定されてよい。
本発明の組成物は、詳細には少なくとも０．０５ｗｔ％の濃度、例えば少なくとも０．０９ｗｔ％の濃度、少なくとも０．１ｗｔ％の濃度など、例えば少なくとも０．５ｗｔ％の濃度、少なくとも０．８ｗｔ％の濃度など、例えば少なくとも１．０ｗｔ％の濃度、例えば０．０９～４ｗｔ％の範囲で、０．１～３％の範囲など、より好ましくは１．０～２．５ｗｔ％の範囲の濃度の非イオン性ポリマーを含んでよい。これは、例えば非イオン性ポリマーがＨＥＣである場合に、当てはまり得る。
一実施形態において、非イオン性ポリマーの濃度は、少なくとも１０ｍＰａｓ、および好ましくは１０００００以下、１４０００ｍＰａｓなどの組成物の粘度を得るのに充分である。１０ｍＰａｓでは、組成物は、典型的には粘性溶液の形態であるが、１０００００ｍＰＡｓでは、組成物は、濃厚なゲルの形態であり得る。
水性溶液
本発明の組成物は、水性溶液を含んでよい。詳細には水性溶液は、水性バッファーであってよい。
水性溶液または水性バッファーは、水を含有する。水性溶液が、水性バッファーである場合、それは、概ね安定なｐＨを提供できる水性バッファーを得るために、緩衝系の成分、即ち弱塩基または酸、ならびにそれらのコンジュゲート酸および塩基も含む。バッファーの例は、Ｔｒｉｚｍａ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳである。
一実施形態において、組成物のｐＨは、７より低く、好ましくは６より低く、より好ましくは５．５以下であり、および好ましくは３より高い、少なくとも３．５などであることが、好ましい。したがってｐＨは、３～６の範囲であり、およそ５などであってよい。これは有利である、なぜなら驚くべきことに、より低いｐＨが特にＥＤＴＡの存在下でハイドロゲル組成物の抗菌効果を有意に上昇させることが示されているためである。さらに、７より低いｐＨはまた、ＴＣＰペプチドの溶解度を上昇させる。溶解度は、例えば実施例４に記載される通り、外観検査により決定されてよい。所望のｐＨは、先に議論された通り、所望のｐＨを有する適切な水性バッファーを用いることにより得られてよい。
そのような実施形態において、水性溶液または水性バッファーは、好ましくは５～５０ｍＭの濃度で、より好ましくは１０～３０ｍＭの範囲の濃度で、酢酸塩を含む酢酸バッファーであってよい。上記酢酸バッファーは、３～６の範囲で、３．６～５．８の範囲でなど、例えばおよそ５のｐＨを有してよい。
酢酸ナトリウムバッファーなどの酢酸バッファーは、３．６～５．８のｐＨを得るためのバッファーとして特に適する。典型的には１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーの場合、５のｐＨが得られ、実施例２を参照されたい。しかし先に説明された通り、他の水性バッファーが、所望のｐＨを得るために用いられ得る。
別の実施形態において、組成物は、ｐH７と８の間、好ましくはｐH７．４である。
中性ｐＨは、幾つかの例では、ヒトまたは動物の体のｐＨに近いｐＨを有する組成物を提供し、このためヒトまたは動物に投与された場合組成物からの刺激のリスクを低下させるため、好ましいであろう。
そのような実施形態において、水性溶液または水性バッファーは、好ましくは５～５０ｍＭ、１０～３０ｍＭの範囲などの濃度の、トリスアミノメタンを含むトリスアミノメタン（トリス）バッファーであってよい。
トリスバッファーは、例えばおよそ７．４のｐＨを得るために用いられてよい。しかし、先に説明された通り、他の水性バッファーが、所望のｐＨを得るために用いられ得る。
水性溶液または水性バッファーは、追加でまたは代わりとして、希釈剤、アジュバント、張度調節剤および／または賦形剤などのさらなる成分を含んでよい。一般にそのようなさらなる成分は、医薬的に許容できなければならない。
用語「希釈剤」は、組成物中のペプチドを希釈する目的を有する水性溶液または非水性溶液を意味すると意図される。希釈剤は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（ひまわり油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油など）のうちの１種または複数であってよい。
用語「アジュバント」は、ペプチドの生物学的効果を増加させるように配合剤に添加される任意の化合物を意味すると意図される。アジュバントは、コロイド銀、または異なるアニオンとの亜鉛、銅、もしくは銀塩、例えば非限定的に、異なるアシル組成物の、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン化物、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および酢酸塩のうちの１種または複数であってよい。アジュバントはまた、抗菌および／または抗炎症特性を有する化合物であってよい。
一実施形態において、本発明の組成物が任意のイオン性ポリマーを含まないことが、好ましい。詳細には、上記組成物が任意のカチオン性ポリマーを含まないことが、好ましいであろう。
「賦形剤」は、ポリマー、脂質およびミネラルの１種または複数などの任意の有用な賦形剤であってよい。
用語「張度調節剤」は、組成物の張度を調節できる化合物を指す。一般に、本発明の組成物が等張であるまたは若干低張であるのいずれかが、好ましい。低張組成物は、例えば等張の５０～９９％である張度を有し得る。張度調節剤は、例えば塩またはグリセロールである。
一実施形態において、組成物は、好ましくは１～２．５％の濃度、好ましくは１．２～２．２ｖｏｌ％の濃度のグリセロールをさらに含む。濃度は、組成物中の濃度、例えばハイドロゲル中の濃度として提供される。一般に、２％のグリセロールを含む組成物は、等張であり、したがって幾つかの実施形態において、組成物は、およそ２％のグリセロールを含んでもよい。しかし他の実施形態において、組成物は、低調であり、この場合それは、１．２～１．９％の範囲内のグリセロールを含んでよい。
ＴＣＰペプチドを含む化合物
本発明は、ＴＣＰペプチドを含む化合物を含む組成物に関する。有用なＴＣＰペプチドは、本明細書の以下のＴＣＰペプチドの節に記載される。幾つかの実施形態において、上記化合物は、上記ＴＣＰペプチド、例えばＴＣＰ－２５からなってよい。しかし他の実施形態において、化合物は、１つまたは複数の追加的部分にコンジュゲートされたＴＣＰペプチドを含んでよい。例えばＴＣＰペプチドは、例えばＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化および／またはアルキル化により、修飾または誘導体化された１種または複数アミノ酸を含んでよい。
例えばＴＣＰペプチド（例えば、ＴＣＰ－２５）は、国際特許出願ＷＯ２０１１／０３６４４２号のｐ．１１，Ｉ．１～ｐ．１５，Ｉ．１４に記載される通り修飾または誘導体化されてよい。
化合物はまた、ＴＣＰペプチドの医薬的に許容できる酸または塩基付加塩であってよい。ＴＣＰペプチドの医薬的に許容できる酸付加塩を調製するために用いられる酸は、特に、非毒性酸付加塩、即ち、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酸、酢酸、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩［即ち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエ酸塩）］の塩などの医薬的に許容できる陰イオンを含有する塩を形成するものである。
ＴＣＰペプチド
本発明は、トロンビン由来Ｃ－末端（ＴＣＰ）ペプチドを含む組成物に関する。本明細書で用いられる用語「ＴＣＰペプチド」は、
アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドであって、
１０～１００、例えば２０～１００、１８～３５など、例えば１８～２５のアミノ酸残基の長さを有する、ペプチドを指す。
一実施形態において、ＴＣＰペプチドは、
アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３（ここで、
Ｘ４、６、９、１１は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｉ、ＭまたはＴであり、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｋ、ＱまたはＲである）
を含み、またはそれからなり、
２０～１００、１８～３５など、例えば１８～２５のアミノ酸残基の長さを有する。
一実施形態において、ＴＣＰペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７（ここで、
Ｘ４、６、９、１１、１４、１５は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｉ、ＭまたはＴであり、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｋ、ＱまたはＲであり、
Ｘ１６は、ＧまたはＤであり、
Ｘ１７は、Ｅ、Ｌ、Ｇ、ＲまたはＫである）
を含み、またはそれからなり、
２０～１００、１８～３５など、例えば１８～２５のアミノ酸残基の長さを有する。
一実施形態において、ＴＣＰペプチドは、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）、
ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）、
ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４）、
ＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
のいずれかを含む、またはそれからなる。
一実施形態において、ＴＣＰペプチドは、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）、
ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）、または
ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４）
のいずれかを含む、またはそれからなる。
１つの好ましい実施形態において、ＴＣＰペプチドは、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、または
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
のいずれかを含む、またはそれからなる。
ＴＣＰペプチドがリポ多糖と、ＣＤ１４のＬＰＳ－結合疎水性ポケットの両方に同時に結合できることが、好ましい。
実施例の節は、ＴＣＰ－２５を含む複数のＴＣＰペプチドの抗菌効果を示す。本明細書で用いられる用語「ＴＣＰ－２５」は、アミノ酸配列ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）からなるペプチドを指す。実施例の節はさらに、ＴＣＰ－２５がＦＹＴ２１、ＧＫＹ２０およびＨＶＦ１８、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２、３および４を含む複数のペプチドに切断され得ること、ならびにＴＣＰ－２５に類似したこれらのペプチドもまた抗菌性であることを示す。上記ペプチドはまた、リポ多糖（ＬＰＳ）結合およびＣＤ１４結合の両方に必要なアミノ酸配列を含む。したがってＴＣＰペプチドは、幾つかの実施形態において、これらのペプチド（ＴＣＰ－２５ＦＹＴ２１、ＧＫＹ２０およびＨＶＦ１８）のいずれかを含んでも、またはそれからなってもよい。好ましくはペプチドは、１８～２５アミノ酸の長さを有するが、ペプチドがこれらのペプチドのいずれかに基づく限り、ペプチドは、最大３５アミノ酸長であってよい。
別の好ましい実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくはＴＣＰ－２５ペプチドは、アミノ酸配列ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する。
異なるアミノ酸が類似の特性を提供する側鎖を有してよく、かつペプチドの生物学的効果が、特異的立体構造または化学的／電気的局所環境を提供するように協調する複数のアミノ酸の側鎖により、例えば疎水性側鎖により引き起こされるため、ペプチドはあるいは、ＴＣＰ－２５配列の少なくとも９０％配列同一性を有してよい。したがってペプチドは、ＴＣＰ－２５ペプチドの中の１つまたは複数、最大で１／１０、即ち最大で３つのアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられたＴＣＰ－２５ペプチドに対応してよい。そのような置き換えにもかかわらず、ペプチドの一般的活性は、ＴＣＰ－２５ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のそれに類似するであろう。
ＴＣＰペプチドがリポ多糖と、ＣＤ１４のＬＰＳ－結合疎水性ポケットとの両方に同時に結合できることが、好ましい。
処置の方法
本発明の組成物は、処置の方法における使用のためのものであってよい。詳細には組成物は、障害の局所処置の方法における使用のためのものであってよい。上記障害は、局所処置が適当である任意の障害であってよい。したがって方法は、障害により影響を受けた局所部位への直接の本発明の組成物の局所投与を含んでよい。
例えば障害は、皮膚、耳、目または鼻の障害であってよい。したがって処置の方法は、皮膚、耳、目または鼻の影響を受けたエリアへの局所投与を含んでよい。
一実施形態において、処置の方法は、外用薬投与、例えば皮膚への外用薬投与を含む。
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、皮膚障害の処置の方法における使用のためのものである。詳細には組成物は、創傷を処置する方法のためのものであってよい。
本発明の組成物または製品は、皮膚または創傷に直接塗布されてよい。実施例に示される通り、本発明の組成物は、抗菌性であり、炎症を低減し、先行技術の技法および製品に比較してより急速かつ良好な創傷治癒を提供する。
好ましい実施形態において、創傷処置の方法は、熱傷創および非治癒性潰瘍を処置する方法を含む。別の実施形態において、創傷処置の方法は、術創を処置する方法を含む。
これらの型の創傷は、特殊な手段を必要とする場合があり、本発明の組成物は、抗菌効果および抗炎症効果の両方を提供するため、そのような創傷の処置に特に有用である。
組成物または製品は、例えば創傷に直接塗布されても、または本明細書に記載された製品のいずれかの形態で、例えば術創を処置するためのバンデージまたは縫合糸ほかとして、適用されてもよい。
処置される障害は、詳細には炎症を含む障害、または炎症に関連する障害、または炎症に罹るリスクのある障害であってよい。詳細には障害は、局所炎症を含む、またはそれに関連する障害であってよい。
処置される障害は、詳細には感染を含む障害、または感染に関連する障害、または感染に罹るリスクのある障害であってよい。詳細には障害は、局所感染を含む、またはそれに関連する障害であってよい。上記感染は、詳細には細菌による感染、即ち細菌感染であってよい。
上記細菌は、任意の感染性細菌であってよい。例えば細菌は、グラム陰性またはグラム陽性菌であってよい。したがって細菌は、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、ステノトロフォモナス属、シゲラ属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ヘモフィルス属、シュードモナス属およびシトロバクター属からなる群から選択される属のものであってよい。一実施形態において、細菌は、黄色ブドウ球菌および緑膿菌からなる群から選択される。別の実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。
上記細菌は、多剤耐性菌であってよい。驚くべきことに、本発明の組成物（したがって製品）は、複数の多剤耐性菌、即ち、複数の公知抗生物質に耐性のある細菌に対して抗菌効果を提供できる。組成物はしたがって、これらの細菌により感染された創傷を処置することを含む、これらの細菌を処置する追加的方法を提供する。
処置を必要とする個体は、任意の個体であってよい。典型的には上記個体は、哺乳動物であり、好ましくは上記個体は、ヒトである。一実施形態において、個体は、糖尿病、動脈不全または静脈不全に罹患した個体である。糖尿病、動脈不全または静脈不全に罹患した個体は多くの場合、非治癒性潰瘍にも罹患し、障害は、したがって糖尿病、動脈不全または静脈不全に罹患した個体の非治癒性潰瘍であってもよい。
一実施形態において、組成物または製品は、皮膚、耳、目または鼻の障害の処置の方法における使用のため、例えば創傷の処置のためである。上記障害は、例えばアトピー性皮膚炎、とびひ、慢性皮膚潰瘍、感染した急性創傷および熱傷創、ニキビ、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ性間擦疹、カンジダ膣炎、中咽頭カンジダ症、目の感染および鼻の感染からなる群から選択されてもよい。さらに障害は、熱傷創、術創または皮膚外傷であってよい。
前述の障害は多くの場合、細菌感染および／または炎症などの合併症を伴うため、本発明の組成物により提供される抗感染的および抗炎症的処置が、有益である。
処置は、好転的処置、治癒的処置および／または予防的処置であってよい。したがって本発明の組成物は、障害に関連する感染および／または炎症のリスクを低減するための方法において利用されてよい。例えば組成物は、上記創傷における感染および／または炎症のリスクを低減するために創傷に投与されてよい。本発明の組成物はしかし、局所感染および／炎症に既に罹患している個体にも投与されてよい。
製品
本発明はまた、本発明による組成物を含む製品を提供する。製品は、例えば本発明の組成物の局所投与を援助し得る製品であってよい。
そのような実施形態において、製品は、例えばゲル、点滴薬、スプレー、クリーム、液体、創傷洗浄液、コンタクトレンズ用液、軟膏、縫合糸、プロテーゼ、インプラント、創傷ドレッシング、プラスター、カテーテル、皮膚移植片、代用皮膚、およびバンデージからなる群から選択されてよい。
点滴薬およびスプレーは、例えば組成物を耳、目、または鼻に塗布するように構成（即ち配合）されてよい。組成物は、例えば目または耳に容易に適用可能な粘性液として配合されてよく、あるいは耳への容易な塗布のためのハイドロゲルとして配合されてもよい。
製品、例えばハイドロゲル、点滴薬、スプレー、創傷ドレッシング、プラスター、代用皮膚、およびバンデージは、皮膚または他の上皮表面または創傷への組成物の投与のために構成または配合されてよい。
一般に組成物および製品は、局所投与用に、詳細には外用薬投与用に配合されてよい。
そのような実施形態において、組成物は、製品上にコートされる、塗装もしくはスプレーされてよく、または組成物は、製品により吸着もしくは吸収されてよい。
そうすることにおいて、組成物は、抗菌および抗炎症特性を製品に付与してよい。
本明細書で用いられる用語「コートされた」は、組成物が製品の表面に塗布されることを指す。したがって製品は、組成物を含む溶液で塗装またはスプレーされてもよい。あるいは製品は、組成物のリザーバ中に浸漬されてもよい。
有利には製品は、組成物で含浸される。「含浸される」は、組成物が製品で吸収または吸着されることを意味する。
項目
本発明はさらに、以下の項目の任意の１つにより定義されてよい：
１．ｃ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｄ）水性溶液と混合された場合にハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、
ｅ）水性溶液、
を含む組成物。
２．ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｂ）水性溶液と混合された場合にハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、
ｃ）水性溶液、
を含む組成物であって、
ｉ．組成物中の化合物の濃度が、少なくとも０．０８ｗｔ％であり、および／または
ｉｉ．非イオン性ポリマーが、少なくとも０．０５ｗｔ％の濃度で上記組成物中に存在する、
組成物。
３．ハイドロゲルまたは粘性溶液であり、好ましくはハイドロゲルである、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４．非イオン性ポリマーが、ヒドロキシル化される、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
５．非イオン性ポリマーが、ポリアリルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、コーンスターチおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、メチルセルロース、エチルセルロースおよびｎ－プロピルセルロースを含むＣ１～Ｃ６－アルキルセルロースなどのアルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース、好ましくはヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロースおよび前述のものの混合物などのヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースおよびヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキル－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースを含む置換されたアルキルセルロースからなる群から選択される、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
６．非イオン性ポリマーが、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（ビニル）アルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
７．非イオン性ポリマーが、ヒドロキシアルキルセルロースからなる群から、好ましくはヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）からなる群から選択される、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
８．本発明の組成物中の非イオン性ポリマーの濃度が、少なくとも１０Ｐａ、少なくとも１５Ｐａなど、例えば１０～８０Ｐａの範囲、４０～６０Ｐａの範囲などの流動点を有する組成物を得るのに充分である、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
９．非イオン性ポリマーが、少なくとも０．０５ｗｔ％の濃度、例えば少なくとも０．０９ｗｔ％の濃度、少なくとも０．１ｗｔ％の濃度など、例えば少なくとも０．５ｗｔ％の濃度、少なくとも０．８ｗｔ％の濃度など、例えば少なくとも１．０ｗｔ％の濃度、好ましくは０．０９～４ｗｔ％の範囲の、より好ましくは１～３ｗｔ％の範囲の濃度で上記組成物中に存在する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１０．非イオン性ポリマーが、少なくとも１ｗｔ％の濃度で上記組成物中に存在する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１１．好ましくは１～３ｖｏｌ％の濃度、より好ましくは１～２ｖｏｌ％の濃度のグリセロールをさらに含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１２．上記水性溶液が、水性バッファーである、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１３．ＥＤＴＡをさらに含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１４．ｄ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｅ）ＥＤＴＡと、
ｆ）水性バッファー、
を含み、
高くても７のｐＨを有する、組成物。
１５．ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
ｂ）ＥＤＴＡと、
ｃ）水性バッファー、
を含む組成物であって、
ｉ．組成物が、高くても８のｐＨを有し、および／または
ｉｉ．組成物中の化合物の濃度が、少なくとも０．０８ｗｔ％である、
組成物。
１６．ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物
を含む組成物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有し、
組成物中の化合物の濃度が、少なくとも０．０１ｗｔ％、好ましくは少なくとも０．０８ｗｔ％、例えば０．０８～３ｗｔ％の範囲である、
組成物。
１７．ａ）アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
を含み、またはそれからなるペプチドを含む化合物、
を含む組成物であって、
ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有し、
組成物中の化合物の濃度が、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．２５ｍＭなど、少なくとも０．３ｍＭなどである、
組成物。
１８．ペプチドが、アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３（ここで、
Ｘ４、６、９、１１は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｉ、ＭまたはＴであり、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｋ、ＱまたはＲである）
を含み、またはそれからなり、
２０～１００のアミノ酸残基の長さを有する、
上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
１９．ペプチドが、アミノ酸配列
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７（ここで、
Ｘ４、６、９、１１、１４、１５は、任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｉ、ＭまたはＴであり、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｋ、ＱまたはＲであり、
Ｘ１６は、ＧまたはＤであり、
Ｘ１７は、Ｅ、Ｌ、Ｇ、ＲまたはＫである）
を含み、またはそれからなり、
２０～１００のアミノ酸残基の長さを有する、
上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２０．ペプチドが、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）、
ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）、
ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４）、
ＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
のいずれかを含む、またはそれからなる、
上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２１．ペプチドが、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、または
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
のいずれかを含む、またはそれからなる、
上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２２．ペプチドが、アミノ酸配列
ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくはペプチドが、アミノ酸配列ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）からなる、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２３．ペプチドが、リポ多糖と、ＣＤ１４のＬＰＳ－結合疎水性ポケットの両方に同時に結合できる、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２４．ペプチドが、少なくとも０．０８ｗｔ％、例えば少なくとも０．１ｗｔ％の濃度で上記組成物中に存在する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２５．ペプチドが、少なくとも０．０１ｗｔ％の濃度、より好ましくは０．０１～５ｗｔ％、０．０８～３ｗｔ％などの濃度で上記組成物中に存在する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２６．ＥＤＴＡが、少なくとも１ｍＭ、１～１００ｍＭの範囲内など、好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭなど、例えば２～１００ｍＭの範囲、２～２５ｍＭの範囲などの濃度で上記組成物中に存在する、項目１３～２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．ＥＤＴＡが、少なくとも２ｍＭ、少なくとも１０ｍＭなど、例えば少なくとも１５ｍＭ、１５～１００ｍＭの範囲など、例えば１５～５０ｍＭの範囲の濃度のＥＤＴＡで上記組成物中に存在する、項目１３～２５のいずれか１つに記載の組成物。
２８．組成物のｐＨが、高くても７である、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
２９．組成物のｐＨが、７より低い、好ましくは６より低い、より好ましくは５．５以下である、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３０．組成物のｐＨが、７より低く、好ましくは６より低く、より好ましくは５．５以下であり、および３より高い、少なくとも３．５である、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３１．組成物のｐＨが、３～６の範囲である、およそ５などである、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３２．水性バッファーが、好ましくは１０～５０ｍＭの濃度、より好ましくは２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、３．６～５、５などのｐＨを有する酢酸バッファーである、項目１２～３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．組成物のｐＨが、高くても８、３～８の範囲など、例えば３．５～８の範囲、５～８の範囲などである、項目１～２７のいずれか１つに記載の組成物。
３４．組成物のｐＨが、７と８の間、好ましくはおよそ７．４である、項目１～２７のいずれか１つに記載の組成物。
３５．水性溶液または水性バッファーが、好ましくは５～２０ｍＭ、およそ１０ｍＭの濃度で、トリスアミノメタンを含むトリスアミノメタン（トリス）バッファーである、項目１～２７および３３～３４のいずれか１つに記載の組成物。
３６．組成物中の上記ペプチドが、少なくとも３０℃、好ましくは少なくとも３５℃、より好ましくは少なくとも４０℃のＴｍを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３７．組成物中の上記ペプチドを含む化合物が、少なくとも３０℃、好ましくは少なくとも３５℃、より好ましくは少なくとも４０℃のＴｍを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３８．組成物中の上記ペプチドが、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも１．０Ｍ、より好ましくは少なくとも１．１ＭのＣｍ ｕｒｅａを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
３９．組成物中の上記ペプチドを含む化合物が、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも１．０Ｍ、より好ましくは少なくとも１．１ＭのＣｍ ｕｒｅａを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４０．組成物中の上記ペプチドが、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも０．９ＭのＣｍ Ｇｎｄ－ＨＣＩを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４１．組成物中に上記ペプチドを含む化合物が、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも０．９ＭのＣｍ Ｇｎｄ－ＨＣＩを有する、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４２．３７℃で２か月間の貯蔵後に、上記ペプチドを含む上記化合物の最初の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４３．３７℃で４か月間の貯蔵後に、上記ペプチドを含む上記化合物の最初の含量の少なくとも７５％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％を含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４４．３７℃で６か月間の貯蔵後に、上記ペプチドを含む上記化合物の最初の含量の少なくとも７０％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも８５％を含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４５．室温で８か月間の貯蔵後に、上記ペプチドを含む上記化合物の最初の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％などを含む、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。
４６．上記項目のいずれかに記載の組成物を含む製品。
４７．ゲル、点滴薬、スプレー、クリーム、液体、創傷洗浄液、コンタクトレンズ用液、軟膏、縫合糸、プロテーゼ、インプラント、創傷ドレッシング、プラスター、カテーテル、皮膚移植片、代用皮膚、およびバンデージからなる群から選択される、項目４６に記載の製品。
４８．組成物が、製品上にコートされる、塗装もしくはスプレーされるか、または製品により吸着もしくは吸収される、項目４６～４７のいずれかに記載の製品。
４９．それを必要とする個体における障害の処置の方法における使用のための、項目１～４５のいずれかに記載の組成物、または項目４６～４８のいずれか１つに記載の製品。
５０．局所投与のために調製される、項目４９に記載の使用のための組成物。
５１．それを必要とする個体における障害の処置のための薬剤の調製のための、項目１～４５のいずれか１つに記載の組成物の使用。
５２．組成物が、局所投与のために調製される、項目５１に記載の使用。
５３．それを必要とする個体における障害の処置の方法であって、上記個体への、項目１～４５のいずれか１つに記載の組成物、または項目４６～４８のいずれか１つに記載の製品の治療有効量の投与を含む、方法。
５４．上記投与が、局所投与である、項目５３に記載の方法。
５５．上記処置が、好転的処置、治癒的処置および予防的処置からなる群から選択される、項目４９～５４のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
５６．障害が、皮膚、耳、目または鼻の障害である、項目４９～５５のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
５７．障害が、創傷である、項目４９～５６のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
５８．創傷が、熱傷および非治癒性潰瘍からなる群から選択される、項目５７に記載の使用のための組成物、使用または方法。
５９．創傷が、術創である、項目５７に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６０．障害が、炎症を含むか、または炎症に関連する、項目４９～５９のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
６１．障害が、細菌による感染を含むか、または細菌による感染に関連する、項目４９～６０のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
６２．細菌が、グラム陰性またはグラム陽性である、項目６１に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６３．細菌が、グラム陰性菌である、項目６１に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６４．細菌が、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、ステノトロフォモナス属、シゲラ属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ヘモフィルス属、シュードモナス属およびシトロバクター属からなる群から選択される属のものである、項目６１に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６５．細菌が、黄色ブドウ球菌および緑膿菌からなる群から選択される、項目６１に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６６．細菌が、多剤耐性菌である、項目６１～６５に記載の使用のための組成物、使用または方法。
６７．上記個体が、糖尿病、動脈不全または静脈不全に罹患している、項目４９～６６のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
６８．上記処置の方法が、外用薬処置である、項目４９～６７のいずれか１つに記載の使用のための組成物、使用または方法。
実施例１
実施例は、ＴＣＰ－２５で機能化されたハイドロゲル配合剤を記載する。この実施例で用いられる用語「ＴＣＰ－２５」は、以下の配列：ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のペプチドを指す。配合剤は、細菌およびＰＡＭＰ誘導性炎症の二重の標的化に有用である。様々なインビトロアッセイを利用して、異なるＴＣＰ－２５ゲルが、グラム陽性黄色ブドウ球菌、グラム陰性緑膿菌および様々な他の臨床細菌単離物に対する有効性について活発にテストされた。ＴＣＰ－２５ゲルの二重の抗微生物および抗炎症作用が、皮下黄色ブドウ球菌および緑膿菌感染の実験的マウスモデルにおいて、およびエンドトキシン誘導性炎症のＮＦ－ｋＢレポータマウスモデルにおいて、実証された。ＴＣＰ－２５ゲルの有効性が、前臨床ブタ部分層創傷感染モデルにおいて示された。ハイドロゲル中のＴＣＰ－２５の薬物動態が、蛍光分光法、ＩＶＩＳバイオイメージング、および質量分析での分析を利用してインビトロ、エクスビボおよびインビボで検討された。ハイドロゲル中の活性化合物の運命を試験するために、ＴＣＰ－２５の分解が、質量分析により分析された。主要なＴＣＰ－２５断片の生物活性が、インビトロアッセイにより実証された。加えて、長期貯蔵後のゲル中および血漿中のＴＣＰ－２５の安定性が、質量分析により分析された。最後に、ＴＣＰ－２５ゲル処置の有効性が、前臨床ブタ部分層創傷感染モデルにおいて臨床的に利用される創傷処置と比較された。臨床への変換をさらに実証するために、上記ブタ感染創傷からの、および黄色ブドウ球菌および緑膿菌によりコロニー形成された非治癒性創傷を有する患者からの、創傷液の炎症促進作用に及ぼすＴＣＰ－２５の効果が、単球モデルを用いて評価された。
材料と方法
倫理に関する声明。全ての動物実験は、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ ＳＦＳ １９８８：５３４に従って実施され、Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ， Ｓｗｅｄｅｎ（許可番号Ｍ２５２－１１、Ｍ１３１－１６、Ｍ８８－９１／１４、Ｍ５９３４－１９、８８７１－１９）によって認可された。ヒト創傷材料の使用は、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＬＵ７０８－０１およびＬＵ５０９－０１）により認可された。
統計解析。全ての微生物アッセイおよび細胞培養を基にしたアッセイは、バイオロジカルレプリケートを示し、少なくとも３回反復された。データは、平均±ＳＥＭとして表される。創傷の臨床スコア付けは、メディアンとして表される。２群間の平均の差は、正規分布データではスチューデントｔ検定を、その他ではマン・ホイットニー検定を用いて解析された。２群より多い群間の平均を比較するために、正規分布データでは一元配置分散分析と事後検定（テューキー）、またはクラスカル・ウォリス検定と事後検定（ダン）が、他に用いられた。各図の凡例に示された統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアｖ８を用いて実施された。Ｐ値＜０．０５は、統計学的に有意と判断された。
ペプチド、バッファー、およびゲル配合剤。ＴＣＰ－２５（９７％純度、酢酸塩）が、Ａｍｂｉｏｐｈａｒｍ（スペイン マドリード）により合成された。テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、シアニン３（Ｃｙ３）、およびシアニン（Ｃｙ５）標識ＴＣＰ－２５ペプチドが、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）により合成された。標識は、全ての例でペプチドのＮ－末端に付加された。標識されたペプチドの純度（９５％）が、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州フレーミングハム）により確認された。用いられたゲル形成物質は、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ、Ｋｌｕｃｅｌ（商標）ＭＦ、ＭＷ８５００００；Ａｓｈｌａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、スイス シャフハウゼン）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ、Ｎａｔｒｏｓｏｌ（商標）２５０ＨＸ、ＭＷ１００００００；Ａｓｈｌａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、スイス シャフハウゼン）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、Ｂｌａｎｏｓｅ（商標）７ＨＯＦ、ＭＷ７２５０００；Ａｓｈｌａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、フランス アリゼ）、ならびにＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、ＭＷ１２６００；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ドイツ シュタインハイム）であった。
ＴＣＰ－２５ハイドロゲルの調製。ゲル配合剤の調製のために、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＣＭＣ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７が、１．３％グリセロールを有する１０ｍＭトリスｐＨ７．４に添加された（ＨＥＣ混合物の場合、バッファーは、５６℃に予備加熱された）。マグネチックスターラーが、均質なゲルが形成されるまで、連続で溶液を撹拌するために用いられた。気泡を除去するために、ゲル配合剤が、３分間遠心分離された（３．５×１０００ｒｐｍ）。所望の量のＴＣＰ－２５ペプチドがその後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）および１．３％グリセロールバッファーに溶解され、その後、ゲルに添加され、撹拌および遠心分離ステップが再度行われた。ＴＣＰ－２５配合剤の初期スクリーニングのために、本発明者らは、１％配合物質（図１Ａの場合ＨＰＣ、ＣＭＣ、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ）を添加された４０μＭ ＴＣＰ－２５、０．５％ポリマーもしくはＰｌｕｒｏｎｉｃが添加された異なるＴＣＰ－２５濃度（図１Ｂの場合）、または０．１％ポリマーもしくはＰｌｕｒｏｎｉｃを有する１０μＭ ＴＣＰ－２５（図１ＣまたはＤの場合）のいずれかを用いた。他に明白に述べられない限り、用語「ＴＣＰ－２５ゲル＃１」は、０．１％ＴＣＰ－２５（０．３ｍＭ）、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスＨＣＩ、１．３％グリセロールおよび１．５％ＨＥＣを含むゲルを指す。ＴＣＰ－２５ゲル＃１が、本実施例に記載されたインビトロおよびインビボ実験に用いられた。ブタ創傷モデルでは、ゲルは、０．１％または１％ＴＣＰ－２５（それぞれ０．３または３ｍＭ）、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスＨＣＩ、１．３％グリセロールおよび２％ＨＥＣポリマーを含有した。上記ゲルが０．１％ＴＣＰ－２５を含む限りにおいて、それは、本明細書では「ＴＣＰ－２５ゲル＃２」と称され、１％ＴＣＰ－２５を含む上記ゲルは、ＴＣＰ－２５ゲル＃３と称される。ゲル配合剤は、さらなる使用まで４℃で貯蔵された。ＴＣＰ－２５の蛍光撮像では、ゲルは、２％蛍光標識ＴＣＰ－２５（ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識）でスパイクされた。
細菌単離物。この計画で用いられた菌株は、大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、緑膿菌（ＰＡＯ１およびＡＴＣＣ２７８５３）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）、表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１４９９０）、およびエンテロコッカス・フェカリス（ＡＴＣＣ２９２１２）であった。この試験で用いられたバイオルミネッセンス性細菌は、緑膿菌および黄色ブドウ球菌であった。本発明者らはまた、黄色ブドウ球菌（１７７９、１７８１、２２７８、２２７９、２４０４、２４０５、２５２８、２７８８、２７８９）、緑膿菌（１０．５、１３．２、２３．１、２７．１、５１．１、６２．２、１５１５９、１８４８８）、表皮ブドウ球菌（２２８２）、およびＥ．フェカリス（２３７４）の臨床単離物を用い、それらは、皮膚および創傷感染物のどちらかに由来した。これらの菌株は、スウェーデン ルンドのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから得られた。
放射状拡散アッセイ（ＲＤＡ）。細菌（大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌）が、フルストレングス（ｆｕｌｌ－ｓｔｒｅｎｇｔｈ）（３％ｗ／ｖ）トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ；Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国メリーランド州スパークス）１０ｍＬ中で対数増殖期中期まで増殖され、遠心分離され（５６００ｒｐｍ×１０分）、その後、１０ｍＭトリスバッファー中で再懸濁された。その後、４×１０６ＣＦＵが、０．０３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ）低電気浸透度（ＥＥＯ）アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国マサチューセッツ州セントルイス）、および０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる下張り（ｕｎｄｅｒｌａｙ）アガロースゲル１５ｍＬに添加され、その後、１４４ｍｍペトリ皿に入れられた。プレートがその後、生検パンチを用いて４ｍｍウェルをアガロースゲル中にパンチすることにより、調製された。ＴＣＰ－２５（６μＬ）がその後、アガロース上のウェルに添加され、３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートされて、ペプチドをゲル中に拡散させた。下張りのゲルが、溶融されたオーバーレイ（蒸留Ｈ２Ｏ中の６％ＴＳＢおよび１％低ＥＥＯアガロース）１５ｍＬで覆われ、プレートがその後、３７℃で２４時間インキュベートされた。ペプチドの抗菌活性が各ウェルの周辺の透明ゾーンとして視覚化され、パンチ径（４ｍｍ）を除くゾーン径として表された。分解されたＴＣＰ－２５の抗菌特性を評定するために、ＲＤＡプレートが調製され（上記の通りの下張りアガロースゲル１５ｍＬ中の４×１０６ＣＦＵ大腸菌）、試料が上記の節に記載された通りロードされた。試料が、分解されたペプチド溶液を０．１５Ｍ ＮａＣＩを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスと混合することにより、調製された。
生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）。菌株が、トッド・ヒューイット（ＴＨ）培地中で対数増殖期中期まで増殖され、その後、遠心分離された（５６００ｒｐｍ×１０分）。細菌ペレットがその後、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスを用いて洗浄され、１０分間再遠心分離され、その後、ペレットは同じ１０ｍＭトリスバッファーに再懸濁された。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス ５０μＬ中の大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌１×１０７ＣＦＵが、異なるＴＣＰ－２５ゲル配合剤（０、１、２、５または１０μＭのいずれかのＴＣＰ－２５を混合された０．５％ＨＰＣ、ＣＭＣまたはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７）を含有する試験管に添加された。試験管はその後、３７℃（５％ＣＯ２）で２時間インキュベートされた。インキュベーションの後、１０倍系列希釈が実施され、希釈物のそれぞれから１０μＬが６回、ＴＨブロス寒天プレートに播種され、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートされ、その後ＣＦＵを決定した。
バイオルミネッセンス性細菌に対するＴＣＰ－２５ゲルの抗菌効果。バイオルミネッセンス性緑膿菌Ｘｅｎ４１および黄色ブドウ球菌ＳＡＰ２２９が、ＴＨ培地中で対数増殖期中期まで増殖され、その後、それらは、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスおよび１．３％グリセロールバッファー（５６００ｒｐｍ）中で２０分間洗浄された。細菌ペレットが１０ｍＭトリスバッファーで希釈され、各菌株から５０μＬ（２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）が、０．１％ＴＣＰ－２５を有する、または有しないゲル配合剤（１．５％ＨＥＣ、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１．３％グリセロール）と混合された。３７℃で２時間のインキュベーションの後、各試料がピペットチップを用いて穏やかに混合された。バイオルミネッセンスが、インビボバイオイメージングシステムＩＶＩＳ□（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて１、５、３０および１２０分目に測定された。
最小発育阻害濃度アッセイ。微生物増殖を予防する抗菌物質の最低濃度を定義するＭＩＣ分析が、マイクロタイターブロス希釈法（Ｗｉｅｇａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００８）を用いて実施された。手短に述べると、新鮮な一夜コロニーが、０．５単位の濁度に懸濁され、さらにミューラー・ヒントンブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に希釈された。ＭＩＣを決定するために、ＴＣＰ－２５が、原液から、系列希釈を介して必要な範囲より１０倍高い濃度で溶解された。その後、各濃度の１０μＬが、９６ウェルマイクロタイタープレート（ポリプロピレン、Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．）のそれぞれ対応するウェルに添加された。細菌が、トリス（ｐＨ７．４）ですすがれ、ＭＨ培地で希釈され、懸濁液９０μＬ（およそ１×１０５ＣＦＵ）が、各ウェルに添加された。プレートが３７℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートされた。ＭＩＣは、生菌の増殖が観察されない濃度とされた。
ＮＦ－ｋＢ／ＡＰ－１アッセイ。ＮＦ－ｋＢ活性化が、製造業者の使用説明書に従い、ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４レポータ細胞（ここではＴＨＰ－１細胞と表す、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて評定された。手短に述べると、ＴＨＰ－１細胞が、１０％加熱非働化ＦＢＳ、１％抗生物質－抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）、１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州）、および２００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州）を有するＲＰＭＩ１６４０細胞培地中で培養された。細胞が、１．８×１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに添加された。先に記載された（ＨＰＣ、ＣＭＣまたはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７中の）異なるＴＣＰ－２５ゲル配合剤（２０μＬ）が、ＬＰＳ ２０μＬ（１μｇ／ｍＬ、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合され、３７℃で一晩インキュベートされたＴＨＰ－１細胞に添加された。上清の一部（２０μＬ）が、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州）１８０μＬと混合され、さらに１時間インキュベートされた（ウェルの残りは、ＭＴＴアッセイに用いられた）。分泌された胎児アルカリホスファターゼＳＥＡＰ（ＮＦ－ｋＢ活性化の指示薬）の濃度が、６００ｎｍの分光光度計を用いて定量的に決定された。
ＭＴＴアッセイ。異なる配合剤（ＴＣＰ－２５を有する、または有しない）に供されたＴＨＰ－１細胞の生存力が、ＭＴＴアッセイを利用して測定された。滅菌濾過されたＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－テトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ドイツ シュタインハイム）溶液（ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ）が、使用されるまで光から保護されて－２０℃で貯蔵された。ＭＴＴ溶液（２０μＬ）が、先に記載された通りＮＦ－ｋＢ／ＡＰ－１アッセイからの残り（１８０μＬ）と共に各ウェルに添加された。プレートが、５％ＣＯ２および３７℃で９０分間インキュベートされた。インキュベーションの後、プレートが３００ｇで１０分間遠心分離され、ＭＴＴ含有培地がアスピレーションにより除去された。青色のホルマザン生成物が、各ウェルごとに１００％ＤＭＳＯ（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、オランダ ハーレム）１００μＬを添加することにより溶解された。プレートがその後、室温で３０分間、穏やかに旋回されて沈殿物を溶解し、吸収が、５５０ｎｍで読み取られた。溶解された細胞が、アッセイの陽性対照として用いられた。生存する非処置細胞の値が、１００％と見なされ、他の処置の値が、非処置の生存細胞に比較して示された。
非治癒性静脈潰瘍を有する患者からの創傷液。創傷液が、３か月より長い潰瘍期間を有する慢性静脈下肢潰瘍を有する患者から、過去に記載された通り回収された（Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。Ｏｐ－Ｓｉｔｅドレッシングが創傷に適用され、創傷液が、２時間後にフィルム下の穏やかなアスピレーションを介して採取された。滅菌創傷液が、乳腺切除後の外科的排膿物から得られた。創傷液は、エッペンドルフ遠心分離機において１０，０００ｒｐｍで遠心分離され、分取され、－２０℃で貯蔵された。この試験では、陽性緑膿菌および黄色ブドウ球菌培養物を有する患者からの創傷液が、用いられた。
円偏光二色性分光法。本発明者らは、温度制御ユニット（２５℃）Ｊａｓｃｏ ＣＤＦ－４２６Ｓ Ｐｅｌｔｉｅｒを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、米国メリーランド州イーストン）を用いて、円偏光二色性分光測定を実施した。試料マトリックスが、２０μＭ ＴＣＰ－２５を用いて調製され、希釈され、異なる配合剤成分（１：１比でそれぞれＨＰＣ／ＨＥＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７を有するＴＣＰ－２５）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍＬ）、または１０ｍＭトリスｐＨ７．４単独と混合された。全ての混合物が室温で３０分間インキュベートされ、その後、試料が１ｍｍ石英製キュベットに入れられた。窒素で外部パージングされた後、試料が、波長間隔２００～２６０ｎｍ（スキャン速度：２０ｎｍ／分）にわたりスキャンされた。各試料につきスキャン５回の平均が、記録された。ベースライン（１０ｍＭトリスバッファー、配合剤成分、またはＬＰＳ）が、各試料のスペクトルから減算された。本発明者らは、過去に記載された通り、１０ｍＭトリスバッファー、ＬＰＳ、および配合剤成分（１：５の比で）の存在下で２２２ｎｍでのモルエリプソメトリーからＴＣＰ－２５のα－ヘリックス含量を計算した。
ＴＣＰ－２５ゲル拡散。拡散アッセイが、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）インサート（０．４μｍ、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国ペンシルベニア州ラドノール）を備えた６ウェルプレートで実施された。ペプチド放出の分析のために、ＴＣＰ－２５ゲル（０．１％ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１．３％グリセロースおよび１．５％ＨＥＣ）が作製された。トリスグリセロールバッファー（４ｍＬ）が、各ウェルの側底区分に添加された。ＴＣＰ－２５ゲル（１ｍＬ）が、頂上区分に添加された。プレートがその後、３７℃でインキュベートされた。２５μＬの試料が、異なる時点（５分、２０分、３０分、１時間、２時間、６時間、２４時間、および４８時間）で側底区分から採取され、蛍光が、分光光度計を用いて５７０および５８３ｎｍで測定された。バッファー中の０．１％ＴＣＰ－２５溶液が、対照に用いられた。
ＴＣＰ－２５の安定性。ＨＥＣゲルまたはバッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１．３％グリセロール）のどちらかの中のＴＣＰ－２５の安定性が、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を利用して検討された。試料が、調製され（１．５％ＨＥＣまたはバッファー中の０．１％ＴＣＰ－２５）、その後、０、１４、６０または１８０日間の貯蔵庫に入れられた。試料マトリックスが、各貯蔵時間からの試料が異なる温度－８０℃、４℃、２０℃および３７℃でも保持されるように、割り付けられた。貯蔵後、試料が質量分析用に調製された。
ＴＣＰ－２５断片の質量分析。１０ｍＭトリス中のＴＣＰ－２５（２μｇ）が、総容量２０μＬ中のＨＮＥ（０．１μｇ）により３７℃で３０分間および／または３時間消化された。ゲル配合剤（０．１％ＴＣＰ－２５、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１．３％グリセロール、１．５％ＨＥＣ）２０ｍｇが、溶液と同じ条件下で０．２μｇ ＨＮＥでも消化された。溶液およびＨＥＣゲル中のＴＣＰ－２５の消化が、ＭＡＬＤＩ質量分析およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を利用して決定された。
ＭＡＬＤＩ質量分析。ゲルまたは溶液からのＴＣＰ－２５試料が、２％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで希釈され、ステンレス製ＭＡＬＤＩターゲットプレート上で直接５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ溶液中の０．５ｍｇ／ｍＬ α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の溶液と混合された。典型的には試料０．５μＬが、ＣＨＣＡ溶液０．５μＬと混合された。次のＭＳ分析が、ＭＡＬＤＩ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ ブレーメン）で実施された。全ての質量スペクトルが、ＦＴ分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を利用して６０，０００分解能（ｍ／ｚ４００）で得られた。質量スペクトルの記録が、８００～４０００Ｄａ質量範囲のポジティブモードで実施された。窒素レーザが、オフモードの自動ゲイン制御により１０μＪで、位置ごとに１０のレーザショットを利用して操作された。スペクトルの評価は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ ２．０．７．ソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、米国カリフォルニア州サンホセ）を用いて実施された。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ。ＭＳ分析が、Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｅａｓｙ－ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ ＭＳシステム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施された。データベース検索が、ＰＥＡＫＳ７．５により以下の設定で実施された：酵素およびメチオニン酸化は、動的修飾として処置されなかった。翻訳後修飾の最大数は、ペプチドごとに１つであった。７ｐｐｍのＭＳ質量誤差範囲および０．０５ＤａのＭＳ／ＭＳ質量誤差範囲が、用いられた。
創傷液および血漿の中のＴＣＰ－２５の質量分析。ミニブタ創傷液および血漿のためのＭＳ分析が、Ｑ＆Ｑ Ｌａｂｓ（Ｍｏｌｎｄａｌ、ウェーデン）で実施された。手短に述べると、内部標準溶液（ＩＳＴＤ）５０μＬが、血漿または創傷液試料３００μＬに添加され、５秒間ボルテックス処理された。その後、０．１６％ＮＨ４ＯＨおよび３０％ＣＡＮが添加され、１０秒間ボルテックス処理された。全試料がその後、Ｏａｓｉｓ ＷＣＸカラム（Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）にロードされ、滴下してカラムを通って流された。すすぎおよび溶出の後、試料がＮ２での蒸発により乾燥された。試料がその後、５０：５０のＣＡＮ：ＭＱで希釈され、ボルテックス処理され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入された。アッセイ範囲は３０～３０００ｎＭであり、定量限界（ＬＯＱ）は１００ｎＭであった。
血漿中のＴＣＰ－２５の安定性。ＴＣＰ－２５（１０μＭ）が、異なる種の血漿中およびＰＢＳ中、３７℃でインキュベートされた。分取液が、０、１、３、および５時間の時点で採取され、最終試料容量中の考えられる差を補填するための内部標準を有して氷冷アセトンを用いるタンパク質沈殿によるＬＣ－ＭＳ分析のために調製された。ＬＣ－ＭＳ分析が、フルスキャンモードで実施され、ＴＣＰ－２５と内部標準とのピーク面積の比が計算され、時間に対してプロットされた。消失について得られたｋ（ｈ－１）値が、ＴＣＰ－２５の半減期を計算するために用いられた。
流動学的分析。０．１％または１％ＴＣＰ－２５を有する、または有しない２％ＨＥＣゲルでの流動学的測定が、プレート／プレートの配置および１ｍｍのギャップを備えたＫｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，英国マルバーン）で実施された。０．００１～１０の剪断歪が、線形粘弾性領域（ＬＶＲ）、ならびに１Ｈｚおよび２５℃での流動点（Ｇ’およびＧ”クロスオーバーでの剪断応力）を決定するために適用された。流動点での剪断応力（Ｐａ）は、レオメータにより直接決定された。加えて、Ｇ’およびＧ”クロスオーバーでの歪みとしての流動点も、決定された。測定は、三重測定で実施された。
マウス炎症モデル。１０～１２週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ ｔｇ（ＮＦｋ□－ＲＥ－Ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポータマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニューヨーク州アルバニ）が、ＬＰＳ（大腸菌５μｇ）での皮下同時処置後のＴＣＰ－２５ゲル＃１の抗炎症効果を試験するために用いられた。マウスの背中が注意深く剃毛され、浄化された。ＬＰＳが、ＴＣＰ－２５ゲル＃１ １００μＬと混合され、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ、米国イリノイ州ディアフィールド）で麻酔されながら直ちに皮下注射された。マウスは、直ちに個別換気ケージに移された。ゲル配合剤中のＴＣＰ－２５が、ペプチドの蛍光撮像のためにＴＣＰ－２５ Ｃｙ５でスパイクされた。ＩＶＩＳスペクトルでのバイオイメージングが、ＮＦ－ｋＢ活性化の縦断的決定に用いられた。ＩＶＩＳ撮像の１５分前に、マウスが、Ｄ－ルシフェリン １００μＬを腹腔内注射された（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスからのバイオルミネッセンスが、検出され、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて定量された。
マウス外科的インプラントモデル。１０～１２週齢雄ＢＡＬＢ／ｃマウスが、外科的インプラントモデルに用いられた。マウスの背中が剃毛され、７０％アルコールで浄化された。イソフルラン麻酔の下で、およそ１０ｍｍの切開がマウスの背部の皮膚に施され、はさみの先端が、小さなポケットを作製するのに用いられた。６ｍｍ径円盤のポリウレタン（ＰＵ）フォーム（Ｍｅｐｉｌｅｘ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ Ｈｅａｔｈ Ｃａｒｅ、スウェーデン ヨーテボリ）が、皮下筋膜の下の挿入された。ＴＣＰ－２５ゲル＃１または対照ゲル １００μＬとＬＰＳ（大腸菌、５μｇ）が、直ちに皮下ポケット中のＰＵ円盤の周辺に沈着され、創傷が縫合糸（ＶＩＣＲＹＬ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、ベルギー）で閉鎖された。マウスが２４時間目に殺処分され、ＰＵディスクが回収された。創傷液が、さらなるサイトカイン分析のためにＰＵディスクから抽出された。
皮下感染のマウスモデル。１０～１２週齢雄ＳＫＨ－１無毛マウスが、２％イソフルランと酸素の混合物を用いて麻酔された。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃１が、ペプチドの蛍光撮像に用いられた。バイオルミネッセンス性細菌の緑膿菌Ｘｅｎ４１または黄色ブドウ球菌２２９の一夜培養物が、リフレッシュされ、ＴＨ培地中で対数増殖期中期まで増殖された。細菌が、１５分間洗浄され（５．６□１０００ｒｐｍ）、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７，４）で希釈された。配合剤はその後、細菌１０６ＣＦＵと混合された。総量１００μＬの汚染混合物（８０μＬゲル＋２０μＬ細菌懸濁液）が、マウスの背中に皮下注射された。インビボ細菌感染およびペプチド局在化が、ＩＶＩＳ撮像を利用して麻酔マウスにおいてバイオルミネッセンス（細菌）および蛍光（ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５）を測定することにより、縦断的に評価された。動物は、バイオルミネッセンスまたは蛍光モードのどちらかで撮像され、得られたデータは、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析された。終了時に、創傷の組織試料が回収され、ＣＦＵが決定された。
予防モデルでは、全ての手順は、ゲル（８０μＬ）が最初にＢＡＬＢ／ｃマウスの背中に皮下注射されたことを除き、上記と類似していた。３０分後に、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌および緑膿菌（２０μＬ中の１０６ＣＦＵ）が、ゲル沈着部位に注射された。インビボ細菌感染が、ＩＶＩＳ撮像を利用して細菌バイオルミネッセンスを測定することにより縦断的に評価された。
マウスにおけるＴＣＰ－２５放出。１０～１２週齢雄ＳＫＨ－１無毛マウスが、２％イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）と酸素の混合物を用いて麻酔された。ＴＣＰ－２５ Ｃｙ５をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃１が、ペプチドの蛍光撮像に用いられた。いくらかのマウスでは、ＴＣＰ－２５ゲル＃１が、ＬＰＳ ２０μｇと混合された。ゲル（１００μＬ）が、イソルランで麻酔されたマウスに皮下注射された。ペプチドの放出が、蛍光モードのＩＶＩＳ撮像を用いてモニタリングされ、得られたデータはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析された。
部分層創傷のミニブタモデル。黄色ブドウ球菌の創傷感染をインビボで試験するために、ミニブタの部分層創傷モデルが用いられた。体重１４～１６ｋｇの雌ゲッチンゲン系ミニブタが、用いられた。手順の全ては、資格のある外科獣医により厳格な無菌技術に従って実施された。創傷形成の前に、ミニブタが１週間馴化され、創傷形成の前夜は絶食された。背部の体毛が、手術の２４時間前に刈り取られた。創傷形成の当日に、ミニブタの背部が、クロルヘキシジン（ＭＥＤＩ－ＳＣＲＵＢスポンジ；Ｒｏｖｅｒｓ、オランダ オス）および生ぬるい水と共にこすり洗いされた。背中がその後、剃毛され、クロルヘキシジン溶液（４％）で消毒され、滅菌ガーゼで乾燥された。その後の手順は、全身麻酔下で実施された。全身麻酔は、チレタミンとゾラゼパム（Ｚｏｌａｃｅｐａｍ）の混合物（Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０、Ｖｉｒｂａｃ、スウェーデン）で実現された。Ｚｏｌｅｔｉｌ導入用量（１ｍＬ／１０ｋｇ体重）が、筋肉内に与えられ、麻酔が、耳介静脈中でカテーテルを利用して静脈内で維持された（０．５ｍＬ／１０ｋｇ体重）。麻酔の間、ミニブタはフェイスマスクを通して酸素が補充された。創傷の外形が、滅菌三角スケールおよび組織ペンで標識された。電動デルマトーム（Ｚｉｍｍｅｒ）を用いて、２．５×２．５ｃｍの大きさの１２の部分層（深さ７５０μｍ）創傷が、ミニブタの背部に作製された（各側に６箇所）。最初の実験では、新鮮な創傷の深さが、生検の凍結切片およびＤＡＰＩ核染色剤での染色により確認された。４ｃｍの最小距離が、創傷間で維持された。ホメオスタシスのために、創傷が滅菌ガーゼで覆われた。一晩の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）培養物が、リフレッシュされ、ＴＨ培地中で対数増殖期中期まで増殖された。細菌が、１５分間洗浄され（５．６×１０００ｒｐｍ）、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）で２×１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度に希釈された。感染のために、細菌が、ＨＥＣ（１０７ＣＦＵ／１００μＬ）に懸濁され、新鮮な創傷表面に塗布された。ゲル（１００μＬ）が、非感染対照創傷に塗布された。１５分後、ＴＣＰ－２５ゲル＃２またはＴＣＰ－２５ゲル＃３ ５００μＬのみが、創傷に塗布され、創傷がその後、一次フォームドレッシング（Ｍｅｐｉｌｅｘ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ；Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン ヨーテボリ）で覆われた。プライマリードレッシングが、透明の呼吸可能な固定ドレッシング（Ｍｅｐｏｒｅ□ Ｆｉｌｍ；Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ、スウェーデン ヨーテボリ）で覆われた。その後、ドレッシングが皮膚用ステープル（ｓｍｉ、ベルギー ザンクト・フィート）で固着された。さらなる保護およびパッディングのために、創傷エリアがその後、２層の滅菌コットンガーゼで覆われ、接着テープで固着された。最後に、１層の可撓性自己接着バンデージ（Ｖｅｔ Ｆｌｅｘ、Ｋｒｕｕｓｅ、デンマーク）が、その下のドレッシングを支持および保護するために用いられた。麻酔からの回復後に、動物は、任意の不快感についてモニタリングされ、水および餌を提供された。動物は、個別に飼育され、連日モニタリングされた。創傷形成および感染の２４時間後に、全身麻酔の下でドレッシングが除去され、観察が行われた。創傷が撮像により証明され、臨床スコア付けが資格のある獣医により実施された。スワブ試料が創傷表面から採取され、細菌分析に用いられた。一次ドレッシングから回収された創傷液が、交換された各時間に採取され、さらに分析された。ＴＣＰ－２５ゲル＃２、ＴＣＰ－２５ゲル＃３またはゲルのみ（５００μＬ）が、各創傷群に塗布され、新しいドレッシングが適用された。短期処置レジメンでは、ドレッシングは毎日交換され、ミニブタは感染の４日後に殺処分された。長期処置レジメンでは、ドレッシングは２、３、５、７および９日目に交換され、ミニブタは１０日目に殺処分された。終了当日に、創傷からの組織試料も回収された。
ベンチマーク比較試験では、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎ（Ｂ Ｂｒａｕｎ、スイス ゼンパッハ）およびＭｅｐｉｌｅｘ Ａｇ（Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン ヨーテボリ）処置群も、加えられた。１％ＴＣＰ－２５－２％ＨＥＣゲルに加え、幾つかの創傷がＰｒｏｎｔｏｓａｎ（５００μＬ）で処置され、他は、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇ（４．５×４．５ｃｍ）で処置された。ミニブタにおける創傷治癒試験では、部分層創傷が先に記載された通り作製されたが、細菌感染は導入されなかった。創傷が、長期処置レジメンにおいてＴＣＰ－２５ゲル＃２、ＴＣＰ－２５ゲル＃３またはゲル単独で処置された。
重感染試験では、上述の短期処置レジメンに、２日目に１つの改変を有して従った。１日目の創傷形成、黄色ブドウ球菌感染および処置に続き、緑膿菌が２日目に創傷に添加された。一晩の緑膿菌培養物が、リフレッシュされ、ＴＨ培地中で対数増殖期中期まで増殖され、洗浄され、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）で希釈された。重感染を確定するために、緑膿菌（１０５ＣＦＵ／１００μＬトリスバッファー）が、創傷表面に塗布された。１５分後に、各処置およびドレッシングが適用された。ドレッシングは３日目に交換され、ミニブタは４日目に殺処分された。
確定された感染の試験では、１日目に１つの改変を有して上述の長期処置レジメンに従った（図７Ｅ）。１日目の創傷形成の直後に、黄色ブドウ球菌（１０７ＣＦＵ／１００μＬ ＨＥＣゲル）が新鮮な創傷表面に添加されたが、処置は適用されなかった。各処置が２日目に開始された後、３、５、７および９日目にドレッシングが交換され、ミニブタは１０日目に殺処分された。
重感染を有するミニブタ創傷からの汚染細菌の同定およびコンディション培地の調製
創傷から採取された新鮮なスワブ試料が、ルンドのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｋａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌに送付され、標準の微生物法を利用して同定された。コンディション培地を調製するために、細菌が、光学密度が１．５に達するまで振とうインキュベータ（１８０ｒｐｍ）内で５ｍＬ ＴＨ培地中、３７℃で一晩（１６時間）増殖された。その後、細菌は３０００×ｇで１０分間遠心分離された。上清が、取り出され、０．２μｍＦｉｌｔｒｏｐｕｒ Ｓフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ）で濾過滅菌された。１％コンディション培地が、ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ細胞を刺激するために用いられた。
インビボＴＣＰ－２５取り込み。ＴＣＰ－２５皮膚浸透および組織取り込みを試験するために、ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２およびＴＣＰ－２５ゲル＃３が用いられた。ＴＣＰ－２５ゲル＃２またはＴＣＰ－２５ゲル＃３は、ミニブタの背部の部分層創傷（２時間）または無傷の皮膚（２および２４時間）のどちらかに塗布された。ゲルの塗布後に、創傷が、先に記載された通りドレッシングされた。ブタが殺処分され、生検が、瞬間凍結され、凍結切片作製のためにＯＣＴ化合物に封入された。凍結切片が、室温（ＲＴ）のＰＢＳで洗浄され（５分で１回）、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）溶液（ＰＢＳ中の０．５ｍＭ）が核対比染色剤として用いられた（１分、ＲＴ）。スライドが、ＰＢＳで洗浄され（５分で１回、ＲＴ）、乾燥されて、退色防止封入培地（ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で封入された。切片がその後、蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて撮像された。
エクスビボＴＣＰ－２５取り込み。エクスビボのブタ皮膚モデルにおいてＴＣＰ－２５取り込みを試験するために、ＴＣＰ－２５ Ｃｙ３をスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃４が、用いられた。ＴＣＰ－２５ゲル＃４は、２％ＴＣＰ－２５、２％ＨＥＣ、１．３％グリセロールおよびｐＨ７．４の１０ｍＭトリスＨＣＩを含む。凍結された皮膚が、解凍され、エタノール（７０％）および滅菌水で洗浄された。ペトリ皿上で、皮膚を、部分的にＰＢＳに沈積した状態にして、水分を保持した。ＴＣＰ－２５ゲル＃４（５０μＬ）が、創傷または無傷の皮膚に塗布され、３７℃で２および２４時間の期間、インキュベートされた。インキュベーションの終了時に、組織試料が、外科用メスを用いて切り出され、凍結され、凍結切片作製のためにＯＣＴ化合物に封入された。凍結切片は、先のインビボ取り込みについて記載された通り、蛍光撮像のために処理された。
創傷液抽出。創傷からの創傷ドレッシング（Ｍｅｐｉｌｅｘ；Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、スウェーデン ヨーテボリ）が、５ｍＬの予め冷蔵された試験管に移され、氷上に保持された。創傷液を抽出するために、ドレッシングが、ｐＨ７．４の氷冷された１０ｍＭトリスバッファー５００μＬに浸漬され、５分間遠心分離された（２０００ｇ、４℃）。抽出された創傷液が、プロテアーゼ阻害剤を有する、または有しない予め冷蔵されたエッペンドルフ管に分取され、さらなる分析まで－８０℃で貯蔵された。
創傷の細菌分析。創傷から回収されたスワブ試料が、ＰＢＳ ５００μＬを有するエッペンドルフ管に入れられ、３０秒間ボルテックス処理された。希釈された試料（ＰＢＳで１０倍希釈）が、ＴＨブロス寒天に播種され、ＣＦＵ分析のために３７℃で一晩インキュベートされた。
ＥＬＩＳＡ。ドレッシング材から採取された創傷液が、ＩＬ－６およびＴＮＦ－α濃度を決定するために用いられた。ブタＩＬ－６およびＴＮＦ－α ＤｕｏＳｅｔ□ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）が、製造業者の推奨に従って用いられた。マウス血漿では、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αが、製造業者の使用説明に従い、マウス炎症キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＡＢ、米国ニュージャージー州フランクリンレークス）を用いて評定された。
マウスにおける単回投与毒性。１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスが、ＴＣＰ－２５ ５ｍｇ（１００μＬトリスバッファー中）を皮下に与えられ、２４時間後に殺処分された。組織（肺、腎臓、肝臓、皮膚および脾臓）が、組織検査のために採取され、Ｈ＆Ｅで染色された。
組織学的検査。マウス組織のために、感染エリアから回収された皮膚試料（生検パンチを使用することにより４ｍｍまたは６ｍｍ）が、濾紙に置かれて巻き上がりを予防し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定され：それらはその後、７０％エタノール中に貯蔵された。ミニブタの創傷では、組織試料が、外科用メスを用いて回収され、中性に緩衝されたホルマリン中で一晩固定され、その後、７０％エタノール中に貯蔵された。系列的脱水の後、組織が、パラフィンブロックに包埋され、切り出され、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色された。試料が、明視野顕微鏡測定（Ａｘｉｏｐｌａｎ２、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて撮像された。ミニブタ創傷生検のＨ＆Ｅ染色切片が、経験のある病理学獣医（Ｍ．Ｐ．）により盲検的手法で検査およびスコア付けされた。組織学的スコア付けは、０～５のスケール（０は、より悪化したスコア、５は最良スコア）で、上皮化、肉芽形成組織、炎症細胞、膿瘍、および組織形成に基づいた。各創傷区分では、９０～１００％の創傷を覆った５つのエリアが、１０倍対物レンズの下で検査された。
結果
異なる配合剤成分の存在下でのペプチドの効果および構造の評価
ＴＣＰ－２５の作用は、ＬＰＳ結合時のＣ形ターンおよびヘリックス構造の形成などの構造転移を含み、細菌膜とＣＤ１４相互作用の両方の能力にある程度依存する。本発明のゲル配合剤は、これらのＴＣＰ－２５の機能を支援する。抗菌活性が、ＴＣＰ－２５単独について（図１Ｅ参照）、またはヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、もしくはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７（本明細書では以後、Ｐｌｕｒｏｎｉｃと呼ぶ）の存在下で決定された。放射状拡散アッセイ（ＲＤＡ）は、静菌／殺菌効果を測定する、寒天拡散に基づく方法である。グラム陰性大腸菌および緑膿菌、ならびにグラム陽性黄色ブドウ球菌に対するＲＤＡを利用して、グラム陰性菌大腸菌および緑膿菌に対して大部分が保持されたＴＣＰ－２５活性を実証できた。しかし、ＣＭＣの添加は、黄色ブドウ球菌のペプチド活性に対するＴＣＰ－２５活性を阻害した（図１Ａ）。溶液中の殺菌効果を測定する生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）を利用する分析は、陰イオン性ＣＭＣポリマーとミセル形成Ｐｌｕｒｏｒｎｉｃの両方がＴＣＰ－２５の抗菌作用と干渉し、一方でペプチドの抗菌活性はＨＰＣ中で保持されることを、実証した（図１Ｂ）。臨床的なおよび規制についての考慮事項もまた、関連の中性ポリマーであるヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）との比較を促し、結果は、ＨＰＣで得られた結果と類似していた（図１Ｅおよび１Ｆ）。
ＴＣＰ－２５のエンドトキシン遮断効果は、ＬＰＳと細胞の両方との特異的相互作用に関係するため、これらの抗炎症活性のための構造的な前提条件は特異的配合剤中の抗菌作用に必要な前提条件と別であり得ることが、考えられる。ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ（商標）－ＣＤ１４細胞をインビトロで用いる異なる配合剤成分の存在下でのＴＣＰ－２５の抗エンドトキシン活性が、決定された。細胞が、ＨＰＣ、ＣＭＣ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃの存在下でまたは不在下で大腸菌ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）とおよびＴＣＰ－２５とインキュベートされた。１８～２４時間のインキュベーションの後、ＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１の活性化が、評定された。結果は、特にＣＭＣ、およびより少ない程度にＰｌｕｒｏｎｉｃが、ＴＣＰ－２５抗エンドトキシン作用と干渉することを示した。しかしＨＰＣは、ＴＣＰ－２５へのいかなる阻害効果も発揮しなかった（図１Ｃ）。上記の通り、関係するポリマーのヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）との比較は、ＨＰＣで得られた結果と類似した結果を生じた（図１Ｇ）。配合剤成分単独、およびＴＣＰ－２５との組み合わせの毒性効果の同時分析が実施され、結果は、配合の組み合わせが、ＭＴＴアッセイを利用して評定されるように、細胞生存能に影響を及ぼさないことを示した（図１Ｄ、図１Ｈ）。
ゲル配合剤成分の存在下でのＬＰＳ結合時のＴＣＰ－２５の構造的特色および考えられる構造転移が、円偏光二色性分光法（ＣＤ）分析を利用して分析された。全体として、結果は、中性ＨＰＣ／ＨＥＣと対照的に、負電荷ＣＭＣがＴＣＰ－２５において、α－ヘリックス含量の増加と矛盾のない強い構造変化を誘導することを示した（図２ＡおよびＢ）。ＴＣＰ－２５のα－ヘリックス含量は、トリスバッファー、ＬＰＳ、およびポリマー（１：５の比で）の存在下で２２２ｎｍでのモルエリプソメトリーから計算された。ＬＰＳの存在下では、ＴＣＰ－２５は、ＨＥＣゲル配合剤中のα－ヘリックス含量の有意な（Ｐ≦０．０５）増加を示し（図２Ｂ）、それはバッファー中のＬＰＳのみにより誘導された配座転移と類似していた。総括すると、これらの構造試験は、機能的試験と良好に一致し、ＴＣＰ－２５作用が中性ポリマーを含む配合剤により容易になること、したがってペプチドのＬＰＳと細胞の相互作用を可能にすることを実証する。図２Ｃは、試験されたゲル成分の存在下でのＴＣＰ－２５ペプチドとＬＰＳの相互作用の略図を表す。
上記データに基づき、１．５％ＨＥＣ、１．３％グリセロール（等張性のため）、および１０ｍＭトリスｐＨ７．４からなるゲル基剤が、さらなる試験に用いられた。黄色ブドウ球菌および緑膿菌を用いる最初の用量反応試験は、ＨＥＣゲル中の０．０１～０．０５％ＴＣＰ－２５の用量（０．０３～０．１５ｍＭ μＭ ＴＣＰ－２５に対応する０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ）が抗菌効果を呈することがを示した（図２Ｃ）。ＨＥＣゲル中の０．１％ＴＣＰ－２５（０．３ｍＭ）の用量が、さらなる試験のために選択された（本明細書では「ＴＣＰ－２５ゲル＃１」と表される）。バイオルミネッセンス性細菌に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル＃１の抗菌効果が、上記の通り定量され、結果は、図３Ａに示されるルミノメトリーの利用により得られた。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、わずか１分のインキュベーション後に緑膿菌ＰＡＯ１および黄色ブドウ球菌のバイオルミネッセンスの急速な低減を生じた。抗菌効果は、膜完全性の損失を検出するヨウ化プロピジウム（赤色）を利用するＬｉｖｅ－Ｄｅａｄアッセイ（ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｋｉｔ Ｌ７０１２）の利用により実証された通り、細菌透過により媒介された。ＶＣＡを利用して、黄色ブドウ球菌および緑膿菌ＰＡＯ１に及ぼすＴＣＰ－２５ゲル＃１の殺菌効果がさらに実証され、この２種の細菌について３ｌｏｇを超える低減を生じた（図３Ｂ）。一連の細菌創傷単離物に及ぼすＴＣＰ－２５ゲルの効果が、分析された。ＴＣＰ－２５ゲル＃１は、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の全ての臨床由来単離物、ならびに追加的創傷単離物および参照株の３ｌｏｇを超える低減を生じた。この結果は、ＣＳＬＡに従う標準の最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイでＴＣＰ－２５を用いてさらに裏づけられており、以下の表１Ａを参照されたい：
Figure 2023507201000001
ペプチドは、以下の表１Ｂに定義された一連の多剤耐性単離物に対しても活性であった。
Figure 2023507201000002
Figure 2023507201000003
全ての例のＭＩＣ値は、０．１％（０．３ｍＭ）を含む、ＴＣＰ－２５ゲル＃１中のＴＣＰ－２５用量未満であることが、留意されなければならない。総括すると、これらの結果は、ＴＣＰ－２５が、ＨＰＣおよびＨＥＣなどの中性ポリマー中で抗菌活性を保持し、複数のグラム陰性およびグラム陽性菌単離物に対し活性であること、ならびに配合されたＴＣＰ－２５ゲル＃１が、細菌透過により介在される急速な殺傷効果を発揮すること、を実証する。
実験的マウスモデルにおける細菌およびエンドトキシン応答に及ぼすＴＣＰ－２５ゲルの効果
細菌の外科的汚染の状況を模擬する２種の異なる動物モデルが用いられ、両者とも、手術および創傷形成に関連する状況を模倣した。直接かつ即座の汚染を模倣する、最初のモデルであるＴＣＰ－２５ゲル＃１は、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌および緑膿菌（１０６コロニー形成単位、ＣＦＵ／動物）を接種され、直ちにＳＫＨ１マウスに皮下注射された。結果は、ＴＣＰ－２５ゲル＃１が、６時間後（図４Ａ）および２４時間後（図４Ｅ）のＣＦＵの分析と合わせ、インビボバイオイメージングにより評定されるように、細菌を低減したことを示した。６時間後のバイオルミネッセンスの初期低減と比較した場合、おそらく単回投与レジメンによる細菌再増殖のため、より高いシグナルが２４時間後に記録された。しかしＣＦＵの低減は、２４時間後の２種の細菌では＞２ｌｏｇであった（図４Ｅ）。ＴＣＰ－２５の組織分布を視覚化するために、ＴＣＰ－２５ゲル＃１は１％Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされ、ペプチドが、試験された期間の間にゲル投与部位に局在化すると観察された（図４Ａ）。細菌分析に対応する感染組織エリアの組織学的分析は、ＴＣＰ－２５ゲル＃１で処置された動物における炎症応答の排除を示した（図４Ｂ）。第二の予防モデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃１は最初に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射された。３０分後に、バイオルミネッセンス性黄色ブドウ球菌および緑膿菌（１０６ＣＦＵ／動物）が、ゲル沈着の部位に注射された。上記の通り、結果は、インビボバイオイメージングによる評定で細菌の低減を示した。
対照ゲルまたはＴＣＰ－２５ゲル＃１が、ＬＰＳを同時に添加して皮下注射された。ＮＦ－ｋＢ活性化を報告したマウスを用いて、ＬＰＳが、配合剤に添加されると局所炎症応答を生じ、それがＴＣＰ－２５を含有するゲルにより排除されることが、見出された（図４Ｃ）。上記の通り、Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲルが用いられ、ペプチドは、試験された期間の間にゲル投与部位に局在化することが観察された（図４Ｃ）。別の実験において、局所創傷浸出液を採取するために皮下に移植された６ｍｍポリウレタン円盤を有するＢＡＬＢ／ｃマウスが、用いられた。このモデルは、外科的インプラントモデルに類似しており、ＬＰＳの適用は、インターロイキン（ＩＬ）－６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－□の増加を生じ、それはＴＣＰ－２５ゲル＃１の添加時に低減された（図４Ｄ）。この結果は、バイオイメージング試験の結果と同等である（図４Ｃ）。総括すると、結果は、ＴＣＰ－２５ゲル＃１が、感染およびエンドトキシン駆動性炎症の皮下モデルにおいてインビボで有意な二重抗感染および抗炎症機能を有することを実証した。
ブタ部分層創傷モデルにおけるＴＣＰ－２５ゲルの効果
ゲッチンゲン系ミニブタにおける部分層創傷モデル（試験の概要は図５Ａに表される）が、用いられた。このモデルは、ヒト創傷形成の状況に変換可能である。外傷および細菌汚染（ここでは汚染創傷モデルと表される）に関して処置が施された臨床状況を模倣する、最初の４日試験では、創傷は黄色ブドウ球菌を接種された後、３０分のインキュベーション時間の後、対照またはＴＣＰ－２５ゲル＃２を塗布され、続いて１日１回ドレッシング交換時にゲル処置された。４日目に、非処置の対照創傷は、炎症および感染の可視的徴候を示した（図５Ｂ）。ＴＣＰ－２５ゲル＃２処置は、感染を排除し、改善された臨床スコアをもたらし（図５Ｂ、Ｃ）、細菌カウントを低減し（図５Ｄ）、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを低下させ（図５Ｅ）、組織レベルでの炎症徴候を低減した（図５Ｆ）。２つの別の実験で、動物２匹が、２日目に重感染を発症し、それが混合感染をもたらした。これらの動物からの創傷データは、ここでは別に表される。単離および同定により、重感染を担う細菌が、緑膿菌であることが見出された。ＴＣＰ－２５ゲル＃２は、この二次的な混合感染も予防した（図５Ｂ～Ｅ）。これらの２種の緑膿菌単離物は、ＲＤＡにおいてＴＣＰ－２５への感受性を示し、ペプチドは、ＴＨＰ－１細胞に及ぼす細菌上清の炎症促進効果を排除した。緑膿菌での自然な重感染を再現するために、細菌汚染モデルが、黄色ブドウ球菌に続く、上記の混合感染から採取された１つの緑膿菌株での同じ創傷への接種を利用して、再度行われた。上記の通り、ＴＣＰ－２５ゲル＃３処置は、感染の発症を予防し、改善された臨床スコアをもたらし、細菌数を低減し、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βを低下させた。これらの実験に続いて、創傷に黄色ブドウ球菌が上記の通り接種された後、３日間およびその後の１日おきの１日１回処置が行われる、１０日試験を行った。この場合もまた、ＴＣＰ－２５ゲル＃２処置が、黄色ブドウ球菌感染を予防し、創傷状況を改善した（図５Ｇ）。組織学的分析は、ペプチド処置創傷が、完全に再上皮化されたことを示し、それは、感染された非処置創傷では観察されなかった（図５Ｇ）。最後に、非感染創傷の正常な治癒に及ぼす効果を評価するために、ＴＣＰ－２５ゲル＃２が、別の実験で部分層創傷に１０日間同様に塗布された。対照ゲルおよびＴＣＰ－２５ゲル処置創傷は両者とも、正常な創傷治癒を示し、組織毒性の徴候はなかった（図５Ｈ）。
インビトロおよびインビボでのＴＣＰ－２５ゲルの薬物動態
インビトロおよびインビボモデルでのゲル配合剤中のＴＣＰ－２５の薬物動態。インビトロでは、ゲルからバッファー溶液へのＴＡＭＲＡ標識ＴＣＰ－２５の拡散速度が、分析された（図１０Ａ）。分析では、０．１％ＴＡＭＲＡ－ＴＣＰ－２５、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１．３％グリセロール、および１．５％ＨＥＣを含むＴＣＰ－２５ゲルが、用いられた。用いた２区分の系では、ペプチドは、蛍光の読み取りにより決定されるように、ゲル相から徐々に溶出され、初期バーストは観察されなかった。ペプチドは、２時間後のバッファー区分で検出され、ペプチド量の約半量が、６時間後にハイドロゲルから放出され、データはＣＤにより検出された弱いペプチド－ポリマー相互作用と互換性があった（図２）。
ＴＣＰ－２５の分布をインビボで評定するために、ＴＣＰ－２５ゲル＃１（Ｃｙ５標識ＴＣＰ－２５をスパイク）は、ＳＫＨ１マウスの背中に皮下沈着された。縦断的ＩＶＩＳバイオイメージングが、ゲルから周辺組織中へのペプチドの核酸を追跡するために用いられ、この結果は、ＴＣＰ－２５の大部分が注射部位に保持されることを示した（図１０Ｂ）。したがって結果は、インビトロモデルで観察された緩やかな拡散と互換性があった（図１０Ａ）。ＬＰＳの存在は、このインビボモデルにおいてＴＣＰ－２５の分布に影響を及ぼさなかった（図１０Ｂ、下の並び）。皮膚および創傷を介する考えられるペプチド取り込みを評定するために、上記のようにＣｙ５標識ＴＣＰ－２５でスパイクされたＴＣＰ－２５ゲル＃２、＃３および＃４が、エクスビボおよびインビボでブタの無傷の皮膚または創傷のどちらかに塗布された（図１０Ｃ、Ｄ）。総ペプチド濃度は、インビボで０．１％（ＴＣＰ－２５ゲル＃２）で保持されただけでなく、１％（ＴＣＰ－２５ゲル＃３）に増加され（図１０Ｃ）、エクスビボで２％に増加された（ＴＣＰ－２５ゲル＃４）（図１０Ｄ）。蛍光ペプチドは、塗布部位で局所的に残留し、皮膚または創傷を介する下部組織への可視的取り込みは、観察されなかった。外用薬処置後のＴＣＰ－２５の考えられる全身取り込みを評定するために、部分層創傷モデルからの血漿が、質量分析を利用して分析された（図１０Ｅ）。ＴＣＰ－２５ペプチドは、部分層創傷へのＴＣＰ－２５ゲル＃２の２４時間塗布の後にブタ血漿で検出されなかった。しかし、インタクトＴＣＰ－２５は、２４時間処置期間後の感染および非感染創傷から得られたドレッシングからの創傷液中で検出された。
インビトロでの好中球エラスターゼによるＴＣＰ－２５の分解、ならびにインビトロおよびインビボで作製されたタンパク質分解性ＴＣＰ断片との比較
複数のＴＣＰが、創傷治癒および炎症の間に活性である支配的酵素である、主要なプロテアーゼのヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）によるインビトロでのトロンビンのタンパク質分解性消化により作製された。対応するＣ－末端ペプチド配列が、急性および非治癒性潰瘍からの創傷液中で同定され、これらの中に、ＴＣＰ断片ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥおよびＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２および４があった。それがＨＮＥに供された後のＴＣＰ－２５の消化パターンが、決定された。酵素消化が、異なる期間実施され。断片化がＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより評価された。図６Ａは、異なる期間の消化の後に得られた主要ペプチドを示す。同定された全てのＴＣＰ－２５断片が、図６Ｂにおいてグラフ表示され、ＴＣＰ断片が、ＨＮＥでのトロンビン消化後に見出された断片と比較された。インビボの創傷中で検出されたＴＣＰもまた、図６Ｂに示される。結果は、創傷液中でおよびＨＮＥでのトロンビンの消化後に検出された複数のペプチドが、ＴＣＰ－２５のＨＮＥ消化後に同定されたものと構造的に重複することを示す（図６Ｂ）。例えば、ペプチドＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＨＶＦ１８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；４）は、主要な断片ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＧＫＹ２０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）と同じく、ＨＮＥによるＴＣＰ－２５のタンパク質分解後に検出された（図６Ａ）。消化パターンもまた、バッファー中でおよびＨＥＣ配合剤中で類似していた（図６Ｃ）。作製されたペプチド断片は、ＲＤＡ中で最大６時間の消化期間の間抗菌活性を保持したが、より長い消化時間は、特にＲＤＡが生理学的塩条件で実施された場合に、ペプチド活性の低減をもたらした（０．１５Ｍ ＮａＣＩ）（図６Ｄ）。要約すると、結果は、ＴＣＰ－２５のＨＮＥ分解が複数の生物活性ＴＣＰ断片の作製をもたらし、そのうちの複数がヒトトロンビンから作製された同一のペプチドと重複し、インビボでのヒト創傷にも存在したことを示した。
インビトロでのＴＣＰ－２５の安定性
ＨＮＥに供された場合のＴＣＰ－２５の急速な分解と対照的に、ＴＣＰ－２５は、バッファー中またはＨＥＣ配合剤（ＴＣＰ－２５ゲル＃１）中のいずれかで４℃または２０℃で長期間貯蔵された場合変化を示さなかった。ＭＡＬＤＩ質量分析を利用する質量分析は、これらの温度で最大１８０日間、分解または酸化／脱アミノ化の誘導を見出さなかった。しかし、３７℃で１８０日間の貯蔵は、質量変化をもたらした。活性アッセイは、質量分析と良好に一致し、ペプチドの抗菌効果および免疫調整効果が最大１８０日間の貯蔵後に保持されることを示した。血漿中のそれらの半減期は、おそらくエンドプロテイナーゼまたは安定性に影響を及ぼす他の因子の差のせいで、血漿採取に用いられた種に依存するということが、他のペプチドについて過去に示されている。このためＴＣＰ－２５の安定性が、質量分析を利用してヒト、ブタ、およびマウス血漿中で試験された。３７℃でインキュベートされた場合のＴＣＰ－２５は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびマウス血漿中でインキュベートされた場合安定であった。ヒトおよびミニブタ血漿中では、半減期はそれぞれ、８．１および２．５時間と計算された。
ＴＣＰ－２５ハイドロゲルと臨床で用いられる創傷処置との比較、および確立された感染に対する効果
様々な銀製ドレッシングおよびＰＨＭＢを含有する製品は、熱傷もしくは外科的創傷での感染を予防するために、または慢性下肢潰瘍の処置として、一般的に用いられる、したがって次の試験では、汚染された創傷モデルのための過去の処置計画を利用して、ＴＣＰ－２５ゲル＃３が、それぞれ銀およびＰＨＭＢを含有する一般的な創傷処置Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎゲルと比較された。したがって創傷は、黄色ブドウ球菌を接種され、その後、３つの創傷処置のいずれかで処置された。０．１％ＴＣＰ－２５ゲル（ＴＣＰ－２５ゲル＃２）について過去に実証された通り、この試験で用いられたＴＣＰ－２５ゲル（ＴＣＰ－２５ゲル＃３）もまた、臨床スコア付け（図７Ｃ）および組織学的分析（図７Ｄ）により評定された通り、黄色ブドウ球菌感染を予防し（図７ＡおよびＢ）、この４日間汚染創傷モデルでの何らかの観察された負の効果はなかった。しかし本発明者らは、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇが、臨床状況および創傷細菌数が感染された対照のものと類似していたため、黄色ブドウ球菌感染を予防することにおいて効果的でないことを観察した（図７Ａ～Ｄ）。Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇドレッシング抽出物中の細菌低減が観察されたが、この変化は、統計学的に有意でなかった（Ｐ＞０．０５）（図Ｓ１１Ａ）。対照的に、ＴＣＰ－２５ゲル＃３は、ドレッシング抽出物中の細菌数を低減できた（＞５ｌｏｇ）。この観察と一致して、インビトロで、本発明者らは、Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇドレッシングが、バッファー条件で黄色ブドウ球菌に対する抗菌効果を示しながら、血漿および創傷液の存在下で効果的でないことを見出した。主に抗菌効果を評価することを目標とした、この感染モデルでは、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎ処置は、臨床創傷スコア付け、細菌感染の低減、およびＴＮＦ－αに関してＴＣＰ－２５ゲル＃３と類似の結果を生じた（図７Ａ～Ｄおよび図７Ｌ）。最後に、確立された感染のモデルでＴＣＰ－２５の効果を評価するために、創傷は、黄色ブドウ球菌を接種され、その後、２４時間で感染が確立され、次に１％ＴＣＰ－２５ゲル（ＴＣＰ－２５ゲル＃３）またはＰｒｏｎｔｏｓａｎで処置された（図７Ｅ）。Ｍｅｐｉｌｅｘ Ａｇは、上記の汚染創傷モデルにおいて無効であることが見出されたため、除外された。２日目の処置の開始前に、全ての創傷は、臨床的に可視の感染徴候および類似の細菌数を示した（図７ＦおよびＧ）。処置は、２連続日の間、１日１回適用され、その後、１０日目まで１日ごとに適用された。結果は、ＴＣＰ－２５ゲル＃３処置が実際に、細菌数による評定で黄色ブドウ球菌および関連の炎症を低減し（図７Ｇ）、サイトカインＴＮＦ－α（図７Ｈ）およびＩＬ－１β（図７Ｍ）の濃度を低下することを示した。注目すべきことに、サイトカイン濃度の低減は、ＴＣＰ－２５ゲル＃３処置創傷中で観察された抗菌効果に先行した（図７Ｈおよび図７Ｍ）。したがって３日目（ＴＣＰ－２５ゲル＃３での処置の２４時間後）に得られた結果は、対照のものと類似の創傷中の細菌数にもかかわらず、ＴＮＦ－α（図７Ｈ）およびＩＬ－１β（図７Ｍ）の低減を示す。本発明者らは、５日目にＰｒｏｎｔｏｓａｎによる細菌数への初期効果を観察したが、それは総合的には、確立された感染モデルにおいては黄色ブドウ球菌および炎症の低減に効果的でなかった（図７Ｆ～Ｈおよび図７Ｍ）。総括すると、これらの結果は、ＴＣＰ－２５ゲル＃３が汚染および感染された創傷のモデルにおいて黄色ブドウ球菌を標的とすることにおいて効果的であること、ならびに処置が細菌の存在と独立してサイトカインを低減する能力を有することを実証する。
上記のブタ創傷モデルは、ＴＣＰ－２５が細菌および炎症を標的とし得ることを示したが、本発明者らは別に、ＴＣＰ－２５ゲルのコンセプトの後者の態様をさらに評価したかった。皮下感染のマウスモデルにおいて、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎゲルは、黄色ブドウ球菌および緑膿菌を低減することにおいてＴＣＰ－２５ゲル３＃と等しく効果的であり（図７Ｉ）、それは、黄色ブドウ球菌汚染創傷モデルにおける両者の処置の観察された予防効果と一致した（図７ＡおよびＢ）。考えられる抗エンドトキシン効果を具体的に評定するために、本発明者らは次に、マウスの背中の各側へのＰｒｏｎｔｏｓａｎゲルまたは０．１％ＴＣＰ－２５ゲル（ＴＣＰ－２５ゲル＃２）のいずれかの付加と共に、ＬＰＳを皮下注射した。このモデルにおいて、ＴＣＰ－２５ゲル＃２は、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎゲルと比較して、有意な（Ｐ＜０．０１）抗炎症活性を呈した（図７Ｊ）。これらのインビボデータと一致して、インビトロ実験は、ＴＣＰ－２５がＰＨＭＢに比較してより高いＬＰＳクエンチング効果を発揮することを示した（図７Ｋ）。最後に、単回投与の毒性試験が実施された。マウスは、ＴＣＰ－２５ ５ｍｇを皮下注射され、臓器が、２４時間後に採取された。肺、腎臓、肝臓、脾臓および皮膚の組織学的検査は、任意の毒性徴候を示さなかった。
ＴＣＰ－２５は創傷中の炎症を標的とする
ＴＣＰ－２５ゲルでの処置はまた、一般に創傷感染に関係するＴＬＲ介在性炎症を標的とし得る。最初の実験は、先に記載された混合感染創傷に由来する創傷液（図５Ｄ）がＴＨＰ－１細胞モデル系においてＮＦ－ｋＢ活性化を誘導することを実証したが、そのような誘導は、ＴＣＰ－２５ゲル処置の創傷または非感染創傷のどちらについても観察されなかった（図８Ａ）。この実験では、０．１％ＴＣＰ－２５、２％ＨＥＣ、１．３％グリセロールおよびｐＨ７．４の１０ｍＭトリスＨＣＩを含むＴＣＰ－２５ゲル＃５が、用いられた。しかし、ＮＦ－ｋＢ誘導のこの非存在は処置の抗感染効果に起因し得るため、本発明者らは次に、ＴＣＰ－２５を、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の両方で感染された動物由来の創傷液に添加した。この場合、ＴＣＰ－２５は、創傷液が誘導した炎症を低減した（図８Ｂ）。非治癒性静脈潰瘍を有する患者は一般に、黄色ブドウ球菌および緑膿菌によりコロニー形成または感染される。これらの細菌に感染された創傷を有する患者５名に由来する創傷液が、選択され、ＴＨＰ－１細胞を様々な度合いに活性化することを見出した（図８Ｃ）。この複合的環境では、ＴＣＰ－２５の添加は、先に注記された通りＮＦ－ｋＢ活性化を低減した（図８Ｂ）。総括すると、結果は、ＴＣＰ－２５はまた、エンドトキシンならびに他のＴＬＲアゴニストおよびサイトカインを含有する複合的創傷環境において炎症を減弱する能力も有することを示す。
流動学
ＴＣＰ－２５ゲルの流動学的特性が、測定された。０．１または１％ＴＣＰ－２５（ＴＣＰ－２５ゲル＃２およびＴＣＰ－２５ゲル＃３）を有しない（対照）または有する２％ＨＥＣゲルのゲル強度が、プレート／プレートの配置および１ｍｍのギャップを備えたＫｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，英国マルバーン）で分析された。０．００１～１０の歪の剪断歪が適用され、線形粘弾性領域（ＬＶＲ）、貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ’’）が、周波数１Ｈｚおよび２５℃で決定された。結果が、図９に示される。
流動点は、Ｇ’とＧ’’の間のクロスオーバーポイントでの剪断応力（Ｐａ）としてＫｉｎｅｘｕｓ Ｐｒｏレオメータを用いて決定された。以下の結果が得られた：
Figure 2023507201000004
考察
感染性疾患は、各年の世界全体の死亡例の数百万例を占める。創傷および手術のエリアでは、感染した熱傷創および術後感染が、著しい罹患率を引き起こし、敗血症などの致命的な全身合併症のリスクと関連する。耐性発症による抗生物質および他の抗微生物薬の有効性減少は、深刻化する問題である。我々は、特定の感染について治療薬がもはや利用できないところまで来ている。それゆえ、治癒を改善して様々な型の創傷中の感染および炎症を低減する、新しい処置に対する重要で満たされていない要件がある。全身抗生物質または局所消毒剤のみを用いる現行の治療は、細菌を標的とするのみであり、関連の炎症への何らかの効果を有しない。反対に、創傷中の過剰な炎症応答を低減する治療薬は主に、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）または局所で生成されたサイトカインを標的とし、後者は現在、前臨床試験の段階である。本発明は、細菌および放出される炎症促進生成物を標的とするペプチドを組み込むハイドロゲルを基にした別のアプローチを実証する。図８Ｄに示される通り、そのような「二重作用」のゲルは、消毒機能を有し、エンドトキシンなどの細菌生成物を遮断することにより炎症促進性応答を標的とする。ＮＦ－ｋＢの上流で作用するＴＣＰ－２５は、ＮＦ－ｋＢ介在性応答の下流にあるＭＭＰおよびサイトカインを標的とする過去の概念と大きく異なる。
本発明は、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルがインビトロおよびインビボで黄色ブドウ球菌および緑膿菌などの病原体を効果的に殺傷することを実証する。ブドウ球菌は、術後感染の根拠をなす主因であり、多剤耐性株の出現は、処置の可能性を困難にする。ＴＣＰ－２５の作用機序は既存の抗生物質と異なるため、ＴＣＰ－２５のインビトロでのＭＲＳＡを標的とする能力は、それが耐性ブドウ球菌への感染のリスクを低減し得るため、興味深い。ＴＣＰ－２５のＭＩＣ分析は、このペプチドが、臨床開発中のＬＬ－３７およびオミガナンなどの他の抗菌性ペプチドと同等の活性を有することを示した。同様に、ここで示される通り、ＴＣＰ－２５はまた、ゲルに配合された場合インビトロで一連の緑膿菌および黄色ブドウ球菌単離物を殺傷した。急性創傷形成および細菌汚染の状況を模倣するマウスモデルを用いたインビボバイオイメージング試験のデータは、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが、インビボでも黄色ブドウ球菌および緑膿菌感染を予防する能力を有することを実証する。特に重要なことは、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが実験的マウスモデルにおいて皮下注射されたエンドトキシンへの局所応答も低減するという知見であった。
ブタ創傷治癒試験は、ヒト創傷治癒状況への良好な変換を有すると見なされる。汚染創傷の短期部分層モデルにおいて、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルは、創傷の黄色ブドウ球菌接種後の感染予防に効率的であった。２つの別の実験では、動物が、２日目に緑膿菌での重感染を獲得し、ＴＣＰ－２５ゲル処置が、そのような混合感染を予防した。注目すべきことに、緑膿菌株の単離および特徴づけの後、これは、黄色ブドウ球菌接種の２４時間後にそのような緑膿菌で創傷を汚染することにより上手く再現された。
これらの上記実験では、サイトカイン濃度の低減が、ＴＣＰ－２５ゲル処置後に定期的に観察された。感染された部分層創傷に由来する創傷浸出液の炎症促進効果が、外部から添加されたＴＣＰ－２５によっても遮断され得るという観察は、ペプチドがインビボでの創傷形成の間に細菌誘導性炎症を低減する能力を有することを示している。実際に、これらの知見は、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルが実験的マウスモデルにおいてエンドトキシン誘導性組織炎症を低減することを実証する初期の実験と一致する。重要なことに、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルは、確立された黄色ブドウ球菌感染のモデルにおいても効果的であった。このモデルにおいて、サイトカイン濃度は、細菌数が影響を受ける前に低減され、インビボでのＴＣＰ－２５ハイドロゲルの抗炎症作用についてさらなる裏づけを加えた。
これらの観察の全ては、臨床に関連する。なぜなら糖尿病および動脈または静脈不全などの様々な病因の非治癒性潰瘍を有する大きな患者群は、阻害された創傷治癒工程を有するためである。後者の群は、最大であり、特に、高レベルの炎症促進性因子、プロテアーゼ、および細菌を有する慢性的で機能不全の炎症を特徴とする。ＴＣＰ－２５が黄色ブドウ球菌および緑膿菌に感染された非治癒性静脈潰瘍を有する患者に由来する創傷液への炎症促進性単球応答も低減するという観察はそれゆえ、それが、ペプチドが様々なＴＬＲアゴニストの混合物を含有する創傷中の過剰な炎症を標的とする能力を有することを示すため、臨床的観点に大いに関連する。この観察は、ＴＣＰ－２５がエンドトキシン、ならびにリポタイコ酸、ペプチドグリカンおよびＣｐＧ ＤＮＡなどの他のＴＬＲアゴニストを標的とするという観察と一致する。
本発明の「二重作用」ゲルのコンセプトの臨床的および変換的能力をさらに示すために、ＴＣＰ－２５ハイドロゲルの有効性が、２種の一般に用いられる創傷処置Ｍｅｐｉｌｅｘ ＡｇおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎ創傷ゲルと比較された。両方の処置に意図される使用は、熱傷および非治癒性潰瘍などの創傷を処置することである。銀含有のドレッシングは、黄色ブドウ球菌感染を予防せず、それは、様々な創傷適応症における消毒剤としての銀の広範囲の使用を考慮すると意外であった。しかし、その長い歴史および一般的な用途にもかかわらず、銀含有のドレッシングまたはクリームが創傷治癒を改善すること、または感染を予防することを実証する臨床的エビデンスはほとんどない。ＴＣＰ－２５ハイドロゲルおよびＰｒｏｎｔｏｓａｎの両方は、皮下細菌感染のマウスモデルおよびブタ部分層黄色ブドウ球菌汚染創傷モデルにおいて抗菌性であった。興味深いことに、汚染された創傷モデルと対照的に、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎは総合的に、確立された黄色ブドウ球菌感染のモデルにおいて細菌感染またはサイトカインのどちらも低減しなかった。注目すべきは、この観察が実際に外科的創傷での近年の知見に対応することであり、Ｐｒｏｎｔｏｓａｎ溶液に浸漬されたドレッシングが細菌数および感染を低減するのに効果的でなかったことを実証する。最後に、ＮＦ－ｋＢレポータマウスモデルを利用した試験は、エンドトキシンスカベンジング効果がＴＣＰ－２５ハイドロゲルに特有であることを実証し、ＰＨＭＢとＴＣＰ－２５の間の機能的差をさらに示した。
過去の試験は、ＴＣＰ－２５およびその生物活性エピトープの構造的機能の関連性に取り組んだ。例えばＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、インビボで創傷液中に存在する。ＴＣＰ－２５の抗菌性およびＬＰＳ結合エピトープもまた、ＴＣＰ－２５の最初の２０のアミノ酸を含有する、ＧＫＹ２０（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）の中に存在する。ＴＣＰ－２５と同様に、これらのペプチドの両方は、二重の抗菌および抗炎症効果を発揮することが示され、それらはまた、エンドトキシンショックのマウスモデルにおいても罹患率を低減する。スクリーニングを基にしたアプローチを利用して、ＧＫＹ２０は、改善された治療指数を示すことが見出された。なぜならこのペプチドは、ヒト血液中で低い溶血性を示しながら抗感染能を保持しためである。ＨＶＦ１８などの断片およびＴＣＰ－２５の関連のトランケーションがインビボで創傷液中に存在するという知見は、複数の生物活性ペプチド断片が同時に存在する冗長性の概念を示している。複数の一過性の生物学的相互作用（Ｋｄ＞μＭ）が生物系で頻繁に起こることが、ますます認識されている。多数の相互作用およびμＭ範囲内の親和性を有する「一過性の薬物」であるＴＣＰファミリーと多くの特徴を共有することはそれゆえ、感染への宿主応答をモジュレートするそのような内在的な生物系の的確な例を表している。
それゆえ医学的観点から、インビボで創傷中に存在するものと類似のＴＣＰ断片が、合成で生成されたＴＣＰ－２５から作製され得るかどうかを探索することは、興味深いことであった。ＴＣＰ－２５は、正常な創傷治癒の間に活性である主要な酵素ＨＮＥにより切断され、注目すべきことに、ＨＶＦ１８が、主要な生物活性ペプチド代謝産物として同定された。他の主要断片の１つが、過去に記載されたＧＫＹ２０ペプチドと同一であったことも、興味深い（図７）。質量分析もまた、インビボでの創傷中の過去に記載された一連の他のトランケート型ＴＣＰ－２５由来断片を同定し、そのうち複数は、インビトロで抗菌および抗エンドトキシン効果の両方を保持することが示された。加えてＲＤＡアッセイは、切断されたＴＣＰ－２５が抗菌活性を保持することを実証し、活性の低減は、生理学的塩条件の存在下で特に注目され、これは、より短いＴＣＰ断片が低減された耐塩性を呈するという過去の観察と矛盾しない。しかし、データは、ＴＣＰ断片の活性が、最大で３～６時間の消化期間の後にも保持されることを示す。純粋なＴＣＰ－２５とハイドロゲル中のＴＣＰ－２５との分解プロファイルの比較は、類似のペプチド断片を同定し、配合剤ポリマーが得られた分解パターンと干渉しないことを示した。したがってこれらのデータは、タンパク質分解時に、ＴＣＰ－２５がインビボで一過性の相互作用および「二重作用」の機能性を保持する複数の生物活性断片を放出するであろうことを実証し、過去に定義されたそれぞれＮ－およびＣ－末端トランケート型ＴＣＰ－２５変異体ＨＶＦ１８およびＧＫＹ２０などの生物活性ペプチドの前駆体としても作用し得る、活性薬物としてのＴＣＰ－２５の使用が動機づける。好中球エラスターゼによる急速かつ特異的な分解と対照的に、ＴＣＰ－２５は、バッファーおよびハイドロゲル配合剤の両方で室温で最長１８０日間、非常に安定しており、それは、治療的および臨床的使用への変換に関係する。したがってＴＣＰ－２５ゲルは、マウスモデルでの注射部位で、およびブタモデルでの創傷および皮膚表面で高度に保持され、ＴＣＰ－２５の全身吸収はなかった。
薬物送達の観点から、ＴＣＰ－２５の二重の機能を可能にする臨床的におよび医薬的に許容できる配合剤の選択は、些細なことではない。なぜならＴＣＰ－２５と、その断片ＨＶＦ１８、ＧＫＹ２０およびＦＹＴ２１は全て、重要な細菌と宿主細胞の相互作用を可能にする柔軟な立体配座を要求するからである。ＴＣＰ－２５に対する配合剤の影響を試験するために、本発明者らは、バイオアッセイおよびＣＤを用いる構造分析の両方の組み合わせを利用した。これらの分析は、中性ハイドロゲルはＴＣＰ－２５の作用を可能にし、一方で陰イオン性ＣＭＣおよびミセル形成Ｆ１２７は様々な度合いで阻害性であることを、示した。加えて、エンドトキシンスカベンジング能は、ＣＭＣによる阻害に特に感受性であった。この観察についての構造的手掛かりが、ＣＤを用いて得られ、それは、ペプチドが、特にＣＭＣの存在下で、ヘリックス構造誘導を含む規則正しい立体配座を呈することを示したが、一方でそれは、ＨＥＣの存在下では不規則であった。ＣＭＣの存在下で観察された立体配座の変化は、ＴＣＰ－２５と陰イオン性ポリマーの間の相互作用と一致する。バイオアッセイにより実証された通り、このポリマーによるペプチドスカベンジング効果は一方で、細菌およびＬＰＳへのＴＣＰ－２５の結合を低減する。類似の理由が、ポリオキシエチレンの親水性単位の間に疎水性ポリオキシプロピレン単位を有し、おそらく両親媒性ＴＣＰ－２５に結合する可能性がある、Ｐｌｕｒｏｎｉｃに当てはまり得る。したがって、これらの構造的および機能的分析に基づいて、ＴＣＰ－２５がＨＥＣ／ＨＰＣなどの非相互作用性の担体配合剤を要求し、標的細菌および宿主細胞とのペプチドの直接の相互作用を可能にすると結論づけられた。流動点の流動学測定は、ペプチドがゲルの特徴を修飾しないことを示す（図９Ａおよび表２）。これらの結果は、ペプチドがＨＥＣポリマーと有意に相互作用しないことを示す図２に表された結果と一致する。さらに、低歪ではＧ’＜Ｇ’’であるため、全ての配合剤は、ゲル様の特徴を示す（図９Ｂ）。
実施例２
実施例２では、最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）が、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、ｎ＝３または１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５、ｎ＝３のいずれかにおいてＥＤＴＡ（ｍＭ）と組み合わせてＴＣＰ－２５（μＭ）で処置された場合の黄色ブドウ球菌、緑膿菌および大腸菌について決定された。
ＭＩＣは、本質的には本明細書の先の実施例１に記載された通り決定された。ＭＢＣは、細菌を殺傷できるＴＣＰ－２５の最小濃度を示す。ＭＢＣは、ＭＢＣを細菌量の減少が観察された濃度ととらえたこと以外は本質的にＭＩＣと同じ手法で決定された。
Figure 2023507201000005
Figure 2023507201000006
表３および４に示される通り、ＥＤＴＡの添加は、ＴＣＰ－２５ペプチド単独に比較して有意に減少されたＭＩＣ値および有意に減少されたＭＢＣ値を提供した（ＥＤＴＡ＝０ｍＭ）。
実施例４
ＴＣＰ－２５の溶解度が、外観検査に基づいて決定された。０．１％ＴＣＰ－２５と、２．５ｍＭ ＥＤＴＡと、１．９％または２％のどちらかのグリセロールとを含む溶液が調製された。加えて、上記溶液はまた、トリス（ｐＨ７．４）または酢酸塩（ｐＨ５．０）のどちらかを含んだ。結果が、図１１に示される。
溶液の外観検査は、酢酸バッファー（１０ｍＭまたは２５ｍＭ）中の低いｐＨ（ｐＨ５．０）では、溶液は、トリス（１０ｍＭまたは２５ｍＭ）中の高いｐＨ（ｐＨ７．４）の溶液に比較して有意に濁りが低いことを示す。このことは、ｐＨ７．４に比較してｐＨ５．０でのＴＣＰ－２５の溶解度上昇を示す。
実施例５
バイオフィルムの形成は、抗菌処置の効果を妨げる可能性がある。それゆえ、バイオフィルムに対するトリスおよび酢酸塩を基にしたゲルの中のＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせの有効性が、評定された。
表５に示された成分を含むゲルは、本質的に実施例１に記載された通り調製された。
Figure 2023507201000007
ＴＣＰ－２５を有しない対照ゲルもまた、調製された。
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）５μｌが、増殖培地（０．５％ＴＳＢ＋０．２％グルコース）１００μｌを含む９６ウェル可撓性ビニルプレートにおいて３７℃で４８時間の期間、インキュベートされて、成熟したバイオフィルムを確立した。バイオフィルム成熟の後、プランクトン細胞が除去され、表４に記載されたゲルのそれぞれ１００μｌが、ウェルに添加され、３７℃で２時間インキュベートされた。インキュベーション後に、バイオフィルムが破裂され、細菌が播種され、ＣＦＵが決定された。結果は、図１２に示される。ＴＣＰ－２５は、バイオフィルムに対して若干の活性を有するが、ＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせは、バイオフィルムに対して非常に効果的である。
緑膿菌（ＰＡＯ１）（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）５μｌが、増殖培地（１×Ｍ６３）１００μｌを含む９６ウェル可撓性ビニルプレートにおいて３７℃で４８時間の期間、インキュベートされて、成熟したバイオフィルムを確立した。バイオフィルム成熟の後、プランクトン細胞が除去され、表４に記載されたゲルのそれぞれ１００μｌが、ウェルに添加され、２時間インキュベートされた。インキュベーション後に、ＣＦＵが上記の通り決定された。結果は、図１３に示される。
黄色ブドウ球菌（図１２）について、完全な阻害が、トリス（１０または２５ｍＭ）、ＥＤＴＡおよびＴＣＰ－２５の組み合わせが用いられた場合に実現された。同じ効果が、酢酸塩（１０または２５ｍＭ）、ＥＤＴＡおよびＴＣＰ－２５の組み合わせを用いることにより実現された。緑膿菌（図１３）については、同じようにトリス（１０または２５ｍＭ）、ＥＤＴＡおよびＴＣＰ－２５の組み合わせが用いられた場合に、完全な阻害が実現された。強い阻害効果は、酢酸塩（１０または２５ｍＭ）、ＥＤＴＡおよびＴＣＰ－２５の組み合わせでも認められた。
実施例６
様々なＴＣＰ－２５ゲルの抗菌効果が、ブタ皮膚エクスビボモデルでテストされた。表６に示された成分を含むＴＣＰゲルが、本質的に実施例１に記載された通り調製された。
Figure 2023507201000008
ブタの皮膚が、冷凍庫に保存された。使用前に、凍結された皮膚が解凍され、エタノール（７０％）および滅菌水で洗浄された。標準化されたサイズの創傷が、加熱装置を利用して皮膚上に作製された。ペトリ皿の上で、皮膚がＰＢＳ中に部分的に沈積されたままにされて水分を保持した。エクスビボでのブタ皮膚上の創傷が、細菌溶液（緑膿菌１０８ＣＦＵ／ｍｌ）３０μｌで感染され、処置剤の添加前に３７℃で２時間インキュベートされた。表６に記載されたＴＣＰ－２５ゲルのそれぞれ１００μｌが、創傷に塗布され、３７℃でさらに２時間インキュベートされた。熱傷創の表面または熱傷創組織中のＣＦＵが、決定された。感染されたが未処置のブタ皮膚が、対照として用いられた。
結果は、図１４に示される。０．１％ＴＣＰ－２５および２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むゲルが、細菌量を低減するのに最も効果的であった。
実施例７
ヒドロキシエチルセルロース、グリセロール、およびｐＨ７．４のトリスバッファーを基にした配合剤を用いる場合、ハイドロゲルの予想外の濁度が、特により高濃度（０．３ｍＭ）のペプチドを用いた場合に、観察された。この観察を背景として、観察された濁度の根底的メカニズムが検討された。ｐＨ７．４では、ペプチドがα－ヘリックス構造の用量依存的増加を呈することが、示された。自己相互作用を示すそのようなヘリックスの誘導は、ｐＨ５．０では観察されない。トリプトファン内部蛍光は、ＴＣＰ－２５が、より高温またはより高濃度の変性剤に暴露された場合に、より高濃度（０．３ｍＭ）でより安定であることを示し、これは、オリゴマー形成と一致する。その上、動的光散乱（ＤＬＳ）による分析は、ＴＣＰ－２５のオリゴマー化が高度に動的であり、ｐＨ、時間および温度に依存することを実証する。
材料と方法
ペプチド：
トロンビン由来ペプチド「ＴＣＰ－２５」（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が、ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ， Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）により合成された。純度（９５％を超える）が、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ Ｖｏｙａｇｅｒ、米国）により確認された。
濁度アッセイ：ＴＣＰ－２５が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５および５．８の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに上昇濃度（１０～３００μＭ）で再懸濁され、ＲＴで１時間インキュベートされた。その後、濁度が、ＤＵ（登録商標）８００ＵＶ／可視分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒＴＭ、米国）を用いて４０５ｎｍでの吸収および透過度を測定することにより、モニタリングされた。
電気泳動およびウェスタンブロット：ＴＣＰ－２５が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５および５．８の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに１ｍＭの濃度で再懸濁された。それぞれの試料３０μＬがその後、１４０００ｇで２０分間遠心分離された。上清および完全なペレット１０μＬが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）の１０～２０％Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲルにロードされた。電気泳動が、１００Ｖで１００分間実施された。ゲルは、クーマシーブリリアントブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いることにより染色され、画像は、Ｇｅｌ Ｄｏｃ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を用いて得られた。オリゴマー化の分析では、濃度範囲のＴＣＰ－２５（１０μＬ中の１０～３００μＭ）が、ＢＮ－ＰＡＧＥ（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ Ｓｙｓｔｅｍ ４～１６％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の使用説明に従ってロードされた。ウェスタンブロッティングのために、材料が次に、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を用いてＰＶＤＦ膜に移された。Ｃ－末端トロンビンエピトープＶＦＲ１７（ＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ；１：１０００希釈、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ、スウェーデン）に対するウサギポリクローナル抗体と、続いてブタ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗体（１：１０００、Ｄａｋｏ、デンマーク）が、ＴＣＰ－２５を検出するために用いられた。ペプチドは、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマーク）と共に５分間インキュベートした後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出することにより、視覚化された。
円偏光二色性分光法：円偏光二色性（ＣＤ）が、異なる濃度（１０から３００μＭ）および異なる緩衝系（１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５および５．８）でのＴＣＰ－２５の二次構造の変化を分析するために用いられた。測定は、２５℃に設定されたＪａｓｃｏ ＣＤＦ－４２６Ｓ Ｐｅｌｔｉｅｒを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、米国）で実施された。石英製キュベット（０．１および０．２ｃｍ）（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ、ドイツ）が、それぞれ１００～３００μＭおよび１０～３０μＭのＴＣＰ－２５濃度に用いられた。スペクトルが、１９０～２６０ｎｍの間で（スキャン速度：２０ｎｍ／分）５回の測定の平均として記録された。スペクトルの生データが、バッファーの寄与について修正され、平均残基楕円率θ（ｍｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ－１）に変換された。二次構造の推定は、Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．１９７３により報告された方程式に従って実行された。
走査電子顕微鏡：ＴＣＰ－２５のオリゴマーが、ネガティブ染色と組み合わせた走査電子顕微鏡（ＴＥＭ）（Ｊｅｏｌ Ｊｅｍ １２３０；Ｊｅｏｌ、日本）により視覚化された。詳細には、１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ１０ ｐＨ５に溶解された１０および３００μＭ ＴＣＰ－２５（それぞれ０．００３ｗｔ％および０．１ｗｔ％に対応）が、分析された。溶解後に、各試料５μＬが、炭素被膜付きグリッド（銅メッシュ、４００）に６０秒間吸着され、２％酢酸ウラニル７μｌで３０秒間染色された。グリッドは、低空気圧でグロー放電を介して親水性にされた。分析は、３回の独立した実験でのグリッド（ピッチ６２μｍ）に張り付けられた試料の１０視野（倍率´４２００）で実施された。
化学的架橋：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳに溶解された１ｍＭ ＴＣＰ－２５ ２０μＬが、上昇濃度のＢＳ３（１８～５８０μＭ）とＲＴで３０分間インキュベートされた。架橋反応は、１ＭトリスｐＨ７．４ １μＬの添加により終了された。形成されたオリゴマーは、先に記載された通りＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）の１０～２０％Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲルと、続いてのクーマシー染色により分析された。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：１４５および５８０μＭのＢＳ３で架橋されたペプチド試料が、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いることによるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ ２．６μＭ、１００Å孔径、米国カリフォルニア州）での逆相クロマトグラフィーによりさらに特徴づけられた。カラムは、ＭｉｌｌｉＱ中に０．２５％ＴＦＡを含有する９５％のバッファーＡと、アセトニトリル中に０．２５％ＴＦＡを含有するバッファーＢとを用いて平衡にされた。架橋剤を有する、または有しないペプチドが、バッファーＡ（１：３）に溶解され、３μｇが、システムに注入された。溶出プロファイルが、勾配（５分目に３５％のＢ、１０分目に４５％）の間にモニタリングされ、２１５ｎｍでのスペクトルが、記録された。カラムの流速は０．５ｍＬ／分であり、全てのランが、ＲＴで実施された。
熱的および化学的変性：熱的および化学的変性が、２８０ｎｍでの励起後に、３００～４５０ｎｍの間の発光蛍光スペクトルを記録することにより分析された。それぞれ１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５に溶解された１０および３００μＭ ＴＣＰ－２５（それぞれ０．００３ｗｔ％または０．１ｗｔ％に対応）の内部蛍光が、ＦＭＯ－４２７Ｓ蛍光モジュールを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計を、スキャン速度２００ｎｍ／分およびスリット幅２ｎｍで使用することにより、１０ｍｍ石英製キュベットで測定された。熱的変性は、温度を上昇させることにより（２０℃から１００℃へ）誘導された。ペプチドが、測定を行う前に所望の温度で１０分間インキュベートされた。Ｔｍは、最大放出蛍光を上昇する温度の関数としてフィットさせることにより決定された。化学的変性は、内部蛍光を測定する前に上昇濃度（０～５Ｍ）の尿素または塩化グアニジニウム（Ｇｎｄ－ＨＣＩ）とペプチドを４℃で２４時間インキュベートすることにより実施された。その後、Ｃｍが計算され、蛍光比（Ｆ３３７／Ｆ３５０）を化学剤の濃度の関数として報告した。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして表される。
動的光散乱：ＴＣＰ－２５のオリゴマーのサイズおよび溶液中のそれらの相対的濃度が、最終容量７５μＬで石英製キュベットを用いてＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、英国）を用いることにより決定された。ＴＣＰ２５ペプチドが、最初のデータ取得の直前に、３００μＭの濃度で１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５に溶解された。オリゴマー化速度が、異なる時点で（０～２４時間および１週間後）および異なる温度での貯蔵後に（ＲＴ、４および－２０℃）モニタリングされた。全ての読み取りが、２５℃で実行された。データは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ－Ｐｒｏ ＺＳ Ｘｐｌｏｒｅｒソフトウエア、バージョン１．３１を用いて処理された。流体力学的径に基づいて、ペプチドオリゴマー／凝集体が、４つの異なるファミリー、即ち小（０．４～５ｎｍ）、中（２０～１５０ｎｍ）、大（２００～９５０ｎｍ）および巨大（１－５□１０３ｎｍ）に分類された。各試料について、スペクトルが、マルチモーダルモードを利用して１１回のサブランを含み３回記録された。グラフでは、異なるファミリーに属するオリゴマーの濃度が、平均±ＳＤとして報告される。
統計解析：全ての実験は、２回繰り返されたＤＬＳを除き、少なくとも３回実施された。結果は、平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表される。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）により解析された。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。Ｐ値は、一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を用いて決定された。
結果
濁度とＴＣＰ－２５のオリゴマー化／凝集の関連性
ＴＣＰ－２５は、インビトロおよびインビボでの抗微生物および抗炎症活性により特徴づけられる３ｋＤａ Ｃ－末端トロンビンペプチドである。３００μＭ ＴＣＰ－２５（０．１ｗｔ％に対応）のＴＣＰ－２５溶液が、溶液が濁りを著しく低下させたｐＨ５と対照的に（図１５Ａ）、ｐＨ７．４で濁った外観を生じたという観察が、この現象のＴＣＰ－２５の濃度－およびｐＨ－依存性におけるさらなる検討を促した。ｐＨ５～７．４および異なる濃度のＴＣＰ－２５の４０５ｎｍでの吸収および相対的透過率が、分析された。図１５Ｂに要約された結果は、ｐＨ７．４および高濃度のＴＣＰ－２５で吸収および透過率の変化を実証し、これは観察された濁度変化と一致する発見である。
オリゴマーまたは凝集体の考えられる形成が、検討された。これは、１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５もしくは５．０に３００μＭ ＴＣＰ－２５（０．１ｗｔ％に対応）を溶解し、試料を遠心分離し、上清およびペレットの両方をＴＣＰ－２５について分析することにより実行された。図１５Ｃは、ＴＣＰ－２５が実際に、特にｐＨ７．４の試料から得られたペレットで検出されたことを示す。次に、凝集されたＴＣＰ－２５が再溶解され得るかどうかを探索するために、ペレットが、ｐＨ７．４試料から、１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．８もしくは５に再懸濁された。結果は、新たに調製されたＴＣＰ－２５と同様の、遠心分離後のペレットおよび上清中の再分配を示し、結果は、ＴＣＰ－２５の観察されたオリゴマー化／凝集の再現性を示す。ＴＥＭが、オリゴマー／凝集体を視覚化するために用いられた。ＴＣＰ－２５が、それぞれｐＨ７．４および５．０バッファーに１０μＭおよび３００μＭの濃度で溶解され、ＴＥＭにより分析された。多数の凝集体が、特に３００μＭのＴＣＰ－２５で、ｐＨ７．４のトリスバッファー中で形成し、それはより少ない凝集体が観察されたｐＨ５．０の酢酸バッファー中の知見と対照的であった。ＴＥＭ画像は、オリゴマー化がｐＨ－および濃度－依存的であることを示している。
ＴＣＰ－２５オリゴマーおよびその組織の構造変化
ペプチドオリゴマー化は、ペプチド二次構造の改変を誘導し得る。これらの分析では、円偏光二色性が利用された。ＴＣＰ－２５が、１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．８もしくはｐＨ５に異なる濃度で溶解された。図１６Ａに示される通り、ペプチドは、ｐＨ７．４でα－ヘリックス構造の濃度依存的増加を示し、優勢なα－ヘリックス構造が、最大濃度３００μＭのＴＣＰ－２５で記録された。そのような著しい濃度依存的構造変化は、ｐＨ５．８または５．０で観察されなかった。
ｐＨ７．４にて濃度依存的様式でオリゴマー化することがＴＣＰ－２５の性向であるとすると、形成された種がさらに分析されなければならなかった。この目的で、１０ｍＭトリスｐＨ７．４に新たに溶解されたＴＣＰ－２５（１０～３００μＭ）が、４～１６％（ｗ／ｖ）のＢｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ（ＢＮ）－ＰＡＧＥに供された。図１６Ｂに示される通り、ＴＣＰ－２５は、広範囲のオリゴマーを形成し、材料の一部は、ゲルに入らず、大きなオリゴマーまたは凝集体を示した。これらのオリゴマーをさらに特徴づけるために、ＴＣＰ－２５が、ＢＳ３と化学的に架橋された。図１６Ｃに認められる通り、ＴＣＰ－２５は、過去の結果と一致して広域のオリゴマーを形成した。Ｃ１８カラムでのＲＰ－ＨＰＬＣ分析は、オリゴマーの存在を確認した。５８０μＭでＢＳ３と架橋されたＴＣＰ－２５は、勾配により早期に溶出された、より高次のオリゴマーを生じた（図１６Ｄ）。濃度依存的オリゴマー化は、可逆的であることが観察された。実際に、ＴＣＰ－２５が、１ｍＭ濃度で１０ｍＭトリスｐＨ７．４に溶解され、その後、１０もしくは３００μＭに希釈された場合、またはこれらの特異的濃度で直接溶解された場合、同じ濃度のペプチドのＣＤスペクトルは、完全に重複していた。
ＴｍおよびＣｍに及ぼすオリゴマー化の効果
タンパク質の変性中点は、フォールディングおよびアンフォールディング状態の両方が等しく平衡に存在する温度（Ｔｍ）または変性体濃度（Ｃｍ）として定義される。これらのパラメータは、オリゴマー化状態で変化される。熱シフトおよび化学変性アッセイが、ＴＣＰ－２５のオリゴマー化により誘導されたＴｍおよびＣｍの潜在的変化を検討するために用いられた。ペプチドが、１０および３００μＭで１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５に溶解され、温度を２０℃～１００℃に上昇させることにより熱的変性に供された。図１７Ａは、それぞれｐＨ７．４および５．０で溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５の２つの各蛍光スペクトルを示す。両方の例で、ペプチドの内部蛍光は、温度の上昇に伴って減少した。同じ結果が、ｐＨ７．４および５．０の両方の１０μＭ ＴＣＰ－２５で得られた。Ｔｍは、最大放出蛍光を温度の関数としてフィットさせることにより決定された（図１７Ａ、上のパネル）。Ｔｍは、ｐＨ変化よりも濃度によってより影響を受け（図１７Ｄ）、より高い濃度で観察されたＴＣＰ－２５のオリゴマー化と一致した。
Ｃｍを決定するために、ＴＣＰ－２５は、上記の通り溶解された後、分析前に上昇濃度の尿素またはグアニジン塩酸塩（Ｇｎｄ－ＨＣＩ）と一晩インキュベートされた。両方の化学剤の存在下でＴＣＰ－２５で得られた結果が、それぞれ図１７Ｂ～Ｃに示される。３００μＭでｐＨ７．４で溶解されたペプチドで得られた蛍光スペクトルの分析は、尿素およびＧｎｄ－ＨＣＩの両方が、ＴＣＰ－２５のチロシンおよびトリプトファン残基の溶媒暴露の変化を示す最大放出波長（λｍａｘ）における赤方偏移を引き起こすことを示した（図１７Ｂ～Ｃ、上のパネル）。その上、Ｇｎｄ－ＨＣＩにより誘導されたアンフォールディングは、２つの転移相を呈した。第一の変性相は、０．５Ｍ Ｇｎｄ－ＨＣＩでの試料中の蛍光強度の増加およびλｍａｘの小さな赤方偏移を特徴とし、変性剤の非存在下でＴＣＰ－２５単独より高い蛍光量子収率を有した中間体の形成を示した。Ｇｎｄ－ＨＣＩ濃度を５Ｍまで増加させると、蛍光の減少およびλｍａｘの３４７から３５５への一貫した赤方偏移が観察され、第二の変性相を示した。完全に異なる挙動が、より低いｐＨで溶解された３００μＭ ＴＣＰ－２５で見出された（図１７Ｂ～Ｃ、上右のパネル）。実際に、いずれの変性剤も有しないＴＣＰ－２５のλｍａｘは、３５４ｎｍに赤方偏移され、Ｔｒｐ残基が既に極性環境に暴露されていることを示した。その上、尿素による変性の場合、一貫した蛍光強度増分も記録され、溶液中に存在する種がＴＣＰ－２５のネイディブ形態より高い蛍光量子収率を特徴とすることを示した。
ｐＨ７．４および５で溶解された１０μＭ ＴＣＰ－２５での結果は、化学剤と独立して、類似の変性プロファイルを示した。いずれの場合も、見出された蛍光強度の上昇ならびに溶媒へのＴｒｐおよびＴｙｒのより低い暴露の証拠であるＧｎｄ－ＨＣＩで変性されたＴＣＰ－２５のλｍａｘの明白な青方偏移があった。２種の変性剤でのＣｍが計算され、Ｉ３３７／Ｉ３５０比を化学剤の濃度の関数として報告し（図１７Ｂ～Ｃ、下のパネル）、図１７Ｂの表に要約される。尿素の存在下でのＣｍが３００μＭ ＴＣＰ－２５よりも１０μＭでかなり低かったという事実は、観察されたＴＣＰ－２５の濃度依存的オリゴマー化がＴＣＰ－２５を変性から保護することを示している。Ｇｎｄ－ＨＣＩでは、Ｃｍは、３００μＭ ＴＣＰ－２５試料についてのみ決定できた。変性のない条件では、ｐＨ５で溶解されたペプチドのＣｍを決定できた。このことは、ペプチドの大部分が組織化されていないことを示し、それは、得られたＣＤデータと一致した。まとめると、熱的および化学的変性実験からの結果は、ペプチドの凝集／オリゴマー化を示す。
ＴＣＰ－２５の熱的変性の可逆性
タンパク質の熱的アンフォールディングは一般に、不可逆的凝集を特徴とする。これがＴＣＰ－２５にも当てはまるかどうかを検討するために、１００℃での変性前および後のペプチドの構造変化が分析された。最初に、変性前および変性後の２０℃でのｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５の１０ｍＭ酢酸塩の中の１０および３００μＭのＴＣＰ－２５の内部蛍光が、比較された。図１８Ａの左パネルに示される通り、ｐＨ７．４で溶解された１０μＭ ＴＣＰ－２５の蛍光は、非変性ペプチドに比較した場合に、変性ＴＣＰ－２５ではおよそ１．７５倍増加した。その上、λｍａｘは、青方偏移し、ペプチドの凝集を示した。類似の結果が、ｐＨ５で溶解されたペプチドで得られた（図１８Ｂ）。完全に異なる挙動が、同じｐＨであるがより高い濃度で溶解されたＴＣＰ－２５の場合に観察された。実際に、ＴＣＰ－２５の内部蛍光は、ペプチドを１００℃に暴露する前と後で同じであり、可逆性を示唆した（図１８Ａ～Ｂ）。わずかに高い蛍光およびλｍａｘの青方偏移が、変位工程後のｐＨ５での３００μＭ ＴＣＰ－２５で見出され、実験の開始時にペプチドのオリゴマー化がより少なかったことと一致した（図１８Ｂ）。
熱的変性工程の可逆性について確認するために、ＴＣＰ－２５の二次構造が、ペプチドを１００℃に暴露する前および後に、ＣＤを用いることにより分析された。ペプチドは、１０ｍＭトリスｐＨ７．４に１０および３００μＭで溶解された。ペプチドの立体配座は、低濃度で組織化されないが、類似のヘリックススペクトルが、３００μＭのＴＣＰ－２５の変性前および後に得られ、変性の可逆性を実証した。ｐＨ５で溶解された１０および３００μＭ ＴＣＰ－２５のデータは、より高濃度での変性の可逆性を確認した。
温度およびｐＨの関数としてのオリゴマーのサイズ
オリゴマーのサイズおよびその相対的分布をさらに把握するために、動的光散乱（ＤＬＳ）が用いられた。ＴＣＰ－２５が、最初の測定の直前に３００μＭで１０ｍＭトリスｐＨ７．４または１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５に溶解された。図１９Ａは、両方のｐＨ値でのペプチドの結果を示す。Ｚ平均（平均粒子径）は、ｐＨ５よりｐＨ７．４で溶解されたＴＣＰ－２５の方が高いことが見出され、ペプチドがｐＨ７．４でより大きなオリゴマーを形成することを示した。興味深いことに、多分散度指数（Ｐｄｉ）は、両方の例で０．６８であり、溶液中の異なる種の存在を示唆した（Ｐｄｉ＜０．１は、試料が単分散されていることを意味する）。
次のステップでは、オリゴマー化の温度依存性が、検討された。図１９Ｂに表された結果は、ＲＴ、４および－２０℃で２４時間貯蔵されたＴＣＰ－２５の分析後に得られた。かなり高い崩壊時間および強度が、ｐＨ７．４では全ての貯蔵条件のペプチドで観察され、ｐＨ５のペプチドについては、ＴＣＰ－２５サイズの増加が示された。低温は一般に疎水性相互作用を促進するため、ｐＨ５では、温度の低下と共に強度の中等度のみの上昇が見出された。図１９Ｃ～Ｅは、オリゴマーのサイズ分布およびそれらの溶液中の濃度を示す。新たに調製された試料では（グラフで０時間目として示される）、粒子の広範囲に及ぶ流体力学的径が、検出された。それゆえそれらは、３つのファミリー：小（０．４～５ｎｍ）、中（２０～１５０ｎｍ）、および大（２００～９５０ｎｍ）に分類された。注目すべきことに、同じ種が、ペプチドが再懸濁されたバッファーのｐＨと独立して見出された。ｐＨ７．４では、中等度に高い数の中サイズのオリゴマーが検出され、ＲＴで１時間後に、ＴＣＰ－２５溶液は、わずかに不鮮明になった。実際に結果は、１＊１０３～５＊１０３ｎｍに及ぶ流体力学的径を有する大きな種が同定されたことを、示した。また注目すべきは、類似の結果が、試料が経時的に（最大１週間）分析された場合に得られたことであった。ｐＨ５で貯蔵されたＴＣＰ－２５は、完全に透明であり、ｐＨ５で１時間後および最大１週間検出されたオリゴマーは、新たに溶解されたＴＣＰ－２５と同一であった。両方の試料が経時的に（１時間から最大１週間）分析された場合に類似の結果が得られたという事実は、用いられた各ｐＨでの安定な化学平衡の急速な形成を示している。
４または－２０℃での貯蔵のサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ）の分析も、実施された。ｐＨ５．０での結果は、類似のサイズ分布を示したが、ｐＨ７．４の試料は、大きなオリゴマーおよびさらに大きなサイズの凝集体を含有した（図１９Ｃ、上右のパネル）。しかし最大の集団は、１５分後に消失し、多数の中径オリゴマーが、代わりに出現した。同じ結果が、試料をＲＴで７５分間貯蔵した後に得られた。総括すると、結果は、ＴＣＰ－２５オリゴマー形成のｐＨ依存性および貯蔵条件の影響を要約する。
考察
ＴＣＰ－２５のオリゴマー化挙動およびその前提条件の定義は、配合されたＴＣＰ－２５ハイドロゲルの観察された濁度についての説明を提供する。
オリゴマーまたは凝集体中のペプチドの組織化は多くの場合、毒性および免疫原性の誘導ならびに、それらの活性の損失に関連する。しかし他のペプチド群では、オリゴマー化または凝集は、ペプチドの自然な作用機序の生来の部分である。オリゴマー化および凝集はそれゆえ、ペプチド機能と一致し得る。ＴＣＰ－２５は、可逆的様式でオリゴマー化することが見出されており、インビトロおよびインビボモデルにおいて観察された有効性と一致する。
ＴＣＰ－２５の配列は、ｐＨ応答性ヒスチジン残基を含有し、それは低ｐＨでプロトン化してペプチドをより帯電させ、低ｐＨでは正味電荷が＋２から＋３に変化する。これは、両親媒性領域の改変およびペプチド溶解度の上昇を導き、オリゴマー化低減を導き得る。これらの結果は、帯電したヒスチジンがローヘリックスの性向を有することを示したデータにより補強される。この特有のヒスチジン残基のｐＨ５．５でのプロトン化はまた、膜破壊によるグラム陰性大腸菌に対するＴＣＰ－２５の抗菌活性を上昇させる。その上、ＴＣＰ－２５は、ｐＨ低下に伴うヒトＣＤ１４への結合親和性低下を示し、中性ｐＨでのより抗炎症性から酸性ｐＨでのより抗菌性への作用機序の切り替えを示唆する。ＴＣＰ－２５中のヒスチジン残基の微細なプロトン化は、活性だけでなくペプチド立体配座およびオリゴマー化傾向にも影響を及ぼすことが示唆される。
ＤＬＣを合わせたＣＤ分析は、ＴＣＰ－２５の立体配座変化がペプチド会合およびオリゴマー化を伴うことを示した。治療的観点から、オリゴマー化の前提条件および結論の理解の改善が、ＴＣＰ－２５の前臨床開発および規制開発を容易にする可能性がある。オリゴマーＴＣＰペプチドが、モノマーペプチドに対しより安定でありより高いＴｍおよびＣｍを有することが実証された。同様にＴＣＰ－２５は、オリゴマー化に好都合な条件下で化学的および熱的な変性の両方により耐性であった。詳細には、治療性ペプチドは、濾過および滅菌などの生成中の複数の工程に耐えなければならず、市場に出され得る前の長い貯蔵に供されなければならないため、熱安定性は非常に重要である。したがって、表面積がモノマーより小さく、このためペプチドが変性およびプロテアーゼ分解を受ける傾向が低いため、オリゴマー化はＴＣＰ－２５の安定化要因として探索され得る。オリゴマー化が、活性分子のより緩徐な放出を容易にし得ることも、考えられる。実際に活性モノマーは、オリゴマーから徐々に放出されたが、この放出は、オリゴマーが組み立てられる配列およびｐＨに依存した。
ＴＣＰ－２５のオリゴマーのサイズ範囲は広範囲であるが、流動力学的径が０．４６、２．８１、４．５８、４３、２３０、４３１、４６２、８０８および１７４０ｎｍのオリゴマーなどのいくらかのサイズが、他よりも多く発生した。さらに、溶液中の粒子サイズの観察された連続変化は、ＴＣＰ－２５のオリゴマー化が異なる時間の後、および条件に応じて、平衡に達する動力学的工程であることを示す。異なる立体配座を呈し、かつ異なるサイズのオリゴマーを形成するペプチドのこの柔軟性は、他のタンパク質およびＡＭＰで報告された通り、安定性だけでなく活性にも寄与し得る。
結論として、ＴＣＰ－２５は中性ｐＨおよびより高用量でα－ヘリックス構造およびオリゴマー化の増加を有することが実証された。ＴＣＰ－２５はまた、高温または変性剤に暴露された場合により高い濃度でより安定であり、これは、オリゴマー形成と一致する。
実施例８
トロンビン由来ペプチドＴＣＰ－２５の抗菌効果の増幅
ＥＤＴＡは、抗酸化効果を発揮することが知られる金属キレート化剤である。興味深いことに、この実施例に記載された結果は、生理学的ｐＨでのＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせが、即座のオリゴマー形成を導き、濁った外観を生じることを示した。予想に反してこの沈殿物の大部分が、ｐＨ５．０で排除されたことが見出された。これは、ＴＣＰ－２５が酸性ｐＨで増加された細菌膜透過を発揮すると示されたため、有利であった。ＥＤＴＡ単独は、若干の静菌効果を示したが、ＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせは、特にｐＨ５で、ＥＤＴＡと組み合わされた場合のインビトロでのプランクトン関連およびバイオフィルム関連細菌に対するＴＣＰ－２５効果の有意な増幅を導いた。その上、予想に反して、貯蔵安定性が、ＥＤＴＡにより低ｐＨで有意に改善された。ＥＤＴＡを有しないＴＣＰ－２５ハイドロゲルと比較して、この実施例に記載されたＴＣＰ－２５＋ＥＤＴＡ ｐＨ５．０ハイドロゲルは、関連のエクスビボ皮膚創傷モデルにおいて改善された有効性を示した。したがってＴＣＰ－２５＋ＥＤＴＡ ｐＨ５．０ハイドロゲルは、バイオフィルムおよびエクスビボ創傷感染モデルにおける共通の創傷病原体の黄色ブドウ球菌および緑膿菌を妨害した。
方法
ＭＩＣ、ＭＢＣ、およびタイム・キルアッセイが、プランクトン細菌細胞およびバイオフィルムに及ぼす、異なるｐＨ条件でのＥＤＴＡと組み合わせたＴＣＰ－２５の効果を試験するために利用された。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイと、それに続く顕微鏡分析が、抗微生物効果を視覚化および定量するために用いられた。エクスビボブタ皮膚創傷感染モデルが、得られた結果を生理学的に関連する条件に変換するために用いられた。安定性が、ＨＰＬＣにより分析された。
ペプチド、バッファー、およびゲル配合剤
トロンビン由来ペプチドＴＣＰ－２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（９７％純度、酢酸塩）が、Ａｍｂｉｏｐｈａｒｍ（スペイン マドリード）により合成された。他に示されなければ、用語ＴＣＰ－２５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のＴＣＰ－２５を指す。この試験では、２種の緩衝系、つまりｐＨ７．４のトリスおよびｐＨ５．０の酢酸塩を用い、両者は１０または２５ｍＭの濃度であった。それぞれのバッファーについて、４０ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を含有する追加的原液が、調製された。この試験で用いられたゲル形成物質は、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ、Ｎａｔｒｏｓｏｌ（商標）２５０ＨＸ、ＭＷ１００００００；Ａｓｈｌａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、スイス シャフハウゼン）であった。配合剤の等張性を実現するために、グリセロールがバッファーに、１０ｍＭバッファー中で２％、および２５ｍＭバッファーで１．９％添加された。ＥＤＴＡが、配合剤に添加され、それぞれ最終濃度１、２．５、５および１０ｍＭを生じた。ゲルは、ＨＥＣ粉末（１．５％ｗ／ｖ）の添加前にバッファーを５６℃に３０分間予備加熱することにより調製された。マグネチックスターラーが、均質なゲルを形成させるために用いられ、それはその後、混合の直後に５分間遠心分離（３．５×１０００ｒｐｍ）された（気泡を除去するため）。ゲルが室温でさらに５分間放置された後、小容量の各バッファーに予め再懸濁された最終濃度０．１、０．５または１％のペプチド溶液を添加した。これらの濃度は、それぞれ０．３ｍＭ、１．５ｍＭおよび３ｍＭに対応する。ペプチドの均質性は、最初にマグネチックスターラーを使用し、続いて力強く振とうすることにより確保された。試験管が再度、５分間遠心分離された。
細菌および増殖条件
トッド・ヒューイット（ＴＨ）ブロスが、１５ｇ／Ｉ ＢａｃｔｏＡｇａｒを３７℃で一晩添加することにより固化され、その後、培養まで４℃で保持された。１つの細菌コロニーが、ＴＨブロス５ｍｌに接種され、３７℃で一晩インキュベートされた。細菌培養物が翌日、ＴＨブロス５ｍｌでリフレッシュされ、対数増殖期中期へと増殖された（ＯＤ６００＝０．４）。洗浄後に、細菌ペレットが、１％細菌溶液（１～２×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を作製するように希釈された。この試験に用いられた菌株は、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３および臨床単離物１７８１、１７７９、２２７８、２２７９、２７８８、２４０４、２５２８、２７８９、緑膿菌ＰＡＯ１および臨床単離物５１：１、２５：１、１０：５、２３：１、６２：２、１５１５９、１８４８８、ならびに大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２を含む。
最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）
９６ウェル丸底ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩＮＣ、米国ケネバンク）が、ＥＤＴＡと組み合わせてＴＣＰ－２５の抗微生物効果を評定するために用いられた。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、標準的プロトコル（Ｗｉｅｇａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００８）に従って実行された。１％細菌溶液が、２×ＢＢＬ（商標）Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）ＩＩカチオン調整ブロス（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国スパークス）で１：１０００倍希釈された。ウェルは、５０μｌ ＭＨブロスで、１．２５～１６０μＭ ＴＣＰ－２５および０～１０ｍＭ ＥＤＴＡの範囲内で系列希釈された処置条件で調製された。次に、細菌溶液５０μｌが添加された。細菌を有しないＭＨブロスが、滅菌対照として用いられ、細菌のみを補充されたものは、増殖対照として用いられた。プレートは、ＭＩＣ分析の前に３７℃で２４時間インキュベートされた。ＭＩＣは、ウェル中の視覚的細菌増殖を予防する最低処置濃度として評定された。ＭＩＣプレートはその後、様々な処置のための最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定するために用いられた。これは、ピペットと用いて各ウェル中の溶液を再懸濁し、その後、ＴＨＡプレート上に液滴１０μｌを配置し、その後、３７℃で一晩インキュベートすることにより実行された。ＭＢＣは、細菌コロニーが観察されない濃度で確立された。
生菌数算定アッセイ（ＶＣＡ）およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）染色
ＡＴＣＣ２９２１３またはＰＡＯ１のどちらかからの１％細菌溶液１０μｌが、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しないｐＨ７．４の１０ｍＭトリスまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸バッファー４０μｌに添加された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５がその後、最終濃度８０μＭに達するように添加された。バッファーのみを補充された細菌が、対照として用いられた。３７℃で６０分間のインキュベーションに続いて、試料がボルテックス処理され、各試料１０μｌがＰＢＳで系列希釈され、ＴＨＡプレートに播種された。ＣＦＵは、３７℃での一晩のインキュベーション後に細菌コロニーをカウントすることにより決定された。細菌殺傷の顕微鏡での視覚化では、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイが実行された。手短に述べると、細菌がＶＣＡと同様に処置された。１時間のインキュベーション後、細菌５０μｌが、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）溶液で１：１希釈された。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）溶液１ｍｌが、ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ Ｌ－７０１２からの各成分（成分Ａ、ＳＹＴＯ（登録商標）９緑色蛍光核酸色素、および成分Ｂ 赤色蛍光核酸色素ヨウ化プロピジウム）１．５μｌをＰＢＳ ９９５μｌに添加することにより調製された。試料は、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する前に１５分間暗所でインキュベートされた。８０μｌが試験管から廃棄され、ペレットが残りの溶質に再懸濁された。液滴（５μｌ）が、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に載せられ、蛍光顕微鏡測定により分析された。
タイム・キルアッセイおよびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）染色
ＶＣＡアッセイと同じ処置条件を利用して、タイム・キルアッセイが実行された。ＡＴＣＣ２９２１３またはＰＡＯ１の１％細菌溶液が、２×ＭＨブロスでさらに１：１０００希釈された。細菌溶液５００μｌが、１０ｍｌ培養試験管中で処置剤５００μｌを補充され、１８０ｒｐｍで３７℃の振とう機に配置された。試料が連続して５、１０、１５および３０分、ならびに１、３、６および２４時間後に採取された。各時点からの試料が系列希釈され、ＴＨＡプレートに配置された。細菌コロニー単位が、翌日カウントされて、ＣＦＵ／ｍｌを決定した。その後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色が、先に記載された通り細菌殺傷を視覚化するために利用された。
バイオフィルム試験
ＡＴＣＣ２９２１３のバイオフィルムが、Ｃｏｓｔｅｒ（商標）９６ウェル丸底ビニルフレキシブルプレート（Ｃｏｒｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国ケネバンク）において、０．２％グルコースを補充された０．５％トリプシン大豆ブロス（ＴＢＳ）中で増殖された。ＰＡＯ１のバイオフィルムが、平底９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ フリッケンハウゼン）において、０．５％カザミノ酸、０．２％グルコースおよび１ｍＭ ＭｇＳＯ４を補充されたＭ６３培地中で増殖された。各増殖培地（１００μｌ）は、１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの細菌溶液５μｌを補充された。次にプレートが、マイクロプレートシールで覆われ、モイストコンテナに入れられ、３７℃で４８時間インキュベートされて、成熟したバイオフィルムを確保した。処置の前に、プランクトン細胞が、バイオフィルムをＰＢＳ １００μｌで洗浄することにより、バイオフィルムから除去された。その後、異なる処置剤１００μｌが、ウェルに添加された。用いられた処置は、１）バッファー、２）バッファー＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３）バッファー＋０．１％ＴＣＰ－２５、および４）バッファー＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．１％ＴＣＰ－２５であった。４つのバッファー条件：即ちｐＨ７．４の１０または２５ｍＭトリス、およびｐＨ５の１０または２５ｍＭ酢酸塩が、この試験に用いられた。その後、処置剤が、ゲルまたは溶液のどちらかとしてバイオフィルムに添加された。処置剤の添加後に、プレートが再度密封され、３７℃でさらに２時間インキュベートされた。処置剤が溶液として添加されるアッセイでは、処置剤およびプランクトン細胞が除去され、廃棄された。その後、バイオフィルムがＰＢＳ １００μｌで２回洗浄された。その後、ＰＢＳ ２００μｌがウェルに添加され、バイオフィルムが、ピペットチップを用いて引っかくことにより破裂された。１０μｌがその後、各ウェルから採取され、系列希釈され、ＣＦＵ決定のために播種された。抽出相での細菌殺傷を予防するために、ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌ硫酸デキストラン１００μｌが、バイオフィルムの破裂の前に添加された。硫酸デキストランは、ＴＣＰ－２５の抗菌効果を中和する。試料１０μｌが系列希釈され、ＴＨＡプレートに播種された。細菌コロニーが、ＣＦＵ決定のために翌日にカウントされた。
エクスビボブタ皮膚熱傷創モデル
ゲッチンゲン系ミニブタからのブタ皮膚移植片が、さらなる使用まで－２０℃で凍結された。皮膚は、ペトリ皿状で２時間除霜され、その後、使用前に９６％エタノールで洗浄された。創傷形成が、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２０２０）により記載された方法に従って作製された。簡単に述べると、直径８ｍｍのはんだごてが、熱傷創を作製するために移植片に対して１５秒間保持された。
処置あたり２つの創傷が、各移植片で作製された。熱傷後に、ＰＢＳが皿に添加され、インキュベーション中の組織の水分を保持した。大腸菌ＡＴＣＣ２９２１３または緑膿菌ＰＡＯ１の１％細菌溶液が、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスバッファーで１：１０希釈され、３０μｌがその後、各ウェルに添加された。Ｐａｒａｆｉｌｍが移植片の上に配置され、蒸発をさらに予防し、プレートがその後、３７℃のインキュベータ内に２時間配置され、感染された。トリスまたは酢酸バッファーのどちらかで希釈された、様々な濃度のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５（０．１～１％）およびＥＤＴＡ（５～２０ｍＭ）を含有する処置剤１００μｌがその後、創傷に添加された。皮膚移植片が新しいＰａｒａｆｉｌｍ片で覆われ、再度インキュベータにさらに２時間入れられた。表面および組織からの材料がその後、分析された。体表面のサンプリングのために、創傷が中和剤（ＰＢＳバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌ硫酸デキストラン）４０μｌで２回洗浄された。洗浄物が採取され、系列希釈され、ＴＨＡプレートに播種された。組織試料が、均質化された組織から得られた。このために、創傷はメスを用いて移植片から切開され、その後、小片に切断された後、中和剤５００μｌおよびおよそ３０個のセラミックビーズ（１．４ｍｍ）（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｍｂｈ、ドイツ ヒルデン）と共に２ｍｌ ＳＣ Ｍｉｃｒｏ Ｔｕｂｅ ＰＣＲ－ＰＴ試験管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ドイツ ニュームブレヒト）中に入れられた。ホモジナイズが、６０００ｒｐｍで３０秒間に設定されたＲｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒを用いて実施され、ランの間に１分間を有して４回繰り返された。その後、全ての試料の系列希釈が、ＴＨＡプレートに播種された。翌日、コロニーがカウントされ、ＣＦＵが決定された。感染エクスビボモデルの略図が、図６Ａに表される。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ＴＣＰ－２５の安定性に及ぼすｐＨの効果が、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いることによるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ ２．６μＭ、１００Å孔径、米国カリフォルニア州）での逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより分析された。カラムが、ＭｉｌｌｉＱ中の０．２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するバッファーＡ９５％と、アセトニトリル中の０．２５％ＴＦＡを含有するバッファーＢ５％とを用いて平衡にされた。ペプチドは、ＯｍｎｉＰｕｒ ＷＦＩ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｗａｔｅｒ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）に溶解され、ｐＨが適宜、ＨＣｌまたはＮａＯＨで５、６または７．４に修正された。その後、容量が、溶液中の純粋なペプチドの最終濃度が０．１％に達するように調整された。試料がその後、ＲＴ、４、３７または７０℃で貯蔵された。注入の直前に、ペプチドがバッファーＡ（１：７）に溶解され、５μｇがシステムに注入された。溶出プロファイルが勾配（１０分目にＢが３５％、２０分目に４５％）の間にモニタリングされ、２１５ｎｍでのスペクトルが記録された。カラムの流速は１ｍＬ／分であり、全てのランが５０℃で実施された。データは、全ての溶出ピークの面積の合計（１００％）に対応する総面積に対するパーセント値として表される。
ＥＤＴＡの存在下でＴＣＰ－２５の安定性をテストするために、ペプチドが、１０ｍＭ ＥＤＴＡを有する、または有しない２５ｍＭ酢酸バッファー中に０．１％で溶解され、ＲＴ、４または３７℃で貯蔵された後、先に報告された通り逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより分析された。異なるｐＨで安定性をテストするために、ペプチドが、蒸留水に０．１％で溶解され、ｐＨがその後、示されたｐＨに達するようにＮａＯＨまたはＨＣｌを添加することにより、修正された。
統計解析
この試験で実証された全ての微生物および顕微鏡アッセイは、少なくとも３回の重複実験により表される。データは、平均±ＳＥＭとして表される。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン８を用いて実施された。条件の間の有意差は、多変量解析のために一元配置分散分析または反復測定の二元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて決定された。
結果
ＴＣＰ－２５は、ｐＨ７．４でＥＤＴＡを用いて大きなオリゴマーを形成し、その現象はｐＨ５．０では観察されなかった。ＴＣＰ－２５とｐＨ５．０バッファーとＥＤＴＡとの組み合わせが、ＭＩＣおよびＭＢＣの両方を劇的に低下させ、ならびに２４時間の期間にわたり細菌の再増殖を予防した。本明細書に記載されたＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡの両方を含むハイドロゲル形成が、インビトロでの成熟バイオフィルム中の黄色ブドウ球菌および緑膿菌の両方に対して高度に効果的であることが示された。その上、感染されたブタ皮膚創傷モデルにおいて、配合剤は、創傷表面および下部組織の細菌を低減することにおいて有意により効果的であることが示された。ＥＤＴＡは、ｐＨ５．０で貯蔵安定性を改善した。
様々なバッファー条件でのＴＣＰ－２５に及ぼすＥＤＴＡ効果
ｐＨ７．４のトリスバッファー中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５への５～１０ｍＭ ＥＤＴＡの添加は、溶液の可視的濁度を生じた。類似の濁度が、０．５～２．５ｍＭ ＥＤＴＡの添加後にも、ただし試料を室温で少なくとも３０分間インキュベートした後にのみ、明らかとなった。遠心分離後に、可視の白色ペレットが形成された。粒子は、バッファー中で可溶化でき、それは、この工程の可逆性を実証し、観察された白色の濁った沈着物がペプチドのオリゴマー形成であることを示唆した。ＴＣＰ－２５がｐＨ７．４のトリス中のＨＥＣを基にしたハイドロゲル中で混合されると、ゲルの濁度の可視的変化が観察された（図２０Ａ）。この濁度は、２．５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でさらにより顕著であった。興味深いことに、ｐＨ５の酢酸バッファーが用いられた場合に、濁りの少ない配合剤が観察された（図２０Ａ）。これらのデータは、実施例７に記載されたより高いｐＨでのＴＣＰ－２５のオリゴマー化での結果と一致する。
ＴＣＰ－２５の抗微生物活性に及ぼすＥＤＴＡの効果
ＥＤＴＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５についてのＭＩＣおよびＭＢＣを低減した。この低減は、ペプチドがｐＨ５で希釈された場合により、ｐＨ７．４に比較してより明白であった。酢酸バッファー（ｐＨ５）を用いて、ＭＩＣの低減が、添加されたＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）の最低濃度で観察され得たが、トリスを用いて、１～２．５ｍＭ ＥＤＴＡが、抗菌効果の増幅を開始するために必要とされた。トリスまたは酢酸塩のどちらかの中の２．５ｍＭ ＥＤＴＡでは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５でのＭＩＣは、３種の細菌株全てで２０～４０μＭから１．２５μＭに減少した（図２０Ｂ）。ＭＢＣもまた、ＥＤＴＡ添加の関数として大きく低減された。ＭＩＣで実証された通り、この効果は、ｐＨ５バッファーで最も顕著であり、ＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＭＢＣを１６０μＭから１．２５μＭに低減した。ｐＨ７．４では、この試験で用いられたＥＤＴＡ濃度のいずれも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５のＭＢＣを最低ペプチド濃度へと低減しなかったが、それでもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の１６０μＭから５～１０μＭへの低減を実証した（図２０Ｃ）。これらの効果をさらに検証するために、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の臨床単離物が評定され、類似のＥＤＴＡ増幅効果が観察された（表７）。同様にＭＢＣは、臨床単離物でも低減され、この効果は、酢酸バッファーを用いた場合により顕著であった（表８）。
Figure 2023507201000009
Figure 2023507201000010
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Figure 2023507201000012
ＴＣＰ－２５はＶＣＡアッセイにおいて細菌殺傷を誘導する
ＶＣＡアッセイを利用して、細菌細胞がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡで処置された場合に有意に低減されることが見出された。興味深いことに、用いたバッファーの効果としての細胞の低減において有意差があったが（二元配置分散分析；ｐ＜０．０００１）、酢酸塩は、より高い細菌殺傷を有し、ＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）±ＥＤＴＡで処置された場合に９９，９～１００％の細胞低減を示した（ｐ＜０．００１）（図２１）。細菌低減の視覚化が、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを用いた顕微鏡画像を用いて実施された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５を含有する処置において、細菌凝集体が観察された。凝集体のサイズ分布に関する情報が、図２２に表される。
ＥＤＴＡはＴＣＰ－２５の抗微生物効果を増幅する
ＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡの経時的な効果を探索するために、本発明者らは、タイム・キルアッセイを実行した。本発明者らは、このアッセイについて、用いた緩衝系に関係する抗菌特性において有意差がないことを見出した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５は、ＥＤＴＡが存在する、または存在しないに関係なく、速効性の抗菌効果を有する。黄色ブドウ球菌では、本発明者らは、ＴＣＰ－２５±ＥＤＴＡで処置された場合５分後にＣＦＵの１００％低減を観察した。興味深いことに、ＴＣＰ－２５単独で処置された試料は、６および２４時間目に再度コロニー形成されたが、ＴＣＰ－２５＋ＥＤＴＡの組み合わせの処置では、この実験期間を通して１００％の細胞低減が観察された（図２３Ａ）。様々な処置の抗菌効果を視覚化するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を利用する蛍光顕微鏡測定が実行され、ＣＦＵについて表された結果を確認した。細菌クラスターである凝集体が、１および２４時間の両方の試料にＴＣＰおよび／またはＥＤＴＡを含有する様々な処置剤において顕微鏡測定で観察された（図２３Ｂ）。様々なサイズの細菌凝集体が見出され、より大きなサイズの凝集体が２４時間の測定ポイントでより高度に存在した。凝集体の形成は、酢酸バッファーを用いた場合により明白であった。さらに酢酸塩では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５は、ＥＤＴＡが存在しない場合に１時間の時点で凝集を起こさないが、経時的にＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのみが、細菌を凝集させる。
ＴＣＰ－２５は、緑膿菌の有意な低減を引き起こすが、２４時間後に、細菌は再度コロニー化した。しかし黄色ブドウ球菌と同様に、細菌ＣＦＵの１００％低減が、ＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）＋ＥＤＴＡでの処置の実験を通して、明白であった（図２４Ａ）。これらの結果は、蛍光顕微鏡測定によりさらに視覚化された。細菌凝集体は、ＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびＴＣＰ－２５＋ＥＤＴＡで処置された緑膿菌でも存在することが見出された。本発明者らは、トリスではＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のみで処置された場合に１時間目に大きな凝集体をより高い割合で認め、これらの凝集体は、経時的に低減され、より大きな割合のより小さな凝集体が明白になった。２４時間の時点で明白な凝集体サイズのこのシフトは、酢酸バッファーを用いた場合には存在しない（図２４Ｂ）。
バイオフィルム関連細菌を低減するＴＣＰ－２５の能力に及ぼすＥＤＴＡの効果
黄色ブドウ球菌および緑膿菌からの成熟バイオフィルムの処置は、用いたバッファー（１０ｍＭトリスまたは１０ｍＭ酢酸塩）と関係なく、ＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびＴＣＰ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）＋ＥＤＴＡが、バイオフィルム内の細菌細胞を低減することを実証した。本発明者らは、２．５ｍＭ ＥＤＴＡをペプチド溶液に補足した場合、用いた両方の細菌で細菌細胞の９９％低減を見出した（図２５ＡおよびＢ）。同様の結果が、２５ｍＭトリスおよび酢酸バッファーを用いてＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡの組み合わせで実証された（図２５ＣおよびＤ）。
ブタ皮膚創傷感染モデルの皮膚におけるＴＣＰ－２５およびＥＤＴＡの効果
様々な用量のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５を含有する処置は、緑膿菌で処置された創傷に及ぼす外用での処置効果を分析した場合に、対照に比較してＣＦＵの用量依存的低減を示した。ここで１％ＴＣＰ－２５は、０．１％ＴＣＰ－２５に比較してＣＦＵの有意に高い低減を有した（ｐ＜０．０５）。分析は、対照と比較した場合に組織内の細菌細胞の有意な低減も実証したが、全ての３種の処置は、創傷の組織内部での細菌の９０％低減を有することが示された（図２６Ａ）。ＥＤＴＡの添加は、緑膿菌に対するＴＣＰ－２５の効果を有意に増幅し、ＣＦＵの用量依存的減少が０．１％ＴＣＰ－２５と組み合わせたＥＤＴＡ濃度の上昇に関連し、２０ｍＭ ＥＤＴＡがＣＦＵの６－ｌｏｇ低減を誘導することを実証した。２０ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．１％ＴＣＰ－２５は、組織中の細菌細胞を有意に低減し、細菌をおよそ９０％低減することを実証した（図２６Ｂ）。次に本発明者らは、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に感染された創傷に及ぼす様々な濃度０．１、０．５または１％のＴＣＰ－２５で１０ｍＭ ＥＤＴＡをテストすることにより進めた。処置の有意な効果は、両方の細菌株で外用的に見出され、最高濃度のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５で処置した場合緑膿菌で６－ｌｏｇ低減および黄色ブドウ球菌で３－ｌｏｇ低減を実証した。細菌の有意な低減が、緑膿菌で検出され、９０％の低減であった（図２６Ｃ）。
ＴＣＰ－２５安定性に及ぼすＥＤＴＡおよびｐＨの効果
図２７に示される通り、ＥＤＴＡを有する、または有しない酢酸バッファー中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の安定性が、分析された。ペプチドは、ＥＤＴＡを有する、または有しない０．１％酢酸バッファーに溶解され、ＲＴ、４または３７℃で貯蔵された後、分析された。結果は、ＥＤＴＡがペプチドを分解から保護したことを示した。次に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴＣＰ－２５の安定性が、異なるｐＨで分析された。ペプチドは、蒸留水に０．１％で溶解され、その後ｐＨが、所望のｐＨに達するようにＮａＯＨまたはＨＣｌを添加することにより修正された。試料はその後、ＨＰＬＣ分析の前にＲＴ、４、３７または７０℃で貯蔵された。ＴＣＰ－２５は、ｐＨ５．０で分解の増加を示した。ＴＣＰ－２５は、０．１％以上でオリゴマー化し、ペプチド分解の有意な低減を導いた（図２８参照）。
考察
この実施例では、ＴＣＰ－２５の抗菌および抗バイオフィルム特性に及ぼすＥＤＴＡの増幅効果が、示される。さらに、ＴＣＰ－２５とＥＤＴＡの組み合わせが、特にｐＨ５．０で、溶解度および性能に関して最適化されることが示される。ＴＣＰ－２５の時間依存的効果を試験した場合、ペプチドは、細菌レベルを有意に低減した。しかし、ＥＤＴＡの非存在下では、２４時間後に細菌の著しい再増殖があった。重要なことに、ＥＤＴＡの添加は、２４時間のインキュベーション時間の間にＴＣＰ－２５の有意で長期間の抗菌効果を生じた。ＴＣＰ－２５単独は、成熟バイオフィルムに浸透し、かつバイオフィルム関連の黄色ブドウ球菌および緑膿菌を低減することが実証された。ＥＤＴＡの添加は、これらの効果を増幅し、細菌の９９％低減が、成熟バイオフィルムにおいて実証された。このことは適切であり、なぜならこのモデルは、金属または他のＥＤＴＡスカベンジャーなどの物質からの可能な干渉が起こり得るインビボ状況をより良好に表し得るためである。しかしながら、ＴＣＰ－２５と１０ｍＭ ＥＤＴＡの組み合わせが、創傷表面および組織内部で細菌レベルを有意に低減できることは注目すべきであった。重要なことにＥＤＴＡは、低ｐＨでＴＣＰ－２５の安定性を有意に改善した。
参考資料
Ｋ． Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ， Ｈ． Ｈｅｒｗａｌｄ， Ａ． Ｓｏｎｅｓｓｏｎ， Ａ． Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ， Ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｅｇ ｕｌｃｅｒ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ． Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９２， ２８１－２８７ （２００４）．

Ｉ． Ｗｉｅｇａｎｄ， Ｋ． Ｈｉｌｐｅｒｔ， Ｒ． Ｅ． Ｈａｎｃｏｃｋ， Ａｇａｒ ａｎｄ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＭＩＣ） ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３， １６３－１７５ （２００８）．

Ｊ．Ｄ． Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔ， Ｊ．Ｓ． Ｄａｖｉｄ， Ｈ．Ｊ． Ｐｏｗｎａｌｌ， Ａ．Ｍ． Ｇｏｔｔｏ， Ｊｒ．， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ （ａｐｏＬＰ－ａｌａｎｉｎｅ） ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １２ （１９７３） １２９０－１２９９．

Claims (25)

  1. ａ）アミノ酸配列
    Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
    Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
    Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
    Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
    Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
    を含むまたはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
    ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
    ｂ）ＥＤＴＡと、
    ｃ）水性バッファー、
    を含む組成物であって、
    ｉ．前記組成物が、高くても８のｐＨを有し、および／または
    ｉｉ．前記組成物中の前記化合物の濃度が、少なくとも０．０８ｗｔ％である、
    組成物。
  2. ａ）アミノ酸配列
    Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
    Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
    Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
    Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
    Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
    を含むまたはそれからなるペプチドを含む化合物であって、
    ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有する、化合物と、
    ｂ）水性溶液と混合された場合にハイドロゲルを形成し得る非イオン性ポリマーと、
    ｃ）水性溶液、
    を含む組成物であって、
    ｉｉｉ．前記組成物中の前記化合物の濃度が、少なくとも０．０８ｗｔ％であり、および／または
    ｉｖ．前記非イオン性ポリマーが、少なくとも０．０５ｗｔ％の濃度で前記組成物中に存在する、
    組成物。
  3. ＥＤＡＴをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
  4. ハイドロゲルまたは粘性溶液であり、好ましくはハイドロゲルである、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記非イオン性ポリマーが、ポリアリルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、コーンスターチおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、メチルセルロース、エチルセルロースおよびｎ－プロピルセルロースを含む、Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースなどのアルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース、好ましくはヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロースおよび前述のものの混合物などの、ヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースおよびヒドロキシ－Ｃ１～Ｃ６－アルキル－Ｃ１～Ｃ６－アルキルセルロースを含む、置換されたアルキルセルロースからなる群から選択され、例えば前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシアルキルセルロースからなる群から、好ましくはヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 好ましくは１～３ｖｏｌ％の濃度で、より好ましくは１～２ｖｏｌ％の濃度で、グリセロールをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記非イオン性ポリマーが、１～３ｗｔ％の範囲の濃度などの、少なくとも１ｗｔ％の濃度で前記組成物中に存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記化合物が、少なくとも０．１ｗｔ％などの、少なくとも０．０８ｗｔ％の濃度で、例えば０．０８～３ｗｔ％０．２ｍＭの範囲で、少なくとも０．２５ｍＭなど、少なくとも０．３ｍＭなどの濃度で前記組成物中に存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  9. ｂ）アミノ酸配列
    Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｗ－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（ここで、
    Ｘ４、６、９は、任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ１は、Ｉ、ＬまたはＶであり、
    Ｘ２は、Ｃ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ３は、Ａ、Ｅ、Ｑ、ＲまたはＹであり、
    Ｘ５は、Ｒ以外の任意の標準的アミノ酸であり、
    Ｘ８は、ＩまたはＬであり、
    Ｘ１０は、Ｈ以外の任意の標準的アミノ酸である）
    を含むまたはそれからなるペプチドを含む化合物
    を含む組成物であって、
    ペプチドが、１０～１００アミノ酸残基の長さを有し、
    前記組成物中の前記化合物の濃度が、少なくとも０．０８ｗｔ％、例えば０．０８～３ｗｔ％の範囲である、
    組成物。
  10. 前記ペプチドが、１８～３５アミノ酸、好ましくは１８～２５アミノ酸の長さを有し、アミノ酸配列
    ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）、
    ＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）、
    ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）、
    ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４）、
    ＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
    ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
    ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
    のいずれかを含むまたはそれからなる、
    前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記ペプチドが、アミノ酸配列
    ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは前記ペプチドが、アミノ酸配列ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）からなる、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  12. ＥＤＴＡが、１～１００ｍＭの範囲でなど、好ましくは少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭなど、例えば２～１００ｍＭの範囲で、２～５０ｍＭの範囲などの、少なくとも１ｍＭの濃度で前記組成物中に存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記組成物の前記ｐＨが、高くても８、例えば７より低く、例えば６より低く、例えば５．５以下であり、および／または前記ｐＨが、３より高い、少なくとも３．５などである、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記組成物の前記ｐＨが、７と８の間、例えばおよそ７．４である、前記請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記組成物内の前記ペプチドを含む前記化合物が、少なくとも３０℃、好ましくは少なくとも３５℃、より好ましくは少なくとも４０℃のＴｍを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記組成物内の前記ペプチドを含む組成物が、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも１．０Ｍ、より好ましくは少なくとも１．１ＭのＣｍ ｕｒｅａを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  17. － ３７℃で２か月間の貯蔵後に前記ペプチドを含む前記化合物の最初の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％など；および／または
    － ３７℃で４か月間の貯蔵後に前記ペプチドを含む前記化合物の最初の含量の少なくとも７５％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％；および／または
    － ３７℃で６か月間の貯蔵後に前記ペプチドを含む前記化合物の最初の含量の少なくとも７０％、少なくとも８０％など、例えば少なくとも８５％；および／または
    － 室温で８か月間の貯蔵後に前記ペプチドを含む前記化合物の最初の含量の少なくとも９０％、少なくとも９５％など、
    を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記請求項のいずれかに記載の組成物を含む製品。
  19. 組成物が、例えば外用薬投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために、場合により局所投与のために調製される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物、またはそれを必要とする個体における障害の処置の方法における使用のための請求項１８に記載の製品。
  20. 組成物が、局所投与のために場合により調製される、それを必要とする個体における障害の処置のための薬剤の調製のための請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  21. それを必要とする個体における障害の処置の方法であって、前記個体への、項目１～１７のいずれか１つに記載の組成物、または請求項１８に記載の製品の治療的有効量の投与、例えば局所投与を含む、方法。
  22. 前記障害が、皮膚、耳、目または鼻の障害である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物、使用または方法。
  23. 前記障害が、創傷、例えば熱傷、非治癒性潰瘍および術創からなる群から選択される創傷である、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の使用のための組成物、使用または方法。
  24. 前記障害が、
    ・ 炎症を含むかもしくは炎症に関連しおよび／または
    ・ 細菌による感染を含むかもしくは細菌による感染、例えば多剤耐性菌による感染に関連する、
    請求項１９～２３のいずれか１項に記載の使用のための組成物、使用または方法。
  25. 前記障害が、バイオフィルムの形成を含む、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の使用のための組成物、使用または方法。
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