JP2023504826A - 効率的かつ特異的なゲノム編集のための部位特異的リコンビナーゼの融合 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概してゲノム編集の分野に関し、リコンビナーゼ単量体の融合を介してゲノム標的配列を効率的かつ特異的に組換えるDNAリコンビナーゼを提供する。より具体的には、本発明は、少なくとも第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及び少なくとも1つのリンカーを含むリコンビナーゼの複合体を含む、効率的かつ特異的なゲノム編集のための融合タンパク質を作製する方法を提供し、前記第1のリコンビナーゼ酵素及び前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼの上流標的部位及び/若しくは下流標的部位の第1の半部位並びに第2の半部位を特異的に認識し;前記第1のリコンビナーゼ酵素及び前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リンカーを介して相互に結合されており;前記リンカーはオリゴペプチドを含むか、又はそれからなる。本発明はさらに、この方法で作製された融合タンパク質に関する。本発明はまた、ヒトX染色体上のint1h領域に存在するDNA配列の反転を触媒するデザイナーリコンビナーゼを開示する。本発明はさらに、前記DNAリコンビナーゼ及び融合タンパク質をコードする核酸分子、並びに医薬組成物における前記融合タンパク質、DNAリコンビナーゼ及び核酸分子の使用に関する。
ゲノム操作は、生物医学研究においてますます重要な技術になりつつある。今日の遺伝子編集の分野における主な手法は、後に細胞修復経路によって補正される、関心のある遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介性二本鎖切断(DSB)の導入である。プログラム可能なヌクレアーゼには4種類あり、標的DNA配列認識の様式に基づいて2つのグループに分けることができる。メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及び転写活性化因子様ヌクレアーゼ(TALEN)は、タンパク質-DNA相互作用を用いてヌクレアーゼを特異的遺伝子座に導くが、クラスターを形成し、規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート結合(clustered, regularly interspaced, short-palindromic repeat-associated (CRISPR))エンドヌクレアーゼは、RNA-DNA相互作用を用いてそれを指示する(Carollの文献, 2014; Wangらの文献, 2017)。プログラム可能なヌクレアーゼは、治療適用の候補であり、それらのうちのいくつかは既に臨床試験中である(Tebasらの文献, 2014; Qasimらの文献, 2015; Cyranoskiの文献, 2016)。
したがって、本発明の課題は、ゲノム標的配列を効率的かつ特異的に組換えるDNAリコンビナーゼを提供することである。特に、個々のリコンビナーゼ単量体が、その結合部位を効率的かつ特異的に見つけて認識しなければならないという課題は解決されなければならない。
本明細書で使用される表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は互換的に使用され、そのような名称は全て子孫を含む。そのため、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という言葉は、導入の回数に関係なく初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。意図的又は偶発的な変異のために、全ての子孫がDNA含有量において正確に同一ではない可能性も理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。違う名称が意図される場合には、これは文脈から明らかになるだろう。
本発明は、細胞内での効率的かつ特異的なゲノム編集のための、特に組換えのための、最も好ましくはゲノムレベルでのDNA配列の反転のためのDNAリコンビナーゼを作製する方法であって、
i. ゲノム中の関心のある配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的な標的部位である核酸配列を同定する工程、ここで、前記潜在的な標的部位は2つの非対称リコンビナーゼ標的部位を含む;
ii. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化している;
iii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化している;
iv. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子及び第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることにより発現ベクターを作製する工程;
v. 反転させるDNA配列を含む細胞を、工程iv)の発現ベクターでトランスフェクトする工程;
vi. 第1のリコンビナーゼ酵素及び第2のリコンビナーゼ酵素を含むDNAリコンビナーゼを発現させる工程;
vii. 工程vi.で発現させたDNAリコンビナーゼが、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程;及び
viii. 工程viiに従って、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるDNAリコンビナーゼを選択する工程
を含む方法を提供する。
i.ゲノム中の関心のある配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的な標的部位である核酸配列を同定する工程、ここで、前記潜在的な標的部位は2つの非対称リコンビナーゼ標的部位を含む;
ii. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化している;
iii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化している;
iv.リンカーペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記核酸は、6~30個のアミノ酸を含むリンカーオリゴペプチドをコードする;
v. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、及びリンカーペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることにより発現ベクターを作製する工程;
vi. 組換える、好ましくは反転させるDNA配列を含む細胞を、工程v)の発現ベクターでトランスフェクトする工程;
vii. 第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質を発現させる工程;
viii. 工程vii.で発現させた融合タンパク質が、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程;及び
ix. 工程viiiに従って、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができる融合タンパク質を選択する工程
を含む方法を提供する。
a) 少なくとも5で最大12 bpの長さを有する潜在的なスペーサー配列である2つの配列について、関心のある配列を含むゲノム又はその一部をスクリーニングするサブ工程、ここで、潜在的スペーサー配列の一方は、関心のある配列の上流にあり、他方の潜在的スペーサー配列は、関心のある配列の下流にあり、該2つの配列は、2メガベース以下、好ましくは1.5メガベース以下又は1メガベース以下、より好ましくは900 kb、800 kb、700 kb、600 kb又は500 kb、最も好ましくは400 kb又は300 kbの最大距離を有し、150 bpの最小距離を有する、
b) 潜在的な半部位とその間のスペーサー配列の両方が潜在的な標的部位を形成するが、各潜在的スペーサー配列について、潜在的な第1の半部位を形成する一方の側の近傍ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチド、並びに潜在的な第2の半部位を形成する他方の側の近傍ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチドを決定することにより潜在的な標的部位を同定するサブ工程、
c)工程b)で同定された潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、配列特異的組換え、好ましくは反転を確実にするための宿主のゲノム中(どこか)に生じない潜在的標的配列を選択するサブ工程、
を含むWO 2018/229226 A1に記載の方法に従って同定することができる。
a)改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として選択し、改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程、該標的部位の配列は同一でないことが好ましいが、各標的部位は、5~12ヌクレオチドのスペーサー配列によって区切られた各10~20ヌクレオチドを有する第1の半部位及び第2の半部位を含み、
b) 基質としてa)で選択される第1の標的部位及び第2の標的部位を含むベクターを用いてDNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリーに分子指向性進化を適用する工程
を含む。
x. 所望の融合タンパク質の潜在的オフターゲット部位を同定する工程;
xi. 工程x.で同定されたオフターゲット部位における所望の融合タンパク質のリコンビナーゼ活性を分析する工程;及び
xii. 少なくとも1つのオフターゲット部位でリコンビナーゼ活性を示さない融合タンパク質を選択する工程
を含み得る。
・4つのリコンビナーゼ単量体が全て異なる;
・3つのリコンビナーゼ単量体が同一であり、1つの単量体が異なる;
・2つのリコンビナーゼ単量体が同一であり、他の2つの単量体が異なる;
・該複合体は2つの異なるホモ二量体を含む;
・該複合体は2つの異なるヘテロ二量体を含む;
・該複合体は2つの同一のヘテロ二量体を含む;
・4つのリコンビナーゼ単量体は全て同一である;
・該複合体は2つの異なる単量体を含む;又は
・該複合体は2つの同一の単量体を含む。
5位のQ、40位のA、44位のT、80位のV、90位のR、94位のL、及び219位のR;又は
5位のQ、40位のA、44位のT、80位のV、90位のR、94位のL、219位のR、232位のG、323位のS及び325位のL;又は
5位のQ、40位のA、44位のT、80位のV、90位のR、94位のL、132位のR、150位のG、219位のR、272位のV、323位のS及び325位のL
によって特徴付けられるアミノ酸配列を有する。
90位のH、94位のS、249位のK、266位のG、272位のV及び282位のK;又は
5位のQ、80位のT、90位のH、94位のS、249位のK、266位のG、272位のV及び282位のK
によって特徴付けられるアミノ酸配列を有する。
X1- X2- X3- X4- X5- X6- (G2S)4 - X7- X8- X9- X10- X11- X12 (式1);
(G2S)2 - X1- X2- X3- X4- X5-X6- X7- X8- X9- X10- X11-X12 - (G2S)2 (式2);及び
X1- X2- X3- X4- X5-X6- X7- X8- X9- X10- X11-X12- X13- X14- X15- X16- X17-X18- X19- X20- X21- X22- X23-X24 (式3);
(式中、
Gはグリシンであり;
Sはセリンであり;かつ
X1~X24の各々は、独立して、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、リジン、セリン及びスレオニンからなる群から選択される)
から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを含むか又はそれからなるリンカーを含む。
表1. 細菌及び酵母T-SSRシステムの認識標的部位
破線の下線: 右半部位
太字:スペーサー配列
核酸配列
a)第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質を発現させる工程;及び
b)工程a)で発現させた融合タンパク質が、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程
を含む方法により試験することができる。
i. リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号31のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号30のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される;より好ましくは、
ii. リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号33のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号32のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される、
ように相互に結合された場合に、loxF8部位上でのヘテロ二量体の最良の活性が示された。
i. リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号94のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号93のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される;より好ましくは、
ii. リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号100のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号99のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される、
ように相互に結合された場合に、loxF8部位上でのヘテロ二量体のさらに最良の活性が示された。
i. 配列番号71又は配列番号103に記載の配列;又は最も好ましくは
ii. 配列番号72又は配列番号97に記載の配列
と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
i. リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号93のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号94のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される;より好ましくは、
ii. リコンビナーゼ標的部位の左半部位などの第1の半部位を特異的に認識する配列番号99のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の右半部位などの第2の半部位を特異的に認識する配列番号100のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼ酵素のN末端とリンカーを用いて融合される、
ように相互に結合された融合タンパク質を提供する。
i. 配列番号34、35及び61の配列を有する核酸;配列番号64の核酸など;又は
ii. 配列番号36、37及び61の配列を有する核酸;配列番号65の核酸など;又は
iii. 配列番号93、94及び61の配列を有する核酸;配列番号98の核酸など;又は
iv. 配列番号99、100及び61の配列を有する核酸;配列番号104の核酸など;又は
v. 配列番号95及び96の配列を有する核酸;又は
vi. 配列番号101及び102の配列を有する核酸;
vii. 配列番号34及び35の配列を有する;又は
viii. 配列番号36及び37の配列を有する核酸;又は
ix. 配列番号67の核酸
を含む核酸である。
i. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化されており;
ii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化されており;
iii. リンカーペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記核酸は、4~60個のアミノ酸を含むリンカーオリゴペプチドをコードし;
iv. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子及びリンカーペプチドをコードする核酸分子を、第1のレポータータンパク質を発現させるための第1のレポーター遺伝子をさらに含む発現ベクターにクローニングすることによって発現ベクターを作製する工程;
v. 宿主細胞を工程iv)の発現ベクターでトランスフェクトし、第2のレポータータンパク質を発現させるための第2のレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドで該宿主細胞をトランスフェクトする工程;
vi. 第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第1のレポーター遺伝子に融合される前記融合タンパク質を発現させる工程と、第2のレポータータンパク質を発現させる工程;
vii. 第1のレポータータンパク質及び第2のレポータータンパク質の二重発現を示し、組換えの成功を示す細胞を特定する工程
を含む方法を提供する。
i. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化されており;
ii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化されており;
iii. リンカーペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記核酸は、6~30個のアミノ酸を含むリンカーオリゴペプチドをコードし;
iv. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子及びリンカーペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることによって発現ベクターを作製する工程;
v. 反転させるDNA配列を含む細胞に、工程iv)の発現ベクター、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするRNA分子又は本明細書に記載の融合タンパク質を送達する工程;
vi. 前記細胞においてヒト染色体上でDNA配列を反転させる工程
を含む方法を提供する。
v. a)第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質を発現させる工程をさらに含み、
前記方法の工程v.で、工程iv.の発現ベクター又は本明細書に記載の融合タンパク質をコードするRNA分子が、例えば、トランスフェクションによって前記細胞内に送達される。
以下の実施例は、本発明の様々な実施態様を説明することのみを目的として提供され、いかなる方法でも本発明を限定することを意図するものではない。
リコンビナーゼを、前述の基質結合タンパク質進化(SLiDE)を用いて進化させた(Buchholz及びStewartらの文献, 2001; Sakaraらの文献, 2007; Karpinskiらの文献, 2016; Lansingらの文献, 2019)。loxF8及び対称部位上での活性リコンビナーゼ並びに不活性リコンビナーゼの選択をそれぞれ変えることによって、カウンターセレクション戦略を確立した。
配列番号32及び33の単量体からなるヘテロ二量体リコンビナーゼが、loxF8配列を認識する単一F8単量体リコンビナーゼを凌駕するかを比較するために、それぞれ非対称loxLTR及びloxBRT配列におけるTre及びBrec1の指向性進化と同等である非対称loxF8部位上で単一リコンビナーゼを用いるSLiDEを行った(Sarkarらの文献, 2007; Hauberらの文献, 2013)。168ラウンドの指向性進化の後に、pEVOベクター中の個々のリコンビナーゼを、異なるアラビノース濃度を用いて大腸菌内で試験した。同定された最良のクローン(H7、配列番号66)は、D7ヘテロ二量体リコンビナーゼ(配列番号32及び33)と比較して効率は低下したが、loxF8配列を組換えた(図6)。
F8リコンビナーゼヘテロ二量体を融合させるための異なるリンカーを設計し、試験した。配列(Gly-Gly-Ser)n及び反復数(n)2、4、6及び8を有する柔軟なリンカーを設計した。その後の5'及び3'オリゴヌクレオチドを、XhoI及びBsrGI-HF制限酵素によって生成される「付着末端」の配列を加えて合成し、配列のアニーリングにより、クローニングに直接使用される二本鎖DNA断片が得られた。
Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、Lys、Ser、Thrアミノ酸をコードする縮重コドンRVMを用いて、3つのリンカーライブラリーを設計した。24個のアミノ酸のリンカー長を用いた。(G2S)8リンカーの配列全体(24個のアミノ酸)、中間部分(12個のアミノ酸)又は縁(各側から6個のアミノ酸)をRVMコドンに変更した。リンカーの柔軟性への変化が融合タンパク質の活性に影響を与え得ることは知られていないので、ライブラリーを設計する際に異なる選択肢を考慮した。既知の柔軟性特性を有する(G2S)配列を、活性への影響を調べるために、リコンビナーゼから遠く(リンカーの中央に)又はリコンビナーゼの近く(リンカーの縁上)のいずれかで保持した。第1のライブラリーを、リンカー配列の中央部分(12個のアミノ酸)を、4つの(G2S)リピートを含む最初に用いたフレキシブルリンカーと同じように保ち、リンカー配列の左右部分(両側から6個のアミノ酸)を(RVM)6に変更するように設計した。第2のライブラリーを逆に設計した:12個のアミノ酸の中央部分を(RVM)12に変更し、6個のアミノ酸の左右部分を2つの(G2S)リピートとして保持した。加えて、リンカーに(G2S)リピートが必要かはわからなかったため、第3のライブラリーでは、リンカーの24個のアミノ酸配列全体を(RVM)24に変更した(図13)。3つのオリゴヌクレオチドを設計し、3つのPCR反応の鋳型として使用した。リンカー配列に、プライマーアニーリングのための2つのアダプター、並びにクローニングのためにリンカーを直接使用することを可能にするXhoI及びBsrGI-HF制限部位を隣接させた。リンカーライブラリーを(G2S)8の代わりに融合タンパク質にクローニングし、リンカーライブラリー1、リンカーライブラリー2、リンカーライブラリー3の3つのライブラリーを得た(図13)。融合タンパク質にはリンカーライブラリーが含まれていたが、リコンビナーゼの配列は変更しなかった。
リンカーライブラリーとの融合タンパク質を、loxF8標的部位上でのそれらの活性を試験するために、pEVO_2rec_loxF8プラスミドにサブクローニングした。消化物は、3つのリンカーライブラリー全てと融合したヘテロ二量体が、200 μg/mlのL-アラビノースの高誘導レベルで、loxF8部位上で活性を有することを明らかにした(図14A)。
L8リンカーを用いたリコンビナーゼ融合を、(G2S)8リンカーのリンカー及び非融合ヘテロ二量体と共に並行して、異なる誘導レベルで、loxF8部位上で試験した。試験消化物は、L8リンカー融合がより効率的にプラスミドを組換えることを明らかにした(図18)。同様に、L8リンカー融合ヘテロ二量体も、非融合ヘテロ二量体と比較してより高い組換え効率を実証した(図19)。したがって、D7単量体とL8リンカー配列との融合は、組換え活性を増加させる。
さらなる目標は、リコンビナーゼヘテロ二量体の融合が組換えの特異性を増加させ、その結果、潜在的なオフターゲット効果を最小限に抑えるかを調べることであった。loxF8配列との遠隔類似性に基づいて、F8リコンビナーゼヘテロ二量体についての潜在的な非対称及び対称オフターゲット部位に似ているloxF8配列と高い類似性を示すヒト配列を、大腸菌切除アッセイで試験した(表2、配列番号19~29)。
融合L8-リコンビナーゼヘテロ二量体は、細菌において良好な活性を示した。したがって、次の工程は、ヒト細胞における組換え効率を調べ、非融合ヘテロ二量体と活性を比較することであった。EGFPと転写的に融合させた融合リコンビナーゼ又は単一リコンビナーゼを含有する発現プラスミドでHEK293T細胞のトランスフェクションを行った(図21)。EGFPのみを発現する空のプラスミドでトランスフェクトした細胞及び非トランスフェクト細胞を、それぞれトランスフェクションの陽性対照及び陰性対照として用いた。
本明細書に記載のリコンビナーゼを、血友病Aを引き起こしているF8遺伝子におけるエクソン1の大きな遺伝子反転を修正するために開発した。ゲノムレベルでのヘテロ二量体の反転効率を研究するために、記載の発現コンストラクト(図21)を利用してHEK293T細胞内でリコンビナーゼを48時間発現させ、その後gDNAを抽出した。HEK293T細胞は、F8遺伝子の反転したエクソン1を保有していない。しかし、リコンビナーゼは、loxF8部位の間のゲノムDNA断片の向きとは無関係に反転反応を行うことができる。したがって、反転していないエクソン1に対する反転したエクソン1の比は、反転効率の代わりとして用いることができる。ゲノムDNA上の反転頻度を計算するために、エクソン1反転に特異的なTaqManプローブを用いるqPCRベースアッセイを開発した。定義した量のエクソン1反転を有するgDNA試料を用いて、標準曲線を計算した。リコンビナーゼトランスフェクト細胞の反転効率は、この標準曲線を用いて後で推定することができる。非融合ヘテロ二量体でトランスフェクトした試料から単離されたgDNAは、反転が細胞の約6,0%において誘導されたことを示した。融合ヘテロ二量体でトランスフェクトした試料では、反転頻度は約9.0%であった(図24)。しかし、トランスフェクション効率は100%ではないため、GFP発現はリコンビナーゼ発現に転写的に結合されているため、GFP+細胞の反転率を修正する必要がある。フローサイトメトリーデータから、それぞれ29.5%(非融合)及び21,3%(融合)のトランスフェクション効率が明らかになった。したがって、リコンビナーゼ発現細胞におけるゲノムレベルでの反転効率は、非融合ヘテロ二量体については20.3%、融合L8ヘテロ二量体については42.7%であった。そのため、L8リコンビナーゼヘテロ二量体の融合は、2倍高い反転率をもたらし、リコンビナーゼヘテロ二量体の融合が組換え活性を増加させることが実証された。
ヒトゲノムに見られる配列を組換えるためにリコンビナーゼを開発したので、ゲノムloxF8レポーター細胞株を開発した(図25A)。組込まれたレポーターのloxF8標的部位の組換え時に、細胞は赤色蛍光タンパク質mCherryを発現し始める。リコンビナーゼを合成mRNAとしてレポーター細胞株にトランスフェクトした(図25B)。合成mRNAをコードする青色蛍光タンパク質(tagBFP)を共トランスフェクトし、トランスフェクション効率を推定した。tagBFP mRNAと共にD7リコンビナーゼ(非融合及び融合 - 配列番号32及び33のリコンビナーゼ単量体を含む)並びにA4リコンビナーゼ(非融合及び融合 - 配列番号93及び94のリコンビナーゼ単量体を含む)でのトランスフェクションの48時間後に行ったフローサイトメトリー分析により、トランスフェクション効率がD7非融合については44.5%、D7融合については48.9%、A4非融合については55.5%及びA4融合については55.7%であることが明らかになった。BFPとmCherry二重陽性細胞は、ヒトレポーター細胞株におけるゲノムレポーターの組換えを反映する。ゲノムレポーターの組換え効率を計算するために、二重陽性(BFP+及びmCherry+)細胞をトランスフェクション効率に正規化した(図25C)。したがって、ゲノムレポーターのD7非融合については71.5%、D7融合については50.7%、A4非融合については24.3%及びA4融合については21.4%が組換わった。
リコンビナーゼヘテロ二量体のD7非融合、D7融合、A4非融合、A4融合及びD11非融合(配列番号32、33、93、94、99及び100のリコンビナーゼ単量体を含む)をコードする合成mRNAでHEK293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にゲノムDNAを抽出し、天然loxF8遺伝子座の140 kb反転について分析した(図26A)。loxF8遺伝子座の向きは、PCR用のプライマーの異なる組み合わせを使用することによって検出することができる(図26A)。プライマーP2及びP3を用いて、loxF8遺伝子座の正常な向きを検出し、プライマーP1及びP3を用いて、loxF8遺伝子座の逆向きを検出した(図26B)。リコンビナーゼヘテロ二量体をコードする合成mRNAでトランスフェクトした細胞のみが、反転特異的バンド(PCR P1+P3)を示す。WT対照又は水対照試料にはバンドが見えない。この実験で用いたゲノムDNAの完全性を確認するために、正常な向きのPCR(P2+P3)を同様に行った。全ての試料は、全てのPCR反応の鋳型として使用されるゲノムDNAが無傷であることを示す予想サイズでPCRバンドを示す。予想通り、反転対照試料はこの反応においてバンドを示さない。これらの結果は、配列番号32及び33(非融合D7リコンビナーゼ)、配列番号93及び94(非融合A4リコンビナーゼ)並びに配列番号99及び100(非融合D11リコンビナーゼ)のリコンビナーゼヘテロ二量体と配列番号72(融合D7リコンビナーゼ)及び配列番号97(融合A4リコンビナーゼ)の融合タンパク質が140 kbの天然loxF8遺伝子座を反転させることができることを示す。
Claims (21)
- 細胞内でのゲノム編集のための、好ましくは組換えのための、より好ましくはゲノムレベルのDNA配列の反転のためのDNAリコンビナーゼの融合タンパク質を作製する方法であって、
i. ゲノム中の関心のある配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的な標的部位である核酸配列を同定する工程、ここで、前記潜在的な標的部位は2つの非対称リコンビナーゼ標的部位を含む;
ii. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化している;
iii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化している;
iv. リンカーペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記核酸が、6~30個のアミノ酸を含むリンカーオリゴペプチドをコードする;
v. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子及びリンカーペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることにより発現ベクターを作製する工程;
vi. 組換える、好ましくは、反転させるDNA配列を含む細胞を、工程v)の発現ベクターでトランスフェクトする工程;
vii. 第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む前記融合タンパク質を発現させる工程;
viii. 工程vii.で発現させた前記融合タンパク質が、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程;及び
ix. 工程viiiに従って、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができる融合タンパク質を選択する工程
を含む、前記方法。 - x. 前記所望の融合タンパク質の潜在的なオフターゲット部位を同定する工程;
xi. 工程x.で同定されたオフターゲット部位における該所望の融合タンパク質のリコンビナーゼ活性を分析する工程;及び
xii. 少なくとも1つのオフターゲット部位上でリコンビナーゼ活性を示さない融合タンパク質を選択する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 工程vii.で発現させた前記融合タンパク質において、前記第1のリコンビナーゼ酵素のC末端が、前記リンカーペプチドを介して前記第2のリコンビナーゼ酵素のN末端に結合されるか、又は該第2のリコンビナーゼ酵素のC末端が、該リンカーペプチドを介して該第1のリコンビナーゼ酵素のN末端に結合される、請求項1又は2記載の方法。
- 請求項1記載の方法の工程i.が、
a) 少なくとも5で最大12 bpの長さを有する潜在的なスペーサー配列である2つの配列について、関心のある配列を含むゲノム又はその一部をスクリーニングするサブ工程、ここで、潜在的スペーサー配列の一方が関心のある配列の上流にあり、他方の潜在的スペーサー配列が関心のある配列の下流にあり、前記2つの配列が、2メガベースの最大距離及び150 bpの最小距離を有する、
b) 潜在的な半部位とその間の前記スペーサー配列の両方が潜在的な標的部位を形成するが、各潜在的スペーサー配列について、潜在的第1の半部位を形成する一方の側の近傍ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチド、並びに潜在的第2の半部位を形成する他方の側の近傍ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチドを決定することにより潜在的な標的部位を同定するサブ工程、
c)工程b)で同定された潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、配列特異的組換え、好ましくは反転を確実にするための、宿主ゲノム中(どこか)に生じない潜在的標的配列を選択するサブ工程、
を含む、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。 - 工程ii.及びiii.に記載の第1のリコンビナーゼ酵素及び前記第2のリコンビナーゼ酵素が、基質結合指向性進化(SLiDE)によって進化され、前記基質結合指向性進化が、a)で選択される前記第1の標的部位上で活性のある少なくとも1つの第1のデザイナーDNA組換え酵素が得られ、前記第2の標的部位上で活性のある少なくとも1つの第2のデザイナーDNA組換え酵素が得られるまで、
a)改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として選択し、改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程、該標的部位の配列は同一でないことが好ましいが、各標的部位が、5~12ヌクレオチドのスペーサー配列によって区切られた各10~20ヌクレオチドを有する第1の半部位及び第2の半部位を含み、
b) 基質としてa)で選択される該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを用いてDNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリーに分子指向性進化を適用する工程
を含む、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。 - 請求項1~5のいずれか一項記載の方法により得られたゲノム編集のための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質がリコンビナーゼの複合体からなり、前記複合体が少なくとも第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及び少なくとも1つのリンカーからなり、前記第1のリコンビナーゼ酵素及び前記第2のリコンビナーゼ酵素が、リコンビナーゼの上流標的部位及び/又は下流標的部位の第1の半部位並びに第2の半部位を特異的に認識し;該第1のリコンビナーゼ酵素及び該第2のリコンビナーゼ酵素が、リンカーを介して相互に結合されており、前記リンカーが、4~50個のアミノ酸を含むオリゴペプチドを含むか又はそれからなり、前記融合タンパク質が、核酸配列
を有するloxF8標的部位の上流のリコンビナーゼ標的配列を特異的に認識し、核酸配列
前記loxF8リコンビナーゼ標的部位の配列番号17の上流リコンビナーゼ標的配列と配列番号18の下流リコンビナーゼ標的配列との間の遺伝子配列の反転を触媒し;かつ
該loxF8リコンビナーゼ標的部位の配列番号17の上流リコンビナーゼ標的配列と配列番号18の下流リコンビナーゼ標的配列との間の遺伝子配列の反転を触媒する能力が、
a)第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質を発現させる工程;及び
b)工程a)で発現させた融合タンパク質が、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程
を含む方法により試験される、前記融合タンパク質。 - 前記リンカーが、
式1、式2及び式3:
X1- X2- X3- X4- X5-X6- (G2S)4 - X7- X8- X9- X10- X11-X12 (式1);
(G2S)2 - X1- X2- X3- X4- X5-X6- X7- X8- X9- X10- X11-X12 - (G2S)2 (式2);及び
X1- X2- X3- X4- X5-X6- X7- X8- X9- X10- X11-X12-X13- X14- X15- X16- X17-X18- X19- X20- X21- X22- X23-X24 (式3)
(式中、
Gはグリシンであり;
Sはセリンであり;かつ
X1~X24の各々は、独立して、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、リジン、セリン及びスレオニンからなる群から選択され;
式1、式2又は式3の前記オリゴペプチドが、グリシン及びセリン残基のみからなっていない)
から選択されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを含むか若しくはそれからなるか、又は
請求項6記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質において、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識する前記第2のリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識する前記第1のリコンビナーゼ酵素のN末端に前記リンカーを用いて融合されるように、該第1のリコンビナーゼ酵素、該第2のリコンビナーゼ酵素及び該リンカーが相互に結合されているか;又は
前記融合タンパク質において、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識する該第1のリコンビナーゼ酵素のC末端が、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識する該第2のリコンビナーゼ酵素のN末端に該リンカーを用いて融合されるように、該第1のリコンビナーゼ酵素、該第2のリコンビナーゼ酵素及び該リンカーが相互に結合されている、
請求項6又は7記載の融合タンパク質。 - 前記ヘテロ二量体の各リコンビナーゼ酵素が、チロシン部位特異的リコンビナーゼのリコンビナーゼ標的部位の第1の半部位と第2の半部位を独立して認識するように指向性進化により進化したチロシン部位特異的リコンビナーゼである、請求項6~8のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- 前記リコンビナーゼ標的部位が、Cre-、Dre-、VCre-、SCre-、Vika-、lambda-Int-、Flp-、R-、Kw-、Kd-、B2-、B3-、Nigri-及びPanto-リコンビナーゼからなる群から選択されるチロシン部位特異的リコンビナーゼの標的部位である、請求項9記載の融合タンパク質。
- 前記第1のリコンビナーゼ酵素が、配列番号30、配列番号32、配列番号93又は配列番号99に記載の配列と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつ/又は前記第2のリコンビナーゼ酵素が、配列番号31、配列番号33、配列番号94又は配列番号100に記載の配列と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であるか;又は
前記融合タンパク質が、配列番号71、配列番号72、配列番号97又は配列番号103に記載の配列と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号71、配列番号72、配列番号97及び配列番号103の各々が、配列番号14のアミノ酸配列を有するリンカーを含む、請求項6~10のいずれか一項記載の融合タンパク質。 - 第1のリコンビナーゼ酵素と第2のリコンビナーゼ酵素からなる融合タンパク質であって、前記第1のリコンビナーゼ酵素と前記第2のリコンビナーゼ酵素が、リコンビナーゼの上流標的部位及び/又は下流標的部位の第1の半部位並びに第2の半部位を特異的に認識し、該第1のリコンビナーゼ酵素が、配列番号30、配列番号32、配列番号93又は配列番号99に記載の配列と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペチドであり、かつ/又は該第2のリコンビナーゼ酵素が、配列番号31、配列番号33、配列番号94又は配列番号100に記載の配列と少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペチドであり、DNAリコンビナーゼヘテロ二量体が、核酸配列
を有するloxF8標的部位の上流のリコンビナーゼ標的配列を特異的に認識し、核酸配列
前記loxF8リコンビナーゼ標的部位の配列番号17の上流リコンビナーゼ標的配列と配列番号18の下流リコンビナーゼ標的配列との間の遺伝子配列の反転を触媒し;
該loxF8リコンビナーゼ標的部位の配列番号17の上流リコンビナーゼ標的配列と配列番号18の下流リコンビナーゼ標的配列との間の遺伝子配列の反転を触媒する能力が、
a)第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む前記融合タンパク質を発現させる工程;
b)工程a)で発現させた該融合タンパク質が、前記細胞内のヒト染色体上のDNA配列を反転させることができるかを分析する工程
を含む方法により試験される、前記融合タンパク質。 - 請求項6~12のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- i. 配列番号34、35及び61の配列を有する核酸;配列番号64の核酸など;又は
ii. 配列番号36、37及び61の配列を有する核酸;配列番号65の核酸など;又は
iii. 配列番号95、96及び61の配列を有する核酸;配列番号98の核酸など;又は
iv. 配列番号101、102及び61の配列を有する核酸;配列番号104の核酸など;又は
v. 配列番号95及び96の配列を有する核酸;又は
vi. 配列番号101及び102の配列を有する核酸;
vii. 配列番号34及び35の配列を有する核酸;又は
viii. 配列番号36及び37の配列を有する核酸
を含むか、又はそれからなる請求項13記載の核酸分子。 - 請求項13又は14による核酸分子、及びその発現を促進するために前記核酸と作用可能に結合された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチド分子。
- 請求項13若しくは14記載の核酸分子又は請求項15記載の組換えポリヌクレオチド分子又は請求項13若しくは14記載の核酸分子を含む発現ベクターを含む哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は細菌宿主細胞。
- 任意に、1以上の治療上許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせて、請求項6~12のいずれか一項記載の融合タンパク質、又は請求項13~15のいずれか一項記載の核酸分子若しくは組換えポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
- 血友病A、特に重症血友病Aの治療に使用するための、請求項1~12のいずれか一項記載の融合タンパク質、又は請求項13~15のいずれか一項記載の核酸分子若しくは組換えポリヌクレオチド、又は請求項17記載の医薬組成物。
- インビトロで細胞内のゲノムレベルでのDNA配列の反転の方法であって、本発明によるゲノム編集のための融合タンパク質を含み、
i. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第1のリコンビナーゼ酵素が、リコンビナーゼ標的部位の第1の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的な設計によって進化されており;
ii. 第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記第2のリコンビナーゼ酵素が、リコンビナーゼ標的部位の第2の半部位を特異的に認識するように指向性進化又は合理的設計によって進化されており;
iii. リンカーペプチドをコードする核酸分子を提供する工程、ここで、前記核酸が、6~30個のアミノ酸を含むリンカーオリゴペプチドをコードし;
iv. 第1のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子、第2のリコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子及びリンカーペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることによって発現ベクターを作製する工程;
v. 反転させるDNA配列を含む細胞に、工程iv)の発現ベクター、請求項6~12のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするRNA分子又は請求項6~12のいずれか一項記載の融合タンパク質を送達する工程;
vi. 前記細胞におけるヒト染色体上のDNA配列の反転工程
を含む、前記方法。 - 前記方法が、
v. a)第1のリコンビナーゼ酵素、第2のリコンビナーゼ酵素及びリンカーペプチドを含む融合タンパク質を発現させる工程をさらに含み、請求項19記載の方法の工程v.において、工程iv)の発現ベクター又は請求項6~12のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするRNA分子が、例えば、トランスフェクションによって前記細胞に送達される、請求項19記載の方法。 - 配列番号17の5'標的配列及び配列番号18の3'標的配列又はそれらの逆相補配列を含むloxF8リコンビナーゼ標的部位。
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