JP2023503738A - パラメータ推定を提供する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

方法を使用して、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）の光学系に対応するパラメータ値を提示するレポートを生成する。パラメータ値は、ＳＩＭ光学系で撮像された画像セットに対応する実行された変調計算に少なくとも部分的に基づく。最小ＦＷＨＭスライスは、第１の画像セット内の画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて特定される。パラメータ推定は、特定された最小ＦＷＨＭスライスに実行される。最良の合焦パラメータは、実行された推定に少なくとも部分的に基づいて特定される。セット内の各画像に対して位相推定が実行される。変調計算は、特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて実行される。レポートは、実行された変調計算に少なくとも部分的に基づく。

Description

（関連出願）
本出願は、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月６日に出願された、発明の名称が「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ」である米国仮特許出願第６２／９４４，６９２号に対する優先権を主張するものである。

このセクションで説明される主題は、単にこのセクションにおける言及の結果として、先行技術であると想定されるべきではない。同様に、このセクションで言及した問題、又は背景として提供された主題に関連する問題は、先行技術において以前に認識されていると想定されるべきではない。このセクションの主題は、単に、異なるアプローチを表し、それ自体はまた、特許請求される技術の実施態様に対応し得る。

構造化照明顕微鏡法（Structured illumination microscopy、ＳＩＭ）は、複数の低解像度の元画像から超解像画像を再構成するコンピュータイメージングアルゴリズムの部類である。復元を確実に成功させるために、元の生画像は高品質でなければならない。高品質の生画像は、イメージング器具の光学性能の慎重な調整、較正、及び診断を必要とする。従来のイメージング器具の特徴に加えて、ＳＩＭイメージング光学素子は、更なる特性化及び検証を必要とする追加の構成要素を有する。

ＳＩＭシステム内のイメージング光学素子及び関連する光学構成要素を用いて品質管理及び較正を促進するためのシステム及び方法、特に、ヌクレオチド配列などの生体試料を撮影するために使用されるＳＩＭシステムを提供することが所望され得る。本明細書では、既存の課題を克服し、本明細書に記載されるような利益を得るために、ＳＩＭを使用して撮像された画像を処理するためのデバイス、システム、及び方法が記載される。

実施態様は、複数の画像セットを受け取ることであって、複数の画像セットの各画像セットは、ある距離だけ被写体から離れて、光学系内の構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を使用して撮像された画像を含み、距離は、複数の画像セットの他の画像セットの画像が撮像された被写体からの距離とは異なり、複数の画像セットの各画像は、関連するチャネル及び関連する格子角度を有する、ことを含む方法に関連する。方法は、第１の画像セットを、第１の画像セットに対応する距離に少なくとも部分的に基づいて、複数の画像セットから分離することを更に含む。方法は、第１の画像セットの各画像に対応する半値全幅（full width at half maximum、ＦＷＨＭ）値を測定することを更に含む。方法は、第１の画像セットの画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することを更に含む。方法は、第１の画像セットに対応する、特定された最小ＦＷＨＭスライスに対するパラメータ推定を実行することを更に含む。方法は、第１の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することを更に含む。方法は、第１の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、特定された最良の合焦パラメータを記憶することを更に含む。方法は、第１の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することを更に含む。方法は、第１の画像セットに対応する特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することを更に含む。方法は、第１の画像セットに対応する実行された変調計算に少なくとも部分的に基づいて、光学系に対応するパラメータ値を提示するレポートを生成することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、第２の画像セットを、第２の画像セットに対応する距離に少なくとも部分的に基づいて、複数の画像セットから分離することを更に含む。方法は、第２の画像セットの各画像に対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）値を測定することを更に含む。方法は、第２の画像セットの画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することを更に含む。方法は、第２の画像セットに対応する、特定された最小ＦＷＨＭスライスにおいてパラメータ推定を実行することを更に含む。方法は、第２の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することを更に含む。方法は、第２の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、特定された最良の合焦パラメータを記憶することを更に含む。方法は、第２の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することを更に含む。方法は、第２の画像セットに対応する特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することを更に含む。生成されたレポートは、第１の画像セットに対応する実行された変調計算及び第２の画像セットに対応する実行された変調計算の組み合わせに少なくとも部分的に基づく。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、第１の画像セット内の各画像に対応するＦＷＨＭ値を測定することは、第１の画像セット内の各画像の中心推定ウィンドウ上で実行される。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、第１の画像セットに対応する特定された最小ＦＷＨＭスライスにおけるパラメータ推定を実行することは、特定された最小ＦＷＨＭスライスの中心推定ウィンドウ上で実行される。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、記憶された最良の合焦パラメータは、格子間隔又は格子角度のうちの一方又は両方を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、第１の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することは、Ｗｉｃｋｅｒの位相推定を実行することを含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、生成されたレポートは、表の形態である。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、パラメータ指定の既定のセットに対して、レポート内のパラメータを比較することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、レポート内のパラメータが、パラメータ指定の既定のセットから逸脱していると判定することと、レポート内のパラメータがパラメータ指定の既定のセットから逸脱しているとの判定に少なくとも部分的に基づいて、光学系の１つ以上の特徴を調整することと、を更に含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、複数の画像セットの各画像セットは１２個の画像を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、複数の画像の各画像は、第１の色チャネル及び第２の色チャネルからなる群から選択される関連付けられたチャネルを有し、複数の画像は、第１の色チャネルに対応する画像、及び第２の色チャネルに対応する画像を含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、複数の画像セットの各画像セットは、第１の色チャネルに対応する画像及び第２の色チャネルに対応する画像を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、複数の画像の各画像は、第１の格子角度及び第２の格子角度からなる群から選択される関連する格子角度を有し、複数の画像は、第１の格子角度に対応する画像、及び第２の格子角度に対応する画像を含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、複数の画像セットの各画像セットは、第１の格子角度に対応する画像、及び第２の格子角度に対応する画像を含む。

本概要の先行する２つの段落のいずれかに記載されたものなどの方法の実施態様において、方法は、複数の画像を撮像することを更に含む。方法は、複数の画像を撮像している間に、光源を、１つ以上の位相マスクに対して第１の位置から第２の位置に移動させるか、又は１つ以上の位相マスクを、光源に対して第１の位置から第２の位置に移動させることのいずれか一方を更に含み、第１の位置は、第１の格子角度を提供し、第２の位置は、第２の格子角度を提供する。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、第１の画像セット内の各画像に対応するＦＷＨＭ値を測定することは、第１の画像セット内の各画像に対応する各格子角度についての未加工かつ未再構成のゼロ値位相を使用して実行される。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、生成されたレポートは、光学系内の対物レンズと被写体との間の距離、複数の画像の各画像に対応するチャネル、角度指数、変調、ＦＷＨＭ値、格子間隔、及び格子角度からなる群から選択されるパラメータ値を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、複数の画像セットを撮像することを更に含む。複数の画像セットを撮像することは、光学系の対物レンズが被写体から第１の距離に位置付けられている間に、第１の画像セットを撮像することを含む。複数の画像セットを撮像することは、光学系の対物レンズが被写体から第２の距離に位置付けられている間に、第２の画像セットを撮像することを更に含む。複数の画像セットを撮像することは、光学系の対物レンズが被写体から第３の距離に位置付けられている間に、第３の画像セットを撮像することを更に含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、変調計算は、第１の画像セット内の画像に対応する縞パターンの配向及び周期性を含む因子を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、被写体は、ヌクレオチドを含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、第１の画像セットの画像のペア間の位相シフトを計算することを更に含み、画像ペアの各画像ペアは、チャネル及び格子角度を共有する。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、生成されたレポートは、計算された位相シフトを含む。

本概要の２つの先行する段落のいずれかにおいて記載されたもののうちのいずれかなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、計算された位相シフトを、位相シフトの所定範囲に対して比較することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが、位相シフトの所定範囲外であると判定することを更に含む。方法は、計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが位相シフトの所定範囲外であると判定することに応答して、位相シフトの所定範囲外である位相シフトを補正するゲイン値を計算することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、計算されたゲイン値に少なくとも部分的に基づいて新規位相シフト電圧を確立することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、新規位相シフト電圧を圧電素子に印加することであって、圧電素子は、光学系内で位相シフトを提供する、ことを更に含む。方法は、新規位相シフト電圧が圧電素子に印加された新しい画像セットを撮像することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、新しい画像セットの画像のペア間の位相シフトを計算することを更に含み、画像ペアの各画像ペアは、チャネル及び格子角度を共有する。方法は、新しい画像の計算された位相シフトを、位相シフトの所定範囲と比較することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、新しい画像の計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが、位相シフトの所定範囲外であると判定することを更に含む。方法は、新しい画像の計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが位相シフトの所定範囲外であると判定することに応答して、更新されたゲイン値を計算して、位相シフトの所定範囲外である新しい画像の位相シフトを補正することを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの方法のいくつかの実施態様において、方法は、計算された更新されたゲイン値に少なくとも部分的に基づいて、追加の新規位相シフト電圧を確立することを更に含む。

いくつかの実施態様では、装置は、構造化照明を標的に向けて発する第１の光学アセンブリを備える。第１の光学アセンブリは、発光アセンブリと、発光アセンブリによって発せられた光に第１のパターンを付与する第１の位相マスクと、発光アセンブリによって発せられた光に第２のパターンを付与する第２の位相マスクと、第１の位相マスク及び第２の位相マスクによって構造化された光の位相を調整する位相調整アセンブリと、を含む。装置は、第２の光学アセンブリを更に備える。第２の光学アセンブリは、第１の光学アセンブリによって照明したときに、標的の画像を撮像する画像センサを含む。装置は、プロセッサを更に備える。プロセッサは、複数の画像セットを受け取ることとなり、複数の画像セットの各画像セットは、ある距離だけ被写体から離れて、第２の光学アセンブリを使用して撮像された画像を含み、距離は、複数の画像セットの他の画像セットの画像が撮像された被写体からの距離とは異なり、複数の画像の各画像は、関連するチャネル及び関連する格子角度を有する。プロセッサは更に、第１の画像セットを、第１の画像セットに対応する距離に少なくとも部分的に基づいて、複数の画像セットから分離することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットの各画像に対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）値を測定することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットの画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットに対応する、特定された最小ＦＷＨＭスライスに対するパラメータ推定を実行することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットに対応する実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、特定された最良の合焦パラメータを記憶することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットに対応する特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することとなる。プロセッサは更に、第１の画像セットに対応する実行された変調計算に少なくとも部分的に基づいて、光学系に対応するパラメータ値を提示するレポートを生成することとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、標的は、試料容器を含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、標的は、試料容器内の生体試料を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、発光アセンブリは、少なくとも２つのチャネルにおいて光を発することとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、少なくとも２つのチャネルは、少なくとも２つの色を含み、少なくとも２つの色の各色は、少なくとも２つのチャネルの対応するチャネルに対応している。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、第１の光学アセンブリは、格子切り替え部を更に含み、格子切り替え部は、発光アセンブリから発せられた光を第１の位相マスク又は第２の位相マスクに向けて選択的に方向付けるか、又は許容する。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、格子切り替え部は、少なくとも１つの可動反射要素を含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、格子切り替え部は、可動反射要素を支持する回転可能プレートを更に含み、回転可能プレートは回転可能であり、それによって反射要素を第１の位相マスク又は第２の位相マスクに関連して選択的に位置付け、それによって、発光アセンブリから発せられた光を第１の位相マスク又は第２の位相マスクに向かって選択的に方向付けるか、又は許容する。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、位相調整アセンブリは、可動反射要素を含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、位相調整アセンブリは、可動反射要素を移動させるためのアクチュエータを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、アクチュエータは、線形経路に沿って可動反射要素を移動させることとなる。

本概要の２つの先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、アクチュエータは圧電素子を含む。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、プロセッサは更に、第１の画像セットの画像のペア間の位相シフトを計算することとなり、画像ペアの各画像ペアがチャネル及び格子角度を共有する。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、プロセッサは更に、計算された位相シフトを、位相シフトの所定範囲に対して比較することとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、プロセッサは更に、計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが、位相シフトの所定範囲外であると判定することとなる。プロセッサは更に、計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが位相シフトの所定範囲外であると判定したことに応答して、位相シフトの所定範囲外である位相シフトを補正するためのゲイン値を計算することとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、プロセッサは更に、計算されたゲイン値に少なくとも部分的に基づいて新規位相シフト電圧を確立することとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、位相調整アセンブリは、第１の位相マスク及び第２の位相マスクによって構造化された光の位相を調整する圧電素子を含み、新規位相シフト電圧は、圧電素子を作動させて、値の所定範囲に近い位相シフトを提供する。

本概要の先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施態様において、装置は、予め形成された光学パターンを含む標的デバイスを更に備える。標的デバイスは、第１の光学アセンブリが、予め形成された光学パターンに向けて構造化照明を発することを可能にすることとなる。標的デバイスは、第１の光学アセンブリによって照明したときに、画像センサが、予め形成された光学パターンの画像を撮像することを更に可能にすることとなる。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、予め形成された光学パターンはドットのアレイを含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、アレイのドットは、不規則な配置で位置付けられている。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、アレイのドットは、少なくとも所定の最小間隔距離だけ互いから離間されている。

本概要の４つの先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施形態において、予め形成された光学パターンは、少なくとも１つの線ペアを含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、第１の位相マスクの第１のパターンは、第１のセットの線を含む。第２の位相マスクの第２のパターンは、第２のセットの線を含む。少なくとも１つの線ペアの線は、第１のセットの線の線に対して、かつ第２のセットの線の線に対してオフ－アングル（off-angle）であるように配置される。

本概要の６つの先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施形態において、標的デバイスは、第１の光学アセンブリからの光に応答して、蛍光を発することとなる流体を含有する流体充填チャネルを更に含む。

本概要の先行する段落に記載されたものなどの装置のいくつかの実施態様において、流体充填チャネルは、およそ２μｍ～およそ１０μｍの深さを有する。

本概要の６つの先行する段落のいずれかに記載されたもののうちのいずれかなどの装置のいくつかの実施形態において、流体充填チャネルは、およそ３μｍの深さを有する。

いくつかの実施態様では、プロセッサ可読媒体は、本概要の先行する段落のいずれかに記載されている方法のうちの任意の１つ以上の方法を実行することによって、コンピューティングシステムにデータを処理させるように構成されているコンテンツを含む。

本明細書でより詳細に考察される前述の概念及び追加の概念の全ての組み合わせが（かかる概念が相互に矛盾しないならば）、本明細書に開示される発明の主題の一部と考えられ、本明細書に記載される便益及び利点を実現すると考えられることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられる。

１つ以上の実施態様の詳細が、添付の図面及び以下の説明に記載される。他の特徴、態様、及び利点は、本明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

１次元（one-dimensional、１Ｄ）変調を伴う格子を使用することによるモアレ縞形成の一例を示す図である。

２次元（two-dimensional、２Ｄ）構造化照明パターンによって生成された照明強度のグラフ的表示である。

ナノウェル配列の幾何学的パターンの例を示す図である。

空間的に構造化された励起光を利用して、試料を撮像することができるＳＩＭ生体試料イメージングシステムの概略図である。

図２のＳＩＭ生体試料イメージングシステムでの使用のための代替的な光学アセンブリの一例の概略図である。

図３の光学アセンブリの位相マスクアセンブリの概略図である。

第１の状態の格子切り替え部及び第１の状態の調整可能な反射要素を有する、図３の光学アセンブリの概略図である。

第１の状態の格子切り替え部及び第２の状態の調整可能な反射要素を有する、図３の光学アセンブリの概略図である。

第２の状態の格子切り替え部及び第１の状態の調整可能な反射要素を有する、図３の光学アセンブリの概略図である。

第２の状態の格子切り替え部及び第２の状態の調整可能な反射要素を有する、図３の光学アセンブリの概略図である。

拡大レンズの歪みに起因して屈曲する平行線の簡略図である。

名目上平行線間の間隔の波長に対してなされた第１のセットの測定値を示すチャートである。

名目上平行線間の間隔の波長に対してなされた第２のセットの測定値を示すチャートである。

全視野（field of view、ＦＯＶ）画像のサブタイル又はサブフィールドの例を示す図である。

ＳＩＭイメージングシステムにおける品質管理チェックのプロセスの一例のフローチャートである。

ＳＩＭイメージングシステムにおける位相較正のためのプロセスの一例のフローチャートである。

非ＳＩＭイメージングシステムにおける使用のための専用標的デバイスの光学パターンを示す図である。

ＳＩＭイメージングシステムにおける使用のための専用標的デバイスの光学パターンを示す図である。

ＳＩＭイメージングシステムにおける強め合いの干渉及び弱め合いの干渉によって得ることができる様々な光強度の例を示すグラフである。

オン－アングル（on-angle）の構造化照明パターンの強度プロファイルの一例を示す図である。

オフ－アングル（off-angle）の構造化照明パターンの強度プロファイルの一例を示す図である。

様々な厚さの流体チャネルのＳＩＭイメージングによる再結像（ｒｅｉｍａｇｅ）された変調信号を示すプロットである。

図の一部又は全ては、例示の目的のための概略図であることが認識されるであろう。図面は、特許請求の範囲の範囲又は意味を制限するために使用されないことを明確に理解した上で、１つ以上の実施態様を例示する目的で提供される。

いくつかの態様では、本明細書では、ＳＩＭシステム、特に、ヌクレオチド配列などの生体試料を撮影するために使用されるＳＩＭシステム内のイメージング光学素子及び関連する光学構成要素を用いた品質管理及び較正を促進するための方法及びシステムが開示される。

ヌクレオチド配列などの生体試料を撮影する文脈において、ＳＩＭは、数百万もの試料点からの蛍光信号を有するフローセルから、密に充填された試料を分解する能力を提供し、それによって、処理に必要な試薬を低減し、画像処理スループットを増大させることができる。場合によっては、ＳＩＭは、隣接する光源を分解するためのアッベ回折限界よりも密に充填されている蛍光試料の解像を可能にし得る。生体試料は、フローセル上の規則的に間隔を空けたナノウェル内にあってもよく、又はランダムに分布したクラスタ内にあってもよい。隣接するナノウェルは、関連する光学系のアッベ回折限界よりも近接して位置付けられてもよい。本実施例は、フローセルのナノウェル上の生体試料に関する一方、本明細書の教示は、様々な他の構成の生体試料、及びＳＩＭを用いる他の種類のシステムにおける生体試料に適用されてもよい。したがって、本明細書の教示は、生体試料の撮影に必ずしも限定されない。

Ｉ．序論

構造化照明は、通常の照明による場合の数倍の分解された照明源を有する画像を生成することができる。構造化照明の角度及び位相変位を変化させた複数の画像を使用して、密集した、言い換えれば、分解不能な高域空間周波数特徴部を、アッベ回折限界に違反することなく光学系によって感知され得る低周波数信号に変換する。この限界は、光及び光学の性質によってイメージングに物理的に課され、最終対物レンズの放射波長と開口数（numerical aperture、ＮＡ）との関数として表される。ＳＩＭ再構成を適用することにより、複数の画像からの情報が空間領域からフーリエ領域に変換され、組み合わされ、処理され、次いで、改善された画像に再構成される。ＳＩＭシステム及び方法で処理されるより低解像度の元画像のセットは、「ＳＩＭスタック」として定義され得る。それぞれのＳＩＭスタックにおける画像は、撮影された素材に対して、対応するｚ位置又は距離に位置する対物レンズにより取得され得る。同じ素材からいくつかのＳＩＭスタックを取得することができ、それぞれのＳＩＭスタックは、同じ素材の他のＳＩＭスタックのｚ位置とは異なるｚ位置を有する。

ＳＩＭでは、格子が使用されるか、又は照明源と試料との間に干渉パターンが生成されて、正弦関数又は余弦関数に従って強度が変化するパターンなどの照明パターンを生成する。ＳＩＭの文脈では、「格子」は、構造化照明パターンを生成する表面に加えて、投影された構造化照明パターンを指すために使用される場合がある。あるいは、構造化照明パターンは、分離コヒーレントビームの部分間の干渉パターンとして生成されてもよい。

例えば、図１に示されるような試料平面上への構造化照明の投影は、試料中の蛍光（又は反射）源と照明パターンを混合して、モアレ縞又はエイリアシングと呼ばれる場合がある新たな信号を誘導する。新しい信号は、高域空間周波数情報を、アッベ回折限界に違反することなく撮像され得るより低域空間周波数にシフトさせる。

図１Ａに示すような１Ｄ強度変調パターン、又は図１Ｂに示すような２Ｄ強度変調パターンで照射された試料の画像を撮像後、モアレ縞又はエイリアシングの複数の画像から、より高域空間周波数からより低域空間周波数にシフトされた情報を含有する新たな信号の一部分を抽出するために、連立一次方程式が解かれ、使用される。

連立一次方程式を解くために、段階的にシフト又は変位された構造化照明パターンを用いて、いくつかの画像が撮像される。角度ごとの様々な位相の画像が、分析のために撮像され、次いでフーリエ領域のシフト及び再結合のために帯域によって分離され得る。画像の数を増やすと、信号対雑音比を高めることによって、再構成された画像の品質を向上させることができる。しかしながら、計算時間もまた増加する場合がある。帯域分離された画像のフーリエ表示をシフトさせ、合計して、再構成和を生成する。最終的に、逆高速フーリエ変換（Fast Fourier Transform、ＦＦＴ）が、再構成和から新しい高解像度画像を再構成する。

１Ｄ変調された照明の標準アルゴリズムは、２Ｄ変調された照明パターンと共に使用される場合、修正を伴い得る。これは、２Ｄ帯域分離を伴うことができる照明ピークの間隔及び照明ピーク角度の推定を含み得る。修正はまた、２次元の位相を推定するために、（１つの点ではなく）２つの点から作用するＷｉｃｋｅｒ位相推定も含み得る。１Ｄ干渉パターンは、図１Ａに示すような１次元回折格子によって、又は２つのビームの干渉パターンの結果として生成されてもよい。場合によっては、試料の撮影中、試料の縞パターンの３つの画像が、様々なパターン相（例えば、０°、１２０°、及び２４０°）で取得され、その結果、試料上のそれぞれの場所がある照明強度の範囲にさらされる。この手順は、光軸を中心にパターン配向を２つ（例えば、４５°、１３５°）又は３つ（例えば、０°、６０°及び１２０°）の別個の角度に回転させることによって繰り返される。

図１Ｂは、２Ｄ回折格子によって、又は二対のコヒーレント光ビームの干渉によって生成され得る強度分布を示す。具体的には、２Ｄ構造化照明は、互いに重ね合わされた２つの直交する１Ｄ回折格子によって形成されてもよい。１Ｄ構造化照明パターンの場合と同様に、２Ｄ照明パターンは、２Ｄ回折格子の使用、又は規則的に反復する縞パターンを生成する二対のコヒーレント光ビーム間の干渉のいずれか一方によって生成され得る。２つの光ビームは、ｙ軸に沿う強度パターン（水平輝線及び暗線）を生成し、それ故に、ｙ対の入射ビームと称される。２つのより多くの光ビームは、ｘ軸に沿う強度パターン（垂直輝線及び暗線）を生成し、ｘ対の入射ビームと称される。ｙ対の、ｘ対の光ビームへの干渉は、２Ｄ照明パターンを生成する。図１Ｂは、このような２Ｄ照明パターンの強度分布を示す。

図１Ｃは、矩形の角部に位置付けられたフローセルの表面におけるナノウェル１０の配置を示す。図１Ｃはまた、ナノウェル１０上に投影された構造化照明の縞パターンの線２０を示す。図示される例では、線２０は、ナノウェル１０のアライメントに対してわずかに角度的にオフセットされており、その結果、線２０は、ナノウェル１０の行ともナノウェル１０の列とも完全に位置合わせされていない（又は平行ではない）。あるいは、線２０は、ナノウェル１０の列若しくは行のアライメントと、又はナノウェル１０の他の空間的配置と任意の他の好適な空間的関係を有してもよい。１Ｄ構造化照明を使用するとき、照明のピーク角度は、画像が矩形の対角線方向に対向する角部を接続する直線に沿って撮影されるように選択される。例えば、３個の画像の２個のセット（合計６つの画像）を、＋４５度及び－４５度の角度で撮影することができる。対角線に沿う距離が矩形の任意の２つの辺の間の距離よりも長くなるにつれて、より高い解像度画像が得られる。ナノウェル１０は、六角形などの他の幾何学的配置に配置されてもよい。次いで、３個以上の画像を六角形の３個の対角線のそれぞれに沿って撮影することができ、例えば、９個又は１５個の画像が得られる。

ＩＩ．用語

構造化照明パラメータについて言及するために本明細書で使用する際、用語「周波数」は、周波数及び周期が逆相関するため、構造化照明パターン（例えば、縞パターン又は格子パターン）の縞と縞との間、又は線と線との間の間隔の逆数を指すものとする。例えば、縞と縞との間の間隔がより大きいパターンは、縞と縞との間の間隔がより小さいパターンよりも低い周波数を有することとなる。

構造化照明パラメータについて言及するために本明細書で使用する際、用語「位相」は、試料を照明する構造化照明パターンの位相を指すものとする。例えば、照明された試料に対して構造化照明パターンを並進移動させることによって、位相を変更することができる。

構造化照明パラメータについて言及するために本明細書で使用する際、用語「配向」は、構造化照明パターン（例えば、縞パターン又は格子パターン）とパターンによって照明される試料との間の相対的な配向を指すものとする。例えば、照明された試料に対して構造化照明パターンを回転させることによって、配向を変更することができる。

構造化照明パラメータについて言及するために本明細書で使用する際、用語「予測する」又は「予測している」は、（ｉ）パラメータを直接測定することなくパラメータの（複数の）値を算出するか、又は（ｉｉ）パラメータに対応する撮像画像からパラメータを推定するかのいずれか一方を意味するものとする。例えば、構造化照明パターンの位相は、時間ｔ２及び時間ｔ３において（例えば、撮像された位相画像から）直接測定又は推定された位相値間の補間によって、時間ｔｌにおいて予測され得る（ｔ２＜ｔｌ＜ｔ３）。別の例として、構造化照明パターンの周波数は、時間ｔ２及び時間ｔ３において、（例えば、撮像された位相画像から）直接測定又は推定された周波数値から外挿することによって、時間ｔｌにおいて予測され得る（ｔ２＜ｔｌ＜ｔ３）。

回折格子によって回折された光について言及するために本明細書で使用する際、用語「次」又は「次数」は、強め合いの干渉に対する回折格子の隣接するスリット又は構造からの光の経路長差を表す整数の波長の数を意味するものとする。反復する一連の格子構造又は他のビーム分割構造上の入射光ビームの相互作用は、光ビームの一部分を元のビームから予測可能な角度方向に再方向付けるか又は回折することができる。用語「０次」又は「０次最大」は、回折格子によって発せられた回折のない中央の明るい縞を指すものとする。用語「１次」は、経路長差が±１波長である、０次の縞の両側に回折される２つの明るい縞を指すものとする。より高次の次数は、元のビームからより大きい角度に回折される。格子の特性は、様々な次数に方向付けられるビーム強度の大きさを制御するように操作され得る。例えば、位相格子は、非０次の送信を最大化し、０次ビームの送信を最小化するように作製されてもよい。

本明細書で使用する際、用語「光学伝達関数」、又は省略形「ＯＴＦ」は、空間周波数の関数としてのイメージングシステムの応答を説明する複素数値伝達関数を意味するものとする。ＯＴＦは、点広がり関数のフーリエ変換から導出することができる。本明細書に記載された例では、ＯＴＦの振幅部分のみが重要である。ＯＴＦの振幅部分は、「変調伝達関数」と称されてもよく、又は省略形「ＭＴＦ」と称されてもよい。

試料について言及するために本明細書で使用する際、用語「特徴」は、相対場所に従って他の点又は他のエリアと区別することができるパターンの点又はエリアを意味するものとする。個々の特徴は、特定の種類の１つ以上の分子を含むことができる。例えば、特徴は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含むことができ、あるいは特徴は、同一の配列（及び／又はその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含むことができる。

本明細書で使用する際、用語「ｘｙ平面」は、デカルト座標系における直線軸ｘ及びｙによって定義される２次元エリアを意味するものとする。検出器及び検出器によって観察される物体に関連して使用される場合、ビーム軸、又は検出器と検出されている物体との間の観測方向に直交しているとしてエリアを更に指定することができる。

本明細書で使用する際、用語「ｚ座標」は、デカルト座標系におけるｘｙ平面に直交する軸線に沿う点、線、又はエリアの場所を特定する情報を意味するものとする。特定の別の実施態様では、ｚ軸は、検出器によって観察される物体の領域に直交する。例えば、光学系の焦点の方向は、ｚ軸に沿って指定されてもよい。

本明細書で使用する際、用語「光学的に結合された」は、別の要素に直接的に又は間接的に光を付与するように適合されている１つの要素を指すものとする。

本明細書で使用する際、単数形で記載され、かつ単語「ａ」又は「ａｎ」に続く要素又は工程は、かかる除外が明示的に記載されていない限り、複数のこれらの要素又は工程を除外しないものとして理解されるべきである。更に、「１つの実施態様」への言及は、また記載された特徴を組み込む追加の実施態様の存在を除外するものとして解釈されることを意図するものではない。更に、反対に明示的に述べられていない限り、特定の特性を有する要素又は複数の要素を「含む」又は「有する」実施態様は、それらがその特性を有するかどうかにかかわらず、追加の要素を含み得る。

本明細書全体を通して使用される用語「実質的に」、「約」、及び「およそ」は、処理のばらつきなどによる小さな変動を説明及び考慮するために使用される。例えば、それらの用語は、±５％以下を、±２％以下など、±１％以下など、±０．５％以下など、±０．２％以下など、±０．１％以下など、±０．０５％以下などとして称することができる。

用語「基づいて」は、「基づいて」いるとして示されているものによって少なくとも部分的に何かが決定されることを意味すると理解されるべきである。何かが何か他のものによって必ずしも完全に決定されなければならないことを示すために、それが完全に決定されるいかなるものに排他的に基づいているとして記載されている。

本明細書で使用する際、用語「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」は、文脈に応じて、ポリヌクレオチド分子、並びに分子の下にある配列を含むように読み取られるべきである。ポリヌクレオチドの配列は、特定の物理的特性を示す情報を含有する（又はコードする）ことができる。

ＩＩＩ．イメージングシステムの構成要素及び配置の例

ＳＩＭシステムのいくつかの実施態様では、線形偏光ビームは、ビームを２つ以上の別個の次数に分割する光学ビームスプリッタによって方向付けられ、２つ以上の別個の次数は、合成され、正弦波強度変動を有する干渉縞パターンとして、撮影された試料上に投影され得る。分割されたビームは、試料平面における最大変調を得るためにパワーが均等である。回折格子は、高度の干渉性及び安定した伝搬角度を有するビームを生成することができるビームスプリッタの例である。２つのかかるビームが組み合わされると、かかるビーム間の干渉は、干渉ビーム間の角度を含む因子によって間隔が決定される均一な規則的な反復縞パターンを作り出すことができる。縞の周期性（fringe periodicity、ＦＰ）と入射角（Θ）と光の波長（λ）との間の関係は、以下の式（Ｉ）で表すことができる。
ＦＰ＝λ÷２ｓｉｎ（θ）、 （Ｉ）
縞の周期（ＦＰ）及び光の波長（λ）は、同じ単位（例えば、ｎｍ）であり、Θは、ラジアンで表される面法線に対する入射角である。

図２～図４Ｂは、ＳＩＭイメージングシステムが取り得る様々な形態の例を示す。これらのシステムは、主に、１Ｄ照明パターンを生成するＳＩＭイメージングシステムとの関連で説明されているが、本明細書に開示された技術は、より高次元の照明パターン（例えば、２次元格子パターン）を生成するＳＩＭイメージングシステムが実装されてもよいことに留意されたい。

図２は、本明細書に記載されるいくつかの実施態様による、構造化照明パラメータの予測を実装することができるＳＩＭイメージングシステム１００を示す。例えば、システム１００は、空間的に構造化された励起光を利用して生体試料を撮影する構造化照明蛍光顕微鏡システムであってもよい。

図２の例では、発光体１５０は、コリメーションレンズ１５１によってコリメートされた光ビームを出力するように構成されている。コリメートされた光は、光構造化光学アセンブリ１５５によって構造化（パターン化）され、対物レンズ１４２を介してダイクロイックミラー１６０によって、移動ステージ１７０上に位置付けられている試料容器１１０の試料に方向付けられる。蛍光試料の場合、試料は構造化励起光に応答して蛍光を発し、得られた光は、対物レンズ１４２によって収集され、蛍光を検出するためにカメラシステム１４０の画像センサに向けられる。

光構造化光学アセンブリ１５５は、試料容器１１０の試料に投影される光のパターン（例えば、縞、典型的には正弦波）を生成するための１つ以上の光回折格子又は他のビーム分割要素（例えば、ビームスプリッタキューブ又はプレート）を含む。回折格子は、１次元透過型格子若しくは１次元反射型格子又は２次元透過型格子若しくは２次元反射型格子であってもよい。回折格子は、正弦波振幅格子又は正弦波位相格子であってもよい。いくつかの変形例では、光構造化光学アセンブリ１５５は、一対の位相マスクを含み、それぞれの位相マスクは、ガラスにエッチングされた目盛りを有するガラス片を含む。

いくつかの実施態様では、（複数の）回折格子は、構造化照明パターンの配向を変更するための回転ステージを利用しなくてもよい。他の実施態様では、（複数の）回折格子は、回転ステージに取り付けられてもよい。いくつかの実施態様では、回折格子は、イメージングシステムの動作中に固定されてもよい（すなわち、回転運動又は線形運動を必要としない）。例えば、以下に更に記載される特定の実施態様では、回折格子は、互いに垂直に配向された２つの固定された１次元透過回折格子（例えば、水平回折格子及び垂直回折格子）を含んでもよい。

図２の例に示されるように、光構造化光学アセンブリ１５５は、０次を含む全ての他の次数を遮断又は最小化しながら、１次の回折光ビームを出力する。しかしながら、代替的な実施態様では、更なる次数の光を試料に投影することができる。

それぞれの撮影周期中、イメージングシステム１００は、光構造化光学アセンブリ１５５を利用して、様々な位相で複数の画像を取得し、縞パターンは、変調方向に横方向に（例えば、ｘ－ｙ平面内で、かつ縞に対して垂直に）変位される。この手順は、光軸を中心に（すなわち、試料のｘ－ｙ平面に対して）パターン配向を回転させることによって、１回以上繰り返される。次いで、撮像された画像をコンピュータ的に再構成して、より高い解像度画像（例えば、個々の画像の横方向空間分解能の約２倍を有する画像）を生成し得る。

システム１００では、発光体１５０は、非コヒーレント発光体（例えば、１つ以上の励起ダイオードによって出力された光ビームを発する）、又は１つ以上のレーザ若しくはレーザーダイオードによって出力される光のエミッタなどのコヒーレント発光体であってもよい。システム１００の例において示されるように、発光体１５０は、出力される光学ビームを案内するための光ファイバ１５２を含む。しかしながら、発光体１５０の他の構成が使用されてもよい。マルチチャネルイメージングシステム（例えば、光の複数の波長を利用するマルチチャネル蛍光顕微鏡）において構造化照明を利用する実施態様では、光ファイバ１５２は、複数の異なる光源（図示せず）に光学的に結合することができ、各光源は様々な波長の光を発する。システム１００は、いくつかの実施態様では、単一の発光体１５０を有するものとして図示されているが、複数の発光体１５０を備えてもよい。例えば、複数の発光体は、以下で更に説明する複数のアームを利用する構造化照明イメージングシステムの場合に備えられてもよい。

いくつかの実施態様では、システム１００は、構造化ビームの形状及び経路を調整するために、ｚ軸に沿って関節運動するレンズ素子を含んでもよい投影レンズ１５６を含んでもよい。例えば、投影レンズ１５６の構成要素は、容器１１０内の試料の試料の厚さの範囲（例えば、様々なカバーガラスの厚さ）を考慮するように関節運動してもよい。

システム１００の例では、流体送達モジュール又はデバイス１９０は、試薬の流れ（例えば、蛍光標識されたヌクレオチド、緩衝剤、酵素、開裂試薬など）を試料容器１１０及び廃棄物バルブ１２０に向けることができ（、かつ通過させることができ）る。試料容器１１０は、試料が上に提供される１つ以上の基材を含んでもよい。例えば、多数の様々な核酸配列を分析するためのシステムの場合、試料容器１１０は、配列決定される核酸が上で結合、付着、又は会合する１つ以上の基材を含んでもよい。基材としては、例えば、ガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、及びシリコンウェハなどの、核酸が付着され得る任意の不活性基材又は基質が挙げられ得る。いくつかの用途では、基材は、試料容器１１０にわたってマトリックス又はアレイに形成された複数の場所におけるチャネル内又は他のエリア内にある。システム１００はまた、試料容器１１０内の流体の状態の温度を任意に調節し得る温度ステーションアクチュエータ１３０及び加熱器／冷却器１３５を備えてもよい。

特定の実施態様では、試料容器１１０は、透明カバープレート、基材、及び透明カバープレートと基材との間に収容された液体を含むパターン化フローセルとして実装されてもよく、生体試料は、透明カバープレートの内側表面又は基材の内側表面に位置してもよい。フローセルは、多数（例えば、何千個、何百万個、若しくは何十億個）の（ナノウェルとも称される）ウェル、又は基材内に、画定されたアレイ（例えば、六角形アレイ、矩形アレイなど）にパターン化されている領域を含んでもよい。各領域は、例えば、合成による配列決定を使用して配列決定され得るＤＮＡ、ＲＮＡ、又は別のゲノム材料などの生体試料のクラスタ（例えば、モノクローナルクラスタ）を形成してもよい。フローセルは、多数の離間したレーン（例えば、８つのレーン）に更に分割されてもよく、各レーンは、クラスタの六角形アレイを含む。

試料容器１１０は、対物レンズ１４２に対する試料容器１１０の移動及び位置合わせを提供するように、試料ステージ１７０に取り付けられてもよい。試料ステージは、３次元のいずれかで移動することを可能にする１つ以上のアクチュエータを有してもよい。例えば、デカルト座標系の観点から、ステージが対物レンズに対してｘ方向、ｙ方向、及びｚ方向に移動することを可能にするアクチュエータが提供されてもよい。これにより、試料容器１１０上の１つ以上の試料の場所が対物レンズ１４２と光学的に位置合わせされて位置付けられることを可能にし得る。対物レンズ１４２に対する試料ステージ１７０の移動は、試料ステージ自体、対物レンズ、イメージングシステムのいくつかの他の構成要素、又は前述の任意の組み合わせを移動させることによって達成され得る。更なる実施態様はまた、静止試料の上でイメージングシステム全体を移動させることを含んでもよい。あるいは、試料容器１１０は、撮影中に固定されてもよい。

いくつかの実施態様では、（典型的にはｚ軸又はｚ方向と称される）焦点方向における試料容器１１０に対する光学構成要素の位置決めを制御するように、フォーカス（ｚ軸）構成要素１７５が含まれてもよい。フォーカス構成要素１７５は、光学ステージ若しくは試料ステージ又はその両方に物理的に連結された１つ以上のアクチュエータを含んで、光学構成要素（例えば、対物レンズ１４２）に対して試料ステージ１７０上の試料容器１１０を移動させて、撮影動作のための適切な焦点合わせを提供することができる。例えば、アクチュエータは、例えば、ステージとの直接的又は間接的な、機械的接続、磁気的接続、流体的接続、若しくは他の接続又は接触によって、それぞれのステージに物理的に連結されてもよい。１つ以上のアクチュエータは、試料ステージを同一の平面内に維持しながら（例えば、光軸に垂直なレベル又は水平姿勢を維持しながら）、ｚ方向にステージを移動させるように構成されてもよい。１つ以上のアクチュエータはまた、ステージを傾けるように構成されてもよい。これは、例えば、試料容器１１０が、表面における任意の傾斜を考慮するように動的に平坦化され得るようになされる。

撮影されている試料の場所における試験試料から生じる構造化された光は、ダイクロイックミラー１６０によってカメラシステム１４０の１つ以上の検出器に向けられ得る。いくつかの実施態様では、１つ以上の発光フィルタを有するフィルタ切り替えアセンブリ１６５が含まれてもよく、１つ以上の発光フィルタを使用して、特定の発光波長を通過させ、他の発光波長を遮断（又は反射）することができる。例えば、１つ以上の発光フィルタを使用して、イメージングシステムの異なるチャネル間を切り替えることができる。特定の実施態様では、発光フィルタは、様々な波長の発光をカメラシステム１４０の様々な画像センサに方向付けるダイクロイックミラーとして実装されてもよい。

カメラシステム１４０は、試料容器１１０の撮影（例えば、配列決定）を監視及び追跡するための１つ以上の画像センサを含んでもよい。カメラシステム１４０は、例えば、電荷結合素子（charge-coupled device、ＣＣＤ）画像センサカメラとして実装されてもよいが、他の画像センサ技術（例えば、アクティブピクセルセンサ）が使用されてもよい。カメラシステム１４０及び関連する光学構成要素は、図２の試料容器１１０の上方に位置付けられるものとして示されているが、１つ以上の画像センサ又は他のカメラ構成要素は、本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなるであろう多数の他の方法でシステム１００に組み込まれてもよい。例えば、１つ以上の画像センサは、試料容器１１０の下に位置付けられてもよく、又は試料容器１１０内に一体化されてもよい。

カメラシステム１４０からの出力データ（例えば、画像）は、ソフトウェアアプリケーションとして実装され得るリアルタイムＳＩＭイメージング部品１９１に伝達されてもよく、このソフトウェアアプリケーションは、以下で更に説明するように、各撮影周期に撮像された画像を再構成して、より高い空間分解能を有する画像を生成することができる。再構成された画像は、経時的に予測される構造照明パラメータの変化を考慮することができる。加えて、ＳＩＭイメージング部品１９１を使用して、予測ＳＩＭパラメータを追跡し、かつ／又は以前の推定及び／若しくは予測ＳＩＭパラメータを与えたＳＩＭパラメータを予測することができる。

コントローラ１９５は、システム１００の多様な光学構成要素を同期させることを含む、構造化照明イメージングシステム１００の動作を制御するために提供され得る。コントローラを実装して、例えば、光構造化光学アセンブリ１５５の構成（例えば、回折格子の選択及び／又は線形並進）、投影レンズ１５６の動き、フォーカス構成要素１７５の作動、ステージの移動、及び撮影操作などのシステム動作の態様を制御することができる。コントローラを実装して、システム１００のハードウェア要素を制御して、経時的な構造化照明パラメータの変化を補正することもできる。例えば、コントローラは、光構造化光学アセンブリ１５５、移動ステージ１７０、又はシステム１００のいくつかの他の要素の構成を制御するモータ又は他のデバイスに制御信号を送信して、経時的な構造化照明の位相、周波数、及び／又は配向の変化を補正又は補償するように構成されてもよい。実施態様では、これらの信号は、ＳＩＭイメージング部品１９１を使用して予測される構造化照明パラメータに従って送信され得る。いくつかの実施態様では、コントローラ１９５は、様々な時間及び／又は試料位置に対応する、予測及び又は推定された構造化照明パラメータを記憶するためのメモリを含み得る。

様々な実施態様では、コントローラ１９５は、ハードウェア、アルゴリズム（例えば、機械実行可能命令）、又は前述の組み合わせを使用して実装されてもよい。例えば、いくつかの実施態様では、コントローラは、１つ以上のＣＰＵ、ＧＰＵ、又は関連するメモリを有するプロセッサを含み得る。別の例として、コントローラは、コンピュータプロセッサ及び機械可読命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体などの動作を制御するためのハードウェア又は他の回路構成を備えてもよい。例えば、この回路構成は、以下：フィールドプログラマブルゲートアレイ（field programmable gate array、ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（application specific integrated circuit、ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（programmable logic device、ＰＬＤ）、複合プログラマブル論理デバイス（complex programmable logic device、ＣＰＬＤ）、プログラマブル論理アレイ（programmable logic array、ＰＬＡ）、プログラマブルアレイ論理（programmable array logic、ＰＡＬ）、及び他の同様の処理デバイス又は回路構成のうちの１つ以上を含んでもよい。更に別の例として、コントローラは、この回路構成と１つ以上のプロセッサとの組み合わせを含んでもよい。

図３は、（例えば、光学アセンブリ１５５の代わりに）システムに組み込むことができる代替的な光学アセンブリ２００の例を示す。本例の光学アセンブリ２００は、発光アセンブリ２１０と、固定反射要素２２０と、位相マスクアセンブリ２３０と、格子切り替え部２５０と、調整可能な反射要素２７０と、投影レンズアセンブリ２８０と、を含む。発光アセンブリ２１０は、コヒーレント光源（例えば、少なくとも１つのレーザなど）及び一対のアナモフィックプリズム、非コヒーレント光源及びコリメータ、又は本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなるであろう任意の他の好適な構成要素が挙げられるが、これらに限定されない多様な構成要素を含み得る。いくつかの変形例では、発光アセンブリ２１０は、２つ以上の別個のチャネル（例えば、青色チャネル及び緑色チャネル）を介して光を発するように動作可能である。２つ以上の別個のチャネルで光が発せられる変形例では、システム１００は、それぞれの画像センサが対応する画像センサに特化するように、２つ以上の対応する画像センサを含み得る。また、いくつかの変形例では、発光アセンブリ２１０は、（例えば、高速シャッタなどを使用して）所定の周波数でパルスで光を発するように動作可能である。

本実施例の反射要素２２０は、光学アセンブリ２００の他の構成要素に対して位置が固定されたミラーを含む。以下により詳細に記載されるように、反射要素２２０は、光学アセンブリ２００の動作中に、発光アセンブリ２１０から発せられた光を位相マスクアセンブリ２３０及び格子切り替え部２５０に向けて反射するように位置付けられ、構成されている。

図４で最も良く分かるように、本実施例の位相マスクアセンブリ２３０は、ベース２４０に固定的に取り付けられた一対の三角形のガラス要素２３２、２４２を含む。それぞれのガラス要素２３２、２４２は、ガラス要素２３２、２４２の１つの側に沿う反射体２３４、２４４を含む。それぞれのガラス要素２３２、２４２はまた、ガラス要素２３２、２４２の別の側に沿う位相マスク２３６、２４６を含む。本実施例では、それぞれの位相マスク２３６、２４６は、ガラス要素２３２、２４２のガラスにエッチングされた格子又は縞パターンを形成する目盛（例えば、平行スリット又は溝など）を含む。目盛間隔は、好適な角度で光を回折するように選択され、システム１００の操作のために撮影された試料の最小解像可能フィーチャサイズに調整されてもよい。以下により詳細に記載されるように、これらの位相マスク２３６、２４６は、光学アセンブリ２００の動作中にモアレ縞又エイリアシングを生成するように構成されている。本実施例では、位相マスク２３６、２４６は、ガラス要素２３２、２４２のガラス内のエッチングされた目盛によって形成されるが、位相マスク２３６、２４６が形成され得る他の好適な方法が、本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなろう。光学アセンブリ２００の動作中、位相マスクアセンブリ２３０全体は、光学アセンブリ２００の他の構成要素に対して静止したままである。

システムの効率を改善するために、各位相マスク２３６、２４６によって出力される０次ビーム及び他の全ての高次の回折ビームは、阻止されてもよい（すなわち、試料１１０に投影された照明パターンからフィルタによって除去されてもよい）。例えば、次数フィルタなどのビーム遮断要素（図示せず）が、位相マスクアセンブリ２３０の後の光路に挿入されてもよい。いくつかの実施態様では、回折格子位相マスク２３６、２４６は、ビームを１次のみに回折するように構成されてもよく、０次（非回折ビーム）は、いくつかのビーム遮断要素によって遮断されてもよい。

図３に示すように、本実施例の格子切り替え部２５０は、シャフト２５４に取り付けられたプレート２５２を含む。シャフト２５４は、シャフト２５４及びプレート２５２を軸線Ａを中心に回転させるように動作可能なモータ２５６と更に連結されており、プレート２５２の一端２６０は、一対のミラー２６２、２６４を含み、それぞれのミラー２６２、２６４はプレート２５２の反対側に取り付けられている。プレート２５２の他端２６６は、後述するように光が通過することを可能にする開口部２６８を画定する。いくつかの変形例では、モータ２５６はステッピングモータである。あるいは、モータ２５６は、任意の他の好適な形態をとることができ、モータ２５６は、任意の他の好適な回転運動供給源で置換されてもよい。図５Ａ～図５Ｄに示されるように、以下により詳細に記載されるように、モータ２５６を作動させて、軸線Ａを中心にシャフト２５４及びプレート２５２を回転させることによって、第１の状態（図５Ａ～図５Ｂ）と第２の状態（図５Ｃ～図５Ｄ）との間で格子切り替え部２５０を移行させることができる。格子切り替え部２５０が第１の状態にあるとき、格子切り替え部２５０及び位相マスクアセンブリ２３０は、第１の格子角度を提供することができる。格子切り替え部２５０が第２の状態にあるとき、格子切り替え部２５０及び位相マスクアセンブリ２３０は、第２の格子角度を提供することができる。

図３にも示されるように、本実施例の調整可能な反射要素２７０は、アクチュエータ２７２が線形経路ＬＰ１に沿って反射要素２７０を駆動するように動作可能であるように、アクチュエータ２７２と連結されているミラーを含む。この実施例では、線形経路ＬＰ１は、軸線Ａと平行である。いくつかの変形例では、アクチュエータ２７２は、圧電素子を含む。別の例として、アクチュエータ２７２は、ソレノイドを含んでもよい。いくつかの他の変形例では、アクチュエータ２７２は、回転運動を線形運動に変換するように動作可能な機械的アセンブリ（例えば、ラック及びピニオン又はウォームギア及びナットなど）と連結されているステッピングモータ又は他の回転駆動源を含む。以下でより詳細に記載されるように、アクチュエータ２７２が線形経路ＬＰ１に沿って反射要素２７０の位置を変更すると、アクチュエータ２７２及び反射要素２７０は、光学アセンブリ２００を通って伝達される光に位相変調を提供するように共に動作可能である。換言すれば、アクチュエータ２７２及び反射要素２７０は共に位相調整アセンブリを提供することができる。

例として、アクチュエータ２７２は、以下により詳細に記載されるように、アクチュエータ２７２の動作中、およそ５μｍの可動域にわたって反射要素２７０を駆動するように動作可能であってもよく、この動作により、およそ２４０度の縞の移動をもたらし得る。あるいは、アクチュエータ２７２は、アクチュエータ２７２の動作中に、およそ２μｍ～およそ１０μｍの範囲の可動域にわたって反射要素２７０を駆動するように動作可能であってもよい。以下により詳細に記載されるように、アクチュエータ２７２は、線形経路に沿う可動域にわたって２つ、３つ、又はそれ以上の様々な位置で反射要素の動きを停止させるように駆動されてもよい。

投影レンズアセンブリ２８０は、本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなるように、１つ以上のレンズ素子（例えば、チューブレンズ）及び様々な他の構成要素を含んでもよい。投影レンズアセンブリ２８０を通過した光は、最終的に、試料容器１１０（例えば、フローセルなど）に到達することができる。場合によっては、これは、試料容器１１０内の生体材料を蛍光発光させることができ、そのような蛍光は、生体材料の分析を可能にする画像センサ（例えば、カメラシステム１４０の画像センサ）によって撮影される。本実施例の投影レンズアセンブリ２８０は、投影レンズアセンブリ２８０の少なくとも一部分を線形経路ＬＰ２に沿って駆動するように動作可能なアクチュエータ２８２と連結されている。いくつかの変形例では、アクチュエータ２８２は、圧電素子を含む。別の例として、アクチュエータ２８２は、ソレノイドを含んでもよい。いくつかの他の変形例では、アクチュエータ２８２は、回転運動を線形運動に変換するように動作可能な機械的アセンブリ（例えば、ラック及びピニオン又はウォームギア及びナットなど）と連結されているステッピングモータ又は他の回転駆動源を含む。以下でより詳細に記載されるように、アクチュエータ２８２は、線形経路ＬＰ２に沿って投影レンズアセンブリ２８０の少なくとも一部分の位置を変更することにより、アクチュエータ２８２及び投影レンズアセンブリ２８０は、ＳＩＭ格子焦点面を調整するように共に動作可能である。

上述のように、本実施例のシステム１００は、コントローラ１９５を含む。コントローラ１９５を使用して、光学アセンブリ２００及びシステム１００の多様な構成要素を同期させることなど、光学アセンブリ２００及びシステム１００の他の機構の動作を制御することができる。コントローラ１９５を実装して、例えば、モータ２５６の作動、アクチュエータ２７２の作動、アクチュエータ２８２を介する投影レンズアセンブリ２８０の１つ以上の要素の移動、フォーカス構成要素１７５の作動、カメラシステム１４０の作動、及び他の撮影動作などのシステム動作の態様を制御することができる。コントローラを実装して、システム１００のハードウェア要素を制御して、経時的な構造化照明パラメータの変化を補正することもできる。例えば、コントローラは、制御信号をデバイス（例えば、モータ２５６、アクチュエータ２７２など）に送信して、経時的な構造化照明の位相、周波数、及び／又は配向の変化を補正又は補償するように構成されてもよい。実施態様では、これらの信号は、ＳＩＭイメージング部品を使用して予測される構造化照明パラメータに従って送信され得る。いくつかの実施態様では、コントローラは、様々な時間及び／又は試料位置に対応する、予測及び推定された構造化照明パラメータを記憶するためのメモリを含んでもよい。

図５Ａ～図５Ｄは、多様な動作段階における光学アセンブリ２００を示す。図５Ａに示す段階では、発光アセンブリ２１０は、反射要素２２０に向かって光を発し、反射要素２２０は、位相マスクアセンブリ２３０及び格子切り替え部２５０に向けて光を反射する。この段階で、格子切り替え部２５０は、反射要素２２０から反射された光がミラー２６２によって更に反射されるように、第１の状態にある。ミラー２６２によって反射された光は、ガラス要素２４２を通過し、位相マスク２４６に向けて光を反射する反射体２４４に到達する。光が位相マスク２４６を通過すると、位相マスク２４６は、パターン化された形態を光に提供する。次いで、このパターン化又は構造化された光は、プレート２５２の開口部２６８を通過し、反射要素２７０に到達し、その後、構造化された光を投影レンズアセンブリ２８０に向けて反射させる。投影レンズアセンブリ２８０を通過した後、構造化された光は、撮影用に標的化された対象物（例えば、試料容器１１０）に到達し、カメラシステム１４０は、標的化された対象物の第１の画像を撮像する。

第１の画像が図５Ａに示される光学系２００の構成で取得された後、アクチュエータ２７２は、線形経路ＬＰ１上の第１の位置から線形経路ＬＰ１上の第２の位置へ反射要素２７０を駆動するように作動され、それにより、光学系２００は次に図５Ｂに示される構成となる。図５Ｂに示す段階では、発光アセンブリ２１０は、反射要素２２０に向かって光を発し、反射要素２２０は、位相マスクアセンブリ２３０及び格子切り替え部２５０に向けて光を反射する。この段階で、格子切り替え部２５０は、反射要素２２０から反射された光がミラー２６２によって更に反射されるように、第１の状態にある。ミラー２６２によって反射された光は、ガラス要素２４２を通過し、位相マスク２４６に向けて光を反射する反射体２４４に到達する。光が位相マスク２４６を通過すると、位相マスク２４６は、パターン化された形態を光に提供する。次いで、このパターン化又は構造化された光は、プレート２５２の開口部２６８を通過し、反射要素２７０に到達し、その後、構造化された光を投影レンズアセンブリ２８０に向けて反射させる。投影レンズアセンブリ２８０を通過した後、構造化された光は、撮影用に標的化された対象物（例えば、試料容器１１０）に到達し、カメラシステム１４０は、標的化された対象物の別の画像を撮影する。

図５Ａに示す段階と図５Ｂに示す段階との間の唯一の違いは、反射要素２７０が第２の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１に沿う第２の位置）にあることである。したがって、この動作段階の間に反射要素２７０が異なる位置にあるため、図５Ｂに示す構成の光学アセンブリ２００で撮像された画像は、図５Ａに示す構成の光学アセンブリ２００で撮像された画像とは異なる位相を有することとなる。

本明細書に記載されたプロセスのいくつかの変形例では、アクチュエータ２７２は、格子切り替え部２５０が第１の状態にある間に、反射要素２７０を線形経路ＬＰ１に沿う第３の位置に駆動するように作動された後、図５Ｃに示され、以下に記載された段階に進む。このようなプロセスの変形例では、カメラシステム１４０は、格子切り替え部２５０が第１の状態にある間に３つの画像を撮像することができ、これらの画像のそれぞれは、線形経路ＬＰ１に沿う反射要素２７０のそれぞれの位置に基づいて異なる位相を表す。当然ながら、アクチュエータ２７２はまた、反射部材２７０を第４の位置、第５の位置などに駆動するように作動されてもよく、それにより、格子切り替え部２５０が第１の状態にある間に、任意の所望の数の位相が画像の撮像中に用いられ得る。

所望の数の画像が、図５Ａ～図５Ｂに示された第１の状態の格子切り替え部２５０により取得された後、モータ２５６が作動されて、シャフト２５４を軸線Ａを中心に回転させ、それによって軸線Ａを中心にプレート２５２を回転させて、格子切り替え部２５０を図５Ｃ～図５Ｄに示される第２の状態に移行させる。図５Ｃに示す段階では、アクチュエータ２７２はまた、反射要素２７０を第２の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１上の第２の位置）から第１の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１上の第１の位置）に戻るように作動されている。いくつかの他の変形例では、反射要素２７０は、第１の状態から第２の状態への格子切り替え部２５０の移行の直後に第２の状態に留まり、反射要素２７０は、反射要素２７０が第２の状態にあり、格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に、画像が撮像された後に第１の状態に遷移する。

図５Ｃに示す段階では、発光アセンブリ２１０は、反射要素２２０に向かって光を発し、反射要素２２０は、位相マスクアセンブリ２３０及び格子切り替え部２５０に向けて光を反射する。ここで第２の状態にある格子切り替え部２５０により、反射要素２２０から反射された光は開口部２６８を通過し、更にガラス要素２３２を通過する。ガラス要素２３２を通過した光は、位相マスク２３６に向けて光を反射する反射体２３４に到達する。光が位相マスク２３６を通過するとき、位相マスク２３６は、パターン化された形態を光に提供する。次いで、このパターン化又は構造化された光は、ミラー２６４から反射される。ミラー２６４は、構造化された光を反射要素２７０に向けて反射し、次いで、構造化された光を投影レンズアセンブリ２８０に向けて反射する。投影レンズアセンブリ２８０を通過した後、構造化された光は、撮影用に標的化された対象物（例えば、試料容器１１０）に到達し、カメラシステム１４０は、標的化された対象物の別の画像を撮影する。

図５Ｃに示される光学系２００の構成で画像を取得した後、アクチュエータ２７２は、第１の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１上の第１の位置）から第２の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１上の第２の位置）へ反射要素２７０を駆動するように作動され、その後、光学系２００は、図５Ｄに示される構成となる。図５Ｄに示す段階では、発光アセンブリ２１０は、反射要素２２０に向かって光を発し、反射要素２２０は、位相マスクアセンブリ２３０及び格子切り替え部２５０に向けて光を反射する。ここで第２の状態にある格子切り替え部２５０により、反射要素２２０から反射された光は開口部２６８を通過し、更にガラス要素２３２を通過する。ガラス要素２３２を通過した光は、位相マスク２３６に向けて光を反射する反射体２３４に到達する。光が位相マスク２３６を通過するとき、位相マスク２３６は、パターン化された形態を光に提供する。次いで、このパターン化又は構造化された光は、ミラー２６４から反射される。ミラー２６４は、構造化された光を反射要素２７０に向けて反射し、次いで、構造化された光を投影レンズアセンブリ２８０に向けて反射する。投影レンズアセンブリ２８０を通過した後、構造化された光は、撮影用に標的化された対象物（例えば、試料容器１１０）に到達し、カメラシステム１４０は、標的化された対象物の別の画像を撮影する。

図５Ｃに示す段階と図５Ｄに示す段階との間の唯一の違いは、反射要素２７０が第２の状態（すなわち、線形経路ＬＰ１に沿う第２の位置）にあることである。したがって、この動作段階の間に反射要素２７０が異なる位置にあるため、図５Ｄに示す構成の光学アセンブリ２００で撮像された画像は、図５Ｃに示す構成の光学アセンブリ２００で撮像された画像とは異なる位相を有することとなる。

本明細書に記載されるプロセスのいくつかの変形例では、アクチュエータ２７２は、格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に、反射要素２７０を線形経路ＬＰ１に沿う第３の位置に駆動するように作動された後、画像を撮像するプロセスが完了する。このようなプロセスの変形例では、カメラシステム１４０は、格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に３つの画像を撮像することができ、これらの画像のそれぞれは、線形経路ＬＰ１に沿う反射要素２７０のそれぞれの位置に基づいて異なる位相を表す。当然ながら、アクチュエータ２７２はまた、反射部材２７０を第４の位置、第５の位置などに駆動するように作動されてもよく、それにより、格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に、任意の所望の数の位相が画像の撮像中に用いられ得る。

上述のように、画像撮像プロセスは、２つ以上の別個のチャネル（例えば、青色チャネル及び緑色チャネル）を介して実行されてもよい。換言すれば、図５Ａ～図５Ｄを参照して上述したプロセスは、２つ以上の別個のチャネルによって実行されてもよい。発光アセンブリ２１０は、両方のチャネルを提供するように動作可能であってもよく、又はそれぞれのチャネルは、チャネル自体の発光アセンブリ２１０を有してもよい。いくつかの変形例では、２つの別個のチャネルは、光学アセンブリ２００を介して同時に作動される。いくつかの他の変形例では、図５Ｄに示す段階の間に第２のチャネルが作動されるまでに、図５Ａに示す段階の間に第１のチャネルが作動され、その後、図５Ａに示される段階の間に第２のチャネルが作動され、その後、図５Ｂに示される段階の間に第１のチャネルが作動され、その後、図５Ｂに示される段階の間に第２のチャネルが作動され、などが行われる。更に別の例として、それぞれのチャネルは、チャネル自体の専用の光学アセンブリ２００を有してもよい。いくつかのそのような変形例では、更なる光学構成要素を利用して、それぞれの光学アセンブリ２００の投影レンズアセンブリ２８０が、それぞれのチャネルから同じ標的（例えば、試料容器１１０）に光を投射することを可能にし得る。１つ以上の光学アセンブリ２００が２つ以上のチャネルの使用を可能にし得る他の好適な方法は、本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなろう。また、システム１００内の他の構成要素（例えば、フィルタ切り替えアセンブリ１６５）は、２つ以上のチャネルの使用を更に可能にし得ることも理解されたい。１つのチャネルが青色であり、別のチャネルが緑色である変形例では、青色チャネルは、およそ４５０ｎｍ～およそ５００ｎｍの範囲の波長の光で動作することができ、緑色チャネルは、およそ５００ｎｍ～およそ５７０ｎｍの範囲の波長の光で動作することができる。

また上述したように、システム１００内の光学アセンブリ２００の使用で撮影される素材は、フローセル上のナノウェル内の１つ以上の生体試料（例えば、ヌクレオチドなど）を含んでもよく、試料容器１１０のいくつかの形態はフローセルを含んでもよい。このようなナノウェルは、規則的な反復パターンに配置されてもよい。矩形パターンに関して、２つの構造化照明の角度が実質的に、パターン内の矩形の対向する角部を接続する２つの対角線に沿って使用されてもよく、その結果、構造化照明の強度ピークは、２つの対角線に対して実質的に垂直に配向される。あるいは、構造化照明の角度は、矩形のナノウェルのパターン方向と同じ方向に沿って（すなわち、矩形の対向する角部に沿わずに）配向されてもよい。

パターン内の六角形の対向する角部を接続する３つの対角線を有するナノウェルの反復六角形パターンについては、３つの構造化照明の角度を、３つの対角線に対して実質的に垂直に配向された強度ピークと共に使用することができる。あるいは、２種類の角度の照明パターンは、ナノウェルの六角形パターンを有するフローセルと共に使用されてもよく、それにより、全ての場合において、３つの構造化照明の角度をナノウェルの六角形パターンと共に使用することが不要となる。更に、構造化照明の角度は、六角形のナノウェルのパターン方向と同じ方向に沿って（すなわち、六角形の対向する角部に沿わず）配向されてもよい。

ナノウェルのパターンの種類にかかわらず、隣接するナノウェルは、関連する光学系のアッベ回折限界よりも近接して位置付けられてもよい。あるいは、試料は、ナノウェルなしで撮影面の上にランダムに分布されてもよい。又は、試料は、ナノウェル以外のいくつかの構造体上の撮影面の上に規則的に配置されてもよい。

ＩＶ．画像処理アルゴリズムの例

Ａ．ＳＩＭ画像処理方法の概要

光学センサ又は（例えば、カメラシステム１４０に組み込まれているような）画像センサによって撮像された画像は、タイルと称されてもよい。以下に記載されるような画像処理アルゴリズムは、撮像された画像タイルをサブタイルに細分化することができる。それぞれのサブタイルは、独立して評価することができる。略中央サブタイルは、他のサブタイルとは異なって処理されてもよい。フローセルの撮影周期は、一部の重なりを有する多くの画像タイルを撮像することができる。サブタイルは、平行であっても、互いに独立して再構成されてもよい。改善されたサブタイルからの再構成は、改善された空間分解能を有する再構成タイルを生成するように共にステッチされてもよい。場合によっては、画像タイルは、サブタイルに細分化されて、ピーク線がサブタイル内でほぼ均等に離間され、それによって、レンズの視野にわたって再構成されたサブタイルからの画質がより良好になる。

場合によっては、少なくとも３つのパラメータがサブタイルごとにマッピングされる。このようなパラメータは、照明ピーク角度、照明ピーク間隔、及び位相変位を含んでもよい。照明ピーク角度はまた、格子角度と称されてもよい。照明ピーク間隔は、格子間隔と称されてもよい。換言すれば、照明ピーク間隔は、格子の周期性（例えば、位相マスク２３６、２４６によって画定された平行線間の間隔）を画定する。位相変位又は位相は、（例えば、アクチュエータ２７２によって駆動されるように、線形経路ＬＰ１に沿う反射要素２７０の位置に基づいて）試料平面上に投影されるような構造化照明パターン又は格子のシフトである。換言すれば、位相は、格子に直交する方向における共通基準点から反復照明パターンの開始までの距離として定義されてもよい。位相は、ラジアン又は度で表すことができ、反復パターンの周期の分画と見なすことができる。位相変位はまた、格子位相と称されてもよい。角度及び間隔は、二次曲面歪みモデルを使用してマッピングすることができる。

以下は、ＳＩＭ画像再構成のパラメータを推定するために使用され得る技術の例を記載する。開示される技術のうちのいくつかは、レンズの欠陥に起因して歪んだ又は曲がった縞のピーク線を補正している。平行であると想定されるパターン線は、画像の中心付近で開始するが、レンズの縁部付近で収束するか、又は非平行になる傾向がある。これは、照明ピーク角度又は配向、照明ピーク間隔、及び位相オフセットに影響を及ぼす。図８Ａは、画像タイルをサブタイル又はサブウィンドウ又はサブフィールドと称される重複領域に分割することを示す。サブタイルは、サブタイル全体の十分な再構成をもたらすパラメータを設定することができるほど十分に小さい。いくつかの変形例では、それぞれのサブタイルは、５１２×５１２ピクセルの光学センサを含む。２５６、４００、１０２４、２０４８及び４０９６又は２５６～４０９６ピクセルの範囲を含むがこれらに限定されない、より大きい又はより小さい数が使用されてもよい。サブタイルは、光学センサの少なくとも２ピクセルだけ重なり合ってもよい。より大きい又はより小さい数が使用されてもよい。例えば、５１２ピクセル幅のウィンドウの場合、最大２５６ピクセルの重なりが使用されてもよく、１０２４ピクセル幅の場合、最大５１２の重なりが使用されてもよい。

パラメータ推定は、２つのステップで実行されてもよい。最初に、画像の略中央サブタイルについてパラメータ推定を実行することができる。次いで、パラメータ推定は、他のサブタイルに対して実行され、略中央サブタイルと比較して、略中央サブタイルのパラメータに対して歪み及び歪みに対する補正を決定することができる。

図６Ａ～図６Ｃは、全視野（field of view、ＦＯＶ）の物理的態様を示す。一実施態様では、５４７２ピクセル×３６９４ピクセルである矩形センサが使用される。当然のことながら、方形センサ、又は、例えば、５４７２×５４７２ピクセル又は４８００×４８００ピクセルなどの異なるサイズのセンサが使用されてもよい。矩形センサが使用されるとき、歪みは、レンズの縁部に最も近いところで最大となる。レンズは、多くの場合、円形であるため、矩形センサは、短辺上ほど長辺上でレンズの縁部に近接しない。

図６Ａは、全視野（ＦＯＶ）にわたる縞の間隔の歪みを示す２つの図を示す。左の図３００は、拡大レンズの歪みに起因して屈曲する平行線の簡略図３００である。図示された線は、画像平面内で平行であることが意図されている。レンズを通して見ると、中心の間隔に対して左右の端部で線が収束しているように見える。右の図３０２は、別の誇張された例である。この図では、縞の線は、左上角部との右下角部との間で斜めに配向されている。縞の間隔は、より容易に見ることができるように誇張されている。縞の線は、中心に対して左上角部及び右下角部において収束している。特定の製造業者のレンズでは、縞パターンは不均一であり得る。

図６Ｂ及び図６Ｃは、緑色及び青色のレーザ照明のための、画像平面内の名目上平行な縞のピーク間の画像における間隔の測定値を示す。カラースケールは、２．８～２．２２の間隔の変動を示す。両方の図において、カラースケールは、平行線間の中心間隔がおよそ２．１４であることを示している。緑色波長照明下の不規則性は、図６Ｂの右上隅に見られる。青色波長照明下でのより大きい不規則性は、図６Ｃにおいて右縁部及び左縁部に沿って見られる。これらの図では、縞パターンは、図の左下から右上まで４５°の角度における一連の平行線であった。したがって、間隔は、図８Ｃの矢印の方向に測定される。これらの図は、レンズによって引き起こされる歪みの補正を動機付ける。レンズは、個別に製造及び装着されるため、組み立て後の個々のシステムの較正及び補正が所望される。

図６Ｄは、画像タイル内の全視野（ＦＯＶ）のサブタイル又はサブフィールドを示す。この図では、図示したサブタイルは、５１２ピクセル×５１２ピクセルである。これらのサブタイルは、図示された視野を細分化してもよく、又は重なり合ってもよい。サブタイルは、より大きくても小さくてもよい。例えば、４００×４００ピクセル及び１０２４×１０２４ピクセルのサブタイルが有効であることが示されている。図は、５×７個のサブタイルを示している。上記のより大きいセンサは、８×１１個のサブタイルを有してもよい。３×３個、５×５個、５×７個、９×９個、９×１６個などのサブタイルの他の構成を使用することができる。より大きいセンサは、より多くのサブタイルに分割されてもよい。サブタイルは、光学センサの少なくとも２ピクセルだけ重なり合ってもよい。サブタイル間で重なり合うために、より多くの画素及びより少ない画素が使用されてもよい。例えば、５１２ピクセル幅のサブタイルの場合、最大２５６ピクセルの重なりが使用されてもよく、１０２４ピクセル幅のサブタイルの場合、最大２５６ピクセルの重なりが使用されてもよい。図６Ｂ及び図６Ｃと一致して、いくつかの候補の略中央サブタイル３０４が存在し、その全ては、奇数×奇数個のサブタイルアレイ内の中央サブタイルを含む、レンズの芯に存在する。本明細書で使用する際、略中央サブタイルは、センサの中心画素を含むか、又は中心画素を含むサブタイルに隣接するかいずれか一方である。平坦であり、小さい誤差を有するいくつかの光学系では、全体的な歪み補償に影響を与えることなく、更に中央サブタイルに隣接するタイル由来のサブタイルを基準として使用することができる。

開示される技術は、画像センサによって捕捉された実質的に全視野にわたって測定されたマッピングの歪みを含む。規則的な構造化照明からの改善された解像度のＳＩＭ再構成が依存する３つのパラメータとしては、縞の間隔、縞の角度、及び縞パターンの位相変位が挙げられる。これらの変数は、構造化照明又は格子パターンの間隔、角度、及び位相オフセットとも称される。中心タイル値からの間隔及び角度変位は、多項式曲面を使用して全視野にわたってあてはめられてもよい。二次曲面及び立方曲面の両方が調査されている。高次多項式もまた使用されてもよい。

画像タイルにわたる縞の間隔及び縞の角度の両方は、二次曲面によってあてはめられてもよい。感度分析は、二次曲面がほぼ立体曲面と同様にあてはまることを示している。二次曲面は、以下の式（ＩＩ）にあてはめられる。
ｆ（ｘ，ｙ）＝ｃ０＋（ｃｌ^＊ｘ）＋（ｃ２^＊ｙ）＋（ｃ３^＊ｘ^＊ｙ）＋（ｃ４^＊ｘ^２）＋（ｃ５^＊ｙ^２） （ＩＩ）

位相推定の一実施態様は、タイトルが「Ｐｈａｓｅ Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（２０１３年）であるＷｉｃｋｅｒらの論文第３節によってＷｉｃｋｅｒらによって提案された技術を用いる。タイトルが「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」（２０１５年）であるＬａｌらの式及び２０１３年のＷｉｃｋｅｒらの式は、Ｗｉｃｋｅｒの位相推定を説明するのに役立つ。

２０１５年にＬａｌらから入手された以下の式（ＩＩＩ）は、周波数成分の３つの帯域：

を取得した画像

から分離する。混合行列は、パターン角度又は配向０に対応する正弦波照明強度パターンＩ_θ，φ（ｒ）を使用して撮像された画像の位相φ_１、φ_２、及びφ_３の推定値を使用する。Ｗｉｃｋｅｒら（２０１３年）は、φ_ｎとして、ある配向でのｎ番目の画像の位相を指している。十分な精度で位相が分からない場合、非混合又は帯域分離プロセスは、周波数ドメインにおいて、観測画像

から空間周波数成分を不完全に分離することとなる。実際には、３つの空間周波数構成要素

は、以下の式（ＩＩＩ）によって提供されるノイズの項によって表されるように、他の構成要素からの残留情報をより多く又はより少なく含有することとなる。

３つの成分を有するこの式は、正弦照明又は余弦照明に対するフーリエ変換から得られる。異なる照明関数が、式を変化させることができる。

したがって、照明正弦波強度パターン位相の正確な知識が重要であり得る。実験設定においてこれらの位相を正確に制御することが常に可能ではないので、取得された画像データから照明パターンの位相を決定することが所望され得る。Ｗｉｃｋｅｒら（２０１３年）は、選択された周波数でコヒーレント正弦波照明を使用して取得されたＳＩＭデータの位相推定技術を提示している。コヒーレント照明は、非常に小さい照明ピーク間隔「ｓ」有する微細格子から良好なパターンコントラストを生成し、これにより再構成された解像度を改善する。照明パターンのピーク周波数を使用して、ｎ番目の画像の照明パターンの位相を取得する。照明パターンのピーク周波数は、フーリエピークとも称される。

Ｗｉｃｋｅｒら（２０１３年）による以下の式（ＩＶ）は、周波数ドメイン内の周波数

にわたって、獲得画像

を有する式（ＩＩ）の一般化された形態を提示する。それぞれの画像は、様々な位相を重ね合わせた

と称される３つの成分を含む。なお、これら３つの成分は、式（ＩＩＩ）における

と同じ３つの成分である。

なお、式（ＩＶ）における「ｃ」は、照明パターンのコントラストと称される。ノイズがない場合、「ｃ」は、式（２）における混合行列Ｍの変調係数「ｍ」と同じである。φ_ｎを決定するために、式（ＩＶ）における周波数

は、照明パターンのピーク周波数である

と置き換えられ、次の式（Ｖ）を得る。

式（Ｖ）は、パターン位相φ_ｎが、周波数

にわたって取得された画像

の位相とほぼ等しいことを示す。パターン位相φ_ｎのこの概算は、３つのガイドラインが遵守される場合、良好な結果をもたらし得る。第１に、照明パターンのコントラストｃは、十分に大きくなければならない。第２に、試料のパワースペクトルは、周波数が大きくなるにしたがって十分速く減少しなければならない。これらの２つのガイドラインが遵守される場合、式（Ｖ）は最後の項によって影響を及ぼされ、したがって、以下の式（ＶＩ）に簡略化され得る。

任意の実数値の試料については、中心周波数

は実数値であることとなる。更に、点広がり関数（ＰＳＦ）

が実数かつ対称である場合、光学伝達関数（ＯＴＦ）

は、実数であることとなる。ＯＴＦは、点広がり関数（ＰＳＦ）の畳み込みである。点広がり関数は、イメージングシステムの光学伝達関数の空間的ドメインの変形例である。「点広がり関数」という名称は、全ての物理光学系が、光の点をある程度ぼかし（広げ）、ぼかしの量が光学構成要素の品質によって決定されることを示す。イメージングシステムの解像度は、ＰＳＦのサイズによって限定される。非対称性ＰＳＦについては、ＯＴＦの位相を考慮するべきである。

第３に、パターン周波数

におけるＯＴＦは、ノイズを克服するのに十分に大きくなければならない。ＯＴＦが小さすぎる場合、取得された画像内のノイズは、

で測定された位相を著しく変更し得る。この位相推定法は、検出ＯＴＦをサポートするために、パターン周波数

外で使用することができない。このような周波数に対して、

である。

光学系のＯＴＦを実験的に決定することができる。例えば、Ｌａｌら（２０１５年）は、疎に分布した１００ｎｍの蛍光ミクロスフェアを有する試料のいくつかの画像を得ることによってＯＴＦを計算する。次いで、１００個超のミクロスフェアに対応する強度分布を重畳し、平均して、システムのＰＳＦの近似値を得た。このＰＳＦのフーリエ変換は、システムのＯＴＦを推定する。この背景により、位相推定技術をサブタイルに適用することができる。

全視野（ＦＯＶ）に対するタイルの位相変位を推定することが有用であり得、それにより、１つのサブタイル内の位相の測定が、タイルにわたって他のサブタイルに外挿することができる。全ＦＯＶの照明ピーク角度及び照明ピーク間隔は、上に提示された二次曲線モデルを使用して、サブタイルの照明ピーク角度及び照明ピーク間隔から推定することができる。位相変位は、サブタイルの画素形状に依存するため、より不規則的であり得、これは、平滑関数の代わりに不規則な階段関数を生成し得る。位相推定は、全ＦＯＶ画像のサブタイルにわたる共通の基準フレームを使用して表すことができる。サブタイルの座標空間は、全ＦＯＶ座標空間にマッピングすることができる。

Ｂ．ＳＩＭシステムの品質管理方法の例

ＳＩＭ光学系における様々な構造パラメータ及び動作パラメータは、ＳＩＭ再構成超解像画像の品質に悪影響を及ぼし得る。例えば、レンズを含む任意の光学系（例えば、上述したレンズアセンブリ２８０内の、カメラシステム１４０に組み込まれているいくつかの他のレンズ）では、少なくとも１つのレンズは、カメラシステム１４０によって撮像された画像内に歪みを生成し得る１つ以上の構造収差を含み得る。別の例として、光学アセンブリ２００内又はシステム１００の光路内の他の場所に構成要素を位置付けることは、既定の指定から逸脱する場合があり、そのような逸脱は、カメラシステム１４０によって撮像された画像内に歪みを生成する場合がある。ＳＩＭ再構成で使用される計算は、収差を有するレンズを使用して、又は他の収差を有する光学アセンブリ２００を使用して撮像されるソース画像の歪みに対する感受性を示し得る。中心の芯の代わりにレンズの大部分を使用して視野を増大させることにより、レンズ内の収差によって引き起こされる歪みに対するＳＩＭ画像再構成の感受性を向上させることができる。したがって、以下で説明する例は、上述の収差（及び他の収差）を検出するためのシステム及び方法を提供し、（可能な場合）このような収差を考慮するために必要に応じて調整を行うことによって、上記で特定された画像の歪みの課題に対する解決策を提供する。換言すれば、以下では、ＳＩＭ光学系内の品質管理チェック又は構造パラメータ及び動作パラメータの検証を行って、それらが既定の指定内にあるかどうかを判定する方法の例を記載する。したがって、以下に提供される品質管理及び検証の教示は、レンズ又は光学アセンブリの他の構成要素における収差によって提示される既知の課題を克服する利点を提供することができる。

品質管理チェックプロセスは、２つの焦点面間の比較を含んでもよく、一方は光学焦点面であり、他方はＳＩＭ格子焦点面である。光学焦点面は、試料容器１１０内の生体試料の最も焦点の合った対物レンズ１４２の位置を観察することによって確立され得る。本実施例では、光学焦点面は、システム１００の対物レンズ１４２をｚ軸に沿って試料容器１１０に向かって、かつ試料容器１１０から離れる方向に移動させることによって調整されてもよい。ＳＩＭ格子焦点面は、アクチュエータ２８２を作動させることによって、投影レンズアセンブリ２８０を線形経路ＬＰ２に沿って移動させることによって調整され得る。ＳＩＭ格子焦点面は、位相マスク２３６、２４６によって提供される構造化された光パターンから、最高の品質の縞又は最大の干渉が観察され得る投影レンズアセンブリ２８０の位置を観察することによって確立され得る。理想的なＳＩＭアセンブリの構成は、可能な限り光学焦点面に近いＳＩＭ格子焦点面（例えば、光学焦点面のおよそ１０ｎｍ以内のＳＩＭ格子焦点面）を提供することができる。ＳＩＭ格子焦点面と光学焦点面との間のこの差は、「共焦点」と見なされ得る。

以下の説明は、処理方法におけるＳＩＭスタックの処理を指す。本実施例では、それぞれのＳＩＭスタックは、１２個の画像、すなわち、２つのチャネルからの６個の画像を含む。各チャネルについて、６つの画像のセットは、（例えば、図５Ａ及び図５Ｂに示すように）格子切り替え部２５０が第１の状態にある間に、反射要素２７０が、線形経路ＬＰ１に沿う３つの異なる位置に配置されて撮影された３つの画像と、（例えば、図５Ｃ及び図５Ｄに示すように）格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に、反射要素２７０が、線形経路ＬＰ１に沿う同じ３つの異なる位置に配置されて撮影された他の３つの画像と、を含む。したがって、ＳＩＭスタック内の各チャネルについての６つの画像のセットは、２つの異なる格子角度又は照明ピーク角度のそれぞれについて３つの異なる位相を表す。あるいは、任意の他の好適な数の画像を使用してそれぞれのＳＩＭスタックを形成してもよく、そのような画像は、上記で特定されたパラメータ以外のパラメータに基づいて互いに異なってもよい。それぞれのＳＩＭスタックは、異なるｚ位置で収集されてもよく、これは、対物レンズ１４２が試料容器１１０から異なる距離に位置して、それぞれのＳＩＭスタックが収集され得ることを意味する。単なる例として、ＳＩＭスタックは、およそ２０個の様々なｚ位置からおよそ４０個の様々なｚ位置において収集され得る。様々なｚ位置は、およそ０．１μｍ～およそ１．０μｍ、又はおよそ０．２μｍ～およそ０．８μｍ、又はおよそ０．５μｍの間隔など、任意の好適な間隔で離間されてもよい。

プロセスは、図７のブロック４００に示すように、各Ｚ位置についてのＳＩＭスタックを収集することによって開始することができる。上述のように、それぞれのＳＩＭスタックは、１２個の画像を含んでもよい。次に、それぞれのＳＩＭスタックは、図７のブロック４０２に示すように、スタック内の各画像についての半値全幅（ＦＷＨＭ）を測定するために読み取られ得る。ＦＷＨＭは、それぞれのチャネル及びそれぞれの格子角度（格子角度は、ＳＩＭスタック内の画像が撮像された時点での格子切り替え部２５０の状態に基づく）の中心推定ウィンドウ上で測定することができる。中心推定ウィンドウを提供するために、画像は中央領域にトリミングされて、比較的高い歪みが起こり得る外縁部及び角部領域を除外することができる。それぞれのチャネルの中心推定ウィンドウ上のＦＷＨＭ値及びそれぞれの格子角度の測定は、それぞれの角度の未加工かつ未再構成の位相０を使用して行われてもよい。各チャネル－角度ペアについて１つだけ位相を測定することは、計算コストを節約することができ、十分な結果を提供することができる。

各ＳＩＭスタックについてのＦＷＨＭが測定された後、プロセスは、図７のブロック４０４に示すように、追加のＳＩＭスタックが処理される必要があるかどうかを判定することとなり、それぞれのＳＩＭスタックは、固有の対応するｚ位置に対応することが理解される。更なるＳＩＭスタックが処理される必要がある場合、プロセスは、全てのＳＩＭスタックについてＦＷＨＭが測定されるまで、更なるＳＩＭスタックのＦＷＨＭを測定し続ける。全てのＳＩＭスタック（すなわち、第１のパス中の全てのｚ位置）についてＦＷＨＭが測定されると、プロセスは、図７のブロック４０６に示すように、最も焦点の合ったｚ位置を有するＳＩＭスタックを特定することとなる。次に、プロセスは、図７のブロック４０８に示されるように、最も焦点の合ったｚ位置を有するＳＩＭスタック内の画像の格子間隔、角度、及び位相を測定することとなる。

最も焦点の合ったｚ位置を有するＳＩＭスタック内の画像の格子間隔、角度、及び位相を測定した後、次に、プロセスは、図７のブロック４１０及び４１２に示されるように、全てのＳＩＭスタック内（すなわち、第２のパス中の全てのｚ位置における）各チャネル－角度ペアについての変調及び位相を測定することとなる。縞の変調は、縞の干渉パターン強度の定量的尺度である（０～１の値であり、１は、完全干渉及び透過損失ゼロを想定する理論上の最大値である）。正確な変調値を算出することは、縞パターンの配向及び周期性の正確な推定の際に予測される。格子の最良焦点面から更に離れる方向であるｚ位置が処理されると、変調値は０に近づくほど低下することが予想される。

全てのＳＩＭスタック（すなわち、全てのｚ位置）で、各チャネル－角度ペアについての変調及び位相が測定されると、プロセスは、図７のブロック４１４に示されるように、各ＳＩＭスタックについての（すなわち、各ｚ位置についての）、全てのＦＷＨＭ、格子間隔、角度、位相、及び変調を表にすることとなる。この表が完成した後、各チャネル－角度ペアについて、プロセスは、図７のブロック４１６に示されるように、ｚ位置対ＦＷＨＭ及びｚ位置対変調に多項式モデル又は曲線をあてはめることとなる。

各チャネル－角度ペアについての多項式モデル又は曲線をあてはめた後、プロセスは、図７のブロック４１８に示されるように、各チャネル－角度ペアについての共焦点測定基準を算出することができる。この共焦点値は、以下のように算出することができる。
共焦点＝最小ＦＷＨＭのｚ位置－最大変調のｚ位置。
上述したように、ＳＩＭ格子焦点面が可能な限り光学焦点面に近い（例えば、光学焦点面のおよそ１０ｎｍ以内のＳＩＭ格子焦点面）共焦点値を有することが所望され得る。

いくつかの実施態様では、プロセスは、表又は他のレポートを生成することができる。表又は他のレポートは、上述のプロセスに基づいて、イメージングシステムに対応する様々なパラメータを手元に示すことができる。単なる例として、レポートが表を含む変形例では、表の列は、ｚ方向の高さ（すなわち、対物レンズ１４２と試料容器１１０との間の距離）、チャネル、角度指数、変調、ＦＷＨＭ、格子間隔、格子角度、及び任意の他の好適なパラメータを含んでもよい。表内のパラメータは、品質管理チェックを提供するために、既定の指定と比較され得る。

表又は他のレポートにおけるパラメータのいずれかが許容量を超えて指定から逸脱した場合、システム１００の光学アセンブリ２００又は他の構成要素に対する調整が行われて、指定内のそれらの逸脱したパラメータをもたらすように試みることができる。例えば、光学アセンブリ２００のいくつかの変形例は、位相シフト又は変調を固定するための調整を可能にし得る。例として、共焦点値が指定から許容量を超えて逸脱する場合、調整は、投影レンズアセンブリ２８０を移動させること、カメラシステム１４０を移動させること、電気光学変調器を移動させること、又は何らかの他の構成要素を移動させることを含んでもよい。更なる例として、位相値が、許容量を超えて指定から逸脱する場合、調整は、全ての光学構成について試料における正確な量の縞の並進移動を達成するために、アクチュエータ２７２を駆動するために使用される電圧を較正することを含み得る。更なる例として、品質管理チェックが傾斜又は色度の収差を明らかにする場合、構成要素カメラシステム１４０は、移動可能に調整され得るが、そのような移動は共焦点に影響を及ぼし得る。本明細書の教示を考慮することで当業者には明らかとなるように、他の好適な種類の調整を提供することができる。

上述の品質管理チェックプロセスは、調整が実際に指定内に逸脱しているパラメータをもたらしているかどうかを確認するために、再度実行されてもよい。指定内に逸脱しているパラメータをもたらす調整を行うことができない場合、逸脱しているパラメータに関与する光学アセンブリ２００の構成要素又はシステム１００の他の構成要素は置換されてもよい。そのような構成要素が置換されない場合、光学アセンブリ２００又はシステム１００を共に拒絶することが所望され得る。

Ｃ．位相較正方法の例

上述したように、光学系２００は、アクチュエータ２７２の作動を通じて、位相シフトを提供してもよく、アクチュエータ２７２は、線形経路ＬＰ１に沿って反射要素２７０の位置を変化させることによって光学系２００の位相を変化させ得る。また上述したように、アクチュエータ２７２は、圧電可動素子又は任意の他の好適な構成要素を備えていてもよい。アクチュエータ２７２が圧電可動素子を含む変形例では、線形経路ＬＰ１に沿った反射要素２７０の位置は、圧電可動素子に印加される電圧に基づいて変化し得る。したがって、様々な位相を、アクチュエータ２７２に提供される、様々な対応する電圧と関連付け得る。アクチュエータ２７２及び反射要素２７０の電圧－移動較正曲線は、位相移動の精度に直接影響し得る。これは、アクチュエータ２７２及び反射要素２７０を組み込んだシステム１００によって提供されるＳＩＭ再構成の品質に影響を及ぼし得る。したがって、正確な位相シフトを達成するために、アクチュエータ２７２の電圧を較正する方法を提供することが所望され得る。このような方法の一例を、図８を参照して以下に詳細に説明する。場合によっては、このプロセスは、光学アセンブリ１００が最初に使用される前に行なってもよい。加えて、又は代替的に、このプロセスは、図７を参照して上述したプロセスを使用して得られたデータにより、光学アセンブリ１００の位相シフトが不正確であることを示すデータが明らかとなった場合に行われてもよい。

本実施例では、アクチュエータ２７２の電圧を較正する方法は、上述の１２画像ＳＩＭスタックのような、１２画像ＳＩＭスタックによって定義される作業の単位を使用して行われる。上述のように、この１２画像ＳＩＭスタックは、各チャネルからの６つの画像を含んでもよい。各チャネルについて、６つの画像のセットは、（例えば、図５Ａ及び図５Ｂに示すように）格子切り替え部２５０が第１の状態にある間に、反射要素２７０が、線形経路ＬＰ１に沿う３つの異なる位置に配置されて撮影された３つの画像と、（例えば、図５Ｃ及び図５Ｄに示すように）格子切り替え部２５０が第２の状態にある間に、反射要素２７０が、線形経路ＬＰ１に沿う同じ３つの異なる位置に配置されて撮影された他の３つの画像と、を含む。換言すれば、各チャネルについての６つの画像からなる各セットは、格子切り替え部２７０の各状態について、３つの関連する位相（例えば、位相０、位相１、及び位相２）を有することとなる。言い換えれば、各チャネル－角度ペアは、３つの対応する位相にある３つの画像を有してよい。当然ながら、このプロセスは、代わりに、チャネル、角度、及び位相ペアリングの任意の他の組み合わせに適用されてもよい。

図８のブロック５００に示すように、位相較正プロセスは、推定ウィンドウサイズＮ、第１の位相ステップ及び第２の位相ステップについての位相ステッピング目標（例えば、それぞれ１２０度及び２４０度）、並びに１０度未満の位相ずれ目標を用い、最も焦点の合ったＳＩＭスタック内の画像を選択することから開始してもよい。

次に、このプロセスは、図８のブロック５０２に示すように、画像視野の中心ウィンドウを所定のサイズ（例えば、１０２４×１０２４ピクセル）にトリミングすることを含んでもよい。このトリミングされた画像を用い、プロセスは、図８のブロック５０４に示すように、格子間隔、格子角度、並びに各チャネル及び各角度についての変調を特定するために、ＳＩＭパラメータ推定を実行してよい。このＳＩＭパラメータ推定は、図７に示すプロセスについて上記に提供された教示に従って実行されてもよい。

ＳＩＭパラメータ推定が完了すると、プロセスは、図８のブロック５０６に示すように、各チャネル－角度ペアについてＷｉｃｋｅｒの位相リファインメント手順を実行して、各画像の位相を推定してよい。Ｗｉｃｋｅｒの位相推定プロセスは、上記の教示に従って行ってよい。

プロセスはまた、図８のブロック５０８に示すように、各チャネル－角度ペアからの３つの位相画像のそれぞれから、３つの位相値を収集してもよい。次に、プロセスは、図８のブロック５１０に示されるように、各チャネル－角度ペアについて位相をアンラップしてよく、そのため、位相値は、段階的に単調に増加する。この位相のアンラップは、各連続するチャネル－角度ペアに３６０度を加えることを含んでもよい。

次に、プロセスは、図８のブロック５１２に示すように、各チャネル－角度ペアについて、第１の画像と第２の画像との間の位相シフトを、ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２＝ｕｎｗｒａｐｐｅｄ ｐｈａｓｅ ２－ｕｎｗｒａｐｐｅｄ ｐｈａｓｅ １として計算してよい。その後同様に、プロセスは、各チャネル－角度ペアについて、第１の画像と第３の画像との間の位相シフトを、ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３＝ｕｎｗｒａｐｐｅｄ ｐｈａｓｅ ３－ｕｎｗｒａｐｐｅｄ ｐｈａｓｅ １として計算してよい。

次に、プロセスは、図８のブロック５１４に示されるように、ＳＩＭスタックにわたり、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値及び全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値を求めてよい。全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値及び全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値が所定範囲内（例えば、目標位相シフトステップの１０度以内）である場合、図８のブロック５２２に示すように、電圧が適切に較正された状態でプロセスが完了したものと見なされてよい。

ＳＩＭスタックにわたる全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値及び全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値の評価により、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値及び全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値が所定範囲内にないことが明らかとなった場合、プロセスは、図８のブロック５１６に示すように、各チャネル－角度ペアに対する所望の設定値の目標を達成するために必要な、比例ゲインの計算に進んでよい。そのため、プロセスは、第１の画像と第２の画像との間の位相シフトのためのゲインを、ｇａｉｎ１２＝１２０／（ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２）として計算してもよく、式中、ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値の単位は度である。そのため、プロセスは、第１の画像と第３の画像との間の位相シフトのためのゲインを、ｇａｉｎ１３＝２４０／（ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３）として計算してもよく、式中、ｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値の単位は度である。これらの比例ゲインの計算は、全てのチャネル－角度ペアについて行われてよい。

比例ゲインの計算が完了した後、プロセスは、図８のブロック５１８に示すように、計算されたゲインを現在の電圧値に適用することによって、アクチュエータ２７２に対する新規電圧を確立してよい。第１の位相（例えば、「位相０」）については、電圧は変化しないままであってもよい。第２の位相（例えば、「位相１」）については、新規電圧は、第２の位相（位相１）についての元の電圧に、上記で計算したｇａｉｎ１２値を乗じたものであってもよい。第３の位相（例えば、「位相２」）については、新規電圧は、第３の位相（位相２）についての元の電圧に、上記で計算したｇａｉｎ１３値を乗じたものであってもよい。これらの新規電圧計算は、全てのチャネル－角度ペアについて行われてよい。

新規電圧が全てのチャネル－角度ペアに対して確立されると、図８のブロック５２０に示すように、新規のＳＩＭ画像スタックが撮像される際に、新規電圧がアクチュエータ２７２に印加されてもよい。次に、図８に示すように上述のプロセスを繰り返して、新規電圧により、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値と全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値とが所定範囲内となったかどうかを判定してよい。新規電圧により、実際に、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値と全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値とが所定範囲内となった場合、プロセスは完了してもよい。新規電圧により、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値と全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値とが所定範囲内となっていない場合、本プロセスは、電圧により、全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１２値と全てのｐｈａｓｅ＿ｓｈｉｆｔ＿１３値とが所定範囲内となるまで、必要な回数にわたって再反復されてよい。

Ｄ．代替的な標的デバイスの例

上述したように、システム１００は、撮影標的として試料容器１１０を提供してもよい。いくつかの他の例では、標的デバイスを、試料容器１００の代わりに提供することが望ましい場合があり、この標的デバイスは、較正及び品質管理チェック目的専用である。このような専用の標的デバイスは、試料容器１１０の代わりにシステム１００内に収まるようにサイズ決め及び構成されていてよく、専用の標的デバイスが、試料容器によって提供されるものと同様の厚さ及び撮影面を有し得るようになっていてよい。専用の標的デバイスは、画像標的表面上に１つ以上の光学パターンを更に含んでいてもよい。ＳＩＭシステムの場合、それらの光学パターンがどのように画定されるかについて、特別な注意を払う必要があり得る。非ＳＩＭシステムで使用される際に、専用の標的デバイスに好適であり得る光学パターンは、ＳＩＭシステムでの使用に好適ではない場合がある。例えば、互いに平行であり、互いに一貫して離れている直線のアレイを使用する光学パターン、完全なグリッドに整列したドットのアレイ、又は規則的な繰り返し要素を有する何らかの他のパターンは、ＳＩＭシステムにおいて所望のモアレ・エイリアシング効果を提供しない場合がある。換言すれば、このようなパターンによっては、構造的に照明された干渉縞の周波数ピークを、標的パターンのアーチファクト周波数ピークから見分けることができない場合がある。

上記を考慮すると、ＳＩＭシステムでの使用専用である標的デバイスにおいては、光学パターン内にランダム化を提供することが所望され得る。これは、ランダムな不規則な様式で配置されたドット、線、又は他の特徴のパターンを含んでもよい。いくつかの例では、光学パターンは疑似ランダム化されていてもよい。このような疑似ランダム化の例を図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａでは、ドットの組は、ドットが互いに等距離に離間するように、規則的な配置で示されている。図９Ａのこの構成は、非ＳＩＭシステムのための標的デバイスでの使用に好適であり得るが、ＳＩＭシステムのための標的デバイスでの使用には好適でない。疑似ランダム化を提供するために、標的の設計では、整ったアレイドットから始め、次いで、各ドットをランダムに移動させて、図９Ｂに示されるようなパターンに到達させてもよい。図９Ｂに示すような疑似ランダム化されたパターンのドットにより、構成は、ＳＩＭシステムのための標的デバイスでの使用に好適なものとなり得る。

図９Ａ及び図９Ｂを参照して上述した実施例では、図９Ｂのパターンは、パターンが最初に規則的な配置で提供されているため、「ランダム化」されたのではなく、「疑似ランダム化された」のである。この「疑似ランダム化」は、「純粋なランダム化」よりも好ましい場合がある。これは、このランダム化プロセス（すなわち、図９Ａのパターンを図９Ｂに示されるようなパターンに変換すること）では、「疑似ランダム化された」パターンにおけるドット間に、所定の最小量の間隔を提供し得るためである。換言すれば、疑似ランダム化プロセスにより、パターンにおけるドットが互いに少なくとも一定の距離だけ離れていることが確保され得る。このことは、ＳＩＭイメージングにおいて重要となる場合があり、それは、標的光学パターン内におけるドットが互いに接近し過ぎている場合には、ＳＩＭイメージングの結果が許容不能なものとなったり、さもなくば、理想未満のものとなってしまう場合があるからである。その他、最小ドット間隔の規則を設けることとは別に、疑似ランダム化では、図９Ａの規則的なアレイからのドットの再配置を純粋にランダムにすることができる。

ＳＩＭシステムにおける較正及び品質管理チェックのための専用の標的デバイスは、上述のドットパターンを含むことに加えて、又はその代わりに、他の光学的特徴を含んでもよい。例えば、標的デバイスは、パターン化された線アレイを含んでいてもよい。このような線アレイは、線ペアを含んでいてもよい。各線ペアは、構造化照明の必要な／予想の角度で傾斜していてもよい。したがって、線ペアの位相と一致するように、また線ペアの位相からずれるように、パターン化された光がシフトされると、（強め合い／同位相及び弱め合い／逆位相の干渉の範囲の結果として）得られる強度における差により、２つのパターン間の平行度の測定が可能となり得る。図１０に示されるように、構造化照明（ｂ／ｄ）が、線ペア（ａ）と位相が一致するように（ｂ）、また位相がずれるように（ｄ）にシフトされると、これにより、それぞれ強め合いの干渉及び弱め合いの干渉により、より強い強度（ｃ）又はより弱い強度（ｅ）が測定される。印刷した線ペア、及び構造化照明の２つのパターンが完全に平行／オン－アングルである場合、得られる強度プロファイルは、図１１Ａに示されるような均一に傾斜した線をもたらすものと予想され得る。しかしながら、構造化照明パターンがオフ－アングルである場合、結果として生じる強度シグネチャにより、軸外角度（off-axis angle）の程度に応じて、図１１Ｂに示されるような周期的な暗い部分が明らかとなり得る。

また、専用の標的デバイスは、光学系２００からの光に応答して蛍光を発する流体を含む流体チャネルを含むことが望ましい場合もある。試料容器１１０がまた、流体チャネルを（例えば、フローセルの一部として）収容し得る限り、そのような流体チャネルの一部は比較的厚くなり得る。比較的厚い流体チャネルは、再結像された縞の変調がより少なく測定され得るため、ＳＩＭイメージングにあまり寄与しない場合がある。

図１２は、流体チャネルの深さに基づく、様々な変調プロットの例を示す。プロット６００は、位相に対する変調の形で入力信号を示している。プロット６０２は、再結像された縞の変調を表す、比較的厚い流体チャネル（例えば、厚さ約７５μｍ）からの信号の例を示す。図示のように、比較的厚い流体チャネルによる再結像された変調は、入力変調よりもかなり小さい。プロット６０４は、再結像された縞の変調を表す、比較的薄い流体チャネル（例えば、厚さ約３μｍ）からの信号の例を示す。図示のように、比較的薄い流体チャネルによる再結像された変調は、比較的厚い流体チャネルによる再結像された変調と比べると、入力変調に実質的に近い。単なる例として、比較的厚い流体チャネルによる再結像された変調は、入力変調の約３０％となり得、比較的薄いチャネルによる再結像された変調は、入力変調の約７０％となり得る。プロット６０６は、再結像された縞の変調を表す、更に薄い流体チャネル（例えば、３μｍよりも任意に薄い）からの信号の例を示す。

これらのプロット６００、６０２、６０４、６０６を比較することによって分かるように、流体チャネルが薄くなるほど、再結像された変調は、入力変調に近くなる。流体チャネルの厚さが０μｍに近づくにつれて、再結像された変調は入力変調に近くなる。これにより、流体チャネルを製造可能な限り薄く設計することが促される。しかしながら、流体チャネルを薄くし過ぎると、流体チャネル内の染料の光安定性に悪影響を及ぼし得る。したがって、流体チャネル内の染料の光安定性と再結像された変調の精度との間の適切なバランスをとることが望ましくなり得る。あくまで例としてであるが、適切なバランスは、約３μｍの流体チャネル厚さであり得る。あるいは、許容可能なバランスは、約２μｍ～約１０μｍの流体チャネル厚さであり得る。

Ｖ．その他

前述の説明は、当業者が本明細書に記載される様々な構成を実践することを可能にするために提供される。対象技術は、様々な図及び構成を参照して特に説明されてきたが、これらは例示目的のみのためであり、対象技術の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。

主題技術を実施するための多くの他の方法が存在し得る。本明細書に記載される様々な機能及び要素は、主題技術の範囲から逸脱することなく、示されるものとは異なって分割され得る。これらの実施態様に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり得、本明細書で定義される一般的な原理は、他の実施態様に適用することができる。したがって、主題技術の範囲から逸脱することなく、当業者によって、多くの変更及び修正を主題技術に行うことができる。例えば、異なる数の所与のモジュール又はユニットが用いられ得、異なる種類若しくは複数の種類の所与のモジュール又はユニットが用いられ得、所与のモジュール又はユニットが追加され得、あるいは所与のモジュール又はユニットが省略され得る。

本明細書に記載される実施例のいくつかの変形例は、コンピュータシステムを使用して実現されてもよく、このコンピュータシステムは、バスサブシステムを介して多数の周辺デバイスと通信する少なくとも１つのプロセッサを含んでいてよい。これらの周辺デバイスは、例えば、メモリデバイス及びファイル記憶サブシステムなどの記憶サブシステム、ユーザーインターフェース入力デバイス、ユーザーインターフェース出力デバイス及びネットワーク・インターフェース・サブシステムを含んでいてよい。入力及び出力デバイスは、コンピュータシステムとのユーザー対話を可能にし得る。ネットワーク・インターフェース・サブシステムは、他のコンピュータシステム内の対応するインターフェースデバイスへのインターフェースなど、外部ネットワークへのインターフェースを提供し得る。ユーザーインターフェース入力デバイスは、キーボード、マウス、トラックボール、タッチパッド、又はグラフィックスタブレットなどのポインティングデバイス、スキャナ、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システム及びマイクロフォンなどのオーディオ入力デバイス、並びに他の種類の入力デバイスを含んでいてよい。一般に、用語「入力デバイス」の使用は、コンピュータシステムに情報を入力するための全ての可能な種類のデバイス及び方法を含むことを意図している。

ユーザーインターフェース出力デバイスは、ディスプレイサブシステム、プリンタ、ファックス装置、又はオーディオ出力デバイスなどの非視覚ディスプレイを含んでいてよい。ディスプレイサブシステムは、陰極線管（Cathode Ray Tube、ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（Liquid Crystal Display、ＬＣＤ）などのフラットパネルデバイス、投影デバイス、又は可視画像を作成するための何らかの他の機構を含んでいてよい。ディスプレイサブシステムはまた、音声出力デバイスなどの非視覚ディスプレイを提供してもよい。一般に、用語「出力デバイス」の使用は、コンピュータシステムからユーザー又は別のマシン若しくはコンピュータシステムに情報を出力するための、全ての可能な種類のデバイス及び方法を含むことを意図している。

記憶サブシステムは、本明細書に記載されるモジュール及び方法のうちのいくつか又は全ての機能を提供するプログラミング及びデータ構築物を記憶してよい。これらのソフトウェアモジュールは、一般に、コンピュータシステムのプロセッサ単独で、又は他のプロセッサとの組み合わせで実行されてもよい。記憶サブシステムで使用されるメモリは、プログラム実行中に命令及びデータを記憶するための、メインのランダムアクセスメモリ（random access memory、ＲＡＭ）、固定命令が記憶された読み取り専用メモリ（read only memory、ＲＯＭ）などの、多数のメモリを含んでいてよい。ファイル記憶サブシステムは、プログラム及びデータファイルのための永続的な記憶装置を提供してよく、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブと取り外し可能な関連媒体、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、光学ドライブ、又は取り外し可能な媒体カートリッジを含んでいてよい。特定の実施態様の機能を実装するモジュールは、記憶サブシステム内のファイル記憶サブシステムによって、又はプロセッサによってアクセス可能な他のマシン内に記憶されてよい。

コンピュータシステム自体は、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、コンピュータ端末、ネットワークコンピュータ、テレビ、メインフレーム、サーバファーム、広く分散した一組の緩くネットワーク化されたコンピュータ、又は任意の他のデータ処理システム若しくはユーザーデバイスを含む様々な種類のものであってよい。コンピュータ及びネットワークは絶え間なく変化する性質のものであるため、本明細書に記載されるコンピュータシステムの例は、開示される技術を例示する目的のための具体例としてのみ意図されている。本明細書に記載のコンピュータシステムよりも多く又は少ない構成要素を有する、コンピュータシステムの多くの他の構成が可能である。

方法ではなく製造物品として、プロセッサによって実行可能なプログラム命令を非一時的コンピュータ可読媒体（computer readable medium、ＣＲＭ）に格納してもよい。プログラム命令が実行されると、上述のコンピュータ実装された方法のうちの１つ以上を実施する。あるいは、プログラム命令は、非一時的なＣＲＭに格納されてもよく、適切なハードウェアと組み合わされたときに、開示の方法を実施するコンピュータ実装されたシステムのうちの１つ以上の構成要素となってもよい。

下線付き及び／又はイタリック体の見出し及び副見出しは、便宜上のみのために使用され、主題技術を限定するものではなく、主題技術の説明の解釈と関連して言及されない。当業者に既知である、又は後に知られることとなる、本開示全体を通して記載される様々な実施態様の要素に対する全ての構造的及び機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、主題技術に包含されることが意図される。更に、本明細書に開示された何物も、そのような開示が上記の説明において明示的に記載されているかどうかにかかわらず、公開専用であることを意図するものではない。

前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、以下でより詳細に考察される（かかる概念が相互に矛盾しないことを提供する）は、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられる。

Claims (20)

1. 複数の画像セットを受け取ることであって、前記複数の画像セットの各画像セットは、ある距離だけ被写体から離れて、光学系内の構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を使用して撮像された画像を含み、前記距離は、前記複数の画像セットの他の画像セットの画像が撮像された前記被写体からの距離とは異なり、前記複数の画像セットの各画像は、関連するチャネル及び関連する格子角度を有する、ことと、
   第１の画像セットを、前記第１の画像セットに対応する前記距離に少なくとも部分的に基づいて、前記複数の画像セットから分離することと、
   前記第１の画像セットの各画像に対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）値を測定することと、
   前記第１の画像セットの前記画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することと、
   前記第１の画像セットに対応する、前記特定された最小ＦＷＨＭスライスに対するパラメータ推定を実行することと、
   前記第１の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することと、
   前記第１の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、前記特定された最良の合焦パラメータを記憶することと、
   前記第１の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することと、
   前記第１の画像セットに対応する前記特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することと、
   前記第１の画像セットに対応する前記実行された変調計算に少なくとも部分的に基づいて、前記光学系に対応するパラメータ値を提示するレポートを生成することと、を含む、方法。
2. 第２の画像セットを、前記第２の画像セットに対応する前記距離に少なくとも部分的に基づいて、前記複数の画像セットから分離することと、
   前記第２の画像セットの各画像に対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）値を測定することと、
   前記第２の画像セットの前記画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することと、
   前記第２の画像セットに対応する、前記特定された最小ＦＷＨＭスライスにおいてパラメータ推定を実行することと、
   前記第２の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することと、
   前記第２の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、前記特定された最良の合焦パラメータを記憶することと、
   前記第２の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することと、
   前記第２の画像セットに対応する前記特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することと、を更に含み、
   前記生成されたレポートは、前記第１の画像セットに対応する前記実行された変調計算と、前記第２の画像セットに対応する前記実行された変調計算との組み合わせに少なくとも部分的に基づく、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の画像セットの各画像に対応する前記ＦＷＨＭ値を測定することは、前記第１の画像セットの各画像の中心推定ウィンドウで実行される、請求項１～２のいずれか一項以上に記載の方法。
4. 前記第１の画像セットに対応する、前記特定された最小ＦＷＨＭスライスにおいてパラメータ推定を実行することは、前記特定された最小ＦＷＨＭスライスの中心推定ウィンドウで実行される、請求項１～３のいずれか一項以上に記載の方法。
5. パラメータ指定の既定のセットに対して前記レポート内のパラメータを比較することを含むことと、
   前記レポート内のパラメータが前記パラメータ指定の既定のセットから逸脱していると判定することと、
   前記レポート内のパラメータが前記パラメータ指定の既定のセットから逸脱しているとの前記判定に少なくとも部分的に基づいて、前記光学系の１つ以上の特徴を調整することと、を更に含む、請求項１～４のいずれか一項以上に記載の方法。
6. 前記生成されたレポートは、前記光学系内の対物レンズと前記被写体との間の距離、前記複数の画像の各画像に対応する前記チャネル、角度インデックス、変調、ＦＷＨＭ値、格子間隔、及び格子角度からなる群から選択されるパラメータ値を含む、請求項１～５のいずれか一項以上に記載の方法。
7. 前記第１の画像セットの画像ペア間の位相シフトを計算することを更に含み、前記画像ペアの各画像ペアは、チャネル及び格子角度を共有しており、前記生成されたレポートは、前記計算された位相シフトを含む、請求項１～６のいずれか一項以上に記載の方法。
8. 前記計算された位相シフトを、位相シフトの所定範囲に対して比較することと、
   前記計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが、位相シフトの前記所定範囲外であると判定することと、
   前記計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが位相シフトの前記所定範囲外であると判定することに応答して、位相シフトの前記所定範囲外である前記位相シフトを補正するゲイン値を計算することと、を更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記計算されたゲイン値に少なくとも部分的に基づいて、新規位相シフト電圧を確立することと、
   前記新規位相シフト電圧を圧電素子に印加することであって、前記圧電素子は、前記光学系内で位相シフトを提供する、ことと、
   前記新規位相シフト電圧を前記圧電素子に印加した状態で、新しい画像セットを撮像することと、を更に含む、請求項８に記載の方法。
10. コンピューティングシステムに、請求項１～９のいずれか一項以上に記載の方法を実行することによって、データを処理させるように構成されたコンテンツを含む、プロセッサ可読媒体。
11. 装置であって、
    構造化照明を標的に向けて発する第１の光学アセンブリであって、前記第１の光学アセンブリは、
    発光アセンブリと、
    前記発光アセンブリによって発せられた光に第１のパターンを付与する第１の位相マスクと、
    前記発光アセンブリによって発せられた光に第２のパターンを付与する第２の位相マスクと、
    前記第１の位相マスク及び前記第２の位相マスクによって構造化された光の位相を調整する位相調整アセンブリと、を備える、第１の光学アセンブリと、
    第２の光学アセンブリであって、前記第２の光学アセンブリは、前記第１の光学アセンブリによって照明したときに、前記標的の画像を撮像する画像センサを備える、第２の光学アセンブリと、
    プロセッサであって、前記プロセッサは、
    複数の画像セットを受け取ることであって、前記複数の画像セットの各画像セットは、ある距離だけ被写体から離れて、前記第２の光学アセンブリを使用して撮像された画像を含み、前記距離は、前記複数の画像セットの他の画像セットの画像が撮像された前記被写体からの距離とは異なり、前記複数の画像の各画像は、関連するチャネル及び関連する格子角度を有する、ことと、
    第１の画像セットを、前記第１の画像セットに対応する前記距離に少なくとも部分的に基づいて、前記複数の画像セットから分離することと、
    前記第１の画像セットの各画像に対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）値を測定することと、
    前記第１の画像セットの前記画像にわたる平均ＦＷＨＭ値に少なくとも部分的に基づいて、最小ＦＷＨＭスライスを特定することと、
    前記第１の画像セットに対応する、前記特定された最小ＦＷＨＭスライスに対するパラメータ推定を実行することと、
    前記第１の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づいて、最良の合焦パラメータを特定することと、
    前記第１の画像セットに対応する前記実行されたパラメータ推定に少なくとも部分的に基づく、前記特定された最良の合焦パラメータを記憶することと、
    前記第１の画像セット内の各画像についての位相推定を実行することと、
    前記第１の画像セットに対応する前記特定された最良の合焦パラメータに少なくとも部分的に基づいて、変調計算を実行することと、
    前記第１の画像セットに対応する前記実行された変調計算に少なくとも部分的に基づいて、前記光学系に対応するパラメータ値を提示するレポートを生成することと、を実行する、プロセッサと、を備える、装置。
12. 前記標的は試料容器を含む、請求項１１に記載の装置。
13. 前記第１の光学アセンブリは、格子切り替え部を更に備え、前記格子切り替え部は、前記発光アセンブリから発せられた光を前記第１の位相マスク又は前記第２の位相マスクに向けて選択的に方向付けるか、又は許容する、請求項１１～１２のいずれか一項以上に記載の装置。
14. 前記位相調整アセンブリは、移動可能な反射要素を備える、請求項１１～１３のいずれか一項以上に記載の装置。
15. 前記位相調整アセンブリは、前記移動可能な反射要素を移動させるアクチュエータを更に備える、請求項１４に記載の装置。
16. 前記プロセッサは更に、前記第１の画像セットの画像ペア間の位相シフトを計算し、前記画像ペアの各画像ペアは、チャネル及び格子角度を共有している、請求項１１～１５のいずれか一項以上に記載の装置。
17. 前記プロセッサは更に、前記計算された位相シフトを、位相シフトの所定範囲に対して比較する、請求項１６に記載の装置。
18. 前記プロセッサは更に、
    前記計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが、位相シフトの前記所定範囲外であると判定し、
    前記計算された位相シフトのうちの少なくとも１つが位相シフトの前記所定範囲外であると判定することに応答して、位相シフトの前記所定範囲外である前記位相シフトを補正するゲイン値を計算する、請求項１７に記載の装置。
19. 前記プロセッサは更に、前記計算されたゲイン値に少なくとも部分的に基づいて、新規位相シフト電圧を確立し、前記位相調整アセンブリは、前記第１の位相マスク及び前記第２の位相マスクによって構造化された前記光の位相を調整する圧電素子を備え、前記新規位相シフト電圧は、前記圧電素子を作動させて、前記値の所定範囲に近い位相シフトを提供する、請求項１８に記載の装置。
20. 予め形成された光学パターンを備える標的デバイスを更に備え、前記標的デバイスは、前記第１の光学アセンブリが、前記予め形成された光学パターンに向かって構造化照明を発することを可能とし、前記標的デバイスは、前記第１の光学アセンブリによって照明したときに、前記画像センサが前記予め形成された光学パターンの画像を撮像することを可能にする、請求項１１～１９のいずれか一項以上に記載の装置。

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