JP2023500719A - 灌流細胞培養を実施するための方法およびシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、灌流細胞培養を実施するための方法およびシステムに関し、これにより、ブリードストリームの上清が回収される。

Description

本発明は、灌流細胞培養を実施するための方法およびシステムに関し、これにより、ブリードストリームの上清が回収される。

バイオマニュファクチャリングにおいて使用される最も一般的な培養モードは、バッチ細胞培養、流加（fed-batch）培養および灌流細胞培養である。これらの技術のうちの１つを選択するための理由は、タンパク質および／または宿主に関連する異なる因子にある。細胞は、担体上に付着してまたは懸濁してのいずれかで培養される。操作するための最も簡単なモードは、おそらく、バッチバイオリアクターである。接種後、細胞は、培地消費に起因する制限に達するまで、および、細胞密度が減少し始めるまで、増殖および産生する。第二の極めて一般的なプロセスは、流加培養であり、ここで、栄養素制限は、培養の間に異なる時点で、高度に濃縮されたフィード（feed）を添加することによって防止される。培養期間は、したがって、バッチモードにおけるよりも長く、および、最終生産性は増大する。

灌流細胞培養プロセスは、バイオリアクターが、高い生存細胞数を保持しながら、培養の間ずっと新鮮な培地を絶えず灌流させることによって、細胞に新鮮な栄養素を同時に提供することによって、および、消費された培地および任意に死細胞および標的生成物を取り出すことによって、数か月までの延長された期間にわたり、継続的に実行するのを可能にする。灌流技術の重要な利点は、バイオリアクター容積あたりのより高い収率、増大した柔軟性およびより一定の生成物品質を包含する。しかしながら、これを達成するためには、システムおよびプロセスは、極めて慎重に設定する必要がある。バッチ供給システムとは違って、灌流システムは、廃棄物を蓄積しない。発現されたタンパク質は、迅速に取り出され、および、精製に利用可能とすることができる － 不安定の傾向があるタンパク質にとって有意な利点。

培養中の細胞を維持しながら消費された培地を取り除くことは、濾過、例として、交互接線流濾過（ＡＴＦ）および標準的な接線流濾過（ＴＦＦ）などの異なる技術を使用して行うことができる。他の方法は、沈降デバイス、遠心分離または音響デバイスの使用を包含する。別の選択肢は、細胞をバイオリアクター中の基盤（キャピラリーファイバー、膜、固定された床におけるマイクロ担体など）に結合させることによって、細胞を保持することである。

好ましい設定についての詳細を提供する灌流細胞培養についての総説は、”Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review”, Jean-Marc Bielser et al., Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340において見出され得る。死細胞のみをブリーディングの間中ずっとシステムから取り出すことができる、濾過ベースの灌流システムは、”Potential of Cell Retention Techniques for Large-Scale High-Density Perfusion Culture of Suspended Mammalian Cells”, D. Voisard, F. Meuwly, P.-A. Ruffieux, G. Baer, A. Kadouri, Cytotechnology 28: 163-175, 1998において記載されている。

いくつかの灌流プロセスにおいて、限外濾過膜は、バイオリアクター中の生成物を保持するために使用される。これらのプロセスはまた、「濃縮供給バッチ」またはＣＦＢと呼ばれる。濃縮流加細胞培養は、追加の容積能力なしで、製造能力を増大させる。この特別な灌流プロセスについての情報は、William C. Yanga,*, Daniel F. Minklera, Rashmi Kshirsagarb, Thomas Ryllb, Yao-Ming Huanga, Journal of Biotechnology 217 (2016) 1-11において見出される。

図１は、技術水準の細胞培養バイオリアクターの概略図を示す。液体細胞培養培地および細胞を包含する細胞培養物（２）を含むバイオリアクター（１）は、攪拌器３によって任意に撹拌される。新しい新鮮な培地は、Ｑ－イン（Ｐとも呼ばれる）を介して添加され得る。細胞、液体培地および標的生成物を包含する収穫ストリームは、Ｑ収穫線を介して、バイオリアクター（１）を去る。Ｑ収穫は、しばしばＨとも呼ばれる。細胞保持デバイス（４）は、細胞フリーまたは細胞低減収穫が回収できるように、例として上に記載の方法によって細胞を保持する。典型的には、灌流細胞培養において、培地は、Ｑ－収穫を介して、絶え間なく供給され、収穫は、Ｑを介して絶え間なく取り除かれる。

一旦、細胞密度が所望される指定地点に達すると、過剰細胞は、定常細胞濃度を維持するために、および、定常状態の操作を達成するために、取り除かれる必要がある。これは、ブリードストリームＱ－ブリード（Ｂとも呼ばれる）を介して行われる。このストリームは、液体および固体部分を包含し、それは、懸濁液である。固体部分は、生存細胞および非生存細胞を包含し、液体部分は、液体細胞培養培地ならびに液体中に存在する廃棄構成要素および標的生成物を包含する。バイオリアクター中の一定の容積を維持するために、典型的には、Ｑ－イン ＝ Ｑ－収穫 ＋ Ｑ－ブリード（またＰ＝Ｈ＋Ｂと呼ばれる）であり、これは、Ｑ－インを介してバイオリアクターに新たに添加された細胞培養培地の容積は、Ｑ－収穫およびＱ－ブリードを介して取り除かれる容積と等しい必要があることを意味する。

例えば、Jean-Marc Bielser et al., Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340において考察されるように、このブリードストリームは、標的生成物の回収なしで、浪費される。その結果として、プロセス収率を最大化するために、ブリードストリーム比率は、典型的には最小化される。それにもかかわらず、プロセスの性能および収率は、異なる流量に依存する。増大した灌流量は、一般に、より多くのバイオマスの生成、およびよってより多くの標的生成物の生成を可能にする。細胞の増殖が速くなると、ブリード比率は大きくなり、収率の喪失につながる。安定した操作は、したがってしばしば、細胞密度が経済学的に実行可能な生産性を達成するのに充分に大きい範囲内であるが、細胞増殖が栄養素制限または他の環境因子のいずれかによってブリード比率を最小化するように制御される状態で、規定される。

よって、経済的な細胞密度だけでなく、高く、より生産的な細胞密度を可能にする方法を見出すことが好ましいだろう。これは、バイオリアクターシステムにブリード回収デバイスを挿入することによって可能であることが見出されている。このデバイスを用いて、過剰な生存細胞および非生存細胞を取り除くために、バイオリアクターから取り出される必要があるが、常にまた標的生成物を含有するブリードは、主に細胞を含む固体画分および標的生成物を含む液体を含む液体画分において最初に分離される。

液体画分は、次いで、バイオリアクターに戻されるように方向づけられるか、または、それは、収穫ストリームに方向づけられ得る。これにより、ブリード中に存在する標的生成物の主要な部分は、浪費されず、回収することができる。これは、より高いプロセス収率に繋がり、および、プロセス最適化におけるさらなる自由度を可能にする。なぜなら、標的生成物の喪失を低減するブリードストリームを制限する必要性がもはや存在しないからである。このブリードストリームは、より高い生成物収率に好ましい場合、さらに拡大され得る。

本発明は、よって、培地入口および収穫出口を有するバイオリアクターを含むバイオリアクターシステムに関し、典型的には細胞保持デバイスを含み、それにより、バイオリアクターはさらに、ブリードのための入口を有するブリード回収デバイス、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段、および、出口を含み、入口は、バイオリアクターからのブリードを、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段、および、バイオリアクターおよび／または収穫にブリードの液体部分を導く出口に導く。細胞は、経時的におよび数回のサイクルで、ブリード回収デバイスに蓄積する。したがって、柔らかい容器が好ましい。サイクルの間の細胞スラリーの除去はまた、可能である。

図１は、技術水準の細胞培養バイオリアクターの概略図を示す。 図２は、本発明に従うブリード回収デバイスを含む灌流バイオリアクターシステムの概略図を示す。 図３は、ブリード回収デバイスからの細胞の沈降後の、バイオリアクターへの再供給されるブリードの液体部分の生存細胞密度を示す。 図４は、本発明に従う２ｖｖｄを有する灌流プロセスのための例示の流量のスキームを示す。 図５Ａは、ブリード回収操作を開始したとき、バイオマスによる自動化定常状態制御を、ブリード回収と組み合わせた定常状態の手動制御に切り替えることを示す。図５Ｂは、実験は、２つの相に分割されることを示す。 図６は、哺乳動物細胞株の、経時的な沈降の傾向線を示す。 図７は、ブリード回収プロセスの逐次的なステップ：（１）バイオリアクターからの細胞懸濁液のブリード；（２）細胞性粒子からの流体の沈降／分離；（３）透明な上清の再供給操作、を記載する。 図８は、２つの異なるポンプ速度を有するラン１の透明な上清の再供給プロセス（流出）を説明する。 図９は、試料ポートを使用する、生存細胞密度の等価な測定を説明する。 図１０は、実験の相１が観察できることを示す。 図１１は、実験の相２が観察できることを示す。

好ましい態様において、システムはさらに、ブリードの流体ストリームをブリード回収デバイスに制御し、および、特に、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に制御するためのポンプ、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から出て、ブリード回収デバイスの出口を通って、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻す、ブリードの液体部分のストリームを制御するためのポンプを含む。

最も単純な場合において、１つの線または管、１つのポンプおよび１つの容器は、ブリード回収を達成するのに充分である。しかしながら、追加の管およびポンプは、ブリード回収デバイスの効率を増大し得る。一態様において、交互に利用され、準連続操作を可能にする、２つの別々の設定容器が存在する。

好ましい態様において、システムは、加えて、プロセス管理システムを含む。

好ましい態様において、ブリード回収デバイスの入口は、管、好ましくは封管可能なプラスチック管である。管の封管は、ポンプによって、バルブまたは他のロック機構によって行われ得る。

好ましい態様において、ブリード回収デバイスの出口は、管、好ましくは封管可能なプラスチック管である。管の封管は、ポンプによって、バルブまたは他のロック機構によって行うことができる。

好ましい態様において、ブリード回復デバイスの出口は、バイオリアクターへ繋がる。好ましくは、それは、水浸（submers）位置で、バイオリアクターに侵入し、これは、培地および細胞懸濁液の表面未満の位置を意味する。

別の好ましい態様において、ブリードの細胞を、ブリードの液体部分から分離するための手段は、細胞の沈降のための容器である。

好ましい態様において、ブリード回収デバイスの出口は、入口に関して反対側、および、該反対側の上半分において、細胞の沈降のための容器に接続されている。

極めて好ましい態様において、細胞の沈降のための溶液は、最も小さい寸法が、水平に位置するその高さである、平らな容器である。
極めて好ましい態様において、平らな容器は、プラスチックバッグである。

本発明はまた、灌流細胞培養のためのプロセスに関し、培地入口および収穫出口を有するバイオリアクター、ならびに、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段にバイオリアクターからのブリードを導くブリード入口、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から、ブリードの液体部分を、バイオリアクターまたは収穫出口に戻るように方向づける出口、を有するブリード回収デバイス、を含むバイオリアクターシステム中で細胞を培養することを含み、これにより、
ｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、新しい細胞培養培地を、培地入口を介して、バイオリアクターに挿入する
ｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、収穫物を、収穫出口を介して、バイオリアクターから取り出す
ｉｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、ある量のブリードを、ブリード回収デバイスの入口を介してバイオリアクターから取り出し、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に方向づけ、細胞を液体部分から分離し、および、液体部分をブリード回収デバイスの出口を通って、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻す。

好ましい態様において、ｉｉｉにおいて、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻されるブリードの液体部分は、バイオリアクターから取り出されるブリード中に含まれる液体の７０％超、好ましくは８０％超、および、バイオリアクターから取り出されるブリードに含まれる細胞の１０％未満、好ましくは５％未満、例として、１～５％、例として、ほぼ１％、ほぼ２５、ほぼ３％またはほぼ４％を含む。

好ましい態様において、ｉｉｉは、ブリード回収デバイスの入口を介してバイオリアクターからある量のブリードを取り出すこと、それを、容器を含むブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に方向づけること、細胞が該容器の底に向かって定着するように、いくからの時間ブリードを該容器中に定着させること、その後、ブリード回収デバイスの出口を通って、細胞が低減した、定着した細胞の上の液体上清を取り出して、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻すことによって、細胞培養プロセスの間に１回または数回実施される。

好ましい態様において、ブリードが容器中に定着される時間は、３０分と２時間との間である。

好ましい態様において、プロセスステップｉ、ｉｉおよびｉｉｉは、バイオリアクター中の細胞培養物の容積が一定のレベルに維持されるように調節される。さらにまた、流量ＢおよびＨの高度な制御を介して、Ｐは、一定のままであり得、これは、定常状態の灌流操作の必須条件であると考えられる。

技術水準に従う灌流バイオリアクターシステムの概略図は、図１に見出すことができる。本発明に従うブリード回収デバイスを含む灌流バイオリアクターシステムの概略図は、図２に示される。
図３は、ブリード回収デバイスからの細胞の沈降後の、バイオリアクターへの再供給されるブリードの液体部分の生存細胞密度を示す。
図４は、本発明に従う２ｖｖｄを有する灌流プロセスのための例示の流量のスキームを示す。

図５～１１についての詳細は、例において見出すことができる。
細胞培養は、細胞が培養される任意の設定で存在する。
細胞培養は、典型的には、バイオリアクター中で実施される。

バイオリアクターは、瓶、管、槽、バッグ、フラスコおよび／またはタンクなどの、細胞の培養に好適な任意の容器である。典型的には、容器は、使用に先立ち滅菌される。細胞培養は、典型的には、環境からの外来微生物の混入を制限する、好適な温度、ｐＨ、浸透圧、通気、撹拌等々などの、細胞の増殖および／または維持に好適な条件下で水性細胞培養培地中の細胞のインキュベーションによって実施される。当業者は、細胞の培養のための好適なインキュベーション条件を知っている。本発明に従って使用されるバイオリアクターは、好ましくは、灌流細胞培養に好適なバイオリアクターである。

本発明において使用される好適なバイオリアクターシステムは、バイオリアクターおよび以下の１以上のような該バイオリアクター中で灌流細胞培養を実行するのに必要なさらなる装置を含む。
－ 撹拌のためのデバイス
－ バイオリアクターへのおよびバイオリアクターからの構成要素の供給および放出のためのデバイス（例として、管、ポンプ、バルブ、保管タンク）
－ 細胞保持デバイス（上記参照）
－ バイオリアクターの容積をモニタリングするためのシステム（例として、バイオリアクターバランス、レベルセンサ等々）
－ 温度、浸透圧、通気、撹拌等々を制御および維持するためのデバイス
－ 細胞培養バイオリアクターの自動化されたまたは部分的に自動化された操作のためのコンピュータシステム。

本発明に従う細胞培養培地（培養培地と同義的に使用される）は、細胞のインビトロでの増殖を維持および／または支持する、ならびに／あるいは、具体的な生理学的状態を支持または維持する、構成要素の任意の混合物である。

それはまた、血漿、血清、胚抽出物などの、明確ではない構成要素、または、他の明確ではない生物学的抽出物またはペプトンを含み得る。それはまた、好ましくは、化学的に明確な培地であってもよい。細胞培養培地は、インビトロ細胞増殖を維持および／または支持するために必要な全ての構成要素を含んでもよく、または、個別に添加されるさらなる構成要素（培地補充物）と組み合わせてまたは組み合わせずに、選択された構成要素の添加のために使用されてもよい。

本発明に従う細胞培養デバイスおよびプロセスは、細菌細胞などの原核細胞、ならびに、酵母、真菌、藻類、植物、昆虫および／または哺乳動物細胞、および、任意に、古細菌などの真核細胞を、増殖させるまたは増殖を維持／支持するのに好適であるように設計される。好ましい細胞は、哺乳動物細胞である。

化学的に明確な細胞培養培地は、化学的に十分に特徴づけられた「明確な」原材料を含む細胞培養培地である。これは、培地中で使用される全ての化学物質が知られている化学組成を意味する。化学的に明確な培地は、化学的に不明確な酵母、動物または植物組織などの化学的に不明確な物質を含まない；これらは、ペプトン、フィーダー細胞、血清、不明確な抽出物または消化物または、化学的に不十分に規定された（poorly defined）タンパク質および／またはペプチドおよび／または加水分解物を培地に寄与し得る他の構成要素を含まない。いくつかのケースにおいて、化学的に明確な培地は、化学的に明確であるタンパク質またはペプチドを含み得る － １つの例はインスリンである（以下の他のものを参照）。

液体細胞培養培地は、典型的には、好適な液体中に粉末状の細胞培養培地を溶解することによって産生される。

粉末状細胞培養培地または乾燥粉末培地または脱水培養培地は、典型的には、製粉プロセスまたは凍結乾燥プロセスから結果として生じる細胞培養培地である。それは、粉末状細胞培養培地が、典型的には、細かい顆粒状、微粒子培地であり、液体培地ではない。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と交換可能に使用され得る；しかしながら、「乾燥粉末」は、本明細書で使用されるとき、単に、顆粒化材料の肉眼外観を指し、他に指示されない限り、材料が、複合体化または凝集化した溶媒が全くないことを意味することを意図しない。粉末状細胞培養培地はまた、顆粒化細胞培地であり得る（例として、ローラー圧縮によって乾燥顆粒化された、または、流動層噴霧造粒によって顆粒化された）。かかる培地はまた、噴霧乾燥によって調製され得る。

液体細胞培養培地を調製するために使用される溶媒（液体とも呼ばれる）は、典型的には水（最も具体的には滅菌および／または脱イオン水または精製された水または注射用水または逆浸透法によって精製された水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標））または水性緩衝液である。溶媒はまた、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的にはｐＨ１～ｐＨ１０の範囲）を提供する可溶性酸性または塩基性イオン、安定剤、界面活性剤、保存料、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含み得る。

細胞の添加に先立つ、溶解された培地のｐＨは、典型的には、ｐＨ２～１２、より好ましくはｐＨ４～１０、さらにより好ましくはｐＨ６～８および最も好ましくはｐＨ６．５～７．５および理想的にはｐＨ６．８～７．３である。

細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての構成要素を含む細胞培養培地は、典型的には、少なくとも１以上の糖類の構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素（窒素塩基）またはそれらの誘導体を包含する。それはまた、組換えタンパク質、例として組換えインスリン、組換えＢＳＡ、組換えトランスフェリン、組換えサイトカイン等々などの化学的に明確な生化学物質を含み得る。

培地はまた、ピルビン酸ナトリウム、高度に精製されたおよびゆえに化学的に 明確に定義された抽出物、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはポロキサマー産物構成要素（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づくブロックコポリマー）とりわけポロキサマー１８８（ときにはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８またはＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８またはＬｕｔｒｏｌ Ｆ６８と呼ばれる）および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤などの表面活性構成要素を包含し得る。

好適な非イオン性界面活性剤の１つの例は、一級ヒドロキシル基で終わる二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、ポロキサマーとも呼ばれ、例としてＢＡＳＦ、Ｇｅｒｍａｎｙからの商品名プルロニック（登録商標）で入手可能である。かかるポロキサマー産物の構成要素は、以下で単に、ポロキサマーまたはプルロニックと呼ばれる。キレーター、ホルモンおよび／または成長因子はまた、添加され得る。

それが含み得る他の構成要素は、乳酸、チオグリコール酸、チオスルファート、テトラチオン酸、ジアミノブタン、ミオイノシトール、ホスファチジルコリン（レシチン）、スフィンゴミエリン、鉄含有化合物（鉄硫黄クラスターを有する化合物を含む）、尿酸、カルバモイルホスファート、コハク酸、チオレドキシン（単数または複数）、オロト酸、ホスファチジン酸、ポリアミン（プトレシン、スペルミジン、スペルミンおよび／またはカダベリンなど）、トリグリセリド、ステロイド（これに限定されないがコレステロールを包含する）、メタロチオネイン、酸素、グリセロール、尿素、アルファ－ケトグルタラート、アンモニア、グリセロホスファート、デンプン、グリコーゲン、グリオキシル酸、イソプレノイド、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、脂質（これらに限定されないがミセルのものを含む）、トリブチリン、ブチリン、コール酸、デオキシコール酸、ポリホスファート、アセタート、タートラート、マラートおよび／またはオキサラートの、純粋な化合物、塩、抱合体、および／または誘導体である。

糖類の構成要素は、グルコース、ガラクトース、リボースまたはフルクトース（単糖類の例）またはスクロース、ラクトースまたはマルトース（二糖類の例）などのすべての単糖類または二糖類、または、糖アルコールなどのそれらの誘導体である。糖類の構成要素はまた、オリゴ糖または多糖類であり得る。

本発明に従うアミノ酸の例は、具体的には、タンパク質原性アミノ酸、とくに必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤ－アミノ酸などの非タンパク質原性アミノ酸である。

チロシンは、Ｌ－またはＤ－チロシン、好ましくはＬ－チロシンを意味する。
システインは、Ｌ－またはＤ－システイン、好ましくはＬ－システインを意味する。
アミノ酸前駆体および類似体もまた包含される。

ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、および４つのカロテノイド）、ビタミンＢ_１（チアミン）、ビタミンＢ_２（リボフラビン）、ビタミンＢ_３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ_５（パントテン酸）、ビタミンＢ_６（ピロドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ_７（ビオチン）、ビタミンＢ_９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ_１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）（アスコルビン酸のホスファートを包含する）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体および類似体もまた包含される。

塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、ホスファート、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオン、または、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を包含する構成要素である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）、カリウム塩化物（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、無水リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）、無水リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）である。

緩衝剤の例は、カーボネート、シトラート、ホスファート、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。

補因子の例は、チアミン、ビオチン、ビタミンＣ、カルシフェロール、コリン、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ（還元型および／または酸化型）、コバラミン、ビタミンＢ１２、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、フラビンアデニンジヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン（還元型および／または酸化型および／またはダイマーとして）、ヘム、ヘミン、ヘモグロビン、フェリチン、ヌクレオチドホスファートおよび／または誘導体（例としてアデノシンホスファート）、補酵素Ｆ４２０、ｓ－アデノシルメチオニン、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、アセチルＣｏ－Ａ、モリブドプテリン、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンの化合物、塩、複合体および／または誘導体である。

核酸構成要素は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、キサンチンおよび／またはヒポキサンチンなどの核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、キサントシン、イノシン、グアノシンおよびチミジンなどのヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸などのヌクレオチド（これらに限定されないが、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなどの、デオキシ－および／またはホスファート誘導体および／またはそれらのダイマー、トリマーおよび／またはポリマーを包含する）である。

これらに限定されないが、使用される濃度で細胞増殖特性に有意に負に影響することなく、培地および／または１以上のその構成要素の透明性および／または可溶性を増大する、培地の物理化学的特性を改善する構成要素は、添加され得る。かかる構成要素は、これらに限定されないがキレート剤（例としてＥＤＴＡ）、抗酸化剤、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤（ポリソルベート８０など）、中和剤、（ポリソルベート８０など）、ミセル形成剤、ミセル阻害剤および／またはポリプロピレングリコール、ポリエチレンアルコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースを包含する。

用語「細胞密度」、「生存細胞密度」および「細胞濃度」は、本明細書に使用されるとき、互換的に、細胞培養の単位容積あたりの代謝的に活性な細胞の数を指す。
用語「灌流」または「灌流プロセス」は、バイオリアクター内の高濃度の細胞が新鮮な増殖培地を細胞培養の間に継続的にまたは１回以上受容し、それにより、標的生成物を含有し得る消費培地が収穫され、これは、細胞培養の間に継続的にまたは１回以上バイオリアクターから除去されることを意味する、標的生成物（例として、抗体または組換えタンパク質）を産生するために使用される細胞培養プロセスを指す。好ましくは、新鮮な増殖培地は、継続的にバイオリアクターに供給され、標的生成物を含有し得る消費された培地は、継続的に収穫される。

本発明のシステムおよびプロセスにおいて培養される細胞は、とりわけ、標的生成物（例として免疫グロブリン（例としてモノクローナル抗体または抗体フラグメント）、融合タンパク質、凝固因子、インターフェロン、インスリン、成長ホルモンまたは他の組換えタンパク質などの治療用生体分子）を発現することができる細胞であり得る。かかる細胞は、例として、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ．６細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ細胞等々であり得る。

「定常状態」は、典型的には、経時的に変化しないか、または、一方向の変化が、別の変化によって継続的に均衡する、安定な状態である。灌流において、定常状態は、「一定の生存細胞密度」によって定義され得る。一定の生存細胞密度は、一定の灌流量と組み合わせて、一定の細胞特異的灌流量（ＣＳＰＲ）を結果として生じ、これは、一般に定常状態を達成する重大な基準であると考えられる。

典型的には、灌流細胞培養を実施するために、少数の細胞および液体細胞培養培地は、バイオリアクターに導入され、および、培養条件は、細胞が分裂し、およびしたがって、増大する細胞密度を生じ、一方で標的生成物を発現するように、選択される。培養は、例として好適な程度の撹拌、酸素／空気の添加、ＣＯ_２および他の気体代謝体等々を包含する、当該分野において知られている方法に従って実施することができる。培養の間、様々なパラメータ（例としてｐＨ、導電率、代謝体濃度、細胞密度等々など）は、所定の細胞型に好適な条件を提供するように制御され得る。

細胞密度は、好適に、バイオリアクター中の細胞濃度が、１ｍｌあたり少なくとも百万個の細胞、好ましくは１ｍｌあたり少なくとも１千万個の細胞、典型的には、１ｍｌあたり１千万個～２千５百万個であるレベルまで増大される。上限は主に、極めて高密度の細胞懸濁液のレオロジー特性によって設定されるであろうし、ここで、撹拌および気体交換は、ペースト様一貫性がアプローチされるとき、妨害することができる。

灌流プロセスの他の欠点は、オペレーターがこの物理的限界（例として最大限の細胞保持デバイス流量、最大限のバイオリアクター酸素移動比率、生成物安定性における制限、および、培地が可能にする最も低い細胞特異的灌流量（ＣＳＰＲ））を達成するのを妨げるかもしれない。細胞生存率は、例として、少なくとも８０％または少なくとも９０％などの、少なくとも５０％であり得る。

バイオリアクター中の細胞によって発現される標的生成物の濃度は、少なくとも０．１ｇ／ｌまたは少なくとも２ｇ／ｌであり得る。典型的には、それは、０．１～５ｇ／ｌであるが、ＣＦＢのようないくつかのプロセスにおいて、生成物は、収穫されないが、バイオリアクター中に保持され、１０～３０ｇ／ｌまでの生成物濃度が達成され得る。

灌流細胞培養に好適な例示のバイオリアクターは、収穫の間にバイオリアクター中に細胞を維持する細胞保持デバイスを含む。この細胞保持デバイスは、音響性交互接線流濾過（ＡＴＦ）、セトラー、遠心分離等であり得る。いくつかの例において、使い捨ての、再利用可能なまたは半使い捨てのバイオリアクターが使用され得る。ハードウェア設計の任意の組み合わせが使用され得る。一例において、使い捨ての細胞保持デバイスが使用され得る。いくつかの態様において、使い捨て導管、チューブ、ポンプ、バッグアセンブリおよび細胞保持デバイスが、ハードパイプおよび再利用可能なデバイスの代わりに、使用される。

本発明のバイオリアクターシステムのバイオリアクターは、これらに限定されないが、約１Ｌ～約２０００Ｌを包含し、この例示の範囲に限定されない、任意の好適な容積を有し得る。ある例示のバイオリアクター容積は、これらに限定されないが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、５００、１０００、１５００Ｌ、任意の中間の容積等を包含する。

例示のバイオリアクターは、例えば、槽全体の体積、槽の高さと直径との間の比率、槽の立体配置（例として、バイオリアクターが、バッグのバイオリアクターであるかどうか）、増殖速度等に依存して、任意の好適な最小限および最大限の作業容積を有し得る。例えば、５Ｌバイオリアクターにおいて、例示の最小作業容積は、約１００ｍＬから約１Ｌまで変化し得、および例示の最大作業容積は、約３．５Ｌから約５Ｌまで変化し得る。２０Ｌバイオリアクターにおいて、例示の最小作業容積は、約１００ｍＬから約５Ｌまで変化し得、および例示の最大作業容積は、約１５Ｌから約１９Ｌまで変化し得る。２００Ｌバイオリアクターにおいて、例示の最小作業容積は、約２０ｍＬから約５０Ｌまで変化し得、および例示の最大作業容積は、約１５０Ｌから約１９０Ｌまで変化し得る。当業者は、上記の数値および範囲は、例示的であり、本発明の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。

バイオリアクターは、１以上のフィード（例として、細胞培養培地）、化学物質（例として、ｐＨ緩衝剤）、抗泡剤等の導入のための、１以上の入口（入口ポートとも呼ばれる）を包含する。それはまた、バイオリアクターからの細胞および／または液体の除去のための、１以上の出口（出口ポートとも呼ばれる）を包含し得る。バイオリアクター中の各入口および／または出口は、これらに限定されないが、１以上の蠕動ポンプ、１以上の加圧機構等を包含する、入口および／または出口を通る流体の流れを開始および実行するための任意の好適な機構を提供され得る。各入口および／または出口は、これらに限定されないが、１以上のマスフローメーター、１以上のフロー制御バルブ等を包含する、入口を通る流体の流れをモニタリングおよび制御するための任意の好適な機構を提供され得る。例えば、バイオリアクターは、バイオリアクターへ入るおよびこれから出ていく物質の流量を制御するためのフロー制御機構を包含し得る。

バイオリアクターはまた、容積および／またはレベルの制御のための手段を含み得る。
バイオリアクターは、細胞培養物に新しい細胞培養培地を導入するために、不連続な時期にまたは絶えず操作され得る、培地入口を含む。バイオリアクターは、消費された細胞培養液、細胞および／または標的生成物を放出するための、１以上の収穫出口を含む。収穫出口は、収穫の比率を制御するためのフロー制御バルブを含み得る。一態様において、収穫物は、収穫瓶または容器中に貯蔵され得る。

本発明のバイオリアクターシステムはさらに、ブリード回収デバイスを含む。フロー制御バルブは、ブリード比率およびブリード抽出期間を制御するために、その入口に提供され得る。

一態様において、バイオリアクターおよび／またはブリード回収デバイスの手段（６）（図２）は、例として柔らかいポリマー、例としてポリエチレン材料またはフィルムから構成された、柔らかい、非多孔性プラスチックバッグである。典型的には、バッグは、それに付着した装備（fitment）を有する。用語「装備」は、本明細書に使用されるときは、それに付着させるために、非多孔性バッグフィルムに溶接された（例として、熱溶接された）、別々の物体を指す。そのため、装備はしばしば、非多孔性バッグの壁を含むポリマー材料と同じまたは類似であり得るポリマー材料を含み得る。装備は、非多孔性バッグの壁よりも高密度の材料であり、および、機能性を可能にするようにバッグに添加され得る。装備の非限定例は、入口または出口を形成するものである。

本発明の好ましい態様において、非多孔性バッグは、バッグに液体または細胞を添加するかこれを引き出すために、非多孔性バッグの壁に少なくとも１つの入口および出口を含み、これにより、それは、入口および出口が組み合わされたものか、または、別々の入口および別々の出口であり得る。バッグはまた、１より多くの入口および／または１より多くの出口を含み得る。ブリード回収デバイスの手段（６）の場合において、バッグは好ましくは、１つの入口および１または２つの出口を含む。

典型的には、チューブは、入口および／または出口に接続される。
本発明の様々な態様において、ブリード回収デバイスの非多孔性バッグは、上段パネルおよび下段パネルを含む二次元使い捨てバッグ、または、三次元使い捨て卓上バイオリアクターバッグ、または、支持体構造を有する使用のための使い捨てバイオリアクターバッグである。非多孔性バッグは、例えば、１リットル、１０リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、または５０００リットルの内部容積を有する、任意のサイズであり得る。

チューブは、典型的には、プラスチックまたは金属から製造された、柔らかいまたは柔らかくないチューブである。好ましくは、それは、柔らかいプラスチックチューブである。チューブの直径および長さは、バイオリアクターシステムのサイズに依存する。典型的には、チューブの内径は、２～５０ｍｍ、典型的には２～３０ｍｍである。

典型的には、バイオリアクターシステムはまた、チューブを介して接続されたポンプおよびバルブを含む。ポンプは、バイオリアクターからの液体または懸濁液または細胞スラリーを、例として、収穫またはブリード回収デバイスへの輸送のための、または、例として、収穫またはブリード回収デバイスからの、バイオリアクターまたは他の位置への、液体または懸濁液または細胞スラリーの輸送のための、ものである。好適なポンプの例は、蠕動ポンプ、磁気的に接続されたポンプ、膜ポンプ等々である。

バルブは、例として、液体、細胞懸濁液または細胞スラリーの流れを妨げる、可能にする、または、方向づけることができるように、位置付けられる。好適なバルブの例は、例として、ソレノイドバルブまたはピンチバルブである。

バイオリアクターシステムは、これらに限定されないが、入口ポートの状態、出口ポートの状態、マルチウェイマニフォールドの状態、キャパシタンスプローブ、細胞培養容積センサ、細胞培養バイオリアクター重量センサ、液体レベルセンサ、温度計、ｐＨプローブ、酸素プローブ、乳酸プローブ、アンモニアプローブ、撹拌速度のセンサ、代謝流動センサ、代謝率センサ、灌流量センサ、一酸化炭素センサ、質量分析、ガスクロマトグラフィー、それらの組み合わせ等を含む、リアルタイムで１以上の操作パラメータを検出するための１以上のセンサまたはプローブを包含し得る。

これらのセンサは、これらに限定されないが、生存細胞密度（キャパシタンスプローブ、または、細胞密度のオンライン測定を提供する任意の代替方法を使用する）、細胞培養容積、細胞培養重量、細胞培養液体レベル、温度、ｐＨ、溶解した酸素、撹拌速度、代謝流動、代謝率、灌流デバイスの灌流量、酸素取り込み率、二酸化炭素産生（例として、ガスクロマトグラフィー、質量分析を使用する）、乳酸レベル、アンモニアレベル、それらの組み合わせ等を包含する、１以上の操作パラメータを検出し得る。バイオリアクターはまた、ソフトセンサを含み得る。

バイオリアクターおよびその入口ポート、出口ポート等は、センサデータの多変量解析を実施するように、および、解析に基づいてリアルタイムでバイオリアクターの操作を自動的に制御するように、設計またはプログラムされた、１以上のプロセス管理システムに接続され得る。プロセス管理システムは、例えば、入口または出口のポートを開放／閉鎖することによって、マルチウェイマニフォールドの状態を変更することによって、バイオリアクターシステムの灌流量を変更することによって、細胞培養物の撹拌速度、温度、ｐＨ、溶解した酸素のレベル、それらの組み合わせ等を変更することによって、操作を制御し得る。

ブリード回収デバイスは、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、バイオリアクターからのブリードを導く、ブリードのための入口、ならびに、バイオリアクターおよび／または収穫出口に、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から導く、ブリードの液体部分のための出口を含む。この場合における収穫出口は、収穫出口の任意の部分、例として、管または収穫容器を意味する。ブリード回収デバイスは、柔らかいかまたは硬い材料、金属、または好ましくは、明確な閉鎖された滅菌容積を形成するプラスチックで構成され得る。

本発明に従うブリード回収デバイスを含む灌流バイオリアクターシステムの概略図を、図２に示す。
液体細胞培養培地および細胞を包含する細胞培養物（２）を有するバイオリアクター（１）は、任意に、撹拌器（３）によって撹拌される。新しい、新鮮な培地は、Ｑ－インを介して添加され得る。細胞、液体培地、および標的生成物を包含する収穫ストリームは、Ｑ－収穫線を介して、バイオリアクター（１）を出る。細胞保持デバイス（４）は、例として、無細胞収穫物が回収され得るように、上に記載の方法によって、細胞を保持し、および、細胞は、バイオリアクター中に保持される。バイオリアクターから取り出されるべきブリードは、Ｑ－ブリードを介してそこから抽出され、および、入口（５）（これは、手段（６）にバイオリアクターからのブリードを導く）を介してブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段（６）に導かれる。

手段（６）において、ブリードの細胞は、ブリードの液体部分から、例として沈降、音響手段、濾過または遠心分離によって、好ましくは沈降によって、分離される。このケースにおいて、沈降は、細胞の懸濁液の、重力に起因して細胞を定着させることによる、細胞の濃縮スラリーおよび無細胞または細胞低減上清液への分離を意味する。液体細胞培養培地、廃棄物および標的生成物を典型的に含む上清液体は、出口（７）を介して手段（６）から取り出される。出口（７）から、それは次いで、バイオリアクターに戻るように方向づけられる（ルートａに従って）、または、収穫出口に方向づけられる（ルートｂに従って）かのいずれかであり得る。ブリード回収のために、ルートａ）は、もちろん好ましい。任意に、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段（６）はまた、細胞のスラリーが取り出され、廃棄物に移される、出口（８）を含む。

好ましい態様において、液体の出口（７）は、液体上清のみがこの出口を介して取り出されるように、位置する。これは、例えば、出口の高さを、それが、定着細胞の高さを超えるように位置決めすることによって、行われる。出口（７）はまた、細胞が出口（７）を通って流れるのを妨げるためのフィルターまたは等価な手段を含む。好ましくは、出口（７）は、入口（５）からできるだけ遠位に位置し、および、手段（６）の上半分に位置し、液体上清を手段（６）から出口（７）を通って取り出すときに、定着細胞が流体ストリームによって妨げられないかこれと共に取られないように、手段（６）中に位置する。好ましくは、出口（７）は、バイオリアクターに戻るように繋がる。

他方の出口（８）は、定着細胞の除去のために設計された任意の出口である。ブリード部分の液体上清部分および細胞への各分離した後、または、手段（６）中の定着細胞の量が、バイオリアクターからのさらなる上清が手段（６）に挿入されなくなると、定着細胞は、出口（８）を介して手段（６）から取り出される。好ましくは、出口（８）は、重力を介して細胞スラリーの簡単な除去を可能にするように、手段（６）の底に位置付けられる。それはまた、もちろん、異なって位置付けられる出口を介して、他の手段によって細胞を取り出すことが可能である。

ブリード回収デバイスはまた、細胞密度を決定するためのセンサまたはプローブを含み得る。入口中の細胞密度は、典型的には、バイオリアクターの細胞密度であるが、出口の細胞密度は、バイオリアクターに戻されるので、理想的には、できるだけ小さい。細胞密度のセンサは、ブリード回収デバイスがいっぱいであるか、または、非常に多数の細胞がバイオリアクターに戻されるので、細胞の沈降が適切に機能していないか、を指し示す。

入口（５）ならびに出口（７）および（８）は、典型的には、バルブおよび／またはポンプを有するチューブを含む。入口および出口は、好ましくは、バイオリアクター中に浸水して位置する。

一態様において、ブリード回収デバイスは、２つの手段（６）を含み、両方が、独立して、入口および出口に接続されている。それはまた、典型的には、入口を通ってバイオリアクターから出てくる懸濁液の流れを手段（６）に方向づけ、および、手段（６）の１つからの液体上清をバイオリアクターおよび／または収穫に戻すように方向づけることができる、少なくとも１のポンプまたはバルブを含む。もし、２以上の手段（６）が存在する場合、ブリード回収は、２つまたはさらに多い手段（６）を交互にロードすることにより、準連続的に実施することができる。１つの手段（６）は、バイオリアクターからの新しい細胞懸濁液を充填され、他の手段（６）中の細胞は、定着することができ、およびその後、液体上清は、バイオリアクターおよび／または収穫に戻るように方向づけることができる。

一態様において、ブリード回収デバイスの入口および出口は、同一である。このケースにおいて（これは、最も単純な設定である）、ブリード回収デバイスは、同時に入口および出口である１つの管のみを介して、バイオリアクターに接続されている。ポンプおよび／またはバルブは、流れを方向づけるために使用される。最初に、ポンプは、バイオリアクターからのブリードを、ブリード回収デバイスに汲み出す。次いで、細胞は、ブリード回収デバイスの容器（手段６）に定着することが可能となる。その後、液体上清は、バイオリアクターに汲み出して戻される。これは、ブリード回収の容器が細胞でいっぱいになりすぎて、細胞の有効な定着が可能でなくなり、上清の除去が可能でなくなるまで、数回行うことができる。

上記のような、ブリード回収デバイスが、定着細胞を取り出すことなく、新たなブリードを数回充填することが意味されるケースでは、柔らかいブラスチックバッグは、好ましいタイプの容器である。

本発明のブリード回収デバイスは、バイオリアクターに戻るように繋がる出口によって、収穫のような他の入口または出口システムとは異なり得る。出口はまた、収穫へ繋がるが、極めて好ましくは、１つの出口は、バイオリアクターに戻るように繋がる。好ましい態様において、ブリード回収デバイスは、バイオリアクターシステムの任意の他の入口および出口またはチューブに接続されていないが、バイオリアクターからの入口およびバイオリアクターへの出口を有するのみであり、好ましくは、それは、ブリード回収デバイスへ、および、ブリード回収デバイスから、流れを方向づけるための少なくとも１つのポンプを有する。

本発明はまた、灌流細胞培養のためのプロセスに関し、培地入口および収穫出口を有するバイオリアクター、ならびに、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、バイオリアクターからのブリードを導く、ブリード入口、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から、ブリードの液体部分を、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻すように方向づけるための出口を有するブリード回収デバイスを含むバイオリアクターシステム中で細胞を培養することを含み、これにより、
ｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、新しい細胞培養培地を、培地入口を介して、バイオリアクターに挿入する
ｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、収穫物を、収穫出口を介して、バイオリアクターから取り出す
ｉｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、ある量のブリードを、ブリード回収デバイスの入口を介してバイオリアクターから取り出し、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に方向づけ、細胞を液体部分から分離し、および、液体部分をブリード回収デバイスの出口を通って、バイオリアクターおよび／または収穫出口に戻す。

ブリード回収デバイスを含むバイオリアクターシステムを用いて、灌流細胞培養は、より柔軟性を持って実施され得る。とくに、生成物の喪失なく、ブリードを取り出すために、バイオリアクターから取り出されるブリードの量は、生成物の喪失を低減するために、それを最小限にまで制限する必要がなく、自由に選択され得る。

好ましい態様において、ステップｉｉｉは、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、入口を通ってバイオリアクターから細胞懸濁液の明確な量を汲み出すことによって実施される。該手段が沈降によって液体からの細胞の分離を提供するケースにおいて、ブリードの液体部分からのブリードの細胞を分離するための手段への汲み出しを停止した後、沈降は開始し、および、細胞は定着し、および、手段の底へ向かって移動する。

細胞が定着し、および、好ましくは、手段の底に固体のケーキを形成するとすぐに、液体上清は、取り出され、バイオリアクターに戻されるか、または、液体収穫に添加され得る。典型的には、細胞は、３０分から５時間まで、好ましくは３０分から２時間まで定着される。設定はまた、必要とされる細胞分離の程度に依存して、より短く／より早く、すなわち３０分未満で行うことができる。いくつかのプロセスのために、ブリード中の部分的な細胞除去は、これが柔軟性を増大する場合、充分であり得る。

典型的には、バイオリアクターまたは収穫に戻される液体の量は、バイオリアクターから取り出され、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に汲み出される、ブリード細胞懸濁液の容積の５０％超である。より好ましくは、７０体積％超、最も好ましくは７５～９０体積％は、バイオリアクターに再供給されるか、または、収穫に添加される。好ましくは、それは、バイオリアクターに再供給される。

好ましくは、バイオリアクターに再供給されるかまたは収穫に添加されるブリードの液体部分は、いずれの細胞も含まない。これは、濾過手段、音響デバイス等々のような収穫出口において使用されるものに類似する細胞保持デバイスを、ブリード回収デバイスに挿入することによって実現され得る。とくに、ブリードの液体部分がバイオリアクターに再供給されるとき、それは、それにもかかわらず、絶対的に無細胞であることは必須ではない。その結果として、ブリードの液体部分を指すとき、それは、バイオリアクターから取り出され、および、ブリード回収デバイスに繋がるブリードと比較して、細胞の数が少なくとも低減しているブリードの一部であることを意味する。理想的には、それは、取り出されているブリード中の生存細胞密度の、１０％未満、好ましくは５％未満、最も好ましくは２％未満、例としてほぼ１％を含む。

図３は、ブリード回収デバイスからの細胞の沈降後の、バイオリアクターに再供給される、ブリードの液体部分の生存細胞密度を示す。ＶＣＤは、ブリードの液体部分の８０％超が再供給されるまで、一定のままであることが理解され得る。

好ましくは、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段は、最も小さい寸法がその高さである、平らな容器である。好ましくは、高さは、他の２つの寸法のいずれかの、半分未満であり、最も好ましくは、四分の一未満である。他の２つの寸法（幅および奥行き）は、回収されるべきブリードの量に従って選択され得る。典型的には、これは、バイオリアクターのサイズに依存する。１０ｃｍ～１００センチメートルの寸法が好適である。

ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段は、好ましくは、沈降によって、液体上清から細胞を分離することによって機能するが、他の手段を使用することもまた、実行可能である。濾過、遠心分離、音響手段等々のような、液体収穫から細胞を分離するためにもまた使用することができる、かかる手段を使用することも可能である。

典型的には、全体のプロセスは、灌流細胞培養の一般的なプロセス要件に従って、実行される。好ましくは、灌流量は、灌流量（新鮮な細胞培養培地の添加）（Ｐ）＝ブリード比率（Ｂ）＋収穫比率（Ｈ）となるように一定に維持されて、定常状態の灌流が達成される。

典型的には、これは、プロセス管理システム、例としてＬｕｃｕｌｌｕｓ ＰＩＭＳによって調節され、これは、例として、ポンプを制御することを介して、灌流プロセスを組織するための、バイオリアクタープローブの予め調整されたパラメータまたはオンラインシグナルのいずれかを読み出す、プログラムされたステップ鎖を使用する。新鮮な培地の添加は、例として、バイオリアクターから出る、収穫およびブリードの流れによって引き起こされる、バイオリアクター重量を減少させるによって自動的に引き起こされる。

好ましい態様において、本発明に従う灌流細胞培養のためのプロセスは、バイオリアクター中の細胞懸濁液の容積（以下ではまた、バイオリアクターの液体容積とも呼ばれる）が、細胞培養の開始時の充填および増殖期間を除いて、プロセスの全体の時間にわたり大体同じのままであるように実行される。本発明に従う、大体同じまたは一定の容積は、バイオリアクターの液体容積が、元の容積の、１１０％超、好ましくは１０５％超まで増大せず、および、元の容積の、９０％未満、好ましくは９５％未満まで減少しないことを意味する。

別の好ましい態様において、本発明に従う、灌流細胞培養のためのプロセスは、連続的なまたは半連続的な灌流および収穫を含む。それは、開始時点での充填および増殖期間を除き、細胞培養の全体の時間にわたり、新鮮な細胞培養培地が、絶え間なくまたは定期的に、バイオリアクターに添加され、および、収穫は、バイオリアクターから、絶え間なくまたは定期的に取り出されることを意味する。灌流および収穫の量は、お互いに独立して変化し得る。一態様において、２つのストリームは、決して完全に停止しない。

極めて好ましい態様において、バイオリアクター中に一定の液体容積を有するシステムにおいて、および、好ましくは、連続的または半連続的な灌流および収穫を有するシステムにおいて、ブリードがバイオリアクターから取り出される間、毎回、バイオリアクターから取り出される液体容積の全体量が１０％未満、好ましくは５％未満のバリエーションを有して一定のままであるように、収穫比率は、ブリード比率によって減少される。これを用いて、新鮮な培地のフィードは、一定のままに維持され得る。これは、変化しない収穫の取り出しに加えて、ブリードの取り出しは、バイオリアクターの液体容積を一定に維持するために過剰な量の新たな培地の添加を必要とするか、または、バイオリアクター内の液体容積の減少に繋がるかのいずれかであるので、好ましい。灌流量ＰおよびＶＣＤは、一定に維持されると、また、ＣＳＰＲは一定であり、これは、長期定常状態操作の要件である。

別の好ましい態様において、ブリード回収デバイスから回収される液体が、バイオリアクターに汲み出して戻される場合、収穫比率は、増大する。好ましくは、それは、バイオリアクターの液体容積が、新鮮な培地の一定の供給を変更する必要なく、１０％未満、好ましくは５％未満のバリエーションで一定のままであるような量まで増大する。これは、ブリード回収デバイスから回収した液体が、バイオリアクターに汲み出して戻される間、収穫比率は、再供給された液体ブリードの量によって増大する。

図４は、本発明に従う、２ｖｖｄを用いる灌流プロセスのための例示の流量のスキームを示す。各ブリード回収操作は、特徴的な生存細胞密度（ＶＣＤ）曲線を結果として生じる（黒色ドットを有する黒色線）、４つの逐次的な相を包含する。相１において、ブリードポンプ（淡い色のドットを有する破線）は、遮断され、収穫ポンプは、２ｖｖｄにおいて実行されているが（黒色三角形を有する破線）、ＶＣＤは増大する。相１は、ブリード操作が引き起こされることがない相である。相２において、ブリードポンプは、２ｖｖｄに設定されるが（ブリード回収デバイスへの流入）、収穫比率は停止する。この時点で、ＶＣＤは、細胞の取り出し、および、ブリード比率に等しい新鮮な培地の供給によって減少する。

相３において、ポンプのオン／オフ状態は、ブリード回収デバイス中の細胞が沈降する相違を有し、相１と等しい。この時間内に、バイオマスケーキは、蓄積する。相４は、再供給またはブリード回収操作を示す：ブリードポンプまたは再供給ポンプは、２ｖｖｄにおいて作動する（ネガティブな兆候）。ポンプの方向づけが逆転するからである（ブリード回収デバイスの流出）。収穫ポンプは、供給された培地の再供給を補うために、および、２ｖｖｄでの新鮮な培地の一定の供給を維持するために、４ｖｖｄで作動する。相４の操作の間、ＶＣＤは、大体透明になった再供給上清中に残っている細胞によって増大するのみである。これらの逐次的な相は、バイオマスがそのセットポイントを超えるときに再び引き起こされる。

液体ストリームのかかる調節は、好ましくは、プロセス管理システムによって調節される。

本発明はまた、ＣＦＢプロセスにおける使用に好適である。
ＣＦＢプロセスは、典型的には、定常状態において操作されない。なぜなら、バイオリアクター中の生成物の蓄積に起因して、ブリーディングを介する生成物の喪失が、極度に高いであろうためである。しかしながら、本発明に従うブリード回収デバイスを含む、および、本発明のプロセスを用いる、バイオリアクター中でＣＦＢプロセスを実行すると、ブリード回収が生成物喪失を最小化するので、ＣＦＢプロセスが、定常状態で操作されるのを可能にする。

本発明は、それによって制限されることはないが、以下の例によってさらに説明される。上または下に引用されたすべての文献、ならびに対応する欧州特許出願ＥＰ１９２０７６６６．９（２０１９年１１月７日出願）は、参照により本明細書に援用される。

例
例１：哺乳動物細胞の沈降速度の決定による、ブリード回収デバイスの設計の評価
方法：
円柱状ガラスカラム（底に二方コックを有し、頂部が開いている）は、細胞懸濁液で充填される（生存細胞密度：３０×１０^６ｖｃ／ｍＬ）。円柱状カラムは、三脚で垂直に固定される。細胞は、次いで、６時間にわたり、カラム中に配置される。沈降は、次いで、細胞および流体の分離線を読み出すことによって、モニタリングされ、この線は、線の下に蓄積する細胞および線の上の大体無細胞の流体によって同定され得る。分離線は、時間の増大と共に、下方に移動する。特定の時点において、沈降の長さは、読み取られる。グラフは、ｘ軸が時間［時間］およびｙ軸が沈降長さ［ｃｍ］で作成される。傾向線(trendline)は、計算され、勾配または沈降速度を結果として生じる。

結果：
図６は、哺乳動物細胞株の、経時的な沈降の傾向線を示す。傾向線の勾配は、沈降速度：０，６８８９ｃｍ／ｈに等しい。

結論：
・ ブリード回収デバイスの設計は、それが、平らな形状で、短い沈降の長さを有する場合、最も機能し得る。短い沈降の長さは、細胞および流体の時間低減分離を実行可能にする。
・ 灌流バイオリアクターのブリード容積を取り扱うために、ブリード回収デバイス中の容積は、より大きい表面にわたって分布されなければならない。
・ デバイスは、外側からの衝撃なしで固定される様式で、設置されなければならない。

例２：バイオプロセス操作における平らな形状のバッグ設計の実行可能性試験
背景情報：
明確な設計の試験は、灌流バイオリアクター操作に含まれる。かかるバイオリアクター実行において、細胞は、１ｍＬあたり５０万個の細胞の低い生存細胞密度で播種され、および、３２×１０^６個の生存細胞／ｍＬまで拡大される。次いで、定常状態は、さもないと指数関数増殖によってさらに蓄積するであろう細胞を取り出すことによって、開始される。この例において、取り出された細胞は、単に、廃棄される代わりに、２Ｄブリード回収バッグに汲み出される。この実験におけるブリード回収操作は、沈降時間の試験、ポンプの適切な操作、および、バッグ設計自体の試験を包含する。実験によって回答されるべき重大な課題は、以下のとおりであった：

１． 沈降細胞をできるだけ短くして、安定したバイオマスケーキ／透明な上清を得るために、どれくらいの時間が必要であるか？
２． 先の課題の約束下、バイオマスプローブのシグナルを増大することなく、透明な上清を再供給することが実行可能であるか？
３． バイオマスケーキが不安定となるまでに、どれくらいのポンプ速度が実行可能であるか？
４． どれくらいのブリードが回収できるか？

方法：
これまでに言及された課題の調査のために、実験のハードウェア設定は、以下のとおり設計される：
ブリードポンプ（スピードおよび方向は、適応可能である）は、バランスおよび接続されたバイオリアクターと組み合わせて使用される。平衡のために、２Ｄバッグアセンブリを有するトラフは、流入および流出を測定するために、配置される。

２Ｄプラスチックバッグは、白色トラフ中に配置され、および、テープと水平に固定される。指定された入口／出口管は、ポンプに繋がる白色クランプを用いて垂直に閉鎖可能なトラフを離れる。トラフの重量は、充分にブリードされた回収プロセスストリームの定量化のためのバランスによって制御される。

２Ｄプラスチックバッグの灌流バイオリアクターへの接続は、ファーメドポンプ管によって接続される２つの封管可能なＣ－Ｆｌｅｘ管からなる特定の管アセンブリで実現される：

バイオリアクターは、ポンプを介してブリードラインチューブを介して２Ｄバッグと接続される。２つの封管可能なＣ－Ｆｌｅｘ管は、滅菌接続のために設置され、および、１つの管は、ポンプに設置される。試料ポートは、生存細胞密度および細胞生存率のための流入および流出ストリームを制御するために統合される。

封管可能な末端の１つはまた、ブリード回収デバイスに行く夫々のブリード懸濁液、および／または、バイオアクターに戻る夫々の透明な上清の、ＶＣＤ制御のためのサンプルポートを含有する。試料ポートは、課題１．）、３．）および４．）に回答するために設置されている。

バイオリアクター制御ユニットに直接設置された一般的に使用されるブリードポンプとは異なり、そのポンプ速度および方向を変更することができる、独立したポンプが使用された。課題２．）の回答は、バイオマスシグナルの読み出しに由来するだろう。

この実験において、以下のプロセスステップの記載されたハードウェア設定を用いる３回の実行が実施された。標的は、１日当たりのブリード総量の半分を供給することである。ブリードの半分の計算は、その前日のブリードの量に基づいている：

１． バイオリアクターからの計算された量を、最大ポンプ速度１２０ｒｐｍ（３９，２ｍＬ／ｍｉｎ）で供給する
２． １２０分間のブリードの沈降
３． ＶＣＤバイオマスシグナルモニタリングの異なる速度／入口制御での上清の再供給

結果：
図７は、ブリード回収プロセスの逐次的なステップ：（１）バイオリアクターからの細胞懸濁液のブリード；（２）細胞性粒子からの流体の沈降／分離；（３）透明な上清の再供給操作、を記載する。

図８は、２つの異なるポンプ速度を有するラン１の透明な上清の再供給プロセス（流出）を説明する。バイオマスケーキがポンプによって妨げられるとき、より遅いポンプスピード２，２９ｍＬ／ｍｉｎは、試験に適用される。バイオマスケーキは、３２ｍＬ／ｍｉｎでさえ安定なままである。ブリード量と比較した、残存するウェットバイオマスのシェアは、約９，６％である。

図９は、試料ポートを使用する、生存細胞密度の等価な測定を説明する。初回細胞密度３，３×１０^６ｖｃ／ｍＬを測定した後、それは、０，５×１０^６ｖｃ／ｍＬ未満まで安定して減少する。より高い初回細胞密度は、試料ポートのチューブに固着する細胞クラスターに由来する。曲線の垂直方向の増大は、バイオマスケーキ破壊の地点、または、バイオリアクターに再供給される最大の上清を指し示す。

すべてのランの外観：

結論：
例２の実験は、以下の課題に回答するために実施された：
１． 細胞をできるだけ短く沈降させて、安定なバイオマスケーキ／透明な上清を得るために、どれくらいの時間が必要であるか？
この実験の設定は、１２０ｍｉｎの沈降時間を試験した。この時間の期間で、安定なバイオマスケーキが構築された。安定性は、ポンプスピードの増大および細胞密度のモニタリングによって証明された。それは、ブリードの最大の流体が回収される限り、２，２９から約３０ｍＬ／ｍｉｎまでの増大したポンプスピードで一定のままであった。

２． 先の課題の約束下で、バイオマスプローブのシグナルを増大させることなく、透明な上清を再供給することは実行可能であるか？
バイオマスシグナルは、定常状態の灌流バイオリアクターにおけるブリードプロセスを引き起こす影響因子であるから、課題の関連性は、付与される。バイオマスは、再供給プロセスの間に２～４ｐＦの範囲内で増大した。この増大の関連性の査定のために、定常状態の操作におけるバイオマスシグナルの正常な揺動を考慮すべきである。細胞保持デバイスまたは供給／収穫プロセスの交互接線流濾過のいずれかによって引き起こされ、細胞濃度およびその結果としてバイオマスシグナルは、経時的に定期的に変化する。観察され得る範囲はまた、ブリード回収操作の再供給の間に観察される範囲内である。この特許の概念において、以下が結論付けられ得る；

ｉ． バイオマスシグナルは、定常状態の灌流プロセスとともにさらに進行するのを可能にする範囲内のままである
ｉｉ． 重複して作業するブリード回収デバイス／プロセスは、ブリード操作を引き起こすバイオマスシグナルのより大きい増大を容易に補うだろう

３． バイオマスケーキが不安定となるまで、どれくらいのポンプスピードが実行可能であるか？
ラン１において、２，２９～３２ｍＬ／ｍｉｎのポンプスピード増大が試験された。バイオマスケーキは、いずれにしても破壊されなかった。

４． どれくらいのブリードが回収できるか？
残存する湿潤バイオマスケーキのシェアは、バイオマスケーキが破壊される前のブリードと比較して、９．４７～１４％の範囲で存在していた（対照試料における細胞密度の増大によって指し示される）。
課題は、ブリードからの生成物の回収の２日間の定常状態の操作が試験された、次の実験をさらに設計するのに役立った。

例３：定常状態の灌流におけるブリード回収操作
背景情報：
技術的実行可能性に関する基本の課題は、例２によって回答される。例３は、操作中断なしで、灌流の定常状態操作におけるブリード回収概念の統合を示す、相補的な実験を記載する。この例によって回答されるべき課題は、定常状態の対照のための主要なパラメータとしてのバイオマスシグナルが、ブリード回収操作の開始前に、同等のレベルで終了するかどうかである。

方法：
灌流バイオリアクターは、哺乳動物の細胞株および適切な培地を用いて灌流（灌流量＝３，６６ｖｖｄ）において実行し、最初に拡大し、次いで、バイオマスシグナル接点８６，５ｐＦ（５０×１０^６ｖｃ／ｍＬ）で、定常状態操作に推移した。前日のブリード量に従って（０，６６ｖｖｄ＝２７７２ｇ）、一日当たりのブリード量の推定値を計算し、および、一日当たり２回のブリード回収操作のために、２で除算した。ブリード回収操作を開始したとき、バイオマスによる自動化定常状態制御を、ブリード回収と組み合わせた定常状態の手動制御に切り替える。
（図５Ａを参照のこと）

概念的には、灌流量は、全体のブリード回収操作の間、一定のままに維持される必要がある。一日当たりの２回のブリード操作の間（一日当たり半分の量のブリードの迅速な除去）、等しい量の新鮮な培地は、バイオリアクターに供給され、この短い時間内に、劇的に灌流を増大する。他方、灌流量は、ブリード操作がないときは減少する。このように、一日当たりの全体の灌流量は、一日の中で変化するが、一定に維持される。

実験は、２つの相に分割される（図５Ｂ）：相１でのブリード操作後、細胞懸濁液は、バイオリアクターに直接再供給されたが、相２では、沈降時間６０ｍｉｎを、ブリードと再供給との間で適用した。両方の相は、２回のブリード回収操作を含有している。

結果：
図１０において、実験の相１が観察できる：
３１ｒｐｍで１３０ｍｉｎ以内のブリード＃１／２（ブリード量１３８６ｇ）（＝ ６４０ｍＬ／ｈ；Ｐ＝３，６６ｖｖｄ）、沈降なし：３ステップのブリード操作を実施すると、最終的なバイオマスシグナルは、最初の接点８６，５ｐＦと比較して、９３，２ｐＦである。

例３の相１と相２との間で、バイオリアクター中のバイオマスは、等しい開始点を有するように、８６，５ｐＦに調整される。図１１において、実験の相２は、観察することができる。

３１ｒｐｍで１３０ｍｉｎ以内のブリード＃１／２（ブリード量１３８６ｇ）（＝６４０ｍＬ／ｈ；Ｐ＝３，６６ｖｖｄ）、１ｈ沈降：３ステップのブリード操作を実施すると、最終的なバイオマスシグナルは、接点８６，５ｐＦに等しい。

結論：
この例において、ブリード操作は、本物の灌流バイオリアクターの定常状態に統合されている。２つの異なる沈降形態は、バイオマスシグナルが、ブリード回収操作の前と同じ値を達成するかどうかを評価するために、試験される。沈降時間なしで、ブリードの再供給は、バイオリアクター中のバイオマスの増大を導くが、６０ｍｉｎの沈降は、ブリード回収の前と同じバイオマスシグナルで終わるのに適している。１２０ｍｉｎの沈降時間の例２と比較して、６０ｍｉｎは、例３において効率的であるようである。これは、細胞がすでに沈降し始め得る設定において、１３０ｍｉｎのより長いブリード時間によって説明できる。例３は、定常状態灌流プロセスへの一般的な適用可能性を示す。この例により、ブリード回収なしでおよび回収有での総収穫量の計算値を計算することができる（表２）：

表２：ブリード回収操作を用いる定常状態灌流バイオリアクターとこれを用いない定常状態灌流バイオリアクターとの間の生産された収穫の比較
通常の収穫収率に加えて、ブリードストリーム３，００ｖｖｄ、ブリード０，６６ｖｖｄ（回収操作なし）はさらに、湿潤バイオマスケーキ約０，１４ｖｖｄに分離され、最終的に廃棄物となり、および、０，５２ｖｖｄは、回収され、収穫収率に添加される。この例のブリード回収操作は、８２から９６％に総収穫収率を増大することができる。
例３において、ブリード回収なしの標準的な定常状態アプローチと比較して、１７％超の収穫を回収することができる。

Claims (15)

1. 灌流（新鮮な培地）入口および収穫出口を有するバイオリアクターを含むバイオリアクターシステムであって、これにより、バイオリアクターはさらに、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、バイオリアクターからのブリードを導くブリード入口、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から、ブリードの液体部分を、バイオリアクターおよび／または収穫に導く出口を有する、ブリード回収デバイスを含む、前記バイオリアクターシステム。
2. ブリード回収デバイスに、およびとくに、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、ブリードのストリームを制御するための、および、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から出たブリードの液体部分のストリームを、ブリード回収デバイスの出口を通って、バイオリアクターおよび／または収穫に戻すように制御するための、少なくとも１つのポンプを含む、請求項１に記載のバイオリアクターシステム。
3. システムがさらに、プロセス管理システムを含む、請求項１または２に記載のバイオリアクターシステム。
4. ブリード回収デバイスの入口および出口が、プラスチック管を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。
5. ブリード回収デバイスの出口が、バイオリアクターに繋がる、請求項１～４のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。
6. ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段が、細胞の沈降のための容器である、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。
7. ブリード回収デバイスの出口は、入口の反対側に、および、該反対側の上半分に、細胞の沈降のための容器に接続されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。
8. ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段は、細胞の沈降のための容器であり、容器は、最も短い寸法がその高さであり、水平に位置する、平らな容器である、請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。
9. 平らな容器がプラスチックバッグである、請求項８に記載のバイオリアクター。
10. 灌流細胞培養のためのプロセスであって、灌流（新鮮な培地）入口および収穫出口を有するバイオリアクター、ならびに、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に、バイオリアクターからのブリードを導く、ブリード入口、およびブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段から、ブリードの液体部分を、バイオリアクターまたは収穫へ戻すように、方向づける出口、を有するブリード回収デバイスを含むバイオリアクターシステム中で細胞を培養することを含み、これにより、
    ｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、新しい細胞培養培地を、灌流入口を介して、バイオリアクターに挿入する
    ｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、収穫物を、収穫出口を介して、バイオリアクターから取り出す
    ｉｉｉ． 細胞培養プロセスの間に、絶え間なく、または、１回または数回、ある量のブリードを、ブリード回収デバイスの入口を介してバイオリアクターから取り出し、ブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に方向づけ、細胞を液体部分から分離し、および、液体部分をブリード回収デバイスの出口を通って、バイオリアクターおよび／または収穫に戻す、前記プロセス。
11. ｉｉｉにおいて、バイオリアクターおよび／または収穫に戻されるブリードの液体部分が、バイオリアクターから取り出されるブリードに含まれる液体の７０％超、および、バイオリアクターから取り出されるブリードに含まれる５％未満の細胞を含む、請求項１０に記載のプロセス。
12. ｉｉｉは、ブリード回収デバイスの入口を介してバイオリアクターからある量のブリードを取り出すこと、それを、容器を含むブリードの液体部分からブリードの細胞を分離するための手段に方向づけること、細胞が該容器の底に向かって定着するように、いくからの時間、ブリードを該容器中に定着させること、その後、ブリード回収デバイスの出口を通って、細胞において低減した、定着した細胞の上の液体上清を取り出して、バイオリアクターおよび／または収穫に戻すことによって、細胞培養プロセスの間に１回または数回実施される、請求項１０または１１に記載のプロセス。
13. ブリードが容器中で定着される時間が１５分～２時間である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプロセス。
14. プロセスステップｉ、ｉｉおよびｉｉｉは、バイオリアクター中の細胞培養物の容積が、一定レベルに維持されるように調節される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
15. プロセスが、限外濾過膜を含むバイオリアクターシステム中のＣＦＢプロセスである、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
    
    
    

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