KR20230050392A - 금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템 - Google Patents

금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20230050392A
KR20230050392A KR1020237008187A KR20237008187A KR20230050392A KR 20230050392 A KR20230050392 A KR 20230050392A KR 1020237008187 A KR1020237008187 A KR 1020237008187A KR 20237008187 A KR20237008187 A KR 20237008187A KR 20230050392 A KR20230050392 A KR 20230050392A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compartment
perfusion
nanoparticles
collection
reaction
Prior art date
Application number
KR1020237008187A
Other languages
English (en)
Inventor
린 트루옹
데이비드 메디나 크루즈
토마스 웹스터
Original Assignee
노스이스턴 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노스이스턴 유니버시티 filed Critical 노스이스턴 유니버시티
Publication of KR20230050392A publication Critical patent/KR20230050392A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

금속성 나노입자의 미생물 합성을 위한 연속적 관류 생물반응기는 미생물 세포의 유실이 없는 나노입자의 합성을 제공한다. 관류 생물반응기는 나노입자를 합성하는 미생물 세포의 배양을 위해 적합한 반응 컴파트먼트로 배지를 분배하는 제1 플로우 배리어를 가진 홀딩 컴파트먼트에 유체적으로 결합된 입구를 포함한다. 반응 컴파트먼트에서의 제2 플로우 배리어는 미생물 세포의 유실을 방지하지만 고갈된 영양 배지에 현탁된 나노입자의 수집을 가능하게 한다.

Description

금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 8월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/066,795호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그의 전문이 본원에 참조로 편입된다.
금속성 나노입자 (NP)는 여러 산업, 특히 헬스케어에 대한 새로운 영역을 제시한다. 그의 항산화제 (L. Valgimigli, et al., 2018), 항균제 (H. Zazo, et al., 2017), 및 항암제 (Mei & Wu, 2017) 특성은 치료 응용분야를 가지는 것을 나타내었다. NP에 대한 수요가 증가함에 따라, 환경-친화적, 비용-효율적, 효과적이고 그리고 일관된 방식으로 NP를 제조하기 위한 방법을 찾는 것이 중요하다. 금속성 NP는 박테리아 세포를 사용하여 제조될 수 있고 (A. Fariq, et al., 2017), 이는 종래의 화학적 방법과 비교하여 산업 및 에너지 폐기물을 감소시킨다. 그러나, 금속성 나노입자의 박테리아 합성을 위한 현재 공정은 막대한 인간 노동력을 필요로 하고, 이는 상당한 오염 위험과 함께 배치 간의 신뢰할 수 없는 결과, 수율 변동 및 순도 변동을 야기한다 (M.L. Verma, et al., 2019). 이에 따라, 미생물 세포를 사용하여 금속성 NP 및 생성물의 개선된 제조를 위한 신규한 방법 및 장치에 대한 필요성이 존재한다.
요약
본 기술은 미생물 세포를 사용하는 나노입자 (NP)의 합성을 위한 장치 및 방법을 제공한다. 상기 기술은 하나 이상의 금속염의 금속성 나노입자로의 화학적 전환에 의해 나노입자를 형성할 수 있는 임의의 세포를 사용하여 실시될 수 있고, 미생물 세포 예컨대 박테리아 세포가 바람직하다. 바람직하게는, 수행되는 화학은 고체 금속 나노입자 또는 마이크로입자를 형성하는 금속염의 환원이다. 상기 기술은 미생물 (세포)의 배양, 이들 미생물에 의한 NP의 합성, 및 연속 흐름 공정을 사용하여 제조된 NP의 후속 회수를 위한 별도의 특별한 구성요소를 갖는 특별한 관류 생물반응기를 제공한다. 상기 기술은 NP의 생합성 과정에서 미생물 세포의 지속적인 또는 간헐적인 보충을 필요로 하지 않는 NP의 연속적인 자동화 합성을 제공할 수 있다. 상기 장치 및 방법은 세포 유실로도 종종 지칭되는 문제인 NP와 함께의 배양으로부터의 미생물 세포의 공동-용리 문제를 방지할 수 있다. 상기 방법은 선택적으로 주요 관류 반응기에 대한 세포의 부착 또는 반부착을 이용하고, 이는 미생물 세포로부터의 NP의 효율적인 분리를 보장할 수 있다. 합성된 NP 및 반응된 배지는 NP가 무세포 수집장치에 통과하도록 하면서 주요 관류 반응기에 미생물 세포를 보유하는 플로우 배리어(flow barrier)를 통과한 후 수집 포트(collection port)로 유동한다. 수집 챔버(collection chamber) 또는 수집 포트 내의 필터는 추가로 미생물 세포로부터 NP를 분리할 수 있다.
본 방법 및 장치는 예를 들어 Ag, Pt, Pd, Se, 및 이들의 임의의 조합, 또는 다른 금속과의 그의 합금을 포함하는 임의의 금속 원소를 함유하거나 이로 이루어진 금속성 나노입자를 합성하기 위해 사용될 수 있고 이는 또한 비금속 원소를 포함할 수 있다. 금속성 나노입자 및 반응 조건과 미생물 세포에 의한 그의 합성을 위한 화학은 예를 들어 WO 2018/218091 A1 및 WO 2020/206459 A1에서 찾을 수 있고, 이는 본원에 참조로 편입된다.
본 기술은 하기 특징 목록에 의해 추가로 요약될 수 있다.
1. 금속성 나노입자의 연속적인 미생물 합성을 위한 관류 생물반응기로서, 하기를 포함하는 생물반응기:
(i) 관류 컴파트먼트(perfusion compartment)에 유체적으로 결합된 펌프에 유체적으로 결합된 액체 영양 배지 저장소를 포함하는 입구 스테이지;
(ii) 관류 컴파트먼트로서,
입구 스테이지로부터 영양 배지를 받도록 구성된 홀딩 컴파트먼트(holding compartment)로서, 반응 컴파트먼트로의 영양 배지의 균일한 분배 및 이송을 위해 구성된 홀딩 컴파트먼트;
미생물 세포에 의한 상기 나노입자의 형성을 위해 구성된 반응 컴파트먼트로서, 나노입자를 합성하기 위해 사용되는 미생물 세포를 지지하는 데 적합한 반응 표면을 포함하는 반응 컴파트먼트;
반응 컴파트먼트로부터의 합성된 나노입자를 함유하는 영양 배지를 수집하고 배지 및 나노입자를 수집 포트로 이송하도록 구성된 수집 컴파트먼트;
홀딩 컴파트먼트와 반응 컴파트먼트 사이에 배치된 제1 플로우 배리어로서, 반응 컴파트먼트로의 배지의 유입 전에 영양 배지를 균일하게 분배하도록 작동하는 제1 플로우 배리어; 및
반응 컴파트먼트와 수집 컴파트먼트 사이에 배치된 제2 플로우 배리어로서, 반응 컴파트먼트에 미생물 세포를 보유하고, 나노입자가 수집 컴파트먼트로 유동하도록 작동하는 제2 플로우 배리어
를 포함하는 관류 컴파트먼트;
(iii) 수집 포트에 유체적으로 결합된 출구 스테이지로서, 수집 포트로부터 나노입자 및 고갈된 영양 배지를 수집하도록 작동하는 출구 스테이지.
2. 특징 1에 있어서, 제2 플로우 배리어가 미생물 세포를 실질적으로 함유하지 않는 수집 컴파트먼트에 나노입자의 현탁액을 제공하는 생물반응기.
3. 특징 2에 있어서, 제2 플로우 배리어가 1% (중량/중량) 미만의 미생물 세포를 포함하는 수집 컴파트먼트에 나노입자의 현탁액을 제공하는 생물반응기.
4. 선행 특징들 중 어느 하나에 있어서, 수집 컴파트먼트는 하나 이상의 필터를 포함하는 생물반응기.
5. 특징 4에 있어서, 필터는 약 0.2 ㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 생물반응기.
6. 선행 특징들 중 어느 하나에 있어서, 관류 생물반응기는 가스-투과성 루프(gas-permeable roof)를 포함하는 생물반응기.
7. 선행 특징들 중 어느 하나에 있어서, 반응 표면은 제거가능한 것인 생물반응기.
8. 선행 특징들 중 어느 하나에 있어서, 수집 컴파트먼트는 수집 포트에 대한 정점에 수렴하는 삼각형 형상을 갖는 생물반응기.
9. 선행 특징들 중 어느 하나에 있어서, 제1 플로우 배리어는 입구 스테이지로부터의 액체 배지의 흐름보다 더 느린 영양 배지의 흐름을 제공하는 생물반응기.
10. 금속성 나노입자를 합성하기 위한 방법으로서,
(a) 선행 특징들 중 어느 하나의 관류 생물반응기, 미생물 세포 배양액, 미생물 세포의 성장을 위한 액체 영양 배지, 및 금속염을 제공하는 단계;
(b) 반응 컴파트먼트를 통한 액체 영양 배지의 흐름하에 금속염의 존재하에서 관류 생물반응기의 반응 컴파트먼트에서 미생물 세포를 배양하고, 이에 의해 상기 금속성 나노입자는 액체 영양 배지에서 형성되고, 수집 챔버에서 수집되는 단계; 및
(c) 수집 챔버의 수집 포트에서 금속성 나노입자를 수집하는 단계
를 포함하는 방법.
11. 특징 10에 있어서, 미생물 세포는 박테리아 세포인 방법.
12. 특징 10 또는 11에 있어서, 단계 (b)는 적어도 약 1주일 동안 연속적으로 수행되는 방법.
13. 특징 10-12 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)에서 수집된 나노입자는 반응 컴파트먼트로부터의 미생물 세포를 본질적으로 함유하지 않는 나노입자의 현탁액의 형태인 방법.
14. 특징 13에 있어서, 나노입자의 현탁액은 1% (중량/중량) 미만의 상기 미생물 세포를 포함하는 방법.
15. 특징 10-14 중 어느 하나에 있어서, 나노입자의 현탁액을 여과하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. 특징 15에 있어서, 여과는 약 0.2 ㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 필터의 사용을 포함하는 방법.
17. 미생물 세포에 의한 나노입자의 합성을 위한 키트로서, 특징 1-9 중 어느 하나의 관류 생물반응기의 관류 컴파트먼트 및 특징 10-16 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
18. 특징 17에 있어서, 관류 컴파트먼트의 하나 이상의 대체 반응 표면을 추가로 포함하는 키트.
19. 특징 17 또는 18에 있어서, 특징 1의 관류 생물반응기의 입구 스테이지 및/또는 출구 스테이지를 추가로 포함하는 키트.
20. 특징 17-19 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 미생물 세포 배양액 및/또는 금속성 나노입자의 제조를 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함하는 키트.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 값의 플러스 또는 마이너스 10%, 5%, 1%, 또는 0.5% 내의 범위와 관련된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "~로 본질적으로 이루어지는"은 청구항의 기본 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계의 포함을 허용한다. 특히 조성물의 구성요소의 설명 또는 장치의 부품의 설명에서의 용어 "포함하는"의 본원에서의 임의의 언급은 대안적인 표현 "~로 이루어지는" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는"으로 교환될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "나노입자"는 약 1 nm 내지 약 999 nm의 범위, 예컨대 약 1 nm 내지 약 100 nm의 범위의 그의 평균 직경을 포함하는 하나 이상의 치수를 갖는 임의의 형상의 입자를 지칭한다.
도 1은 (1) 배지를 함유하는 배지 저장소, 펌프(2), 배관(3), 라인, 또는 플로우 채널, 주요 관류 반응기(4) (각각 그 안에 반응 컴파트먼트(19)를 가짐), 필터(5), 수집 저장소(6), 및 제조후 프로세싱 또는 제2 프로세스로의 이송과 같은 추가의 프로세싱(7)을 포함하는 전체 공정 흐름도의 일례를 나타낸다. 관류 시스템(40)은 입구 스테이지(38) (예를 들어, 배지 저장소, 펌프, 및 입구 배관), 주요 관류 반응기(4), 및 출구 스테이지(39) (예를 들어, 필터 및 수집 저장소)를 포함한다.
도 2는 연동 펌프 (선행 기술)의 개략적 예시를 나타낸다.
도 3은 홀딩 컴파트먼트(8), 제1 플로우 배리어(9), 반응 컴파트먼트(10), 제2 플로우 배리어(11), 및 수집 포트(14)를 갖는 수집 컴파트먼트(12)를 포함하는 관류 컴파트먼트(19)를 포함하는 예시적인 관류 반응기(4)의 측면도를 나타낸다. 나타낸 치수는 인치로 표시된다.
도 4는 반응 표면(13), 수집 컴파트먼트(12), 및 수집 포트(14)를 포함하는 관류 컴파트먼트(19)의 구현예의 상면도를 나타낸다. 상기 예는 인치로 표시된다.
도 5는 내부 관류 컴파트먼트(19)를 포함하고 그리고 배지의 주입을 위한 입구 포트(15)를 포함하는 관류 반응기(4)의 구현예의 우측 측면도를 나타낸다. 치수는 인치로 도시된다.
도 6은 수집 컴파트먼트(12)의 중안에 놓이고 수집 포트(14)를 둘러싼 그의 일부의 형상(57)을 나타내는 관류 컴파트먼트(19)의 구현예의 저면도를 나타낸다. 치수는 인치로 도시된다.
도 7은 관류 컴파트먼트(19)의 제거가능한 반응 표면(17)의 일례를 나타낸다.
도 8은 관류 컴파트먼트(19)의 루프(18)의 일례를 나타낸다.
도 9는 제거된 컴파트먼트의 루프가 없는 관류 컴파트먼트(19)의 프레임(16) 및 제거가능한 반응 표면(17)의 3차원 사시도를 나타낸다.
도 10은 관류 컴파트먼트(19)의 조립된 프레임(16) 및 루프(18)을 나타낸다.
도 11은 프레임(16) 및 루프(18)을 포함하는 외부 관점으로부터 보여지는 관류 컴파트먼트의 최종 외관을 포함하는 주요 관류 반응기(4)의 일례를 나타낸다. 입구 배관(34) 및 출구 배관(35) (또는 수집 배관)이 또한 도시되어 있다.
도 12는 반응 표면에 평행한 표면 A의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타내고, 속도 크기 규모는 좌측에 나타낸다. 상기 도면은 등각투상도에서 홀딩 컴파트먼트(20)에서의 속도 크기, 반응 컴파트먼트(21)에서의 속도 크기, 수집 컴파트먼트(22)에서의 속도 크기, 입구 포트(23)에서의 속도 크기, 및 수집 포트(24)에서의 속도 크기를 나타낸다.
도 13은 우측 투영도에서 입구 포트에 대해 평행하고 반응 표면 및 표면 A에 대해 수직한 표면 B의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 속도 크기 규모는 좌측에 나타낸다.
도 14는 반응 표면 및 입구 포트에 대해 수직한 표면 C의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 상기 도면은 홀딩 컴파트먼트(70)에서의 속도 크기, 반응 컴파트먼트(71)에서의 속도 크기, 수집 컴파트먼트(72)에서의 속도 크기, 입구 포트(73)에서의 속도 크기, 수집 포트(74)에서의 속도 크기, 제1 플로우 배리어(9)의 내리막 경사면(52)에서의 속도 크기(75), 반응 표면에서의 속도 크기(76), 및 제2 플로우 배리어(11)의 오르막 경사면(77)에서의 속도 크기(77)을 나타낸다. 속도 크기 규모는 좌측에 도시된다.
도 15는 반응 표면에 대해 평행한 표면에서 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 상기 시뮬레이션은 입구 포트에서의 벽 전단 응력(25) 및 수집 포트에서의 벽 전단 응력(26)을 포함한다. 벽 전단 응력 규모는 좌측에 나타낸다.
도 16는 관류 컴파트먼트(19) 전반에서 조절된 범위인 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 상기 시뮬레이션은 반응 표면에서의 벽 전단 응력(27), 제1 플로우 배리어에서의 벽 전단 응력(28), 및 수집 컴파트먼트에서의 벽 전단 응력(29)를 포함한다. 벽 전단 응력 규모는 좌측에 나타낸다.
도 17은 표면의 7E-05 m/s 입구 속도로 시뮬레이션된 이산화탄소 정상-상태 분포 결과를 나타낸다. 상기 시뮬레이션은 내부 투영도로서 도시되는 입구 포트(30)에서의 이산화탄소 (CO2) 농도, 홀딩 컴파트먼트(31)에서의 CO2 농도, 반응 컴파트먼트(32)에서의 CO2 농도, 수집 컴파트먼트(33)에서의 CO2 농도, 및 수집 포트(34)에서의 CO2 농도를 포함한다. CO2 규모의 질량 분율은 좌측에 나타낸다.
본 기술은 관류 생물반응기 내의 미생물의 배양, 이들 미생물에 의한 NP의 합성, 및 제조된 NP의 후속 회수를 가능하게 하는 추가의 그리고 특별한 구성요소와 조합되는 관류 생물반응기의 특별한 설계 및 방법을 제공한다. 상기 기술은 NP의 연속적인 합성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 박테리아로부터의 NP 제조의 종래 방법은 박테리아를 성장시키고, 배양액을 플레이팅하고, 배지를 교환하는 다수의 수동 단계를 포함한다 (Saklani & Jain, 2013). 이들 단계 중 임의의 것은 오염의 위험을 높이고 감소된 효율을 야기하면서 인간 노동력 및 시간을 필요로 한다. 본 기술에서, 배양 배지의 일관되고 조정가능한 교환은 시뮬레이션 데이터로 확인된 바와 같이 모든 배양된 세포에 대한 균일한 배지 노출 및 유실 효과로 인한 세포 손실의 예방을 야기하는 구조 설계를 갖는 관류 시스템에 의해 보장된다.
상기 설계는 배양 배지의 교환 및 생물학적 최적 환경의 유지를 통해 미생물 또는 박테리아 세포의 부착을 지원하는 특성을 갖는 물질을 이용할 수 있다. 상기 설계는 또한 복수의 원소 유형의 NP 또는 원소들의 조합을 갖는 NP의 동시 제조를 충족시킬 수 있다. 상기 기술은 미생물 또는 박테리아의 상이한 종을 이용하고, 수동 개입을 감소시키거나 근절하고, NP 제조 공정을 통해 오염 위험을 줄이는 데 있어서 유연성을 제공한다. 생물학적 스캐폴딩 물질(scaffolding material)을 사용하는 종래 설계는 이러한 물질의 제조를 필요로 하고, 세포들 간의 불균일한 배지 노출을 갖고 (D. Egger, et al., 2017; J. Schmid, et al., 2018), 이는 또한 부착되는 세포를 필요로 하고, 한편 이는 상이한 종의 박테리아 간에 용이하게 옮길 수 없다.
예시적인 전체 공정의 흐름도는 도 1에 나타나 있다. 도 1을 참조하면, 관류 시스템(40)은 하기 3개의 주요 부품을 포함한다: 입구 스테이지(38), 주요 관류 반응기(들)(4), 및 출구 스테이지(39). 본원에 사용되는 바와 같이, "관류 시스템"은 입구 스테이지(38), 관류 반응기(4), 및 출구 스테이지(39)를 포함하는 전체 시스템(40)을 지칭한다. NP 합성의 제어는 모든 3개의 부품에서 발휘될 수 있다.
첫 번째는 입구 스테이지(38)로서, 여기서 하나 이상의 배지 저장소(1)은 준비된 배지를 포함하고, 이는 공정 전반에서 유동하는 기본 유체이다. 배지 저장소 또는 배지를 갖는 저장소(1)은 NP 제조의 복수의 종을 지원할 수 있다. 입구 스테이지(38)은 주요 관류 반응기(4)에 상류에 있는 공정과 관련된다. 입구 스테이지는 배지 저장소(1), 펌프 또는 또는 연동 펌프(2), 및 라인, 배관 또는 플로우 채널(3)(관류 반응기(4) 안으로 배지를 공급함)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "라인"은 각 배관 또는 플로우 채널에서의 각각의 스트림과 관련된다. 일반적으로, 하나의 라인은 특정 종의 박테리아에 특정 금속염 용액을 공급하는 하나의 배지 스트림과 관련된다. 배지 저장소(1)으로부터의 라인, 배관, 또는 플로우 채널(3)은 다채널 펌프(2)(예를 들어, 다채널 연동 펌프)에 연결될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기재된 관류 컴파트먼트(19)는 주요 관류 반응기(4)의 내부에 있다. 각 관류 반응기(4) 내부의 반응 컴파트먼트 (도 3의 10 참조)를 포함하는 각 관류 컴파트먼트(19)의 크기, 및 관류 반응기(4) 및 관류 컴파트먼트(19) 내부에 있는 반응 컴파트먼트의 표면 상에서의 유체 흐름의 두께와 원하는 배지의 턴오버 속도(turnover rate)에 따라 유량이 설정된다. 펌프로부터의 각 라인은 배관, 라인, 또는 플로우 채널(3)을 통해 관류 반응기(4)에 연결된다.
도 1을 참조하면, 출구 스테이지(39)는 임의의 유실된 세포 또는 고체 폐기물을 수집하기 위한 관류 반응기(4)의 수집 포트로부터의 필터(5)로 시작한다. 필터(5)는 수집 보틀(collection bottle) 또는 수집 저장소(6)에 이어지는 튜브(3)에 연결된다. 관류 반응기의 장점으로 인해, 이 보틀은 대부분의 배지 및 NP를 포함할 수 있다. 수집 보틀은 튜브를 통해 추가 제2 프로세싱(7)에 배치처리되거나 연결되어 연속 공정을 형성할 수 있다. 제2 프로세스(7)의 목적은 NP를 정제하는 것이다. 이 프로세스는 비제한적으로 원심분리, 투석, 현탁, 액체 추출, 동결 건조 및 분무 건조를 포함한다 (J.D. Robertson, et al., 2016; S.K. Balasubramanian, et al., 2010). 이용가능한 장비, 각 NP 원소의 특성, 및 응용분야의 목적 파라미터에 기초하여 배양 용액으로부터 NP를 정제하고 추출하기 위한 복수의 방법이 존재한다. 또한, 본 개시내용에 기재된 특정 치수의 설계의 경우, 프로세스는 배치처리될 수 있다는 것을 반드시 유의해야 한다. 그러나, 최적의 산업적 규모의 프로세스는 관류 반응기로부터의 출력이 NP 추출 및 정제에 대한 입력으로 작용하여 연속적일 수 있다.
도 1에 나타낸 배지 저장소 또는 컨테이너(1)은 NP의 제조에 대한 입력 물질 또는 반응물로서 작용하는 추가의 금속염과 함께 예를 들어 박테리아가 성장하고 번성하는 것을 돕는 영양 용액을 포함한다. 배지 저장소는 NP 합성을 통해 미생물 수명을 유지하는 데 필요한 일정 부피의 영양 용액을 수용할 수 있다. 배지 저장소 컨테이너는 여러 튜브가 컨테이너 외부로의 흐름을 보장하도록 연결될 수 있도록 배관 어답터로 캡핑될 수 있다. 저장소 내의 배지는 임의의 원하는 금속염 용액과 함께 배양 배지, 분화 배지, 및 선택 배지 중 하나 또는 조합으로부터 제조된 영양 용액을 포함한다. 저장소 내의 배지의 체적은 예를 들어 고려되는 여러 요인들에 따라 계산될 수 있다. 동일한 배지를 이용하는 관류 반응기 또는 관류 컴파트먼트의 수가 고려될 수 있다. 관류 컴파트먼트의 원하는 배지 턴오버가 고려된다. 다른 요인은 관류 반응기(4)에서의 관류 컴파트먼트(들)(19)의 체적이다. 배지 계획 과정에서, NP 제조의 원하는 총 시간이 또한 고려된다.
배지 저장소의 체적은, 배지를 소모하는 시간이 배지의 화학적 특성 (안정성)이 생물학적 성장에 적합하지 않은 것으로 간주되는 시간보다 더 적은 한, 확장가능하다. 저장소 컨테이너는 예를 들어 날진(Nalgene), 붕규산 유리, 아크릴 유리, 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 컨테이너는 견고하고, 누수가 방지되고, 고압멸균 프로세스를 견딜 수 있고, 생물학적 조건에서 불활성으로 유지될 수 있다. 다른 예에서, 배지 저장소는 멸균 배지, 및 백에 고정된 배관을 부착하도록 구성된 노즐을 포함하는 중합체 백의 형태일 수 있다.
도 1에서, 펌프(2) 또는 다채널 펌프는 임의의 적합한 펌프일 수 있다. 도 2는 바람직한 연동 펌프를 나타낸다. 연동 펌프가 본원에서의 관류 컴파트먼트의 치수를 위해 이용될 수 있는 한편, 상이한 유형의 펌프는 관류 반응기(4)에서의 관류 컴파트먼트(19)의 크기에 기초하여 사용될 수 있다. 관류 컴파트먼트는 확장가능하기 때문에, 원하는 유량이 또한 확장가능하고, 펌프 전력 및 용량이 또한 확장가능하다. 다른 펌프 유형은 원심 펌프, 축형 펌프 및 다른 정변위 펌프를 포함한다 (Pump types, World Pumps, 2003).
펌프는 원하는 체적 유량을 발생시키는 데 필요한 특정 압력을 결정하기 위해 초기에 보정할 수 있다. 일부 예에서 기재된 설계의 경우, 체적 유량은 적을 수 있다. 따라서, 연동 펌프는 이 원하는 유량을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 연동 펌프는 유체를 이동시키기 위한 압축 - 이완의 주기를 이용하는 정변위 펌프를 지칭한다. 다채널형 연동 펌프는 도 1에서의 펌프(2)에 대해 사용될 수 있고, 복수의 관류 컴파트먼트 상에서의 원하는 유량을 동시에 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 연동 펌프는 유체를 수송하기 위해 정변위를 이용하는 펌프의 유형이다. 연동 펌프로부터 발생된 압력은 유체의 스트림이 겪는 지속적인 압축-이완 주기로부터 초래된다.
도 1에서, 관류 컴파트먼트(19)는 주요 관류 반응기(4) 내부에 있고, 세포의 실제 성장 및 NP의 제조가 일어나는 구성요소를 포함한다. 내부 관류 컴파트먼트(19)를 도시하는 측면 투영도가 도 3에 나타나 있다. 도 3을 참조하면, 관류 컴파트먼트(19)는 하기 3개의 주요 공간을 포함한다: 홀딩 컴파트먼트(8), 반응 표면(13) 및/또는 선택적인 제거가능한 반응 표면(17)을 갖는 반응 컴파트먼트(10), 및 수집 컴파트먼트(12). 수집 컴파트먼트(12)는 내리막 경사면(56) 및 수집 포트(14)를 포함한다. 관류 컴파트먼트(19)는 하기 2개의 제거가능한 구성요소를 포함할 수 있다: 컴파트먼트의 루프(18) 및 선택적인 제거가능한 반응 표면 또는 플레이트(17).
홀딩 컴파트먼트(8)은 입구 배지 용액 (입구 포트(15))의 하류 및 제1 플로우 배리어, 또는 제1 플로우 배리어(9)의 것에 대한 상류로서 정의되는 공간이다. 홀딩 컴파트먼트(8)은 제1 플로우 배리어(9)의 높이 및 베이스에 의해 수직하게 경계를 이룬다. 홀딩 컴파트먼트는 평면 표면(51) 및 오르막 표면(경사면)(50)을 포함하고, 이는 플로우 배리어(9)의 선두 표면을 형성한다. 플로우 배리어(9)의 높이 및 오르막 경사면(50)의 기울기는, 입구 포트(15)가 제1 플로우 배리어(9)보다 수직적으로 아래에 있는 한, 변화될 수 있다.
제1 및 제2 플로우 배리어는 반응 컴파트먼트를 가로질러 연장되고 상류 홀딩 컴파트먼트 및 하류 수집 컴파트먼트로부터 반응 컴파트먼트를 분리하는 상승형 구조이다. 제1 및 제2 플로우 배리어는 구조에 있어서 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로, 각 플로우 배리어는 상류 오르막 경사면, 피크 및 하류 내리막 경사면을 가질 것이다. 경사면은 선형 또는 만곡형을 포함하는 임의의 원하는 프로파일을 가질 수 있고, 배리어의 각 측면에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 피크는 원하는 날카로운 각도일 수 있거나, 둥근형일 수 있거나, 또는 제2 수직형 배리어를 포함할 수 있다. 제1 배리어의 기능은 균일하게 흐름을 분배하고 또한 반응 표면에서 원하는 낮은 수준으로 전단 응력을 감소시키는 낮은 수준으로 흐름 속도를 감소시키는 것일 수 있다. 제2 배리어의 기능은 반응 표면에서 흐름 및 전단 응력을 설정하는 데 기여하고, 반응 컴파트먼트에 미생물 세포를 보유하는 것일 수 있고 나노입자가 배리어를 가로질러 수집 컴파트먼트로 유동하게 할 것이다.
홀딩 컴파트먼트(8)은 여러 기능을 제공할 수 있다. 홀딩 컴파트먼트는 입구 포트(15)로부터 입구 배지를 받을 수 있다. 홀딩 컴파트먼트는 입구 포트로부터의 초기 유체 흐름에 의해 야기되는 과도한 응력을 방지할 수 있다. 이는 박테리아의 불균등 배지 노출 및 불균일 흐름을 방지할 수 있다. 홀딩 컴파트먼트(8)은 반응 컴파트먼트(10)에서의 박테리아 세포로의 노출 전에 실시되는 배지와 금속염의 혼합을 위한 공간을 제공할 수 있다. 홀딩 컴파트먼트(8)은 시스템 오작동의 경우에 버퍼 영역을 제공할 수 있다.
도 3에서, 반응 컴파트먼트(10)은 주요 관류 반응기의 설계의 구성요소와 관련된다. 반응 컴파트먼트(10)은 전체 구조에 대해 중앙에 배치된다. 이 컴파트먼트는 반응 표면(13), 선택적인 제거가능한 반응 표면(17)을 포함하는 공간과 관련된다. 반응 컴파트먼트(10)의 높이는 관통하여 유동하는 배지의 두께와 동일하고, 이는 2개의 플로우 배리어(도 3의 9 및 11 참조)의 높이와 동일하다. 반응 컴파트먼트(10)은 또한 반응 공간으로 지칭될 수 있다.
예를 들어, 도 3을 참조하면, 반응 컴파트먼트(10)은 제1 플로우 배리어(9)에 대해 하류 및 제2 플로우 배리어, 또는 제2 플로우 배리어(11)에 대한 상류로서 정의되는 공간이다. 이는 2개의 플로우 배리어의 프레임 및 높이에 의해 수직하게 경계를 이룬다. 이 컴파트먼트는 NP의 제조가 일어나는 제어 공간과 관련된다. 반응 컴파트먼트는 제1 플로우 배리어(9)의 내리막 경사면(52), 반응 표면(13) 또는 선택적인 제거가능한 반응 표면(17), 및 제2 플로우 배리어(11)의 오르막 경사면(55)를 포함하는 제2 플로우 배리어(11)을 포함한다. 반응 컴파트먼트(10)은 반응 표면(13) 및/또는 선택적인 제거가능한 반응 표면(17) (경사면(52 및 55)의 2개의 단부에 의해 경계를 이룸)을 포함하고, 반응기의 프레임(60)은 아래에 있다. 이 반응 컴파트먼트(10)은 제거가능한 반응 표면 (또는 플레이트)(17) (또한 도 7의 17 참조)이 삽입될 수 있는 반응 표면(13)을 포함한다. 선택적으로, 제거가능한 반응 표면 (또는 플레이트)(17)은 프레임(60)에 직접적으로 배치될 수 있다. 도 3에서, 반응 표면(13) 또는 선택적인 제거가능한 반응 표면(17) (플레이트)는 박테리아 세포가 플레이팅되고, 성장되고 NP를 제조하기 위해 컨디셔닝되는 곳이다.
반응 컴파트먼트(10)은 여러 기능을 제공할 수 있다. 반응 컴파트먼트는 NP의 제조가 일어나는 제어된 공간을 제공할 수 있다. 반응 컴파트먼트는 미생물 세포의 배지에의 균일한 노출을 보장할 수 있다. 이는 세포 성장을 위한 적절한 생물학적 조건을 보장할 수 있다. 반응 컴파트먼트는 세포의 유실을 방지하고 면적당 제조되는 NP의 효율을 증가시킬 수 있다. 반응 컴파트먼트는 예를 들어 세포 유실을 방지하기 위한 오르막 경사면(55) 및 플로우 배리어(11)을 포함하는 배리어와 함께 반응 컴파트먼트(10)에 미생물 세포를 갖는 부드럽고 균일한 관류 흐름을 제공함으로써 세포 유실을 방지할 수 있다.
펌프의 목적은 배지의 일정한 흐름 특성을 보장하기 위해 압력 기울기를 생성하는 것이다. 펌프는 그것이 관류 컴파트먼트에 대한 체적 유량을 제어하기 때문에 관류 시스템의 중요한 부분이다. 개별적으로, 체적 유량은 하기 식 1을 사용하여 계산될 수 있다.
Figure pct00001
식 1: 관류 컴파트먼트에 대한 유량 계산
식 1에서:
Q = 관류 컴파트먼트 (19, 도 3)으로 유동하기 위해 필요한 체적 유량.
Figure pct00002
= 관류 컴파트먼트 내에서의 반응 컴파트먼트 (10, 도 3)의 체적
t = 원하는 배지 턴오버 시간.
도 3을 참조하면, 관류 컴파트먼트(19), 또는 "보드"는 박테리아 (또는 미생물) 세포에 대한 반응 챔버 및 실제 성장을 나타낸다. 컴파트먼트의 베이스(60)은 스테인리스 강, 또는 하기 표 1에 제공되는 예를 갖는 다른 상용성 물질로 제조될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 베이스(60)과 관련하여: 용어 베이스 및 프레임은 상호교환적으로 사용된다. 이는 주요 관류 반응기 (4, 도 1)의 외부 구조의 일부이다. 이는 관류 반응기의 면적 풋프린트(area footprint)의 대부분을 차지한다. 이는 스테인리스 강 또는 하기 표 1에 열겨된 다른 예시적인 상용성 물질로 제조될 수 있다.
[표 1] 관류 컴파트먼트에 대한 예시적인 물질 및 사양:
Figure pct00003
관류 컴파트먼트는 예를 들어 베이스로서 스테인리스 강, 반응 표면으로서 폴리스티렌, 루프, PTFE 0.2 미크론 필터 및 PTFE 튜브로서 폴리메틸 메타크릴레이트를 사용하여 설계될 수 있다. 관류 컴파트먼트는, 달리 언급되지 않는 한, 그것의 기재된 구성요소 각각에서 그리고 모든 차원 - 직교형(cartesian) 및 원통형 모두-에서 확장가능하다. 관류 컴파트먼트의 각각의 구성요소는 표 1에 나타낸 예를 갖는 다양한 물질로 제조될 수 있다. 관류 컴파트먼트 그 자체는 열거된 물질의 적합한 특성을 갖는 구성요소의 임의의 조합을 사용하여 조립될 수 있다. 보드의 크기는 표적 NP 제조에 필요한 배지의 체적에 기초하여 조정될 수 있다. 이 컴파트먼트의 베이스 및 적합한 시뮬레이션 모델의 설계는 도 3 내지 도 17에 예시된다.
도 3에서, 관류 컴파트먼트(19)의 플로어는 선택적으로 제거가능한 반응 표면(17)일 수 있는 반응 표면(13)이고, 폴리스티렌 또는 표 1에 상세된 다른 상용성 물질로 제조될 수 있다. 관류 컴파트먼트(19)의 상부 투영도는 도 4에 나타나 있다. 도 4에서, 반응 표면(13)은 선택적인 제거가능한 반응 표면(17) (도 3) 없이 도시된다. 반응 표면(13) 또는 선택적으로 제거가능한 반응 표면은 미생물 세포가 그 위에 플레이팅되는 표면이다. 도 7은 분리된 또는 제거가능한 반응 표면(17)을 나타내고, 이에서 세포가 시딩되고 부착되며 치수는 인치이다. 반응 표면은 미생물이 성장하는 곳이고 NP가 제조가 이루어지는 곳이다.
루프 (18, 도 3)는 관류 컴파트먼트의 상면과 관련된다. 예를 들어, 루프는 프레임의 상면에 배치되는 장비와 관련되고, 예시적인 루프(18)는 도 8에 나타나 있다. 컴파트먼트의 루프는 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 또는 표 1에 상세된 가스-투과성 상용성 중합체로 제조될 수 있다.
도 5는 입구 포트(15)를 갖는 관류 컴파트먼트(19)의 우측 투영도를 나타낸다. 도 6은 수집 포트(14)를 나타내는 수집 컴파트먼트(12)가 확대된 관류 컴파트먼트(19)의 하부 투영도를 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, 수집 컴파트먼트(12)는 내리막 경사면(56)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 내리막 경사면(56)은 주요 관류 반응기의 설계의 구성요소이다. 도 6에 예시된 바와 같이, 내리막 경사면(56)은 NP 제조 부위의 하류에 그리고 수집 포트(14)에 대해 상류에 배치되었다. 이는 배관에 대한 유체의 응력을 감소시키고 반응기 전반에서 흐름을 균일하고 층류로 유지시키기 위한 경사면으로서 설계된다.
도 6에서, NP를 포함하는 반응된 배지는 수집 컴파트먼트(12)의 하단부에 있는 수집 포트(14)로 유동하고, 추가의 하류 프로세싱으로 이어진다. 수집 컴파트먼트(12)는 제2 플로우 배리어(11)에 대한 하류 및 수집 포트(14)의 상류로서 정의되는 공간이다. 수집 컴파트먼트(12)는 제2 플로우 배리어(11)의 높이 및 프레임에 의해 수직하게 경계를 이룬다. 수집 컴파트먼트(12)는 제조가 이루어진 후 배지가 NP로 포화되는 제어 공간과 관련된다. 수집 컴파트먼트(12)는 내리막 표면(56), 및 수집 포트(14)로 지칭되는 관류 반응 외부로 스트림이 유동하게 하는 오리피스를 포함한다. 수집 컴파트먼트(12)는 수집 포트와 동심인 원형 단부(57)에 수렴하는 정삼각형을 갖는다. 도 6에 예시된 바와 같이, 수집 컴파트먼트(12)의 각 삼각형 레그의 크기 및 수집 포트(14) 주위의 동심 수렴부(57)의 반경은, 반경이 제2 플로우 배리어 (11, 도 3)까지의 수집 포트 사이의 수평 거리보다 크지 않는 한, 확장가능하다. 수집 컴파트먼트(12)는 여러 기능을 제공할 수 있다. 수집 컴파트먼트는 NP의 제조로부터 NP의 수집까지의 이송 공간을 제공할 수 있다. 수집 컴파트먼트는 시스템의 오작동의 경우에 버퍼 공간을 제공할 수 있다. 수집 컴파트먼트는 배지의 일관된 배출을 보장할 수 있다. 수집 컴파트먼트는 출구 배관에서 전단 응력을 감소시킬 수 있다.
수집 포트(14)는 수집 컴파트먼트(12)에 대한 하류로서 정의되는 공간이다. 수집 포트(14)는 관류 컴파트먼트의 프레임을 관통하여 돌출되는 원형 베이스를 갖는 오리피스 공간이고, 일례는 도 4 및 도 6에 도시되어 있다. 이 오리피스(14)는 수집 컴파트먼트(12)의 단부의 수렴 원형 형상(57)에 대해 동심이다. 이 오리피스의 바닥은 평면 표면이고, 한편 이 오리피스의 상면은 내리막 표면(56)으로 인해 수직으로 고르지 않을 수 있다. 오리피스의 내부 표면적은 출구에 대한 배관에 연결되는 적합한 크기의 탭을 사용하여 나사형일 수 있다. 수집 포트 크기는, 나사 크기 및 튜브가 얻어질 수 있는 한, 확장가능하다.
수집 포트(14)는 주요 관류 반응기의 설계의 구성요소이다. 이는 NP 제조 부위의 하류에 배치되고, 이는 NP-배지 용액이 반응기 외부로 유동하는 포트이다. 이는 반응기의 단부에 위치한다.
출구 스테이지는 주요 관류 반응기에 대한 하류의 프로세스와 관련된다. 출구 스테이지는 배관, 필터 (도 1의 항목 5 참조), 수집 보틀, 및 결합 제2 프로세스 (도 1의 항목 7 참조)를 포함한다.
필터 및 수집 시스템은 관류 컴파트먼트로부터의 하류에 위치한다. 필터는 수집 포트로부터 흐름을 받는다. 필터 시스템의 목적은 원하는 NP 크기보다 더 큰 크기를 갖는 입자를 제거하는 것이다. 이 제거된 입자는 유실된 세포, 세포 대사산물, 또는 다른 미지의 대사물질 폐기물을 포함한다. 원하는 NP는 약 100 nm (0.1 ㎛)보다 작은 크기를 갖는다. 따라서, 필터 멤브레인 기공 크기는 기재된 컴파트먼트에 대해 약 0.2 ㎛이도록 선택될 수 있다. 기재된 컴파트먼트에 대한 예시적인 필터는 루어 락(Luer lock)을 사용하여 입구 및 출구 튜브에 연결되는 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 시린지 필터이도록 선택될 수 있다. 그러나, 상이한 멤브레인 크기 및 물질을 갖는 필터가 사용될 수 있고, 적합한 필터의 예시적인 목록은 표 1에 나타나 있다. 일련의 복수의 필터가 시스템에 설치될 수 있다.
수집 보틀 (또는 컨테이너)는 필터로부터 하류에 위치한다. 수집 보틀 (도 1의 6 참조)은 일정 부피의 대사된 배지 및 제조된 NP를 수용하는 컨테이너와 관련된다. 이 장치는 필터링 프로세스 (도 1의 항목 5 참조) 뒤에 배치된다. 수집 보틀은 다수의 배관이 컨테이너 내부 그리고 외부로 유동하는 것을 보장하기 위해 연결될 수 있도록 배관 어답터로 캡핑될 수 있다. 저장소 내부의 용액은 현탁된 NP와 함께 대사된 용액을 포함한다.
보틀의 체적은 확장가능하다. 수집 보틀은, 보틀이 견고하고, 누수가 방지되고, 고압멸균 프로세스를 견딜 수 있고, 생물학적 조건에서 불활성으로 유지되는 한, 예를 들어 날진, 붕규산 유리, 아크릴 유리, 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 다른 예에서, 수집 보틀은 가요성 중합체 저장소에 있을 수 있다.
수집 보틀은 시스템으로부터 제거되고 제2 프로세스에 대한 출구로 이송되어, 전체 시스템을 회분식 또는 반회분식 시스템으로 만들 수 있다. 수집 보틀은 또한 출구 흐름을 가지거나 또한 제2 프로세스에 결합되어 전체 시스템을 연속적으로 만들 수 있다. 이러한 프로세스는 비제한적으로 원심분리, 투석, 현탁, 액체 추출, 동결 건조, 및 분무 건조를 포함한다. 제2 프로세스의 목적은 제조된 NP의 분리 및 정제이다.
도 8에서, 관류 컴파트먼트의 루프(18)은 장치의 프레임과 동일한 수평 치수로 제조될 수 있다. 또한 인큐베이터의 환경에서 충분한 분자 수송을 보장하면서 무균성을 유지하기 위한 필요성으로 인해, 루프는 가스-투과성 고체, 예컨대 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 또는 표 1에 열거된 다른 적합한 물질로 제조될 수 있다. 루프의 두께는 프레임의 수직 표면의 두께의 것보다 작거나 동일하여야 한다.
도 9는 도 8에 도시된 루프(18)이 없이 조립된 프레임(16) (회색) 및 반응 표면 (백색)(17)을 포함하는 관류 컴파트먼트(19)를 도시한다. 제거가능한 반응 표면(17)은 반응 컴파트먼트(10) 내에 배치된다. 도 10에서, 조립된 프레임(16) (짙은 회색) 및 루프(18) (밝은 회색)은 관류 컴파트먼트(19)를 둘러싼다. 도 11은 외부로부터의 주요 관류 반응기(4) 외관을 도시하며, 이는 프레임(16), 및 루프(18)을 포함한다. 입구(34), 및 출구(35) 배관이 또한 도시되어 있다.
본 기술의 목적은 박테리아 또는 다른 미생물 세포로부터의 합성을 사용하여 NP 제조 공정의 작업흐름을 증가시키기 위한 것이다. 본 기술은 배지가 멸균되고 일정한 방식으로 교환될 수 있는 반연속적 관류 시스템을 통해 NP의 제조를 자동화할 수 있다. 상기 기술은 NP 생성물의 품질과 효율의 증가 및 오염 위험의 감소를 제공할 수 있다. 본원의 관류 시스템 및 방법은 예를 들어 원하는 속도로의 영양 배지의 일정한 공급을 충족시킬 수 있다. 원하는 속도로의 대사된 배지의 일정한 제거가 달성될 수 있다. 모든 시딩된 세포에 대한 균일하고 적합한 배지 노출이 제공된다. 적합한 생물학적 환경의 균일하고 일관된 유지가 달성될 수 있다. 관류로 인한 세포 유실의 방지는 본원의 설계 및 방법을 통해 가능하다. NP 수집 전의 적합한 크기 여과가 실시될 수 있다. 상기 기술은 복수의 관류 반응기를 동시에 작동시키는 능력을 가능하게 한다. 상기 시스템 및 방법은 박테리아 또는 다른 미생물 세포 및 금속 원소의 특성에 기초하여 맞춤화하는 능력을 제공한다. 수동 개입의 최소화는 NP 합성 전반에서 가능하다.
복수의 관류 컴파트먼트 시뮬레이션은 상기 기술의 특징이 실시될 수 있는 방식을 입증한다. 설계된 관류 반응기에 대한 시뮬레이션 결과는 일정하고 조정가능한 속도로 배지 교환이 이루어지는 것을 나타낸다. 흐름은 수직벽 근처의 영역을 제외하고 반응 표면 상에 시딩된 모든 세포에 대한 균일한 배지 노출을 야기한다. 흐름은 예상된 바와 같이 입구 및 출구에서 가장 빠르다. 설계는 그렇지 않으면 발생될 수 있는 흐름 속도의 불균일한 분포를 성공적으로 방지한다. 설계는 또한 배지의 배출을 지원하고, 이는 모든 대사된 배지가 컴파트먼트로부터 제거되는 것을 보장한다. 시뮬레이션은 또한 반응 표면 상에서의 벽 응력이 무시할 정도록 작고 가능한 세포 유실을 제한하는 것을 나타낸다. 게다가, 시뮬레이션은 적합한 인큐베이터 파라미터를 고려하여, 관류 반응기가 정상-상태에서 생물학적으로 적합한 환경을 유지하는 것을 나타낸다 (Yang & Xiong, 2012).
관류 컴파트먼트는 성숙한 박테리아 세포 효소 활성을 이용하여 생체 NP의 일정하고, 일관되고, 깨끗한 생성을 보장하기 위해 사용된다. 수반되는 시스템에 대해 가능한 일부 예시적인 목적은 하기와 같다: 원하는 기간 (배지 턴오버 시간)에 걸친 배지의 교환, 세포 유실 및 세포 손실의 회피, 미생물 또는 박테리아에 대한 성장 기간에 걸친 연속적인 관류. 상기 시스템은 생체적합성 조건 (예를 들어, 온도, 압력, 이산화탄소 농도)를 유지할 수 있고, 소비 자원을 감소시키고 오류를 방지하기 위해 수동 노동을 감소시킬 수 있고, 효율 및 처리량을 최대화될 수 있다.
이러한 목적의 일부는 프로토타입의 실행가능성에 대한 개념 증명을 제공하기 위해 시뮬레이션된다. 유체 수송 시뮬레이션 프로그램인 Ansys Fluent를 사용하여 이러한 결과를 생성한다. Ansys Fluent는 모멘텀, 위상, 물질, 종, 및 에너지의 보존 및 수송 원리의 구축된 물리학을 이용하여 특정 형상 내에서 흐름 전반에 걸쳐 상이한 특성을 입증한다.
입구 포트의 영역과 함께 관류 컴파트먼트의 반응 표면의 제어 공간에 기초하여, 배지의 운동 속도는 모든 시뮬레이션에 대해 7.0E-05 m/s인 것으로 추정될 수 있다. 그러나, 배지의 운동 속도는, 평면 플레이트를 통한 생성된 흐름이 층류를 유지하는 한, 확장가능하다. 평면 플레이트 상에서의 흐름은 레이놀즈 수가 5.0E05 m/s를 초과하지 않는 경우 층류인 것으로 가정될 수 있다. 레이놀즈 수는 하기 식 2를 사용하여 계산될 수 있다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00004
식 2: 평면 플레이트 상의 흐름에 대한 레이놀즈 수 법칙
Figure pct00005
= 관심대상의 유체의 밀도
Figure pct00006
= 유체의 속도 벡터
x = 유체가 유동하는 길이
Figure pct00007
= 관심대상의 유체의 속도
관류 컴파트먼트의 시뮬레이션은 여러 가정을 이용한다. 배지의 특성은 물의 것과 유사하다고 가정되고 그 이유는 용액 중의 물의 농도는 다른 성분보다 상당하게 더 높기 때문이다. 벽에서의 미끄럼 없는 조건이 가정된다 - 미세유체 시뮬레이션에서 일반적임 (B.E. Rapp, 2016). 일정한 강도 특성이 가정된다 - 온도 및 압력에서의 변화는 무시할 정도로 작다. 평형상태의 정상 상태 - 시스템이 가정된다. 최종적으로, 반응 표면 - 강철의 낮은 확산 계수에서 질량 플럭스가 없다고 가정한다.
이러한 가정은 모멘텀, 에너지, 및 물질 전달의 원리인 관계식에 적용된다. 시뮬레이션을 위해, 장치의 흐름 프로파일을 조사하기 위해 표면을 만든다. 표면 A는 장치의 바닥으로부터 y = 30 mm에서의 단면 표면이다. 표면 B는 장치의 좌측으로부터 x = 200 mm에서의 단면 표면이다. 표면 C는 장치의 중심선 폭 z에서의 단면 표면이다.
유체 흐름 시뮬레이션은 컴파트먼트 전반에서 배지 관류의 예시의 개념의 증명을 제공하기 위해 수행된다. 유체 흐름 시뮬레이션은 최고 배지 노출의 영역을 결정하고 일정한 배지 턴오버를 보장하지 않는 정체 영역(stagnant area)을 확인하기 위해 사용된다. 모델이 기초하는 관계식은 연속 방적식 (식 3) 및 3차원 나비에-스토크스 식(Navier-Stokes equation) (식 4)를 포함한다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00008
식 3: 연속 방정식
Figure pct00009
식 4: 나비에-스토크스 식
Figure pct00010
= 속도 벡터의 기울기
Figure pct00011
= 압력의 기울기
Figure pct00012
= 유체의 밀도
Figure pct00013
= 속도 벡터의 전미분
Figure pct00014
= 중력 가속도
Figure pct00015
= 유체의 속도
유체 흐름 시뮬레이셔의 결과는 도 12, 도 13, 및 도 14에 나타낸다. 도 12에서, 반응 표면과 평행한 표면 A의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 도 12는 등각투상도에서의 (20) 홀딩 컴파트먼트에서의 속도 크기, (21) 반응 컴파트먼트에서의 속도 크기, (22) 수집 컴파트먼트에서의 속도 크기, (23) 입구 포트에서의 속도 크기, 및 (24) 수집 포트에서의 속도 크기를 포함한다.
도 13은 우측 투영도에서의 입구 포트에 대해 평행하고 반응 표면 및 표면 A에 대해 수직한 표면 B의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 14는 반응 표면 및 입구 포트에 대해 수직한 표면 C의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 도 14에는 내부 투영도에서의 (70) 홀딩 컴파트먼트에서의 속도 크기, (71) 반응 컴파트먼트에서의 속도 크기, (72) 수집 컴파트먼트에서의 속도 크기, (73) 입구 포트에서의 속도 크기, (74) 수집 포트에서의 속도 크기, (75) 제1 플로우 배리어(9)의 내리막 경사면(52)에서의 속도 크기, (76) 반응 표면에서의 속도 크기, 및 (77) 제2 플로우 배리어(11)의 오르막 경사면(55)에서의 속도 크기를 나타낸다.
관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 흐름이 반응 컴파트먼트 내에서 균일하고 대칭적인 패턴을 보이고, 속도는 입구 및 수집 포트에서의 그것의 최대값에 도달되는 것을 나타낸다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 모든 방향에서의 벽 근처의 영역이 미끄럼 없는 조건으로부터 예상되는 바와 같이 더 저조한 유체 흐름 노출을 받는 것을 나타낸다. 7E-05 m/s의 낮은 입구 속도로부터 예상되는 바와 같이 관류 컴파트먼트를 통한 저-속도 크기가 나타난다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 홀딩 컴파트먼트가 입구 포트로부터의 속도의 초기 급증을 방지하고, 이에 따라 반응 컴파트먼트에서 일정하고 서서히 진행되는 배지 노출을 보장하는 것을 나타낸다.
벽 응력 연구가 또한 실시된다. 관류 컴파트먼트를 구축하는 데 사용되는 임의의 물질이 장기간에 걸쳐 흐름을 견딜 수 있는 것을 보장하기 위해 벽 전단 응력을 조사하는 것이 중요하다. 게다가, 벽 응력의 조사는 세포의 유실 방지를 확인할 수 있다. 반응 표면에 대한 낮고 균일한 벽 응력은 박테리아 세포가 표면 상의 배지 흐름에 의해 운반되는 기회의 가능성이 낮다는 것을 나타낸다.
전단 응력은 정상 상태에서의 용액의 저속 유량으로 인해 관류 컴파트먼트 전반에서 낮고 그리고 반응 컴파트먼트 전반에서 일관되게 유지될 것이라고 가정된다. 모델에서의 벽 전단 응력은 뉴턴의 점도 법칙 (식 5)를 사용하여 계산된다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00016
식 5: y-표면에서 작용하는 x-방향에서의 흐름의 뉴턴의 점도 법칙
Figure pct00017
= y-방향 표면에서 작용하는 x-방향 흐름의 벽 전단 응력
Figure pct00018
= x-방향에서의 속도 벡터
Figure pct00019
= 유체의 속도
벽 전단 응력 시뮬레이션의 결과는 도 15 및 도 16에 나타낸다. 도 15는 반응 표면에 대해 평행한 표면에서의 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 시뮬레이션은 (25) 입구 포트에서의 벽 전단 응력 및 (26) 수집 포트에서의 벽 전단 응력을 포함한다. 시뮬레이션은 입구 (25, 도 15) 및 수집 포트 (26, 도 15)에서의 전단 응력이 컴파트먼트의 임의의 다른 표면에서의 것보다 상당하게 더 높다는 것을 나타낸다. 이 결과는 입구 포트 및 수집 포트에서; 속도가 그의 최고점인 이후의 예상을 확인한다. 그러나, 전단 응력은 두 포트에서 대략 4E-05 파스칼의 최대값으로 여전히 미미하다.
도 16은 관류 컴파트먼트(19) 전반에서 조절된 범위인 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 시뮬레이션은 (27) 반응 표면에서의 벽 전단 응력, (28) 제1 플로우 배리어에서의 벽 전단 응력, 및 (29) 수집 컴파트먼트에서의 벽 전단 응력을 포함한다. 도 16은 동일한 시뮬레이션의 결과를 표시하며, 그러나 윤곽선의 범위는 컴파트먼트에 대한 응력의 분포를 예시하기 위해 조정된다. 입구 포트 및 수집 포트는 그의 전단 응력이 조절된 범위를 벗어나기 때문에 윤곽선을 가지지 않는다. 결과는 반응 표면, 제1 플로우 배리어 (28, 도 16), 및 제2 플로우 배리어의 하류에 있는 수집 컴파트먼트 (29, 도 16)에서의 전단 응력을 나타낸다.
관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 낮은 유체 흐름 속도로 인해 예상되는 바와 같이 장치에 걸쳐 낮은 벽 전단 응력이 존재하는 것을 나타낸다. 입구에서의 최대 응력은 약 6E-05 파스칼이고, 출구에서는 약 3E-05 파스칼이다. 관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 장치 내에서, 전단 응력은 입구 포트 및 모든 오르막 및 내리막 섹션에 근접하여 더 높다는 것을 나타낸다. 최대값은 2개의 두 경사로의 상부에서 2E-06 파스칼의 크기를 갖는다. 관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 반응 표면에서 낮고 균일한 전단 응력을 나타내고, 컴파트먼트에서 최대 세포 보유를 보장하는 것을 나타낸다.
관류 컴파트먼트 내에서의 이산화탄소 분포는 예를 들어 배양을 위한 실행 가능한 조건을 입증하기 위해 연구되었다. 반응 표면에서의 생물학적으로 적합한 환경을 유지하는 것이 중요하다. 장치의 루프가 PMMA 중합체층 또는 가스의 투과 특성을 유지하는 표 1에 열거된 다른 적합한 물질을 사용하여 제조되기 때문에, 장치에서의 환경은 전체 장치가 CO2 인큐베이터에 배치되는 경우 5% 이산화탄소를 포함하는 것으로 추정될 수 있다. 이산화탄소 분포는 물질 전달 구성 원리를 사용하여 액체 필름 흐름의 전반에 걸쳐 계산될 수 있다. 하기 가정이 시뮬레이션에 적용된다: 1) 확산 단독 (대류 물질 전달 없음), 2) 일정한 물질 확산 계수, 3) 일정한 유체 특성 (뉴턴 유체), 4) 정상 상태 (비-과도(non-transient)), 5) 장치의 임의의 벽에서의 물질 플럭스 없음 (고체-액체 표면에서의 경계 조건), 6) 5% 이산화탄소 인큐베이터 환경 (액체-가스 표면에서의 경계 조건). 시뮬레이션은 픽(Fick)의 제2 확산 법칙으로 지칭되는 식 6에 기재된 확산-단독 물질 전달 구성 원리에 기초한다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00020
식 6: 픽의 제2 확산 법칙
Figure pct00021
= 이산화탄소의 농도
Figure pct00022
= 이산화탄소와 물 간의 확산 계수
Figure pct00023
= 시간
이 가정을 사용하여, CO2 인큐베이터에서 정상 상태에서의 반응 표면 이산화탄소 분포는 도 17에 보여진다. 도 17은 표면의 7E-05 m/s 입구 속도로 시뮬레이션된 이산화탄소 정상-상태 분포 결과를 나타낸다. 시뮬레이션은 (30) 입구 포트에서의 이산화탄소 (CO2) 농도, (31) 홀딩 컴파트먼트에서의 CO2 농도, (32) 반응 컴파트먼트에서의 CO2 농도, (33) 수집 컴파트먼트에서의 CO2 농도, 및 (34) 수집 포트에서의 CO2 농도를 포함하고, 이들 모두는 내부 투영도로서 도시된다. 상기 결과는 컴파트먼트 전반에서의 정상 상태에서의 이산화탄소는 균일하고 박테리아 수명에 대해 적절한 5% - 수준에 도달되는 것을 나타낸다. 컴파트먼트의 루프에 대해 가스 투과성 물질을 사용하는 것은 인큐베이터의 공기의 장치로의 확산을 가능하게 하고, 배지로 이산화탄소 가스를 주입할 필요가 없다.
본원에 개시된 기술은 NP 제조를 위해 시딩된 박테리아 세포에 대해 영양 배지의 연속적인 관류를 가능하게 하는 방법 및 장치를 나타낸다. 상세한 예는 3개의 스테이지로 이루어진 관류 시스템과 관련된다: 입구 스테이지, 관류 컴파트먼트, 및 출구 스테이지. 입구 스테이지는 배지 저장소 및 연동 펌프를 수반하고, 이는 복수의 평행한 생산 라인에 흐름을 제공한다. 출구 스테이지는 일련의 필터 및 수집 보틀 (제2 정제 프로세스에 연결됨)을 포함한다. 관류 컴파트먼트는 인접한 삼각형 부분과 조합된 직사각형 본체로서 설계된다. 관류 컴파트먼트는 홀딩 컴파트먼트, 반응 컴파트먼트, 및 수집 컴파트먼트로 나누어진다.
시스템 설계는 박테리아 성장에 대한 효율적인 조건을 보장하고 이에 따라 박테리아 또는 다른 미생물 세포로부터의 NP 제조를 촉진한다. 기재된 예는 신규 배지의 일정한 공급 및 원하는 속도로의 배지의 일정한 제거를 가능하게 한다. 설계된 관류 컴파트먼트는 반응 표면에서의 시딩된 세포에 대한 균일하고 일관된 배지 노출과 생물학적 목표 조건의 균일하고 일관된 유지를 가능하게 하는 것을 나타낸다. 관류 반응 내에서의 흐름 시뮬레이션은 또한 반응 표면 상에서의 최소 벽 전단 응력을 나타내고, 이는 세포 유실의 잠재성을 제한한다. 이 특징은 반응 표면에서의 일정하고 최적의 세포 밀도를 보장하고, 이는 가장 효율적인 박테리아 성장 및 NP 제조를 가능하게 한다.
본원의 구현예는 박테리아 세포를 사용하는 NP의 유용하고 다양한 제조를 가능하게 한다. 제거가능한 반응 표면은 상이한 종의 박테리아를 사용하는 상이한 원소의 NP의 신속하고 유연한 제조를 가능하게 할 수 있다. 연동 펌프는 복수의 관류 반응기가 동시에 작동하는 것을 가능하게 한다. 일련의 필터는 유일하게 적합한 크기의 NP가 수집되는 것을 보장한다. 수집 보틀로부터 추가의 정제 프로세스에의 연결은 NP의 잠재적인 자동화된 연속적 제조를 지원한다. 폐쇄된 시스템은 수동 개입을 최소화하고, 이는 오염의 기회 및 다른 절차적 오류를 감소시킨다.
생물반응기 설계는 배양 배지의 일관되고 조정가능한 교환을 제공하고, 이는 시뮬레이션 데이터에 의해 확인된 바와 같이, 구조 설계가 모든 배양된 세포에의 균일한 배지 노출 및 유실 효과로 인한 세포 손실의 방지를 초래하는 관류 시스템에 의해 보장된다. 상기 설계는 그 특성이 배양 배지의 교환 및 생물학적 최적 환경의 유지를 통해 박테리아 세포의 부착을 지원하는 물질을 이용할 수 있다. 상기 설계는 또한 복수의 원소 유형의 NP의 동시 제조를 충족시킨다. 상기 설계는 복수의 종의 박테리아를 이용하고, 수동 개입을 감소시키고, NP 제조 프로세스 전반에서의 오염 위험을 줄이는 데 있어서 유연성을 제공한다. 장치 및 방법은 나노입자를 합성하기 위해 이용되는 세포가 본질적으로 없는 나노입자의 현탁액을 생성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "본질적으로 없는"은 5% (중량/중량) 미만, 2% (중량/중량) 미만, 1% (중량/중량) 미만, 0.5% (중량/중량) 미만, 0.2% (중량/중량) 미만, 또는 0.1% (중량/중량) 미만의 세포가 있는 현탁액과 관련된다. 제공되는 세포의 중량을 측정하고 현탁액의 총중량과 비교함으로써 측정이 실시된다.
본 기술의 신규하고 특이한 특징의 예는 하기를 포함한다: 1) 홀딩 컴파트먼트, 반응 컴파트먼트 및 수집 컴파트먼트로의 종래의 평판층 반응기의 구분, 2) 세포 부착을 향상시키는 제거가능한 반응 표면, 3) NP 생성물을 정제하기 위한 반응기의 하류에 있는 인라인 필터링 시스템, 4) 적합한 생물학적 한경을 보장하기 위한 반응기의 가스-투과성 루프.
장점 및 개선점의 예는 하기를 포함한다: 1) 유동하는 배지에 대한 반응 표면 상의 세포의 일관되고 균일한 노출, 2) 관류 시스템으로부터의 세포 유실 제한, 효율 증가 및 자원 절약, 3) 동시적인 복수의 제조 라인, 및 4) 제거가능한 반응 표면으로 인한 다양한 박테리아 종으로부터의 다양한 NP의 원소의 상이한 제조에 대한 적용가능성.
상이한 유형의 세포는 금속성 NP를 제조하는 능력을 갖고, 본 기술에 사용될 수 있으며 줄기 세포를 비롯하여 포유동물 세포 및 미생물 세포를 포함한다. 상이한 금속 원소 및 그의 산화물 또는 황화물은 본 기술에 따라 제조된 NP의 구성성분일 수 있다. 합성된 NP는 비정질, 결정질, 공결정질, 금속성, 유리 또는 이들의 조합일 수 있다. NP 제조를 위해 적합한 다양한 박테리아 및 적합한 원소의 예는 표 2에 나타나 있다.
[표 2] NP 합성을 위한 박테리아의 예
Figure pct00024
NP 제조를 위해 적합한 다양한 진균 세포 및 적합한 원소의 예는 표 3에 나타나 있다.
[표 3] NP 합성을 위한 진균의 예
Figure pct00025
본 기술은 예를 들어 하나의 장비에서 세포 배양 및 세포 제조, 수집 및 NP의 예비 정제를 조합하는 장점을 제공할 수 있다. 상기 기술은 상기 개시된 예 또는 특징 중 임의의 것을 포함하는 키트로서 제공될 수 있다.
실시예
실시예 1: 유체 흐름 시뮬레이션.
시뮬레이션의 경우, 장치의 흐름 프로파일을 조사하기 위해 표면을 만들었다. 표면 A: 장치의 바닥으로부터의 y = 30 mm에서의 단면 표면 (예를 들어, 도 12). 표면 B: 장치의 좌측으로부터의 x = 200 mm에서의 단면 표면 (예를 들어, 도 13). 표면 C: 장치의 장치의 중심선 폭 z에서의 단면 표면 (예를 들어 도 14).
도 3에서의 치수는 하기 표 4에서 센티미터로 전환되었다:
[표 4] 도 3의 예시적인 길이 치수:
Figure pct00026
유체 흐름 시뮬레이션은 컴파트먼트 전반에서 배지 관류의 예시의 개념의 증명을 제공하기 위해 수행된다. 이는 최고 배지 노출의 영역을 결정하고 일정한 배지 턴오버를 보장하지 않는 정체 영역을 확인하기 위해 사용된다. 모델이 기초하는 관계식은 연속 방적식 (식 3) 및 3차원 나비에-스토크스 식(Navier-Stokes equation) (식 4)를 포함한다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00027
식 3: 연속 방정식
Figure pct00028
식 4: 나비에-스토크스 식
Figure pct00029
= 속도 벡터의 기울기
Figure pct00030
= 압력의 기울기
Figure pct00031
= 유체의 밀도
Figure pct00032
= 속도 벡터의 전미분
Figure pct00033
= 중력 가속도
Figure pct00034
= 유체의 속도
유체 흐름 시뮬레이셔의 결과는 도 12, 도 13, 및 도 14에 나타낸다. 도 12에서, 반응 표면과 평행한 표면 A의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 도 12는 등각투상도에서의 (20) 홀딩 컴파트먼트에서의 속도 크기, (21) 반응 컴파트먼트에서의 속도 크기, (22) 수집 컴파트먼트에서의 속도 크기, (23) 입구 포트에서의 속도 크기, 및 (24) 수집 포트에서의 속도 크기를 포함한다.
도 13은 우측 투영도에서의 입구 포트에 대해 평행하고 반응 표면 및 표면 A에 대해 수직한 표면 B의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 14는 반응 표면 및 입구 포트에 대해 수직한 표면 C의 7E-05 m/s 입구 속도를 사용한 유체 시뮬레이션 결과를 나타낸다. 도 14에는 내부 투영도에서의 (70) 홀딩 컴파트먼트에서의 속도 크기, (71) 반응 컴파트먼트에서의 속도 크기, (72) 수집 컴파트먼트에서의 속도 크기, (73) 입구 포트에서의 속도 크기, (74) 수집 포트에서의 속도 크기, (75) 제1 플로우 배리어(9)의 내리막 경사면(52)에서의 속도 크기, (76) 반응 표면에서의 속도 크기, 및 (77) 제2 플로우 배리어(11)의 오르막 경사면(55)에서의 속도 크기를 나타낸다.
관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 흐름이 반응 컴파트먼트 내에서 균일하고 대칭적인 패턴을 보이는 것을 나타낸다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 속도가 입구 및 수집 포트에서의 그것의 최대값에 도달되는 것을 나타낸다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 모든 방향에서의 벽 근처의 영역이 미끄럼 없는 조건으로부터 예상되는 바와 같이 더 저조한 유체 흐름 노출을 받는 것을 나타낸다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 7E-05 m/s의 낮은 입구 속도로부터 예상되는 바와 같이 관류 컴파트먼트를 통한 저-속도 크기가 있는 것을 나타낸다. 관류 컴파트먼트를 통한 유체 흐름 결과는 홀딩 컴파트먼트가 입구 포트로부터의 속도의 초기 급증을 방지하고, 이에 따라 반응 컴파트먼트에서 일정하고 서서히 진행되는 배지 노출을 보장하는 것을 나타낸다.
실시예 2: 벽 응력 연구.
벽 응력 연구를 실시하였다. 관류 컴파트먼트를 구축하는 데 사용되는 임의의 물질이 장기간에 걸쳐 흐름을 견딜 수 있는 것을 보정하기 위해 벽 전단 응력을 조사하는 것이 중요하다. 벽 응력의 조사는 세포의 유실 방지를 확인할 수 있다. 반응 표면에 대한 낮고 균일한 벽 응력은 박테리아 세포가 표면 상의 배지 흐름에 의해 운반되는 기회의 가능성이 낮다는 것을 나타낸다.
전단 응력은 정상 상태에서의 용액의 저속 유량으로 인해 관류 컴파트먼트 전반에서 낮고 그리고 반응 컴파트먼트 전반에서 일관되게 유지될 것이라고 가정된다. 모델에서의 벽 전단 응력은 뉴턴의 점도 법칙 (식 5)를 사용하여 계산된다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00035
식 5: y-표면에서 작용하는 x-방향에서의 흐름의 뉴턴의 점도 법칙
Figure pct00036
= y-방향 표면에서 작용하는 x-방향 흐름의 벽 전단 응력
Figure pct00037
= x-방향에서의 속도 벡터
Figure pct00038
= 유체의 속도
벽 전단 응력 시뮬레이션의 결과는 도 15 및 도 16에 나타낸다. 도 15는 반응 표면에 대해 평행한 표면에서의 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 시뮬레이션은 (25) 입구 포트에서의 벽 전단 응력 및 (26) 수집 포트에서의 벽 전단 응력을 포함한다. 시뮬레이션은 입구 (25, 도 15) 및 수집 포트 (26, 도 15)에서의 전단 응력이 컴파트먼트의 임의의 다른 표면에서의 것보다 상당하게 더 높다는 것을 나타낸다. 이 결과는 입구 포트 및 수집 포트에서; 속도가 그의 최고점인 이후의 예상을 확인하였다. 그러나, 전단 응력은 두 포트에서 대략 4E-05 파스칼의 최대값으로 여전히 미미하다.
도 16은 관류 컴파트먼트(19) 전반에서 조절된 범위인 7E-05 m/s 입구 속도로 Ansys Fluent 소프트웨어를 사용한 벽 전단 응력 시뮬레이션을 나타낸다. 시뮬레이션은 (27) 반응 표면에서의 벽 전단 응력, (28) 제1 플로우 배리어에서의 벽 전단 응력, 및 (29) 수집 컴파트먼트에서의 벽 전단 응력을 포함한다. 도 16은 동일한 시뮬레이션의 결과를 표시하며, 그러나 윤곽선의 범위는 컴파트먼트에 대한 응력의 분포를 예시하기 위해 조정된다. 입구 포트 및 수집 포트는 그의 전단 응력이 조절된 범위를 벗어나기 때문에 윤곽선을 가지지 않는다. 결과는 반응 표면, 제1 플로우 배리어 (28, 도 16), 및 제2 플로우 배리어의 하류에 있는 수집 컴파트먼트 (29, 도 16)에서의 전단 응력을 나타낸다.
관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 낮은 유체 흐름 속도로 인해 예상되는 바와 같이 장치에 걸쳐 낮은 벽 전단 응력이 존재하는 것을 나타낸다. 입구에서의 최대 응력은 약 6E-05 파스칼이고, 출구에서는 약 3E-05 파스칼이다. 관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 장치 내에서, 전단 응력은 입구 포트 및 모든 오르막 및 내리막 섹션에 근접하여 더 높다는 것을 나타낸다. 최대값은 2개의 두 경사로의 상부에서 2E-06 파스칼의 크기를 갖는다. 관류 컴파트먼트를 통한 벽 전단 응력 결과는 반응 표면에서 낮고 균일한 전단 응력을 나타내고, 컴파트먼트에서 최대 세포 보유를 보장하는 것을 나타낸다.
실시예 3: 이산화탄소 분포 연구.
이산화탄소 분포를 주요 관류 반응기에서 연구하였다. 반응 표면에서의 생물학적으로 상용성인 환경을 유지하는 것이 중요하다. 장치의 루프가 PMMA 중합체층 또는 가스의 투과 특성을 유지하는 표 1에 열거된 다른 적합한 물질을 사용하여 제조되기 때문에, 장치에서의 환경은 전체 장치가 CO2 인큐베이터에 배치되는 경우 5% 이산화탄소를 포함하는 것으로 추정될 수 있다. 이산화탄소 분포는 물질 전달 구성 원리를 사용하여 액체 필름 흐름의 전반에 걸쳐 계산될 수 있다. 하기 가정이 시뮬레이션에 적용된다: 1) 확산 단독 (대류 물질 전달 없음), 2) 일정한 물질 확산 계수, 3) 일정한 유체 특성 (뉴턴 유체), 4) 정상 상태 (비-과도), 5) 장치의 임의의 벽에서의 물질 플럭스 없음 (고체-액체 표면에서의 경계 조건), 및 6) 5% 이산화탄소 인큐베이터 환경 (액체-가스 표면에서의 경계 조건).
시뮬레이션은 픽의 제2 확산 법칙으로 지칭되는 식 6에 기재된 확산-단독 물질 전달 구성 원리에 기초한다 (Wesenl & Bird, 2006).
Figure pct00039
식 6: 픽의 제2 확산 법칙
Figure pct00040
= 이산화탄소의 농도
Figure pct00041
= 이산화탄소와 물 간의 확산 계수
Figure pct00042
= 시간
이 가정을 사용하여, CO2 인큐베이터에서 정상 상태에서의 반응 표면 이산화탄소 분포는 도 17에 보여질 수 있다. 도 17은 표면의 7E-05 m/s 입구 속도로 시뮬레이션된 이산화탄소 정상-상태 분포 결과를 나타낸다. 시뮬레이션은 (30) 입구 포트에서의 이산화탄소 (CO2) 농도, (31) 홀딩 컴파트먼트에서의 CO2 농도, (32) 반응 컴파트먼트에서의 CO2 농도, (33) 수집 컴파트먼트에서의 CO2 농도, 및 (34) 수집 포트에서의 CO2 농도를 포함하고, 이들 모두는 내부 투영도로서 도시된다. 결과는 컴파트먼트 전반에서의 정상 상태에서의 이산화탄소는 균일하고 박테리아 수명에 대해 적절한 5% - 수준에 도달되는 것을 나타낸다. 컴파트먼트의 루프의 가스 투과성 물질을 사용하는 것은 인큐베이터의 공기의 장치로의 확산을 가능하게 하고, 배지로 이산화탄소 가스를 주입할 필요가 없다.
참조문헌
Figure pct00043
Figure pct00044

Claims (20)

  1. 금속성 나노입자의 연속적 미생물 합성을 위한 관류 생물반응기로서,
    (i) 관류 컴파트먼트에 유체적으로 결합된 펌프에 유체적으로 결합된 액체 영양 배지 저장소를 포함하는 입구 스테이지;
    (ii) 관류 컴파트먼트로서,
    입구 스테이지로부터 영양 배지를 받도록 구성된 홀딩 컴파트먼트로서, 반응 컴파트먼트로의 영양 배지의 균일한 분배 및 이송을 위해 구성된 홀딩 컴파트먼트;
    미생물 세포에 의한 상기 나노입자의 형성을 위해 구성된 반응 컴파트먼트로서, 나노입자를 합성하기 위해 사용되는 미생물 세포를 지지하는 데 적합한 반응 표면을 포함하는 반응 컴파트먼트;
    반응 컴파트먼트로부터의 합성된 나노입자를 함유하는 영양 배지를 수집하고 배지 및 나노입자를 수집 포트로 이송하도록 구성된 수집 컴파트먼트;
    홀딩 컴파트먼트와 반응 컴파트먼트 사이에 배치된 제1 플로우 배리어로서, 반응 컴파트먼트로의 배지의 유입 전에 영양 배지를 균일하게 분배하도록 작동하는 제1 플로우 배리어; 및
    반응 컴파트먼트와 수집 컴파트먼트 사이에 배치된 제2 플로우 배리어로서, 반응 컴파트먼트에 미생물 세포를 보유하고, 나노입자가 수집 컴파트먼트로 유동하도록 작동하는 제2 플로우 배리어
    를 포함하는 관류 컴파트먼트;
    (iii) 수집 포트에 유체적으로 결합된 출구 스테이지로서, 수집 포트로부터 나노입자 및 고갈된 영양 배지를 수집하도록 작동하는 출구 스테이지
    를 포함하는 생물반응기.
  2. 제1항에 있어서, 제2 플로우 배리어가 미생물 세포를 실질적으로 함유하지 않는 수집 컴파트먼트에 나노입자의 현탁액을 제공하는 생물반응기.
  3. 제2항에 있어서, 제2 플로우 배리어가 1% (중량/중량) 미만의 미생물 세포를 포함하는 수집 컴파트먼트에 나노입자의 현탁액을 제공하는 생물반응기.
  4. 제1항에 있어서, 수집 컴파트먼트는 하나 이상의 필터를 포함하는 생물반응기.
  5. 제4항에 있어서, 필터는 약 0.2 ㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 생물반응기.
  6. 제1항에 있어서, 관류 생물반응기는 가스-투과성 루프를 포함하는 생물반응기.
  7. 제1항에 있어서, 반응 표면은 제거가능한 것인 생물반응기.
  8. 제1항에 있어서, 수집 컴파트먼트는 수집 포트에 대한 정점에 수렴하는 삼각형 형상을 갖는 생물반응기.
  9. 제1항에 있어서, 제1 플로우 배리어는 입구 스테이지로부터의 액체 배지의 흐름보다 더 느린 영양 배지의 흐름을 제공하는 생물반응기.
  10. 금속성 나노입자를 합성하기 위한 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 관류 생물반응기, 미생물 세포 배양액, 미생물 세포의 성장을 위한 액체 영양 배지, 및 금속염을 제공하는 단계;
    (b) 반응 컴파트먼트를 통한 액체 영양 배지의 흐름하에 금속염의 존재하에서 관류 생물반응기의 반응 컴파트먼트에서 미생물 세포를 배양하고, 이에 의해 상기 금속성 나노입자는 액체 영양 배지에서 형성되고, 수집 챔버에서 수집되는 단계; 및
    (c) 수집 챔버의 수집 포트에서 금속성 나노입자를 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 미생물 세포는 박테리아 세포인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 단계 (b)는 적어도 약 1주일 동안 연속적으로 수행되는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 단계 (c)에서 수집된 나노입자는 반응 컴파트먼트로부터의 미생물 세포를 본질적으로 함유하지 않는 나노입자의 현탁액의 형태인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 나노입자의 현탁액은 1% (중량/중량) 미만의 상기 미생물 세포를 포함하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 나노입자의 현탁액을 여과하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 여과는 약 0.2 ㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 필터의 사용을 포함하는 방법.
  17. 미생물 세포에 의한 나노입자의 합성을 위한 키트로서, 제1항의 관류 생물반응기의 관류 컴파트먼트 및 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.
  18. 제17항에 있어서, 관류 컴파트먼트의 하나 이상의 대체 반응 표면을 추가로 포함하는 키트.
  19. 제17항에 있어서, 관류 생물반응기의 입구 스테이지 및/또는 출구 스테이지를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제17항에 있어서, 하나 이상의 미생물 세포 배양액 및/또는 금속성 나노입자의 제조를 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함하는 키트.
KR1020237008187A 2020-08-17 2021-08-17 금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템 KR20230050392A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063066795P 2020-08-17 2020-08-17
US63/066,795 2020-08-17
PCT/US2021/046387 WO2022040242A1 (en) 2020-08-17 2021-08-17 Microbe-aided perfusion system for metallic nanoparticle production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230050392A true KR20230050392A (ko) 2023-04-14

Family

ID=80323239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237008187A KR20230050392A (ko) 2020-08-17 2021-08-17 금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230295551A1 (ko)
EP (1) EP4196566A1 (ko)
KR (1) KR20230050392A (ko)
CN (1) CN116194569A (ko)
WO (1) WO2022040242A1 (ko)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10767154B2 (en) * 2008-03-25 2020-09-08 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Temperature controlling surfaces and support structures
US20100330367A1 (en) * 2009-02-03 2010-12-30 Ut-Battelle, Llc Microbially-mediated method for synthesis of non-oxide semiconductor nanoparticles
WO2016090297A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 The New York Stem Cell Foundation Perfusion bioreactor
EP3420068A1 (en) * 2016-02-23 2019-01-02 Corning Incorporated Perfusion bioreactor and method for using same to perform a continuous cell culture
WO2018183972A2 (en) * 2017-04-01 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for using behavior data of impurities and target proteins to design downstream processes
JP2020532414A (ja) * 2017-08-31 2020-11-12 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 中空糸膜濾過システムおよび生物学的に生成される生成物を製造するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230295551A1 (en) 2023-09-21
EP4196566A1 (en) 2023-06-21
WO2022040242A1 (en) 2022-02-24
CN116194569A (zh) 2023-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160319234A1 (en) Continuously controlled hollow fiber bioreactor
EP0433463B1 (en) Rotary culture device
US8951784B2 (en) Cell culture bioreactor
CN201626959U (zh) 用于细胞培养的微灌流装置
EP2115116B1 (en) Methods to control cell movement in hollow fiber bioreactors
US7608447B2 (en) Pulse-medium perfusion bioreactor with improved mass transport for multiple-3-D cell constructs
KR101750148B1 (ko) 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법
US8841122B2 (en) Systems and methods for expanding high density non-adherent cells
CN102239244B (zh) 用于截留和返回细胞的方法和装置
JP2011519575A (ja) 規模調整が可能な細胞培養バイオリアクター及び細胞培養方法
US20210348096A1 (en) Continuous flow microbioreactor
CN112888774A (zh) 细胞培养系统、及使用其的细胞块的制造方法
WO2017066663A1 (en) Method of manufacturing cells using a hollow fiber bioreactor
JP2023503590A (ja) 積層固定床バイオリアクターおよびその使用方法
KR20230050392A (ko) 금속성 나노입자 제조를 위한 미생물을 이용하는 관류 시스템
US11584906B2 (en) Cell culture vessel for 3D culture and methods of culturing 3D cells
US20220204905A1 (en) Bioreactor and methods of use thereof
CN114426926A (zh) 装配式板式塔型贴壁细胞反应器及其肝细胞的培养方法
CN114058505A (zh) 新型灌流培养用高密度微载体截留装置和使用方法
JP2023503649A (ja) ラジアルフロー型固定床バイオリアクター及びその使用方法
WO2024044348A1 (en) System and method for perfusion bioreactor for 3d cell culture
Langhammer et al. Evaluation of a Scalable Disposable Bioreactor System for Manufacturing of Mammalian Cell Based Biopharmaceuticals
IL176212A (en) Biological reactor with pulsed medium injection with improved mass transfer for multiple three-dimensional cell structures