JP2023135972A - 分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】平衡定数が小さい反応系において少量の試料で平衡定数を半定量できる測定装置を提供する。【解決手段】第１の分子と第２の分子が結合してなる試料の解離定数を測定するための測定装置であって、第１の分子で修飾された表面を有する粒子と、第２の分子で修飾され、第１の分子と第２の分子が結合することによって粒子が保持される試料保持面１１を有する基板１０と、粒子に音響放射力を付与する超音波トランスデューサー２０と、超音波トランスデューサー２０に印加する電気信号の電圧値を調整する電圧調整器３０と、粒子が音響放射力を受けることによって第１の分子と第２の分子が解離することによって基板１０の試料保持面１１から離脱した時の粒子に付与した音響放射力又は超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値を出力する出力部５０と、を備える、分析装置１００。【選択図】図１

Description

本発明は、分析装置に関する。

創薬分野においてより効率的な作用を示す化学合成品を創出するには作用を定量化できる解析方法が必要とされており、結合親和性が、相互作用の定量評価パラメータのひとつとして広く用いられている。
例えば、生体分子（タンパク質やＤＮＡなど）と、リガンドや結合パートナー（ドラッグや阻害剤など）との相互作用の強さを示す解離定数（Ｋ_ｄ）の分析方法として、表面プラズモンが光によって励起される現象を利用して、試料中の物質を定量分析する表面プラズモン共鳴測定装置が用いられている。表面プラズモン共鳴では、センサ上に固定されたリガンドにアナライトがフロースルー式に添加される。アナライトを含む試料液の通液によりリガンドに対する結合が試験され、アナライトを含まないバッファが通液されることで解離が試験される。つまり、センサ上の質量変化が共鳴条件の変化として検出されるため、解析対象の標識が不要とされている。

特許文献１には、金属薄膜の一方の面に誘電体試料を接触させるとともに、この金属薄膜の他方の面に全反射の条件で偏光光を入射して表面プラズモン共鳴を誘起させ、その反射光を検出することで、前記誘電体試料の状態を測定する表面プラズモン測定手段と、前記誘電体試料に物理的又は化学的な刺激を加える刺激手段とを備え、この刺激手段により刺激された前記誘電体試料の状態変化を前記表面プラズモン測定手段により測定するように構成したことを特徴とする表面プラズモン共鳴を利用した測定装置が記載されている。

特許文献２には、固体支持体表面に固定されたリガンドと溶液中のリガンドに対する結合パートナーとの間の可逆的分子相互作用についての反応速度論的パラメータを決定する方法であって、該方法は：ａ）連続的に、該固定されたリガンドの中間体の再生又は更新を介することなく、該固体支持体表面に対して、種々の既知濃度の該結合パートナーを含む複数の流体体積を流して、該固定されたリガンドへの結合パートナーの結合を可能にする工程、ｂ）該固体支持体表面に対して結合パートナーを含まない１つの流体体積を流して、該リガンドからの結合パートナーの解離を可能にする工程、ｃ）工程ａ）及びｂ）の間、時間及び結合パートナーの溶液濃度に対して、該固体支持体表面に結合した該結合パートナーの瞬間的な量をモニタリングし、そして結合データを収集する工程、ならびにｄ）該結合パートナーと該固定されたリガンドとの間の相互作用についての所定の反応速度論的モデルを、収集された結合データに対して、好ましくは全体的にフィットさせることによって反応速度論的パラメータを決定する工程であって、このモデルは固体支持体表面における物質移動制限を可能にする、工程を包含する方法が記載されている。

特開平６－１６７４４３号 特表２００６－５２７３６５号公報

表面プラズモンを励起するために用いられる方法として、プリズムを用いた全反射減衰法を利用した方法がある。全反射減衰法を使った表面プラズモンを励起する光学配置の一つとして、ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と呼ばれる方法が挙げられる。この方法はプリズム底面に厚さ約５０ｎｍの金属薄膜（金や銀など）を蒸着してその表面で生じる表面プラズモンを励起する方法である。特許文献１に記載された測定装置もｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を用いている。
特許文献１に記載された測定装置や漏洩モードセンサー等の全反射減衰を利用した測定装置は、多数の試料について測定する場合、測定に長時間を要するという課題がある。特に、例えば抗原抗体反応や化学反応等に伴う試料性状の変化を検出するために、１つの試料について時間間隔をおいて何回か測定を行なう場合には、その１つの試料に関する測定が終了しなければ新しい試料の測定に入れず、試料全体の測定に非常に長い時間を必要とする。
また、特許文献２に記載された方法は、夾雑物による非特異的結合の影響が大きく現れるため、試料液が十分に精製されていない場合、正確な測定が困難である。また、光学技術を利用しているため、マルチプレックスのセンシングを適用することができず、試料液に不明材料が含まれ得る夾雑物では測定が困難である。
また、従来の平衡定数の測定方法は平衡定数が大きい反応系に適しているため、平衡定数が小さい反応系に適用する場合、多量の試料を必要とする。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、平衡定数が小さい反応系において少量の試料で平衡定数を半定量できる測定装置を提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を提供する。
［１］ 第１の分子と第２の分子が結合してなる試料の解離定数を測定するための測定装置であって、
前記第１の分子で修飾された表面を有する粒子と、
前記第２の分子で修飾され、前記第１の分子と前記第２の分子が結合することによって前記粒子が保持される試料保持面を有する基板と、
前記粒子に音響放射力を付与する超音波トランスデューサーと、
前記超音波トランスデューサーに印加する電気信号の電圧値を調整する電圧調整器と、
前記粒子が音響放射力を受けることによって前記第１の分子と前記第２の分子が解離することによって前記基板の前記試料保持面から離脱した時の前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値を出力する出力部と、を備える、分析装置。
［２］ さらに、前記基板の前記試料保持面に保持されている前記粒子の個数を計測する粒子個数計測部を備え、
前記出力部は、前記基板の前記試料保持面に保持させた粒子のうちの５０個％以上の粒子が音響放射力を受けることによって前記基板の前記試料保持面から離脱した時の前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値を出力する、［１］に記載の分析装置。
［３］ さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値に基づいて、前記粒子の結合エネルギーを算出する算出部を備える、［１］又は［２］に記載の分析装置。
［４］ さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と、前記粒子の結合エネルギーとに基づいて、前記第１の分子と前記第２の分子の結合力を算出する算出部を備える、［１］又は［２］に記載の分析装置。
［５］ さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と、前記粒子の結合エネルギーとに基づいて、前記第１の分子と前記第２の分子の解離定数を算出する算出部を備える、［１］又は［２］に記載の分析装置。
［６］ さらに、前記解離定数に基づいて、前記第１の分子及び／又は前記第２の分子の種類を同定する同定部を備える、［６］に記載の分析装置。
［７］ 前記第１の分子及び前記第２の分子の少なくとも一方は２種以上の分子である、［６］に記載の分析装置。
［８］ 前記粒子がポリスチレン粒子であり、前記第１の分子及び前記第２の分子がそれぞれ独立にＤＮＡ、タンパク質及び低分子化合物からなる群から選択されるいずれか１種である、［６］又は［７］に記載の分析装置。

本発明によれば、平衡定数が小さい反応系において少量の試料で平衡定数を半定量できる測定装置を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る分析装置の模式図である。 図１に示す分析装置において基板から測定対象物の粒子が離脱する状態を示す概念図である。 本発明の別の一実施形態に係る分析装置において基板から測定対象物の粒子が離脱する状態を示す概念図である。 実験例１で作製した分析用基板Ｎｏ．１を用いて測定した超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と粒子の浮揚率との関係を示すグラフである。 実験例１で作製した分析用基板Ｎｏ．１～３を用いて測定した超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧と粒子の浮揚率との関係を示すグラフである。 第１の分子及び第２の分子のいずれにもＤＮＡ（３塩基～７塩基）を用いたＮＤＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子のＤＮＡの塩基対が解離して離脱したときの超音波トランスデューサーの印加電圧値と、浮揚率の関係を表すグラフである。 第１の分子及び第２の分子のいずれにもＤＮＡ（３塩基～７塩基）を用いたＮＤＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子のＤＮＡの塩基対が解離して離脱したときの超音波トランスデューサーの印加電圧値と、解離定数の理論値の関係を表すグラフである。 第１の分子及び第２の分子として３塩基のＤＮＡのペア及び７塩基のＤＮＡのペアを含む夾雑系で実施した場合の超音波トランスデューサーの印加電圧値と、ガラス基板から離脱したＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子の浮揚率の関係を表すグラフである。 図８をガウス関数でフィッティングしたときのグラフである。

以下、本発明の一実施形態に係る分析装置について、図面を適宜参照しながら詳細に説明する。以下の説明で用いる図面は、本発明の特徴を分かりやすくするために、便宜上特徴となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等は実際とは異なっていることがある。また、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、本発明の効果を奏する範囲で適宜変更して実施することが可能である。

図１は、本発明の一実施形態に係る分析装置の模式図である。
図１において、分析装置１００は、基板１０と、基板１０を保持する基板ホルダー１５と、超音波トランスデューサー２０と、電圧調整器３０と、電源４０と、出力部５０と、粒子個数計測部６０と、算出部（不図示）とを備える。

基板１０は、分析対象である粒子が、音響放射力を受けることによって離脱可能に保持される試料保持面１１を有する。本実施形態の分析装置１００において、試料保持面１１は、基板１０の下面とされている。基板１０としては、例えば、ガラス基板を用いることができる。

基板ホルダー１５は、溝部１６を有する。基板１０は、試料保持面１１が溝部１６と対向するように基板ホルダー１５に支持されている。溝部１６には、媒質１７が充填されている。媒質１７は、超音波を伝播する液体であれば、特に制限はない。媒質１７としては、例えば、水、アルコールを用いることができる。

超音波トランスデューサー２０は、電気信号を超音波に変換して、粒子に音響放射力を付与する音響放射力発信部として作用する。超音波トランスデューサー２０としては、放射される超音波の周波数が、溝部１６の媒質１７内にて定在波が生成する周波数とされていることが好ましい。超音波の周波数は、５００ｋＨｚ以上２０００ｋＨｚの範囲内にあることが好ましい。

電圧調整器３０は、電源４０から供給された電気エネルギーを、超音波トランスデューサー２０に付与する電気信号に変換し、電気信号の電圧値を調整する。電圧調整器３０としては、超音波トランスデューサー２０に付与する入力信号の波形と電圧を有する電気信号を生成する関数発生部と、電気信号の電圧を増幅する電力増幅部とを有する装置を用いることができる。電圧調整器３０から超音波トランスデューサー２０に付与する電気信号の電圧値もしくはその電気信号を付与することによって生じる音響放射力は、出力部５０に送られる。

粒子個数計測部６０は、基板１０の試料保持面１１に、分子複合体を介して保持されている粒子の個数を計測する。粒子個数計測部６０は、顕微鏡６１と、顕微鏡６１に接続する計測器６２とを含む。顕微鏡６１は、基板１０の試料保持面１１に保持されている粒子に焦点が合わされていて、試料保持面１１に保持された粒子を検出できるようにされている。計測器６２は、顕微鏡６１で検出された粒子の個数を計測する。音響放射力を付与する前の試料保持面１１に保持された粒子の個数から、音響放射力を付与する後の試料保持面１１に保持された粒子の個数を減ずることによって、基板１０の試料保持面１１から離脱した粒子の個数を算出することができる。計測器６２で計測された粒子の個数に関するデータは、出力部５０に送られる。

出力部５０は、超音波トランスデューサー２０から粒子に付与された音響放射力又は超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値が入力される。また、計測器６２で計測された基板１０の試料保持面１１に保持された粒子の個数、試料保持面１１から離脱した粒子の個数などの粒子の個数に関するデータが入力される。出力部５０は、例えば、基板１０の試料保持面１１に保持された粒子の個数又は試料保持面１１から離脱した粒子の個数と、粒子が試料保持面１１から離脱した時の粒子に付与した音響放射力又は超音波トランスデューサー２０に印加した電圧値を集計して出力する。出力部５０からの音響放射力又は電圧値の出力は、例えば、基板１０の試料保持面１１に保持させた粒子のうちの５０個％以上の粒子が基板１０の試料保持面１１から離脱した時の音響放射力又は電圧値個数としてもよい。具体的には、出力部５０は、基板１０の試料保持面１１に保持させた粒子のうちの５０個％の粒子が基板１０の試料保持面１１から離脱したときの超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値（Ｖ_５０）を出力してもよい。

算出部は、出力部５０から出力された粒子に付与した音響放射力又は超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値に基づいて粒子を試料保持面を保持している結合した２分子の解離定数を算出する。

次に、結合した２分子の解離定数の算出方法について説明する。

図２は、図１に示す分析装置において基板から測定対象物の粒子が離脱する状態を示す概念図である。
図２において、超音波トランスデューサー２０にて生成した超音波は、基板ホルダー１５を介して媒質１７に伝播する。媒質１７内において、超音波は節２を有する定在波１を形成する。

粒子５がマイクロ粒子６からなる場合について解離定数の算出方法を説明する。マイクロ粒子６は、表面に第１の分子６ａを有する。基板１０の試料保持面１１は、マイクロ粒子６の第１の分子６ａと相互作用する第２の分子１１ａを有する。マイクロ粒子６は、第１の分子６ａと試料保持面１１の第２の分子１１ａとが結合することによって、基板１０の試料保持面１１に保持されている。なお、第１の分子６ａと第２の分子１１ａの相互作用により形成された複合体は第１の分子６ａと第２の分子１１ａに可逆的に解離することができる。第１の分子６ａと第２の分子１１ａの間の結合としては、水素結合、イオン結合等が挙げられる。

マイクロ粒子６としては、例えば、無機物粒子、有機物粒子を用いることができる。無機物粒子の例としては、シリカ粒子を挙げることができる。有機物粒子の例としては、ポリスチレン粒子、ポリメチルメタクリレート粒子を挙げることができる。マイクロ粒子６は、平均粒子径が１μｍ以上１００μｍ以下の範囲内にあることが好ましく、平均粒子径が５μｍ以上５０μｍ以下の範囲内にあることがより好ましい。平均粒子径は、顕微鏡とマイクロスケーラーを用いて計測した粒子５の粒径の平均値である。
マイクロ粒子６の第１の分子６ａ及び試料保持面１１の第２の分子１１ａは、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、及び低分子化合物を挙げることができる。第１の分子６ａ及び第２の分子１１ａは、それぞれ独立にＤＮＡ、タンパク質及び低分子化合物からなる群から選択されるいずれか１種であることが好ましい。

超音波定在波を垂直に発生させた場合の粒子５（マイクロ粒子６）に働く音響放射力Ｆ_ａｃ及び沈降力Ｆ_ｓｅｄは、それぞれ、下記の式（１）及び式（２）で表すことができる。

式（１）及び式（２）において、λは超音波の波長であり、ｒは粒子５の半径であり、αは装置依存パラメータであり、分析装置１００で使用されている各種の機器及び機器のジオメトリなどによって変化する値であり、Ｖは超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧であり、ｚは定在波１の節２からの粒子５の距離であり、ｇは重力加速度であり、ρ及びγはそれぞれ媒質１７の密度及び圧縮率であり、ダッシュ（´）は該当特性を特定するものである。

超音波の波長λ、粒子５（マイクロ粒子６）の半径ｒ、並びに媒質１７の密度ρ、ρ´及び圧縮率γ、γ´が既知である場合、式（１）から、粒子５（マイクロ粒子６）に働く音響放射力Ｆ_ａｃは超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧Ｖの関数となる。また、式（２）から、粒子５（マイクロ粒子６）に働く沈降力Ｆ_ｓｅｄは定数となる。

粒子５がマイクロ粒子６のみである場合、粒子５に働く音響放射力Ｆ_ａｃと沈降力Ｆ_ｓｅｄの合成力Ｆ_{ｔｏｔａｌ}が、マイクロ粒子６の第１の分子６ａと試料保持面１１の第２の分子１１ａとの結合力Ｆ_ｂｉｎｄよりも大きくなる（Ｆ_{ｔｏｔａｌ}＝Ｆ_ａｃ＋Ｆ_ｓｅｄ＞Ｆ_ｂｉｎｄ）と、第１の分子６ａと第２の分子１１ａとの結合が切れて、粒子５が基板１０の試料保持面１１から離脱する。すなわち、超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧値Ｖを徐々に大きくして、平均超音波エネルギーを増加させることによって、ある電圧値で粒子５が基板１０の試料保持面１１から離脱するようになる。従って、例えば、予め半径が既知の粒子５、並びに密度及び圧縮率が既知の媒質１７を用いて、音響放射力と、その粒子が基板１０の試料保持面１１から離脱したときの超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値との関係を示す検量線を作成しておくことによって、第１の分子６ａと第２の分子１１ａが解離する時の結合力を求めることができる。

第１の分子６ａと第２の分子１１ａとが分離（解離）する時、Ｆ_ｂｉｎｄは下記の式（３）により表すことができる。

式（３）において、ｘは第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合が切れて粒子５が基板１０の試料保持面１１から離脱するまでの移動距離であり、Ｅは第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合エネルギーである。

第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合が切れて複合体が第１の分子６ａと第２の分子１１ａに分離（解離）する時の解離定数Ｋ_ｄは、以下の式（４）により表すことができる。

式（４）において、ΔＥは第１の分子６ａと第２の分子１１ａの分離（解離）前後の結合エネルギー変化であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは媒質１７の温度である。

式（３）と式（４）とから、解離定数Ｋ_ｄは、粒子５の第１の分子６ａと試料保持面１１の第２の分子１１ａの結合力Ｆ_ｂｉｎｄの関数であることがわかる。

また、第１の分子６ａと第２の分子１１ａとが分離（解離）する時、Ｆ_ｂｉｎｄ＝Ｆ_ａｃ＋Ｆ_ｓｅｄとなるため、超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧値Ｖは、結合力Ｆ_ｂｉｎｄを用いて以下の式で表すことができる。

式（５）ないし式（７）中の記号の意味は既に記載したとおりである。

以上より、解離定数Ｋ_ｄは、超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧値の関数であることがわかる。

粒子５に働く音響放射力Ｆ_ａｃと沈降力Ｆ_ｓｅｄの合成力Ｆ_{ｔｏｔａｌ}が、マイクロ粒子６の第１の分子６ａと試料保持面１１の第２の分子１１ａとの結合力Ｆ_ｂｉｎｄよりも大きくなる（Ｆ_{ｔｏｔａｌ}＝Ｆ_ａｃ＋Ｆ_ｓｅｄ＞Ｆ_ｂｉｎｄ）と、第１の分子６ａと第２の分子１１ａとの結合が切れて、粒子５が基板１０の試料保持面１１から離脱する。すなわち、超音波トランスデューサー２０に印加される電気信号の電圧値Ｖを徐々に大きくして、平均超音波エネルギーを増加させることによって、ある電圧値で粒子５が基板１０の試料保持面１１から離脱するようになる。よって、例えば、予め解離定数が既知の第１の分子と第２の分子の組合せを用いて、解離定数Ｋ_ｄと、その粒子が基板１０の試料保持面１１から離脱したときの超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値Ｖとの関係を示す検量線を作成しておくことによって、分析対象の第１の分子６ａと第２の分子１１ａの解離定数を求めることができる。

なお、図１に示した本実施形態の分析装置１００では、基板１０の試料保持面１１が基板１０の下面とされていて、粒子５をぶら下げた形で保持するようにされている。また、超音波トランスデューサー２０は、基板ホルダーを介して、粒子と対向する位置に配置されている。試料保持面１１及び超音波トランスデューサー２０の配置はこれに限定されるものではない。例えば、試料保持面１１は基板１０の上面とされていてもよい。また、超音波トランスデューサー２０は基板１０を介して粒子と対向する位置に配置されていてもよい。

図３は、本発明の別の一実施形態に係る分析装置において基板から測定対象物の粒子が離脱する状態を示す概念図である。図３に示す分析装置では、超音波トランスデューサー２０の上に基板１０が配置され、試料保持面１１が基板の上面とされている。すなわち、超音波トランスデューサー２０は基板１０を介して粒子５と対向する位置に配置されている。

図３に示す分析装置１０１では、粒子５は、粒子５に働く音響放射力Ｆ_ａｃと沈降力Ｆ_ｓｅｄの合成力Ｆ_{ｔｏｔａｌ}が第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合力Ｆ_ｂｉｎｄよりも大きくなることによって基板１０の試料保持面１１から離脱して、上方にある超音波の定在波の節２に移動する。すなわち、結合力が大きな第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合によって保持されている粒子５を試料保持面１１から離脱させるのに必要な超音波トランスデューサー２０に印加する電気信号の電圧値Ｖ_１と比較して、結合力が小さい第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合によって保持されている粒子５を試料保持面１１から離脱させるのに必要な超音波トランスデューサー２０に印加する電気信号の電圧値Ｖ_２は低くなる（Ｖ_２＜Ｖ_１）。

なお、第１の分子６ａと第２の分子１１ａが分離（解離）する時のＦ_ｂｉｎｄ＝Ｆ_{ｔｏｔａｌ}＝Ｆ_ａｃ＋Ｆ_ｓｅｄであるが、上述したとおり、粒子５の半径ｒ及び媒質１７の密度ρ、ρ´が既知である場合、Ｆ_ｓｅｄは定数となる。このとき、Ｆ_{ｔｏｔａｌ}は_Ｆａｃに依存し、Ｆ_ｂｉｎｄは、第１の分子６ａと第２の分子１１ａが分離（解離）する時の粒子５に働く音響放射力Ｆ_ａｃに依存する。

また、粒子５（マイクロ粒子６）の半径ｒ及び媒質１７の密度ρ、ρ´が既知であるという条件の下、本実施形態の分析装置１００及び１０１は、粒子５に付与した音響放射力Ｆ_ａｃ又は超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値Ｖから、粒子５の結合エネルギー（第１の分子６ａと第２の分子１１ａの結合エネルギー）Ｅを測定するように構成されていてもよい。この場合、算出部（不図示）において粒子５の結合力Ｆ_ｂｉｎｄを算出する。

また、粒子５（マイクロ粒子６）の半径ｒ及び媒質１７の密度ρ、ρ´が既知であるという条件の下、本実施形態の分析装置１００及び１０１は、粒子５に付与した音響放射力Ｆ_ａｃ又は超音波トランスデューサー２０に印加した電気信号の電圧値Ｖから、第１の分子６ａと第２の分子１１ａの解離定数Ｋ_ｄを測定するように構成されていてもよい。この場合、算出部（不図示）において第１の分子６ａと第２の分子１１ａの解離定数Ｋ_ｄを算出する。

この場合において、本実施形態の分析装置１００及び１０１は、測定された解離定数に基づいて、第１の分子６ａ及び／又は第２の分子１１ａの種類を同定する同定部（不図示）を備えていてもよい。前記同定部は、例えば、入力された解離定数Ｋ_ｄに適合する第１の分子６ａと第２の分子１１ａの組合せを出力するように構成されている。

さらに、本実施形態の分析装置１００及び１０１は、第１の分子６ａ及び第２の分子１１ａの少なくとも一方が２種以上の分子である夾雑系であってもよい。この場合、第１の分子６ａと第２の分子１１ａのそれぞれの組合せの解離定数を計測するように構成されてもよい。

以下では実施例によって本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
＜超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と粒子の浮揚率との関係＞
（１）基板の作製
ガラス基板への第１の分子（イブプロフェン（ＩＢ））による修飾は、ガラス基板をエポキシ基含有シランで修飾し、次いで、エポキシ基の開環反応を利用して、エポキシ基含有シランとイブプロフェンのアミノ基とを結合させることによって行った。
まず、ガラス基板をシランカップリング剤（３－グリシジルプロピルトリエトキシシラン）で１時間の表面処理することによって、ガラス基板をエポキシ基含有シランで修飾した。エポキシ基はｐＨが９付近で水素基と反応するため、エポキシ基含有シランで修飾したガラス基板の表面に、ホウ酸緩衝液３０ｍＬ（ｐＨ９．１８）とイブプロフェンとを加えて、４時間反応させ、第１の分子（イブプロフェン）で表面を修飾したガラス基板を作製した。

（２）ポリスチレンマイクロ粒子の作製
ポリスチレンマイクロ粒子への第２の分子（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））による修飾は、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応によって行った。
まず、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）に、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを投入し、混合した。こうして、ＥＤＣ濃度が３０ｍｇ／ｍＬで、ＮＨＳ濃度が３６ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を調製した。次いで、このＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬとカルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子１００μＬ（１．４×１０^６個、ポリスチレンマイクロ粒子の平均粒子径：１５μｍ）とを混合して、カルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子表面上のカルボキシル基を活性化させ、ＢＳＡの塩基性残基由来のアミノ基を結合できるようにした。活性化させたカルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子を水で１回洗浄し、未反応のＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を取り除いてカルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子の水性分散液を得た。次いで、カルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子の水性分散液にＢＳＡの２ｎｍｏｌを投入して、４時間反応させて、第２の分子（ＢＳＡ）で表面を修飾したポリスチレンマイクロ粒子を作製した。

（３）分析用基板の作製
第１の分子（ＩＢ）で表面を修飾したガラス基板の表面に、第２の分子（ＢＳＡ）で修飾したポリスチレンマイクロ粒子分散液１０μＬ（１．４×１０^５個）を滴下した。その後、４時間静置して、第２の分子で表面を修飾したポリスチレンマイクロ粒子を自然沈降させた。こうして、第２の分子で表面を修飾したポリスチレンマイクロ粒子の第２の分子（ＢＳＡ）と第１の分子で表面を修飾したガラス基板の第１の分子（ＩＢ）とを相互作用させることによって、ガラス基板にＩＢとＢＳＡの結合を介したポリスチレンマイクロ粒子を保持させた。得られたガラス基板を分析用基板Ｎｏ．１とした。

また、第１の分子をマンナン（Ｍａｎ）、第２の分子をコンカナバリンＡ（ＣｏＡ）とした分析用基板Ｎｏ．２を、第１の分子をグリコーゲン（Ｇｌｙ）、第２の分子をコンカナバリン（ＣｏＡ）とした分析用基板Ｎｏ．３を、それぞれ作製した。分析用基板Ｎｏ．２及びＮｏ．３の作製方法は、分析用基板Ｎｏ．１と同様の工程である。第２の分子をコンカナバリンとしたポリスチレン粒子１０μＬ（１．４×１０^５個）を、第１の分子をマンナンとして作成したガラス基板、グリコーゲンとして作製したガラス基板にそれぞれ投入して、４時間反応させて、分析用基板Ｎｏ．２及び３を作製した。

（４）ポリスチレンマイクロ粒子の離脱試験
ポリスチレンマイクロ粒子の離脱試験は、図１に示す分析装置を用いて実施した。
分析用基板を、第２の分子で表面を修飾したポリスチレンマイクロ粒子を保持させた面（試料保持面）が下を向くように基板ホルダーの上に配置した。基板ホルダーの溝部をホウ酸緩衝液で満たした後、分析装置の電圧調整器にて生成させた１ＭＨｚの正弦波電圧を超音波トランスデューサーに印加して、音響放射力を発生させ、ポリスチレンマイクロ粒子に音響放射力を付与した。音響放射力の付与中、顕微鏡を用いてガラス基板に保持されているポリスチレンマイクロ粒子を観察し、ガラス基板に保持されているポリスチレンマイクロ粒子の個数を計測した。超音波トランスデューサーに印加する正弦波電圧の電圧値は、電圧調整器を用いて１分間の間隔で１Ｖずつ上昇させた。

分析用基板Ｎｏ．１の試験結果を、図４に示す。図４は、超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値（横軸）と、ガラス基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子の割合（浮揚率；縦軸）との関係を示すグラフである。

図４のグラフの縦軸の浮揚率は、以下の式（ｉ）により算出した値である。
浮揚率（％）＝（１－Ｎ_ｖ／Ｎ_０）×１００ （ｉ）
式（ｉ）において、Ｎ_ｖは、超音波トランスデューサーに電圧を印加したときに、第１の分子と第２の分子が解離せずにガラス基板に保持されているポリスチレンマイクロ粒子の個数を表す。Ｎ_０は、超音波トランスデューサーに電圧を印加したときに、第１の分子と第２の分子が解離せずにガラス基板に保持されているポリスチレンマイクロ粒子の個数を表す。浮揚率は、第１の分子と第２の分子の結合が解離しガラス基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子の割合を表す。すなわち、浮揚率が大きいことは、ガラス基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子の割合が大きいことを意味する。

図４のグラフから、超音波トランスデューサーへの印加電圧値の上昇に伴って、浮揚率が大きくなること、すなわち、ガラス基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子が増加することがわかる。これは、超音波トランスデューサーへの印加電圧値を大きくすることによって、音響放射力Ｆ_ａｃが増大し、第１の分子と第２の分子の分子間の結合エネルギーを超えるとポリスチレンマイクロ粒子が超音波の定在波の節に向かって浮揚するためである。結合エネルギー分布や粒度分布に広がりを持つため、超音波トランスデューサーへの印加電圧に対する粒子の浮揚率の関係はガウス関数で表される。

図５は、分析用基板Ｎｏ．１～３の超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値（横軸）と、ガラス基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子の割合（ＤＰ；縦軸）との関係を示すグラフである。
図５のグラフから、第１の分子と第２の分子の種類によって分子間の結合エネルギーが大きくなるに伴って、浮揚率が超音波トランスデューサーへの印加電圧が高電圧で大きくなることがわかる。

［実験例２］
（１）ガラス基板の作製
ＤＮＡ修飾ガラス基板の作製は、実験例１に対して、ガラス基板上にアミノ基修飾ＤＮＡ（３塩基～７塩基）を加える点が異なっており、それ以外は同様である。エポキシ基含有シランとアミノ基修飾ＤＮＡ（３塩基～７塩基）のアミノ基とを結合させることによって行った。

（２）ポリスチレンマイクロ粒子の作製
ＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子の作製は、実験例１に対して、カルボキシル基修飾シリカマイクロ粒子の水性分散液にアミノ基修飾ＤＮＡ（３塩基～７塩基）を投入する点が異なっており、それ以外は同様である。カルボキシル基修飾ポリスチレンマイクロ粒子表面上のカルボキシル基を活性化させ、アミノ基修飾ＤＮＡ（３塩基～７塩基）を結合させることによって行った。

（３）分析用基板の作製
ＤＮＡ修飾シリカマイクロ粒子付きガラス基板の作製は、実験例１に対して、ガラス基板の表面に滴下する分散液が、ＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子分散液である点が異なっており、それ以外は同様である。ＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子のＤＮＡとＤＮＡ修飾ガラス基板のＤＮＡとを相互作用させることによって、ガラス基板にＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子を保持させた。修飾したＤＮＡの塩基数が異なるガラス基板を分析基板として作製し、それぞれ、３塩基を分析用基板Ｎｏ．４、４塩基を分析用基板Ｎｏ．５、５塩基を分析用基板Ｎｏ．６、６塩基を分析用基板Ｎｏ．７、７塩基を分析用基板Ｎｏ．８とした。

（４）ポリスチレンマイクロ粒子の離脱試験
ポリスチレンマイクロ粒子の離脱試験は、実験例１と同様である。

図６は、第１の分子及び第２の分子のそれぞれにＤＮＡ（３塩基～７塩基）を用いたＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子が、２本鎖ＤＮＡが解離して１本鎖ＤＮＡに分解したことにより、基板から離脱した時の超音波トランスデューサーの印加電圧値（横軸）と、浮揚率（ＤＰ；縦軸）の関係を表すグラフである。ＤＮＡの塩基数が増加することで結合が解離してポリスチレン粒子が離脱するときの超音波トランスデューサーへの印加電圧が大きくなることがわかる。

図７は、１の分子及び第２の分子のそれぞれにＤＮＡ（３塩基～７塩基）を用いたＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子が、２本鎖ＤＮＡが解離して１本鎖ＤＮＡに分解したことにより、基板から離脱したポリスチレンマイクロ粒子の個数が５０個％になった時の超音波トランスデューサーの印加電圧値（Ｖ_５０；横軸）と解離定数の理論値（ｌｏｇＫ_ｄ；縦軸）の関係を表すグラフである。解離定数の理論値は、３塩基～７塩基の各ＤＮＡのギプス自由エネルギーを数式（４）の関係から算出したものである。各塩基配列のギプス自由エネルギーの値は、例えば、Ｉｎｔｅｆｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社が公開する計算アルゴリズムから入手することができる（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ）。図７のグラフから、超音波トランスデューサーの印加電圧値に対する解離定数の対数値は、線形の相関を示すことがわかる。この相関関係のグラフを検量線として用いることができる。

［実施例１］
実験例１で作製した分析用基板Ｎｏ．１～Ｎｏ．３について、ポリスチレンマイクロ粒子の浮揚率が５０個％となったときの超音波トランスデューサーの電気信号の印加電圧（Ｖ_５０）、上述した数式（１）で示されるＦ_ａｃ、及び図７の検量線から算出された解離定数Ｋ_ｄを示す。

［実施例２］
実験例２で作製した分析用基板Ｎｏ．４～Ｎｏ．８について、ポリスチレンマイクロ粒子の浮揚率が５０個％となったときの超音波トランスデューサーの電気信号の印加電圧（Ｖ_５０）、上述した数式（１）で示されるＦ_ａｃ、自由結合エネルギーの文献値ΔＧ^ａ及び図７の検量線から算出された解離定数Ｋ_ｄを示す。

［実験例３］
３塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子と７塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子とをガラス基板の保持させた夾雑系の分析用基板を作製し、実験例２と同様の計測を実施した。

図８は、超音波トランスデューサーの印加電圧値（横軸）と、ガラス基板から離脱したＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子の割合（縦軸）との関係を表したグラフである。図８のグラフから、結合エネルギーが小さい３塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子がまず離脱し、その後印加電圧が大きくなると結合エネルギーが小さい７塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレンマイクロ粒子が離脱することがわかる。

図９に、図８のグラフをガウス関数でフィッティングしたグラフを示す。図９のグラフから、３塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレン粒子が離脱するときのトランスデューサー印加電圧と、７塩基のＤＮＡ修飾ポリスチレン粒子が離脱するときのトランスデューサー印加電圧を切り分けることができる。つまり、本装置は第１の分子及び第２の分子がそれぞれ複数種類含まれる試料においても分子複合体が解離する現象を電圧値の差で判別することができ、夾雑系の生体分子の結合力や解離定数を計測することができる。

本発明の分析装置は、従来の表面プラズモン共鳴を用いた手法とは異なった音響放射力を利用して、分子複合体の解離定数を、短時間な測定時間で計測すること、及び夾雑物の中の複数の結合の判別をすることができるため、創薬分野においてより効率的な作用を示す化学合成品を創出することに貢献する。

１ 定在波
２ 節
５ 粒子
６ マイクロ粒子
６ａ 第１の分子
１０ 基板
１１ 試料保持面
１１ａ 第２の分子
１５ 基板ホルダー
１６ 溝部
１７ 媒質
２０ 超音波トランスデューサー
３０ 電圧調整器
４０ 電源
５０ 出力部
６０ 粒子個数計測部
６１ 顕微鏡
６２ 計測器
１００、１０１ 分析装置

Claims (8)

1. 第１の分子と第２の分子が結合してなる試料の解離定数を測定するための測定装置であって、
   前記第１の分子で修飾された表面を有する粒子と、
   前記第２の分子で修飾され、前記第１の分子と前記第２の分子が結合することによって前記粒子が保持される試料保持面を有する基板と、
   前記粒子に音響放射力を付与する超音波トランスデューサーと、
   前記超音波トランスデューサーに印加する電気信号の電圧値を調整する電圧調整器と、
   前記粒子が音響放射力を受けることによって前記第１の分子と前記第２の分子が解離することによって前記基板の前記試料保持面から離脱した時の前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値を出力する出力部と、を備える、分析装置。
2. さらに、前記基板の前記試料保持面に保持されている前記粒子の個数を計測する粒子個数計測部を備え、
   前記出力部は、前記基板の前記試料保持面に保持させた粒子のうちの５０個％以上の粒子が音響放射力を受けることによって前記基板の前記試料保持面から離脱した時の前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値を出力する、請求項１に記載の分析装置。
3. さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値に基づいて、前記粒子の結合エネルギーを算出する算出部を備える、請求項１又は２に記載の分析装置。
4. さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と、前記粒子の結合エネルギーとに基づいて、前記第１の分子と前記第２の分子の結合力を算出する算出部を備える、請求項１又は２に記載の分析装置。
5. さらに、前記粒子に付与した音響放射力又は前記超音波トランスデューサーに印加した電気信号の電圧値と、前記粒子の結合エネルギーとに基づいて、前記第１の分子と前記第２の分子の解離定数を算出する算出部を備える、請求項１又は２に記載の分析装置。
6. さらに、前記解離定数に基づいて、前記第１の分子及び／又は前記第２の分子の種類を同定する同定部を備える、請求項５に記載の分析装置。
7. 前記第１の分子及び前記第２の分子の少なくとも一方は２種以上の分子である、請求項６に記載の分析装置。
8. 前記粒子がポリスチレン粒子であり、前記第１の分子及び前記第２の分子がそれぞれ独立にＤＮＡ、タンパク質及び低分子化合物からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項６又は７に記載の分析装置。

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