JP2023123517A - アンジェルマン症候群アンチセンス治療 - Google Patents

Abstract

【課題】母方から遺伝されたユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）遺伝子の発現又は機能に影響する変異により引き起こされるアンジェルマン症候群（ＡＳ）を治療するための薬学的組成物を提供する。【解決手段】１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／または賦形剤を含み、前記１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特定の核酸配列の連続した部分に少なくとも９８％の相補性を有する、１０～３０個のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ）の５’－末端を標的とすることができる、対象におけるアンジェルマン症候群の治療又は予防に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド薬学的組成物である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１日に出願された米国仮出願第６２／５９３，４３１号お
よび２０１８年５月２４日に出願された出願シリアル第６２／６７６，０３４号の優先権
を主張するものであり、これらは参照によりそれらのすべてが本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、２０１８年１１月３０日に作成された「９２２００１－２０２０ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という題名のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして
電子形態で提出された配列表を含む。配列表の内容は、そのすべてが本明細書に組み込ま
れる。

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、重度の知的障害および運動障害、てんかん、睡眠障
害、ならびに異常に「幸せを感じる」気質に関連付けられる神経発達疾患である。ＡＳを
有する個人は、多くの場合、２～３歳で診断され、通常の寿命を有する。彼らは、生涯に
わたって、生活に介護および医療ケアを必要とする。現在、ＡＳを有する個人のための治
療選択肢はほとんどなく、そのほとんどは、てんかん発作を治療するための抗てんかん薬
を含む。

アンジェルマン症候群は、母方から遺伝されたユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ
（ＵＢＥ３Ａ）遺伝子の発現または機能に影響する変異により引き起こされる。大部分の
遺伝子とは異なり、ＵＢＥ３Ａは、ゲノムインプリンティングを受けており、ゲノムイン
プリンティングとは、遺伝子の他方のアレルをオンにしたままで、一方のアレルをオフに
するという、自然に発生する、まれな現象である。中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンで
は、父方ＵＢＥ３Ａアレルはオフになっているが、体内の他のすべての細胞型では、ＵＢ
Ｅ３Ａの両方のアレルがオンになっている。このため、ＡＳは常に、母方から遺伝された
ＵＢＥ３Ａアレルに影響する変異により引き起こされる。

父方ＵＢＥ３Ａアレルは、いくつかのタンパク質コーディングおよび非コーディング転
写物を発現する長鎖ＲＮＡ転写物の成分である、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ
３Ａ－ＡＳ）によりオフになっている。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳは、父方アレルから、かつＣＮ
Ｓのニューロンにおいてのみ発現され、これは、父方ＵＢＥ３Ａアレルの発現をオフとす
るのに十分および必須である。何故ＵＢＥ３Ａがニューロンにおいて刷り込みを受けるの
かということは不明確であるが、父方染色体上にＵＢＥ３Ａの不活性であるが機能的であ
るコピーが存在するために、それは、ＡＳを有する個人を治療するために独特の機会を作
り出す。現在までの研究は、父方ＵＢＥ３Ａアレルをオンにすることが、ＡＳを治療する
ための実行可能な治療であることを示している。

本明細書では、自身の安定性のために重要であるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の５’－末端
にある領域が開示される。これらの知見に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチド（
ＡＳＯ）が、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、父方ＵＢＥ３Ａアレルの発現を再活性化
するために、この領域を標的とするために設計された。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を
標的とするこれらのＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、かつ父方ＵＢＥ３Ａア
レルをオンとすることができる。ＳＮＨＧ１４は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを含む、いくつかの
異なるＲＮＡをコードする多シストロン性転写物である。

したがって、本明細書では、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ）の５
’－末端を表すと考えられている、ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端とＳＮＯＲＤ１０９Ｂ
の５’－末端との間の標的エクソンに対して少なくとも９８％（すなわち、９８％、９９
％、または１００％）の相補性を有する、１０～３０個のヌクレオチド長（すなわち、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個）の連続したヌクレオチド配列を
含有するＡＳＯが開示される。特に、標的エクソンは、ヒト染色体１５ヒトゲノムアセン
ブリｈｇ１９上の２５，５１１，５７７～２５，５１６，６８１位に対応する、ＵＢＥ３
Ａ－ＡＳの５’－末端中であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＵＢＥ３Ａ
－ＡＳの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つであり、これは、２５，５
１１，５７７～２５，５１１，７６１（エクソン１）、２５，５１２，０５９～２５，５
１２，１９１（エクソン２）、２５，５１３，４７６～２５，５１３，６００（エクソン
３）、２５，５１４，７５２～２５，５１４，８８０（エクソン４）、および２５，５１
６，５６５～２５，５１６，６８１（エクソン５）位に対応し得る。したがって、標的核
酸は、配列番号１、２、３、４、または５内の１０～３０個のヌクレオチドの連続した核
酸配列であり得る。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳエクソン１～５、ＵＢＥ３Ａ
－ＡＳエクソン５およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂエクソン１、および／またはＳＮＯＲＤ１０
９Ｂエクソン１～２を含むエクソン境界である。

ＡＳＯを設計するための方法および戦略は、当該技術分野において知られている。いく
つかの実施形態では、ＡＳＯは、ヒト対象の間で保存されている配列を標的するために設
計される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、霊長類対象の間で保存されている配列を
標的するために設計される。

オリゴヌクレオチドは、例えば、ギャップマー設計を有する、アンチセンスオリゴヌク
レオチド（すなわち、当業者によって理解されているように、その標的核酸に対してアン
チセンスである）であり得る。開示されたオリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写
物の分解、軽減、または除去により、ニューロンにおける父方ＵＢＥ３Ａ発現を誘導する
ことができる。それは、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ｓｎｏＲＮＡの上流部位にあるＵＢＥ３Ａ
－ＡＳの５’－末端を標的とすることにより、これを行う。エクソン１～５を標的するよ
うに設計されたＡＳＯの実施例は、表１、２、３、４、または５において提供される。例
えば、いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、核酸配列、配列番号６、７、８、９、１０、
または１１を含む。

開示されたＡＳＯはまた、安定性、溶解性、活性、細胞分布、および／または細胞取込
みを改善するために１つ以上の修飾を有することができる。例えば、開示されたＡＳＯは
、１つ以上の糖修飾されたヌクレオシドおよび／または修飾されたヌクレオシド間結合を
含有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然
のホスホジエステルから、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある結合へと修
飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、天
然に生じる核酸塩基とは異なるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である１つ以
上の修飾された核酸塩基を含有する。

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実
施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。さらなる他の実施形態では、
ＡＳＯは、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含有する。例えば、Ａ
ＳＯは、ギャップマー、ヘッドマー、またはテイルマーオリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、ギャップマーの中心ブロックは、ヌクレアーゼ分解から内部ブ
ロックを保護する修飾されたリボヌクレオチドのブロックに隣接される。例えば、ＡＳＯ
は、エキソヌクレアーゼに対する保護のための３’－および５’－末端にある３、４、ま
たは５個の修飾されたリボヌクレオチドモノマーと共に、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断
を活性化するために、７、８、９、１０個、またはそれ以上の天然のＤＮＡモノマーのス
トレッチを含有することができる。いくつかの場合では、修飾されたリボヌクレオチドは
、２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）ＲＮＡヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ
）－修飾ヌクレオチド、または２’－ロック核酸（ＬＮＡ）である。ギャップマーＡＳＯ
の実施例は、表７、１１、および１７において提供される。したがって、いくつかの実施
形態では、開示されたＡＳＯは、配列番号３６２～３９２から選択された核酸配列を有す
る。

本明細書で開示される１つ以上のＡＳＯ、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、
塩、および／または賦形剤を含む薬学的組成物も開示される。

父方ＵＢＥ３Ａの発現が抑制されている標的細胞におけるＵＢＥ３Ａ発現のインビボま
たはインビトロ誘導のための方法であって、１つ以上の開示されたＡＳＯまたは本明細書
で開示される組成物を有効量で前述の細胞に投与することによる方法も開示される。

ＵＢＥ３Ａのインビボ活性に関連する疾患、障害、または機能不全を治療または予防す
るための方法であって、治療的または予防的有効量の開示された１つ以上のＡＳＯを、ア
ンジェルマン症候群などの疾患、障害、または機能不全を患っているか、またはその疑い
のある対象へ投与することを含む方法も開示される。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明において示
される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の
範囲から明らかとなる。例えば、当業者は、本明細書を読むことにより、本開示がＵＢＥ
３Ａの発現に影響を与えるための本明細書に記載されるような特定の配列の有用性を実証
しており、そのような配列であるか、またはそれらを標的とする（例えば、相補的である
）オリゴヌクレオチドフォーマットの有用性をさらに教示していることを認識するだろう
。当業者は、本開示が任意の特定の作用機序に限定されないことを認識し、提供されるオ
リゴヌクレオチドは、それらが例えばＲＮアーゼＨ活性を含むアンチセンス機序を介して
作用するかに関わらず、有用であり得、また、そのような配列であるか、またはそれらを
標的とするオリゴヌクレオチドの他の治療的フォーマット（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲ
ＮＡ、ヌクレアーゼｇＲＮＡ等）もまた提供される。類似的に、当業者は、本明細書で記
載されるような有用な配列を定義することにより、本発明はまた、そのような配列のため
の様々なフォーマット（例えば、それらが発現される（例えば、インビボ、インビトロ、
またはその両方など）ベクターなどの核酸ベクターの一部として）も記載していることを
認識するだろう。故に、当業者は、本開示を読むことにより、本明細書の「ＡＳＯ」への
参照が例示的であり、適切な核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が作用機序に関わらず
利用され得ることを認識するだろう。当業者は、様々な機序のうちのいずれかを介して作
用する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の適切なフォーマットおよび構造（例えば、
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ヌクレアーゼｇＲＮＡ等）に関する広範な文献を認識している
。いくつかの実施形態では、提供される核酸は、１つ以上の機序的コンテキストにおいて
有用であることが当該技術分野において知られているフォーマットおよび／または構造的
特徴（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＲＩＳＣ、Ｃａｓなどの核酸指向ヌクレアーゼ等を含む）
を組み込む。

ヒトおよびマウスにおけるＰｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ／アンジェルマン症候群（ＰＷＳ／ＡＳ）刷り込み領域を示す。図１Ａは、ヒトＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図１Ｂは、マウスにおけるＰＷＳ／ＡＳ刷り込みオルソロガス領域の参照配列の注釈を示す。図１Ｃは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの３’－末端を示す。図１Ｄは、ヒト、マカク（カニクイザルマカク）、ブタ、ゾウ、マウス、およびラットの間のオルソロガス領域を示す鎖アラインメントを示す。標的領域は、非ヒト霊長類間では保存されているが、げっ歯類間では保存されていない。図１Ｄはまた、領域のゲノム的進化速度プロファイリング（ＧＥＲＰ）プロットも示す。正の値は、特定のＤＮＡ塩基での進化的制約を表す。 マウスＵｂｅ３ａ－ＡＳを標的とするＡＳＯの分析を示す。図２Ａは、マウスＵｂｅ３ａ－ＡＳ転写物およびマウス特異的ＡＳＯのおおよその位置の図である。ボックスおよび線はそれぞれ、エクソンおよびイントロンを表す。矢印は、転写の方向を表す。図２Ｂは、父方Ｕｂｅ３ａタンパク質レベルを測定するために使用されるＵｂｅ３ａＹＦＰレポーターアレルの図である。Ｕｂｅ３ａＹＦＰマウスモデルは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を内因性Ｕｂｅ３ａ遺伝子座の３’－末端に標的させることにより産生された。Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの発現は、父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰアレルの転写を阻害し、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの損失は、父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰ発現を再活性化し、これは、抗ＹＦＰ抗体を使用する免疫蛍光イメージングにより検出されることができる。図２Ｃは、マウス初代海馬ニューロンにおけるＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。マウス初代海馬ニューロンは、父方から遺伝されたＵｂｅ３ａＹＦＰアレルを有する新生児マウス（０ＤＩＶ）から産生され、インビトロで７日（７ＤＩＶ）後に治療された。治療の３日後（１０ＤＩＶ）、Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質レベルが個々の細胞において測定された。図２Ｄは、ビヒクル（ｖｅｈ）、負対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ）、トポテカン（トポ）、ＡＳＯ－Ｂ、およびＡＳＯ１．１で治療された初代ニューロンにおける父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質を示す免疫蛍光画像を含む。図２Ｅは、ビヒクル（ｖｅｈ、１％のＤＭＳＯ；ｎ＝３）、対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ、１５μＭ；ｎ＝３）、トポテカン（トポ、０．３μＭ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－Ｂ（１、５、１５μＭ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－１．１（１、５、１５μＭ）、ＡＳＯ－１．２（１、５、１５μＭ）、およびＡＳＯ３．１（１、５、１５μＭ）で治療された個々のニューロン細胞における父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰ平均強度レベルを示す。省略形：ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；Ｔｘ、治療；ＤＩＶ、インビトロでの日数；ｎ．ｓ．、有意でない。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とするＡＳＯの分析を示す。図３Ａは、ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびヒト特異的ＡＳＯ（ＡＳＯ１～６）のおおよその位置を示す図である。ＡＳＯ－７は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳのイントロンに位置する。ボックスおよび線はそれぞれ、エクソンおよびイントロンを表す。図３Ｂは、カリオタイプに関して正常な個体からのヒトＧＡＢＡ作動性誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンにおいてＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶ後に治療され、次いで、２０ＤＩＶにて、ＲＮＡ単離のために処理された。図３Ｃおよび３Ｄは、対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ、１０μＭ）、およびＡＳＯ１～７（１０μＭ）、およびトポテカン（トポ、１μＭ）で治療したｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図３Ｃ）およびＵＢＥ３Ａ（図３Ｄ）の相対的定常状態ＲＮＡレベル（ＡＳＯ－Ｃに対して正規化された）を示す。省略形：Ｔｘ、治療；ＤＩＶ、インビトロでの日にち。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるヒトＡＳＯ－４およびトポテカンの分析を示す。図４Ａ～４Ｆは、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびトポテカン（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図４Ａ）、ＳＮＯＲＤ１１６（図４Ｂ）、ＩＰＷ（図４Ｃ）、ＳＮＯＲＤ１１５（図４Ｄ）、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ（図４Ｅ）、およびＵＢＥ３Ａ（図４Ｆ）定常状態ＲＮＡレベルの相対的発現（１ｎＭに対して正規化された）を示す。図４Ｇは、５９ＤＩＶで治療されたＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４を調べるための実験タイムラインの図である。図４Ｈ～４Ｉは、ＡＳＯ－Ｃ（１０μＭ）およびＡＳＯ－４（１、５、および１０μＭ）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図４Ｈ）およびＵＢＥ３Ａ（図４Ｉ）定常状態ＲＮＡレベルの相対的発現（ＡＳＯ－Ｃに対して正規化された）を示す。省略形：Ｔｘ、治療。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 ヒトＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける最適化されたＡＳＯの分析を示す。図５Ａは、ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける最適化されたＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｂは、ＡＳＯ－３．１、ＡＳＯ－３．２、ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、ＡＳＯ－４．４、ＡＳＯ－６．１、ＡＳＯ－４．Ｉ、およびＡＳＯ－４．Ｓの５ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ；ｎ＝６）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの（水対照に対して正規化された）相対的発現を示す。ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓは、２つの企業（ＡＳＯ－４．Ｉ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＡＳＯ－４．Ｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により製造されたＡＳＯ－４を表す。図５Ｃは、ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１を調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｄは、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓ）ならびにＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルの（１ｎＭに対して正規化された）相対的発現を示す。図５Ｅは、グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１を調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｆは、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓ）ならびにＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０ｕＭ；ｎ＝３）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルの（水対照に対して正規化された）相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 マウスＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域におけるＡＳＯ標的領域の同定を示す。図６Ａは、マウス染色体７Ｃ上のオルソロガスＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図６Ｂは、マウス脳からのＲＮＡ－配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）データから産生された転写物アセンブリを示す。図６Ｃは、Ｓｎｏｒｄ１１５宿主遺伝子転写物／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの５’－末端のエクソン中に保持されたＳｎｏｒｄ１１５ ｓｎｏＲＮＡを示すＡＳＯ標的領域を示す。アラインされたＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りは、アセンブリ転写物の下に示される。エクソンおよびイントロンはそれぞれボックスおよび線で示される。図６Ｄは、保持されたエクソンＳｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０１８３６（配列番号４９０）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０１９３６（配列番号４９１）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０４４９３（配列番号４９２）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ００００００８２４４３（配列番号４９３）、およびＳｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０４４２７（配列番号４９４）中のｓｎｏＲＮＡの配列アラインメントであり、保持されたｓｎｏＲＮＡが、機能的ｓｎｏＲＮＡ形成のために必要とされる縮重ボックスを有することを示す。 ヒトＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域におけるＡＳＯ標的領域の同定を示す。図７Ａは、Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ／アンジェルマン症候群（ＰＷＳ／ＡＳ）刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図７Ｂは、ヒトＰＷＳ多シストロン性転写物のＲＮＡ－ｓｅｑアセンブリを示す。図７Ｃは、ＳＮＯＲＤ１１５－４５を示し、これは、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物の３’－末端／ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端にあるエクソン中に保持されている。成人ヒト脳から産生されたアラインされたＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りは、Ｌ１ラインが転写されていることを示す。図７Ｄは、ＳＮＯＲＤ１１５クラスター（ＳＮＯＲＤ１１５－３９－４８およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂ）の３’－末端の参照配列の注釈を示す。図７Ｅは、ＳＮＯＲＤ１１５－４４とＳＮＯＲＤ１１５－４５との間のＬ１ライン要素の位置を示す。図７Ｆは、げっ歯類では軽減されているものの、ＳＮＯＲＤ１１５－４５－４８領域での保存を示す主要なクレードを表す有胎盤類の鎖アラインメントを示す。図７Ｇは、ＳＮＯＲＤ１１５－４４（機能的ｓｎｏＲＮＡ）（配列番号４９５）、ＳＮＯＲＤ１１５－４８（配列番号４９６）、ＳＮＯＲＤ１１５－４５（配列番号４９７）、ＳＮＯＲＤ１１５－４６（配列番号４９８）、およびＳＮＯＲＤ１１５－４７（配列番号４９９）に対する標的領域中のｓｎｏＲＮＡの配列アラインメントを示し、ＳＮＯＲＤ１１５－４５（保持された）、ＳＮＯＲＤ１１５－４６（部分的に保持された）、およびＳＮＯＲＤ１１６－４７が、機能的ｓｎｏＲＮＡ形成のために必要とされる縮重ボックスを有することを示す。 候補ＡＳＯの薬力学的分析を示す。図８Ａは、異なる骨格およびＲＮＡ修飾設計を有するＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝２）で治療されたＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける正規化されたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの近似用量応答曲線を示す。用量応答曲線は、４－パラメータロジスティック回帰モデル（Ｈｉｌｌ）を使用して近似される。グラフは、近似されたモデルおよび標準誤差を表す。Ｙ軸は、相対的ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを表し、Ｘ軸は、ＡＳＯのｌｏｇモル（Ｍ）濃度を表す。図８Ｂおよび８Ｃは、候補ＡＳＯ間の関係を示し、３つのクラスターへとグループ分けする、近似用量応答曲線の階層的クラスター化の樹状および星状プロットである。 アンジェルマン症候群ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析を示す。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたアンジェルマン症候群ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける正規化されたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの４－パラメータロジスティック回帰モデル（Ｈｉｌｌ）。 ＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌで治療されたアンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＰＷＳ多シストロン性転写物によりコードされたＲＮＡの発現分析を示す。ビヒクル（１％のＨ２Ｏ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（３０μＭ；ｎ＝３）、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたＡＳ ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＳＮＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＨＧ１１６、ＳＮＯＲＤ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、ＩＰＷ、ＳＮＨＧ１１５、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ、およびＵＢＥ３Ａの正規化された定常状態ＲＮＡレベルが示される。データは、ビヒクルに対するＲＮＡの平均パーセンテージを表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、ビヒクルに対する、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを使用する、統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。 カニクイザルマカクにおけるＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析を示す。ビヒクル（０．９％の食塩水；ｎ＝５）、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（１０ｍｇ；ｎ＝３）、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（１０ｍｇ；ｎ＝３）で治療したマカクＣＮＳ領域におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが示される。データは、ビヒクルに対するＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡの平均パーセンテージを表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、ビヒクルに対する、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを使用する、統計的に有意な差異（ｐ ＜ ０．０５）を示す。

別名ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａアンチセンス転写物およびＵＢＥ３Ａ－Ａ
Ｓ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳとしても知られている、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ転写
物は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子に対してアンチセンスＤＮＡ鎖上にある、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写
物の転写により産生される転写物についての名称である。すべて大文字を用いた遺伝子名
はヒト遺伝子（例えば、ＵＢＥ３Ａ）を示し、初めの文字のみ大文字を用いた遺伝子名は
マウス遺伝子（例えば、Ｕｂｅ３ａ）を示すことに留意されたい。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写
物は、ＳＮＵＲＦ－ＳＮＲＰＮをコードする大きな多シストロン性転写ユニット、オーフ
ァンＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ＳＮＯＲＤ）のクラスター、およびいくつかの
特徴付けられていない長鎖非コーディングＲＮＡの部分として転写される。マウスおよび
ヒトの両方では、ＵＢＥ３Ａ／Ｕｂｅ３ａ遺伝子は、中枢神経系のニューロンにおいて刷
り込みを受けており、それは、母方アレルからのみ発現される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂ
ｅ３ａ－ＡＳ転写物は、父方ＵＢＥ３Ａ／Ｕｂｅ３ａアレルの転写をサイレンシングする
のに必須かつ十分であり、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの阻害は、父方ＵＢＥ３
Ａ／Ｕｂｅ３ａアレルの転写を再活性化する。母方から遺伝されたＵＢＥ３Ａアレルの機
能または発現に影響する変異は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を引き起こす。ＡＳでは
、父方アレルは、機能的であるが、後成的にサイレンシングされている。ＡＳ患者におい
てサイレンシングを止めると、父方ＵＢＥ３Ａアレルは、ニューロンにおける機能的ＵＢ
Ｅ３Ａの供給源となり得る。

ＵＢＥ３Ａ－ＡＳをコードする多シストロン性転写ユニット（本明細書では以後、ＰＴ
Ｕと称される）は、約４５０，０００塩基対の長さである。ＰＴＵの転写は、ＳＮＵＲＦ
－ＳＮＲＰＮ遺伝子座の上流エクソン（Ｕ－エクソン）で開始し、ＵＢＥ３Ａの５’－末
端に向かって停止する。ＰＴＵは以下のように編制される（５’－３’）：ＳＮＵＲＦ－
ＳＮＲＰＮ、ＳＮＯＲＤ１０７、ＳＮＯＲＤ６４、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ、ＳＮＯＲＤ１１
６（２９コピー）、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５（４８コピー）、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ、お
よびＵＢＥ３Ａ、これは、上流転写物の逆方向に配向している。多シストロン性転写物は
、代替的スプライシングを受け、代替的３’－プロセシングに供される。ＳＮＵＲＦ－Ｓ
ＮＲＰＮは、２つのポリペプチドをコードする。ＳＮＯＲＤは、宿主遺伝子転写物（ＳＮ
ＨＧ１４）のイントロン中にあり、スプライシングを受けたイントロンのエキソヌクレア
ーゼ脱分岐により産生される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子に重複する転写物
の３’－末端を表す。大部分のＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、リボソーム生合成におい
て役割を果たし、それらは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の２’－Ｏ－メチル化を導く
。しかし、ＰＷＳ／ＡＳ領域に位置するｓｎｏＲＮＡは、既知のｒＲＮＡに対して相補的
な任意の配列を欠失している。しかし、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡは、セロトニン
受容体２Ｃ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの代替的スプライシングを変化させることが見出された。

本明細書では、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の５’－末端はその安定性のために重要である
という証拠が開示される。本明細書で開示されるように、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端
を標的とするＡＳＯは、おそらくＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、かつ父方ＵＢＥ３Ａ
アレルをオンとすることにより、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳレベルを減少させることができる。

本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、それが当業者によって一般的に
理解されているように、２つ以上の共有結合したヌクレオシを含む分子として定義される
。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとしても参照
され得る。オリゴヌクレオチドは、固相化学合成、続いて、精製により、実験室で一般的
に作製される。オリゴヌクレオチドの配列を参照する場合、参照は、共有結合したヌクレ
オチドもしくはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはそれらの修飾に
対してなされる。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、人工のもの、例えば、化
学的に合成されたものである。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドはまた、１つ以
上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドも含み得る。

本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸に、特に
、標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調整
することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。いくつかの実施形態では、本明
細書で開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。

用語「連続したヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの
領域を指す。この用語は、本明細書では、用語「連続した核酸塩基配列」および用語「オ
リゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリ
ゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列中に存在する。い
くつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列を含み、場合
により、連続したヌクレオチド配列に官能基を付着させるのに使用されることができる、
さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば、ヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。
ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、なくてもよい。

ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのブロックを構築し、天
然に生じるおよび非天然に生じるヌクレオチドの両方を含むことができる。天然では、Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、
および１つ以上のホスフェート基（ヌクレオシドでは不在である）を含む。ヌクレオシド
およびヌクレオチドはまた、「ユニット」または「モノマー」として互換的に称されても
よい。

本明細書で使用される用語「修飾されたヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は
、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾を導入することにより、等価なＤＮＡ
またはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。いくつかの実施形
態では、修飾されたヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾されたヌクレオシド
という用語はまた、本明細書では、用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「ユ
ニット」または修飾された「モノマー」と互換的に使用されてもよい。

用語「修飾されたヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを共に共有結合するホ
スホジエステル（ＰＯ）結合または天然のリン酸結合以外の結合として当業者に一般的に
理解されているように定義される。修飾されたヌクレオシド間結合を有するヌクレオチド
は、「修飾されたヌクレオチド」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾されたヌ
クレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較してオリゴヌクレオチドのヌクレアー
ゼ耐性を増加する。天然に生じるオリゴヌクレオチドについては、ヌクレオシド間結合は
、隣接ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を作りだすホスフェート基を含む。修飾さ
れたヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに
特に有用であり、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに
修飾されたヌクレオシドの領域中などの、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドのＤ
ＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域でヌクレアーゼ切断に対して保護するように働くこ
とができる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから、例え
ば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある結合へと修飾された１つ以上のヌクレオシ
ド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中のオリゴヌクレオチドをインキュベートす
ることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ［例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ
（ＳＶＰＤ）］を使用することにより、決定されることができ、この両方は当該技術分野
において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌ
クレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合として称される。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配
列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は修飾されており、オリゴヌクレオチドま
たはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の、例えば、少なくとも
６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、または例えば、少なく
とも９０％が修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれ
らの連続したヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合が修飾されている。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートなどのように、オリゴヌクレオチドを非ヌク
レオチド官能基に結合させるヌクレオシド間結合はホスホジエステルであり得ることが認
識されよう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に結
合させるヌクレオシド間結合は修飾されている。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配
列のすべてのヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。

修飾されたヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエー
ト、およびボラノホスフェートを含む群から選択され得る。いくつかの実施形態では、修
飾されたヌクレオシド間結合は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼ
Ｈリクルートメントと適合するものであり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチ
オエート、またはボラノホスフェートである。

いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、硫黄（Ｓ）を含み、例えば、ホスホ
ロチオエートヌクレオシド間結合である。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態学、お
よび製造の容易さに起因して特に有用である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチ
ドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％
はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド
配列中のヌクレオシド間結合の、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％
、例えば、少なくとも８０％、または例えば、少なくとも９０％がホスホロチオエートで
ある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチ
ド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性のヌクレオシド間結
合、特に、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ、アミド－３、ホルムアセ
タールまたはチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。さらなる
ヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００９／１２４２３８（参照により本明細書に組み込まれ
る）に開示されている。一実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００７／０３１
０９１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているリンカーから選択される
。

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーについては領域
Ｇ、またはヘッドマーおよびテイルマーの非修飾ヌクレオシド領域などのように、標的核
酸と二本鎖を形成するときにヌクレアーゼをリクルートすることができるオリゴヌクレオ
チド領域において特に有用である。しかし、ホスホロチオエート結合はまた、ギャップマ
ーについての領域ＦおよびＦ’、またはヘッドマーおよびテイルマーの修飾されたヌクレ
オシド領域などのように、非ヌクレアーゼリクルート領域および／または親和性増強領域
においても有用であり得る。

しかし、設計領域の各々は、ＬＮＡなどの修飾されたヌクレオシドがヌクレアーゼ分解
に対して結合を保護する領域において特に、ホスホジエステル結合などの、ホスホロチオ
エート以外のヌクレオシド間結合を含むことができる。１つまたは２つの結合などのホス
ホジエステル結合を、特に修飾されたヌクレオシドユニット（典型的には、非ヌクレアー
ゼリクルート領域中）の間またはそれに隣接して含ませることにより、オリゴヌクレオチ
ドのバイオアベイラビリティおよび／または生体分布を修飾することができる。ホスホジ
エステル結合を有するオリゴヌクレオチドの教示について、ＷＯ２００８／１１３８３２
は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホ
スホロチオエートおよび／またはボラノホスフェート結合である。いくつかの実施形態で
は、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合で
ある。

核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌ
クレオシドおよびヌクレオチド中に存在する、プリン（例えば、アデニンおよびグアニン
）ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、およびシトシン）部分を含む。核酸
塩基という用語は、天然に生じる核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーショ
ンの間に機能的である修飾された核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」
は、天然に生じる核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシ
ル、キサンチン、およびヒポキサンチン、ならびに非天然に生じるバリアントの両方を指
す。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、修飾されたプ
リンまたはピリミジン、例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジンに変更す
ることにより修飾されており、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチ
ル－シトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－
ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ
－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－
ジアミノプリン、および２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基である。

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ
、またはＵにより示されることができ、ここで、各文字は、場合により、等価機能の修飾
された核酸塩基を含むことができる。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドでは、核酸
塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。こ
れらの修飾の組み合わせも使用され得る。例えば、５ｍＣのＬＮＡヌクレオシドが使用さ
れ得る。同様に、２’－ヒドロキシメチル（２’－ＯＭｅ）５ｍＣが使用され得る。

用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対合につい
ての能力を説明する。ワトソン－クリックの塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）
およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、
修飾された核酸塩基、例えば、シトシンの代わりに使用されることが多い５－メチルシト
シンを伴うヌクレオシドを含むことができ、したがって、相補性という用語は、非修飾の
核酸塩基と修飾された核酸塩基との間のワトソン－クリック塩基対合を包含することが理
解されよう。

本明細書で使用される用語「相補性％」は、別の核酸分子（例えば、標的核酸）の特定
の位置にある連続したヌクレオチド配列と特定の位置で相補的である（すなわち、ワトソ
ン－クリック塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続し
たヌクレオチド配列のヌクレオチドのパーセントでの数を指す。パーセンテージは、２つ
の配列間で対を形成するアラインされた塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチド中のヌク
レオチドの総数で割り、１００を掛けることにより、算出される。このような比較では、
（塩基対を形成する）アラインされていない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチを呼
ばれる。

本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」
は、反対側の鎖上にある塩基対との間で水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する
、２本の核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）として理解されるもので
ある。２本の核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それ
は多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖を形成している温度として
定義される融解温度（Ｔｍ）に関して記載される。生理的条件では、Ｔｍは厳密には親和
性に比例していない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態のＧｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ
°は、結合親和性のより正確な表示であり、反応の解離定数（Ｋｄ）に、ΔＧ°＝－ＲＴ
ｌｎ（Ｋｄ）の式によって関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であ
る。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オ
リゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ
°は、反応に関連付けられるエネルギーであり、ここで、水性濃度は１Ｍであり、ｐＨは
７であり、温度は３７℃である。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションは、自発的反応であり、自発的反応については、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ
°は、実験的に測定することができ、例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９６５、Ｃｈｅｍ．Ｃ
ｏｍｍ．３６－３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔ
ｏｄａｙに記載されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法により測定することがで
きる。当業者は、ΔＧ°測定について市販装置が利用可能であることを知っているだろう
。Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１
２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８
－５４０５により記載されている適切に誘導された熱力学的パラメータを使用する、Ｓａ
ｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：
１４６０－１４６５により記載されているような最近傍モデルを使用することにより、Δ
Ｇ°は数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによりその意図された核
酸標的を調整する可能性を有するために、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドは、
１０～３０個のヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の
推定されたΔＧ°値を伴って、標的核酸とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では
、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態のＧｉｂｂｓ自由エネルギーΔ
Ｇ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、－１０ｋｃａｌの範囲未満の、例えば、
－１５ｋｃａｌ未満の、例えば、－２０ｋｃａｌ未満の、例えば、８～３０個のヌクレオ
チド長であるオリゴヌクレオチドについては－２５ｋｃａｌ未満の、推定されたΔＧ°値
を伴って、標的核酸にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、オリ
ゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば、－１２～－４０、例えば、－１５
～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば、－１８～－２５ｋｃａｌの推
定されたΔＧ°値を伴って、標的核酸にはハイブリダイズする。

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子中に存在す
る標的配列と相補的であるか、またはそれにハイブリダイズする、少なくとも８ヌクレオ
チドの連続したヌクレオチド配列を含む。連続したヌクレオチド配列（およびしたがって
標的配列）は、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、または３０個の連続したヌクレオチド、例えば、１２～２５個
の、例えば、１４～１８個の連続したヌクレオチドから構成される。

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を阻害、変
異、または欠失する機能的核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはヌクレアーゼ
ｇＲＮＡである。

本明細書で使用される用語「発現の調整」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＵＢＥ３
Ａの量と比較されたときにＵＢＥ３Ａ ＲＮＡ／タンパク質の量を変更するオリゴヌクレ
オチドの能力についての包括的な用語として理解されるものである。代替的には、発現の
調整は、開示されたオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験を参照することにより決
定され得る。オリゴヌクレオチドにより影響を受ける調整は、すなわち、ＳＮＯＲＤ１１
５－４５ ｓｎｏＲＮＡの下流にあるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的することによ
り、父方ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の抑制を軽減する、除去する、予防する、弱める、低下
する、または終結するその能力に関連する。調整は、例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳにより影
響を受ける阻害性機序の除去または遮断により、父方ＵＢＥ３Ａの発現を復活させる、増
大する、または増強するオリゴヌクレオチドの能力として可視化することもできる。

開示されたオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ
中で見出されるリボース糖部分と比較したときに糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレ
オシドを含んでもよい。リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、主に、
親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善す
る目的で作製される。そのような修飾は、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）もしくは二環
での置換によりリボース環構造が修飾されたもの、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２および
Ｃ４炭素環のビラジカル結合を典型的に有するもの、またはＣ２炭素とＣ３炭素との間の
結合を典型的に欠失している連結されていないリボース環（例えば、ＵＮＡ）を含む。他
の糖修飾されたヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソースヌクレオシド（ＷＯ２０１
１／０１７５２１）または三環式ヌクレオシド（ＷＯ２０１３／１５４７９８）を含む。
修飾されたヌクレオシドはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸
の場合のように、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドを含む。

糖修飾はまた、リボース環上の置換基を、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドで天然に見
出される水素または２’－ＯＨ基以外の基へ変更することによりなされる修飾も含む。置
換は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入されてもよい。修飾された糖部分を
有するヌクレオシドはまた、２’置換されたヌクレオシドなどの２’修飾されたヌクレオ
シドも含む。実際、２’置換されたヌクレオシドの開発に対して多くの関心が集中されて
、数多くの２’置換されたヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に増
強されたヌクレオシド耐性および増強された親和性などの有益な特性を有することが見出
された。

２’糖修飾されたヌクレオシドは、２’位でＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌ
クレオシド（２’置換されたヌクレオシド）であり、または２’連結されたビラジカルを
含み、２’置換されたヌクレオシドおよびＬＮＡ（２’－４’ビラジカル結合した）ヌク
レオシドを含む。例えば、２’修飾された糖は、オリゴヌクレオチドに対して増強された
結合親和性および／または増大したヌクレアーゼ耐性を提供することができる。２’置換
された修飾されたヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル
－ＲＮＡ（Ｏ－Ｍｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ
（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－フルオロ－
ＡＮＡ（Ｆ－ＡＮＡ）である。さらなる例については、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎ
ｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９－４４４３およびＵｈｌ
ｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０
００、３（２）、２９３－２１３；ならびにＤｅｌｅａｖｅｙおよびＤａｍｈａ、Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１９、９３７を参照されたい。

ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’
との間にリンカー基（ビラジカルまたは結合と称される）を含む修飾されたヌクレオシド
である。これらのヌクレオシドは、文献中では、ブリッジ核酸または二環式核酸（ＢＮＡ
）とも呼ばれる。

ヌクレアーゼ介在分解は、そのような配列と二本鎖を形成するときに相補的ヌクレオチ
ド配列の分解を介在することができるオリゴヌクレオチドを指す。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ介在分解を
介して機能してもよく、ここで、開示されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特に
、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えば、
ＲＮアーゼＨをリクルートすることができる。ヌクレアーゼ介在機序を介して作用するオ
リゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５～６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を典型的
に含み、親和性増強ヌクレオシドが片側または両側に隣接しているオリゴヌクレオチド、
例えば、ギャップマー、ヘッドマー、およびテイルマーである。

本明細書で使用される用語「ギャップマー」は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシ
ド（フランク）が５’および３’で隣接している、ＲＮアーゼＨリクルートオリゴヌクレ
オチドの領域（ギャップ）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャ
ップマー設計が本明細書で記載される。ヘッドマーおよびテイルマーは、ＲＮアーゼＨを
リクルートすることができるオリゴヌクレオチドであり、ここでは、フランクの一方が欠
失しており、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオ
シドを含む。ヘッドマーについては、３’フランクが欠失しており（すなわち、５’フラ
ンクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）、テイルマーについては、５’フランクが欠
失している（すなわち、３’フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する開示されたオリゴヌクレオチドのコンジュゲー
ションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に
影響を与えることにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつ
かの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベ
イラビリティ、代謝、排泄、浸透、および／または細胞取込みを改善することにより、オ
リゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を修飾または増強する。特に、コンジュゲートは、
オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞型に標的化してもよく、それにより
、その器官、組織、または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの効果を増強することがで
きる。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織、または器官におけるオリゴヌク
レオチドの活性、例えば、非標的細胞型、組織、または器官におけるオフターゲット活性
または活性を軽減するように役割を果たすことができる。ＷＯ９３／０７８８３およびＷ
Ｏ２０１３／０３３２３０は、適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により
本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１２／１４３３７９は、トランスフェリン受容体に対
して親和性を有する抗体断片に対するコンジュゲーションにより、血液脳関門を超えて薬
物を送達する方法を提供し、これは参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、
細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペ
プチド、毒素（例えば、細菌の毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシ
ド）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、
非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば、血液脳関門を超えての送達を促進
する抗体または抗体断片、特に、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断
片。

用語「対象」は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、
例えば、哺乳類であり得る。故に、対象は、ヒトまたは動物患者であり得る。用語「患者
」は、臨床者、例えば、医師の治療を受けている対象を指す。

用語「治療的有効」は、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十
分な量の、使用される組成物の量を指す。そのような改善は、軽減または変更のみを必要
とし、排除は必ずしも必要としない。

用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内にあり、合理的な利益／危
険性の比に応じて、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症
を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織に接触させての使用に適切である、化合物、材料
、組成物、および／または剤形を指す。

用語「治療」は、疾患、病理学的状態、または障害を治す、緩和する、安定化させる、
または予防することを意図した、患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的な治療、
すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けて具体的に管理された治療を含
み、また、対症的な治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向
けて管理された治療も含む。加えて、この用語は、一時緩和治療、すなわち、疾患、病理
学的状態、または障害を治すのではなく症状を緩和するために設計された治療；予防的治
療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限にするか、また
は部分的もしくは完全に阻害するように管理された治療；および支持的治療、すなわち、
関連する疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けて管理された別の特異的な治療を
補足するために利用される治療を含む。

用語「阻害する」は、当業者が認識するように、特定の時点で評価されることができる
、活性、応答、状態、疾患、または他の生理学的パラメータにおける減少を指し、そのよ
うなものとして、いくつかの実施形態では、阻害は、開始の遅延、または頻度の減少であ
り得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、阻害は、活性、応答、状
態、または疾患の完全な除去を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた
、例えば、天然または対照レベルと比較したときに、活性、応答、状態、または疾患にお
ける１０％の減少を含み得る。故に、減少は、天然または対照レベルと比較したときに、
１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または任意の量の
減少であり得る。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物（
ＡＦ４００５００）の５’－末端にあるエクソンを標的するために設計され、これは、Ｓ
ＮＯＲＤ１１５－４６、ＳＮＯＲＤ１１５－４７、ＳＮＯＲＤ１１５－４８、およびＳＮ
ＯＲＤ１０９Ｂ ｓｎｏＲＮＡを包含し、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－
ＡＳ）の５’－末端を表すと考えられる。特に、標的核酸は、ヒト染色体１５ヒトゲノム
アセンブリｈｇ１９上の２５，５１１，５７７～２５，５１６，６８１位に対応する、Ｕ
ＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＵＢＥ
３Ａ－ＡＳの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つであり、これは、２５
，５１１，５７７～２５，５１１，７６１（エクソン１）、２５，５１２，０５９～２５
，５１２，１９１（エクソン２）、２５，５１３，４７６～２５，５１３，６００（エク
ソン３）、２５，５１４，７５２～２５，５１４，８８０（エクソン４）、および２５，
５１６，５６５～２５，５１６，６８１（エクソン５）位に対応し得る。

したがって、 いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡ
ＡＧＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＧＡ
ＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣ
ＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧ
ＴＧＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴ
ＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧ（エクソン１、配列番号１）である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡ
ＴＧＴＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＧＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣ
ＧＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣ
ＴＣＣＣＡＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ（エクソン２、
配列番号２）である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡ
ＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡ
ＡＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧ（エクソン３、配列番号３）であ
る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡ
ＡＣＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＴＣ
ＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡ
ＣＣＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧ（エクソン４、配列番号４
）である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡ
ＧＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＡＣＣ
ＣＡＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴ
ＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧ（エクソン５、配列番号５）である。

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣ
ＣＡＧＧＣＡＣ（ＡＳＯ－１、配列番号６）を有する。

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、核酸配列ＧＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴ
ＣＣ （ＡＳＯ－２、配列番号７）を有する。

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣ
ＣＴＧＡＡＣＡ（ＡＳＯ－３、配列番号８）を有する。

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＧＧ（ＡＳＯ－４、配列番号９）を有する。

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣ
ＡＣＡＧＴＣＴ（ＡＳＯ－６、配列番号１０）を有する。

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＣＡＡ
ＧＣＣＡＡＡＧ（ＡＳＯ－７、配列番号１１）を有する。

ＳＮＯＲＤ１１５領域の３’－末端の標的エクソン１であり得るさらなるＡＳＯは、以
下の表１で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン２であり得る例示
的なＡＳＯは、以下の表２で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン
３であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表３で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末
端の標的エクソン４であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表４で提供される。ＳＮＯＲＤ
１１５の３’－末端の標的エクソン５であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表５で提供さ
れる。

開示されたオリゴヌクレオチドは、父方ＵＢＥ３Ａの発現、特に、ニューロン細胞にお
ける父方発現されたＵＢＥ３Ａの誘導または上方制御の調整をすることができる。調整は
、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端にハイブリダイズすることにより成し遂げられる。ある
実施形態では、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドは、－１０ｋｃａｌ未満のΔＧ
°、例えば、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば、－１２～－４０、例えば、－１５～－３
０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば、－１８～－２５ｋｃａｌのΔＧ°を
伴って、配列番号１の標的核酸の下位配列にハイブリダイズする。

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、食塩水または非標的オリ
ゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＵＢＥ３Ａの発現レベルと比較して
少なくとも２０％だけ、より好ましくは、食塩水または非標的オリゴヌクレオチドで治療
されたニューロン細胞におけるＵＢＥ３Ａの発現レベルと比較して少なくとも３０％、３
５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０
％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０
％、２４０％または２５０％だけ、ＵＢＥ３Ａの発現を増大することができる。いくつか
の実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、食塩水または非標的オリゴヌクレオ
チドで治療されたニューロン細胞におけるＳＮＯＲＤ１１１５－４５の下流のＳＮＨＧ１
４転写物のレベルと比較して少なくとも２０％だけ、より好ましくは、食塩水または非標
的オリゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＳＮＯＲＤ１１１５－４５の
下流のＳＮＨＧ１４転写物のレベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０
％、７０％、８０％、９０％、または９５％だけ、ＳＮＯＲＤ１１５－４５の下流のＳＮ
ＨＧ１４転写物のレベルを軽減することができる。

開示されたオリゴヌクレオチドによる標的調整は、オリゴヌクレオチドの連続したヌク
レオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって駆動される。いくつか
の実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との
間のミスマッチを含む。ミスマッチにも関わらず、標的核酸に対するハイブリダイゼーシ
ョンはなお、ＵＢＥ３Ａ発現の所望の調整を示すのに十分であり得る。ミスマッチから生
じた軽減された結合親和性は、好都合にも、オリゴヌクレオチド配列内に存在するＬＮＡ
を含む２’修飾されたヌクレオシドなどを標的するための結合親和性を増大することがで
きる、オリゴヌクレオチド中の増大した数のヌクレオチドおよび／または増大した数の修
飾されたヌクレオシドによって埋め合わされる。

開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されるＵＢＥ３Ａ－Ａ
Ｓの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つに対して少なくとも９０％の相
補性、例えば、少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９３
％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％
、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、または１００％の相補性を有
する、１０～３０個のヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を有することができる
。

オリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチド配列中のヌクレオシド糖修飾のパター
ンを指す。開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドを
含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシドを含んでもよい。い
くつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドおよびＤＮＡ
ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌ
クレオシドおよびＲＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオ
チドは、糖修飾されたヌクレオシドおよびＡＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾されたヌクレ
オシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、
少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個
、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なく
とも１５個、または少なくとも１６個の修飾されたヌクレオシドを含む。一実施形態では
、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾されたヌクレオシド、例えば、２～９個の修
飾されたヌクレオシド、例えば、３～８個の修飾されたヌクレオシド、例えば、４～７個
の修飾されたヌクレオシド、例えば、６または７個の修飾されたヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレ
オシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチド配列内のヌクレオ
シド間結合は、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートヌクレオシド間結合である
。

いくつかの実施形態では、開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の
糖修飾されたヌクレオシド、例えば、２’糖修飾されたヌクレオシドを含む。好ましくは
、開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドまたは
２’糖修飾されたヌクレオシドを含み、ここで、２’位は、－Ｆ；－ＣＦ３、－ＣＮ、－
Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ１０アル
キル）、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２；
－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ
２－Ｃ１０アルケニル）、または－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ
１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキ
ニル）、－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）２、－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ
－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ
１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２
、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、および－Ｎ（
Ｃ１－Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）
からなる群から独立して選択された置換基によって置換されている。

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＬＮＡ
ユニット、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡユニット、例えば
、２～６個のＬＮＡユニット、例えば、３～７個のＬＮＡユニット、４～８個のＬＮＡユ
ニット、または３、４、５、６もしくは７個のＬＮＡユニットを含む。いくつかの実施形
態では、すべての修飾されたヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実
施形態では、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含み、式中、－Ｌ－は、－
Ｏ－ＣＨ２－であり、－ＣＨ２－は場合により置換されている。いくつかの実施形態では
、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含み、式中、－Ｌ－は、－Ｏ－ＣＨ２
－である。いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含
み、式中、－Ｌ－は、－Ｏ－ＣＨ（Ｅｔ）－である。さらなる一実施形態では、オリゴヌ
クレオチドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡと、以下のＬＮＡユニット：ベータ－Ｄもし
くはアルファ－Ｌ配置のいずれかであるチオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ
、および／またはＥＮＡ、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上との両方を含み得
る。さらなる一実施形態では、すべてのＬＮＡシトシンユニットは、５－メチル－シトシ
ンである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続したヌクレオチド配
列は、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡユニット、および３’末端
に少なくとも２つのＬＮＡユニットを有する。

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨをリクルー
トすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書では単
に「ギャップマー」とも称される、ギャップマー設計または構造を有する。ギャップマー
構造では、オリゴヌクレオチドは、’５－＞３’の方向に少なくとも３つの別個の構造的
領域、５’－フランク、ギャップ、および３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を含む。この設
計では、フランキング領域ＦおよびＦ’（ウイング領域とも呼ばれる）は、ＵＢＥ３Ａ－
ＡＳ標的核酸に相補的である修飾されたヌクレオシドの連続したストレッチを含み、一方
で、ギャップ領域、Ｇは、オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成するときにヌク
レアーゼ、好ましくは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮアーゼ、例えば、ＲＮアーゼ
Ｈをリクルートすることができるヌクレオチドの連続したストレッチを含む。ヌクレアー
ゼ、特に、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができるヌクレオシドは、ＤＮＡ、アルフ
ァ－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＵＮＡからなる群から選択され
得る。領域Ｇの５’および３’末端に隣接する領域ＦおよびＦ’は、好ましくは、非ヌク
レアーゼリクルートヌクレオシド（３’エンド構造を伴うヌクレオシド）、より好ましく
は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、３’フラ
ンクは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、好ましくは、少なくとも２つのＬＮＡヌ
クレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’フランクは、少なくとも１つのＬＮＡ
ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’および３’フランキング領域の両方
は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、フランキング領域中のすべて
のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態では、フランキング領域は
、ＬＮＡヌクレオシドおよび他のヌクレオシド（混合フランク）の両方、例えば、ＤＮＡ
ヌクレオシドおよび／または非－ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、２’置換されたヌク
レオシドを含み得る。この場合では、ギャップは、親和性増強修飾ヌクレオシド、好まし
くは、ＬＮＡ、例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡが５’および３’末端で隣接してい
る少なくとも５個のＲＮアーゼＨリクルートヌクレオシド（２’エンド構造を伴うヌクレ
オシド、好ましくは、ＤＮＡ）の連続した配列として定義される。結果として、ギャップ
領域に隣接した５’フランキング領域および３’フランキング領域のヌクレオシドは、修
飾されたヌクレオシド、好ましくは、非ヌクレアーゼリクルートヌクレオシドである。フ
ランクがＤＮＡを含む混合フランクを伴うオリゴヌクレオチドでは、５’および３’ヌク
レオシドは、修飾されたヌクレオシドである。

開示されたオリゴヌクレオチドを製造するための方法は知られている。いくつかの場合
では、方法はホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９
８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４、ｐａｇｅｓ ２
８７－３１３を参照されたい）。さらなる一実施形態では、方法は、連続したヌクレオチ
ド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、キラル原子を含む１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合
での立体化学の制御を提供するオリゴヌクレオチド方法論が利用される。例えば、これら
の方法論について参照により組み込まれる、ＷＯ２０１０／０６４１４６、ＷＯ２０１４
／０１２０８１、ＷＯ２０１５／１０７４２５、ＷＯ２０１６／０７９１８３、ＷＯ２０
１６／０７９１８１、ＷＯ２０１６／０９６９３８、ＷＯ２０１７／１９４４９８、およ
びＷＯ２０１８／１７７８２５を参照されたい。

当業者は、本開示により提供される有用な核酸が本明細書で記載されるオリゴヌクレオ
チドの配列を保存および／または発現するものを含むことを認識するだろう。いくつかの
実施形態では、そのような核酸は、細胞（例えば、微生物細胞、例えば、生産のための、
および／または哺乳類細胞、例えば、治療のための）への送達、および／または細胞にお
ける複製および／または発現のために適切なベクターであってもよく、またはそれを含ん
でもよい。当業者は、様々な技術を認識している（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による
などの増幅、制限消化によるなどの切断、例えば、ギャップ修復によるなどのインビトロ
またはインビボのいずれかでのライゲーションによるなどの結合、のうちの１つ以上を利
用するなどの組換え核酸技術）。

前述したオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートのいず
れか、および薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／または賦形剤を含む薬学的組
成物も開示される。薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を含み
、薬学的に許容される塩は、ナトリウムおよびカリウム塩を含むがこれらに限定されない
。いくつかの実施形態では、希釈剤は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。

開示されたオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物または製剤の調整のための薬学的に許
容される活性または不活性物質と混合されてもよい。薬学的組成物の製剤化のための組成
物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むがこれらに限定さ
れない多数の基準に依存する。

当業者は、オリゴヌクレオチド療法などの核酸療法の貯蔵および／または投与のために
有用な様々な製剤化ストラテジーを認識している。例えば、Ｐｕｓｈｐｅｎｄｒａら、「
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｆｒｏｍ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｓ、ｅｄ． ＥｒｄｍａｎｎおよびＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅ
ｒｌａｇ、２０１２；Ｊｕｌｉａｎｏ 「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」 Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．４４：６５
１８、２０１６などを参照されたい。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして製剤化される。
特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関しては、プロドラッグが作用部位、例えば
、標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドから切断され得
る。

疾患を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本明細書
で開示されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的組
成物を、疾患を患っているか、またはその疑いのある対象へ投与することを含む方法も開
示される。

本明細書で参照されるような障害の治療用医薬の製造のための、または本明細書で参照
されるような障害の治療方法のための開示されたオリゴヌクレオチドの使用も開示される
。

開示された薬学的組成物は、局所的（例えば、皮膚、吸入、眼、または耳へ）、または
経腸（例えば、経口的に、もしくは胃腸管を介して）、または非経口的（例えば、静脈内
、皮下、筋内、脳内、脳室内、もしくは髄腔内）投与により投与されてもよい。いくつか
の実施形態では、開示された薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋
内注射もしくは注入、髄腔内もしくは頭蓋内、例えば、脳内もしくは脳室内への投与を含
む非経口経路により投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、脳内
または脳室内注射により投与される。別の実施形態では、活性のあるオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、髄腔内に投与される。いくつかの実施形態
では、薬学的組成物は、小脳延髄槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｅ ｍａｇｎａ）注
射により投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載される薬学的組成物を用いるＡＳ療法は、Ａ
Ｓを患っているか、またはその疑いのある対象（複数可）に投与される。いくつかの実施
形態では、対象は、母方ＵＢＥ３Ａ遺伝子における欠損に関連した遺伝的特徴を有すると
決定されている。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、母方欠失であるか
、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、片親性ダイソ
ミーであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、
ＵＢＥ３Ａ変異であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝
的特徴は、刷り込み欠損であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに関連付けられている１つ以上の発達履歴およ
び／またはラボ的知見特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を有すると決定されて
いる：
（ｉ）正常な頭囲を有し、かつ大きな先天性異常がない、正常な出生前および出生時履
歴；
（ｉｉ）新生児および／または乳児の時期の授乳時に困難がある；
（ｉｉｉ）６～１２月齢までに発達遅延のエビデンスがみられ、時に、躯幹の低緊張状
態に関連付けられる；
（ｉｖ）不安定な四肢の動き、および／または笑いの増大；
（ｖ）発達は遅延されるが、進展する（技能の喪失はない）；
（ｖｉ）正常な代謝、血液、および化学的ラボ的プロファイル；
（ｖｉｉ）ＭＲＩまたはＣＴを使用して評価された場合に構造的に正常な脳（軽度の皮
質萎縮または髄鞘形成異常を有することがある）。

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに一貫して関連付けら
れる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を示すことが決定され
ている：
（ｉ）発達の遅延、機能的に重大である；
（ｉｉ）運動またはバランス障害、通常は、歩行失調および／または四肢の振戦運動。
いくつかの実施形態では、そのような運動障害は軽度であり得る。いくつかの実施形態で
は、そのような運動障害は、明らかな運動失調として現れないが、例えば、前傾、不安定
さ、不器用さ、または素早くぎくしゃくした動きであるか、またはそれらを含み得る；
（ｉｉｉ）独特な挙動：笑い／笑顔の頻度が増えること；明らかに幸せな様子；簡単に
興奮する性格、多くの場合、高揚して手を羽ばたかせたり手を振ったりする運動を伴う；
多動的挙動の任意の組み合わせ
（ｉｖ）言語障害、例えば、言葉の使用を欠いているか、または最小限である；代替的ま
たは追加的に、感受性および非言語的コミュニケーションスキルは言語スキルに比べて高
い。

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに頻繁に（例えば、時
間の約８０％）関連付けられる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうちの１つ
以上を示すことが決定されている：
（ｉ）頭囲の成長が、遅延され、不釣り合いなものであり、通常は、結果として、２歳
までに小脳症を生じる（正常なＯＦＣの≦２Ｓ．Ｄ．）。いくつかの実施形態では、小脳
症は、１５ｑ１１．２－ｑ１３欠失を伴う人においてより顕著である；
（ｉｉ）てんかん発作、通常は、３歳までに発症する。いくつかの実施形態では、てん
かん発作の重症度は、年齢に従って減少し得るが、それにも関わらず、いくつかの実施形
態では、てんかん発作障害は、大人になっても継続する。
（ｉｖ）当該技術分野において知られているような特徴的なパターンを伴う異常なＥＥ
Ｇ。いくつかの実施形態では、ＥＥＧの異常さは、人生の初めの２年で生じ、臨床的特徴
に先行することがあり、臨床的なてんかん発作事象に相関しないこともある。

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに時折（例えば、時間
の約２０％～８０％）関連付けられる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうち
の１つ以上を示すことが決定されている：
（ｉ）平らな後頭部
（ｉｉ）後頭動脈溝
（ｉｉｉ）舌を突き出している
（ｉｖ）舌を押し出す；吸い込み／飲み込み障害
（ｖ）乳児期の授乳における問題および／または躯幹の低緊張状態
（ｖｉ）上顎前突
（ｖｉｉ）広く開いた口、広く隙間の空いた歯
（ｖｉｉｉ）頻繁によだれを垂らす
（ｉｘ）過剰な噛む／口の動きの挙動
（ｘ）斜視
（ｘｉ）色素不足の皮膚、薄い色の髪の毛および眼の色、いくつかの実施形態では、家
族と比較して決定され、典型的には欠失の場合においてのみ見られる。
（ｘｉｉ）過剰な四肢下部の深部腱反射
（ｘｉｉｉ）特に歩行運動中の、高揚した湾曲した腕の位置
（ｘｉｖ）回内または外反した足首を伴うすそ広がりな足どり
（ｘｖ）熱に対する感受性の増大
（ｘｖｉ）異常な睡眠覚醒サイクル、および睡眠の必要性の減少
（ｘｖｉｉ）水に対する興味／水に魅惑されること；特定の紙およびプラスチックなど
のカサカサ音のなる物品に対して魅惑されること
（ｘｖｉｉｉ）食べ物に関連した異常な挙動
（ｘｉｘ）肥満（年齢の高い小児において）
（ｘｘ）脊柱側湾症
（ｘｘｉ）便秘

いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるような核酸療法（例えば、ＡＳＯなど
のオリゴヌクレオチド療法）を用いるＡＳの治療のための療法レジメンは、本明細書で記
載されるようなオリゴヌクレオチドを含むおよび／または送達する薬学的組成物の１つ以
上の用量の投与であるか、それを含む。

いくつかの実施形態では、提供される療法レジメンが実施される対象は、例えば、１つ
以上の他の核酸療法（例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とする１つ以上の他のオリゴヌク
レオチド）を含む１つ以上の他のＡＳ療法を受けているか、または以前に受けた。例えば
、ＷＯ２０１４００４５７２Ａ３、ＵＳ９６１７５３９Ｂ２、ＵＳ２０１７０３６２５９
２Ａ１、およびＥＰ２８６４４７９Ｂ１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、提供される療法レジメンが実施される対象は、１回以上のて
んかん発作を以前に患ったか、または患っており、および／または抗てんかん発作療法を
受けているか、または以前に受けた。例えば。いくつかの実施形態では、対象は、１つ以
上のバルプル酸、クロナゼパム、フェノバルビタール、トピラマート、カルバマゼピン、
ラモトリジン、レベチラセタム、フェニトイン、ゾニサミド、エトサクシミド、ガバペン
チン、フェルバマート（ｆｅｌｂａｔａｍｅ）、オキシカルバゼピン、トランキセン（ｔ
ｒａｎｘｅｎｅ）、ＡＣＴＳ、ニトラゼパム、プレガバリン、ミソリン、ビガバトリンな
どを以前に受けたか、または受けていてもよい。いくつかの特定の実施形態では、対象は
、１つ以上のバルプル酸、クロナゼパム、フェノバルビタール、トピラマート、カルバマ
ゼピン、ラモトリジン、および／またはレベチラセタムを以前に受けたか、または受けて
いてもよい。

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、例えば、ケトン食療法、低
血糖指数療法等などの食事療法を以前に受けたか、または受けていてもよい。

さらになお代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、迷走神経刺激因
子を用いる治療を以前に受けたか、または受けていてもよい。

本開示を読む当業者には明らかであるように、提供される治療方法は、本明細書に記載
されるようなオリゴヌクレオチドおよびさらなる療法（例えば、代替的なオリゴヌクレオ
チドおよび／または抗てんかん療法および／または１つ以上の他の療法介入）の一方また
は両方を実施することを含み、その結果、対象は、組み合わせ療法（例えば、それらに同
時に曝露される、例えば、重複した投与を介するなど）を受けることになる。髄腔内投与
用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドの使用
も開示される。

脳内または脳室内投与用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオ
リゴヌクレオチドの使用も開示される。

脳室内投与用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオリゴヌクレ
オチドの使用も開示される。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、別の治療薬と
の組み合わせ治療において使用される。治療薬は、例えば、抗けいれん薬であり得る。

本発明の多数の実施形態が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範
囲から逸脱することなく、様々な修飾がなされてもよいことが理解されよう。したがって
、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

実施例１：
結果
マウスおよびヒトＣＮＳのＲＮＡ－配列決定分析は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの安定性および
／または転写のために重要であると考えられている領域を同定した。領域のさらなる分析
は、マウスとヒトとの間の低レベルの配列保存を示した（図１Ａ～１Ｄ）。

これらの知見に基づいて、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ転写物における特定領域を標的とするため
に、マウス特異的ＡＳＯが設計された（表６および図２Ａ）。この領域を標的とするＡＳ
Ｏが父方Ｕｂｅ３ａアレルの発現を再活性化するかどうかを試験するために、初代海馬ニ
ューロンの培養液をＵｂｅ３ａＹＦＰレポーターマウスモデルから産生し（Ｕｂｅ３ａ＋
／ＹＦＰ；図２Ｂ）、インビトロでの７日目（ＤＩＶ）にて、対照ＡＳＯ［ＡＳＯ－Ｃ（
１０ｕＭ、ｎ＝３）］、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳを標的とする３つのＡＳＯ［ＡＳＯ－１．１、
ＡＳＯ－１．２、ＡＳＯ－３．１（１μＭ、５μＭ、および１５μＭ、ｎ＝３）］、なら
びにＡＳＯ－Ｂ（１μＭ、５μＭ、および１５μＭ、ｎ＝３）］で治療した。正対照とし
て、ニューロンは、トポテカン［トポ（３００ｎＭ、ｎ＝３）］で治療され、負はビヒク
ル対照［Ｖｅｈ（１％、ｎ＝３）；図２Ｃ］であった。治療の３日後（１０ＤＩＶ）、免
疫蛍光イメージングを使用して、個々の細胞中の父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質レベル
が定量された。対照（ＡＳＯ－ＣおよびＶｅｈ）と比較して、各治療は実質的に父方Ｕｂ
ｅ３ａＹＦＰタンパク質レベルを増大し、ＡＳＯ－１．１（１５μＭ）、ＡＳＯ－３．１
（１５μＭ）、およびトポテカン治療（図２Ｄおよび２Ｅ）では同様のレベルが成し遂げ
られた

次いで、この領域を標的とするために、ヒト特異的ＡＳＯが設計され、これは、ヒトの
非多形的領域ならびにマカク（アカゲザルおよびカニクイザル）で保存されている領域（
１００％）を標的とする４つのＡＳＯを含んだ（表７および図３Ａ）。ヒト誘導多能性幹
細胞（ｉＰＳＣ）神経前駆細胞は、１４ＤＩＶの間にＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化し
、次いで、対照ＡＳＯ［ＡＳＯ－Ｃ（１０μＭ、ｎ＝３）］、トポテカン［トポ（１μＭ
、ｎ＝２）］、ならびにＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とする６つのＡＳＯ［ＡＳＯ－１、ＡＳ
Ｏ－２、ＡＳＯ－３、ＡＳＯ－４、ＡＳＯ－５、およびＡＳＯ－６（１０μＭ、ｎ＝３）
］で治療された。さらに、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のイントロン領域を標的とするＡＳ
Ｏが含まれた（ＡＳＯ－７）。治療の６日後（２０ＤＩＶ）、ＲＮＡをニューロンから単
離し、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの定常状態ＲＮＡレベルを対照治療に対して推
定した（図３Ｂ）。ＡＳＯ－７を除き、各ＡＳＯは有意にＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベ
ルを減少し、ＡＳＯ－２およびＡＳＯ－４は最大の効果を有した（表８および図３Ｃ）。
各ＡＳＯでの治療後に、ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルも増大した（図３Ｄ）。

ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対する効果を考慮して、ＡＳＯ－４の効力もさらに
調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶにて、１０ポイン
トの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４、および正対照として、および治療間の比較のた
めにトポテカンで治療された［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３０
０ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ＡＳＯ－４、ｎ＝６；トポテカン
、ｎ＝２）］。２０ＤＩＶにて、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、
用量応答曲線を近似して、ＩＣ５０およびＥ最大（すなわち、最大ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ阻害
）を推定した（表９および図４Ａ）。用量応答曲線のＡＳＯ－４およびトポテカンは有意
に異なり（並列試験：Ｆ（３，１４５）＝１１．２、ｐ＜０．０００１）、故に、相対的
効力は推定されなかった。等価試験は、ＡＳＯ－４およびトポテカンのＩＣ５０およびＥ
最大が等価でなかったことを示した［ＡＳＯ－４／トポテカンＩＣ５０比：＝１．２（信
頼下限＝１．１；信頼上限＝１．３）；Ｅ最大比＝－４．１（信頼下限＝－１２．９；信
頼上限＝４．８）］。

次いで、ＡＳＯ－４標的領域の上流に位置するＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ
１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ ＲＮＡについて、ＡＳＯ－４およびトポテカンの効
果を調べた（図１Ａを参照されたい）。ＳＮＯＲＤ１１６を除き、ＡＳＯ－４は、ＩＰＷ
、ＳＮＯＲＤ１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ／ＢのＲＮＡレベルに対して有意な効果
を有したが、用量依存性の様式ではなかった。対照的に、トポテカンは、ＳＮＯＲＤ１１
６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ ＲＮＡレベルに対して
有意な効果を示し、これは用量依存性であった（表１０および図４Ｂ－４Ｅ）。より高い
濃度のトポテカン（３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；図４Ｆ）を除き、ＡＳＯ－４お
よびトポテカンの両方は、用量依存性の様式で総ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを増大した。

ｉＰＳＣ－由来ニューロンの分化のより遅い時点において、ＡＳＯ－４の効力がさらに
調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、５９ＤＩＶにおいて対照ＡＳ
Ｏ［ＡＳＯ－Ｃ、１０μＭ（ｎ＝３）］およびＡＳＯ－４［１ｕＭ、５μＭ、および１０
μＭ（ｎ＝３）］で治療され、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの定常状態ＲＮＡレベ
ルは上記したように測定された（図４Ｇ）。より速い時点におけるＡＳＯ－４で治療した
ニューロンとは異なり、ＵＢＥ３ＡおよびＵＢＥ３Ａ－ＡＳのＲＮＡレベルは、高度に逆
比例していた（図４Ｈおよび４Ｉ）。例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対する
ＡＳＯ－４（１０μＭ）の効果は、１４および５９ＤＩＶで治療したニューロン間で同様
であった［２０ＤＩＶ：ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ：↓８７％（９５％信頼区間（ＣＩ）：８０～
９５％）；６５ＤＩＶ：↓８１％（９５％ ＣＩ：７４～８８％）］が、ＵＢＥ３Ａ Ｒ
ＮＡレベルに対するＡＳＯ－４の効果は実質的に５９ＤＩＶで治療したニューロンで増大
していた［２０ＤＩＶ：↑３０％（９５％ＣＩ：１６～４４％）；６５ＤＩＶ：↑８６％
（９５％ＣＩ：５９％～１１３％）］。

次いで、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、およびＡＳ
Ｏ－４．４）の標的配列ならびに他の２つの標的領域、ＡＳＯ－３（ＡＳＯ－３．１およ
びＡＳＯ－３．２）およびＡＳＯ－６（ＡＳＯ－６．１）（表１１）を最適化するために
、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的とするさらなるＡＳＯが設計された。さらに、比
較目的のために、２つの異なる販売元においてＡＳＯ－４が製造された（ＡＳＯ－４．Ｓ
、Ｓｉｇｍａ；ＡＳＯ－４．Ｉ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）。ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロン（ＧＡＢＡ作動性）は、１４ＤＩＶにて、５ポイ
ントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－３．１、ＡＳＯ－３．２、ＡＳＯ－４．Ｓ、ＡＳ
Ｏ－４．Ｉ、ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、ＡＳＯ－４．４、およ
びＡＳＯ－６．１［３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ（ｎ＝６）］で治療され
た。２０ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０およびＥ最大が上記されたように推定された（
図５Ａ－Ｂおよび表１２）。用量応答曲線はＡＳＯ間で同様であり（並列試験：Ｆ（１６
，５１３）＝１．６、ｐ＝０．０６）、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は最高の相対的
効力を有した（表１３）。有意な差はＡＳＯ－４．ＳとＡＳＯ－４．Ｉとの間で観察され
なかった。

ｉＰＳＣ－由来ニューロンの分化のより遅い時点において、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－
６．１の効力がさらに調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、２９Ｄ
ＩＶにて、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６で治療さ
れた［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ
、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］。３５ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０および
Ｅ最大が上記されたように推定された（図５Ｃ～Ｄおよび表１４）。用量応答曲線のＡＳ
Ｏ－４およびＡＳＯ－６．１は同様ではなかった（並列試験：Ｆ（３，１７２）＝２２．
７、ｐ＜０．０００１）。等価試験は、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１が等価な効力を
有したが、異なるＥ最大値を有したことを示し［ＡＳＯ－６．１／ＡＳＯ－４比：ＩＣ５
０＝１．０３（信頼下限＝１．０；信頼上限＝１．１）；Ｅ最大＝－１．３（信頼下限＝
－２．６；信頼上限＝－０．０８）］、ＡＳＯ－６．１はＵＢＥ３Ａ－ＡＳレベルの最大
の阻害を有した。ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルに対するＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の
効果は同様であり、各治療は用量依存性の様式でＲＮＡレベルを増大した（図５Ｄ）。

ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンに
おいても調べられた。グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶにて
、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１で治療された
［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１
０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］。２０ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０およびＥ最
大が上記されたように推定された（図５Ｅ－Ｆおよび表１５）。用量応答曲線のＡＳＯ－
４およびＡＳＯ－６．１は同様であり、有意に異ならず（並列試験：Ｆ（３，１６５）＝
１．９、ｐ＝０．１）、ＡＳＯ－６．１は最高の相対的効力を有した（表１６）。期待さ
れたように、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、用量依存性の様式でＵＢＥ３Ａ ＲＮ
Ａレベルを増大したが（図５Ｆ）、各濃度について治療に帰することができなかった高い
程度の変動が存在した（Ｒ２＝０．１７）。

結論
ＡＳのための療法の開発に向けて、マウスおよびヒトニューロンにおいて、特定領域を
標的とするＡＳＯがＵｂｅ３ａ－ＡＳ／ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを阻害し、父方Ｕｂｅ３ａ／Ｕ
ＢＥ３Ａアレルの発現を再活性化するかを決定するために、実験が実施された。まとめる
と、知見は、マウスおよびヒトニューロンにおけるこの領域を標的とするＡＳＯは強力な
アンチセンス活性を有し、Ｕｂｅ３ａ／ＵＢＥ３Ａの刷り込みを反転させることを示す。

Ｕｂｅ３ａ－ＡＳを標的する３つのＡＳＯのうちの２つ（ＡＳＯ－１．１およびＡＳＯ
－３．１）は、マウスニューロンにおいて父方Ｕｂｅ３ａアレルの発現を、最適濃度のト
ポテカン（３００ｎＭ）により成し遂げられたものと同様のレベルまで再活性化した。

同様に、ヒト特異的ＡＳＯの各々は、ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３
Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルを有意に減少し、より高い濃度のＡＳＯ－４およびＡＳ
Ｏ－６．１はほぼ完全にＵＢＥ３Ａ－ＡＳの発現を廃止した。ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－
６．１標的領域がヒトとマカクとの間で１００％保存されていることを考慮すると、これ
らのＡＳＯの効力は、カニクイザルまたはアカゲザルマカクのいずれかにおいてインビボ
で調べることができる。トポテカンとは異なり、ＡＳＯ－４は、上流ＳＮＯＲＤ１１６、
ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、またはＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ ＲＮＡに対して、あるとし
ても小さな効果を有し、これは、ＡＳＯが標的領域またはその下流での転写を終結すると
いう考えと一致する。

低濃度（３ｎＭ）のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレ
ベルを有意に減少するが、より高い濃度（≧１００ｎＭ）のＡＳＯはＵＢＥ３Ａ ＲＮＡ
レベルを増大するために必須ではない。これは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳがＵＢＥ３Ａの転写を
阻害するために必要とされる特定の閾値、またはＵＢＥ３Ａ－ＡＳの不活性化が父方ＵＢ
Ｅ３Ａの再活性化を導く時間のずれ、またはＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを定量するために
使用されるアッセイの感受性を反映してもよい。

まとめると、知見は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳにおける候補領域を標的とするＡＳＯが、ニュ
ーロンにおけるＵＢＥ３Ａの刷り込みをほとんど完全に廃止し、将来の臨床開発のために
少なくとも２つのＡＳＯを明らかにしていることを示唆している。

異なるＲＮＡ修飾［２’－ヒドロキシメチル（２’－ＯＭｅ）、２’－メトキシ－エチ
ル ２’－ＭＯＥ、およびロック核酸（ＬＮＡ）］、および骨格［ホスホロチオエート（
ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）］から構成されるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．
１の誘導体も設計された（表１７）。

材料および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチド設計
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｓｏｌｉｇｏ（核酸の統計的折り畳み
および調節性ＲＮＡの研究のためのソフトウェア）を使用して設計された。簡単に言うと
、最も低い結合部位分断エネルギーおよび自由結合エネルギーを伴う候補ＡＳＯ（２０～
１８ｍｅｒ）が、各標的配列について同定され、次いで、増大した効果を有するモチーフ
について検査した。Ｓｏｌｉｇｏにより作製された標的配列の予測された最も低い自由エ
ネルギー質量中心二次構造内のアクセシビリティに基づいて、ＡＳＯはさらにフィルター
にかけられた。いくつかの場合では、ＲＮＡｆｏｌｄおよびＭｆｏｌｄにより作製された
最も低い自由エネルギー構造を使用して、二次構造モデルが比較された。

ヒトＡＳＯは、以下の基準を使用してフィルターにかけられた：１）標的配列は、多形
性であった［ｄｂＳＮＰ１３８、ｄｂＳＮＰ１５０、および１０００ゲノムフェーズ３統
合バリアント細胞（ＳＮＶ、ＩＮＤＥＬ、およびＳＶ）］；２）標的配列は、アカゲザル
およびカニクイザルマカクで１００％保存されていなかった；３）標的配列は、保持され
たＳｎｏｒｄ１１５／ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ（エクソンあたり）の上流に位置
した。次いで、残存するＡＳＯを、自由エネルギー（＜＝－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、標的
部位ヌクレオチドについての平均非対合確率、結合部位分断エネルギー（低＞高）、二次
構造内の位置（Ｅｎｓｅｍｂｌ質量中心）、および高い／低い効果に関連する配列モチー
フの存在／不在によりランク付けした。

マウス初代海馬ニューロン
海馬ニューロンの初代培養液は、Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰの雄と野生型Ｃ５７ＢＬ／
６Ｊ雌を交配することによるＰ０－Ｐ１子マウス（Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ＋およびＵｂｅ３
ａｍ＋／ｐＹＦＰ）から産生された。遺伝子型は、以前に記載された方法を使用して決定
された。簡単に言うと、海馬ニューロンは、ポリ－Ｄ－リジン（１５２０２８、Ｔｈｅｒ
ｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびラミニン（２３０１７－０１、Ｔｈ
ｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングした９６ウェルオプテ
ィカルボトムプレートにて、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびペニシリン／ストレ
プトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した神経基礎Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で培養した。培養液は使用時まで５％のＣＯ２中、３
７℃で維持された。

マウスニューロンイメージング
マウス初代海馬ニューロンは、１０ＤＩＶ（治療の３日後）に、４％のパラホルムアル
デヒドを用いて固定された。次いで、培養液は、１ＸＰＢＳで２回洗浄され、ＰＢＳ中の
４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定され、次いで、１ＸＰＢＳ中で３回洗浄され
た。細胞は、５％のヤギまたはロバ血清を加えたＰＢＳ（Ｔ－ＰＢＳ）中の０．３％のト
リトン－Ｘ１００中で、１～２時間、室温で穏やかに攪拌しながらブロッキングされた。
細胞は、抗－ＧＦＰ［Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ ６００－３０８（ウ
サギ）］および抗－ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５－５５７（ｍｏｕｓｅ）］抗体
と共に２４時間、４℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートされた。細胞は、０．１％
のＴｗｅｅｎ ２０ １ＸＰＢＳ中で各々１５分間ずつ３回洗浄され、次いで、抗ウサギ
４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１１－５４５－１４４）お
よび抗マウスＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５－１６５
－１６６）二次抗体と共に２４時間４℃で暗所にてインキュベートされた。次いで、細胞
は、０．１％のＴｗｅｅｎ２０ １ＸＰＢＳ中で各々１５分間ずつ４回洗浄された。３回
目の洗浄において１：１０００の希釈でＨｏｅｃｈｓｔ染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、核が標識された。

Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５およびＧｅｎ５ Ｉｍａｇｅ＋ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗ
ｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、プレートが画像化された。簡単に言うと、４Ｘの対
立倒立を使用して、自動画像ステッチのために重複タイルを伴う５ｘ４の自動焦点画像を
獲得することにより、各ウェルのモンタージュ画像を作製した。使用されたフィルターは
、ＤＡＰＩ（３７７，４７７）、ＧＦＰ（４６９，５２５）、およびＲＦＰ（５３１，５
９３）であった。露光時間およびゲインは、負および正対照を使用して、各プレートにつ
いて調整された。ＧＦＰおよびＲＦＰフィルターについて使用したのと同じ焦点高さを用
いて、自動焦点を各ウェルについて核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ＤＡＰＩ）に対して実施し
た。Ｇｅｎ５ Ｉｍａｇｅ＋ソフトウェアにより画像を共にステッチした。

ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ６．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、単一細胞の画像分析
を実施した。簡単に言うと、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ＤＡＰＩ）または成熟ニューロン
（ＮｅｕＮ、ＲＦＰ）のいずれかについて、獲得画像において無作為に選択された細胞の
サイズおよび強度に基づいて包含および排除パラメータを最適化することにより、個々の
トラックマスクを作製した。次いで、ＧＦＰの平均および中央強度値を、選択されたマス
クの境界内で獲得し、各細胞内のＵｂｅ３ａＹＦＰについての強度値を産生した。

ヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロン
ＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来神経前駆
細胞（ＮＲＣ－１００－０１０－００１およびＧＮＣ－３０１－０３０－００１、Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
を、製造元のプロトコルに従ってニューロンに分化させた。簡単に言うと、神経前駆細胞
は解凍され、化学的に画定された培地中で再懸濁され、ポリ－Ｄ－リジンおよびラミニン
でコーティングされた滅菌培養プレートへ添加された。プレーティングの２４時間後に培
地を交換し、次いで、培地の半分をその後３～５日毎に交換した。

ＲＮＡ単離
培養されたｉＰＳＣ－由来ニューロンについて、Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキット（Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５５μｌのライセート容積にて使用し
て、ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成を実施した。

ＲＮＡレベルの分析
標的転写物の定常状態ＲＮＡレベルは、ＴａｑＭａｎ定量的リバース－転写ＰＣＲ（ｑ
ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを使用して測定された。全反応容積は、１０ｕＬであり、２μｌ
のｃＤＮＡ、１Ｘの遺伝子発現マスターミックス（４３６９０１６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉ
ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、および１ＸのＴａｑＭａｎ
プライマーアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。
サイクリング条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、ならびに９５℃で１５秒間お
よび６０℃で１分間の４０サイクルであり、各サイクルの６０℃での工程において読み取
りが行われた。反応は、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔ１０００ ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂ
ｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）において実行され
、内部対照（ＰＰＩＡ、Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および標的［ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ、Ｈｓ０１３７２９５７＿ｍ１；Ｓ
ＮＯＲＤ１１６－１１、Ｈｓ０４２７５２６８＿ｇＨ；ＳＮＯＲＤ１１５、Ｈｓ０４２７
５２８８＿ｇＨ；ＩＰＷ、Ｈｓ０３４５５４０９＿ｓ１；ＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ、ＡＰ
４７ＷＶＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＵＢＥ３Ａ：フォ
ワードＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴ（配列番号５００）；リバース：ＣＣ
ＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＡＡＴＣＡＧＡＡ（配列番号５０１）；およびプローブ：ＡＴＧ
ＡＣＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧ（配列番号５０２）］反応を共に実施した。データ
を取り出し、ＢＩＯＲＡＤ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。内部対照Ｃｑ値≧３０を有する試料をフィルター
分けした。データの品質を視覚的に調査して、技術的および／またはプレートレプリケー
トの間の不一致を同定した。推測統計および記述統計のための測定は、ΔΔＣｑ値（２－
ΔΔＣｑ＝２－（Ｃｑ［標的］－Ｃｑ［内部対照］）－（Ｃｑ［標的］－Ｃｑ［内部対照
］））からなる。

実施例２：ＡＳＯ標的領域の同定
マウス組織および細胞から産生されたＲＮＡ－配列決定データの分析は、Ｓｎｏｒｄ１
１５クラスターの３’－末端とＵｂｅ３ａアンチセンス（Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ）転写物の５
’－末端との間に位置する領域を明らかにし、これは、Ｓｎｏｒｄ１１５宿主遺伝子転写
物のプロセシングおよびＵｂｅ３ａ－ＡＳの転写のために重要であると考えられている遺
伝要素を含有している（図６Ａ～６Ｄ）。ヒト組織から産生されたＲＮＡ－配列決定デー
タの分析は、ＳＮＯＲＤ１１５クラスターの３’末端とＳＮＯＲＤ１０９Ｂとの間に位置
する領域を明らかにし（図７Ａ～７Ｇ）、これは、マウスにおいて観察されたものと同様
の要素を含んだ；しかし、この領域の比較分析は、ヒトとげっ歯類との間には配列保存が
ほとんどないか、または全く存在しないことを示した。

材料および方法
ＲＮＡ－配列決定
ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ（７４１３６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈ
ｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離された。ＲＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光定
量（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定され、ＲＮＡ
品質は、４２００ Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎ
ｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して評価された。ＲＮＡ－配列決定ライブラリーは、Ｉ
ｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（２００
２０５９７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造元のプロ
トコルに従って使用して産生された。７５塩基対の対になった末端配列決定は、Ｔｅｘａ
ｓ Ａ＆Ｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ
Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅにおいて、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌ
ｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施された。生の配列決定読み取
りは、ＣＡＳＡＶＡを使用して処理された。得られたＦＡＳＴＱ配列は、ＦＡＳＴＱＣを
使用して調べられた。

ＦＡＳＴＱ配列は、Ｈｉｓａｔ２（バージョン２．１．０）を以下の設定で使用してヒ
ト参照アセンブリ（ｈｇ１９）に対してアラインされた：－－ｆｒ。次いで、アラインさ
れたＳＡＭ配列をバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ＢＡＭ配列に変換し、インデックスを付け
、Ｓａｍｔｏｏｌｓを使用してソーティングした。個々の試料からのＢＡＭファイルを合
成し、Ｓａｍｔｏｏｌｓを使用してインデックスを付けた。アラインされた配列は、Ｓａ
ｍｔｏｏｌｓのビューコマンドを使用してフィルター分けされ、非独自的にアラインされ
た読み取りを除いた（品質＞１）。

転写物アセンブリは、以下のオプションでＳｔｒｉｎｇｔｉｅ（バージョン１．３．４
．ｄ）を使用して合成した試料から産生された：（ｓｔｒａｎｄｅｄ）－－ｒｆ－ｆ０－
ｊ２。ｇｆｆｒｅａｄ （ＧＦＦ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）を使用して、単一のエクソン転写物は、アセンブリされた転写物から排除された
。

実施例３：リードＡＳＯの同定
ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１標的配列を標的とし、かつ異なる骨格設計およびＲＮ
Ａ修飾からなる１８個のＡＳＯが、潜在的なリードＡＳＯを同定するために設計された（
表１７）。正常なｉＰＳＣ由来ニューロン（ＧＡＢＡ作動性）は、１０ポイントの１／２
ｌｏｇ用量曲線の各ＡＳＯで治療され、ＩＣ５０およびＥ最大値を比較された。神経前駆
細胞は１８ＤＩＶでニューロンに分化し、次いで、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量応答
ＡＳＯ［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μ
Ｍ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝２）］で治療された。２４ＤＩＶにて、ＵＢＥ３Ａ
－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、上記したように用量応答曲線が近似された（
図８Ａおよび表１８）。用量応答曲線は有意に異なった（並列試験：Ｆ（５１，６０６）
＝７．８６；ｐ＜０．０００１；Ｒ２＝０．９０）ので、相対的効力は推定されなかった
。近似曲線の階層的なクラスター化は、ＡＳＯの３クラスターを明らかにし、クラスター
１が９つの最も強力なＡＳＯを表した（図８Ｂおよび８Ｃ）。クラスター１の分析は、Ａ
ＳＯが同様の曲線を有し（並列試験：Ｆ（２４，２９９）＝１．０１；ｐ＝０．５；Ｒ２
＝０．９３）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌが他のＡＳＯと比べて少なくとも３倍強力であ
ることを示した（表１９）。しかし、さらなる分析は、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ、ＡＳ
Ｏ－６．１．ＰＳ．Ｍ、およびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｍが等価なＩＣ５０値を有す
るが、他のＡＳＯは若干効力が少ないことを示した（表２０）。相対的効力および内部選
択基準に基づいて、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏがさ
らに調査された。

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例２で記載されたものと同様であった。

実施例４：アンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１
．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析
次いで、ＡＳＯ－６．１．ＰＳ．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの効力が、１５ｑ
１１－ｑ１３領域の母方由来欠失を有するアンジェルマン症候群患者からのｉＰＳＣ由来
ニューロンにおいて調べられた。誘導多能性幹細胞は、ニューロンに分化し、次いで、１
０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．
４．ＰＳ．Ｌ［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ
、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］で治療された。治療の６日後に、ＵＢ
Ｅ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、用量応答曲線が上記したように近似さ
れた（図９Ａ）。用量応答曲線は、ＡＳＯ間で同様であったが（並列試験：Ｆ（３，１３
２）＝１．０７、ｐ＝０．４、Ｒ２＝０．８２）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（４３７ｎ
Ｍ）はＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（１．２２ｕＭ）よりもおよそ２．７倍だけより強
力であった。ＩＣ５０値は等価であった［ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ／ＡＳＯ－４．
４．ＰＳ．Ｌ ＩＣ５０比：＝０．９６（信頼下限＝０．９；信頼上限＝１．０）］。Ｅ
最大値は同様であった（３０μＭ：ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ＝０．０１±０．０００７
；ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ＝０．０５±０．００４）が、信頼区間［ＡＳＯ－６．
１．ＰＯ－１．Ｏ／ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ Ｅ最大比：＝－９．１（信頼下限＝－２
２４；信頼上限＝２０５）］に起因して等価であるとは見なされなかった。

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例２で記載されたものと同様であった。

アンジェルマン症候群誘導多能性幹細胞由来ニューロン
アンジェルマン症候群ｉＰＳ細胞（ＡＧ１－０ ｉＰＳＣｓ）（ＥＣＮ００１、Ｋｅｒ
ａｆａｓｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）は、ヒト胚性幹細胞培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１１３
３０－０５７、Ｇｉｂｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）
、２０％のノックアウト血清リプレイスメント（１０８２８－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１Ｘの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ－グルタミン
、７μｌ／ｍＬの２－メルカプトエタノール、および４μｇ／ｍＬの基礎線維芽細胞成長
因子］中で、照射マウス胚性線維芽細胞と共培養された。初回継代では、ＰｌｕｒｉＳＴ
ＥＭヒトＥＳ／ｉＰＳ培地（ＳＣＭ１３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌ
ｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）についての製品マニュアルに従って、ＡＧ１－０細胞が継代され、
この培地は、フィーダーフリーであり、細胞を解離するためにＤｉｓｐａｓｅＩＩ（ＳＣ
Ｍ１３３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を利用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ｈ
ＥＳＣ適格性マトリックス（３５４２７７、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を細胞外マトリックスとして使用した。第２の継代では、
マトリックスは、ビクロネクチン（ＣＣ１３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）に変
更された。続く継代の間、分化した細胞がコロニーのおよそ＜５％を表すまで、分化の領
域は手動で除去された。４回の続く継代の後、ＡＧ１－０細胞は、細胞外マトリックスと
してビクロネクチンを欠いているＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＳ／ｉＰＳ神経新生キット（Ｓ
ＣＲ６０３、ＳＣＭ１１０、およびＳＣＭ１１１）を使用して、分化された。初回継代は
ＥＺ－ＬｉＦＴ（ＳＣＭ１３９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を用いて実施され、
高品質のｉＰＳ細胞を得た。神経前駆細胞をステージゼロ（Ｐ０）で凍結し、その後、分
化のために解凍した。分化は、ポリ－Ｄ－リジン（１０μｇ／ｍＬ）およびラミニン［１
０μｇ／ｍＬ（２３０１７－０１５、Ｇｉｂｃｏ）でコーティングされた滅菌培養プレー
トにて、分化培地（ＳＣＭ１１１）中、分化の１０日間において実施された。いくつかの
場合では、細胞は、セルラーダイナミクス維持培地（ＮＲＭ－１００－１２１－００１、
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、
ＷＩ）中で分化された。

実施例５：ＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．Ｏ、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌで処理した
アンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＰＷＳ多シストロン性転写物の発現分
析
ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏが、ＰＷＳ多シストロ
ン性転写物によりコードされるＲＮＡ転写物のレベルに影響を与えるかを決定するために
、ＲＮＡ－配列決定が、各ＡＳＯで治療されたＡＳ ｉＰＳ細胞において実施され、ＳＮ
ＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＯＲＤ１１６宿主遺伝子転写物（ＳＮＨＧ１１６）、ＳＮＯＲ
Ｄ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物（ＳＮＨＧ１１５
）、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ、およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベル
が定量化された。ＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルも測定された。アンジェルマン症候群
ｉＰＳ細胞は上記したようにニューロンへと分化し、次いで、ビヒクル（１％のＨ２Ｏ、
ｎ＝３）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（３０ｕμＭ、ｎ＝３）およびＡＳＯ－６．１．Ｐ
Ｏ－１．Ｏ（３０μＭ、ｎ＝３）で治療された。治療の６日後、培養液から単離された総
ＲＮＡ（ｒＲＮＡ枯渇した）に対して、ＲＮＡ ＲＮＡ－配列決定が実施された。ＳＮＨ
Ｇ１１６、ＳＮＨＧ１１５、およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の注釈を作製するために、ト
ランスクリプトームが、ビヒクルＲＮＡ－ｓｅｑデータからアセンブリされ、次いで、参
照遺伝子注釈へと組み込まれた。ビヒクルに対して、ＳＮＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＨＧ
１１６、ＳＮＯＲＤ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、およびＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡの定
常状態ＲＮＡレベルは同様であり、有意に異ならなかった。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．
Ｏではなく、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＩＰＷレベル（１．５倍）を減少したが、効
果は有意ではなかった。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ
は、ＳＮＨＧ１１５およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを有意に減少した。ＡＳＯ－
６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＳＮＨＧ１１５レベルに対し
て同様の効果を有した；しかし、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－
１．Ｏ（ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ：－６．１倍変化；ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ：
－２．８倍変化）よりも、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対してはるかに大きな効果
を有した。ＡＳＯ治療は、ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルをおよそ１．２倍増大したが、効果
は有意ではなかった（図１０および表２１）。

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例４で記載されたものと同様であった。

ＰＷＳ ＲＮＡの示差的発現分析
ＲｅｆＳｅｑ遺伝子注釈の正規化されたＦＰＫＭ（１００万あたり１０００あたりの断
片）値は、デフォルト設定および以下のオプションを用いるＣｕｆｆｎｏｒｍを使用して
推定される：－ｕ。各遺伝子注釈のＦＰＫＭ値は、各試料についてアウトプットファイル
から決定され、記述および推測統計のために使用された。

実施例６：カニクイザルマカクにおけるＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４
．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析
ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６標的領域は、いくつかの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）種にわた
って保存されており、故に、大型動物モデルにおける安全性および効率性の研究の両方が
可能となる。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６
．１．ＰＯ－１．Ｏの効能を調べるために、ＡＳＯが、髄腔内腰部穿刺によりカニクイザ
ルマカクへ送達された。動物は、ビヒクル（０．９％の食塩水、ｎ＝５）、ＡＳＯ－６．
１．ＰＯ－１．Ｏ（１０ｍｇ、ｎ＝３）、およびＡＳＯ．４．４．ＰＳ．Ｌ（１０ｍｇ、
ｎ＝３）の単回ボーラス注射を投与された。治療の２８日後、中枢神経（ＣＮＳ）組織が
収集され、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定された。総じて、ＡＳＯ－４
．４．ＰＳ．Ｌは、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏよりも、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレ
ベルに対してより大きな効果を有した（表２２）。ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、大部分
のＣＮＳ領域においてＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡを減少し、側頭葉、一次運動皮質、脳橋
、髄、海馬、淡蒼球、前頭皮質（放射冠）、前頭前野、および脊髄腰部において大きな効
果を有した。同様に、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏは、大部分のＣＮＳ領域においてＵ
ＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを減少し、大きな効果は、脳橋、動眼神経核、および脊髄
腰部において観察された（図１１および表２３）。

材料および方法
ＡＳＯの投与
ＮＨＰ研究は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏ
ｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓの各制度によ
り認可されたプロトコルを使用して実施された。２～４ｋｇの体重の雄および雌カニクイ
ザルマカク（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を麻酔し、単回１ｍＬ用量のＡ
ＳＯまたはビヒクルを髄腔内腰部穿刺により投与した。ビヒクル対照品目（０．９％の塩
化ナトリウム）中に凍結乾燥したＡＳＯを溶解させることにより、投与用溶液を調製し、
０．２μｍのフィルターを介して濾過した。ＣＮＳおよび脊髄試料を回収し、ＣＮＳを４
ｍｍの冠状スライスに切片化した。組織試料を即時凍結し、ＲＮＡ単離まで－８０℃で貯
蔵した。

ＲＮＡ単離
４ｍｍの組織パンチを目的の各領域から採取し、そのおよそ半分はＲＮＡ単離のために
使用した。ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（７４１３６、
Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施され、組織崩壊および溶解は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ
ＩＩ中の５ｍｍのステンレススチールビーズを用いて実施された。ＲＮＡは、２容積の３
０μｌの水中に溶離され、全溶離容積は６０μｌとなった。ＲＮＡは、Ｑｕｂｉｔおよび
ＲＮＡ ＸＲアッセイ（Ｑ３３２２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ）を用いて定量化された。ｃＤＮＡは、高性能ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（４３
８７４０６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を全反応容積５０μ
ｌで使用して、２μｇのインプットＲＮＡから合成された。

組織におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルの分析
カニクイザルマカクのＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ緑色定量的リバー
ス－転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して推定された。全反応容積は、１０μｌであ
り、２μｌのｃＤＮＡ、１ＸのＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａ
２５７４１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５００ｎＭ
の各プライマー（フォワードおよびリバース）を含んだ。サイクリング条件は、５０℃で
２分間、９５℃で２分間、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイク
ルであり、各サイクルの６０℃での工程において読み取りが行われた。反応は、ＢＩＯ－
ＲＡＤ Ｔ１０００ ＣＦＸ９６サーモサイクラーで実行され、内部対照（ＰＰＩＡ、フ
ォワード：ＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣ （配列番号５０３）；リバース
：ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡ （配列番号５０４））および標的（Ｕ
ＢＥ３Ａ－ＡＳ、フォワード：ＣＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡ （配列番
号５０５）；リバース：ＧＧＡＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣ（配列番号５０６）
）反応が別々に実施された。データが回収され、初期分析がＢＩＯＲＡＤ ＣＦＸ Ｍａ
ｅｓｔｒｏソフトウェアを用いて実施され、深層統計分析は、ＥｘｃｅｌおよびＪＭＰを
用いて実施された。

実施例７：スプライスされたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物のエクソン境界を標的とするＡＳＯ
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳエクソン１～５およびＳＮＯ
ＲＤ１０９Ｂエクソン１～２を含むエクソン境界である。標的配列は、各エクソン（隣接
エクソンの５’および３’－末端を表す１９個のヌクレオチド）のエクソンの境界を中心
として配置する３８個のヌクレオチド（各エクソンの１９個のヌクレオチド）からなる。
セグメント１～２、２～３、３～４、５～６、７～８、９～１０、および１１～１２を含
むエクソン境界を伴う、１２セグメントの配列が存在した。染色体コーディネートは表２
４に提供される。スプライスされたエクソン（｜、エクソンのジャンクション）および介
入エクソンの配列（［］）を示す単一の合成されたジャンクション配列が作製された。エ
クソンのジャンクションを標的とするＡＳＯ（２０－、１９、および１８－ｍｅｒ）は、
表２５に提供される。

合成されたジャンクション配列
ＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧ｜ＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧ［
］ＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ｜ＧＡＴＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧ
［］ＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧ｜ＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧ
Ａ［］ＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧ｜ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧ
ＡＡ［］ＡＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧ｜ＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡ
ＡＣＴ［］ＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＧ｜ＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧ
ＡＴＣＣ（配列番号４８９）。
｜＝３’－５’ エクソンのジャンクション
［］＝介入エクソンの配列

実施例８：ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およ
びＣＲＩＳＰＲガイド
上記するように、いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核
酸配列を阻害、変異、または欠失する機能的核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ま
たはヌクレアーゼｇＲＮＡである。

ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｉＲＮＡの実施例は、表２６において
提供される。ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｈＲＮＡの実施例は、表２
７において提供される。ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｇＲＮＡの実施例
は、表２８において提供される。

別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開
示された本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意
味を有する。本明細書で引用された刊行物およびそれらが引用した材料は、参照により本
明細書に具体的に組み込まれる。

当業者であれば、単に慣用的な実験手法を使用することで、本明細書で記載された特定
の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または、それらを確認することができるだろ
う。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

Claims (13)

1. 核酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の連
   続した部分に少なくとも９８％の相補性を有する１０～３０個のヌクレオチド長の連続し
   たヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、８、９、１０、または１１からなる群か
   ら選択される配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. １つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオ
   チド。
4. 前記１つ以上の修飾されたヌクレオシドが、２’糖修飾されたヌクレオシドである、請
   求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記１つ以上の２’糖修飾されたヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’
   －Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ
   、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フ
   ルオロ－ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項
   ４に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記１つ以上の修飾されたヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項５に記
   載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、
   請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記連続したヌクレオチド配列内の前記ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌ
   クレオシド間結合である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができる、請求項１に
   記載のオリゴヌクレオチド。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
11. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３６２～３９２からなる群から選択される核酸配
    列を有する、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド、ならびに薬学
    的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
13. 治療的または予防的有効量の請求項１２に記載の組成物を、アンジェルマン症候群を患
    っているか、またはその疑いのある対象へ投与することを含む、対象においてアンジェル
    マン症候群を治療または予防するための方法。