JP2023121226A - 検体の前処理方法及びその応用 - Google Patents
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Abstract
【課題】LC-MS又は電気泳動による分析に先立つタンパク質含有検体の従来の前処理方法は長時間を要し、様々な適用への制限となっており、またサンプル損失等の問題もあった。これらの課題を解決することができる迅速かつ高効率の前処理方法の開発が必要とされていた。【解決手段】タンパク質の変性と、基質に固定化された耐熱性酵素を用いるタンパク質の消化とを同時に行う工程と、消化されたペプチドを回収する工程とを含む、タンパク質を含む検体の前処理方法を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質分析の分野に関する。より具体的には、本発明は、血液（全血、血漿及び血清）、唾液、尿などの体液、薬品、食品等のタンパク質含有検体の迅速かつ効率的な前処理に有利な方法に関する。本発明の方法は、LC-MS又は電気泳動による分析に用いるサンプルを調製するための前処理方法であって、特定の疾患への罹患可能性についてのインビトロ診断、生物医薬品及び食品の品質評価、生物学的産物の同定、特徴付け及び定量のために好適に使用することができる。
液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）は、高感度で低分子量の化合物を検出することができる技術であり、とりわけ、血液、ホルモン及び薬物のインビトロ診断、環境分析、食品分析、細胞培養のプロセス管理のための分析等に利用されている。一方、ペプチドやタンパク質などの高分子は、一般に、LC-MSにおいてそのままで高感度に検出することは困難である。
タンパク質を含有する検体についてLC-MSによる高感度検出を可能にするためには、検体を前処理して、予めタンパク質を分解しておくことが必要とされる。そのため、検体中に含まれるタンパク質をタンパク分解酵素により低分子に断片化（ペプチドマッピング）した後、LC-MSで検出する方法が開発されている。前処理は通常複数の工程を必要とするため、工程が多い程、分析用サンプルの調製により長い時間を要する上、分析における誤差が大きくなり得るという問題が存在していた。
例えば、検体が、複数のジスルフィド結合を有するタンパク質を含有する場合、従来の方法では、i）タンパク質内のジスルフィド結合を切断するための「還元」、ii）還元によって生成したチオール基が再び酸化してジスルフィド結合に戻らないための「アルキル化」、iii）過剰のアルキル化試薬の不活性化のための「クエンチング」、iv）タンパク質分解酵素を使用して還元及びアルキル化されたタンパク質を分解する「消化」、の4つの工程が必要とされる。検体中のタンパク質が不明である場合にも、上記の工程は基本的に全て実施されることとなる。また、検体中のタンパク質濃度や検体組成等の状況に応じて、検体の濃縮、緩衝液置換、脱塩、及び界面活性剤除去などの追加の工程も必要である。上記した従来の方法による前処理のプロセスは、数時間～約18時間を要する。そのため、ペプチド及びタンパク質分析のためのLC-MSの商業的応用は、現在のところ完全には実現されていない。
一方、電気泳動は、DNA、RNA、又はタンパク質分子を、それらのサイズ及び電荷に基づいて分離するために使用される実験室的技術であり、ゲルを通して分離すべき分子を移動させるために電流が使用される。ゲル中の細孔はふるいのように働き、より小さな分子がより大きな分子よりも速く移動する。電気泳動において使用される条件は、所望のサイズ範囲の分子を分離するために調節され得る。
電気泳動はタンパク質や遺伝子変異の研究において非常に重要な技術である。タンパク質や遺伝子（DNA）に変異があると、変異体はしばしばより長いかより短いかにサイズが変更しており、そのため電気泳動ゲル上で正常なタンパク質や遺伝子とは異なる位置にバンドが現れるため、臨床診断や法医学試験を含む多くの診断試験が電気泳動を用いて行われている。LC-MSと同様に、電気泳動においてもタンパク質含有検体の前処理は必要であり、上記と同じ問題に直面し得る。
したがって、LC-MSや電気泳動による効率的な分析のためにタンパク質含有検体を前処理するための改善された方法が必要とされていた。
したがって、LC-MSや電気泳動による効率的な分析のためにタンパク質含有検体を前処理するための改善された方法が必要とされていた。
特許文献１には、質量分析のための試料のオンライン調製のための方法及びシステムが記載されている。この方法及びシステムは、液体クロマトグラフィーカラム上でタンパク質を還元するものであり、還元剤とタンパク質との間の接触及び/又は還元されたタンパク質のアルキル化剤への曝露を減少させることができると記載されている。この方法は、タンパク質を液体クロマトグラフィーカラム上に保持し、還元剤を含む溶液をカラムに流して、保持されたタンパク質のジスルフィド結合の一以上を切断するようにするものである。次いで、溶離液をカラムに流し、還元されたタンパク質をカラムから溶出するようにさせ、還元されたタンパク質を含有する溶出液をイオン源に送達することをさらに含むことができる。特許文献１の方法は、タンパク質の還元のための良好な方法であるが、タンパク質の消化を含む、検体の前処理に必要な他の工程を含んでいない。また、検体毎に異なるカラムを必要とするか、又は、カラムを再利用する場合には還元されたタンパク質を完全に除去するために洗浄を含む複数の工程に多くの時間及び手間を費やさなければならない。
特許文献２には、低温下で高分子ポリマー溶液を添加して体液からタンパク質を抽出した後、高温条件下で界面活性剤とトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンを一定量添加して変性・還元することにより、LC-MS分析用のタンパク質含有体液サンプルを調製する方法が記載されている。この方法では、シリカミクロスフェア上にグラフトされたヨード酢酸ブラシをタンパク質溶液に添加して、タンパク質スルフヒドリル基と反応させるための固相アルキル化剤として働かせ、次いで、ミクロスフェアを遠心分離によって除去する。その後、タンパク質をペプチドに消化するためにプロテアーゼを添加し、消化されたペプチドをLC-MSによって分析する。しかしながら、特許文献２の方法でタンパク質を抽出するために使用される高分子ポリマーはタンパク質の変性及び還元プロセスを妨害し得るものであり、この前処理方法のコストを増加させ得る。また、消化の前に界面活性剤、還元剤及びアルキル化ミクロスフェアの他に前記ポリマーも除去することが必要であり、そのため前処理において必要とされる工程数がより多くなっている。
血液、ホルモン、薬物、環境試料、食品試料、及び細胞培養試料等の複雑な検体のタンパク質分析を商業的に適用可能にするためには、例えばタンパク質の存在及び量の変化の理解のために迅速に行うことが必要とされる。しかしながら、上記の通り、タンパク質の還元・アルキル化及びクエンチング、それに続く溶液中又はゲル中でのタンパク質消化を含む従来の前処理方法では、数時間～約18時間を要し、これが大規模プロテオーム分析及びその臨床的適用であるインビトロ診断又は薬物品質評価への応用を制限していた。さらに、従来の方法において生じ得る酵素の慢性的な自己消化及びサンプル損失もまた、LC-MS又は電気泳動によるタンパク質の検出をさらに妨げるものであった。また、界面活性剤、有機溶媒、及び尿素のような添加剤がより完全な消化を促進するために使用される場合、これらの添加剤が消化物を汚染し、そのため余分な精製手順を必要とし、試料の前処理時間をさらに増加させることとなっていた。従って、これらの課題を解決することができる迅速かつ高効率の前処理方法の開発が要求されていた。
本発明者らは、上記の課題を解決することを目的として種々検討を行い、本発明の前処理方法を見出した。本発明の方法は、LC、LC-MS、及び電気泳動による分析の適用範囲を広げるために、検体の前処理における変性及び消化の工程をワンポット・ワンステップの工程に短縮し、前処理のスピードアップを図るものである。
本発明の一実施形態において、磁性ビーズ、シリカビーズ、金属ビーズ、樹脂ビーズ及び多糖ビーズからなる群より選択される基質上に固定化された耐熱性消化酵素を使用することによって、熱変性及び酵素消化を高温のワンポット工程で同時に進行させることができ、それによって、検体の前処理時間を有意に減少させることができる。
本発明は、
i）還元、アルキル化、クエンチング、及び消化を含む、従来の４段階の検体前処理方法をワンポットでのワンステップの方法とすること、
ii）少量のタンパク質を含む検体、又は微量の検体であっても、短い消化時間で実質的に改良された効率的な消化を行うこと、
iii）特に診断及び予後診断目的のための疾患特異的バイオマーカーの発見のためにタンパク質の信頼できる同定を行うこと、
iv）最終分析サンプル中の残存消化酵素をなくし、LC-MSの堅牢性を確実にし、その耐用期間を改善すること、
v）ワンステップの検体前処理方法で未処理のタンパク質を消化すること、
vi）従来は少なくとも18時間であった前処理のための時間を1時間未満に短縮すること
を可能とする、検体の前処理方法を記載する。
i）還元、アルキル化、クエンチング、及び消化を含む、従来の４段階の検体前処理方法をワンポットでのワンステップの方法とすること、
ii）少量のタンパク質を含む検体、又は微量の検体であっても、短い消化時間で実質的に改良された効率的な消化を行うこと、
iii）特に診断及び予後診断目的のための疾患特異的バイオマーカーの発見のためにタンパク質の信頼できる同定を行うこと、
iv）最終分析サンプル中の残存消化酵素をなくし、LC-MSの堅牢性を確実にし、その耐用期間を改善すること、
v）ワンステップの検体前処理方法で未処理のタンパク質を消化すること、
vi）従来は少なくとも18時間であった前処理のための時間を1時間未満に短縮すること
を可能とする、検体の前処理方法を記載する。
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示する技術的思想の範囲内において、当業者が種々の変更を加えることが可能である。
酵素は、そのほとんどが穏やかな条件下で、複雑な化学プロセスを触媒することが知られている。工業的、商業的及び実験室的プロセスにおける酵素の利用は、水性媒体中でのそれらの高い活性ならびに高い基質特異性及び生成物選択性により可能となったものである。しかしながら、酵素の中には極端な条件下でそれらの生理学的機能を実行するように自然の進化を通して選択されたものがあり、それらは一般的に「正常な」生理学的範囲から外れる温度、塩分、pHで、及び溶媒が含まれる環境下で最適に作動することができる。酵素を用いた工業的適用が成功するためには、生体触媒である酵素がその生理学的環境からかなり離れた条件下でも安定かつ機能的である必要がある。典型的には、天然酵素は工業用生体触媒のすべての要件を満たすわけではないため、その一以上の機能特性の改変又は改良が必要とされる。酵素の性能を改変又は改良するために、従来化学的又は遺伝的ツールがほとんど独立した戦略として使用されてきた。しかしながら、異なるストラテジーを組み合わせて用いることで相乗効果が示され、例えば、遺伝的に改変された酵素の特性を、固定化又は化学的改変を介してさらに改良することができ、また、化学的に改変された酵素も固定化を介してさらに安定化され得る。
本発明では、基質に固定化された耐熱性消化酵素を用いて、タンパク質を高温でワンポットの工程で同時に変性・消化することにより、検体の前処理のための時間を大幅に短縮した、タンパク質を含む検体の前処理方法を提供する。固定化酵素は、使用される固定化基質に依存する種々の方法を使用して除去することができる。消化されたペプチドは、回収され、電気泳動分析、LC-MSなどのために使用し得る。
従来、タンパク質分析において、膵臓セリンエンドプロテアーゼであるトリプシンは、明確な基質特異性を有するため、主として使用されてきた。トリプシンによる消化は一般に溶液中で行われるが、これはハイスループットタンパク質同定技術の進歩を制限し得る多くの欠点を提示している。干渉し得る自己消化ペプチドの出現を避けるために、トリプシン対基質比は低く保たなければならず、その結果、長い消化時間（典型的には＞12時間）が必要とされる。また、消化速度は基質濃度によって制限されるため、マイクロモルレベルの基質濃度は、タンパク質の同定のために十分なペプチド量を必要とする標準的な溶液中プロトコルでは問題となる。こうした長いインキュベーション時間、及び高い温度の使用は必然的に、トランスペプチデーション及び非特異的切断、脱アミド化、酸化、ならびにトリプシン自己消化産物のような、より多くの困難をもたらしている。
従来の方法での別の欠点は、手動でのサンプルの取り扱い、及び溶液ベースの方法に必要とされる余分な工程であり、これは、ペプチドの損失及びヒトケラチンのような汚染物質の導入をもたらし得る。ペプシン、エンドプロテイナーゼ、及びキモトリプシンのような消化に使用される他のタンパク質分解酵素は同じ問題を提示する上に、トリプシンと比較して基質特異性が低い。
耐熱性酵素として知られる好熱性微生物（55～100℃の範囲で最適に増殖する生物）由来の酵素の使用は、酵素安定性の問題に対する解決策としてしばしば提案されている。また、従来の酵素の化学的又は遺伝的修飾は、耐熱性酵素を提供することができることも知られている。高温で機能する耐熱性酵素の独特の属性は、極度の熱安定性が必要とされる生物工学的及び生物触媒的用途におけるそれらの使用を可能にする。本発明において、検体の前処理の方法は、固定化された耐熱性酵素を用いて、タンパク質を55℃～100℃の間で1分間～4時間加熱することによって、未処理/未還元タンパク質を同時に変性及び消化することを含む。この加熱時間の範囲は従来よりも効率的な検体の前処理を可能にし、従来の方法で必要とされる18時間を超える時間と比較して非常に短い。また、55～100℃の温度範囲は、55℃より低い温度が耐熱性酵素を無効にし、一方、100℃より高い温度は、周囲圧力でタンパク質に潜在的に損傷を与え得るため、重要である。高温でタンパク質を同時に変性及び消化するために使用され得る耐熱性酵素としては、例えばサーモリシン（Thermolysin）、カルドリシン（Caldolysin）、サーミターゼ（Thermitase）、及びプロテイナーゼK（Proteinase K）を挙げることができる。これらの酵素は、高温で酵素活性を維持する能力を有するため、高温でタンパク質を効果的に分解するために使用することができる。高温でのこれらの酵素の安定性のために、酵素は回収後にリサイクルされ、再使用することができる。そのため、本発明の前処理方法は、消化酵素が1回のみ使用され得る従来の方法と比較してコストの点でも有利である。
耐熱性酵素の使用が成功するか否かは、酵素反応に必要とされる過酷な条件（非天然溶媒、高温及び高圧）への暴露時に活性を保持するそれらの能力に依存する。これらの制約に加えて、多くのプロセスは酵素が反応媒体から除去可能であること、再使用可能であること、又は少なくともリサイクル可能であることを必要とするが、その存在によって生成物流を汚染しない。担体の表面上の酵素固定化は、上記に列挙した問題の多くに対処することができる。この目的のために一般的に使用される方法は、共有結合、捕捉、及び物理的吸着である。吸着は、タンパク質と表面との相互作用の支配的なメカニズムと考えられ、原則として、共有結合又はカプセル化による固定化に先行する最初の事象である。一般に、固定化酵素は、高温で増大した安定性を獲得する。しかしながら、バイオテクノロジー応用のために酵素をうまく利用するための鍵は、固定化の際に酵素が機能したままであることを確実にすることである。
本発明の1つの実施形態では、磁性ビーズ(例えばAbsolute MagTM Amine Magnetic Nanoparticles，CD Bioparticles)、シリカビーズ(例えばシリカゲル，シグマ)、金属ビーズ（例えば鋼球ＳＵＳ３０４ミリサイズ）、樹脂ビーズ(例えばMelamine resin beads Supelco)及び多糖ビーズ（例えばAlginate and cellulose beads）及びほかの基板からなる群より選択される基質上に固定化された耐熱性消化酵素を使用することによって、熱変性及び酵素消化がワンポット工程で同時に進行し、それによって、検体の前処理時間を有意に減少させることができる。本発明における固定化耐熱性酵素の使用は、遊離酵素を使用する従来の前処理方法よりも大きな利点を示す。耐熱性酵素は狭い空間（μL/nL体積を有することが多い）内に固定化されるので、高い酵素対基質比を達成することができ、その結果、存在量が少ないタンパク質、及び微小量のプロテオミクス検体に対してさえ、本発明の方法の実質的に改善された消化能力、短い消化時間、酵素の自己消化がないこと、及び効率的な消化といった特徴によって、好適に使用することができる。さらに、耐熱性固定化酵素による消化による検出結果の再現性は、それらがタンパク質の信頼できる同定を提供し得ることを意味する。これは、診断及び予後診断のための疾患特異的バイオマーカーの発見のために、特に重要である。より重要なことに、固定化耐熱性酵素は、分離及び同定システムに容易に連結され得、迅速、効率的、高スループット及び自動化プロテオーム分析を可能にする。また、酵素は消化後に試料中に残存する場合にはLC-MS分析の精度を妨害する可能性があるが、固定化することにより、自発的沈降、遠心分離、磁気的蓄積、超音波による捕捉、濾過、及び膜分離を含む固定化基質に依存した方法を用いて試料から容易かつ完全に除去することができ、消化されたペプチドから酵素を分離し、それによって、その後のLC-MS又は電気泳動分析のためのペプチドを回収することができることが保証される。そうすることによって、この前処理方法は、正確なペプチドマッピング及びLC-MS又は電気泳動分析からのタンパク質の信頼できる同定を保証する。
また、一般に、還元アルキル化及びクエンチングの反応シーケンスを使用することは必ずしも必要ではないが、消化前のタンパク質の変性は有効な酵素消化のために必要である。したがって、タンパク質を迅速に変性させることができると考えられる熱変性は、還元アルキル化及びクエンチングによる消化前タンパク質の改変シーケンスの良好な代替物と考えることができる。しかしながら、単純な熱変性の場合、標的タンパク質が沈殿して不溶性になり、それによって消化効率を低下させ得る。しかし、固定化耐熱性酵素を用いた本発明のワンポット法で熱変性と酵素消化を同時に行うことができれば、タンパク質が不溶化するリスクを低減し、タンパク質を高速に消化することができる。本発明のタンパク質含有検体の前処理方法において、固定化耐熱性酵素は、未処理/未還元タンパク質を高温かつ30分未満で消化するために提供される。消化前にタンパク質の還元、アルキル化、及びクエンチングの別々の工程を経る必要がなく、サンプル前処理時間を短縮し、かつ試薬のコストを著しく減少させることができる。
本発明の別の実施形態では、本発明の固定化された耐熱性酵素を使用して、予め還元され、アルキル化されたタンパク質を消化することができる。本発明のさらに別の実施形態では、場合によってはLC-MS解析のためにジスルフィドを還元する必要があり得るので、必要な場合には本発明の固定化耐熱酵素で消化した後に、消化されたタンパク質を還元し、アルキル化することができる。
材料
ヒトIgG溶液は武田薬品工業株式会社から購入した。磁気固定化トリプシン（Magresynトリプシン）をResyn Biosciencesから、耐熱性サーモリシン（V4001）及びTris-塩化カルシウム（Tris-CaCl2）バッファーはプロメガ社からそれぞれ購入した。アミン磁気ビーズ（Absolute MagTM Amine Magnetic Nanoparticles）はCD Bioparticlesから購入し、サーモリシンの固定化に使用した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、タカラバイオ（株）から、ジチオトレイトール（DTT）、ヨードアセトアミド（IAA）及びバイオカーボネートアンモニウム（ABC）は、富士フイルム和光純薬（株）からそれぞれ購入した。
ヒトIgG溶液は武田薬品工業株式会社から購入した。磁気固定化トリプシン（Magresynトリプシン）をResyn Biosciencesから、耐熱性サーモリシン（V4001）及びTris-塩化カルシウム（Tris-CaCl2）バッファーはプロメガ社からそれぞれ購入した。アミン磁気ビーズ（Absolute MagTM Amine Magnetic Nanoparticles）はCD Bioparticlesから購入し、サーモリシンの固定化に使用した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、タカラバイオ（株）から、ジチオトレイトール（DTT）、ヨードアセトアミド（IAA）及びバイオカーボネートアンモニウム（ABC）は、富士フイルム和光純薬（株）からそれぞれ購入した。
サーモリシンの固定化
25mgの耐熱性サーモリシンを、1mLの0.1M Tris-CaCl2バッファーに、150rpmの継続的な振盪中、室温で溶解した。次いで、50mgのアミン磁気ビーズを5mlの0.1M PBS緩衝液に分散させ、サーモリシン溶液を添加した。混合物を振盪インキュベーター中に150rpmで置き、室温で2時間、固定化を行った。反応終了後、固定化した耐熱性サーモリシンを磁気分離により回収した（Liu, X.等, Immobilization of Lipase onto micron-size magnetic beads. Journal of Chromatography B, 822 (2005) 91-97の方法に準拠）。
25mgの耐熱性サーモリシンを、1mLの0.1M Tris-CaCl2バッファーに、150rpmの継続的な振盪中、室温で溶解した。次いで、50mgのアミン磁気ビーズを5mlの0.1M PBS緩衝液に分散させ、サーモリシン溶液を添加した。混合物を振盪インキュベーター中に150rpmで置き、室温で2時間、固定化を行った。反応終了後、固定化した耐熱性サーモリシンを磁気分離により回収した（Liu, X.等, Immobilization of Lipase onto micron-size magnetic beads. Journal of Chromatography B, 822 (2005) 91-97の方法に準拠）。
分析
消化反応の追跡のためにHPLCを用いた（Hitachi HT、LaChrom Elite、カラム: Nacalai、COSMOSIL Protein-R、溶媒:水/アセトニトリル/0.1% TFA、15/85～85/15勾配）。反応速度は、ヒトIgGモノマー及びダイマーに対応する保持時間における全溶出ピーク面積から計算した（ヒト血液由来IgGはあるパーセンテージでダイマーを含有するため）。
消化反応の追跡のためにHPLCを用いた（Hitachi HT、LaChrom Elite、カラム: Nacalai、COSMOSIL Protein-R、溶媒:水/アセトニトリル/0.1% TFA、15/85～85/15勾配）。反応速度は、ヒトIgGモノマー及びダイマーに対応する保持時間における全溶出ピーク面積から計算した（ヒト血液由来IgGはあるパーセンテージでダイマーを含有するため）。
［実施例１］
図１に示す工程で、以下の実験を行った。本実施例の工程は、検体中のタンパク質を高温で変性させると同時に固定化耐熱性酵素によって短時間で消化する工程と、消化されたペプチドと固定化酵素を分離して、固定化酵素を除去する工程とを含む。固定化酵素が除去され、消化されたペプチドを含む検体は、LC、LC-MS又は電気泳動のための分析用サンプルとして供することができる。
図１に示す工程で、以下の実験を行った。本実施例の工程は、検体中のタンパク質を高温で変性させると同時に固定化耐熱性酵素によって短時間で消化する工程と、消化されたペプチドと固定化酵素を分離して、固定化酵素を除去する工程とを含む。固定化酵素が除去され、消化されたペプチドを含む検体は、LC、LC-MS又は電気泳動のための分析用サンプルとして供することができる。
タンパク質含有検体としてヒトIgG溶液を用い、耐熱性酵素を用いてタンパク質の熱変性及び酵素消化を高温で同時に行った。ヒトIgGを50mM ABC緩衝液で希釈して、7.5mg/mL IgG溶液を形成した。70μlのIgG溶液を別のチューブにピペットで移し、磁気ビーズ上に固定化された耐熱性サーモリシンの50μl懸濁液を添加した。
混合物を70℃又は85℃でそれぞれ0.5時間、1時間及び2時間加熱した。磁石を用いて、固定化された耐熱性サーモリシンを蓄積し、変性及び消化工程の後に回収した。次いで、消化されたペプチドを、LC-MS又は電気泳動分析のために回収した。反応は1.5mLチューブ中で実施し、ブロックヒーター浴を加熱及び撹拌のために使用した。
その結果、図３に示すように、いずれの温度条件下でも、30分間（0.5時間）加熱することにより、75％以上の消化率が得られた。
その結果、図３に示すように、いずれの温度条件下でも、30分間（0.5時間）加熱することにより、75％以上の消化率が得られた。
［比較例１］
比較例として、磁気ビーズ基質上に固定化した耐熱性酵素サーモリシンと、同様に固定化した従来の非耐熱性タンパク分解酵素トリプシンを50℃で用いて、熱変性と酵素消化を同時に行った。ヒトIgGを50mM ABC緩衝液で希釈して、7.5mg/mL IgG溶液を形成した。70μlのIgG溶液を別のチューブにピペットで移し、磁気ビーズ上に固定化された酵素の50μl懸濁液を添加した。混合物を50℃でそれぞれ0.5時間、1時間及び2時間加熱した。磁石を用いて、固定化されたサーモリシン及びトリプシンを蓄積し、変性及び消化工程の後に回収した。次いで、消化されたペプチドを、LC-MS又は電気泳動分析のために回収した。反応は1.5mLチューブ中で実施し、ブロックヒーター浴を加熱及び撹拌のために使用した。
その結果、図４に示すように、いずれの固定化酵素と共に加熱した場合も、2時間までの加熱で消化率は20％以下であった。
比較例として、磁気ビーズ基質上に固定化した耐熱性酵素サーモリシンと、同様に固定化した従来の非耐熱性タンパク分解酵素トリプシンを50℃で用いて、熱変性と酵素消化を同時に行った。ヒトIgGを50mM ABC緩衝液で希釈して、7.5mg/mL IgG溶液を形成した。70μlのIgG溶液を別のチューブにピペットで移し、磁気ビーズ上に固定化された酵素の50μl懸濁液を添加した。混合物を50℃でそれぞれ0.5時間、1時間及び2時間加熱した。磁石を用いて、固定化されたサーモリシン及びトリプシンを蓄積し、変性及び消化工程の後に回収した。次いで、消化されたペプチドを、LC-MS又は電気泳動分析のために回収した。反応は1.5mLチューブ中で実施し、ブロックヒーター浴を加熱及び撹拌のために使用した。
その結果、図４に示すように、いずれの固定化酵素と共に加熱した場合も、2時間までの加熱で消化率は20％以下であった。
［実施例２］
図２に示す従来の前処理方法に沿って、タンパク質の熱変性、それに続く還元及びアルキル化を行った後、固定化耐熱性酵素による高温での酵素消化を行った。本実施例の工程は、検体中のタンパク質を高温で変性させた後に還元剤を添加して還元し、アルキル化剤によってアルキル化した後、固定化耐熱性酵素によって消化する工程を含む。
図２に示す従来の前処理方法に沿って、タンパク質の熱変性、それに続く還元及びアルキル化を行った後、固定化耐熱性酵素による高温での酵素消化を行った。本実施例の工程は、検体中のタンパク質を高温で変性させた後に還元剤を添加して還元し、アルキル化剤によってアルキル化した後、固定化耐熱性酵素によって消化する工程を含む。
ヒトIgGを50mM ABC緩衝液で希釈して、7.5mg/mL IgG溶液を形成した。100μlのIgG溶液を別のチューブにピペットで入れ、75℃で30分間加熱してタンパク質を変性させた。次いで0.5Mジチオトレイトール（DTT）20μlを添加し、変性したタンパク質を55℃で1時間加熱して還元した。50μlの0.5Mヨードアセトアミド（IAA）溶液を還元型IgGに添加し、室温の暗所で30分間インキュベートして、還元型IgGをアルキル化した。
70μlの還元・アルキル化されたIgGを別のチューブにピペットで移し、磁気ビーズ上に固定化された耐熱性サーモリシンの50μl懸濁液を添加した。混合物を70℃又は85℃でそれぞれ0.5時間、1時間及び2時間加熱した。磁石を用いて、固定化されたサーモリシンを蓄積し、変性及び消化工程の後に回収した。次いで、消化されたペプチドを、LC-MS又は電気泳動分析のために回収した。反応は1.5mLチューブ中で実施し、ブロックヒーター浴を加熱及び撹拌のために使用した。
その結果、図５に示すように、いずれの温度条件下でも、30分間（0.5時間）加熱することにより、80％以上の消化率が得られた。
その結果、図５に示すように、いずれの温度条件下でも、30分間（0.5時間）加熱することにより、80％以上の消化率が得られた。
［比較例２］
比較例として、タンパク質の熱変性、続いて還元及びアルキル化を行った後、固定化非耐熱性トリプシンによる高温での酵素消化を行った。
比較例として、タンパク質の熱変性、続いて還元及びアルキル化を行った後、固定化非耐熱性トリプシンによる高温での酵素消化を行った。
ヒトIgGを50mM ABC緩衝液で希釈して、7.5mg/mL IgG溶液を形成した。100μlのIgG溶液を別のチューブにピペットで入れ、75℃で30分間加熱してタンパク質を変性させた。次いで0.5Mジチオトレイトール（DTT）20μlを添加し、変性したタンパク質を55℃で1時間加熱して還元した。50μlの0.5Mヨードアセトアミド（IAA）溶液を還元型IgGに添加し、室温の暗所で30分間インキュベートして、還元型IgGをアルキル化した。
70μlの還元・アルキル化されたIgGを別のチューブにピペットで移し、磁気ビーズ上に固定化されたトリプシンの50μl懸濁液を添加した。混合物を70℃又は85℃でそれぞれ0.5時間、1時間及び2時間加熱した。磁石を用いて、固定化されたトリプシンを蓄積し、変性及び消化工程の後に回収した。次いで、消化されたペプチドを、LC-MS又は電気泳動分析のために回収した。反応は1.5mLチューブ中で実施し、ブロックヒーター浴を加熱及び撹拌のために使用した。
その結果、図６に示すように、いずれの温度条件下でも、２時間までの加熱で消化率は20％以下であった。
その結果、図６に示すように、いずれの温度条件下でも、２時間までの加熱で消化率は20％以下であった。
本発明により、LC、LC-MS、及び電気泳動による分析のためのサンプルを、従来よりも迅速かつ簡便に安価で提供することができるため、本発明の方法は、タンパク質含有検体の分析を必要とする多くの分野において幅広く適用することができる。
Claims (8)
- タンパク質を含む検体の前処理方法であって、タンパク質の変性と、基質に固定化された耐熱性酵素を用いるタンパク質の消化とを同時に行う工程と、消化されたペプチドを回収する工程とを含む、前記方法。
- 検体を55～100℃で1分間～4時間加熱することによってタンパク質を変性させる、請求項１に記載の方法。
- 前記基質が、磁性ビーズ、シリカビーズ、金属ビーズ、樹脂ビーズ及び多糖類ビーズからなる群より選択されるものである、請求項１又は２に記載の方法。
- 固定化された耐熱性酵素を消化されたペプチドと分離して回収する工程を更に含み、該工程が、自然沈降、遠心分離、磁気的蓄積、超音波による捕捉、濾過、及び膜分離からなる群より選択される方法を用いて実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 固定化された耐熱性酵素を再利用する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- LC、LC-MS又は電気泳動による分析のための前処理方法である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 固定化耐熱性酵素で未還元又は未変性タンパク質を消化することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記耐熱性酵素が、サーモリシン、カルドリシン、サーミターゼ、プロテイナーゼKを含む天然又は修飾酵素の群から選択される、請求項１に記載の方法。
Priority Applications (2)
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| JP2022024440A JP2023121226A (ja) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | 検体の前処理方法及びその応用 |
| PCT/JP2022/046771 WO2023157457A1 (ja) | 2022-02-21 | 2022-12-20 | 検体の前処理方法及びその応用 |
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| JP2022024440A JP2023121226A (ja) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | 検体の前処理方法及びその応用 |
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Family Applications (1)
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| JP2022024440A Pending JP2023121226A (ja) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | 検体の前処理方法及びその応用 |
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2022
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| Publication number | Publication date |
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| WO2023157457A1 (ja) | 2023-08-24 |
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