JP2023107234A - 単一粒子局在顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】単一の粒子の位置特定を行うことのできる顕微鏡を提供する。【解決手段】単一粒子局在顕微鏡１００は、試料領域内に位置する単一粒子に検出光を放出させるように適応化された照明光の空間的に異なる分布を有する光パターンのシーケンスを用いて、試料領域を照明する光学システム１０２と、照明光パターンのシーケンスに応答して試料領域から出射する検出光の強度のシーケンスを検出する検出器１１６と、検出光の強度のシーケンスに基づいて試料領域内の粒子の位置特定を行うための潜在的位置の配置を決定するプロセッサ１３２と、を備える。プロセッサは、光学システムに、特定の空間分布を有する後続の光パターンを用いて試料領域を照明させ、検出器に、後続の光パターンに応答して試料領域から出射する検出光の後続の強度を検出させ、検出光の後続の強度に基づいて複数の潜在的位置のうちのいずれが試料領域内の粒子の実際の位置を表すかを判定する。【選択図】図１

Description

本発明は、試料領域内の単一粒子の位置特定を行うための単一粒子局在顕微鏡および方法に関する。

光学顕微鏡法の分野では、回折解像限界未満の精度で個々の粒子の位置特定を可能にする方法が利用可能となっている。これらの方法は、拡散粒子の単一粒子追跡および超解像撮像に使用することができる。

例えば、超解像蛍光撮像の技術は、偏光ビームが二軸性結晶を通して回折する際に生じる円錐回折に基づいている。この技術に基づく方法は、円錐回折顕微鏡検査法（ＣＯＤＩＭ：Conical Diffraction Microscopy）、種々のトポロジによる強度の射影シーケンス（ＰＳＩＴ：Projected Sequence of Intensities with various Topologies）を含む円錐回折を用いた超解像（ＳＲＣＤ：Super-Resolution using Conical Diffraction）、および位置依存性光学セマフォ（ＰＤＯＳ：Position Dependent Optical Semaphore）などの略語によって知られている。これらの方法によれば、単一の蛍光エミッタは、光パターンのシーケンスを用いてエミッタを順次に照明し、各光パターンでの照明中に放出される光の強度を測定し、測定された光強度の集合に適合するエミッタ位置を計算することによって、位置特定を行うことができる。

上記で説明した方法は、国際公開第２０１２／０４９３８１号、国際公開第２０１３／１５３２９４号および国際公開第２０１９／０４３４５８号に開示されている。さらに、Julien Caron et al., Conical diffraction illumination opens the way for low phototoxicity super-resolution imaging, Cell Adhesion & Migration (2014), pages 430 - 439, DOI:10.4161/cam.29358、Clement Fallet et al., Conical diffraction as a versatile building block to implement new imaging modalities for superresolution in fluorescence microscopy, Nanoimaging and Nanospectroscopy II (2014), Proc.of SPIE Vol.9169, 916905およびFrancisco Balzarotti et al., Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes, Science (2016), DOI 10.1126/science.aak9913.の刊行物が参照される。後者の刊行物に記載されているように、最小の光子束で粒子を追跡する方法は、暗追跡と称されることが多い。このカテゴリはまた、一般にＭＩＮＦＬＵＸとして公知であり、国際公開第２０１３／０７２２７３号、国際公開第２０１８／０６９２８３号、国際公開第２０１５／０９７０００号および国際公開第２０１７／１５３４３０号に開示されるアプローチも含まれる。

上述した方法は、粒子位置の位置特定に関してアンビギュイティ（ambiguity）の不確実性に悩まされており、この不確実性はこれまで考慮されたことはなかった。したがって、照明光パターンのシーケンスに応答して測定された光強度のシーケンスに基づいてエミッタ位置を計算する場合、対称性の理由から、測定された光強度に等しく一致する複数の潜在的なエミッタ位置が決定され、これらの位置のうちのどの位置が実際のエミッタ位置を表すかは不明である。

これまでのところ、このアンビギュイティの問題に対する効率的な解決手段は存在していない。複数の潜在的位置のうちの１つにおいて位置特定による測定シーケンスを単に繰り返して、この位置が実際のエミッタ位置であるか否かを調べることも考えられる。しかしながら、かかる解決手段は、複雑な測定シーケンスの繰り返しのために時間がかかる。特に、照明光を選択された潜在的位置に再度配向するために、走査ミラーなどの光学走査デバイスをゆっくりと移動させる必要がある。かかる走査デバイスの機械的移動は、特に円錐回折などの電気光学効果または音響光学効果を使用することによって照明光パターンを変化させるのに必要な短時間と比較して、相当の時間を要する。さらに、機械的な公差が測定精度に影響を及ぼす可能性がある。さらに、この簡単な解決手段は、測定シーケンスを繰り返すために改竄によって誤った潜在的位置が選択された場合、特に非効率的となる。最後に、粒子は測定のシーケンスを完了するために十分な光を放出する必要があるため、光子収支の点で好ましくない。

したがって、本発明の目的は、明確にかつ効率的に試料領域において単一の粒子の位置特定を行うことのできる顕微鏡および方法を提供することである。

前述の目的は、独立請求項の主題によって達成される。有利な実施形態は、従属請求項および以下の説明において定義される。

単一粒子局在顕微鏡は、試料領域内に位置する単一粒子に検出光を放出させるように適応化された照明光の空間的に異なる分布を有する光パターンのシーケンスを用いて、試料領域を照明するように構成された光学システムを備える。単一粒子局在顕微鏡は、照明光パターンのシーケンスに応答して、試料領域から出射される検出光の強度のシーケンスを検出するように構成された検出器を備える。単一粒子局在顕微鏡は、検出光の強度のシーケンスに基づいて、試料領域内の粒子の位置特定を行うための潜在的位置の配置を決定するように構成されたプロセッサを備える。プロセッサは、光学システムに、複数の潜在的位置の配置に対して非対称である照明光の空間分布を有する少なくとも１つの後続の光パターンを用いて、試料領域を照明させるようにさらに構成されている。プロセッサは、検出器に、少なくとも１つの後続の光パターンに応答して、試料領域から出射する検出光の少なくとも１つの後続の強度を検出させるように構成されている。プロセッサは、検出光の少なくとも１つの後続の強度に基づいて、複数の潜在的位置のうちのいずれが試料領域内の粒子の実際の位置を表すかを判定するように構成されている。

本明細書で提案される顕微鏡は、複数の強度測定のシーケンスにおいて適用される照明光パターンの対称性により、別の手法では区別できない複数の粒子位置を区別するように適応化されており、これにより、複数の粒子位置が区別されることになる。照明光パターンの対称性は、限定するものではないが、前述の円錐回折ベースの方法などの一部の超解像位置特定アプローチにおいて生じる。また、前述のＭＩＮＦＬＵＸ法も、単一粒子の位置特定を行うために光対称パターンを用いて動作させることができる。これらの方法の全てにおいて、試料を順次に照明する光パターンの対称性により、対称な光パターンのシーケンスに応答して測定される検出光強度のシーケンスに、１つだけでなく、等しく一致する複数の位置が得られる。複数の潜在的な粒子位置間の区別は、位置特定のアンビギュイティを解決するためのテストパターンとして使用される少なくとも１つの追加の照明光パターンを用いて試料を照明することによって達成できる。この目的のために、テストパターンの空間分布は、当該パターンが先に計算された粒子位置から生じる配置に対して非対称な形状を有するように選択される。

提案される解決手段は、１回の測定を追加するのみで実現することができる。さらに、レーザー走査顕微鏡法において典型的に使用される走査ミラーなどの走査デバイスのいかなる機械的な再配置も必要としない。その結果、高速で光効率のよい位置特定を達成することができる。

例えば、光学システムは、前述した走査ミラーなど、試料上で照明光を走査するために移動可能な機械的走査デバイスを備えることができる。これにより、試料中の個々の点を走査し、撮像することができる。各点は、特定の試料領域に対応しており、当該試料領域は、光学システムの焦点領域と一致し、顕微鏡によって位置特定される単一のエミッタを含む。かかる構成では、プロセッサは、この目的のために走査デバイスを使用することなく、非対称テストパターンを形成する少なくとも１つの後続の光パターンを用いて特定の試料領域を照明することを光学システムに行わせることができ、これにより、機械的再配置を行う必要がなくなる。

特に、走査デバイスの物理的な、したがって低速の移動と、特定の潜在的位置に対する複数の測定シーケンスの繰り返しと、を伴う好ましくない手段は、その特定の位置が真の粒子位置ではなく改竄の状況を反映している場合、特に非効率的である。対照的に、提案される解決手段では、検証および改竄の状況を明確に区別することが可能である。

異なる光パターンは、区別すべき潜在的な粒子位置に関して同様のアンビギュイティをもたらしうる。本発明の解決手段は、その対称性のためにアンビギュイティを引き起こすあらゆる種類の光パターンに適用することができる。これにより、特定の状況に対して非対称なテストパターンを採用することができる。

テストパターンを用いた追加の強度測定は、位置特定プロセスの精度を高めるために使用することもできる。換言すれば、追加の測定は、アンビギュイティの識別に限定されるものではない。

さらに、テストパターンに基づく追加の強度測定は、テスト測定に先行する測定と比較して、時間を短縮し、かつ／またはテストパターンの照明強度を低減することができる。満たすべき唯一の条件は、テスト測定によって提供される検出信号が正しい粒子位置と誤った粒子位置との間の明確な区別を可能にする程度に十分に高いことである。

以下では、単一粒子は、例えば、単純な分子、タンパク質、特に蛍光分子およびタンパク質などを含む広い意味で理解される。ナノ粒子、小胞－脂質液滴などのより複雑な粒子も同様であり、しかもこれらに限定されない。

好ましくは、光学システムは、試料領域を照明するための光パターンのシーケンスおよび少なくとも１つの後続の光パターンの両方を生成するように構成された電気光学デバイスまたは音響光学デバイスを備える。例えば、照明光を所定の空間分布を有する光パターンに順次に整形するために、円錐回折の原理に従って作動されるビーム整形ユニットを使用することができる。これは、潜在的な粒子位置の計算の基礎となる対称光パターンと、真の粒子位置を偽の位置から区別することのみを可能にする非対称形状を有する、後に照射されるテストパターンと、の両方に当てはまる。かかる電気光学デバイスまたは音響光学デバイスは、走査ミラーなどの構成要素の機械的再配置が要求される走査デバイスと比較して、高速で動作することができる。したがって、光学システムが試料上で照明光を走査するために移動される走査デバイスを備える場合、可能であれば照明光パターンの全て、または少なくともテストパターンを生成するのは、機械的走査デバイスではなく、電気光学デバイスまたは音響光学デバイスであることが好ましい。

好ましい実施形態によれば、光学システムは、試料領域において照明光から光分布を形成し、試料領域において光パターンのシーケンスを生成するために光分布を移動させるように構成される。機械的な調整を必要としない光分布の高速な電気光学的移動は、例えば上述したような円錐回折によって達成することができる。

例えば、光学システムは、試料領域内に光パターンのシーケンスを生成するために、光分布を光伝搬方向に対して横方向に２つの異なるシフト位置へ順次にシフトさせ、かつ／または光分布を光伝搬方向に対して平行な中心軸線を中心として異なる回転位置へ順次に回転させるように構成されうる。

光分布は、渦巻き形状またはドーナツ形状でありうる。かかる光分布は、例えば、ＭＩＮＦＬＵＸアプローチを用いた位置特定において実現されうる。

好ましくは、光分布は、少なくとも２つの強度最大値であって、当該強度最大値間に延在する中心対称軸線から対称に対向する少なくとも２つの強度最大値と、中心対称軸線に沿った強度最小値と、を含み、当該強度最小値は好ましくは０である。かかる構成により、本明細書で提案される非対称照明テストパターンを適用する際に真と偽とを確実に区別することが可能な少なくとも２つの潜在的な粒子位置が得られる。

プロセッサは、検出光の強度のシーケンスに基づいて、試料領域内の粒子の位置特定を行うための複数の潜在的位置を表す複数の極値の空間確率分布を決定するように構成されうる。かかる空間確率分布は、最初に潜在的な粒子位置のセットを調べるために効率的な方法で使用することができ、次いで、その位置が非対称テストパターンによって正しいまたは正しくないに分類される。

好ましくは、プロセッサは、検出された強度のシーケンスに応じて、予め計算されたテーブルから空間確率分布を決定するように構成されうる。これにより、特に、高速で正確な粒子位置の決定が可能となる。

プロセッサは、空間確率分布に基づいて、複数の潜在的位置がそれに沿って位置する対称線を決定することと、後続の光パターンの空間分布を対称線に対して非対称であるように定義することと、を行うように構成されうる。かかる対称線を参照することにより、テストパターンに適した非対称な光分布を見つけることが容易かつ効率的になる。

好ましい実施形態によれば、プロセッサは、後続の光パターンを用いて試料領域を照明する前に、検出された強度のシーケンスに基づいて検出光の後続の強度を推定することと、試料領域内の粒子の実際の位置を判定するために、推定された後続の強度と検出された後続の強度とを比較することと、を行うように構成される。例えば、推定された強度値は、潜在的な粒子位置の各々に対して予め計算されていてよい。次いで、当該推定された強度値を、テストパターンを形成する後続の光パターンによる照明に応答して測定される検出光強度と容易に比較することができる。

好ましくは、検出器は、検出光の強度のシーケンスおよび後続の強度の両方を検出するために単一光子を計数するように構成される。単一光子カウンタを用いることにより、検出光強度を高精度に測定することができる。

別の態様によれば、試料領域内の単一粒子の位置特定を行うための方法が提供され、当該方法は、試料領域内に位置する粒子に検出光を放出させるように適応化された照明光の空間的に異なる分布を有する光パターンのシーケンスを用いて、試料領域を照明するステップと、照明光パターンのシーケンスに応答して、試料領域から出射する検出光の強度のシーケンスを検出するステップと、検出光の強度のシーケンスに基づいて、試料領域内の粒子の位置特定を行うための潜在的位置の配置を決定するステップと、を含む。試料領域は、複数の潜在的位置の配置に対して非対称である照明光の空間分布を有する少なくとも１つの後続の光パターンを用いて照明される。少なくとも１つの後続の光パターンに応答して、試料領域から出射する検出光の少なくとも１つの後続の強度が検出される。検出光の少なくとも１つの後続の強度に基づいて、複数の潜在的位置のうちのいずれが試料領域内の粒子の実際の位置を表すかの判定が行われる。

好ましくは、試料領域は、１つの粒子のみが試料領域内に位置する単一粒子局在条件を満たすように準備される。前述の条件により、試料に含まれる粒子間の平均距離が光学システムの回折限界空間分解能よりも大きいことを保証する特異化（singularization）が規定される。

単一粒子局在条件は、例えば、意図した特異化の達成のために十分に低い粒子濃度を選択することによって満たされうる。

代替的に、単一粒子局在条件は、粒子の大部分を非発光状態に保つための、粒子の光活性化または光不活性化によって満たされうる。

以下、図面を参照して具体的な実施形態を説明する。

一実施形態による単一粒子局在顕微鏡を示すブロック図である。 一実施形態による、単一の蛍光エミッタの位置特定を行うための異なる空間分布を有する光パターンに基づく３つの強度測定のシーケンスを示す図である。 図２に示される３つの光パターンの対称性を示す図である。 対称線に沿って配置された複数の潜在的なエミッタ位置を示す空間確率分布を示す図である。 一実施形態による、複数の潜在的なエミッタ位置に対して非対称な空間分布を有する光パターンに基づく第４の強度測定を示す図である。 第４の測定に基づく正しいエミッタ位置の判定を示す図である。 一実施形態による単一の蛍光エミッタの位置特定を行うための方法を示すフロー図である。

図１は、一実施形態による単一粒子局在顕微鏡１００を示すブロック図である。顕微鏡１００は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ：Laser Scanning Confocal Microscope）に基づく構成として実現可能であるが、これに限定されない。図１は、本明細書で提示される解決手段の動作方式を理解するのに有用な顕微鏡１００の構成要素のみを示している。言うまでもなく、顕微鏡１００は、図１のブロック図に明示的に示されていない追加の構成要素を含むことができる。例えば、図１には示されていないが、顕微鏡１００は、照明および検出の両方に使用されるチューブレンズおよび対物レンズなどの光学レンズ、ならびに共焦点設定に従って画像形成における焦点外光の量を低減する働きをするピンホールを含むことができる。

顕微鏡１００は、試料キャリア１０６上に配置された試料１０４を照明する光学システム１０２を備える。光学システム１０２は、試料１０４に含まれる蛍光体を励起して検出光１１２として蛍光放射を放出させるべく適応化された波長範囲の照明光１１０を生成するように構成されたレーザー光源１０８を含む。光学システム１０２は、照明光１１０を試料１０４上へ反射させ、検出光１１２を検出器１１６に向けて透過させるように構成されたダイクロイックビームスプリッタ１１４を備えることができる。光学システム１０２は、試料１０４上で照明光１１０を走査するために移動可能なミラーアセンブリなどの走査デバイス１１８をさらに含むことができる。これにより、試料１０４内の個々の点を走査し、撮像することができる。各点は、特定の試料領域１２０に対応しており、当該試料領域１２０は、光学システム１０２の焦点領域と一致し、顕微鏡１００によって位置特定される単一の蛍光エミッタ１２２を含む。検出光１１２は、検出器１１６によって捕捉される前に走査デバイス１１８へ戻されるので、図１に示されている実施形態は、いわゆるデスキャン型コンフィグレーションである。

光学システム１０２は、空間的に異なる光分布を有する光パターンのシーケンス１２４を用いて試料領域１２０を照明するように構成されている。この目的のために、光学システム１０２は、光源１０８から放出された照明光１１０のビーム順次整形を実行するように構成された電気光学デバイスまたは音響光学光学デバイスを備えることができる。図１に示されている特定の実施形態によれば、光学システム１０２は、例えば上述したCarot et al．の刊行物に記載されているように、照明光１１０を順次に所定の光パターンに整形するために円錐回折の原理に従って動作するビーム整形ユニット１２６を備える。したがって、ビーム整形ユニット１２６は、二軸性結晶、偏光状態発生器（ＰＳＧ）および偏光状態分析器（ＰＳＡ）を含むことができる。ＰＳＧは、二軸性結晶の入口１２８および出口１３０にそれぞれ配置された一対のポッケルスセルが後に続く直線偏光子からなる。ＰＳＡは、逆の順序で同様に配置されている。全てのポッケルスセルは、電子的に制御され、ビーム整形ユニット１２６内の機械部品を移動させることなく偏光を制御することを可能にする。この光学セットアップは、非常に短い時間で、１つの光パターンから異なる光分布を有する別の光への切り替えを行うように適応化されている。特に、ビーム整形ユニット１２６の切り替え時間は、例えば、走査デバイス１１８がその機械的移動によって対応する方式で照明光１１０に作用するのに要する時間よりも数桁短いことに留意されたい。

顕微鏡１００は、顕微鏡動作を全体として制御するために使用されうるプロセッサ１３２をさらに含む。本実施形態によれば、プロセッサ１３２は、以下で説明するように、光源１０８、ビーム整形ユニット１２６、走査デバイス１１８および検出器１１６を具体的に制御して、単一のエミッタ１２２が試料領域１２０内で明確に位置特定されることを可能にする。

特に、プロセッサ１３２は、ビーム整形ユニット１２６に、図２に示されているような異なるトポロジを有する光パターンのシーケンスを用いて試料領域１２０を照明させることができる。本実施形態によれば、図２の上から下に示されているように、第１の光パターン１２４－１、第２の光パターン１２４－２および第３の光パターン１２４－３が順次に生成される。試料領域１２０が光パターン１２４－１、１２４－２および１２４－３を用いて順次に照明されると、検出器１１６は、試料領域１２０から出射する検出光１１２を、対応する光強度のシーケンスＩ１、Ｉ２およびＩ３で捕捉する。この目的のために、検出器１１６は、強度のシーケンスＩ１、Ｉ２、Ｉ３を検出する際に単一光子を計数するように構成されうる。したがって、強度Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３を検出するための３つの強度測定の１つのシーケンスは、それぞれの光子計数を表す３倍の整数（ｍ１，ｍ２，ｍ３）をもたらす。

図２の例において、３つの光パターン１２４－１、１２４－２および１２４－３の各々は、ダブルピークから形成される光分布として生成される。より具体的には、各光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３は、第１の強度最大値（ピーク）２３６－１、２３６－２、２３６－３および第２の強度最大値（ピーク）２３８－１、２３８－２、２３８－３を含み、第１および第２の強度最大値は、それぞれの光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の対称中心を形成する強度最小値２４０－１、２４０－２、２４０－３から対称に対向している。強度最小値２４０－１、２４０－２、２４０－３は、好ましくは０である。図２から見て取れるように、強度最小値２４０－１、２４０－２、２４０－３によって与えられる３つの光パターン１２４－１、１２４－２および１２４－３の対称中心は、互いに一致する。換言すれば、光パターン１２４－１、１２４－２および１２４－３が３つの強度測定のシーケンスにおいて１つのパターンから別のパターンに切り替えられても、対称中心は変化しない。

図２は、照明光１１０が伝搬する方向に対して垂直な断面における各光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３を示す平面図であることに留意されたい。したがって、それぞれの光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の強度最小値２４０－１、２４０－２、２４０－３は、光伝搬方向に沿って延在する対称軸線を規定する。図２は、各光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の光強度の空間的変動を示す簡略化された図であることにさらに留意されたい。したがって、図２は、各光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３を、その２つの強度最大値２３６－１／２３８－１、２３６－２／２３８－２、２３６－３／２３８－３がその間の強度最小値から鋭く分離された状態で示しているが、各強度ピークは、実際には、それぞれの対称中心２４０－１、２４０－２、２４０－３におけるその最大値から最小値への強度の連続的な減少によって特徴付けられる。

全体として、ビーム整形ユニット１２６によって光パターンのシーケンス１２４－１、１２４－２、１２４－３を生成するプロセスは、構造化された光分布を提供し、この光分布を試料領域１２０内でその形状自体を変化させることなく移動させるプロセスと見なすことができる。図２に示されている実施形態によれば、２つのピークとその間の強度最小値とによって形成される構造化された光分布は、全体として、強度最小値と一致する対称中心を中心として１２０°の角度だけ回転される。ただし、かかる構成は、一例としてのみ理解されるべきである。例えば、渦巻き形状またはドーナツ形状の分布のような構造化された光分布は、試料領域１２０において異なる光パターンのシーケンスを生成するために、その位置において全体としてシフトされることがある。さらに、光パターンのシーケンスを生成するために、他のタイプの構造化された照明光分布および／または異なるもしくはより複雑なシーケンスが使用されてもよい。

図２に示されているような光パターンのシーケンスに基づいて単一の蛍光エミッタの位置特定を可能にするために、特異化条件を満たす必要がある。したがって、超解像位置特定プロセスを実行する際には、光学システム１０２の焦点領域と一致する光学システム１０２の試料領域１２０内に１つの粒子のみが存在することを保証すべきである。特異化条件は、試料１０４を適切に準備するための種々の方法を適用することによって満たすことができる。例えば、試料１０４は、試料１０４に含まれる蛍光エミッタの適切な濃度を選択することによって準備されてもよい。代替的に、関与する粒子の性質に応じて、粒子の大部分を非発光状態に保つための光活性化または光不活性化が適用されてもよい。いずれの場合も、蛍光エミッタの濃度は、エミッタ間の平均距離が光学システム１０２の回折限界空間分解能より大きいことが保証されるように、試料１０４内のまばらなエミッタ分布を達成するために十分に低くすべきである。かかるエミッタの特異化が達成された場合、光学システム１０２の回折限界空間分解能によって決定される光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の空間寸法よりもはるかに高い空間精度で、試料領域１２０内の単一のエミッタ１２２の位置特定が可能となる。

以下では、上記で説明したように蛍光エミッタ１２２が試料領域１２０内で特異化されると仮定する。次に、試料領域１２０を照明する光パターンのシーケンス１２４－１、１２４－２、１２４－３に応答して検出された強度のシーケンスＩ１、Ｉ２、Ｉ３に基づいて、試料領域１２０内の蛍光エミッタ１２２の位置特定の試みが可能となる。これは、ビーム整形ユニット１２６によって制御される光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の空間分布の正確な知識によって行うことができる。強度Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３がノイズなしで測定され、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３が公差なしで既知であると仮定すると、蛍光エミッタ１２２の位置を無限の精度で計算可能であると結論付けることができる。換言すれば、位置特定の精度は、強度Ｉ１、Ｉ２およびＩ３をそれぞれ測定する際に発生するノイズΔＩ１、ΔＩ２およびΔＩ３と、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の不完全性と、によってのみ制限されると見なすことができる。しかしながら、図３～図６を参照して以下に説明するように、測定された強度Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３および光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の先験的知識に基づいて計算可能なエミッタ位置に関して、アンビギュイティが生じる。

図３および図４に示されているように、したがって、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の空間光分布の対称性に起因して、蛍光エミッタ１２２の複数の潜在的位置が検出された強度トリプル（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に等しく一致するというアンビギュイティが生じる。本例によれば、各光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３は、２つのピーク、すなわち光パターンの強度最大値２３６－１／２３８－１、２３６－２／２３８－２、２３６－３／２３８－３の間に延在する軸線Ｍに対して、鏡面対称を示している（図２を参照）。説明を簡単にするために、ミラー軸線Ｍは、図３の上部の第１の光パターン１２４－１についてのみ示されている。それぞれの光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の鏡面対称は、図３に示されているような２つの点によって規定される対称線３４２をもたらす。これらの点のうちの第１の点は、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の対称中心、すなわち、光パターンの２つのピーク間の強度最小値２４０－１、２４０－２、２４０－３によって与えられる。第２の点は、蛍光エミッタ１２２の真の位置によって与えられる。

図４は、測定誤差ΔＩ１、ΔＩ２、ΔＩ３および事前に既知の光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の空間分布を考慮した、強度Ｉ１±ΔＩ１、Ｉ２±ΔＩ２、Ｉ３±ΔＩ３に基づいてプロセッサ１３２によって計算される空間確率分布４４４を表すマップを示している。空間確率分布４４４は、トリプル測定（Ｉ１±ΔＩ１，Ｉ２±ΔＩ２，Ｉ３±ΔＩ３）に適合する潜在的なエミッタ位置を示す複数の領域を含む。図４から見て取れるように、２つの潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂが存在しており、これらは、図４においてＣで示されている前述の対称中心（第１の点）から対称に対向する対称線３４２上に位置している。したがって、潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂは、対称線３４２の中心Ｃに対して鏡面対称である。潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂの鏡面対称は、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の鏡面対称を反映している。図４の例では、２つの潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂがエアリーディスク（Airy disk）４５０内に位置すると仮定される。

図４からさらに見て取れるように、エアリーディスク４５０の外側に、その前述の対称中心から対称に対向する対称線３４２上に配置された２つの追加のエミッタ位置４４８ａ、４４８ｂが存在する。また、潜在的なエミッタ位置４４８ａ、４４８ｂは、対称線３４２の中心Ｃに対して鏡面対称であり、潜在的なエミッタ位置４４８ａ、４４８ｂの鏡面対称は、同様に、光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３の鏡面対称を反映している。

したがって、図４に示されている例によれば、２対の潜在的なエミッタ位置４４６ａ／４４６ｂおよび４４８ａ／４４８ｂが計算され、各対のエミッタ位置は、測定された強度トリプル（Ｉ１±ΔＩ１，Ｉ２±ΔＩ２，Ｉ３±ΔＩ３）に等しく一致する。実験の特定の状況に応じて、２つの位置の対４４６ａ／４４６ｂおよび４４８ａ／４４８ｂのうちのいずれがエミッタ１２２の実際の位置を含むかを判定することが可能となりうる。例えば、検出経路内のピンホールによる検出光の抑制を用いて、図４の例における正しい位置として対４４８ａ／４４８ｂを除外することができる。なお、以下で明らかになるように、位置の対４４６ａ／４４６ｂと４４８ａ／４４８ｂとを区別する必要すらない。

いずれの場合も、空間確率分布４４４のみに基づいて、潜在的位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂのうちのどの位置が実際のエミッタ位置を表すかを判定することは可能ではない。したがって、光パターン１２４－１、１２４－２および１２４－３の対称性のために、測定された強度トリプル（Ｉ１±ΔＩ１，Ｉ２±ΔＩ２，Ｉ３±ΔＩ３）は、試料領域１２０内のエミッタ１２２の位置を明確に特定するのに十分ではない。

上記で説明した問題を解決するために、本明細書では、複数の潜在的なエミッタ位置に関するアンビギュイティを解決するための最終測定を実行するためのテストパターンとして使用される少なくとも１つの後続の光パターンを用いて試料領域１０４を照明することを提案する。より具体的には、テストパターンは、強度トリプル（Ｉ１±ΔＩ１，Ｉ２±ΔＩ２，Ｉ３±ΔＩ３）に基づいて先に計算された潜在的位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂの配置に対して非対称である所定の空間分布を用いて生成される。このテストパターンに応答して後続の検出光強度が検出され、これを用いて、複数の潜在的位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂのうちのいずれが正しいエミッタ位置であるかを判定することができる。

本実施形態によれば、後続の光パターンの形状および／または向きは、図４に示されている推定確率分布４４４に従って決定されうる。好ましくは、正確なエミッタ位置と誤った位置との間の検出光強度の差を最大にする非対称光パターンが使用される。図５の下部は、図２～図４に示した例に続く適切な非対称光パターン５２４を示している。図５から見て取れるように、後続の光パターン５２４は、先の光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３とは著しく異なる空間光分布を有する。例えば、光パターン５２４は、１つの強度最大値（ピーク）５３８のみを有しており、この最大値は、潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂの全てが沿って位置する対称線３４２から横方向に変位する。したがって、光パターン５２４の空間分布が、先に計算されたエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂの全体的な配置に対して非対称であることが保証される。これに関して、図５は、光パターン５２４の空間強度変化に関する簡略化された図であることにも留意されたい。光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３と同様に、光パターン５２４の強度は、実際には、その最大値から、好ましくは０である最小値までの強度の連続的な減少によって特徴付けられる。

図５の例では、後続の光パターン５２４は、その強度最大値が蛍光エミッタ１２２の近くに、すなわち正しいエミッタ位置であることが判明した位置４６６ａの近くに位置する。したがって、検出器１１６によって測定される後続の（第４の）強度Ｉ４±ΔＩ４は、比較的高いものとなる。後続の強度Ｉ４±ΔＩ４に基づいて、プロセッサ１３２は、エミッタ位置４４６ａが正しい一方で、４４６ｂ、４４８ａおよび４４８ｂなどの他の位置が誤っていると判定することが可能となる。

適切な判定を行うために、プロセッサ１３２は、光パターン５２４で試料領域１２０を照明する前に先に測定された強度トリプル（Ｉ１±ΔＩ１，Ｉ２±ΔＩ２，Ｉ３±ΔＩ３）に基づいて、後続の光パターン５２４での試料領域１２０の照明に応答して検出される後続の光強度Ｉ４±ΔＩ４の強度を推定するように構成することができる。例えば、本実施形態では、プロセッサ１３２は、蛍光エミッタ１２２が潜在的位置４４６ａまたは他の潜在的位置４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂのいずれかに位置する場合に検出されると予想される推定強度値を計算することができる。これらの推定された強度値を、光パターン５２４に応答して実際に測定された強度Ｉ４±ΔＩ４と比較することによって、プロセッサ１３２は、潜在的位置のうちのどの位置が正しいエミッタ位置であるかを判定することができる。図２～図６に示した例では、位置４４６ａについて推定された強度値は、他の位置４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂについて推定された強度値よりも著しく高い。実際に測定される強度Ｉ４±ΔＩ４は、比較的高い推定強度値に対応し、その結果、位置４４６ａが正しいエミッタ位置として認識される。換言すれば、他の潜在的なエミッタ位置４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂは、図６に十字記号で示されているように、誤った位置として確実に排除することができる。

図７は、一実施形態による顕微鏡１００を用いて蛍光エミッタ１２２を位置特定するための方法を示すフロー図である。

方法は、ステップＳ１から開始し、ステップＳ１では、試料１０４が上述した特異化条件を満たすように準備される。したがって、試料１０４は、検査される試料領域１２０内に１つの粒子のみが位置することが保証されるように準備される。

ステップＳ２において、プロセッサ１３２は、光源１０８および走査デバイス１１８を制御して、照明光１１０を試料１０４の特定の点へと配向する。この点は、光学システム１０２の焦点領域と一致し、位置特定すべき特異化されたエミッタ１２２を含む試料領域１２０を形成する。

ステップＳ３～Ｓ５において、プロセッサ１３２は、図２および図３に一例として示したように、空間的に異なる光分布を有する光パターンのシーケンス１２４－１、１２４－２、１２４－３を生成するようにビーム整形ユニット１２６を制御する。

より具体的には、ステップＳ３において、第１のダブルピーク光パターン１２４－１を用いて試料領域１２０を照明することによって第１の測定が実行される。これに応答して、単一光子カウンタとして構成された検出器１１６は、光パターン１２４－１を用いて照明された蛍光エミッタ１２２から放出された第１の光子数ｍ１を検出する。図２によれば、蛍光エミッタ１２２は、光パターン１２４－１の強度最大値２３６－１によって形成されるピークの周辺部分に位置し、例示的な数の１３個の光子が強度Ｉ１として計数されると仮定される（すなわち、ｍ１＝Ｉ１＝１３）。

続いて、ステップＳ４において、第２のダブルピーク光パターン１２４－２を用いて試料領域１２０を照明することによって第２の測定が実行される。これに応答して、検出器１１６は、第２の光パターン１２４－２を用いて照明された蛍光エミッタ１２２から放出された第２の光子数ｍ２を検出する。図２および図３によれば、蛍光エミッタ１２２は、第１の測定と比較して、第２の光パターン１２４－２によって形成される対称の強度最大値のうちの１つに若干近い位置にあると仮定され、その結果、１９などのより多くの数の光子が強度Ｉ２として計数されると仮定される（すなわち、ｍ２＝Ｉ２＝１９）。

続いて、ステップＳ５において、第３のダブルピーク光パターン１２４－３を用いて試料領域１２０を照明することによって第３の測定が実行される。これに応答して、検出器１１６は、第３の光パターン１２４－３を用いて照明された蛍光エミッタ１２２から放出された第３の数ｍ３の光子を検出する。図２および図３によれば、蛍光エミッタ１２２は、第１および第２の測定と比較して、第３の光パターン１２４－３によって形成される２つのピークの最大値から遠くに位置すると仮定される。したがって、１などの少数の光子が計数されると仮定される（すなわち、ｍ３＝Ｉ３＝１）。

ステップＳ６において、プロセッサ１３２は、この例では（１３，１９，１）に等しいトリプル強度（ｍ１，ｍ２，ｍ３）から空間確率分布４４４を決定することができる。空間確率分布４４４は、図４に示されているように、潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂを表す複数の極値を示す。空間確率分布４４４を計算するとき、プロセッサ１３２は、事前に既知の光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－４の特定の空間分布を考慮に入れる。例えば、空間確率分布４４４は、予め計算されたテーブルに基づいて決定することができる。

ステップＳ７において、プロセッサ１３２は、空間確率分布４４４に基づいて、図４に示されているように、全ての潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂが沿って位置する対称線３４２を決定することができる。次に、プロセッサ１３２は、対称線３４２に沿って位置する潜在的なエミッタ位置４４６ａ、４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂの配置に対して非対称である適切な照明光分布を定義することができる。

ステップＳ８において、プロセッサ１３２は、後続の第４の光パターンを用いて試料領域１２０を照明することに応答して予想される検出光強度を推定することができ、その非対称光分布はステップＳ７において決定されたものである。具体的には、プロセッサ１３２は、ステップＳ６で決定された複数の潜在的位置に関連する光子数の形態で複数の推定強度値を計算することができる。

ステップＳ９において、プロセッサ１３２は、第４の強度測定を実行するために、ビーム整形ユニット１２６に、ステップＳ７で決定された照明光１１０から非対称光分布を形成させる。試料領域１２０は、図５の下部に示されているように、光パターン５２４を用いて照明される。これに応答して、検出器１１６は、光パターン５２４を用いて照明された蛍光エミッタ１２２から放出された第４の光子数ｍ４を検出する。

ステップＳ１０において、プロセッサ１３２は、光子数ｍ４をステップＳ８において計算された推定光子数と比較する。本例では、光子数ｍ４は、エミッタ位置４４６ａに対して先に推定された光子数に近いと仮定される。対照的に、ｍ４は、他の潜在的位置４４６ｂ、４４８ａ、４４８ｂについて推定された光子数とは著しく異なる。結果として、プロセッサは、蛍光エミッタ１２２が位置４４６ａに位置すると決定する。

潜在的なエミッタ位置に関するアンビギュイティを解決するための上述したような後続の強度測定は、非常に高速に実行することができることに留意されたい。したがって、図５に示されている光パターン５２４などのテストパターンは、ビーム整形ユニット１２６によって生成することができ、当該ビーム整形ユニット１２６は、電気光学デバイスまたは音響光学デバイスによって実現することができるが、これらに限定されない。かかるデバイスは、図１に示されている走査デバイス１１８のような他のタイプのビーム影響構成要素とは異なり、機械部品のいかなる物理的移動も必要としない。さらに、テストパターンの光分布は、潜在的なエミッタ位置の配置に対して非対称であるので、潜在的なエミッタ位置の１つについて測定の完全なシーケンスを繰り返すのではなく、アンビギュイティを解決するために１つの追加のテスト測定のみを実行することで十分でありうる。

本明細書で提案されるアンビギュイティの確認は、上述した実施形態に限定されない。例えば、図５に示されているような光パターン１２４－１、１２４－２、１２４－３および後続の光パターン５２４は、円錐回折を適用することによって生成される。さらに、光パターンは、パターンの中心に位置する強度最小値から対称に対向する２つの強度ピークを含む構造化された光分布の形態で生成される。しかしながら、例えばＭＩＮＦＬＵＸにおいて実現されている、位置がシフトされる渦巻き形状またはドーナツ形状のパターンのような他のタイプの光分布が実現されてもよい。

本明細書で使用されるように、用語「および／または（かつ／または）」は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数の項目のあらゆる全ての組み合わせを含んでおり、「／」として略記されることがある。

いくつかの態様を装置の文脈において説明してきたが、これらの態様が、対応する方法の説明も表していることが明らかであり、ここではブロックまたは装置がステップまたはステップの特徴に対応している。同様に、ステップの文脈において説明された態様は、対応する装置の対応するブロックまたは項目または特徴の説明も表している。

１００ 単一粒子局在顕微鏡
１０２ 光学システム
１０４ 試料
１０６ 試料キャリア
１０８ 光源
１１０ 照明光
１１２ 検出光
１１４ ダイクロイックビームスプリッタ
１１６ 検出器
１１８ 走査デバイス
１２０ 試料領域
１２２ 蛍光エミッタ
１２４ 光パターンのシーケンス
１２４－１ 光パターン
１２４－２ 光パターン
１２４－３ 光パターン
１２６ ビーム整形ユニット
１２８ 二軸性結晶の入口
１３０ 二軸性結晶の出口
１３２ プロセッサ
２３６－１ 光パターンの強度最大値
２３６－２ 光パターンの強度最大値
２３６－３ 光パターンの強度最大値
２３８－１ 光パターンの強度最大値
２３８－２ 光パターンの強度最大値
２３８－３ 光パターンの強度最大値
２４０－１ 光パターンの強度最小値
２４０－２ 光パターンの強度最小値
２４０－３ 光パターンの強度最小値
３４２ 対称線
４４４ 空間確率分布
４４６ａ 潜在的位置
４４６ｂ 潜在的位置
４４８ａ 潜在的位置
４４８ｂ 潜在的位置
４５０ エアリーディスク
５２４ 後続の光パターン

Claims (15)

1. 単一粒子局在顕微鏡（１００）であって、前記単一粒子局在顕微鏡（１００）は、
   試料領域（１２０）内に位置する単一粒子（１２２）に検出光（１１２）を放出させるように適応化された照明光（１１０）の空間的に異なる分布を有する光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）を用いて、前記試料領域（１２０）を照明するように構成された光学システム（１０２）と、
   照明光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）に応答して、前記試料領域（１２０）から出射する検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）を検出するように構成された検出器（１１６）と、
   前記検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に基づいて、前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の位置特定を行うための潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）の配置を決定するように構成されたプロセッサ（１３２）と、
   を備え、
   前記プロセッサ（１３２）は、
   前記光学システム（１０２）に、複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）の配置に対して非対称である照明光（１１０）の空間分布を有する少なくとも１つの後続の光パターン（５２４）を用いて、前記試料領域（１２０）を照明させることと、
   前記検出器（１１６）に、前記少なくとも１つの後続の光パターン（５２４）に応答して、前記試料領域（１２０）から出射する検出光（１１２）の少なくとも１つの後続の強度（Ｉ４）を検出させることと、
   前記検出光（１１２）の少なくとも１つの後続の強度（Ｉ４）に基づいて、前記複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）のうちのいずれが前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の実際の位置を表すかを判定することと、
   を行うようにさらに構成されている、
   単一粒子局在顕微鏡（１００）。
2. 前記光学システム（１０２）は、前記試料領域（１２０）を照明するための前記光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）および前記少なくとも１つの後続の光パターン（５２４）の両方を生成するように構成された電気光学デバイスまたは音響光学デバイス（１２６）を備える、
   請求項１記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
3. 前記光学システム（１０２）は、前記試料領域（１２０）において照明光（１１０）から光分布を形成し、前記試料領域（１２０）において前記光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３；５２４）を生成するために前記光分布を移動させるように構成されている、
   請求項１または２記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
4. 前記光学システム（１０２）は、前記試料領域（１２０）内に前記光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）を生成するために、前記光分布を光伝搬方向に対して横方向に異なるシフト位置へ順次にシフトさせ、かつ／または、前記光分布を前記光伝搬方向に対して平行な中心軸線を中心として異なる回転位置へ順次に回転させるように構成されている、
   請求項３記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
5. 前記光分布は、渦巻き形状またはドーナツ形状である、
   請求項３または４記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
6. 前記光分布は、少なくとも２つの強度最大値（２３６－１，２３８－１；２３６－２，２３８－２；２３６－３，２３８－３）であって、前記強度最大値（２３６－１，２３８－１；２３６－２，２３８－２；２３６－３，２３８－３）間に延在する中心対称軸線から対称に対向する少なくとも２つの強度最大値（２３６－１，２３８－１；２３６－２，２３８－２；２３６－３，２３８－３）と、前記中心対称軸線に沿った強度最小値（２４０－１，２４０－２，２４０－３）と、を含み、前記強度最小値（２４０－１，２４０－２，２４０－３）は、好ましくは０である、
   請求項３または４記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
7. 前記プロセッサ（１３２）は、前記検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に基づいて、前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の位置特定を行うための複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）を表す複数の極値を有する空間確率分布（４４４）を決定するように構成されている、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
8. 前記プロセッサ（１３２）は、検出された前記強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に応じて、予め計算されたテーブルから前記空間確率分布（４４４）を決定するように構成されている、
   請求項７記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
9. 前記プロセッサ（１３２）は、前記空間確率分布（４４４）に基づいて、前記複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）のうちの少なくとも２つを含む対称線（３４２）を決定することと、前記後続の光パターン（５２４）の空間分布を前記対称線（３４２）に対して非対称であるように定義することと、を行うように構成されている、
   請求項７または８記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
10. 前記プロセッサ（１３２）は、前記後続の光パターン（５２４）を用いて前記試料領域（１２０）を照明する前に、検出された前記強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に基づいて検出光（１１２）の後続の強度（Ｉ４）を推定することと、前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の実際の位置を判定するために、推定された後続の強度と検出された後続の強度（Ｉ４）とを比較することと、を行うように構成されている、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
11. 前記検出器（１１６）は、前記検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）および前記後続の強度（Ｉ４）の両方を検出するために単一光子を計数するように構成されている、
    請求項１から１０までのいずれか１項記載の単一粒子局在顕微鏡（１００）。
12. 試料領域（１２０）内の単一粒子（１２２）の位置特定を行うための方法であって、前記方法は、
    前記試料領域（１２０）内に位置する粒子（１２２）に検出光（１１２）を放出させるように適応化された照明光（１１０）の空間的に異なる分布を有する光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）を用いて、前記試料領域（１２０）を照明するステップと、
    照明光パターンのシーケンス（１２４－１，１２４－２，１２４－３）に応答して、前記試料領域（１２０）から出射する検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）を検出するステップと、
    前記検出光（１１２）の強度のシーケンス（Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３）に基づいて、前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の位置特定を行うための潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）の配置を決定するステップと、
    を含み、
    前記試料領域（１２０）は、複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）の配置に対して非対称である照明光（１１０）の空間分布を有する少なくとも１つの後続の光パターン（５２４）を用いて照明され、
    前記少なくとも１つの後続の光パターン（５２４）に応答して、前記試料領域（１２０）から出射する検出光（１１２）の少なくとも１つの後続の強度（Ｉ４）が検出され、
    前記検出光（１１２）の少なくとも１つの後続の強度（Ｉ４）に基づいて、前記複数の潜在的位置（４４６ａ，４４６ｂ，４４８ａ，４４８ｂ）のうちのいずれが前記試料領域（１２０）内の粒子（１２２）の実際の位置を表すかの判定が行われる、
    方法。
13. 前記試料領域（１２０）は、１つの粒子（１２２）のみが前記試料領域（１２０）内に位置する単一粒子局在条件を満たすように準備される、
    請求項１２記載の方法。
14. 前記単一粒子局在条件は、適切な粒子濃度を選択することによって満たされる、
    請求項１３記載の方法。
15. 前記単一粒子局在条件は、粒子の大部分を非発光状態に保つための、粒子の光活性化または光不活性化によって満たされる、
    請求項１３記載の方法。