JP2023099265A - Molecular marker for discriminating clubroot resistance or susceptible chinese cabbage varieties based on high-density genetic map of chinese cabbage and uses thereof - Google Patents
Molecular marker for discriminating clubroot resistance or susceptible chinese cabbage varieties based on high-density genetic map of chinese cabbage and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023099265A JP2023099265A JP2022006431A JP2022006431A JP2023099265A JP 2023099265 A JP2023099265 A JP 2023099265A JP 2022006431 A JP2022006431 A JP 2022006431A JP 2022006431 A JP2022006431 A JP 2022006431A JP 2023099265 A JP2023099265 A JP 2023099265A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chinese cabbage
- clubroot
- seq
- plant
- resistance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 88
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 title claims abstract 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 244000221633 Brassica rapa subsp chinensis Species 0.000 description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 8
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 8
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 8
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 8
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 8
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 8
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 8
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 8
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 8
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 8
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 8
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 8
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 8
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 8
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 8
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 8
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 8
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 8
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 8
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 8
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 8
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 8
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 8
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 8
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 8
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 8
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 8
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 8
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 8
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 8
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 8
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 8
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241001503436 Plasmodiophora brassicae Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 5
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 5
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 5
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 4
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 101000706985 Pinus strobus Putative disease resistance protein PS10 Proteins 0.000 description 4
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 4
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 1
- 235000011332 Brassica juncea Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 235000007297 Gaultheria procumbens Nutrition 0.000 description 1
- 240000001238 Gaultheria procumbens Species 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150073872 ORF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000201976 Polycarpon Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 101150109085 TSA gene Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ハクサイの高密度遺伝子地図に基づいた根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ品種を区別するための分子マーカー及びその用途に関する。 The present invention relates to a molecular marker and its use for distinguishing clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage cultivars based on high-density genetic maps of Chinese cabbage.
根こぶ病(clubroot)は、根こぶ病菌(Plasmodiophorabrassicae)によって感染される土壌病であって、アブラナ科作物に大きな被害を与える。根こぶ病菌(P.brassicae)は、人工培地では栽培されない活物寄生菌であって、ハクサイだけではなく、キャベツ、大根、ブロッコリーなどほとんどのハクサイ科作物で発生しており、全世界的に大きな被害を与えている。根こぶ病菌は、病んだ組織（根こぶ）に数多くの休眠胞子を形成し、劣悪な環境で生存するか、越冬することになるが、該休眠胞子は、土壌において長くは、１５年間生存可能なので、根こぶ病は、防除するのに非常に困難な土壌病である。 Clubroot is a soil disease caused by the clubroot fungus (Plasmodiophorabrassicae), which causes great damage to cruciferous crops. Clubroot fungus (P. brassicae) is a live parasite fungus that cannot be cultivated in artificial media. doing damage. Knot fungus forms a large number of dormant spores in diseased tissues (knots) and survives in a poor environment or overwinters, but the dormant spores survive in the soil for up to 15 years. Because of this, clubroot is a very difficult soil disease to control.
韓国では、1928年京畿道で初めてハクサイ根こぶ病の発生が報告されており、毎年ハクサイの30～70%が被害を受けている。ハクサイ品種のほとんどは、ハクサイ根こぶ病菌のレース(race)特異的抵抗性を有しており、多数の種子会社は、ハクサイ根こぶ病菌の全てのレースに抵抗性を有する品種の開発に集中している。 In South Korea, the first outbreak of clubroot was reported in Gyeonggi-do in 1928, and 30-70% of Chinese cabbages are affected every year. Most of the Chinese cabbage cultivars have race-specific resistance to the Chinese cabbage clubroot, and many seed companies are concentrating on developing varieties that are resistant to all races of the Chinese cabbage clubroot. ing.
分子遺伝学的方法に基づいた染色体地図は、分子マーカーの位置と組換えの比率に基づいた遺伝子間の相対的な距離を決定可能にした。さらに、分子遺伝学的地図の構成は、地図基盤の遺伝子クローニング(map-based gene cloning), QTL(Quantitative Trait Loci)の発見を可能にし、MAS(Marker Assisted Selection)の位置を予測可能にした。 Chromosome maps based on molecular genetic methods have allowed the determination of relative distances between genes based on the location of molecular markers and the rate of recombination. Furthermore, the construction of molecular genetic maps enabled map-based gene cloning, QTL (Quantitative Trait Loci) discovery, and MAS (Marker Assisted Selection) location prediction.
一方、韓国登録特許第1560736号には、ハクサイ根こぶ病菌(Plasmodiophora brassicae)のＴＳＡ遺伝子に基づいた「ハクサイ根こぶ病診断用プライマー及びその用途」が開示されており、韓国登録特許第1815220号には、根こぶ病菌に対する４種の表現型のハクサイ品種を用いてハクサイ根こぶ病菌(Plasmodiophora brassicae)のレースを判別する方法に関する「ハクサイ根こぶ病菌のレースを判別する新規な方法」が開示されているが、本発明のハクサイの高密度遺伝子地図に基づいた根こぶ病バンリム菌株特異的抵抗性または感受性ハクサイ品種を区別するための分子マーカー及びその用途については記載されていない。 On the other hand, Korean Registered Patent No. 1560736 discloses a primer for diagnosis of Chinese cabbage clubroot and use thereof based on the TSA gene of Plasmodiophora brassicae, and Korean Registered Patent No. 1815220 discloses discloses a ``novel method for determining the race of Chinese cabbage clubroot fungus (Plasmodiophora brassicae)'', which relates to a method for determining the race of Chinese cabbage clubroot fungus (Plasmodiophora brassicae) using four phenotypical Chinese cabbage cultivars against clubroot. However, molecular markers for distinguishing clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage cultivars based on the high-density genetic map of Chinese cabbage of the present invention and their use are not described.
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明者は、ハクサイ根こぶ病菌バンリム(Banglim)病原型(pathotype)に対して抵抗性を示す09CR500系統と感受性を示す09CR501系統とを用いて、ハクサイ８番染色体上に存在するハクサイ根こぶ病抵抗性関連量的形質遺伝子座(QTL; PbBrA08Banglim)を確認した後、前記PbBrA08BanglimQTL領域に対して精密遺伝子地図作成(Fine-mapping)を行い、09CR.11390652と09CR.11755754マーカーとの間で根こぶ病抵抗性に係わる候補遺伝子(ORF1、ORF2及びORF3)を確認した。また、前記ORF2遺伝子上に存在する５個のマーカーを開発し、前記開発されたマーカーが根こぶ病に対する抵抗性または感受性ハクサイ系統を正確に区別可能であるということを確認することで、本発明を完成した。 The present invention was derived in response to the above requirements, and the present inventors have identified the 09CR500 line showing resistance to the Chinese cabbage root-knot bacterium Banglim pathotype and the 09CR501 line showing susceptibility. After confirming the Chinese cabbage clubroot resistance-related quantitative trait locus (QTL; PbBrA08 Banglim ) present on chromosome 8 of Chinese cabbage using a strain, a precise genetic map was created for the PbBrA08 Banglim QTL region ( Fine-mapping) was performed to confirm candidate genes (ORF1, ORF2 and ORF3) involved in clubroot resistance between the 09CR.11390652 and 09CR.11755754 markers. In addition, by developing five markers present on the ORF2 gene and confirming that the developed markers can accurately distinguish between clubroot resistant and susceptible Chinese cabbage lines, the present invention completed.
前記課題を解決するために本発明は、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドプライマーセット；及び配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドプライマーセット；からなる群から選択された１つ以上のプライマーセットを含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別するためのプライマーセット組成物を提供する。 In order to solve the above problems, the present invention provides oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOS: 1 and 2; oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOS: 3 and 4; oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set composition for determining clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals, comprising one or more primer sets selected from the group consisting of an oligonucleotide primer set; and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10. offer things.
また、本発明は、前記プライマーセット組成物を含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別するためのキットを提供する。 The present invention also provides a kit for determining clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals, comprising the primer set composition.
また、本発明は、ハクサイ試料からゲノムＤＮＡを分離する段階；前記分離されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーセット組成物を用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階；及び前記増幅段階の産物を検出する段階；を含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別する方法を提供する。 Further, the present invention provides a step of isolating genomic DNA from a Chinese cabbage sample; a step of performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and the primer set composition to amplify a target sequence; and the amplification step. detecting a product of; clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals.
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなる根こぶ病に対する植物体の抵抗性を増加させるハクサイ由来のORF2遺伝子を提供する。 The present invention also provides a Chinese cabbage-derived ORF2 gene that increases the resistance of a plant to clubroot, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57.
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む組換えベクターで植物細胞を形質転換させる段階；及び前記形質転換された植物細胞から形質転換植物を再分化する段階；を含む、根こぶ病に対する抵抗性が増加した形質転換植物体の製造方法を提供する。 The present invention also provides a step of transforming a plant cell with a recombinant vector containing a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 57; and a step of redifferentiating a transformed plant from the transformed plant cell. to provide a method for producing a transformed plant having increased resistance to clubroot.
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む組換えベクターで植物細胞を形質転換させる段階を含む、植物体の根こぶ病抵抗性を増加させる方法を提供する。 The present invention also provides a method for increasing clubroot resistance in a plant, comprising transforming a plant cell with a recombinant vector containing a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57. .
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む植物体の根こぶ病抵抗性を増加させるための組成物を提供する。 The present invention also provides a composition for increasing the clubroot resistance of a plant containing the Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57.
本発明の分子マーカーは、ハクサイ根こぶ病に対する抵抗性または感受性を示すハクサイ個体を正確に判別することができるので、ハクサイ根こぶ病に対して抵抗性を有するハクサイ品種を早期に選別して育成することができ、育種にかかる時間、費用及び努力を節減するのに非常に有用であると期待される。 Since the molecular marker of the present invention can accurately identify Chinese cabbage individuals exhibiting resistance or susceptibility to clubroot disease of Chinese cabbage, Chinese cabbage varieties resistant to clubroot disease of Chinese cabbage can be selected and cultivated at an early stage. and is expected to be very useful in saving time, money and effort in breeding.
本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドプライマーセット；配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドプライマーセット；及び配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドプライマーセット；からなる群から選択された１つ以上のプライマーセットを含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別するためのプライマーセット組成物を提供する。 To achieve the objects of the present invention, the present invention provides oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2; oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 3 and 4; oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6; and oligonucleotide primer sets of 8; and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 9 and 10; A primer set composition is provided.
本発明のプライマーセットは、望ましくは、前記５個のプライマーセットからなる群から選択される１つ以上のプライマーセットを含み、５個のプライマーセットを同時に利用すれば、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体をさらに効率的に区別することができる。 The primer set of the present invention desirably contains one or more primer sets selected from the group consisting of the above five primer sets, and if the five primer sets are used simultaneously, clubroot resistance or susceptibility can be improved. Chinese cabbage individuals can be distinguished more efficiently.
前記プライマーは、各プライマーの配列長によって、配列番号１ないし１０の配列内の１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上の連続ヌクレオチドの切片からなるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例えば、配列番号１のプライマー（２０個オリゴヌクレオチド）は、配列番号１の配列内の１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上の連続ヌクレオチドの切片からなるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。また、前記プライマーは、配列番号１ないし１０の塩基配列の付加、欠失または置換された配列も含みうる。 The primers may comprise oligonucleotides consisting of segments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more consecutive nucleotides within the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10, depending on the sequence length of each primer. For example, the primer of SEQ ID NO: 1 (20 oligonucleotides) may comprise oligonucleotides consisting of segments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more contiguous nucleotides within the sequence of SEQ ID NO: 1. . In addition, the primers may also contain additions, deletions, or substitutions of the base sequences of SEQ ID NOS: 1-10.
本発明において、「プライマー」は、複製しようとする核酸鎖に相補的な単一鎖オリゴヌクレオチド配列を言い、プライマー延長産物の合成のための開始点として作用する。前記プライマーの長さ及び配列は、延長産物の合成を開始するように許容せねばならない。プライマーの具体的な長さ及び配列は、要求されるＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複合度(complexity)だけではなく、温度及びイオン強度のようなプライマー利用条件に依存するであろう。 In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be replicated and acts as a starting point for the synthesis of primer extension products. The length and sequence of the primer must allow for initiation of synthesis of extension products. The specific length and sequence of the primers will depend on primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target desired.
本発明において、プライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドは、さらにヌクレオチド類似体(analogue)、例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、アルキルホスホロチオエートまたはペプチド核酸(peptidenucleicacid)を含むか、または挿入物質(intercalatingagent)を含む。 In the present invention, the oligonucleotides used as primers further contain nucleotide analogues such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptidenucleicacids, or contain intercalating agents.
本発明において、前記根こぶ病は、プラスモディフォラ・ブラシカ(Plasmodiophora brassicae)病源菌によって発病したものでもあり、望ましくは、ローカル病源菌バンリム(Banglim)によって発病したハクサイ根こぶ病でもあるが、特にそれに制限されない。 In the present invention, said clubroot is also caused by Plasmodiphora brassicae pathogenic fungus, preferably Chinese cabbage clubroot caused by local pathogen Banglim, but particularly but not limited to it.
また、本発明は、前記プライマーセット組成物を含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別するためのキットを提供する。 The present invention also provides a kit for determining clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals, comprising the primer set composition.
本発明の一具現例において、前記キットは、増幅反応を行うための試薬をさらに含み、前記増幅反応を行うための試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、dNTPs、及びバッファを含んでもよいが、それらに制限されない。 In one embodiment of the present invention, the kit further comprises reagents for performing an amplification reaction, and the reagents for performing the amplification reaction may include, but are not limited to, DNA polymerase, dNTPs, and buffers. .
本発明の一具現例において、前記キットは、最適の反応遂行条件を記載した使用者案内書をさらに含んでもよい。案内は、キットの使用方法、例えば、逆転写緩衝液及びＰＣＲ緩衝液製造方法、提示される反応条件などを説明する印刷物である。案内は、パンフレットまたはチラシ形態の案内パンフレット、キットに付着されたラベル、及びキットを含むパッケージの表面上に説明を含む。また、案内は、インターネットのように電気媒体を介して公開されるか、提供される情報を含む。 In one embodiment of the present invention, the kit may further include a user's guide describing optimal reaction performance conditions. The instructions are printed materials that explain how to use the kit, eg, how to make the reverse transcription and PCR buffers, suggested reaction conditions, and the like. The instructions include informational brochures in the form of brochures or flyers, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. Guidance also includes information published or provided via electronic media such as the Internet.
また、本発明は、ハクサイ試料からゲノムＤＮＡを分離する段階；前記分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセット組成物を用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階；及び、前記増幅段階の産物を検出する段階；を含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別する方法を提供する。 Further, the present invention provides a step of isolating genomic DNA from a Chinese cabbage sample; using the isolated genomic DNA as a template, performing an amplification reaction using the primer set composition to amplify a target sequence; detecting a product of the step; and discriminating clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals.
本発明の一具現例による方法において、前記プライマーセット組成物は、前述した通りである。 In the method according to one embodiment of the present invention, the primer set composition is as described above.
本発明の方法は、ハクサイ試料からゲノムＤＮＡを分離する段階を含む。前記ゲノムＤＮＡを分離する方法は、当業界に公知された方法を利用し、例えば、ＣＴＡＢ方法を利用し、Wizard prepキット（Promega社）を利用することもできる。前記分離されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明の一実施例によるオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて増幅反応を行って標的配列を増幅することができる。 The method of the invention involves isolating genomic DNA from a Chinese cabbage sample. As a method for isolating the genomic DNA, a method known in the art can be used, for example, the CTAB method and Wizard prep kit (Promega) can be used. Using the isolated genomic DNA as a template, an amplification reaction can be performed using the oligonucleotide primer set according to one embodiment of the present invention to amplify the target sequence.
本発明の一具現例において、前記増幅された標的配列は、検出可能な標識物質で標識されうる。前記標識物質は、蛍光、リン光または放射線を発する物質でもあるが、それらに制限されない。望ましくは、前記標識物質は、Cy-5またはCy-3である。標的配列の増幅時、プライマーの5’-末端にCy-5またはCy-3を標識してＰＣＲを遂行すれば、標的配列が検出可能な蛍光標識物質によって標識されうる。また、放射性物質を用いた標識は、PＣＲ遂行時、３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加すれば、増幅産物が合成されながら、放射線が増幅産物に混入されて増幅産物が放射線によって標識されうる。標的配列を増幅するために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーセットは、前述した通りである。 In one embodiment of the present invention, the amplified target sequence can be labeled with a detectable labeling substance. Said labeling substance is also a substance that emits fluorescence, phosphorescence or radiation, but is not limited thereto. Desirably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When the target sequence is amplified, the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent label by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer and performing PCR. In addition, labeling using a radioactive material, when performing PCR, if a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, an amplification product is synthesized, and radiation is mixed into the amplification product for amplification. The product can be radiolabeled. The oligonucleotide primer sets used to amplify the target sequences are as described above.
本発明の一具現例において、前記根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を区別する方法は、前記増幅段階の産物を検出する段階を含み、前記増幅段階産物の検出は、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動、放射線測定、蛍光測定またはリン光測定を通じて行われるが、それらに制限されない。増幅産物を検出する方法の１つとして、毛細管電気泳動を行うことができる。毛細管電気泳動は、例えば、ABi Sequencerを利用することができる。また、ゲル電気泳動を行い、ゲル電気泳動は、増幅産物の大きさによってアガロースゲル電気泳動または、アクリルアミドゲル電気泳動を利用することができる。また、蛍光測定方法は、プライマーの5’-末端にCy-5またはCy-3を標識してＰＣＲを遂行すれば、標的配列が検出可能な蛍光標識物質によって標識され、このように標識された蛍光は、蛍光測定器を用いて測定することができる。また、放射線測定方法は、PＣＲ遂行時、３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加して増幅産物を標識した後、放射線測定器、例えば、ガイガー計数器(Geiger counter)または液体シンチレーション計数器(liquid scintillation counter)を用いて放射線を測定することができる。 In one embodiment of the present invention, the method of distinguishing clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage individuals comprises detecting the products of the amplification step, wherein the detection of the products of the amplification step includes DNA chips, gel electrophoresis, , capillary electrophoresis, radiometry, fluorometry or phosphorescence measurements, but not limited thereto. One method of detecting amplification products is capillary electrophoresis. Capillary electrophoresis can utilize, for example, the ABi Sequencer. In addition, gel electrophoresis is performed, and agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis can be used depending on the size of the amplified product. In the fluorescence measurement method, if the 5'-end of the primer is labeled with Cy-5 or Cy-3 and PCR is performed, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling substance. Fluorescence can be measured using a fluorometer. In addition, when performing PCR, a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to label the amplified product, and then the radiation is measured using a radiation measuring device such as a Geiger counter. Alternatively, radiation can be measured using a liquid scintillation counter.
また、本発明の一具現例による方法において、前記配列番号１及び２のプライマーセット（SH_852マーカー）を用いてＰＣＲを遂行した場合、2,305bp、配列番号３及び４のプライマーセット（SH_866マーカー）を用いてＰＣＲを遂行した場合、390bp、配列番号５及び６のプライマーセット（SH_868マーカー）を用いてＰＣＲを遂行した場合、２７５ｂｐ、配列番号７及び８のプライマーセット（SH_820マーカー）を用いてＰＣＲを遂行した場合、５１４ｂｐ、配列番号９及び１０のプライマーセット（SH_870マーカー）を用いてＰＣＲを遂行した場合、２４２ｂｐサイズの単一バンドを示せば、根こぶ病抵抗性ハクサイ個体と判別し、単一バンドが検出されなければ、根こぶ病感受性ハクサイ個体と判別することができる。 In addition, in the method according to one embodiment of the present invention, when PCR is performed using the primer set (SH_852 marker) of SEQ ID NOs: 1 and 2, the primer set (SH_866 marker) of 2,305 bp and SEQ ID NOs: 3 and 4 is used. 390 bp when PCR was performed using the primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6 (SH_868 marker), 275 bp when PCR was performed using the primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8 (SH_820 marker). When PCR was performed using a primer set of 514 bp and SEQ ID NOS: 9 and 10 (SH_870 marker), if a single band of 242 bp size was shown, it was determined as a clubroot-resistant Chinese cabbage individual. If no band is detected, clubroot-susceptible Chinese cabbage individuals can be identified.
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなる根こぶ病に対する植物体の抵抗性を増加させるハクサイ由来のORF2遺伝子を提供する。 The present invention also provides a Chinese cabbage-derived ORF2 gene that increases the resistance of a plant to clubroot, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57.
本発明による根こぶ病に対する植物体の抵抗性を増加させる配列番号５７の塩基配列からなるORF2遺伝子は、ハクサイ根こぶ病バンリム菌株によって発病する根こぶ病に対する抵抗性ＱＴＬであるPbBrA08Banglim 領域で明らかになった遺伝子であって、プラスモディフォラ・ブラシカ(Plasmodiophora brassicae)のバンリム(Banglim)病原型に対して抵抗性を示すハクサイ09CR500個体から分離され、ハクサイ参照遺伝子（Chiifu）とプラスモディフォラ・ブラシカのバンリム病原型に対して感受性を示すハクサイ09CR501個体と塩基配列上に変異を示すことが特徴である。 The ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57, which increases the resistance of plants to clubroot according to the present invention, is evident in the PbBrA08 Banglim region, which is a resistance QTL to clubroot caused by the Chinese cabbage clubroot Banlim strain. This gene was isolated from a Chinese cabbage 09CR500 individual showing resistance to the Banglim pathogen of Plasmodiphora brassicae, and the Chinese cabbage reference gene (Chiifu) and Plasmodiphora brassicae Chinese cabbage 09CR501 individuals that are susceptible to the banrim pathogen of .
前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号５７の塩基配列とそれぞれ７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに係わる「配列相同性の％」は、２つの好適に配列された配列と比較領域とを比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に係わる参照配列（追加または削除を含まない）に比べて、追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。 Homologues of said base sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57. May contain sequences. A "percent sequence homology" for a polynucleotide is determined by comparing two well-aligned sequences to a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the optimal sequence of the two sequences. may contain additions or deletions (ie, gaps) relative to the reference sequence (not containing additions or deletions) pertaining to .
また、本発明は、前記ハクサイ由来のORF2遺伝子を含む組換えベクターを提供する。 The present invention also provides a recombinant vector containing the ORF2 gene derived from Chinese cabbage.
用語「組換え」は、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、またはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を指称するものである。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子切片を、センスまたは、アンチセンス形態のうち、１つとして発現することができる。また、組換え細胞は、天然状態の細胞で発見される遺伝子を発現することができるが、前記遺伝子は、変形されたものであって、人為的な手段によって細胞内に再び取り込まれたものである。 The term "recombinant" refers to a cell that replicates a heterologous nucleic acid, expresses said nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. . Recombinant cells can express genes or gene segments that are not found in the native form of the cell, in one of sense or antisense forms. Recombinant cells can also express genes found in cells in their natural state, but the genes have been modified and reintroduced into the cell by artificial means. be.
用語「ベクター」は、細胞内に伝達するＤＮＡ断片（ら）、核酸分子を指称するときに使用される。ベクターは、ＤＮＡを複製させ、宿主細胞から独立して再生産されうる。用語「伝達体」は、よく「ベクター」と互換して使用される。用語「発現ベクター」は、目的したコーディング配列と、特定宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列を発現するのに必須な適正核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。 The term "vector" is used when referring to DNA segment(s), nucleic acid molecules that are transferred into cells. Vectors are capable of replicating DNA and being reproduced independently of a host cell. The term "vehicle" is often used interchangeably with "vector". The term "expression vector" refers to a recombinant DNA molecule containing a desired coding sequence and the proper nucleic acid sequences necessary to express the coding sequence in operable linkage in a particular host organism.
本発明のベクターは、典型的にクローニングまたは発現のためのベクターとして構築されうる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築されうる。例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させうる強力なプローモーター（例えば、pLλプローモーター、trpプローモーター、lacプローモーター、T7プローモーター、tacプローモーターなど）、解読の開始のためのリポソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として大膓菌(Escherichia coli)が用いられる場合、E.coliトリプトファン生合成経路のプローモーター及びオペレーター部位、そして、ファージλの左向きプローモーター（pLλプローモーター）が調節部位として利用されうる。 The vectors of the present invention can typically be constructed as cloning or expression vectors. In addition, the vectors of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the host is a prokaryotic cell, a strong promoter capable of promoting transcription (e.g., pLλ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.), a liposome binding site for initiation of decoding, and a transcription/decoding termination sequence. When Escherichia coli is used as the host cell, the promoter and operator sites of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway and the phage lambda leftward promoter (pLλ promoter) can be used as regulatory sites.
一方、本発明に用いられるベクターは、当業界でよく使用されるプラスミド（例えば、pSC101、ColE1、pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEXシリーズ、pETシリーズ及びpUC19など）、ファージ（例えば、λgt4-λB、λ-Charon、λΔz1及びM13など）、またはウイルス（例えば、SV40など）を操作して作製されうる。 On the other hand, vectors used in the present invention include plasmids (e.g., pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19), phages (e.g., λgt4-λB) commonly used in the art. , λ-Charon, λΔz1 and M13), or viruses (such as SV40).
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来のプローモーター（例えば、メタロチオニンプローモーター）または哺乳動物ウイルスに由来のプローモーター（例えば、アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプローモーター、SV40プローモーター、サイトメガロウイルスプローモーター及びHSVのtkプローモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。 On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the host is a eukaryotic cell, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (e.g., metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, the adenovirus late promoter, the vaccinia virus 7.5K promoter, the SV40 promoter, the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV) are used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
本発明の組換えベクターは、望ましくは、植物発現ベクターである。 The recombinant vector of the present invention is desirably a plant expression vector.
植物発現ベクターの望ましい例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のような適当な宿主に存在するとき、それ自体の一部、いわゆる、T-領域を植物細胞に転移させうるTi-プラスミドベクターである。他の類型のTi-プラスミドベクター（EP 0 116 718 B1号参照）は、現在植物細胞、または雑種ＤＮＡを植物のゲノム内に適当に挿入させる新たな植物が生産されうる原形質体であって、雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに用いられている。Ti-プラスミドベクターの特に望ましい形態は、EP 0 120 516 B1号及び米国特許第4,940,838号に請求されたような、いわゆるバイナリー(binary)ベクターである。本発明による遺伝子を植物宿主に導入させるのに用いられる他の適したベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、CaMV）、及び単一鎖ウイルス、ゲミニウイルスなどに由来することができるようなウイルスベクター、例えば、非完全性植物ウイルスベクターから選択されうる。そのようなベクターの使用は、特に植物宿主を適当に形質転換することが困難であるときに有利である。
A preferred example of a plant expression vector is a Ti-plasmid vector which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens, is capable of transferring part of itself, the so-called T-region, into plant cells. is. Another type of Ti-plasmid vector (see
発現ベクターは、望ましくは、１つ以上の選択性マーカーを含む。前記マーカーは、通常、化学的な方法として選択されうる特性を有する核酸配列であって、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別可能な全ての遺伝子がそれに該当する。その例としては、グリホサート(glyphosate)またはホスフィノスリシン（phosphinothricin）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン、G418、ブレオマイシン(Bleomycin)、ハイグロマイシン(hygromycin)、クロラムフェニコール(chloramphenicol)のような抗生剤耐性遺伝子があるが、それに限定されるものではない。 Expression vectors desirably contain one or more selectable markers. The marker is usually a nucleic acid sequence that has the property of being selectable by chemical means, and includes all genes that allow transformed cells to be distinguished from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol. include, but are not limited to, antibiotic resistance genes.
本発明による植物発現ベクターにおいて、プローモーターは、CaMV 35S、アクチン、ユビキチン、pEMU、MASまたはヒストンプローモーターでもあるが、それらに制限されない。「プローモーター」という用語は、構造遺伝子からのＤＮＡアップストリームの領域を意味し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子を言う。「植物プローモーター」という植物細胞において転写を開始することができるプローモーターである。「構成的(constitutive)プローモーター」は、ほとんどの環境条件及び発達状態または細胞分化下で活性があるプローモーターである。形質転換体の選択が各種段階で各種組織によってもなされるので、構成的プローモーターが本発明において望ましい。したがって、構成的プローモーターは、選択可能性を制限しない。 In the plant expression vector according to the invention, the promoter is also, but not limited to, CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoters. The term "promoter" refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in a plant cell. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation. Constitutive promoters are desirable in the present invention, since selection of transformants is also made at different stages and by different tissues. Thus, constitutive promoters do not limit selectability.
本発明による植物発現ベクターにおいて、ターミネーターは、通常のターミネーターを使用し、その例としては、ノパリン合成酵素(nopaline synthase, NOS)、イネα－アミラーゼRAmy1 Aターミネーター、ファセオリン(phaseoline)ターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピン(Octopine)遺伝子のターミネーターなどがあるが、それらに限定されるものではない。 In the plant expression vector according to the present invention, the terminator used is a conventional terminator, examples of which include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium - Examples include, but are not limited to, the terminator of the octopine gene of tumefaciens.
また、本発明は、本発明の前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。 The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector of the present invention.
本発明のベクターを安定し、かつ連続してクローニング及び発現させうる宿主細胞は、微細潮流、微生物などを含む当業界に公知されたいかなる宿主細胞も利用することができ、例えば、E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)、バチルス・チューリンジエンシス(B. thuringiensis)のようなバチルス属菌株、そして、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratiamarcescens)及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがある。 Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vectors of the present invention can be any host cells known in the art, including microtidal currents, microorganisms, etc., e.g., E. coli JM109. , E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, B. thuringiensis and enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, and various Pseudomonas species.
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（例えば、Saccharomyce cerevisiae）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Chinese hamster ovary）、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及びMDCK細胞株）及び植物細胞などが用いられ、望ましくは、植物細胞である。 When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, host cells include yeast (e.g., Saccharomyce cerevisiae), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK , COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells, preferably plant cells.
本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、CaCl2方法、ハナハン方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))及び電気穿孔方法などによって実施されうる。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、リン酸カルシウム沈澱法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法、DEAE-デキストラン処理法、及び遺伝子ボンバードメントなどによってベクターを宿主細胞内に注入することができる。 When the host cell is a prokaryotic cell, the method for transferring the vector of the present invention into the host cell includes the CaCl2 method, the Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)). ) and electroporation methods. Alternatively, if the host cell is a eukaryotic cell, the vector can be transferred into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, and the like. can be injected into
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む組換えベクターで植物細胞を形質転換させる段階；及び、前記形質転換された植物細胞から形質転換植物を再分化する段階；を含む、根こぶ病に対する抵抗性が増加した形質転換植物体の製造方法を提供する。 The present invention also provides a step of transforming a plant cell with a recombinant vector containing a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 57; and regenerating a transformed plant from the transformed plant cell. A method for producing a transformed plant having increased resistance to clubroot, comprising the steps of:
植物の形質転換は、ＤＮＡを植物に転移させる任意の方法を意味する。そのような形質転換方法は、必ずしも再生及び（または）組織培養期間を有する必要はない。現在は、植物種の形質転換は、双子葉植物だけではなく、単子葉植物をいずれも含む植物種について一般的である。原則的に、任意の形質転換方法は、本発明による雑種ＤＮＡを適当な先祖細胞に導入させるのに用いられる。方法は、原形質体に対するカルシウム／ポリエチレングリコール方法、原形質体の電気穿孔法、植物要素への顕微注入法、各種植物要素の（ＤＮＡまたはＲＮＡ－コーティングされた）粒子衝撃法、植物の浸潤または成熟花粉または小胞子の形質転換によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介された遺伝子転移において（非完全性）ウイルスによる感染などから適当に選択されうる。本発明による望ましい方法は、アグロバクテリウム媒介されたＤＮＡ伝達を含む。特に望ましくは、EP A 120 516号及び米国特許第4,940,838号に記載されたような、いわゆるバイナリーベクター技術を利用するものである。 Transformation of plants means any method of transferring DNA to plants. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and/or tissue culture period. Plant species transformation is now common for both dicotyledonous as well as monocotyledonous plant species. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into the appropriate progenitor cell. Methods include the calcium/polyethylene glycol method on protoplasts, electroporation of protoplasts, microinjection into plant elements, particle bombardment of various plant elements (DNA or RNA-coated), plant infiltration or Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer by transformation of mature pollen or microspores may be suitably selected from infection with (non-perfect) viruses and the like. A preferred method according to the invention involves Agrobacterium-mediated DNA transfer. Particularly preferred is the use of so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.
本発明の方法は、本発明による組換えベクターによって植物細胞を形質転換する段階を含むが、前記形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefiaciens)によって媒介されうる。また、本発明の方法は、前記形質転換された植物細胞から形質転換植物を再分化する段階を含む。形質転換植物細胞から形質転換植物を再分化する方法は、当業界に公知された任意の方法を利用することができる。 The method of the invention comprises transforming a plant cell with a recombinant vector according to the invention, said transformation may be mediated by A. tumefaciens. The method of the invention also includes the step of regenerating a transformed plant from said transformed plant cell. Any method known in the art can be used to regenerate a transformed plant from a transformed plant cell.
植物の形質転換に用いられる「植物細胞」は、いかなる植物細胞にもなる。植物細胞は培養細胞、培養組織、培養器官または全体植物、望ましくは、培養細胞、培養組織または培養器官及びさらに望ましくは、培養細胞のいかなる形態にもなる。「植物組織」は、分化された、または未分化された植物の組織、例えば、その限りではないが、実、茎、葉、花粉、種子、癌組織及び培養に用いられる多様な形態の細胞、すなわち、単一細胞、原形質体(protoplast)、芽及びカルス組織を含む。植物組織は、インプランタ(inplanta)や器官培養、組織培養または細胞培養状態でもある。 A "plant cell" used in plant transformation can be any plant cell. Plant cells may be in any form of cultured cells, tissue cultures, organ cultures or whole plants, preferably cell cultures, tissue cultures or organ cultures and more preferably cell cultures. "Plant tissue" means a differentiated or undifferentiated plant tissue such as, but not limited to, fruit, stem, leaf, pollen, seed, cancer tissue and various forms of cells used in culture, It includes single cells, protoplasts, sprouts and callus tissue. Plant tissue is also in implanta, organ culture, tissue culture or cell culture.
本発明の一具現例において、前記植物体は、アブラナ科(Cruciferae)植物体でもあり、望ましくは、ハクサイ、ブロッコリー、キャベツ、大根、芥子菜、若大根、冬菜、ハクサイ、チョンガー大根、チンゲン菜、アブラナ、カリフラワー、ケール（サム(ssam)ケール、青汁用ケール）、赤大根などでもあり、最も望ましくは、ハクサイでもあるが、それらに制限されない。 In one embodiment of the present invention, the plant is also a Cruciferae plant, preferably Chinese cabbage, broccoli, cabbage, radish, mustard greens, young radish, winter greens, Chinese cabbage, chonger radish, bok choy, Canola, cauliflower, kale (ssam kale, green juice kale), red radish, and most preferably Chinese cabbage, but are not limited thereto.
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む組換えベクターによって植物細胞を形質転換させる段階を含む、植物体の根こぶ病抵抗性を増加させる方法を提供する。 The present invention also provides a method for increasing clubroot resistance in a plant, which comprises transforming a plant cell with a recombinant vector containing a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57. .
また、本発明は、配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子を含む、植物体の根こぶ病抵抗性を増加させるための組成物を提供する。本発明の組成物は、有効成分として配列番号５７の塩基配列からなるハクサイ由来のORF2遺伝子または前記遺伝子を含む組換えベクターを含み、前記遺伝子または前記遺伝子を含む組換えベクターによって植物細胞を形質転換させることで、根こぶ病に対する植物体の抵抗性を増加させうる。 The present invention also provides a composition for increasing the clubroot resistance of a plant, comprising an ORF2 gene derived from Chinese cabbage consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:57. The composition of the present invention contains, as an active ingredient, a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57 or a recombinant vector containing the gene, and a plant cell is transformed with the gene or a recombinant vector containing the gene. The resistance of the plant body to clubroot can be increased by increasing the
以下、本発明の実施例を通じて詳細に説明する。下記特定の例示及び実施例は、発明の一部具現例を含むものであって、全ての具現例を含んでいないという点に留意せねばならない。本明細書によって開示される発明の内容は、ここで説明される特定の実施例に制限されず、本発明が属する技術分野において通常の技術者が多様に具現可能であるということは自明である。したがって、本明細書に開示された発明の内容は、ここに記載された特定の実施例に制限されず、これについての変形及び他の具現例も特許請求の範囲内に含まれると理解されねばならない。 Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described in detail. It should be noted that the specific illustrations and examples below include some, but not all, implementations of the invention. It is self-evident that the content of the invention disclosed by this specification is not limited to the specific examples described here, and can be embodied in various ways by those skilled in the art in the technical field to which the invention belongs. . Accordingly, it should be understood that the inventive subject matter disclosed herein is not limited to the particular embodiments described herein, and that variations and other implementations thereof are included within the scope of the appended claims. not.
材料及び方法
１．植物材料及び表現型の分析
先行研究（Int. J. Mol. Sci., 2020, 21, 4157）において、ハクサイ根こぶ病バンリムに対して抵抗性を示す09CR500及び感受性を示す09CR501個体（バイオブリーディング育種会社提供）を用いてハクサイ根こぶ病抵抗性関連QTL領域（PbBrA08Banglim ；関連地図のA08上の207,889～13,590,812bp）を確認した。前記QTL領域のFine-mappingのための組換え植物体の選別のために2,986 F2植物体を２つの抵抗性形質関連マーカー（InDelマーカーである09CR.11755754とSNPマーカーである09CR.11390652）を活用して遺伝型分析(genotyping)と表現型評価を遂行した。InDelマーカーである09CR.11755754とSNPマーカーである09CR.11390652との間で組換えが確認された総２２個の組換え植物体がFine-mappingのために選択された。
Materials and Methods1. Analysis of plant materials and phenotypes (Int. J. Mol. Sci., 2020, 21, 4157) showed that 09CR500 plants resistant to clubroot and 09CR501 plants susceptible to Chinese cabbage clubroot (Biobleeding breeding) (Provided by the company) was used to identify the clubroot resistance-related QTL region (PbBrA08 Banglim ; 207,889 to 13,590,812 bp on A08 of the related map). For selection of recombinant plants for fine-mapping of the QTL region, 2,986 F2 plants were selected using two resistance trait-associated markers (InDel marker 09CR.11755754 and SNP marker 09CR.11390652). Then genotyping and phenotypic evaluation were performed. A total of 22 recombinant plants in which recombination was confirmed between InDel marker 09CR.11755754 and SNP marker 09CR.11390652 were selected for Fine-mapping.
マーカーを開発した後実用化のための汎用性検定(validation)のために188個Brassica core-collection系統（表１）を活用した。全ての植物体は、忠南大学校温室で栽培及び試験された。 After developing the markers, 188 Brassica core-collection lines (Table 1) were utilized for versatility validation for commercialization. All plants were cultivated and tested in the greenhouse of Chungnam National University.
２．ハクサイ根こぶ病菌接種及び症状評価
ハクサイ根こぶ病菌バンリム(Banglim)は、種子会社バイオブリーディング（BioBreeding Co.、韓国）が、深刻な根こぶ病が発生した国内地域（江原道平昌郡芳林面）で収集したローカル病源菌であり、バンリム病源菌の独特の病原性を維持するために、病源菌をハクサイに持続的に感染させた。
2. Chinese cabbage clubroot inoculation and symptom evaluation Banglim, a Chinese cabbage clubroot fungus, was introduced by the seed company BioBreeding Co. ) and persistently infected Chinese cabbage with the pathogen to maintain the unique virulence of the banlim pathogen.
具体的に、バンリム病原体の胞子懸濁液(2×106胞子/ml)を準備した後、胞子懸濁液５ｍｌを灌漑方法（土壌注入）によって２週苗に接種し、ハクサイ根こぶ病症状は、接種後６週目に評価した。こぶ(club)形成の程度に対する評価基準は、図１に示された総７個の尺度(scale)に分類され、植物体の平均尺度が２以下である場合に抵抗性と評価した。 Specifically, after preparing a spore suspension (2×10 6 spores/ml) of Banlim pathogen, 5 ml of the spore suspension was inoculated into seedlings for 2 weeks by an irrigation method (soil injection), and symptoms of clubroot of Chinese cabbage were detected. was assessed 6 weeks after inoculation. Evaluation criteria for the degree of club formation were classified into a total of 7 scales shown in FIG. 1, and plants with an average scale of 2 or less were evaluated as resistant.
QTL(Quantitative trait locus)を分析するために尺度を疾病指数（発病度、Disease Index）に変換し、疾病指数は、次のような計算式によって計算された。
疾病指数=[(n1+2n2+ … +6n6)/NT×6]×100.
ｎ１からｎ６までは、各尺度別に症状がある植物の数を示し、ＮＴは、テストに使用された総植物の数を意味する
In order to analyze the QTL (Quantitative trait locus), the scale was converted into a disease index (Disease Index), and the disease index was calculated by the following formula.
Disease index=[(n 1 +2n 2 + … +6n 6 )/N T ×6]×100.
n1 to n6 indicate the number of plants with symptoms for each scale, NT means the total number of plants used in the test.
２．マーカー開発及び遺伝型分析
Illumina Genome Analyzer-IIxシステムとpaired-ends方式を用いて３０倍Illumina sequence coverageで09CR500（抵抗性）ゲノムシーケンシグを遂行した後、CLC Genomic Workbench v12.0.2(CLC bio、米国）を使用して参照アセンブリーを生成し、参照アセンブリー(B. rapa_sequence_v3.0)とPbBrA08Banglim 遺伝子座の隣接マーカー間のマップ飽和は、CLC Genomic Workbench v12.0.2マニュアルによって遂行された。
2. Marker development and genotype analysis
09CR500 (resistant) genome sequencing was performed at 30x Illumina sequence coverage using the Illumina Genome Analyzer-IIx system and paired-ends method, followed by reference using CLC Genomic Workbench v12.0.2 (CLC bio, USA). Generating the assembly and map saturation between the reference assembly (B. rapa_sequence_v3.0) and the flanking markers of the PbBrA08 Banglim locus was accomplished by the CLC Genomic Workbench v12.0.2 manual.
HRMプライマーは、次のような媒介変数があるCLC genomic workbench 12.0を使用して設計された（表２）。primer product size range=80~200, primer GC clamp=2, 1, or undefined, primer max diff TM=3 or 4, primer min GC=30, primer max GC=60, primer product optimal TM=60, primer self any=4 or 5, primer max size=25 or undefined.
また、ＰＣＲは、９４℃ ４分→［９４℃ ２０秒、５５～６０℃ ２０秒、７２℃ ２０秒］（４５回反復）→７２℃ ７分の条件で遂行し、ＰＣＲ増幅産物は、LightScanner system(Idaho Technologies、米国）を通じて分析した。
HRM primers were designed using CLC genomic workbench 12.0 with the following parameters (Table 2). primer product size range=80~200, primer GC clamp=2, 1, or undefined, primer max diff TM=3 or 4, primer min GC=30, primer max GC=60, primer product optimal TM=60, primer self any=4 or 5, primer max size=25 or undefined.
In addition, PCR was performed under the conditions of 94° C. 4 minutes → [94° C. 20 seconds, 55-60° C. 20 seconds, 72° C. 20 seconds] (45 repetitions) → 72° C. 7 minutes. It was analyzed through a system (Idaho Technologies, USA).
３．ハクサイ根こぶ病抵抗性関連候補遺伝子探索
PbBrA08Banglim のFine-mappingを通じて狭められた領域において候補遺伝子を予測するために、ブラシカデータベース(Brassica database, BRAD)バージョン3.0(http://brassicadb.org/brad/)を使用し、FGENESH(http://softberry.com; Salamov and Solovyev, 2000)を通じて優勢な候補遺伝子の位置を予測した。そして、候補遺伝子のドメインは、Pfamデータベースを基盤に、CLC genomic workbench 12.0.2(CLC bio、デンマーク）を通じる参照遺伝子（Chiifu）の配列分析を通じて確認した。
3. Search for candidate genes related to clubroot resistance in Chinese cabbage
To predict candidate genes in the region narrowed through Fine-mapping of PbBrA08 Banglim , we used the Brassica database (BRAD) version 3.0 (http://brassicadb.org/brad/) and FGENESH (http://brassicadb.org/brad/). Predicted the location of dominant candidate genes through http://softberry.com; Salamov and Solovyev, 2000). Domains of candidate genes were then confirmed through sequence analysis of reference genes (Chiifu) using CLC genomic workbench 12.0.2 (CLC bio, Denmark) based on the Pfam database.
４．ＰＣＲ分析
RT-PCR(reverse transcription PCR)及びqRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析のために、総ＲＮＡは、２つの両親系統（09CR500及び09CR501）にハクサイ根こぶ病菌「バンリム(Banglim)」を接種し、１．５時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１週及び２週後に、葉及び根試料を回収した後、RNeasy plant Mini Kit(QIAGEN Inc、米国）を使用して抽出した。1 μg total RNAは、oligo-(dT)プライマーとTOPscript（商標）逆転写酵素(Enzynomics Co.,韓国）を使用してcDNAを合成した。前記cDNAを鋳型とし、遺伝子特異的プライマーセット（表３）とSYBR Green Supermixを使用してqRT-PCR分析（CFX96（商標） Real-Time System, Bio-Rad Co.、米国）を遂行した。相対的な遺伝子発現レベルは、２－△△Ｃｔの方法で算出し、全ての実験は、３回反復遂行した。
4. PCR analysis
For reverse transcription PCR (RT-PCR) and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis, total RNA was inoculated with Chinese cabbage clubroot 'Banglim' into two parental lines (09CR500 and 09CR501). 1.5 hours, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 1 week and 2 weeks later, leaf and root samples were collected and then treated with the RNeasy plant Mini Kit (QIAGEN Inc, USA). ) was used to extract. 1 μg total RNA was synthesized into cDNA using an oligo-(dT) primer and TOPscript™ reverse transcriptase (Enzynomics Co., Korea). Using the cDNA as a template, qRT-PCR analysis (CFX96™ Real-Time System, Bio-Rad Co., USA) was performed using gene-specific primer sets (Table 3) and SYBR Green Supermix. Relative gene expression levels were calculated by the method of 2 -ΔΔCt and all experiments were performed in triplicate.
実施例１．ハクサイ根こぶ病の分離パターン(segregation pattern)分析
PbBrA08Banglimの遺伝を確認するために、２,９８６個のＦ２植物体をプラスモディフォラ・ブラシカ(P.brassicae)のバンリム病原型によってテストした。２つの両親系統のうち、09CR500は、バンリムに対して抵抗性を示し、09CR501は、バンリムに対して感受性を示し、Ｆ２植物体のうち、抵抗性及び感受性植物の数は、それぞれ２,０７６個、９１０個であることを確認した（表４）。また、Ｆ２に含まれた188個Brassica core-collection系統のうち、９個系統は、バンリム病原型に対して抵抗性を示し、残りの１７９個系統は、感受性を示した（保持結果未提示）。
Example 1. Segregation pattern analysis of clubroot of Chinese cabbage
To confirm the inheritance of PbBrA08 Banglim , 2,986 F2 plants were tested with the banlim pathogen of P. brassicae. Of the two parental lines, 09CR500 was resistant to banrim and 09CR501 was susceptible to banlim, and among the F2 plants, the numbers of resistant and susceptible plants were 2,076, respectively. and 910 (Table 4). In addition, of the 188 Brassica core-collection strains included in F2 , 9 strains showed resistance to the vanlim pathogen, and the remaining 179 strains showed susceptibility (holding results not shown ).
実施例２．PbBrA08Banglim QTL関連マーカー開発
ハクサイ根こぶ病バンリムに対して抵抗性を示す09CR500及び感受性を示す09CR501個体（バイオブリーディング育種会社提供）を用いてハクサイ根こぶ病抵抗性関連QTL領域（PbBrA08Banglim ；関連地図のA08上の207,889~13,590,812 bp）を確認（図２Ａ）した後、前記PbBrA08BanglimQTL領域に存在する09CR.11755754(physical position: 11,755,630)と09CR.11390652(physical position: 11,390,629)マーカーの隣接領域(flanking region)に対する遺伝子地図を飽和させるために、09CR500とChiifuとの間の変異を確認した。
その結果、09CR.11755754と09CR.11390652マーカー間の領域において3,186個の単一ヌクレオチド変異体(SNV)、210個の多重ヌクレオチド変異体(MNV)、364個の欠失(deletion)、418個の挿入(insertion)及び26個の置換(substitution)、総4,204個の変異を確認した（表５）。
Example 2. Development of PbBrA08 Banglim QTL - related marker 207,889 to 13,590,812 bp on A08 of A08) (Fig. 2A), 09CR.11755754 (physical position: 11,755,630) and 09CR.11390652 (physical position: 11,390,629) markers adjacent to the PbBrA08 Banglim QTL region ( Mutations between 09CR500 and Chiifu were confirmed to saturate the genetic map for the flanking region).
As a result, 3,186 single-nucleotide variants (SNVs), 210 multiple-nucleotide variants (MNVs), 364 deletions, 418 We identified 26 insertions and 26 substitutions, for a total of 4,204 mutations (Table 5).
以後、HRM分析のために９４個のInDelマーカーを増幅することができるプライマーセットをデザインした。９４個のプライマーセットのうち、４１個（４３．６％）のプライマーセットが予測された配列を増幅し、２つの両親系統とそれらのＦ１個体においても多形成が示されたことを確認した（表６）。以後、前記４１個InDelマーカーのうち、２６個マーカー（表２）を選択して実験を進めた（図２Ｂ）。 A primer set capable of amplifying 94 InDel markers was then designed for HRM analysis. Of the 94 primer sets, 41 (43.6%) primer sets amplified the predicted sequences, confirming that the two parental lines and their F1 individuals also exhibited polymorphism ( Table 6). Subsequently, 26 markers (Table 2) were selected from among the 41 InDel markers, and experiments were carried out (Fig. 2B).
実施例３．PbBrA08Banglim QTLのFine-mapping分析
PbBrA08BanglimQTL領域においてバンリム根こぶ病抵抗性に対して最も有意味なマーカーを選抜するために、PbBrA08Banglim のFine-mappingを遂行した。まず、特定マーカー（InDelマーカーである09CR.11755754とSNPマーカーである09CR.11390652）の遺伝型分析結果を基盤に、総２２個の組換え植物体（Ｆ２）を選抜した（図３）。前記選発された２２個の組換え植物体を新たに開発されたマーカー（表２）を使用して遺伝型分析を遂行し、新たに開発されたマーカーを活用した遺伝型分析結果を基盤に、２２個の組換え植物体は、１６個のクループ（Ｇ１－Ｇ１６）に区分された。各遺伝型によって１６個のグループ（Ｇ１～Ｇ１６）に分けられる２２個の組換え植物体に基づいて標的地域の範囲を決定した。
Example 3. Fine-mapping analysis of PbBrA08 Banglim QTL
Fine-mapping of PbBrA08 Banglim was performed to select the most significant markers for clubroot resistance in the PbBrA08 Banglim QTL region. First, a total of 22 recombinant plants (F 2 ) were selected based on the results of genotype analysis of specific markers (InDel marker 09CR.11755754 and SNP marker 09CR.11390652) (Fig. 3). Genotype analysis was performed on the selected 22 recombinant plants using the newly developed markers (Table 2), and based on the results of genotype analysis using the newly developed markers. , 22 recombinant plants were divided into 16 croup (G1-G16). The extent of the target area was determined based on 22 recombinant plants divided into 16 groups (G1-G16) by each genotype.
具体的に、図３のあるマーカー位置においてＰ１及びＦ１遺伝型である場合、抵抗性を示し、Ｐ２遺伝型である場合、感受性を示すと予測することができる。また、図３の最も左側に記載された表現型(phenotype)は、病理検定結果であって、０は、根こぶ病に対する抵抗性を意味し、数字が大きくなるほど感受性であることを意味し、６は、完全な感受性であることを意味する。したがって、Fine-mappingを通じて病理検定結果を説明することができる遺伝型を示すマーカーを探すことができる。 Specifically, it can be predicted that the P1 and F1 genotypes at a certain marker position in FIG. 3 indicate resistance, and the P2 genotype indicates susceptibility. In addition, the phenotype shown on the leftmost side of FIG. 3 is the pathological test result, 0 means resistance to clubroot, and the larger the number, the more sensitive it is, 6 means full susceptibility. Therefore, it is possible to search for genotypic markers that can explain pathological test results through fine-mapping.
根こぶ病抵抗性の表現型を示すG1とG6～G16を見れば、09CR.11390652マーカーから09CR.11755754マーカーに行くほど徐々に小くなる09CR500ゲノムの断片を含んでおり、PbBrA08BanglimQTL領域が、09CR.11390652マーカーからSH_930マーカーとの間に狭められた。 G1 and G6-G16, which display clubroot-resistant phenotypes, contain progressively smaller fragments of the 09CR500 genome from the 09CR.11390652 marker to the 09CR.11755754 marker, and the PbBrA08 Banglim QTL region. , narrowed between the 09CR.11390652 marker and the SH_930 marker.
また、根こぶ病感受性の表現型を示すG2～G5を見れば、09CR.11390652マーカーとSH_922マーカーとの間に09CR500ゲノムの断片を含んでいるので、PbBrA08BanglimQTL領域が、09CR.11390652マーカーとSH_922マーカーとの間に位置するものではないということが分かった。 In addition, looking at G2 to G5, which show the clubroot susceptibility phenotype, the PbBrA08 Banglim QTL region contains a fragment of the 09CR500 genome between the 09CR.11390652 marker and the SH_922 marker. It turns out that it is not located between the SH_922 markers.
前記Fine-mapping分析を通じてPbBrA08Banglim QTLは、SH_852とSH_930との間の領域に狭められ、前記狭められた領域にSH_852、SH_866、SH_868、SH_820、SH_870及びSH_930マーカーが含まれているということが分かった。 Through the fine-mapping analysis, it was found that the PbBrA08 Banglim QTL was narrowed to the region between SH_852 and SH_930, and the narrowed region contained SH_852, SH_866, SH_868, SH_820, SH_870 and SH_930 markers. rice field.
実施例４．候補遺伝子の予測及び発現レベル分析
Fine-mapping結果において表現型を最もよく説明するＳＨ＿９２４を活用し、抵抗性系統において、その近傍のゲノム断片の構造を調べるために、CLC genomic workbenchを使用して09CR500のリシーケンシグデータを使用してBLASTN分析を遂行した結果、scaffold14322がBraA08g013480.3C遺伝子と相同性とが優れることを確認した（表７）。
Example 4. Candidate gene prediction and expression level analysis
Leveraging SH_924, which best describes the phenotype in the fine-mapping results, and resequencing data for 09CR500 using the CLC genomic workbench, we used CLC genomic workbench to examine the structure of its neighboring genomic fragments in resistant lines. BLASTN analysis confirmed that scaffold14322 has excellent homology with the BraA08g013480.3C gene (Table 7).
前記scaffold14322(21,498 bp)の1,518～3,183 bp領域は、BraA08g013480.3C遺伝子の２番目及び３番目エクソンと重畳しており、これは、09CR500にPbBrA08Banglimが含まれた21kb以上の挿入があることを意味する。 The 1,518-3,183 bp region of the scaffold14322 (21,498 bp) overlaps with the second and third exons of the BraA08g013480.3C gene, indicating that there is an insertion of 21 kb or more containing PbBrA08 Banglim in 09CR500. means.
また、FGENSHプログラム(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)を通じてscaffold14322に存在するハクサイ根こぶ病抵抗性関連候補遺伝子３個を予測し、前記遺伝子をそれぞれORF1、ORF2及びORF3と名付けた。ORF1及びORF3遺伝子は、Nodulin-likeタンパク質を、ORF2遺伝子は、疾病抵抗性に係わるTIR-NBS-LRRドメインをコーディングすると予想された（図４及び表８）。 In addition, three candidate genes related to clubroot resistance of Chinese cabbage present in scaffold14322 were predicted through the FGENSH program (http://linux1.softberry.com/berry.phtml), and the genes were named ORF1, ORF2 and ORF3, respectively. rice field. The ORF1 and ORF3 genes were predicted to code for Nodulin-like proteins, and the ORF2 gene was predicted to code for the TIR-NBS-LRR domain involved in disease resistance (Fig. 4 and Table 8).
前記３個の遺伝子のうち、ORF1（BraA08g013480.3C）遺伝子の２番目及び３番目エクソン部分は、参照遺伝子(Chiffu)と一部重畳しているが、ORF2遺伝子は、Ｃhiifuと重畳する部分がなかった。 Of the three genes, the second and third exons of the ORF1 (BraA08g013480.3C) gene partially overlap with the reference gene (Chifu), but the ORF2 gene does not overlap with Chiifu. rice field.
ORF2遺伝子は、大きさが6,808 bp（mRNA：4,598 bp）であり、７個のエクソンで構成されると予測されており、ORF3遺伝子は、大きさが1,319 bp（mRNA：366 bp）であり、３個のエクソンで構成されると予測された。 The ORF2 gene is 6,808 bp in size (mRNA: 4,598 bp) and is predicted to consist of 7 exons, the ORF3 gene is 1,319 bp in size (mRNA: 366 bp), Predicted to consist of 3 exons.
また、ハクサイ根こぶ病バンリム菌株の接種前・後に、２つの両親系統の根と葉組織において、ORF2及びORF3遺伝子の発現レベルをＰＣＲによって分析した結果、09CR501（感受性）に比べて、09CR500（抵抗性）でORF2及びORF3遺伝子の発現レベルが顕著に増加したということを確認した（図５）。その中で、ORF2遺伝子の構造は、植物病抵抗性に関与すると報告されたTIR-NBS-LRR構造を有していた。 In addition, the expression levels of ORF2 and ORF3 genes were analyzed by PCR in the root and leaf tissues of the two parental lines before and after inoculation with the Chinese cabbage clubroot strain Banlim. It was confirmed that the expression levels of the ORF2 and ORF3 genes were remarkably increased (Fig. 5). Among them, the structure of ORF2 gene had TIR-NBS-LRR structure, which was reported to be involved in plant disease resistance.
ハクサイの植物病源菌に対して完全な耐性を与えるＣＲ遺伝子(CRa, Crr1a)がTIR-NBS-LRRをコーディングすると知られており、NBS-LRR類型の植物病抵抗性遺伝子は、多様な植物病原体による感染に対する抵抗性調節に関与すると知られており、本発明では、バンリム病原型によって発病された根こぶ病の抵抗性に対する潜在的な候補遺伝子としてORF2遺伝子を最終選抜した。 It is known that the CR genes (CRa, Crr1a) that give complete resistance to Chinese cabbage plant pathogens encode TIR-NBS-LRR. In the present invention, the ORF2 gene was finally selected as a potential candidate gene for resistance to clubroot caused by the vanlim pathogen.
実施例５．分子マーカー開発及び根こぶ病抵抗性判別能分析
PbBrA08Banglim QTLを対象にしてFine-mappingを遂行し、根こぶ病抵抗性に対して最も有意味なマーカーとしてSH_852、SH_866、SH_868、SH_820、SH_870及びSH_930マーカーを選抜し、その中、SH_852、SH_866、SH_868、SH_820及びSH_870マーカーは、ORF2のTIR-NBS-LRRドメインをターゲットとして作製され（図６Ａ）、SH_930マーカーは、ORF3をターゲットとして作製された。
Example 5. Molecular marker development and clubroot resistance discrimination ability analysis
Fine-mapping was performed on the PbBrA08 Banglim QTL, and SH_852, SH_866, SH_868, SH_820, SH_870 and SH_930 markers were selected as the most significant markers for clubroot resistance, among which SH_852 and SH_866. , SH_868, SH_820 and SH_870 markers were generated targeting the TIR-NBS-LRR domain of ORF2 (Fig. 6A), and the SH_930 marker was generated targeting ORF3.
以後、根こぶ病の抵抗性に対する潜在的な遺伝子として最終選発されたORF2遺伝子を標的とするSH_852、SH_866、SH_868、SH_820及びSH_870マーカー（表２）をそれぞれ用いてハクサイ根こぶ病に対する抵抗性個体(R、09CR500）、感受性個体(S、09CR501；及びChiifu）及び抵抗性を示す異型接合体(H、09CRF1)を対象にしてＰＣＲを遂行した。従来の先行研究において、ハクサイ根こぶ病菌のバンリム病原型に対する抵抗性形質は、遺伝分析を通じて単因子優性として作用するので、Ｆ１植物体は、根こぶ病に対して抵抗性を示す。 Thereafter, resistance to clubroot of Chinese cabbage using SH_852, SH_866, SH_868, SH_820 and SH_870 markers (Table 2) targeting the ORF2 gene, which was finally selected as a potential gene for resistance to clubroot, was investigated. PCR was performed on individuals (R, 09CR500), susceptible individuals (S, 09CR501; and Chiifu) and resistant heterozygotes (H, 09CRF1). In previous studies, the resistance trait to the vanrim pathogen of Chinese cabbage clubroot acts as a single-factor dominance through genetic analysis, so F1 plants exhibit resistance to clubroot.
ＰＣＲ結果、抵抗性個体（R及びH）でのみバンドが検出され、感受性個体(S及びChiifu）では、バンドが検出されていないということを確認した（図６Ｂ）。これを通じて、本発明の分子マーカーがハクサイ根こぶ病に対する抵抗性または感受性ハクサイ個体を正確に区別可能であるということを分かった。 As a result of PCR, it was confirmed that bands were detected only in resistant individuals (R and H), but not in susceptible individuals (S and Chiifu) (Fig. 6B). Through this, it was found that the molecular marker of the present invention can accurately distinguish resistant or susceptible Chinese cabbage individuals to clubroot of Chinese cabbage.
また、前記５個のマーカーのうち、SH_866マーカーの実用化のための汎用性検定(validation)のために187個のBrassica core-collection系統（表１）を活用した。検定結果、９個の系統のみ抵抗性を示しており、一方、残り178個の植物は、２個の中間抵抗性系統(DI:13及び25)を含んで感受性を示した（図７）。 In addition, 187 Brassica core-collection strains (Table 1) were used for validation of the SH_866 marker for practical use among the five markers. As a result of the test, only 9 lines showed resistance, while the remaining 178 plants showed susceptibility, including 2 intermediate resistant lines (DI: 13 and 25) (Fig. 7).
187個のBrassica core-collection系統の遺伝子型評価結果、７個の抵抗性系統が表現型及び遺伝子型データと一致した。178個の感受性系統のうち、CSR_098(DI:25)及びCSR_045(DI:37.5)を除外し、177個系統の表現型が感受性遺伝子型によって一致した。すなわち、本発明のSH_866マーカーは、表現型と遺伝子型が約98.4%と一致し、根こぶ病に対する抵抗性及び感受性系統を正確に区分することができる（表９）。 Genotyping of 187 Brassica core-collection lines resulted in 7 resistant lines that were consistent with the phenotypic and genotypic data. Of the 178 susceptible lines, CSR_098 (DI: 25) and CSR_045 (DI: 37.5) were excluded, and the phenotypes of 177 lines were matched by the susceptible genotype. That is, the SH_866 marker of the present invention has a phenotype-genotype match of about 98.4%, and can accurately distinguish clubroot-resistant and susceptible lines (Table 9).
Claims (8)
前記分離されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセット組成物を用いて増幅反応を行って標的配列を増幅する段階と、
前記増幅段階の産物を検出する段階と、を含む、根こぶ病抵抗性または感受性ハクサイ個体を判別する方法。 isolating genomic DNA from a Chinese cabbage sample;
Using the isolated genomic DNA as a template, performing an amplification reaction using the primer set composition of claim 1 to amplify a target sequence;
and detecting the product of said amplification step.
前記形質転換された植物細胞から形質転換植物を再分化する段階と、を含む、根こぶ病に対する抵抗性が増加した形質転換植物体の製造方法。 Transforming a plant cell with a recombinant vector containing a Chinese cabbage-derived ORF2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57;
and regenerating the transformed plant from the transformed plant cells.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0192095 | 2021-12-30 | ||
| KR1020210192095A KR102415534B1 (en) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | Molecular marker based on high-resolution genetic map for discriminating clubroot disease-resistant or sensitive cabbage cultivar and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP7285976B1 JP7285976B1 (en) | 2023-06-02 |
| JP2023099265A true JP2023099265A (en) | 2023-07-12 |
Family
ID=82396968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022006431A Active JP7285976B1 (en) | 2021-12-30 | 2022-01-19 | Molecular markers for distinguishing clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage cultivars based on a high-density genetic map of Chinese cabbage and their uses |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7285976B1 (en) |
| KR (1) | KR102415534B1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005176619A (en) * | 2003-12-16 | 2005-07-07 | Mie Prefecture | Selection marker for clubroot-resistant rapes |
| JP2012065567A (en) * | 2010-09-22 | 2012-04-05 | National Agriculture & Food Research Organization | Method of making clubroot resistance cruciferae plant |
| KR102116428B1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-05-28 | 충남대학교 산학협력단 | Primer set for discriminating clubroot disease-resistant Brassica rapa cultivar and uses thereof |
| WO2022136239A1 (en) * | 2020-12-21 | 2022-06-30 | NPZ Innovation GmbH | New native clubroot resistance in rapeseed brassica napus |
| WO2022164752A1 (en) * | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Clubroot resistance in brassica |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101704382B1 (en) * | 2015-11-06 | 2017-02-08 | 충남대학교산학협력단 | Specific primer set for discrimination of cabbage clubroot disease-resistant cultivar and uses thereof |
| KR102167788B1 (en) * | 2018-11-30 | 2020-10-19 | 대한민국 | A primer set for discrimination of clubroot disease-resistant cultivar and idenditication method by using the same |
-
2021
- 2021-12-30 KR KR1020210192095A patent/KR102415534B1/en active IP Right Grant
-
2022
- 2022-01-19 JP JP2022006431A patent/JP7285976B1/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005176619A (en) * | 2003-12-16 | 2005-07-07 | Mie Prefecture | Selection marker for clubroot-resistant rapes |
| JP2012065567A (en) * | 2010-09-22 | 2012-04-05 | National Agriculture & Food Research Organization | Method of making clubroot resistance cruciferae plant |
| KR102116428B1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-05-28 | 충남대학교 산학협력단 | Primer set for discriminating clubroot disease-resistant Brassica rapa cultivar and uses thereof |
| WO2022136239A1 (en) * | 2020-12-21 | 2022-06-30 | NPZ Innovation GmbH | New native clubroot resistance in rapeseed brassica napus |
| WO2022164752A1 (en) * | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Clubroot resistance in brassica |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHOI, R., ET AL.: ""Quantitative trait locus mapping of clubroot resistance and Plasmodiophora brassicae pathotype Bang", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 21, JPN6022052726, 10 June 2020 (2020-06-10), pages 4157 - 15, ISSN: 0005057294 * |
| KATO, T., ET AL.: ""Fine mapping of the clubroot resistance gene CRb and development of useful selectable marker in Bra", BREEDING SCIENCE, vol. 63, JPN6022052725, 2013, pages 116 - 124, ISSN: 0005057295 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102415534B1 (en) | 2022-07-01 |
| JP7285976B1 (en) | 2023-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7956239B2 (en) | QTL controlling Sclerotinia stem ROT resistance in soybean | |
| US8039686B2 (en) | QTL “mapping as-you-go” | |
| AU2017203293B2 (en) | Qtls associated with and methods for identifying whole plant field resistance to sclerotinia | |
| CN112351679A (en) | Methods for identifying, selecting and producing southern corn rust resistant crops | |
| US20130198912A1 (en) | Dna sequence that confers aphid resistance in soybean | |
| CN111988988A (en) | Method for identifying, selecting and producing bacterial blight resistant rice | |
| Chien et al. | Phosphate transporter PHT1; 1 is a key determinant of phosphorus acquisition in Arabidopsis natural accessions | |
| Thakro et al. | A superior gene allele involved in abscisic acid signaling enhances drought tolerance and yield in chickpea | |
| EP3169786B1 (en) | Qtl associated with and methods for identifying shatter resistance in canola | |
| Xu et al. | Genetic variation in the glycine-rich protein gene BnGRP1 contributes to low phosphorus tolerance in Brassica napus | |
| JP7285976B1 (en) | Molecular markers for distinguishing clubroot-resistant or susceptible Chinese cabbage cultivars based on a high-density genetic map of Chinese cabbage and their uses | |
| KR102172873B1 (en) | SRPK4 gene for enhancing plant resistance to fusarium wilt and uses thereof | |
| KR102717766B1 (en) | NAC013 gene controlling pithiness in radish taproots and uses thereof | |
| WO2023068618A1 (en) | Nac013 gene inducing pithiness in radish storage roots, and use thereof | |
| WO2024175308A1 (en) | Plants with improved performance | |
| WO2023035011A1 (en) | Compositions and methods for conferring resistance to geminivirus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220119 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221212 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230210 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230515 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230523 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7285976 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |