JP2023090723A - 超長鎖脂肪酸組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】超長鎖不飽和脂肪酸が有益な健康効果を有することを示している。従って、体内で必要とされるこれらの脂肪酸を満たすためには、ＶＬＣＦＡｓの組成物を提供する必要がある。しかしながら、既知の生物学的原料において見られるＶＬＣＵＳＦＡｓの量は非常に限定されており、そして、そのようなＶＬＣＵＳＦＡｓを含む既知の組成物は、より短い脂肪酸前駆体から合成されたものであるか、遺伝子組換え技術を用いたプロセスによるものであるか、又はトランスジェニック植物からのものである。【解決手段】本発明は、超長鎖不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物を含む組成物に関する。その脂肪酸混合物の脂肪酸は天然オイルより分離される。特に、その脂肪酸混合物は超長鎖一価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＭＵＦＡｓ）及び超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡｓ）の両方の濃縮した量を含む。本発明の一の態様において、その脂肪酸混合物のコレステロール量が最小限に抑えられ、そして産生のための方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は超長鎖不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物に関する。特に、本発明は、超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価不飽和脂肪酸の両方の量が濃縮されているような脂肪酸混合物を含む組成物を提供する。

長鎖脂肪酸の中で、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡｓ）、及び特に長鎖オメガ３脂肪酸（ＬＣｎ３）、鎖長Ｃ２０～Ｃ２２の脂肪酸は、文献において最も関心を受けている。頭字語である（エイコサペンタエン酸の）ＥＰＡ及び（ドコサヘキサエン酸の）ＤＨＡは、魚油及び他の原料からの価値あるオメガ３酸を記載することにおいて、だれもが知っている名前になっている。また、植物原料由来のα－リノレン酸（ＡＬＡ）の豊富な製品は商用利用可能である。近年、鎖長Ｃ２０～Ｃ２２を有する長鎖一価不飽和脂肪酸（ＬＣＭＵＦＡｓ）は科学的な関心の焦点になるようになった。例えば、Ｂｒｅｉｖｉｋ ａｎｄ Ｖｏｊｎｏｖｉｃ，Ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ，ＵＳ ９，４０９，８５１Ｂ２参照。

これに関して、脂質はＸがそれらのアルキル鎖内の炭素原子数であって、かつＹがそのような鎖内の二重結合の数であって；かつここで「ｎＺ」がメチル末端基から最初の二重結合までの炭素原子数である、式Ｘ：ＹｎＺにより記載されることを記述される。多価不飽和脂肪酸において、各二重結合は一つのメチレン（－ＣＨ２）基によって次の二重結合と離れている。この命名法を用いて、ＥＰＡは２０：５ｎ３；ＤＨＡは２２：６ｎ３かつＡＬＡはＣ１８：３ｎ３であって、一方でＣ２０：１ｎ９及びＣ２２：１ｎ１１は北大西洋の魚油における最も豊富なＬＣＭＵＦＡｓを示す。

また、さらに、魚油のようなオメガ３脂肪酸の天然原料は、Ｃ２０～Ｃ２２よりもより短い及びより長い長さの脂肪酸を含む。本明細書で用いられるように、超長鎖脂肪酸（又はＶＬＣＦＡｓ）という用語は、２２炭素原子数より長い鎖長を有する平均脂肪酸（又はＦＡｓ）を意図し；超長鎖多価不飽和脂肪酸（又はＶＬＣＰＵＦＡｓ）という用語は、２２炭素原子数より長い鎖長を有する平均多価不飽和脂肪酸（又はＰＵＦＡｓ）を意図し；超長鎖一価不飽和脂肪酸（又はＶＬＣＭＵＦＡｓ）という用語は、２２炭素原子数より長い鎖長を有する平均一価不飽和脂肪酸（又はＭＵＦＡｓ）を意図し；一方でＶＬＣｎ３という用語は、２２炭素原子数より長い鎖長を有する多価不飽和オメガ３脂肪酸を意味し、ＶＬＣｎ３がＶＬＣＰＵＦＡのサブグループを示すことが理解されている。超長鎖飽和脂肪酸（ＶＬＣＳＦＡｓ）という用語は２２炭素原子数より長い鎖長を有する平均飽和脂肪酸（又はＳＦＡｓ）を意図する。超長鎖不飽和脂肪酸（又はＶＬＣＵＳＦＡｓ）という用語は、２２炭素原子数より長い鎖長を有する平均不飽和脂肪酸、すなわち、２４炭素原子以上の鎖長を有する不飽和脂肪酸を意図し、かつＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの両方を含む。

ＥＰＡ及びＤＨＡの豊富な海産オメガ３濃縮物を生産するために、短鎖脂肪酸及びＣ２２脂肪酸より長い分子の両方を取り除くことによって、多価不飽和Ｃ２０～Ｃ２２画分を濃縮する慣習の産業的なプロセスが設計されている。そのようなプロセスの例は、分子／短行程蒸留、尿素画分化、抽出及びクロマトグラフィー工程であり、それらのすべては海産脂肪酸及び他の原料由来の同様の材料のＣ２０～Ｃ２２画分を濃縮するために利用されうる。これらの工程のレビューはＢｒｅｉｖｉｋ Ｈ（２００７）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ．Ｉｎ：Ｂｒｅｉｖｉｋ Ｈ（ｅｄ）Ｌｏｎｇ－Ｃｈａｉｎ Ｏｍｅｇａ－３ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｏｉｌｓ．Ｔｈｅ Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ，ＰＪ Ｂａｒｎｅｓ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｉｄｇｗａｔｅｒ，ＵＫ，ｐｐ １１１－１４０において提供される。Ｃ２０～Ｃ２２ＭＵＦＡｓの濃縮のためのいくつかの工程は米国９，４０９，８５１Ｂ２において示される。

多価不飽和脂肪酸はとても酸化しやすい。オリゴマー／ポリマーの酸化産物について上限を課す薬局方及び自主基準に従うために、例えば、蒸留、抽出及び同様の工程によって、ＤＨＡのそれらの鎖長を有する成分を取り除くことが一般的である。さらに、海産油のそのようなより高分子成分は、コレステロールを含むそのようなオイルの所望されない不けん化構成物と、並びに臭素化ジフェニルエーテルのような有機汚染物質と典型的に関連している。

しかしながら、オメガ３酸を含む、生物学的に活性なＰＵＦＡＳは、ＥＰＡ及びＤＨＡのＣ２０～Ｃ２２鎖長に限定されない。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ‘ｓ Ｓｏｉｃｉｅｔｙ’ｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙに従い、オメガ３及びオメガ６ファミリーの両方のＶＬＣＰＵＦＡｓは網膜、脳及び精液内に存在する。２０１４年に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ‘ｓ Ｓｏｉｃｉｅｔｙ’ｓ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙは、哺乳動物のＶＬＣＰＵＦＡｓの代謝のレビューによって更新された。このレビューでは、ＶＬＣＰＵＦＡｓが哺乳動物体内で網膜組織、精巣、脳、及び精子に分離されている情報を示している。さらに、このレビューでは、眼の最適動作及び脳組織及び男性不妊症についてそれらの重要性を含む、ＶＬＣＰＵＦＡｓの価値のある生理学的な役割上とても役立つ情報を提供している。一方で、そのレビューでは、ＬＣＰＵＦＡｓと異なり、ＶＬＣＰＵＦＡｓが食事供給源から得ることができず、そしてそれゆえより短い脂肪酸前駆体からその場で合成されなければならないことを述べている。

この信念の結果として、さらなる取り組みにおいて組換え技術を用いるＶＬＣＰＵＦＡｓの産生に焦点を当てている。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（ＵＳ２００９／０２０３７８７Ａ１）では、ＥＬＯＶＬ４遺伝子を用いるＣ２８～Ｃ３８ＶＬＣＰＵＦＡｓを産生するための組換えプロセスを開示している。また、Ｋａｔａｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２００８／０６１３３４）では、ＶＬＣＭＵＦＡ Ｃ２４：１ｎ９の上昇した濃度の種油、及びまたＣ２６：１ｎ９のわずかな程度の種油が、トランスジェニック種子から回収されうることを開示している。近年の本の章において、Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＡｎｄｅｒｓｏｎは、網膜内の疾病を治療することにおいてＶＬＣＰＵＦＡｓの重要性が、ＶＬＣＰＵＦＡｓが網膜の欠陥において再構成されうる場合に、固められると考えられること述べている。「しかしながら、ＶＬＣＰＵＦＡｓはマウスの給餌試験を可能にするための十分に多量の化学合成ができない」（Ｂｅｎｎｅｔｔ ＬＤ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＥ（２０１６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ＶＬＣ－ＰＵＦＡ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｉｎ：Ｃ．Ｂｏｗｅｓ Ｒｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｒｅｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８５４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。この懸念より、ＶＬＣＰＵＦＡｓを動物の餌に加えている研究はなく、そしてさらに、ヒトの臨床研究も全くない理由を示している。我々の知る限りでは、ＷＯ２０１６／１８２４５２においてＢｒｅｉｖｉｋ及びＳｖｅｎｓｅｎは、天然オイルから、初めて超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡｓ）、特に超長鎖オメガ３脂肪酸（ＶＬＣｎ３ｓ）の組成物、並びにそのようなＶＬＣｎ３ｓの高い濃度を含む組成物を産生するための方法を開示している。Ｂｒｅｉｖｉｋ 及び Ｓｖｅｎｓｅｎはさらに魚油のような天然オイルにおける少量のＶＬＣｎ３ｓのみを開示し、そしてこれらの及び他の超長鎖脂肪酸が、その目的が鎖長Ｃ２０～Ｃ２２を有する高濃縮オメガ３脂肪酸である伝統的な海産オメガ３濃縮物の産生時に実質的に取り除かれる理由を説明している。

オメガ３脂肪酸、及び特にＬＣＰＵＦＡｓ ＥＰＡ及びＤＨＡは、広範な有益な健康効果を有すること既知であり、従って異なる使用について既知である。また、上述のように、近年、海産のＣ２０～Ｃ２２ＬＣＭＵＦＡｓは有益な健康効果を有することが知られるようになった。さらに、また、ＶＬＣＭＵＦＡｓが有益な健康効果を有しうる徴候がある。例えば、超長鎖脂肪酸（すなわち、ＶＬＣＭＵＦＡ及びＶＬＣＰＵＦＡ）への伸長のための酵素を欠損したマウスは、鱗状及びしわの多い皮膚並びに著しく損傷した表皮バリア機能を示し、出生後数時間以内に死に（Ｖａｓｉｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．５ ４７１―４８２ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｌ４８０）、ＶＬＣＵＳＦＡｓの機能及び必要性を示している。

超長鎖不飽和脂肪酸が有益な健康効果を有することを示している。従って、体内で必要とされるこれらの脂肪酸を満たすためには、ＶＬＣＦＡｓの組成物を提供する必要がある。しかしながら、既知の生物学的原料において見られるＶＬＣＵＳＦＡｓの量は非常に限定されており、そして、そのようなＶＬＣＵＳＦＡｓを含む既知の組成物は、より短い脂肪酸前駆体から合成されたものであるか、遺伝子組換え技術を用いたプロセスによるものであるか、又はトランスジェニック植物からのものである。

本発明は超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価脂肪酸の両方の脂肪酸混合物を含む組成物を提供する。その超長鎖不飽和脂肪酸は天然オイルから由来し、そしてこれらの脂肪酸の量は濃縮されている。

一の側面において、その組成物は、脂肪酸混合物を含み、ここでその脂肪酸混合物は、超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価不飽和脂肪酸の両方を含み、かつさらにここで脂肪酸混合物のコレステロールの量は最小限に抑えられている。

本発明はさらにＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓの両方を含む脂肪酸混合物を含む組成物の産生の方法を提供し、ここでその脂肪酸混合物はオイル材料より調製され、その方法は：
ｉ）オイル材料に存在する遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換すること；及び
ｉｉ）ステップｉ）のオイル材料に存在する超長鎖脂肪酸エステルからステップｉ）のコレステロールエステルを分離すること
のステップを含んでいる。

本発明の組成物は、濃縮した量の超長鎖不飽和脂肪酸の脂肪酸混合物を含む。特に、その脂肪酸混合物は、超長鎖一価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＭＵＦＡｓ）及び超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡｓ）の両方の濃縮した量を含む。一の態様において、脂肪酸混合物のコレステロール量は特に低い。

組成物の脂肪酸混合物は主に脂肪酸を含み、そして好ましくはその脂肪酸混合物の少なくとも９０．０重量％、例えば少なくとも９５．０重量％は異なる脂肪酸である。その調製した組成物は、従って好ましくはオイル組成物であり、また脂肪酸組成物又は濃縮した組成物と称され、ここでこの組成物はＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの両方の濃縮した量を含む。

第一の態様において、その組成物は、少なくとも０．５重量％、例えば少なくとも１．０重量％、例えば少なくとも２．０重量％のＶＬＣＭＵＦＡｓの脂肪酸混合物を含む。より好ましくは、その脂肪酸混合物は少なくとも４重量％のＶＬＣＭＵＦＡｓ、例えば５重量％より多くの、８重量％より多くの、１５重量％より多くの、２０重量％より多くの、３０重量％より多くの、４０重量％より多くの、５０重量％より多くの又は６０重量％よりさえも多くの超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む。一の態様において、その脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物の４．０～５０．０重量％の、例えば８．０～５０．０重量％の量のＶＬＣＭＵＦＡｓを含む。

脂肪酸混合物の、ＶＬＣＭＵＦＡｓ、及び任意の他のＶＬＣＦＡｓは、２２炭素原子より長い鎖長を有する。従って、そのＶＬＦＡｓは本明細書で２４炭素原子数以上の鎖長を有すると定義される。一の態様において、その組成物の脂肪酸混合物は少なくとも一つの２４炭素数以上の長さの鎖長を有するＶＬＣＭＵＦＡを含む。

好ましくは、その組成物は異なる、一価不飽和及び多価不飽和の両方であるようなＶＬＣＵＳＦＡｓの混合物を含む。これに関して、そのＶＬＣＵＳＦＡｓは２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０又は４２の炭素数の鎖長を有しうる。好ましくは、その組成物のＶＬＣＵＳＦＡｓは２４、２６、２８、３０及び３２炭素原子数の鎖長を有する脂肪酸の混合物である。一の態様において、その脂肪酸混合物は少なくとも１％の、例えば少なくとも３％の、例えば少なくとも６％の、例えば少なくとも１０％の２４炭素原子数より長い鎖長、すなわち２６以上の炭素原子数を有するＶＬＣＭＵＦＡｓを含む。

その組成物に存在しうるＶＬＣＵＭＦＡｓは、これらに限定されないが、以下の脂肪酸の群のうちいずれか一つより選択される：Ｃ２４：１（テトラコセン酸（ネルボン酸））、Ｃ２６：１（ヘキサコセン酸）、Ｃ２８：１（オクタコセン酸）、Ｃ３０：１及びＣ３２：１。

一の態様において、Ｃ２８：１脂肪酸の量は少なく、そしてこの特定のＶＬＣＭＵＦＡの量は、その脂肪酸混合物の４．０重量％未満、３．０重量％未満、２．０重量％未満、例えば１．０重量％未満、そして好ましくは０．５重量％未満である。

ＶＬＣＭＵＦＡｓについて、本出願人は、未加工のオイルからそれらを分離することができ、そして用いられる未加工のオイルにおける同じＶＬＣＭＵＦＡｓの含量と比較して量を増やした。一の態様において、本組成物の脂肪酸混合物は挙げられる量において任意のこれらのＶＬＣＭＵＦＡｓを含む：
Ｃ２４：１：４．０～５０．０％、例えば７．０～４０．０％、８．０～２０．０％、例えば１３．０～２０．０％、例えば約４０％；
Ｃ２６：１：１．０～２０．０％、例えば６．０～２０．０％、例えば１０．０～１８．０、より具体的には１１．０～１５．０％、例えば約１３％。

本発明の組成物は、豊富な組成物であって、ここで、不飽和脂肪酸、そして特にＶＬＣＵＳＦＡｓは分離され、そしてその濃度は用いられる未処理のお入りにおけるこれらの含量と比較して増加している。従って、その豊富な組成物は未処理の原料から選択され、分類され、かつ濃縮される所望される脂肪酸を含む。

その組成物の脂肪酸混合物は、超長鎖一価不飽和脂肪酸に加えて、さらに超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む。これらの多価不飽和脂肪酸は、２，３，４，５，６，７又は８つの二重結合を含みうる。

一の態様において、その脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物内に少なくとも０．５重量％、例えば少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも５重量％、少なくとも８重量％、又は少なくとも１０重量％のＶＬＣＰＵＦＡｓを含む。一の態様において、その脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物中に５．０～４０．０重量％、例えば７．０～１５．０重量％の量のＶＬＣＰＵＦＡｓを含む。その脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物に少なくとも５．０重量％、８．０重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％又はさらに少なくとも６０重量％のＶＬＣＰＵＦＡｓを含みうる。

例えば、その組成物の脂肪酸混合物は、ＶＬＣＭＵＦＡｓに加えて、挙げられる量においてＶＬＣＰＵＦＡｓの以下の群のいずれか又はこれらの任意の組み合わせを含みうる：
Ｃ２４ ＶＬＣＰＵＦＡＳ：少なくとも１．０％：例えば１．０～２０．０％、例えば２．０～１２．０％又は
Ｃ２６ ＶＬＣＰＵＦＡｓ：０．５～３０．０％；例えば１．０～１２．０％；又は
Ｃ２８ ＶＬＣＰＵＦＡｓ：１．０～７０．０％、例えば２．０～３０．０％、例えば少なくとも５％、又は
Ｃ３２ ＶＬＣＰＵＦＡｓ：０．０～５．０％、
Ｃ３２～Ｃ４０ ＶＬＣＰＵＦＡｓ：０．０～５．０％。

ＶＬＣＰＵＦＡｓについて、本出願人は未処理のオイルからこれらを分離でき、用いられる未処理の同じＶＬＣＰＵＦＡｓの量と比較してこれらの量を増やすことができた。一の態様において、本組成物の脂肪酸混合物は、挙げられる量の任意において以下のＶＬＣＰＵＦＡｓ、又はこれらの任意の組み合わせを含む：
Ｃ２４：５ｎ３：１．０～１０．０％、例えば約５％；
Ｃ２６：４ｎ３：１．０～６．０％、例えば約４％；
Ｃ２６：５ｎ３：１．０～７．０％、例えば約５％；
Ｃ２６：６ｎ３：少なくとも５％、例えば５．０～２０．０％、例えば約１０％；
Ｃ２８：４ｎ３：１．０～５．０％、例えば約３％；
Ｃ２８：５ｎ３：０．５～３．０％、例えば約２％；
Ｃ２８：６ｎ３：２．０～１０．０％、例えば約６％；
Ｃ２８：７ｎ３：０．５～２．０％、例えば約１％；
Ｃ２８：８ｎ３：４．０～６０％、例えば約４０％；
Ｃ３０：５、Ｃ３０：６及びＣ３０：８：０．５～２．０％；及び
Ｃ３２～Ｃ４０ ＰＵＦＡｓ：０．０～５．０％。

一の態様において、その脂肪酸混合物は少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも約４～５０％のＣ２８ＶＬＣＰＵＦＡｓを含む。特定の態様において、その脂肪酸混合物は、その脂肪酸混合物の少なくとも５重量％の総量において、Ｃ２８：６ｎ３、Ｃ２８：７ｎ３及びＣ２８：８ｎ３脂肪酸のいずれかを含む。従って、少なくとも５重量％の；少なくとも８重量％の又は少なくとも１０重量％のＣ２８：６、Ｃ２８：７及び／又はＣ２８：８の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物が産生されうる。また、同時にＣ２８：４ｎ３、Ｃ２８：５ｎ３及び／又はＣ２８：６ｎ３の濃縮した画分を産生されうる。同様に、Ｃ２４：５ｎ３及び／又はＣ２４：６ｎ３の濃縮した脂肪酸混合物を産生することができ、そして一の態様において、その脂肪酸混合物は少なくとも５重量％のＣ２４：５ｎ３脂肪酸を含む。さらに別の特定の態様において、その脂肪酸混合物は少なくとも５％のＣ２６ＶＬＣＰＵＦＡｓ、例えば少なくとも５％のＣ２６：６ｎ３のＶＬＰＵＦＡを含む。

ＶＬＣＰＵＦＡｓは例えば、オメガ３、オメガ６又はオメガ９脂肪酸であり、そして好ましくはオメガ３又はオメガ６脂肪酸であり、そして最も好ましくはそれらはオメガ３ＰＵＦＡｓである。特定の態様において、その組成物は、これらに限定されないが、いずれか一つの以下の脂肪酸の群より選択されるＶＬＣＰＵＦＡｓを含む：Ｃ２４：５ｎ３、Ｃ２６：６ｎ３、Ｃ２８：６ｎ３、Ｃ２８：８ｎ３。一の態様において、その脂肪酸混合物はその脂肪酸混合物の少なくとも１０重量％のオメガ３ＶＬＣＰＵＦＡｓを含む。

従って、本発明の組成物は超長鎖一価及び多価不飽和脂肪酸の両方を含む。一の態様において、本組成物の脂肪酸混合物は少なくとも４％のＶＬＣＭＵＦＡｓ、例えば少なくとも８％のＶＬＣＭＵＦＡｓ及び少なくとも１％のＶＬＣＰＵＦＡｓを含む。一の態様において、本組成物の脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物の少なくとも９．０重量％のＶＬＣＵＳＦＡｓを、例えば脂肪酸混合物の１０重量％より多くの、１５重量％より多くの、２０重量％より多くの、３０重量％より多くの、４０重量％より多くの、５０重量％より多くの、６０重量％より多くの、７０重量％より多くの、８０重量％より多くの、又はさらに９０重量％より多くの、ＶＬＣＵＳＦＡを含む。一の態様において、その脂肪酸混合物は、少なくとも１重量％の２４炭素原子数より長い鎖長を有する超長鎖不飽和脂肪酸（ＶＬＣＵＳＦＡｓ）を、例えば少なくとも１重量％の２４炭素原子数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む。そのＶＬＣＵＳＦＡ含量はＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの組み合わされる量である。一の態様において、その脂肪酸混合物におけるＶＬＣＭＵＦＡｓとＶＬＣＰＵＦＡｓとの間の重量比は、例えばＶＬＣＭＵＦＡｓとオメガ３ＶＬＣＰＵＦＡｓとの間で、好ましくは３：１～１：２の範囲内である。

高濃度のＶＬＣＵＳＦＡｓが存在すると、自然に短鎖及び長鎖の脂肪酸が低い濃度になる。しかしながら、いくつかの長鎖不飽和脂肪酸は組成物中、特に有益な健康効果を有するような脂肪酸に存在しうる。一の態様において、ＶＬＣＵＳＦＡｓに加えて、その脂肪酸組成物は一以上のＬＣＰＵＦＡ、例えば一以上のＣ２０～Ｃ２２ＰＵＦＡｓを含む。ある態様において、その脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物の少なくとも５重量％のＬＣＰＵＦＡｓを、例えば、少なくとも１０重量％の、少なくとも２０重量％の、少なくとも２５重量％の、少なくとも３０重量％の、少なくとも４０重量％の、少なくとも５０重量％の、又は少なくとも６０重量％の少なくとも一つのＬＣＰＵＦＡを、例えば一以上のＣ２０～Ｃ２２長鎖ＰＵＦＡｓを含む。一の態様において、そのＬＣＰＵＦＡｓはＥＰＡ、ＤＨＡ及びオメガ３ＤＰＡ（ａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、２２：５ｎ３）の少なくとも一つを含む。本発明のある態様において、本組成物のＥＰＡ：ＤＨＡの重量比は、約１：１５から約１０：１、約１：１０から約８：１、約１：８から約６：１、約１：５から約５：１、約１：４から約４：１、約１：３から約３：１又は約１：２から約２：１に及ぶ。一の態様において、本組成物の脂肪酸混合物は、脂肪酸混合物に、少なくとも８重量％のＶＬＣＭＵＦＡｓ、少なくとも１重量％のＶＬＣＰＵＦＡｓ及び少なくとも５重量％のＬＣＰＵＦＡｓを含む。

さらに、本発明の組成物は、Ｃ１８及び長鎖一価不飽和脂肪酸（ＬＣＭＵＦＡｓ）を含むことができ、そしてその脂肪酸混合物は一の態様において、少なくとも１重量％のＣ１８～Ｃ２２ＭＵＦＡｓ、例えば少なくとも１重量％のＣ２０～２２ＭＵＦＡｓを含む。一の態様において、その脂肪酸混合物は天然オイル由来の少なくとも１重量％のＶＬＣＭＵＦＡＳ及び少なくとも１重量％のＶＬＣＰＵＦＡｓを含み、そしてここでその脂肪酸混合物はさらに少なくとも１０重量％のＣ２０～Ｃ２２一価不飽和脂肪酸を含む。本組成物のそのようなＭＵＦＡｓは、これらに限定されないが、以下の脂肪酸の群より選択される：オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、バクセン酸（Ｃ１８：１ｎ７）、ゴンドイン酸（Ｃ２０：１ｎ９）、ガドレイン酸（Ｃ２０：１ｎ１１）、エルカ酸（Ｃ２２：１ｎ９）及びセトレ酸（Ｃ２２：１ｎ１１）。一の態様において、エルカ酸の量は、本組成物の脂肪酸混合物の８．０重量％未満、例えば５重量％未満、好ましくは３重量％未満そしてさらに好ましくは２重量％未満である。別の態様において、オレイン酸の量は、本組成物の脂肪酸混合物の５．０重量％未満、そしてより好ましくは２重量％未満である。

さらに、三重結合を含む、アセチレン酸、例えばｔｒａｎｓ－１１－オクタデセン－９－イン酸と称されるキシメニン酸（Ｃ１８Ｈ３０Ｏ２、Ｃ１８：１）は、好ましくは本脂肪酸混合物に存在せず、そしてアセチレン酸の量は、脂肪酸混合物の０．１重量％未満である。

さらに、ＶＬＣＵＳＦＡｓを濃縮した脂肪酸混合物は、好ましくは全ての長さの、少量の飽和脂肪酸を含む。用途によっては、超長鎖飽和脂肪酸（ＶＬＣＵＳＦＡｓ）を２％より高い濃度で含むことが有益な場合もあるが、その量は好ましくは低く保つべきである。総じて、その脂肪酸混合物は、１．０％未満の飽和脂肪酸、より好ましくは０．５％未満の飽和脂肪酸を含む。特に、Ｃ１６：０（パルミチン酸）、Ｃ１８：０（ステアリン酸）、及びＣ２０：０（アラキジン酸）は低く、そして好ましくはこれらの含量は、総じて、１．０％未満である。特に、ステアリン酸の量は低く、そして好ましくは１．０％未満であり、そしてより好ましくは０．５％未満である。さらに、超長鎖飽和脂肪酸（ＶＬＣＳＦＡ）の量は低く、そしてその脂肪酸Ｃ２４：０、Ｃ２６：０、Ｃ２８：０及びＣ３０：０の量は好ましくは合計して、その脂肪酸混合物の２．０重量％未満、より好ましくは１．０％重量未満、そして最も好ましくは０．５％重量未満である。

ある態様において、その組成物の脂肪酸混合物の脂肪酸は、天然原料のオイル、例えば水生動物又は植物、天然の非水性植物油又はそのような油の組み合わせからの油より生じ、すなわち、分離される。好ましくは、その脂肪酸は、水性動物又は植物から、例えば、海産又は淡水生物からの、オイル、又はオイルの組み合わせから生じる。より好ましくは、その脂肪酸は、海産油より生じ、すなわち、オイルは海産動物又は植物より生じている。一の態様において、その天然オイルは海綿から由来せず、そして海綿の群は天然原料の群から否定される。海産及び／又は淡水の海綿のいずれからのオイルは否定される。その海産油は、これらに限定されないが、魚油、軟体動物油、甲殻類油、海産哺乳動物油、プランクトン油、藻類油、及び微細藻類油を含むリストより選択されうる。また、脂肪酸混合物の脂肪酸は上記のような２以上の天然原料の組み合わせから生じうる。「魚油」という用語は、任意の魚の種類に存在する全ての脂質画分を含む。「魚」は、硬骨魚及び軟骨魚綱（サメ、エイ、及びラットフィッシュのような軟骨性の魚）、円口類及び無顎類を含む用語である。未処理の原料の選択に限定されず、硬骨魚の中で好ましい種類はカタクチイワシ科、アジ科、ニシン科、キュウリウオ科、サケ科及びサバ科のような魚の科の間で見られうる。由来されうるそのようなオイルからの特定の魚の種類は、ニシン、カラフトシシャモ、カタクチイワシ、サバ、ブルーホワイティング、イカナゴ、タラ、及びスケトウダラを含む。そのオイルは魚の全体、又は魚の一部、例えば肝臓又は魚の切り身を取り除いて残った部分から由来されうる。サメのような、軟骨魚類の種類の間で、そのオイルは好ましくは肝臓から得られうる。「軟体動物オイル」という用語は、軟体動物門からの任意の種類、例えば、イカ及びタコのような頭足類の綱の任意の動物において存在する全ての脂質画分を含む。本明細書で利用されるように、「プランクトン油」という用語は、大水域に生息し、流れに逆らって泳ぐことができず、クラゲなどの大型生物は含まれない多様な生物の集まりである全ての脂質画分を意味する。「天然植物オイル」という用語は、藻類及び微細藻類意味し、そしてまた、任意の単細胞生物からのオイルを含むことを意味する。それゆえ、その天然植物オイルは、非トランスジェニック植物、野菜類、種子類、藻類、微細藻類及び単細胞生物より由来した全てのオイルより選択されうる。

本明細書で用いられるように、「天然オイル」及び「天然材料からのオイル」及び「未処理のオイル」という用語は、これらに限定されないが、一以上の天然生物から得られるグリセリド、リン脂質、ジアシルグリセリルエーテル、ろうエステル、ステロール、ステロールエステル、セラミド又はスフィンゴミエリンを含む、脂質を含む任意の脂肪酸を意味する。その天然生物は遺伝的に修飾されていない（非ＧＭＯ）。

天然において、脂肪酸の二重結合は全てｃｉｓ型である。多価不飽和オメガ３及びオメガ６脂肪酸における各二重結合は一つのメチレン（－ＣＨ２－）基によって次の二重結合から離れている。脂肪酸分子中の二重結合の全てのｃｉｓ型及び正確な位置は、脂肪酸の生物学的変化及び作用に必要である。体内の天然脂肪酸の作用は、化学的に合成した脂肪酸から離れて配置することができ、それらはいくつかのトランス異性体及び、二重結合の位置が有益な天然脂肪酸のそれより逸脱する脂肪酸を必ず含み、その全てがそれらの天然対応物に競合する生物学的な効果をもたらしうる。本発明の脂肪酸混合物のＶＬＣＰＵＦＡｓは全てｃｉｓ型である。

本発明の脂肪酸混合物の脂肪酸及び組成物は天然原料から分離され、濃縮され、脂肪酸の濃縮した量を得る。少量のＶＬＣｎ３ｓのみが魚油のような天然オイルに存在する。ＶＬＣＵＳＦＡｓが、ある動物種のわずかな器官において微量に天然において見られるのみであるので、商用生産のための手段は存在しなかった。さらに、ＤＨＡのそれより長い、すなわちＣ２２より長い鎖長を有する脂肪酸は、たいてい海産油から脂肪酸を精製するためのプロセスにおいて除去され、より高分子量の成分が所望されない構成物、例えば、脂肪酸より形成したオリゴマー及びポリマー、及びまた不けん化構成物、例えばコレステロールに関連される。従って、海産油から多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡｓ）の濃縮した組成物を調製する際に、より重いＶＬＣＵＳＦＡｓはたいてい除去され、他の重い成分を除去することの結果として、廃棄されている。

本出願人は今回、ＶＬＣＵＳＦＡｓが海産油からのような天然原料から調製されうることを発見し、そのような新たな組成物を提供する。従来は他の脂肪酸組成物の産生からの、特にＥＰＡ及びＤＨＡの豊富な組成物の調製物からの、廃棄産物と考えられていたものが、現在では価値あるＶＬＣＵＳＦＡを含む組成物を調製するために用いられうるので、一つの利点は、未処理の材料の改善した、持続可能な使用である。本出願人は驚くべきことに、天然原料ではそのような脂肪酸の非常に少ない含量を有するが、海産油のような天然原料からのＶＬＣＵＦＳＡｓを分離しそして濃縮する（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）（すなわち濃縮する（ｅｎｒｉｃｈ））ことによりＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓの両方を含む、請求した組成物を調製できることを発見した。特に、本出願人は、蒸留によってＶＬＣ脂肪酸を驚くほど選択的に高濃縮しうることを発見した。そのＶＬＣ脂肪酸を蒸留によって長鎖脂肪酸から分離でき、高濃度のＶＬＣＭＵＦＡ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの産生を可能にする。

以下の概要は天然オイルの異なる例において存在するＶＬＣＵＳＦＡｓの適当量を提供する。

上記の情報は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ ＦＩＤ）による未処理のオイルの出願人の分析により得られ、その結果は面積パーセント（Ａ％）として示された。また、そのオイルはＣ３０より長い鎖長を有するＶＬＣＦＡｓを含みうる。

上記のような未処理のオイルは微量のＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓを含むが、請求される組成物はこれらより調製され、そして本出願人はＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓの両方がこれらのオイルから濃縮されうることを発見した。

本発明に従う脂肪酸組成物は典型的に、その脂肪酸が典型的にグリセリド型である、天然オイルからの脂肪酸のエステル転移反応又は加水分解の適当な工程によって得られ、単離でき、そして後の物理化学的精製プロセスを受ける。その脂肪酸は化学的に合成されない。一の態様において、その組成物のＶＬＣＵＳＦＡｓは、天然原料から分離したオイルと比較して修飾されない。従って、一の態様において、ＶＬＣＰＵＦＡｓの鎖長は未修飾であり、そして好ましくは、その天然のＶＬＣＵＳＦＡｓは伸長のための任意のステップを経ることなく組成物中に含まれる。さらに、その組成物は、ＶＬＣＵＳＦＡｓを分泌又は産生する任意の脂質産生細胞を含まない。むしろ、その組成物はある量のＶＬＣＵＳＦＡｓを含み、ここでこれらは天然原料より分離され、商用使用のためのスケールアップ産生のための適用な方法を用いて、高濃縮される。従って、ＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの両方を含むＶＬＣＵＳＦＡｓの量は、出発オイルにおける同じ脂肪酸の含量と比較して、増加され、好ましくはかなり増加される。異なるプロセスステップから及び異なる出発オイルからの画分は、組成物の脂肪酸混合物を調製するために混合されうるが、出発オイルの組成物は、もちろんその最終製品の組成物に決定的である。

本発明の一の側面において、その組成物の脂肪酸混合物は、出発オイルの含量と比較して、減少した量のコレステロールを含む。海産油のより高分子量の成分は、典型的にコレステロールを含む、所望されない不けん化構成物と関連され、コレステロールからのＶＬＣ脂肪酸を分離するために特に必要である。思いがけなく、本出願人はＶＬＣＵＳＦＡｓが、例えば、コレステロール及び様々なグリセリドを含むオイルより分離されうること、並びにそのＶＬＣＵＳＦＡｓがコレステロールより分離され、高濃縮されうることに気付いた。本出願人はＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓが、熱的に分解されることなく、高品質の分子／短行程蒸留工程を用いた蒸留画分のようになるために十分な揮発性であることを発見し、そしてそのような工程の方法を提供する。さらに、驚くべきことに、そのＶＬＣ脂肪酸は、減少した量のコレステロールと組み合わされる濃縮した量のＶＬＣ脂肪酸を有する脂肪酸混合物の産生を可能にする蒸留によってグリセリド及びコレステロールエステルから分離されうることを発見した。コレステロールの量は、総コレステロールとして、すなわち遊離及びエステル化したコレステロールからのコレステロールとして測定される（Ｐｈ．Ｅｕｒ．Ｃｈａｐｔｅｒ２．４．３２；ＵＳＰ オメガ－３脂肪酸エチルエステル参照）。一の態様において、その組成物の脂肪酸混合物は３０ｍｇ／ｇ未満の、例えば１５ｍｇ／ｇ未満の、例えば５．０ｍｇ／ｇ未満の、例えば４．０ｍｇ／ｇ未満の、例えば３．０ｍｇ／ｇ未満の量におけるコレステロールを含む。好ましくは、コレステロールは、存在するコレステロールの量がゼロに近づくように、例えば０．１ｍｇ／ｇの脂肪酸混合物の低さで除去される。

特に、一の態様において、本発明は、脂肪酸混合物を含む組成物を提供し、ここでその脂肪酸混合物は天然オイル由来の少なくとも１重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも１重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、かつここでその脂肪酸混合物が３０ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む。より具体的に、そのような組成物の脂肪酸混合物は５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む（ｍｇコレステロール／ｇ脂肪酸混合物）。

別の態様において、本発明は脂肪酸混合物を含む組成物を提供し、ここでその組成物は天然オイルから由来した少なくとも０．５重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも０．５重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、そしてここでその脂肪酸混合物は１．５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む。

一の態様において、その組成物の脂肪酸混合物は、上に開示されるように、少なくとも４％のＶＬＣＭＵＦＡｓ及び少なくとも１％のＶＬＣＰＵＦＡｓを含み、ここでその脂肪酸混合物は５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む。より具体的に、そのような混合物は少なくとも８％のＶＬＣＭＵＦＡｓを含む。

その脂肪酸混合物、特にそのような低いコレステロール含量を有するそれらは、好ましくは少なくとも９０．０重量％、９５．０重量％、９７．０重量％、例えば９８．０重量％、例えば９９．０重量％の量において、脂肪酸を含む。従って、その脂肪酸混合物は、実質的に脂肪酸のみを含み高度に精製され、オメガ３ＬＣＰＵＦＡｓのような、開示されるようなＰＵＦＡｓ及びＭＵＦＡｓを、ＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＦＡｓを濃縮することに加えて、含んでいる。その脂肪酸は、本明細書で後に開示されるように、異なる形態において提供されうる。長鎖及び超長鎖ＰＵＦＡｓを含む、不飽和脂肪酸の総重量％は、好ましくは少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％である。一の態様において、その脂肪酸混合物は、ＶＬＵＳＦＡｓの存在に加えて、一価及び多価不飽和長鎖脂肪酸を合計として、好ましくは少なくとも３０重量％、例えば少なくとも重量４０％、より好ましくは少なくとも５０重量％を含む。別の態様において、ＬＣ及びＶＬＣ不飽和脂肪酸の合計は少なくとも３０重量％である。

本発明の精製した及び高濃縮した脂肪酸混合物は、さらに微量の不必要な汚染物質を有する。例えば、以下の実施例７（表１２）及び実施例９（表１９）において示すように、組成物は調製され、ここで、酸化産物を含むオリゴマー及びポリマーの副生成物の量は、出発オイルにおけるその量より著しく減少している。好ましくは、そのような酸化産物は脂肪酸混合物の最大で１．５重量％、例えば最大で１．０重量％、より好ましくは最大で０．５重量％である。より具体的には、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢＡＰ）及び多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のような、環境的な汚染物質の量は、本発明の脂肪酸混合物において低い。一の態様において、その組成物の脂肪酸混合物は２μｇ／ｋｇ未満のベンゾ［ａ］ピレン（ＢＡＰ）を含む。別の態様において、その脂肪酸混合物は、好ましくは１０μｇ／ｋｇ未満の多環芳香族炭化水素（４ＰＡＨ）を含む。４ＰＡＨはベンゾ［ａ］アントラセン、クリセン、ベンゾ［ｂ］フルオランテン及びベンゾ［ａ］ピレンの合計として定義される。

さらに、本発明の精製した、及び高濃縮した脂肪酸混合物は、好ましくは魅力的な透明色、例えばかすかな透明色又は透明な淡黄色を有する。調製したオイル、すなわち脂肪酸混合物が、許容可能な色を有するかどうかを評価するために、ガードナー色数を用いうる。一の態様において、その調製した脂肪酸混合物は、９未満の、例えば８未満の、より好ましくは７未満の、最も好ましくは６未満のガードナー色数を、例えば以下の実施例９、表１９に提供されるように、約５のガードナー色数を有する。本出願において用いられるガードナー色数は、技術規格ＡＳＴＭ Ｄ １５４４において規格化されている。

ＶＬＣＵＳＦＡｓ及び本組成物の他の脂肪酸の両方である、本組成物の脂肪酸は、異なる形態でありうる。一の態様において、その組成物の脂肪酸は遊離脂肪酸；脂肪酸塩；モノ－、ジ－、トリグリセリド；エステル、例えばエチルエステル；ろうエステル；Ｏ－アセチル化ω－ヒドロキシ脂肪酸（ＯＡＨＦＡｓ）；コレステリルエステル；セラミド；リン脂質及びスフィンゴミエリン；の単体又は組み合わせにおける群より選択される。また、その脂肪酸は消化管において吸収されうる、又は局所適用後に体表面より吸収されうる任意の形態でありうる。好ましくは、その脂肪酸は遊離脂肪酸、脂肪酸塩、エチルエステル、グリセリド又はろうエステルの形態である。一の態様において、カルボン酸基がヒドロキシ基、すなわち脂肪アルコールに還元されるＶＬＣＭＵＦＡＳ及びＶＬＣＰＵＦＡｓを含む組成物のＶＬＣＵＳＦＡｓは、否定される。一の態様において、エロバノイド（ｅｌｏｖａｎｏｉｄｓ）（ＥＬＶｓ）と呼ばれるＶＬＣＰＵＦＡヒドロキシ化誘導体は、否定される。混合物における脂肪酸の重量％に関する際には、脂肪酸の任意の上記の広範な定義した形態を計算の基礎として用いうる。さらに、上記に挙げられる任意の形態において提供される、その組成物の脂肪酸は、好ましくは他の有効成分と結合しない。従って、本組成物の脂肪酸混合物は純粋な、未反応の、高濃度のＶＬＣＵＳＦＡ混合物である。しかしながら、脂肪酸末端基はオリジナルから、例えばグリセリドからエステルのように、修飾されている。

特定の態様において、本組成物のＶＬＣＵＳＦＡｓは任意のステロイド、例えば、エストロゲンと連結されない。

その組成物の高度に濃縮し、精製した脂肪酸混合物は、ある量のＶＬＣＵＳＦＡを含み、ここでそのＶＬＣＵＳＦＡは、商用利用のスケールアップ生産に適当な方法を用いて、天然原料から分離され、高濃縮（例えば濃縮）される。本発明の脂肪酸混合物を調製するためのプロセスは、典型的に工程ステップ、例えば、ａ）不純物若しくは不必要な成分を除去する精製ステップ、ｂ）安定性を増加するかつ／若しくは濃度を増加するステップ、並びに／又はｃ）任意の順序の化学反応ステップを含む。そのような精製ステップは、例えば蒸留、任意のアルカリ精製／脱酸、例えば遊離脂肪酸及び水溶性不純物を除去すること、脱ガム、酸化産物及び着色した成分を除去する漂白含みうる。その濃縮ステップは、例えば蒸留及びクロマトグラフィーに加えて、任意の抽出物及び尿素錯体化（ｕｒｅａ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）を含みうる。その化学反応ステップは、典型的に脂肪酸末端基の形態を、例えばグリセリドからエステルに変化する。

好ましい態様において、その組成物の濃縮した脂肪酸混合物は、ＶＬＣＵＳＦＡｓを選択し、高濃縮する一連の蒸留を含む産生方法によって入手される。好ましくは、そのＶＬＣＵＳＦＡｓは短行程／分子蒸留を含む方法により分離される。より具体的には、また、その方法は尿素錯体化（ｕｒｅａ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）工程を含む。本出願人はＶＬＣ脂肪酸を選択的に濃縮することを可能にしている。そのＶＬＣ脂肪酸は、驚くべき良い選択性を有し、例えばＤＨＡのように、ＬＣ脂肪酸より分離することができ、高濃度のＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの産生を可能にする。一つの選択は、価値のある長鎖オメガ３脂肪酸が既に除去されたオイルを使用することであって、すなわち、オメガ３濃縮物の産生からの残渣画分を使用することである。従って、一つの潜在的な工程は、オメガ３濃縮物の製造のための伝統的な二段階の短行程／分子蒸留工程の第二のステップからの残渣を用いることを含む。そのような残渣は伝統的なプロセシングより典型的に低い値の副産物を示す。それゆえ、オメガ３濃縮物は典型的に、第一のステップにおいて最大でＣ１８の鎖長を有する脂肪酸のエチルエステルの含量が削減されたエチル化した海産油の二段階の短行程蒸留により製造される。第二のステップにおいて、第一のステップからの残渣は、蒸留ユニットを通じて通過され、オメガ３酸の豊富な蒸留物、特にＥＰＡ及びＤＨＡを分離する。最終産物がトリグリセリド製品として販売される場合に、グリセロールによるさらなるエステル交換反応が必要とされる。そのような第二の蒸留又は続く蒸留からの残渣は、多量の部分的なグリセリドを含み、かつ、コレステロールが濃縮され、すなわち、コレステロールの量が蒸留ステップのための出発オイルよりも高い。そのような残渣の商用の値は、価値のあるとみなされている脂肪酸（主にＥＰＡ及びＤＨＡ）が蒸留物の流れにおいて回収されるので、現在のところとても低い。しかしながら、そのような残渣は、これが高濃度のＤＨＡ及びＥＰＡを未だに含みうることに加えて、元々のオイルのＶＬＣＵＳＦＡｓのたいていを含むだろう。驚くべきことに、濃縮した量のＶＬＣＵＳＦＡｓを、そして好ましくは低いコレステロール含量を含む、本発明に従う脂肪酸混合物はそのような残渣より提供されうる。

好ましい態様において、減少した含量のコレステロールを有する、ＶＬＣＵＳＦＡｓの組成物は、コレステロール除去のための少なくとも一段階を含む脂肪酸混合物を調製するためのプロセスによって入手される。そのようなプロセスステップは、遊離コレステロールがコレステロールエステルへ変換されるステップを含む。そのような変換は、好ましくは、酵素学的に、例えば、実施例１に示されるように、例えばリパーゼによって行われる。さらに、そのプロセスはコレステロールエステルを超長鎖脂肪酸エステルより分離するステップを含む。そのような分離は、好ましくは、高品質の分子／短行程蒸留工程のような一以上の蒸留により行われる。

従って、さらなる側面において、本発明は第一又は第二の側面に従う組成物の産生方法を提供する。その方法は、脂肪酸混合物を含む組成物を調製するステップを含み、ここでその脂肪酸混合物は超長鎖一価不飽和脂肪酸（ＶＬＭＵＦＡｓ）及び超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡｓ）の両方を含み、そしてさらにここで脂肪酸混合物のコレステロール量を最小限に抑える。調製した濃縮した組成物は。天然原料のオイルから分離され、濃縮されている所望される脂肪酸を含み、そして同時にその得られた組成物は、上記の側面において開示されるように、許容可能な低量のコレステロールを含む。

従って、本発明は、ＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓの両方を濃縮した量において含む脂肪酸混合物を含む組成物の産生のための方法を提供し、ここで、その脂肪酸混合物は、オイル材料から調製され、その方法は：
ｉ）オイル材料内に存在する遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換すること、及び
ｉｉ）ステップｉ）のオイル材料内に存在する超長鎖脂肪酸エステルからステップｉ）のコレステロールエステルを分離すること、
のステップを含んでいる。

そのオイル材料は天然原料から由来し、そして本方法のためのこの出発オイル材料は、第一の側面に記載される天然原料のオイルから選択されうる。好ましくは、そのオイル材料は海産油である。一の態様において、そのオイル材料は、処理された天然原料からのオイルであり、すなわち、例えば、不純物又は不必要な成分を除去する精製ステップ、安定性を増やす及び／若しくは濃度を高めるステップなどの上記の段落に開示されるようなステップ、並びに／又は化学的な反応ステップを既に経験しうる。一の好ましい態様において、そのオイル材料はエチル化した海産油である。従って、そのオイル材料の脂肪酸は好ましくは主にエチルエステル型である。一の態様において、そのオイル材料は、長鎖オメガ３脂肪酸が既に除去されているオイルであり、そしてより具体的にはそのオイルは。オメガ３濃縮物の製造のための短行程／分子蒸留工程からの残渣である。

ステップｉ）において、そのオイル材料はエステル化触媒、例えばリパーゼによってもたらされ、遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換する。適当なリパーゼは好ましくは固定化酵素、例えばＬｉｐｏｚｙｍｅ４３５、Ｎｏｖｏｚｙｍｅであるが、また非固定化酵素はより困難な使用後の回復が見られたが、作用しうる。温度、圧力及び反応時間を含む、本反応条件は、同じ酵素の使用によるエチルエステルのトリグリセリドへの変換の場合に用いられる通常の操作条件に基づき選択される。典型的に、５０～９０℃の範囲内の温度及び１～５０ｍｂａｒの圧力が適当である。反応ステップｉ）の間、遊離コレステロールがほぼ完全にコレステロールエステルに変換され、一方で同時にエチルエステルが限られた程度しかグリセリドに変換されないので、実施例１及び９に示されるように、遊離コレステロールの量は段階的に減少する。これは、非常に驚くべきことに、そのリパーゼがコレステロールエステルの酵素合成におけるアルコール基質として遊離コレステロールを受け取ることを示した。通常、そのような変換はコレステロールエステラーゼ酵素により行われる。また本プロセスは、適当な酵素調製物の、他の相対量及び他の原料を利用して、かつ本明細書及び実施例に記載されている以外の反応時間及び真空度を含む他の反応条件を利用して、かつ／又はエステル交換反応時に副産物として形成されるエタノールを除去する工程を含む、反応を完了させるためにもたらされるために利用される追加の工程を含むことによって実施されうる。ステップｉ）の反応が完了する際に、その材料は、例えば、ステップｉｉ）前に冷却され、そして濾過される。

ステップｉｉ）において、コレステロールエステル及び脂肪酸エステルを含むステップｉ）からのオイル材料は、蒸留され、コレステロールエステルからＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓを分離する。そのような分離は好ましくは、高品質の分子／短行程蒸留工程のような一以上の蒸留によって行われる。一の態様において、第一の蒸留は、コレステロールエステルの実質的な部分が残渣廃棄画分として回収されうる条件で実施される。

酵素処理前に存在していた脂肪酸エチルエステルの量と比較して、ごく限られた量がジ－及びトリグリセリドとしての残渣においてロスした。これは上述の非常に驚くべき効果に起因されうる：その遊離コレステロールをほぼ完全にコレステロールエステルに変換することができ、一方で同時にそのエチルエステルはごく限られた程度でしか、ジ－及びトリ－グリセリドに変換されない。ジ－及びトリ－グリセリドへの変換が少ないので、その量はコレステロールエステルを水溶液中に保ち、短行程／分子蒸留の加熱表面上の有害な沈殿を避け、かつコレステロールエステルの蒸発を減少する有益な可溶化液として寄与するために十分であるように思われる。そのような可溶化液の非存在下で、沈殿したコレステロールエステルは、オイルの流れ及び加熱表面上の熱転移に有害であるだろう。ＶＬＣＦＡｓ及びコレステロールエステルの豊富な、その海産脂肪酸グリセリド相は、例えばエチルエステル溶液を冷却することによるコレステロールの沈殿によって、蒸留によって、又は当業者に既知の他の手法によって、コレステロールからの分離に利用可能なＶＬＣＦＡｓを作成するために、さらなる反応、例えば加水分解又はエチル化ステップにかけられうる。また、コレステロールエステルを含むＶＬＣ脂肪酸のグリセリド溶液は、例えば、養殖のための飼料の原料、特に養殖魚の稚魚、及び養殖される甲殻類のための飼料としても、それ自身が価値のある産物になる。

実施例５によって例示されるように、本発明は、以下のコレステロール含量を、低い濃度のコレステロールを有する海産脂肪酸組成物を製造するための既存の方法を利用し、可能な限り減らすために利用されうる。

ステップｉｉ）について上記のように、ＶＬＣＵＳＦＡｓを含む、そのような第一の蒸留からの蒸留物は、さらに一回以上蒸留されうる。第二及び続く蒸留の条件は、そのＶＬＣＳＦＡｓが、好ましくは主に一つの画分に、例えば残渣内にあって、一方で、より軽い画分が除去されることを保証するために選択されるべきである。一の態様において、第一の蒸留を第二の蒸留より高い温度で実行する。

ステップｉ）及びｉｉ）の後の、その蒸留したオイルの脂肪酸混合物の分析は、驚くべきことにＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓが熱的に分解されずに蒸留されうることを示した。また、驚くべきことに、そのＶＬＣ脂肪酸が蒸留によってグリセリド及びコレステロールエステルから分離されうることを発見した。本明細書に記載されるように、短行程／分子蒸留は、そのスチルを通過する単回のパスから得られうる最大の分離度が、一つの理論段数として未だにみなされるので、通常、限られた程度の分画化しか示さないとみなされている。

本開示の組成物は、脂肪酸混合物に加えて、少なくとも一つの添加剤を含みうる。そのような添加剤の選択は、使用目的及び投与剤形を含む、いくつかの要因に依存する。そのような添加剤は、使用について安全であり、都合がよく、かつ／又は他の許容可能なものでありうるように、適用可能な、及び効果的な調製において、可溶化し、懸濁し、増粘し、希釈し、乳化し、安定化し、保存し、保護し、着色し、香り付けし、かつ／又は有効成分を機能しうる。添加剤の例は、これらに限定されないが、溶媒、担体、粘度調整剤、希釈剤、結合剤、甘味料、芳香剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、増量剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、潤滑剤、着色剤、色素、増粘剤、安定剤、つや出し剤、ゲル化剤、分散剤、塩、オイル、ワックス、ポリマー、シリコーン化合物、生体剤（ｂｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、塗膜形成要素、等張化剤、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、無機及び有機の日焼け止め剤、抗炎症剤、フリーラジカル消去剤、保湿剤、ビタミン類、酵素及び保存剤を含む。また、添加剤は一以上の役割又は機能を有しうるか、又は一以上の群において分類されうる；分類は記述のみであり、限定されることを意図されていない。ある態様において、例えば、少なくとも一つの添加剤は、コーンスターチ、ラクトース、グルコース、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、クエン酸、酒石酸、水、エタノール、グリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、セテアリルアルコール、カルボキシメチルセルロース、及び脂肪性物質、例えば、固い脂肪、又はその適当な混合物より選択されうる。ある態様において、現在開示されるその組成物は、これらに限定されないが、トコフェロール、例えばαトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、及びδトコフェロール、又はそれらの混合物、ＢＨＡ、例えば２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール及び３－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール、又はそれらの混合物、並びにＢＨＴ（３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシトルエン）、並びにパルミチン酸アスコルビル、又はそれらの混合物を含む群より選択される抗酸化剤を含む。

一の側面において、本発明は、医薬品／医薬的な、薬剤によって栄養価を高めた組成物、栄養補助食品、食品添加剤、又は化粧品としての使用のための記載される脂肪酸組成物、又は任意の記載される脂肪酸組成物を含む任意の製剤に向けられる。一の態様において、本開示の組成物は、開示した脂肪酸混合物のいずれかのものを含む医薬組成物である。また、その医薬組成物は、一以上の追加の医薬品有効成分、及び／又は医薬的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又は抗酸化剤を含みうる。本医薬組成物は、これらに限定されないが、錠剤、コーティング錠、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、分散剤、懸濁剤、シロップ、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、乳剤、スプレー、坐薬、及びペッサリーを含む任意の慣習の投与剤形で製剤化されうる。慣習の製剤技術が用いられうる。本組成物は、これらに限定されないが、経口的に、静脈内に、筋肉内に、舌下に、皮下に、髄腔内に、口腔内に、直腸性に、経腟的に、眼内に、経鼻的に、吸入によって、経皮的に、又は皮膚性を含む、任意の投与経路によって投与されうる。

別の態様において、本発明は、任意の記載した脂肪酸組成物を含む、栄養補助食品、又は食品添加剤、又は薬剤によって栄養価を高めた調製物に向けられる。そのような栄養補助食品、食品添加剤、又は薬剤によって栄養価を高めた組成物は、これらに限定されないが、液体栄養としての、食糧としての、及び飲料としての、任意の経路を通じる投与のために産生されうる。一の態様において、その組成物は治療目的で使用される。栄養補助食品、又は食品添加剤、又は薬剤によって栄養価を高めた調製物における使用のために、その組成物はカプセル剤の剤形において、好ましくはゼラチンカプセルの剤形においてありうる。そしてそのカプセルは香り付けされうる；錠剤、散剤、又は液剤でありうる。

さらに別の態様において、本発明は、例えば皮膚科用化粧品において、開示される脂肪酸組成物を含む化粧品処方に向けられる。そのような化粧品処方は、これらに限定されないが、散剤、液剤、分散剤、懸濁剤、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、乳剤、スプレー、ペースト剤、スプレー、固形及び半固形を含む群より選択されうる。その化粧品処方は、皮膚、粘膜、爪及び／又は髪への適用のための任意の既知の方法を用いて適用されうる。

本ＶＬＣＵＳＦＡｓは、皮膚及び／又は肺及び／又は腸管の障壁を含む、ヒト又は動物の体表面と環境との間の障壁を支持することにおける役割を有するように思われる。これは、特に、身体が完全に乾くことを避けるために、水分へのその身体の障壁の機能、皮膚の乾燥すること／しわ、及びＵＶ照射によってもたらされる皮膚を傷つける光による老化に対する保護、並びに体内に入る病原微生物に対するさらなる保護を含む。一の態様において、本発明の組成物は光による老化に対する皮膚の保護における使用のためである。別の態様において、本発明の組成物は、乾燥することに対する及び微生物の侵入に対する皮膚の障壁を改善することにおける使用のためである。

また、一の側面について開示される態様を本発明の他の側面に適用することを理解されるべきである。例えば、また本組成物を開示した態様は、産生のための方法に向けられる側面について適用する。

本明細書に開示されるそれぞれの成分、化合物、置換成分、又はパラメータは、単体又は本明細書に開示される一以上のそれぞれの及び全ての他の成分、化合物、置換成分、又はパラメータとの組み合わせにおいて解釈されるべきであると理解されるべきである。

また、本明細書に開示されるそれぞれの成分、化合物、置換成分若しくはパラメータについて、それぞれの量／値又は量／値の範囲は、本明細書に開示される任意の他の成分、化合物、置換成分若しくはパラメータについて開示されるそれぞれの量／値又は量／値の範囲との組み合わせにおいて開示されるように解釈されるべきであること、並びにまた、本明細書で開示される二以上の成分、化合物、置換成分、若しくはパラメータについての量／値又は量／値の範囲の任意の組み合わせは、それゆえ本記載の目的のために互いに組み合わせて開示されることを理解されるべきである。

本明細書に開示されるそれぞれの範囲のそれぞれの下限は、同じ成分、化合物、置換成分又はパラメータについて本明細書に開示されるそれぞれの範囲のそれぞれの上限との組み合わせにおいて開示されるように解釈されるべきであることをさらに理解される。それゆえ、２つの範囲の開示は、それぞれの範囲のそれぞれの下限とそれぞれの範囲のそれぞれの上限との組み合わせにより由来される４つの範囲の開示として解釈されるべきである。３つの範囲の開示は、それぞれの範囲のそれぞれの下限とそれぞれの範囲のそれぞれの上限との組み合わせにより由来される９つの範囲の開示などとして解釈されるべきである。

本発明の特定の態様は以下に挙げられる。

１．脂肪酸混合物が、天然オイルから由来した少なくとも１重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも１重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、かつその脂肪酸混合物が３０ｍｇ／ｇ未満のコレステロール、例えば５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む脂肪酸混合物を含む組成物。

２．脂肪酸混合物を含む組成物であって、ここでその脂肪酸混合物が、天然オイルから由来した少なくとも０．５重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも０．５重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、かつここでその脂肪酸混合物が１，５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む組成物。

３．脂肪酸混合物を含む組成物であって、ここでその脂肪酸混合物が、天然オイルから由来した少なくとも１重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも１重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、かつここでその脂肪酸混合物がさらに少なくとも１０重量％のＣ２０～Ｃ２２一価不飽和脂肪酸を含む組成物。

４．その脂肪酸混合物が少なくとも２重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～３のいずれか一項の組成物。

５．脂肪酸混合物を含む組成物であって、ここでその脂肪酸混合物が天然オイルから由来した少なくとも４重量％、例えば少なくとも８重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも１重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む組成物。

６．その天然オイルが、海産又は淡水生物由来である、項目１～５のいずれか一項の組成物。

７．その天然オイルが魚油、軟体動物油、甲殻類油、海産哺乳動物油、プランクトン油、藻類油、及び微細藻類油から選択される、項目１～６のいずれか一項の組成物。

８．その脂肪酸混合物が少なくとも１５重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～７のいずれか一項の組成物。

９．その脂肪酸混合物が少なくとも１重量％の２４炭素数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～８のいずれか一項の組成物。

１０．その脂肪酸混合物が少なくとも６重量％の２４炭素数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～９のいずれか一項の組成物。

１１．その脂肪酸混合物が少なくとも１０重量％の２４炭素数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～９のいずれか一項の組成物。

１２．その脂肪酸混合物が少なくとも２重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１１のいずれか一項の組成物。

１３．その脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１２のいずれか一項の組成物。

１４．その脂肪酸混合物が少なくとも１０重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１３のいずれか一項の組成物。

１５．その脂肪酸混合物が少なくとも１０重量％の一以上の超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１４のいずれか一項の組成物。

１６．その脂肪酸混合物が少なくとも２０％の総量において、超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１５のいずれか一項の組成物。

１７．その脂肪酸混合物が少なくとも５０％の総量において、超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１６のいずれか一項の組成物。

１８．その脂肪酸混合物が少なくとも５０％の総量において、超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１７のいずれか一項の組成物。

１９．その脂肪酸組成物が超長鎖一価不飽和脂肪酸と超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸とを３：１～１：２の重量比において含む、項目１～１８のいずれか一項の組成物。

２０．その脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の一以上のＣ２８超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、項目１～１９のいずれか一項の組成物。

２１．その脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の少なくとも一つの超長鎖脂肪酸Ｃ２８：６ｎ３及びＣ２８：８ｎ３を含む、項目１～２０のいずれか一項の組成物。

２２．その脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の超長鎖脂肪酸Ｃ２６：６ｎ３を含む、項目１～２１のいずれか一項の組成物。

２３．その脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の超長鎖脂肪酸Ｃ２４：５ｎ３を含む、項目１～２２のいずれか一項の組成物。

２４．その脂肪酸混合物がさらに少なくとも１重量％のＣ１８～Ｃ２２一価不飽和脂肪酸を含む、項目１～２３のいずれか一項の組成物。

２５．その脂肪酸混合物がさらに少なくとも１重量％のＣ２０～２２多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡｓ）、例えば少なくとも５重量％のＬＣＰＵＦＡｓ、例えば少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％のＬＣＰＵＦＡｓを含む、項目１～２４のいずれか一項の組成物。

２６．前記脂肪酸が、遊離脂肪酸、遊離脂肪酸塩、モノ－、ジ－、トリグリセリド、エチルエステル、ろうエステル、コレステリルエステル、セラミド、リン脂質又はスフィンゴミエリンの、単体又は組み合わせにおける形態である、項目１～２５のいずれか一項の組成物。

２７．前記脂肪酸が、遊離脂肪酸、遊離脂肪酸塩、エチルエステル、グリセリド又はろうエステルの形態である、項目１～２６のいずれか一項の組成物。

２８．その脂肪酸混合物が５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む、項目１及び３～２７のいずれか一項の組成物。

２９．その脂肪酸混合物がアセチレン脂肪酸を含まない、項目１～２８のいずれか一項の組成物。

実施例

以下の実施例は請求されるようにＶＬＣＵＳＦＡｓの組成物が天然オイルから調製されうることを例示するために提供され、ここでその脂肪酸は天然オイルから由来し、そしてこれらの超長鎖脂肪酸の量は濃縮される。本実施例では、異なるＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓを高濃縮しうること、その脂肪酸を異なる形態において提供しうること、その組成物が高い純度を有すること、及びそのＶＬＣＵＳＦＡｓをコレステロールから分離し、そして濃縮しうることを示す。本実施例はさらに、（典型的にＥＰＡ及びＤＨＡを含む）長鎖オメガ３濃縮物の産物からの残渣画分を、請求したＶＬＣＵＡＳＦｓ組成物を調製するために用いることができ、未処理のオイルの持続可能な使用を提供する。

以下の実施例において、これが本出願に利用可能であったので、サバ又はイワシ由来のオイルを使用した。同様のプロセス及び例示はいくつかのＶＬＣＵＳＦＡｓを含む他のオイル、例えば海産又は淡水生物由来のオイルを用いて同様に実施された。例えば、ニシン、スケトウダラ、ブルーホワイティング、カラフトシシャモ、養殖サケ、オキアミ油、又はカズノコエキスを出発オイルとして用いた。

実施例１：イワシ及びサバオイルからのＶＬＣＵＳＦＡ組成物

約３６％のＥＰＡ及び約２５％のＤＨＡを含む、オメガ３酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用スケールの蒸留からの、１２０ｋｇの残渣を、（オイル重量の）２５重量％の２％ナトリウムエトキシドを含むエタノールによってそれを反応することによって、エチルエステルに変換した。その混合物を８０℃で１時間撹拌した。その超過したエタノールを続いて真空下で蒸発した。その撹拌を停止し、続けて３０分後、少量の暗く重い相のグリセロールを下部のバルブを介して反応容器から排出した。そのオイルを続いて５％のクエン酸を含む水によって洗浄し、そして２回水によって洗浄した。そのオイル相を続いて４０～５０℃で真空下で乾燥し、表１のカラム２に示される１１０ｋｇの組成物を有するオイルを提供した。

（表１、列２）オイルを短行程蒸留（ＶＴＡ、デガッサーを有するモデルＶＫ８３－６－ＳＫＲ－Ｇ）において二重蒸留をかけた。第一のカラムの温度は１７５℃だった（４ｋｇ／時間の流量及び０．０１ｍｂａｒの真空度）。その残渣を廃棄物（１０ｋｇ）として回収し、一方でその蒸留物を第二のカラムにかけた。第二のカラムの温度は１３０℃だった（約３．２ｋｇ／時間の流量及び０．０１ｍｂａｒの真空度）。その蒸留物（１５ｋｇ）は短鎖脂肪酸が濃縮され、一方でＶＬＣＦＡｓを含む精製した産物（８５ｋｇ）をオイル残渣として回収した（カラム３、表１）。

グリセリド含量、遊離コレステロール含量及び脂肪酸プロファイルの分析を、出発オイル（表１、列２）及び二重蒸留後のオイル残渣（表１、列３）について実施した。

表１：ＶＬＣＦＡｓの精製及び高濃縮時の異なる画分の脂肪酸プロファイル。結果を；エチルエステル（ＥＥ）、モノグリセリド（ＭＧ）、ジグリセリド（ＤＧ）及びトリグリセリド（ＴＧ）についてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からのクロマトグラフィーにおける領域パーセント（Ａ％）として、脂肪酸分析についてガスクロマトグラフィーからのＡ％として示す。
列２：出発オイル
列３：二重蒸留後の残渣
列４：列３の酵素処理したオイルの二重蒸留からの残渣
列５：列４のオイルの二重蒸留からの残渣
列６：列５のオイルの二重蒸留からの残渣

酵素処理
二重蒸留からのオイル残渣（８２．７ｋｇ）（表１、列３）に１．９３ｋｇの固定化酵素（Ｌｙｐｏｚｙｍｅ ４３５，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を加え、そしてその混合物を８０℃及び真空（１０ｍｂａｒ）で４６時間撹拌した。冷却濾過後、そのオイルを蒸留にかけた。

酵素処理の間の、試料の分析からの結果を以下の表２に示す。

表２：

表２では、遊離コレステロールが４６時間の反応時間後、４１．１１ｍｇ／ｇから０．２５ｍｇ／ｇへと段階的に減少されることを示す。これは、酵素学的なステップの間に、遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換することを意味している。これは、驚くべきことに、リパーゼがコレステロールエステルの酵素学的な合成においてアルコール基質として遊離コレステロールを受けることを示す。通常そのような変換はコレステロールエステラーゼ酵素によって行われる。

また、上記のプロセスは、適当な酵素調製物の、他の相対量、及び他の原料を利用すること、並びに本実施例に記載されるもの以外の他の反応時間及び真空度を含む、他の反応条件を利用することで、かつ／又はエステル転移反応の際に副産物として形成されるエタノールを除去するための工程を含む、反応を完結させるために用いられる追加の工程を含むことによって、実行される。

反応時に、モノグリセリド（ＭＧ）の量は減り、ジ－及びトリグリセリド（ＤＧ、ＴＧ）の量は増えた。オメガ３酸トリグリセリド、オメガ３酸エチルエステル及び魚油について欧州薬局方及びＵＳＰモノグラフにおいて記載されるものと同様である、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法は、おそらく長鎖脂肪酸の多い試料中のＭＧ含量を過剰評価し、かつエチルエステル（ＥＥ）含量を過小評価することに、その長鎖ＥＥｓがより短いＭＧｓ鎖と同様の分子サイズを有し、そして、この理由のためにＭＧｓと共溶出するので気付くべきである。それゆえ、４６時間後の試料中のＭＧの真の含量はおそらく低い。

４６時間後の（表２、列６）、オイル処理した酵素は、短行程蒸留における二重蒸留（ＶＴＡ、デガッサーを有するモデルＶＫ８３０６０ＳＫＲ－Ｇ）をかけた。第一のカラムの温度は１８０度（４ｋｇ／時の流量及び０．０１ｍｂａｒの真空度）であり、その残渣を廃棄物として回収し、一方で、その蒸留物は第二のカラムをかけた。その第二のカラムの温度は１３０℃（約３．３ｋｇ／時の流量及び０．０１ｍｂａｒの真空度）だった。第二のカラムからの蒸留物（２０．８ｋｇ）はより短い鎖の脂肪酸を濃縮し、一方で、濃縮した量のＶＬＣ不飽和脂肪酸を含む精製した産物（４３．２ｋｇ）を第二のカラムから残渣として回収した（表１、列４）。本組成物の総コレステロールは０．６ｍｇ／ｇのみであり、出発オイル（表１、列２）における５２．５ｍｇ／ｇから減った。この総コレステロールの大幅な減少は、上記のように第一の蒸留ステップからの残渣画分において取り除かれているコレステロールエステルによってもたらされた。

酵素処理後の第二の蒸留からの残渣オイル（表１、列４）は、続いて短行程蒸留装置における一連の蒸留にかけられた（温度１３０～１４１℃及び真空度０．０１ｍｂａｒ、ＶＴＡ、デガッサーを有するモデルＶＫ８３－６－ＳＫＲ－Ｇ）。各ステップについて、軽いフラクション（２０～３０％）を蒸留物として除去し、一方でその残渣を次の蒸留ステップに戻してかけた。第一の蒸留ステップからの残渣（Ｒ）の組成物を、表１の列５に示す。表１列６では、蒸留物（Ｄ）の典型的な組成物を示す。以下の蒸留物からの残渣の組成物（ＲＲ－ＲＲＲＲＲＲ）を表３の列２～６において示した。

表３：蒸留物２～６からの脂肪酸プロファイル

エチル化後、酵素処理後の両方の、蒸留したオイルの分析、及び蒸留では、驚くべきことにＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓを熱分解せずに蒸留することができたことを示した。また、驚くべきことにそのＶＬＣ脂肪酸を蒸留によってグリセリド及びコレステロールエステルから分離することができたことが分かった。本明細書で記載されるように、短行程／分子蒸留は、通常、限られた程度の画分化しかできないと考えられ、スチルを通じる単回のパスから得られうる最大の分離度を、未だに一つの理論段数としてみなす。

上記の蒸留ステップは、驚くべきことにＶＬＣ脂肪酸を選択的に高濃縮しうることを示している。そのＶＬＣ脂肪酸を、驚くべき選択性によって、ＤＨＡのようなＬＣ脂肪酸より分離することができ、高濃度のＶＬＣＭＵＦＡ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの産生を可能にする。

尿素画分化

最終蒸留物（表３、列６）からのいくつかのオイルを、尿素沈殿工程にかけた。尿素画分化は、同一の鎖長だが、異なる不飽和度を有する脂肪酸の分離フラクションを分離するための方法である。

２２５ｇの尿素を４５０ｇのエタノール（９６％）とジャケット付リアクター内で混合し、そして撹拌下で８０℃に加熱した。１５０ｇのオイル（表３、列６）を加え、そしてその混合物を３０分間撹拌した。２５℃に冷却後、その混合物を濾過し、その濾過物のエタノールを部分的に蒸発させ、そして混合物を二回目の濾過にかけた。そのオイルを続いて５％クエン酸を含む水によって洗浄し、そして水によって２回洗浄し、そして真空下で乾燥し、７３．９ｇのオイルを得た（表４、列２）。この産物のオイル（３５ｇ）を短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて蒸留した。１３２℃の温度、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力での第一の蒸留後、残渣（～１０ｇ）（「Ｒ１３２」、表４、列４）及び蒸留物（２５ｇ）を回収した。また、同じ産物オイルの第二の部分（～３５ｇ）を１３５℃、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留し、そして残渣（～８ｇ）（「Ｒ１３５」、列５）及び蒸留物（～２７ｇ）を回収した。１３２及び１３５℃での蒸留からの二つの蒸留物（～５２ｇ）を組み合わせ、そして１２６℃及び１３０℃の温度でそれぞれ、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒで蒸留した（各～２５ｇ）。１２６℃（～８ｇ）及び１３０ｇ（～７ｇ）での蒸留物からの残渣の組成物を（表４）列６（「ＤＲ１２６」）及び７（「ＤＲ１３０」）においてそれぞれ示した。最終的に、蒸留からの蒸留物（～３７ｇ）を組み合わせ、１２２℃で蒸留し、その残渣の組成物（「ＤＤＲ１２２」）（～７ｇ）を表４列８において示した。

尿素沈殿物からのいくつかの尿素付加物を水及びヘプタンと混合した。相分離後、そのヘプタン層を水によって２回洗浄し、蒸発させた。その尿素付加物の脂肪酸組成物を表４の列３に示した。

表４：

本結果は、ＶＬＣＭＵＦＡｓが尿素沈殿によって効率的に除去されうることを示しており、ＶＬＣＰＵＦＡｓからこれらを分離し、ＶＬＣＭＵＦＡ含量を３８．３１％（表３、列６）から、１．９８％（表４、列２）へと減らし、ＶＬＣＰＵＦＡの含量を同時に２９．３４％から６４．２３％へと増やした（表３、列６）。尿素付加物の分析では、６６．８１％のＶＬＣＭＵＦＡの高い含量（表４、列３）及び３．４３％のみのＶＬＣＰＵＦＡを示した。

従って、尿素画分化を効率的に用いることができ、同一の鎖長を有するＶＬＣＵＳＦＡｓの各群中で脂肪酸の分離した画分をもたらした。それゆえ、画分化ツールとして尿素を用いることによって、各鎖長中の最も不飽和度の高いＶＬＣＰＵＦＡｓの相対量を、非尿素錯体化画分（ｎｏｎ－ｕｒｅａ ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ）において増加することができ、一方で同時により少ない不飽和度のＶＬＣＰＵＦＡｓの相対含量を脂肪酸の尿素錯体化画分（ｕｒｅａ ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ）において増やしうる。それゆえ、例えば、（ＶＬＣＭＵＦＡｓにより出発する）最も二重結合数の少ない脂肪酸は、尿素付加物（ＵＡ）としてのＶＬＣＰＵＦＡｓの混合物から段階的に分離されうる。一方で、不飽和度の最も高い脂肪酸、特にＣ２８：８ｎ３は、非尿素付加物（ＮＵＡ）画分が大幅に残っている。そのような尿素画分化を典型的に相対的な出発材料について用いられる条件下で行い、その条件は周知であるか又は当業者により容易に決定されうる。尿素を典型的に商用の濃縮したＰＵＦＡ組成物の濃縮物において用いられる時間について、典型的に（例えば至適及び８０℃の間の温度での）反応条件下で（オイル重量１部に対して、０．３～５部の範囲の）量において加える。

濾過：

蒸留６からのいくつかのオイル（表３、列６）を－１５℃に冷却し、そして濾過した。出発オイルの組成物、濾過物及びフィルターケーキをそれぞれ表５の列２、３及び４に示した。

そのフィルターケーキ（表５、列４）を１０℃に加熱し、そして再度濾過し、その濾過物の組成物及びフィルターケーキをそれぞれ表５の列５及び６に示した。

表５：

実施例２：コレステロール除去。

以下の表６の列２に記載されている組成物を有する、サバオイルを、当該分野の技術に従って反応させ、エチルエステルを形成した。

表６の列２に記載したサバオイルの短鎖脂肪酸のエチルエステルの含量を短行程蒸留により減らした（ＶＴＡ、デガッサーを有するモデルＶＫ８３－６－ＳＫＲ－Ｇ）。その蒸留を１５７℃の温度、７．４ｋｇ／時及び０．０１ｍｂａｒの真空度で行った。この工程では９６．５％の蒸留物及び３．５％の残渣をもたらした。その残渣のエチルエステルの組成物を、以下の表６の列３において示した。当業者に周知であるように、本ステップからの蒸留物画分を他の所望される産物の製造のために利用しうる。

そのような蒸留物からの残渣（表６、列３）を当該分野において記載されるように、無水エタノール中のエチレンナトリウムによってエチル化し、グリセリド含量を減らした。

そのエチル化したオイルを、続いて４．５ｍｌ／分の流量及び１８０℃の温度での１０^－３ｍｂａｒの圧力（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）で短行程蒸留スチルにおける二重蒸留をかけた。その残渣（～１０％）を廃棄物として回収し、一方でその蒸留物（～９０％）（表６、列４）をさらなる工程にかけた。

酵素処理：

４４６ｇの蒸留物（表６、列４）に２５ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を加え、８０℃、真空（１０ｍｂａｒ）で３６時間処理した。実施例１に記載したものと同様に、遊離コレステロールを実質的に本ステップにおいてコレステロールエステルに変換した。

酵素処理後のオイル（３６２ｇ）を短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて１８０℃の温度で、４．５ｍｌ／分の流速及び１０^－３ｍｂａｒで蒸留し、コレステロールエステルのほとんどを含む残渣（１１０ｇ）、及び蒸留物（２５４ｇ）（表６、列５）を回収した。９０ｇの蒸留物（表６、列５）を短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を１１０℃の温度で、３．５ｍｌ／分の流速及び１０^－３ｍｂａｒの圧力を用いて蒸留した。～１８ｇの残渣（表６、列７）及び～７２ｇの蒸留物（表６、列６）を回収した。

上記（表６、列５）からの９０ｇの蒸留物を短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて１００℃の温度で、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。～４５ｇの残渣（表６、列９）及び～４５ｇの蒸留物（表６、列８）を回収した。

尿素画分化及び濾過：

酵素処理及び蒸留後のいくつかのオイルである、その蒸留物（表６、列５）を尿素沈殿法（ｕｒｅａ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）にかけ、同じ長さで異なる不飽和度を有する脂肪酸を分離した。

１００ｇの尿素をジャケット付リアクターにおいて、２１０ｇのエタノール（９６％）と混合し、撹拌下で８０℃に加熱した。５６ｇのオイル（表６、列５）を加え、そしてその混合物を３０分間撹拌した。２５℃に冷却後、その混合物を濾過し、そのエタノールを蒸発させ、そしてその混合物を二度目の濾過にかけた。そのオイルを続いて５％クエン酸を含む水によって洗浄し、そして水によって２回洗浄し、真空下で乾燥させ、１９．５ｇのオイルを得た（表６、列１０）。

表６：

クロマトグラフィーによる分離：

表６、列７からの１００ｍｇのオイルを標準的な方法によりメチル化し、ヘキサンに溶解した。そのヘキサン相をＡｇＮＯ３をコートしたシリカを有する固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）ＡＧ－ＩＯＮ ７５０ｍｇ／６ｍｌ）を通じて溶解した。ヘキサン内へのメチル化したオイルの適用後、そのカートリッジをアセトンによって溶出し、表７、列２に示した組成物を有するオイルを得て、そして続いて４０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含むアセトンによって、表７、列３に示した組成物を有するオイルを得た。

その上記の結果ではＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓを、（これらに限定されないが、）クロマトグラフィーの使用によって、互いに分離することができ、高い又は低いＶＬＣ－ＰＵＦＡ／ＶＬＣ－ＭＵＦＡ比を有する組成物を産生することを示している。

表７：

実施例３：酵素処理をせずに得られたＶＬＣＵＳＦＡ組成物

約３６％のＥＰＡ及び約２５％のＤＨＡを含んでいるオメガ３酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用規模の蒸留物からの残渣（表８、列２）を、短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ）を用いて１８０℃の温度、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。残渣（表８、列４）及び蒸留物（表８、列３）を回収した。また、同じ出発残渣（列２）を当該技術に従ってエチルエステルに変換し、その分析結果を表８、列５に示している。

表８、列３の蒸留物をさらに短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて１１５℃の温度で、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留し、残渣（表８、列７）及び蒸留物（表８、列６）を回収した。

１８０℃での蒸留からの蒸留物（列３）は、出発オイルと比較して、さらにより低い総量のコレステロールを有していた（８．６７対３７．３７ｍｇ／ｇ）；この肯定的な効果は残渣画分において回収されているコレステロールエステルによってもたらされた（列４）。その蒸留物は、主に遊離コレステロールの形態におけるコレステロールを含む。

列２及び５から見られうるように、（同じ）出発オイルのエチル化は総コレステロール含量を変えないが、いくつかのコレステロールエステルは遊離コレステロールに変換される。遊離コレステロールが蒸留によってＶＬＣＭＵＦＡ及びＶＬＣ－ＰＵＦＡからより分離され難いので、蒸留時の残渣画分におけるコレステロールエステルとしてのコレステロールを可能な限り除去する利点が分かっていた。これは、表８の列２対列５におけるオイルの総コレステロールの比較により例示されている。

表８、列３における蒸留物のさらなる蒸留は、ＶＬＣＰＵＦＡ（６．５９％）及びＶＬＣＭＵＦＡ（９．４％）の濃縮した残渣（列７）をもたらし、その（総）コレステロールは８．７から１１．９ｍｇ／ｇへごくわずかに増加した（列３）が、出発濃度の３７．４ｍｇ／ｇからは効果的に減少した（列２）。

表８：

本実施例では（総及び遊離）コレステロール含量がＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ及びＶＬＣ－ＭＵＦＡｓの豊富なオイルの精製及び高濃縮のための蒸留の使用時に変化する方法を示す。従って、コレステロールエステルの形態におけるコレステロールは蒸留によってＶＬＣ－ＰＵＦＡ及びＶＬＣ－ＭＵＦＡより分離することができ、一方でその遊離コレステロールが蒸留のみによってはＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ及びＶＬＣ－ＭＵＦＡｓより分離し難いことが分かった。

実施例４：蒸留によるコレステロールの分離
約３６％のＥＰＡ及び約２５％のＤＨＡを含んでいるオメガ－３－酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用規模の蒸留からの、残渣（表９、列２）を、短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて１８０℃、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。～９０％（表９、列３）の蒸留物及び約１０％の残渣を回収した。その蒸留物を当該分野において記載されるようにエチル化し、その産物を表９、列４に示されるように分析した。そのエチル化したオイルを最終的に短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４）を用いて１１０℃の温度、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。約６０％の残渣（表９、列５）を回収し、そして分析した。

分析結果は、主にそのコレステロールエステルが残渣画分において除去されたので、１８０℃での第一の蒸留の際に、蒸留物の総量のコレステロールを減少させたことを示した（表９、列３）。エチル化ステップにおいて、総コレステロールは基本的に同じにとどまったが、一方で脂肪酸はトリグリセリド（ＴＧ）からエチルエステル（ＥＥ）に変換された。その最終の蒸留ステップでは残渣内の超長鎖脂肪酸の濃度を高めたが、また、そのコレステロール濃度も高めた。

本実施例ではＶＬＣ－ＰＵＦＡ及びＶＬＣＭＵＦＡ含量及び（遊離及び総）コレステロール含量が精製及び高濃縮を通じて変化する方法を例示している。本実施例において記載されるプロセスによって、コレステロールの含量を効果的に減らし、一方でＶＬＣ－ＰＵＦＡ及びＶＬＣ－ＭＵＦＡが高濃縮されると、遊離コレステロールは増加した。

表９：

実施例５：非常に低いコレステロール含量を有するＶＬＣＵＳＦＡ組成物

イワシ及びサバオイルの混合物からの（約１８％のＥＰＡ（Ｃ２０：５ｎ３）及び１２％ＤＨＡ（Ｃ２２：６ｎ３）を含んでいる商品をもたらすために意図されるオイルの頭字語の）未精製の「１８１２」オイル（表１０、列２）を、商用の脂肪酸濃縮物の製造から副産物として得られた７％のＣ１４～Ｃ１８脂肪酸エチルエステル画分に加え、そして続いて短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４）を用いて１８０℃の温度、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。出発未精製オイルにおいて存在する総コレステロールの半分よりわずかに少なく含む、９０％の残渣（表１０、列３）、及び１０％の蒸留物を回収した。その残渣（表１０、列３）を当該分野において記載されるように、例えばエタノールによってオイルを反応させることで、エチル化し、その産物を分析し、これを表１０、列４に示した。実施例１に記載したものと同様に、そのエチル化したオイルを続いて酵素（リパーゼ）によって一晩真空下、８０℃で処理した。その生じたオイルを表１０、列５に示した。その酵素処理したオイルを、最終的に、１８０℃の温度、５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で、短行程蒸留スチルを用いて蒸留した（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４）。約１０％の残渣及び約９０％の蒸留物（表１０、列６）を回収し、そして分析した。

その分析結果は、１８０℃での第一の蒸留時に、主に遊離コレステロールが蒸留画分によって除去されたので、その総コレステロールが減ったことを示している。エチル化において、総コレステロールの含量は変化しないままであるが、一方でその脂肪酸はＴＧからＥＥに変換された。続く酵素処理は残存している遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換した。最終蒸留ステップ時に、そのコレステロールエステル及びグリセリドは残渣に残存し、一方で、その蒸留物は非常に低い総コレステロールだった。１ｍｇ／ｇ未満の総コレステロールを有する蒸留物を産生した。その脂肪酸プロファイルは、約０．５％のＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓをそれぞれ有し、本プロセスステップ時に未変化のままだった。当業者は、また、上記に記載した「１８１２」オイルのコレステロール含量の実質的な減少が、第一ステップのＣ１４～Ｃ１８脂肪酸エチルエステル画分の追加に続いて短行程蒸留スチルを用いる蒸留を行うことなく得られうることに気付くだろう。

さらに、当業者は、上記のようなコレステロール含量を減らすための方法が、エチル化ステップについて、エチルエステルを形成するために出発オイルをエタノールと反応することの好ましい態様を介するだけでなく、対応するエステルを形成して実施されうることに気付くだろう。

ＷＯ２００４／００７６５５では、魚油からのＣ１～Ｃ４（メチル～ブチル）の総コレステロール含量を減らすプロセスを、１８ページ、１３行～１９ページ、９行に記載しているが、その記載をサポートする実施例又は請求項を含んでいない。ＷＯ２００４／００７６５５では、長鎖Ｃ２０～Ｃ２２ＰＵＦＡｓ、例えばＥＰＡ及びＤＨＡ（例えば２ページ、１６行～３ページ、１３行及び１３ページ、５～２４行を参照）を単に言及し、海産油におけるＶＬＣＦＡｓの存在に関しては、全く触れられていない。ＶＬＣＦＡｓはＬＣＦＡｓよりも高い温度で蒸留するので、そのＶＬＣＦＡエステルが短行程／分子蒸留のような工程によってコレステロールエステルから実質的に分離されうることは非常に驚くべきことである。ＷＯ２００４／００７６５５のプロセスと比較して、現在のプロセスの重要な利点は、残渣の残存する遊離コレステロールのエステル化が行われ、より完全なコレステロールの除去を提供することである。

表１０：

実施例６：色の評価

オメガ－３－酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用規模の蒸留からの二つの異なる残渣（表１１、列２及び３）を、ガードナー色数について分析し、以下の二つの精製及び高濃縮したＶＬＣＰＵＦＡ／ＶＬＣＭＵＦＡオイルと比較した；

表１１、列４に提供される、表３、列６のオイル。

表１１、列５に提供される、表１９（実施例９）、列２のオイル。

表１１：

本結果は、その残渣画分が非常に強い色調を有し、一方で、本発明により開示されるそれらのように、蒸留及び他の精製／高濃縮ステップよって得られた精製したＶＬＣＵＳＦＡ組成物（最終産物）が許容可能な色をもたらすことを示している。

実施例７：ＶＬＣＵＳＦＡ組成物はさらに活性炭によって精製される

オメガ－３－酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用規模の蒸留からの二つの残渣（表１２、列２及び３）からベンゾ［ａ］ピレン（ＢＡＰ）及び芳香族多環式（４ＰＡＨ）を精製し、そして活性炭（ＡＣ）処理前後で、高濃縮したＶＬＣＰＵＦＡ＆ＶＬＣＭＵＦＡ濃縮物（表３、列６において同じオイルである表１２、列４）と比較した（表１２、列４及び５）。

表１２：

その残渣画分は、ＢＡＰ及び４ＰＡＨについて上記の許容可能な／法的な値を含む。しかしながら、精製した組成物（表１２、列４）は、これらの汚染物質を許容可能な／法的な濃度よりも低く含む。その活性炭処理したオイルは両方の環境的な汚染物質を非常に減らした。

実施例８：高濃度ＶＬＣＵＳＦＡ組成物の調製
最終蒸留物からのオイルのいくつか（実施例１、表３、列６）を、尿素沈殿法（ｕｒｅａ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）にかけた。尿素画分化は、同じ鎖長であるが、異なる不飽和度を有する脂肪酸の分離画分を分離するための方法である。

３００ｇの尿素を６００ｇのエタノール（９６％）とジャケット付リアクター内で混合し、そして撹拌下で加熱し還流した。１５０ｇのオイル（実施例１、表３、列６）を加え、そして撹拌した混合物を３０分間還流下で撹拌した。２５℃に冷却後、その混合物を濾過し、その濾過物のエタノールを部分的に蒸発させ、そしてその混合物の二度目の濾過を行った。そのオイルを続いて、５％クエン酸を含む水によって洗浄し、そして水によって２回洗浄し、真空下で乾燥し、表１３の列２に示した脂肪酸組成物を有するオイルを得た。この産物オイルをさらに短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力）を用いて蒸留した。そのオイルを１１６℃で第一の蒸留を行い、軽い画分を除去した。その残渣を続いて１４５℃の温度で蒸留し、そして、その蒸留物を回収した。その蒸留物をさらに１１２℃で蒸留し、この蒸留からの残渣をさらに取り、１１０℃の温度で蒸留にかけた。その残渣画分は（さらに取られ、そして）表１３の列３に示した脂肪酸組成物を有していた。

表１３：

（蒸留からの、すなわち表１３、列３の）残渣オイルの一部を、３０ｍｌの９６％エタノール中に１．５ＫＯＨを有する７．５ｇのオイルを反応することによって、加水分解した（Ｈｙｄｒｏｌ．）。１時間５０℃で加熱後、その溶液を冷却し、そしてクエン酸を飽和させた１００ｍｌの水によってクエンチした。その遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を酢酸エチルによって抽出し、そして水によって洗浄した。その有機相の蒸発では、７グラムのオイルをもたらした。

このオイルをシリカ（４０ｇのｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ０．０６３～０．３００ｍｍ）のカラム（２．５ｃｍ径）を通じて得た。第一のカラムを２００ｍｌのイソオクタンによって溶出し、オイルはこの画分には見られなかった。そのカラムを続いて１００ｍｌの１５％酢酸エチルを含むイソオクタンによって溶出し、この画分（～１．５ｇ）（画分１）は表１３の列４に示される組成物を有していた。別の１００ｍｌの１５％酢酸エチルを含むイソオクタンによる溶出では、画分２（～３ｇ）をもたらし、列５に示された組成物を有していた。別の１００ｍｌの１５％酢酸エチルを含むイソオクタンによる溶出では、画分３（～１．５ｇ）をもたらし、表１３の列６に示される脂肪酸組成物を有していた。

従って、高濃度のＶＬＣＵＳＦＡｓ及び高純度を有する組成物を得た。特に、脂肪酸Ｃ２８：８ｎ３は高濃度で得られた。

実施例９：減少したコレステロール含量からのトリグリセリドのＶＬＣＵＳＦＡｓの組成物の調製

約３６％のＥＰＡ及び約２５％のＤＨＡ、及び表１４の列２に示される脂肪酸組成物を含んでいるオメガ－３－酸濃縮物を産生するために利用されるエチル化したイワシ及びサバオイルの商用規模の蒸留からの、４７．８２ｋｇの残渣を、その残渣と（オイル重量の）７重量％の２％のナトリウムエトキシドを含む無水エタノールとを反応させることにより、エチル化プロセスにかけ、残存するグリセリドの含量を減らした。その混合物を８０℃で１時間循環下で撹拌した。その超過したエタノールを続いて真空下で蒸発させた。その撹拌を止め、そして３０分後、少量の暗く重い相のグリセロールをリアクターから底のバルブを介して排出した。そのオイルを続いて５％クエン酸を含む水によって洗浄し、そして水によって２回洗浄した。そのオイル相を続いて４０～５０℃で真空下で乾燥し、表１４の列３に示される組成物を有するオイルを直接次ステップにかけた。

表１４：ＶＬＣＦＡｓの精製及び高濃縮時の異なる画分の脂肪酸プロファイル及びコレステロール含量。結果を領域パーセント（Ａ％）として；エチルエステル（ＥＥ）、モノグリセリド（ＭＧ）、ジグリセリド（ＤＧ）及びトリグリセリド（ＴＧ）についてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からのクロマトグラムにおいて示し、そして脂肪酸分析についてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）からのＡ％として示した。当業者は、その脂肪酸組成物がエチル化及び酵素処理によって変化しないことに気付くだろう。この理由のために、列３及び４の脂肪酸組成物は分析されていない。
列２：残渣画分
列３：エチル化後
列４：下記のような酵素処理後
列５：（下記のような）列４の酵素学的処理したオイルの単回の蒸留からの蒸留物
列６：（下記のような）列５のオイルの蒸留物からの残渣

酵素処理

エチル化ステップから生じたオイル材料（表１４、列３）を４．８ｋｇの固定化酵素（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ４３５，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びその混合物を４８時間８０℃及び真空（１０ｍｂａｒ）で撹拌した。冷却及び濾過後、その得られたオイル材料（４２．１６ｋｇ）を蒸留にかけた。

酵素処理時の試料の分析からの結果を以下の表１５に示す。

表１５

表１５に提供される結果は、遊離コレステロールが４８時間の反応時間にわたって、１２．４ｍｇ／ｇから０．５３ｍｇ／ｇへと段階的に減少されることを示している。これは、酵素学的なステップの際に、遊離コレステロールがコレステロールエステルに変換されることを意味する。これは驚くべきことに、リパーゼ酵素がコレステロールエステルの酵素学的な合成におけるアルコール基質のように遊離コレステロールを受けること示す。通常そのような変換はコレステロールエステラーゼ酵素によって行われる。また、上記のプロセスは、適当な酵素調製物の、他の相対量、及び他の原料を利用すること、並びに本実施例に記載されるもの以外の他の反応時間及び真空度を含む、他の反応条件を利用することで、かつ／又はエステル転移反応の間副産物として形成されるエタノールを除去するための工程を含む、反応を完結させるために用いられうる追加の工程を含むことによって、実行される。

酵素反応時に、モノグリセリド（ＭＧ）の量は減り、そしてジ－及びトリグリセリド（ＤＧ、ＴＧ）の量は増加した。ＳＥＣ法が、オメガ－３－酸トリグリセリド、オメガ－３－酸エチルエステル及び魚油について欧州薬局方及び米国薬局方のモノグラフにおいて記載されたものと同様であり、おそらく長鎖脂肪酸の多い試料中のＭＧ含量を過剰評価し、そしてエチルエステル（ＥＥ）含量を過小評価することに、その長鎖ＥＥｓがより短いＭＧｓ鎖と同様の分子サイズを有し、そして、この理由のためにＭＧｓと共溶出するので、気付くべきである。それゆえ、４８時間後の試料中のＭＧの真の含量はおそらく低い。

４８時間後の、酵素処理したオイル（表１４、列４）を続いて、短行程蒸留（ＶＴＡ，デガッサーを有するモデルＶＫ８３－６－ＳＫＲ－Ｇ）において単回の蒸留にかけた。第一のカラムの温度は１９０℃（４ｋｇ／時の流量及び０．０１ｍｂａｒの真空度）であって、その残渣を廃棄物として回収し、一方でその蒸留物はさらにかけられた。驚くべきことに、その蒸留物（表１４、列５）の総コレステロールは、出発オイル（表１４、列２）における１４．７ｍｇ／ｇから減り、０．６ｍｇ／ｇのみであった。この総コレステロールの大幅な減少は、酵素処理時の遊離コレステロールの驚くべきエステル化によってもたらされ、そしてそのコレステロールエステルは上記のように第一の蒸留ステップからの残渣画分において取り除かれうる。

酵素処理後（表１４、列５）の蒸留からの蒸留物オイル（３５．３８ｋｇ）を続いて、一連の短行程蒸留装置（温度１２０～１４１℃及び真空度０．０１ｍｂａｒ、ＶＴＡ、デガッサーを有するモデルＶＫ８３－６－ＳＫＲ－Ｇ）にかけた。各ステップについて、軽い画分（２０～３０％）を蒸留物として除去し、一方でその残渣を、次の蒸留ステップに戻した。最終蒸留後の残渣の組成物（５．７２ｋｇ）を表１４の列６に示した。

エチル化後及び酵素処理後の両方の、蒸留したオイルの分析では、驚くべきことに、ＶＬＣＰＵＦＡｓ及びＶＬＣＭＵＦＡｓが熱分解されずに蒸留されうることを示した。また、驚くべきことに、ＶＬＣ脂肪酸は蒸留によってグリセリド及びコレステロールエステルから分離され、コレステロール含量を実質的に減少した、ＶＬＣＵＳＦＡｓの濃縮した組成物を提供することが分かった。

冷却濾過：
上記の蒸留からの３．５ｋｇの残渣オイル（すなわち表１４、列６）を冷却し、そして３℃で一晩保存し、そして続いて濾過した。（表１４、列６の時点での）その出発オイルの脂肪酸組成物（Ａ％）、その濾過物及びフィルターケーキを表１６の列２、３及び４にそれぞれ示した。

表１６：

上記の結果は、また、飽和脂肪酸がフィルターケーキから除去されやすいので、冷却画分化により、一価及び多価不飽和脂肪酸から飽和脂肪酸が画分化されうることを示している。

漂白

上記の冷却濾過後のオイル（すなわち、濾過物、表１６、列３）を８％漂白土及び０．５％活性炭によって７５℃で１時間漂白した（３．０３ｋｇ）。その反応混合物を冷却し、そして濾過した。その漂白後のオイルは０．２ｍｅｑ／ｋｇの過酸化物価及び１４．７のアニシジン価を有していた。

再エステル化
２．７５ｋｇの漂白後の上記のオイルを再エステル化し、６．０５％グリセロール及び５％の固定化酵素（Ｌｙｐｏｚｙｍｅ ４３５，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と真空下（５～１０ｍｂａｒ）、８０℃で２４時間混合することによって、トリグリセリド脂肪酸を調製した。その反応混合物を冷却し、濾過した。

漂白

上記の再エステル化後のオイル（２．３１ｋｇ）を６％漂白土によって漂白し、７５℃及び５～１０ｍｂａｒで１時間撹拌した。その反応混合物を冷却し、濾過した。漂白後のオイル（１．９７ｋｇ）は０．１ ｍｅｑ／ｋｇの過酸化物価及び７．３のアニシジン価を有していた。

蒸留

上記の漂白からのオイル（１．９７ｋｇ）を短行程蒸留スチル（ＶＴＡ、モデルＶＫＬ－７０－４－ＳＫＲ－Ｔ）を用いて１９０℃、３．５ｍｌ／分の流量及び１０^－３ｍｂａｒの圧力で蒸留した。その残渣（１．２０ｋｇ）を産物として回収し、一方で（エチルエステル及びＭＧの豊富な）蒸留物を廃棄した。蒸留前後のエチルエステル及びグリセリド含量（残渣）を表１７において示した。

表１７：

脱臭

蒸留後の上記の残渣オイル（１．２０ｋｇ）は、主にトリグリセリドの形態の脂肪酸を含み、真空下（１～５ｍｂａｒ）及び１４０℃で３時間、蒸気によって脱臭された。その反応混合物を冷却し、そして混合したトコフェロールを追加した。脱臭した「ＶＬＣＦＡトリグリセリド」オイル（１．１６ｋｇ）の分析結果を、以下の表１８及び１９に示した。

表１８

表１９

ＵＳＰという列はｏｍｅｇａ－３ Ａｃｉｄ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓの米国薬局方のモノグラフを意味し、そしてＧＯＥＤという列は「ＧＯＥＤ ｖｏｌｕｎｔａｒｙ ｍｏｎｏｇｒａｐｈ」を意味する。Ｐｈ．Ｅｕｒという列は、その試験のための最大限度に関するＯｍｅｇａ－３－ａｃｉｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓの欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ）（２０１９年第９版）のモノグラフを意味する。表１９に記載されるように、ＶＬＣＦＡトリグリセリド産物は、全３システムの要求に従う。

当業者は、酸化に対する保護が、表１９に例示されるように、数ｋｇのバッチよりも生産スケールの量についてあまり難しくないことに気付くだろう。それゆえ、上記の型の試験結果は、そのプロセスが商用スケールで行われた場合に、表１９に示される値よりも低い値を有し、さらに良くなる可能性がある。

上記で調製した濃縮物は、高度に精製され、グリセリド混合物に変換された。その精製したＶＬＣＦＡトリグリセリド産物は透明色を有し、かつ酸化パラメータ、コレステロール含量及び環境汚染物質について非常に低い値を有する。

上記の実施例及び結果は、本明細書で開示され、請求されるようにＶＬＣＭＵＦＡｓ及びＶＬＣＰＵＦＡｓの脂肪酸混合物を含んでいる豊富な組成物が作製されうることを示している。

Claims (31)

1. 脂肪酸混合物を含む組成物であって、ここで前記脂肪酸混合物が、少なくとも４．０重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸及び少なくとも１．０重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、ここで、前記脂肪酸が天然オイルより由来し、かつここで前記超長鎖一価不飽和脂肪酸及び前記超長鎖多価不飽和脂肪酸が２４炭素原子数以上の鎖長を有する組成物。
2. 前記天然オイルが海産油又は淡水生物からのオイルである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記天然オイルが魚油、軟体動物油、甲殻類油、海産哺乳動物油、プランクトン油、藻類油、及び微細藻類油から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記脂肪酸混合物が少なくとも３０重量％の一価及び多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記脂肪酸混合物が少なくとも８．０重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記脂肪酸混合物が少なくとも１５重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記脂肪酸混合物が少なくとも１重量％の２４炭素原子数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記脂肪酸混合物が少なくとも６重量％の２４炭素原子数より長い鎖長を有する超長鎖一価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記脂肪酸混合物が少なくとも２重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記脂肪酸混合物が少なくとも１０重量％の一以上の超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記脂肪酸混合物が少なくとも１０重量％の一以上の超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記脂肪酸混合物が少なくとも２０％の総量において超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５０％の総量において超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記脂肪酸混合物が超長鎖一価不飽和脂肪酸及び超長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸を３：１～１：２の重量比において含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の一以上のＣ２８超長鎖多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の少なくとも一つの前記超長鎖脂肪酸Ｃ２８：６ｎ３及びＣ２８：８ｎ３を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の前記超長鎖脂肪酸Ｃ２６：６ｎ３を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記脂肪酸混合物が少なくとも５重量％の前記超長鎖脂肪酸Ｃ２４：５ｎ３を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記脂肪酸混合物がさらに少なくとも１重量％のＣ１８～Ｃ２２一価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記脂肪酸混合物がさらに少なくとも１重量％のＣ１８～Ｃ２２多価不飽和脂肪酸を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記脂肪酸が、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、モノ－、ジ－、トリグリセリド、エチルエステル、ろうエステル、コレステリルエステル、セラミド、リン脂質又はスフィンゴミエリンの、単体又は組み合わせの形態である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記脂肪酸が、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、エチルエステル、グリセリド又はろうエステルの形態である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記脂肪酸混合物が５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記脂肪酸混合物が８未満のガードナー色数を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記脂肪酸が２μｇ／ｋｇ未満のベンゾ［ａ］ピレン（ＢＡＰ）及び／又は１０μｇ／ｋｇ未満の多環芳香族炭化水素（４ＰＡＨ）を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 医薬品、機能性食品、栄養補助食品、食品添加剤又は化粧品としての使用のための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 少なくとも１．０重量％の超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡｓ）及び少なくとも４．０重量％の超長鎖一価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＭＵＦＡｓ）を含む脂肪酸混合物を含む組成物の産生のための方法であって、ここで前記脂肪酸混合物がオイル材料より調製され、
    ｉ）オイル材料内に存在する遊離コレステロールをコレステロールエステルへ変換すること；及び
    ｉｉ）ステップｉ）の材料内に存在する超長鎖脂肪酸エステルからステップｉ）のコレステロールエステルを分離すること：
    のステップを含む方法。
29. ステップｉ）において前記オイル材料を、リパーゼのような、エステル化触媒と接触させ、前記遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換する、請求項２８に記載の方法。
30. ステップｉｉ）においてコレステロールエステル及び脂肪酸エステルを含むステップｉ）からの前記オイル材料が、蒸留される、請求項２８又は２９に記載の方法。
31. ５ｍｇ／ｇ未満のコレステロールを含む請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物の産生のための請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。