JP2023087650A

JP2023087650A - 腸内微生物ゲノムｄｎａ低張保護剤とその製造方法及び応用

Info

Publication number: JP2023087650A
Application number: JP2022178587A
Authority: JP
Inventors: 周軍衛; Junwei Zhou; 盧景勳; Jingxun Lu
Original assignee: Biomed Technology Holdings Ltd
Current assignee: Biomed Technology Holdings Ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2022-11-08
Publication date: 2023-06-23
Also published as: US20230183777A1; CN115466740A

Abstract

【課題】腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を提供する。【解決手段】成分として、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１×ＰＢＳ、１００～２００ｍＭのグアニジンチオシアン酸塩を含有する。前記腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤のｐＨ値は７．０～７．４の間である。本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤は、低温の冷蔵庫を必要とすることなく、腸内微生物サンプルを便利且つ安全に３週間保存可能であり（室温）、低温であればより長期的に保存可能である。また、当該試薬には毒性がなく、使用しやすく、低コストであり、幅広い応用がより容易である。本発明は、更に、上記の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の製造方法及び応用を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、生化学及び分子生物学の分野に属し、具体的には、ヒトの腸内微生物ゲノムＤＮＡの安定性を保護する化学試薬に関する。

ヒトや動物の腸内には大量の有意義な微生物が存在する。これらの腸内微生物と宿主の健康には密接な関係が存在し、全世界の学術界及び産業界から広く注目を集めている。近年は、多くの研究機関及び企業が、腸内細菌叢と人体の疾病との関係研究や、腸内健康検査サービスに力を入れている。現在、腸内微生物の検出については米国で広く展開されており、本邦はこの方面に着手したばかりであるが、成長は非常に速い。腸の健康アセスメントや腸内微生物移植ドナーの健康診査を行う際には、高品質の腸内微生物ゲノムＤＮＡを抽出可能なことがポイントとなる。しかし、腸内には大量のヌクレアーゼが存在するため、腸内微生物ゲノムＤＮＡは室温で非常に分解されやすい。そこで、腸内微生物ゲノムＤＮＡの安定性を維持することが、腸内微生物ゲノムＤＮＡを効果的に抽出するための重要な前提となる。腸内微生物ゲノムＤＮＡ保護剤は、サンプルの輸送や操作中に腸内微生物ゲノムＤＮＡの完全性を効果的に保護し得るため、腸内微生物の生態学的分析や代謝特性の検出においても極めて重要である。特に、室温での郵送を求められるサンプルの場合、輸送過程の温度は制御が困難なことから、深刻なＤＮＡ分解が生じてしまう。一方、低温や恒温では大幅にコストが増大する。そのため、経済的且つ効果的な腸内微生物ゲノムＤＮＡ保護剤にいっそう依存することとなる。

ホルムアルデヒドは、ゲノムＤＮＡ保護剤に広く使用されている。ホルムアルデヒドは、細胞膜を安定させることで細胞溶解を減少可能とする。そのほか、ホルムアルデヒドは、ヌクレアーゼを抑制することで、例えば、ＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）によるＤＮＡ分解といった酵素反応を抑えることも可能である。しかし、ホルムアルデヒド又はホルムアルデヒドを放出する物質の使用には明らかな欠点が存在する。つまり、これらは、核酸分子間、又は、タンパク質と核酸との架橋を誘発することで核酸の分離効率を低下させる恐れがある。現在、ゲノムＤＮＡ保護剤の研究及び開発は一定の進展を得ているが、新たな要求も絶えることがない。特に、新たな腸内細菌叢検出分野では、微生物ＤＮＡの長期的な安定を室温で維持することが、検出感度と精度の向上、及び輸送コストの制御において極めて重要となっている。

本発明は、上記を背景として、新たな腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を開発し、ヒトの腸内微生物ゲノムＤＮＡが室温で分解されるとの課題を効果的に解決することで、室温における腸内微生物ゲノムＤＮＡの長期保存を実現し、その安定性を更に向上させる。

本発明の目的は、腸内微生物ゲノムＤＮＡを安定させ得る方法を提供し、且つ、従来の腸内微生物ゲノムＤＮＡ保護剤の技術的欠点を解消可能とすることで、サンプル中の全微生物ゲノムＤＮＡの安定を可能な限り全面的に保護することを目的とする。且つ、１）このような保護の作用条件を室温に適したものにし、２）保護作用の有効期間を３週間まで延長することを実現する。また、これにより、サンプルが日常的な輸送条件（例えば、郵送）に適するよう確実に保証する。

上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術方案を採用する。

本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤は、無色、無毒の透明な溶液であり、迅速に腸内微生物の細胞質に浸透可能である。また、成分が、特定の比率で迅速且つ効果的に腸内サンプル中のＤＮアーゼを不活性化することで、サンプル中のＤＮＡを一定期間内は室温で分解されないようにする。本試薬は、恒温や低温の利用という不便さを解消可能であるほか、腸内微生物サンプルの室温輸送における課題を効果的に解決可能である。本発明におけるＤＮＡ保護試薬の有益な効果は、次のいくつかの方面で体現される。

ヒトの腸内微生物の数は膨大であり（人体の細胞総数の３～１０倍）、種類が非常に多い（１０００種類を超える）。そのため、細菌由来の各種ＤＮアーゼが非常に多く、ＤＮＡの急速な分解が招来され得る。これに対し、本発明で記載するＤＮＡ保護試薬は、複数種類の異なる有効成分を含有する。グアニジンチオシアン酸塩は、脱共役剤であって、強力なタンパク質変性剤の一種である。グアニジンチオシアン酸塩は、ＤＮアーゼを急速に不活性化することで、ＤＮＡがＤＮアーゼによって分解されないよう保護可能とする。本発明で記載するＤＮＡ保護試薬のもう１つの成分であるＴｗｅｅｎ２０は、非イオン型の界面活性剤であり、細胞膜の透過性を強化可能とすることで、微生物細胞に対するグアニジンチオシアン酸塩の進入を加速して、ゲノムＤＮＡを保護する作用を発揮する。本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤は、非特異性のタンパク質変性剤である。当該保護剤は、ＤＮアーゼを抑制及び不活性化してＤＮＡを保護可能なだけでなく、大多数のその他のプロテアーゼの抑制及び変性も可能なため、サンプル中のＲＮＡ、発現プロファイル及びタンパク質の完全性についても同様に保護可能である。本発明で記載するＤＮＡ保護試薬中の０．１×ＰＢＳは、低張緩衝液であり（１×ＰＢＳは等張緩衝液）、微生物細胞を膨張状態にすることで、Ｔｗｅｅｎ２０及びグアニジンチオシアン酸塩の作用効率を大幅に向上可能とする。本発明で記載する微生物ゲノムＤＮＡ保護剤の保管温度は４～２５度であり、ヒトの腸内微生物サンプルの保存に非常に適している。

本発明は、更に、上記の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の製造方法を提供する。当該方法は、以下のステップを含む。

水中にグアニジンチオシアン酸塩を加え、８０度のウォーターバスに放置して完全に溶解させる。その後、リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）とＴｗｅｅｎ２０水溶液を順に加え、均一に攪拌したあと、ｐＨを７．０～７．４に調整して超純水で定容する。最後に、各成分を上記の比率とすることで、本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を取得する。

本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の製造方法において、好ましくは、前記水は超純水である。

本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の製造方法において、好ましくは、ＮａＯＨを使用してｐＨを調整する。

図１は、サンプルを室温で１週間保存し、本件特許の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤と、ＰＢＳ緩衝液及び某メーカー製品による保護効果（サンプル中の微生物の種多様性）を比較したものである。図２は、サンプルを室温で２週間保存し、本件特許の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤と、ＰＢＳ緩衝液及び某メーカー製品による保護効果（サンプル中の微生物の種多様性）を比較したものである。図３は、サンプルを室温で３週間保存し、本件特許の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤と、ＰＢＳ緩衝液及び某メーカー製品による保護効果（サンプル中の微生物の種多様性）を比較したものである。

本発明の技術方案において、上記のグアニジンチオシアン酸塩、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０、超純水等の原料又は成分は、いずれも従来の試薬であるか、従来の製品に従来の方法を使用して製造可能な試薬である。各試薬の入手元は表２の通りである。

本発明で記載する製造方法において、上記のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びＴｗｅｅｎ２０水溶液の製造方法はそれぞれ次の通りである。

リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）の調製：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１粒取り、８００ｍｌの超純水中に十分溶解させてから、１０００ｍｌまで定容し、４度で保存する。

５％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液の調製：２．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を取り、４０ｍｌの超純水中に十分溶解させてから、５０ｍｌまで定容し、４度で保存する。

以下に、実施例形式で本発明の技術方案につき更に説明するとともに、関連の実験によって、本発明の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の有益な効果を証明する。

１Ｌの滅菌ガラス瓶に４００ｍｌの超純水を投入し、１７．７ｇのグアニジンチオシアン酸塩を加えてから、８０度のウォーターバスに放置して完全に溶解させた。次に、上記の方法で調製した試薬として、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、４０ｍｌの５％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液を順に加え、均一に攪拌したあと、５Ｎ及び１ＮのＮａＯＨでｐＨを７．０～７．４に調整してから、超純水で１Ｌまで定容し、４度で保存した。

製造した腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤には、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１５０ｍＭのグアニジンチオシアン酸塩が含有されていた。

実施例１の応用
上記の成分に従って腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を調製してから、ＰＢＳ緩衝液及び某商業ブランドのＤＮＡ保護剤との比較実験を行った。具体的なステップは次の通りであった。

５ｍｌチューブを使用して、本実施例で提供する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を１ｍｌ、又はＰＢＳを１ｍｌ、又は某商業ブランドのＤＮＡ保護剤を１ｍｌそれぞれ添加した。また、腸内微生物サンプル（糞便）をそれぞれ採取した。各チューブに採取したサンプル量は約１０～１００μｌであった。

採取したサンプルは室温で放置し、輸送環境温度をシミュレーションした。そして、第１週、第２週、第３週に腸内微生物ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出試薬キットには、キアゲン香港（ＱＩＡＧＥＮＨＯＮＧＫＯＮＧＰＴＥ．ＬＩＭＩＴＥＤ）の核酸抽出試薬（ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ）を使用した。

取得したＤＮＡについて、１６Ｓ遺伝子ＰＣＲ増幅を行ったあと、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社）でシーケンシングした。サンプル中の微生物の種多様性を比較することで、腸内微生物ゲノムＤＮＡに対する保護剤の保護効果を判断可能であった。

結果は、図１～３に示す通りであった。

図１～３に示すように、ヒトの腸内微生物サンプル（糞便）に本件特許の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を加えたあと、３つのタイミング（第１週、第２週、第３週）のシーケンシングで検出された微生物の種多様性は、いずれも、ＰＢＳ緩衝液及び某商業ブランドのＤＮＡ保護剤を加えた場合の結果より明らかに高かった（図１～３は、それぞれ、第１週～第３週の検出結果に対応している）。且つ、検出された微生物の種多様性は、室温での保存期間の長期化に伴って明らかに低下することはなかった。これは、以下を意味していた。

１）本件特許製品（腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤）は、ヒトの腸内微生物サンプル中のゲノムＤＮＡに対し顕著な保護作用を発揮した。

２）本件特許製品（腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤）は、同種の製品よりも、ヒトの腸内微生物サンプル中のゲノムＤＮＡに対し良好な保護効果を有していた。

Claims

成分として、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１×ＰＢＳ、１００～２００ｍＭのグアニジンチオシアン酸塩を含有し、ｐＨ値が７．０～７．４の間であることを特徴とする腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤。
低張リン酸緩衝生理食塩水（０．１×ＰＢＳ）を使用することを特徴とする請求項１に記載の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤。
低張リン酸緩衝生理食塩水（０．１×ＰＢＳ）と１００～２００ｍＭのグアニジンチオシアン酸塩を組み合わせて使用することを特徴とする請求項１に記載の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤。
前記腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤のｐＨ値は７．０～７．４の間であることを特徴とする請求項１に記載の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤。
請求項１に記載の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を製造する方法であって、
水中にグアニジンチオシアン酸塩を加えて、８０度のウォーターバスに放置して完全に溶解させ、その後、リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）とＴｗｅｅｎ２０水溶液を順に加え、均一に攪拌したあと、ｐＨを７．０～７．４に調整して水で定容し、最後に、各成分を上記の比率とすることで、本発明で記載する腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤を取得する、とのステップを含むことを特徴とする方法。
前記水は超純水であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
ＮａＯＨを使用してｐＨ値を調整することを特徴とする請求項５に記載の方法。
細菌の保存、酵母の保存、植物組織の保存、動物組織の保存、接着細胞の保存、浮遊細胞の保存、ヒト及び動物の体表面微生物の保存、ヒト及び動物の口腔微生物の保存、ヒト及び動物の腸内微生物の保存、ヒト及び動物の生殖器微生物の保存過程における請求項１に記載の腸内微生物ゲノムＤＮＡ低張保護剤の応用。