JP2023080185A - キメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

【課題】嵩高い細胞外ドメインを有する標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、Ｆａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供すること。【解決手段】本発明はまた、かかるＣＡＲをコードする核酸配列および構築物、かかるＣＡＲを発現する細胞、ならびにその治療における使用を提供する。第２の態様では、本発明の第１の態様のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。第３の態様では、本発明の第２の態様の第１の核酸配列、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。特に、本発明は、Ｆａｂ様抗原結合ドメインを有するＣＡＲに関する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
がん処置での使用のためのいくつかの免疫治療剤（治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれる）が記載されている。

キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能とつなぎ合わせたタンパク質である。その通常の形態は、抗原認識アミノ末端（バインダー）、およびＴ細胞活性化シグナルを伝達するエンドドメインと接続された膜貫通ドメインを有するタイプＩ膜貫通ドメインタンパク質の形態である。

これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインと融合した融合物である。かかる分子により、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞を活性化させる。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現するとき、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。種々の腫瘍関連抗原に対するＣＡＲが開発されており、その多くが現在臨床試験段階である。

ＣＡＲ－Ｔ細胞媒介処置は小型の標的抗原（ＣＤ１９またはＧＤ２など）で成功を収めているが、キメラ抗原受容体は、嵩高い細胞外ドメインを有する抗原に応答したシグナル伝達に失敗することが多い。

抗原遭遇後の下流シグナル伝達を効率よく作動させるにはシナプスに適切な距離が必要である。（ＴＣＲのペプチドＭＨＣとの相互作用を介して）Ｔ細胞が抗原提示細胞と遭遇した際に、界面のタンパク質は、サイズに基づいて受動的に分離する。大きなエクトドメインを有するホスファターゼ（ＣＤ４５およびＣＤ１４８など）は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の密接な接触領域から排除される（図１を参照のこと）。ペプチドＭＨＣとＴＣＲの相互作用によって形成されたシナプスは、ＣＤ４５の閉塞に最適である。ＣＤ１９などのより小さな抗原を標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、シナプス形成に対する障壁はなく、かかる抗原は、複数のエピトープで効率的に標的にされ得る。図２に示すように、ＣＤ２２などの大きなタンパク質は、固有の問題を引き起こす。かかるタンパク質上の膜遠位エピトープを標的にすることにより、ホスファターゼがシナプスに侵入してチロシンリン酸化を阻害する最適以下のシナプス距離が生じる可能性がある。膜近位領域を標的にすることはシナプス形成を改善し得るが、エピトープが立体的に閉塞されると、シナプス内にホスファターゼを存在させて、チロシンリン酸化（キナーゼ活性）を減弱し、それによってＣＡＲシグナルを伝達させる標的の連結が最適以下となる可能性がある。

したがって、大きいか嵩高い標的抗原を発現する標的細胞を死滅させることができる代替のＣＡＲ Ｔ細胞アプローチが必要である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
嵩高い細胞外ドメインを有する標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記標的抗原が、少なくとも約１５０Åの細胞外ドメインを有する、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記標的抗原が、少なくとも約４００個のアミノ酸の細胞外ドメインを有する、項目１または２に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記標的抗原が、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ１、またはＦｃＲＬ５である、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記標的抗原がＣＤ２２である、項目４に記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記抗原結合ドメインが、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

を含む、項目５に記載のＣＡＲ。
（項目７）
配列番号６５として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６として示した配列を有するＶＬドメインを含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記抗原結合ドメインが、ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

を含む、項目５に記載のＣＡＲ。
（項目９）
配列番号９９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１００として示した配列を有するＶＬドメインを含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目１０）
前記項目のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
（項目１１）
以下の一般構造：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＬ
を有し、
ここで、
ＶＨは、第１のポリペプチドの重鎖可変ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＨは、前記第１のポリペプチドの重鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、前記第１のポリペプチドのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、前記第１のポリペプチドの膜貫通領域をコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、前記第１のポリペプチドのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＶＬは、第２のポリペプチドの軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＬは、前記第２のポリペプチドの軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、前記第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列である、項目１０に記載の核酸配列。
（項目１２）
項目１０または１１に記載の第１の核酸配列、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列を含む、核酸構築物。
（項目１３）
項目１０または１１に記載の第１の核酸配列；ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列；およびｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第３のＣＡＲをコードする第３の核酸配列を含む、核酸構築物。
（項目１４）
前記第１の核酸配列が抗ＣＤ２２ Ｆａｂ ＣＡＲをコードし；前記第２の核酸配列が抗ＣＤ７９ ｄＡｂ ＣＡＲをコードし；前記第３の核酸配列が抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードする、項目１３に記載の核酸構築物。
（項目１５）
項目１０または１１に記載の核酸配列または項目１２～１４のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（項目１６）
項目１～９のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
（項目１７）
項目１～９のいずれかに記載の第１のＣＡＲ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
（項目１８）
項目１～９のいずれかに記載の第１のＣＡＲ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する第２のＣＡＲ；およびｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第３のＣＡＲを発現する細胞。
（項目１９）
前記第１のＣＡＲが抗ＣＤ２２ Ｆａｂ ＣＡＲであり；前記第２のＣＡＲが抗ＣＤ７９
ｄＡｂ ＣＡＲであり；前記第３のＣＡＲが抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲである、項目１６に記載の細胞。
（項目２０）
項目１０または１１に記載の核酸配列；項目１２～１４のいずれかに記載の核酸構築物；または項目１５に記載のベクターを細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入するステップを含む、項目１６～１９のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
（項目２１）
項目１６～１９のいずれかに記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
（項目２２）
項目１９に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。（項目２３）
前記がんがＢ細胞リンパ腫または白血病である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
がんの処置で使用するための項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２５）
がんを処置するための医薬組成物の製造における項目１６～１９のいずれかに記載の細胞の使用。

Ｆａｂ ＣＡＲ（Ｆａｂ）、ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を有する古典的ＣＡＲ、ホスファターゼＣＤ４５、ＣＤ４／ＴＣＲ／ＭＨＣ複合体、およびＣＤ２：ＣＤ５８複合体の細胞外ドメインの相対サイズを示す概要図。ＴＣＲ：ＭＨＣ相互作用またはＣＡＲ：標的抗原相互作用のいずれかを介してＴ細胞が腫瘍細胞と相互作用するとき、免疫シナプスが形成され、ホスファターゼ（ＣＤ４５およびＣＤ１４８など）が排除される。

ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＣＤ４／ＴＣＲ／ＭＨＣ複合体、およびＣＤ２：ＣＤ５８複合体の細胞外ドメインの相対サイズを示す概要図。ＣＤ２２は、非常に大きく嵩高い細胞外ドメインを有する。これにより、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＤ２２細胞外ドメインとの組み合わせた長さが最適なＴ細胞；標的細胞シナプスにとって長すぎるため、ＣＡＲ Ｔ細胞の標的になり難く、このことは、ホスファターゼ（ＣＤ４５およびＣＤ１４８など）が効率的に排除されないことを意味する。

（Ａ）ＣＤ２２を標的にするＦａｂＣＡＲ、およびｂ）ＣＤ２２を標的にする古典的ｓｃＦｖ ＣＡＲについてのＴ細胞：標的細胞シナプスを示す概要図。驚いたことに、細胞外ドメインはｓｃＦｖ ＣＡＲ細胞外ドメインより長くて嵩高いにも関わらず、大きくかつ嵩高い細胞外ドメインを有する標的抗原に関連する問題を解決するようであり、ＦａｂＣＡＲにより、標的細胞と遭遇した際のＣＡＲ媒介性シグナル伝達が向上し、より効率的に標的細胞を死滅させる。

ＦａｂＣＡＲまたはｓｃＦｖ ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＣＤ２２発現標的細胞の殺滅を比較したグラフ。Ｔ細胞に、Ｆａｂ ＣＡＲまたはＣＤ８ストークスペーサーを有するｓｃＦｖ ＣＡＲのいずれかを発現するウイルスベクターで形質導入した。抗原結合ドメインは、同一の抗ＣＤ２２抗体（１０Ｃ１または１Ｄ９－３のいずれか）に基づいていた。Ｔ細胞を、ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と２４時間共培養し、標的細胞の絶対数、および非形質導入（ＮＴ）条件下で標的数にしたがって正規化したＣＡＲ中の数を計算した。正規化データを、標的細胞の生存率として示す。

標的細胞との４日間の共培養後のＴ細胞増殖を示すヒストグラム。ＣＤ５６枯渇ＣＡＲ発現Ｔ細胞をＲａｊｉ標的細胞と共培養し、フローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞の分裂時に生じるＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）の希釈を測定した。ＣＴＶで標識されたＴ細胞は、４０５ｎｍ（紫色）レーザーで励起される。以下の構築物の同一パネルを殺滅アッセイに関して試験した：すなわち、１０Ｃ１ ＦａｂＣＡＲ；ＣＤ８ストークスペーサーを有する１０Ｃ１ ｓｃＦｖ ＣＡＲ；１Ｄ９－３ ＦａｂＣＡＲ、およびＣＤ８ストークスペーサーを有する１Ｄ９－３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ。

キメラ抗原受容体の異なる結合ドメイン形式 （ａ）Ｆａｂ ＣＡＲ形式；（ｂ）ｄＡｂ ＣＡＲ形式；（ｃ）ｓｃＦｖ ＣＡＲ形式

異なる形式のＣＡＲを使用したＣＤ１９、ＣＤ２２、およびＣＤ７９を標的にするＣＡＲ ＯＲゲート （ａ）２つのＦＭＤ－２Ａ配列を使用して２つの受容体のコード配列が分離されているトリシストロン性カセットを生成することができる；（ｂ）以下の３つの異なる形式を組みわせたＯＲゲート：ＣＤ１９についてはｓｃＦｖ－ＣＡＲ、ＣＤ２２についてはＦａｂ ＣＡＲ、およびＣＤ７９についてはｄＡｂ ＣＡＲ。

９Ａ８抗原結合ドメインを有するＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞および３Ｂ４抗原結合ドメインを有するＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞による標的細胞殺滅を比較したＦＡＣＳベースの殺滅アッセイの結果を示すグラフ。

９Ａ８抗原結合ドメインを有するＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞および３Ｂ４抗原結合ドメインを有するＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞を比較したＳｕｐＴ１標的細胞との７２時間の共培養後のＩＬ－２放出を示すグラフ。

種々の抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞による標的細胞殺滅を比較したＦＡＣＳベースの殺滅アッセイの結果を示すグラフ。標的細胞は、非形質導入ＳｕｐＴ１細胞（Ａ）；または以下の３つのＣＤ２２発現レベルのうちの１つを示すＣＤ２２を発現するように形質導入されたＳｕｐＴ１細胞のいずれかであった： Ｂ－フローサイトメトリーによって検出不可能な「超低レベル」 Ｃ－細胞あたり平均２５５コピーのＣＤ２２を発現する「低レベル」 Ｄ－細胞あたり平均７８，９１６コピーのＣＤ２２を発現する「高レベル」 種々の抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲを発現するＴ細胞による標的細胞殺滅を比較したＦＡＣＳベースの殺滅アッセイの結果を示すグラフ。標的細胞は、非形質導入ＳｕｐＴ１細胞（Ａ）；または以下の３つのＣＤ２２発現レベルのうちの１つを示すＣＤ２２を発現するように形質導入されたＳｕｐＴ１細胞のいずれかであった： Ｂ－フローサイトメトリーによって検出不可能な「超低レベル」 Ｃ－細胞あたり平均２５５コピーのＣＤ２２を発現する「低レベル」 Ｄ－細胞あたり平均７８，９１６コピーのＣＤ２２を発現する「高レベル」

２つのＦａｂＣＡＲを発現するときに交差対合する問題を示す概要図。

ＦａｂＣＡＲ間の交差対合を回避するための「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」および「Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ」を示す概要図。

本発明者らは、ｓｃＦｖ結合ドメインと対照的にＦａｂ結合ドメインを有するＣＡＲを使用して、嵩高い抗原のＣＡＲ媒介標的化および嵩高い標的抗原を発現する標的細胞のＣＡＲ媒介殺滅の効率を改善することが可能であることを見出した。

したがって、第１の態様では、本発明は、嵩高い細胞外ドメインを有する標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

標的抗原は、少なくとも約１５０Åの細胞外ドメインを有し得る。

標的抗原が、少なくとも約４００個のアミノ酸の細胞外ドメインを有し得る。

標的抗原は、以下の群から選択され得る：ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ１、またはＦｃＲＬ５。特に、標的抗原はＣＤ２２であり得る。

抗原結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗原結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

ＣＡＲは、配列番号６５として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６として示した配列を有するＶＬドメインを含み得る。

ＣＡＲは、配列番号９９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１００として示した配列を有するＶＬドメインを含み得る。

第２の態様では、本発明の第１の態様のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。

核酸配列は、以下の一般構造：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＬ
を有し得、
ここで、
ＶＨは、第１のポリペプチドの重鎖可変ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＨは、前記第１のポリペプチドの重鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、前記第１のポリペプチドのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、前記第１のポリペプチドの膜貫通領域をコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、前記第１のポリペプチドのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＶＬは、第２のポリペプチドの軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＬは、前記第２のポリペプチドの軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、前記第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列である。

第３の態様では、本発明の第２の態様の第１の核酸配列、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。

特に、本発明の第２の態様の第１の核酸配列；ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列；およびｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第３のＣＡＲをコードする第３の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。

第１の核酸配列は、抗ＣＤ２２ Ｆａｂ ＣＡＲをコードすることができ；第２の核酸配列は抗ＣＤ７９ ｄＡｂ ＣＡＲをコードすることができ；第３の核酸配列は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲをコードすることができる。

第４の態様では、本発明の第２の態様の核酸配列または本発明の第３の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。

第５の態様では、本発明の第２の態様のＣＡＲを発現する細胞を提供する。

特に、本発明の第１の態様の第１のＣＡＲ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。

特に、本発明の第１の態様の第１のＣＡＲ；ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインを有する第２のＣＡＲ；およびｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する第３のＣＡＲを発現する細胞を提供する。

第１のＣＡＲは抗ＣＤ２２ Ｆａｂ ＣＡＲであり得；第２のＣＡＲは抗ＣＤ７９ ｄＡｂ ＣＡＲであり得；第３のＣＡＲは抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲであり得る。

第６の態様では、本発明の第５の態様の細胞を作製する方法であって、本発明の第２の態様の核酸配列；本発明の第３の態様の核酸構築物；または本発明の第４の態様のベクターを細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入するステップを含む、方法を提供する。

第７の態様では、本発明の第５の態様の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物を提供する。

第８の態様では、本発明の第７の態様の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。

がんは、例えば、Ｂ細胞リンパ腫または白血病であり得る。

第９の態様では、がんの処置で使用するための本発明の第７の態様の医薬組成物を提供する。

第１０の態様では、がんを処置するための医薬組成物の製造における本発明の第５の態様の細胞の使用を提供する。

本発明は、嵩高い細胞外ドメインを有する抗原を標的にするときにＣＡＲ媒介シグナル伝達および標的細胞殺滅が改善されるキメラ抗原受容体を提供する。かかる抗原は、最適以下のＴ細胞：標的細胞シナプスを形成するので、古典的ＣＡＲを用いて標的にすることが困難である。

かかる抗原を標的にすることができると、がん処置の全く新しい可能性が広がる。多くの潜在的に有用ながん標的抗原は、嵩高い細胞外ドメイン、例えば、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ１、またはＦｃＲＬ５を有する。本発明は、これらの抗原を標的にするための改良された構築物を提供し、前記構築物は、これらの標的を単一の標的として使用することができ、重要には、ＣＡＲ－Ｔ細胞の効率および安全性を高めるために複数の抗原を標的にするためのストラテジーに含めることができる。
キメラ抗原受容体

本発明は、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体に関する。

古典的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラタイプＩ膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくことができる。スペーサードメインは、通常、バインダーを膜から分離し、適切な配向を可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じて、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみですら十分な場合がある。膜貫通ドメインは、細胞膜内にタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果的に、これらの第１世代の受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞による殺滅を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を、それが増殖および生存するように十分に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合により、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは最も効力のある共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす免疫学的シグナル２）を供給する。いくつかの受容体も記載されており、この受容体には、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなど）が含まれる。活性化、増殖、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより効力のある第３世代のＣＡＲをここに記載している。

ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。

したがって、ＣＡＲは、典型的には、以下を含む：（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むか、それと会合している細胞内ドメイン。
ＣＡＲは、以下の一般構造を有し得る：

抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
抗原結合ドメイン

抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の一部である。古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む（図６ｃを参照のこと）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはＶＨＨ抗原結合ドメインを有するＣＡＲも産生されている（図６ｂを参照のこと）。

本発明のキメラ抗原受容体では、抗原結合は、例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ断片を含む（図６ａを参照のこと）。ＦａｂＣＡＲは、以下の２つの鎖を含む：抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する鎖；および重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する鎖。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＬとＣＨとの間の会合により、受容体が組み立てられる。

Ｆａｂ ＣＡＲの２本の鎖は、以下の一般構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ－ＣＬ
または
ＶＬ－ＣＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ－ＣＨ

本明細書中に記載のＦａｂ型キメラ受容体について、抗原結合ドメインは、一方のポリペプチド鎖由来のＶＨおよび他方のポリペプチド鎖由来のＶＬで構成されている。

ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインとＣＨ／ＣＬドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、可動性を示し、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的に分離するのに役立ち得る。

可動性リンカーは、グリシン、トレオニン、およびセリンなどの小型で非極性の残基から構成され得る。リンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎリンカー（式中、ｎは反復数である）などの１またはそれより多くのグリシン－セリンリンカーの反復を含み得る。各リンカーは、５０、４０、３０、２０、または１０アミノ酸長未満であり得る。
定常領域ドメイン

ヒトには以下の２つのタイプの軽鎖が存在する：カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖。ラムダクラスは、以下の４つのサブタイプを有する：λ_１、λ_２、λ_３、およびλ_４。Ｆａｂ型キメラ受容体の軽鎖定常領域は、これらの軽鎖タイプのいずれかに由来し得る。

本発明のキメラ受容体の軽鎖定常ドメインは、カッパ鎖定常ドメインである配列番号１として示した配列を有し得る。
配列番号１

哺乳動物免疫グロブリン重鎖には以下の５つのタイプが存在する：γ、δ、α、μ、およびε（それぞれ、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥクラスを定義する）。重鎖γ、δ、およびαは、３つのタンデムＩｇドメインから構成される定常ドメインを有し、可動性を付与するヒンジを有する。重鎖μおよびεは、４つのドメインから構成される。

本発明のＦａｂ型キメラ受容体のＣＨドメインは、γ免疫グロブリン重鎖に由来する配列番号２として示した配列を含み得る。
配列番号２

スペーサー

古典的ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、かつ抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含む。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを異なる方向に配向させて結合を容易にすることが可能である。

ＦａｂＣＡＲ（図６Ａ）では、古典的キメラ抗原受容体（図６Ｃ）およびｄＡｂ ＣＡＲ（図６Ｂ）において見られるように、スペーサーにより２本のポリペプチド鎖を二量体化させることができる。２本のポリペプチド鎖は、例えば、ジスルフィド架橋（複数可）を形成するのに適切な１またはそれより多くのシステイン残基を含み得る。ＩｇＧ１由来のヒンジは、これに関して適切である。ＩｇＧ１ヒンジに基づいたスペーサーは、配列番号３として示した配列を有し得る。
配列番号３（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：

あるいは、ヒンジスペーサーは、配列番号４として示した配列を有し得る。
配列番号４（ヒンジスペーサー）

本発明のＦａｂＣＡＲでは、図６Ａに示すように、二量体ＦａｂＣＡＲの２つのポリペプチド（ｐｏｙｐｅｐｔｉｄｅ）は同一である。これらのポリペプチドは、同一の抗体に由来する同一の抗原結合ドメインを有し、同一の標的抗原上の同一のエピトープに結合する。二量体内の第１および第２のポリペプチドは、同一の転写物からコードされたポリペプチドの単純な複製である。
膜貫通ドメイン

膜貫通ドメインは、膜を横切るキメラ受容体の一部である。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを、キメラ受容体の膜貫通部分を供給するために使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの配列および全長を、当業者がＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を使用して決定することができる。あるいは、人為的にデザインされたＴＭドメインを使用しても良い。
エンドドメイン

エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。エンドドメインは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、前記細胞内ドメインに会合し得る。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されているエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。共刺激シグナルは、Ｔ細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには以下の２つの主なタイプが存在する：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）およびＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲなど）。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、増殖／生存シグナルを伝達させるためにＣＤ３－ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。

エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン（ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＩＣＯＳ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＧＩＴＲなど）。

抗原認識部分がシグナル伝達部分由来の個別の分子上に存在するいくつかの系が記載されている（ＷＯ０１５／１５０７７１号；ＷＯ２０１６／１２４９３０号、およびＷＯ２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含むことができ、この成分は、シグナル伝達ドメインを含む個別の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することが可能である。本発明のベクターは、かかる抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。

キメラ受容体はシグナルペプチドを含み得るため、シグナルペプチドが細胞の内側で発現されるときに、新生タンパク質は小胞体、その後に細胞表面に向かい、そこで発現される。シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。
標的抗原

「標的抗原」は、本発明のキメラ受容体の抗原結合ドメインによって特異的に認識および結合される実体である。

標的抗原は、がん細胞上に存在する抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。

標的抗原は、比較的長く、および／または嵩高い細胞外ドメインを有し得る。ＣＤ４５の細胞外ドメインのサイズは２１６Åである。典型的に使用されるスペーサーに応じて、古典的ＣＡＲの抗原結合ドメインは、２５～７５Åの範囲であり、そのようなものとして、１５０Åを超える抗原は、シナプス形成が不十分なために標的にするのが困難であり、それにより、前記シナプス内にホスファターゼが存在することになる。

標的抗原は、約１５０Åを超える細胞外ドメインを有し得、例えば、標的抗原は、サイズが１５０～４００Å、２００～３５０Å、または２５０～３１０Åである細胞外ドメインを有し得る。

標的抗原の細胞外ドメインの分子サイズとアミノ酸長との間には相関関係がある。小型の細胞外ドメインを有する抗原（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９）および嵩高い細胞外ドメインを有する抗原（ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２２）の両方についての細胞外ドメインのサイズとアミノ酸数の例を、以下の表に示す。

標的抗原は、約４００アミノ酸長を超える細胞外ドメインを有し得、例えば、標的抗原は、サイズが４００～１０００、５００～９００、６００～８００、または６００～７００アミノ酸長である細胞外ドメインを有し得る。

ＣＤ２２の細胞外ドメインは、その細胞外ドメイン中に７つのＩｇＧ様ドメインを有する。本発明のキメラ受容体の標的抗原は、少なくとも４、５、６、または７つのＩｇ様ドメインに等しい長さであり得る。ＣＤ２１の細胞外ドメインは、各々が約６０アミノ酸の２１個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を有する。本発明のキメラ受容体の標的抗原は、少なくとも１５、１７、１９または２１個のＣＳＲに等しい長さであり得る。

標的抗原は、Ｔ細胞：標的細胞シナプスでＴ細胞と標的細胞との間に最適な細胞内距離より長い細胞外ドメインを有し得る。標的細胞は、少なくとも４０、５０、６０、または７０ｎＭである細胞外ドメインを有し得る。

標的抗原は、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ１、またはＦＣＲＬ５であり得る。
ＣＤ２２

ＣＤ２２は、７つの細胞外ＩｇＧ様ドメインを有し、これらは、一般にＩｇドメイン１～Ｉｇドメイン７として同定され、Ｉｇドメイン７は、Ｂ細胞膜に最も近位にあり、Ｉｇドメイン１はＩｇ細胞膜から最も遠位にある。

ＣＤ２２のアミノ酸配列に関するＩｇドメインの位置（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２０２７３）を、以下の表にまとめている：

ｍ９７１、ＨＡ２２、およびＢＬ２２ ｓｃＦｖに由来する抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲの例は、Ｈａｓｏら．（Ｂｌｏｏｄ；２０１３；１２１（７））に記載されている。抗体ＨＡ２２およびＢＬ２２は、ＣＤ２２のＩｇドメイン５上のエピトープに結合する。

他の抗ＣＤ２２抗体（マウス抗ヒトＣＤ２２抗体１Ｄ９－３、３Ｂ４－１３、７Ｇ６－６、６Ｃ４－６、４Ｄ９－１２、５Ｈ４－９、１０Ｃ１－Ｄ９、１５Ｇ７－２、２Ｂ１２－８、２Ｃ４－４、および３Ｅ１０－７；およびヒト化抗ヒトＣＤ２２抗体ＬＴ２２およびイノツズマブ（Ｇ５＿４４）など）が公知である。表１は、各抗体についてのＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲ配列（太字で下線）、およびＣＤ２２上の標的エピトープの位置をまとめている。
表１

ＣＤ２２に結合するＦａｂＣＡＲの抗原結合ドメインは、表１に列挙したＣＤ２２抗体のいずれかに由来するＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、または少なくとも７０、８０、９０、もしくは９０％配列同一性を有し、ＣＤ２２への結合能を保持するそのバリアントを含み得る。
ＣＤ２１

ＣＲ２としても公知のＣＤ２１は、補体系に関与する成熟Ｂ細胞および濾胞樹状細胞上で発現するタンパク質である。成熟Ｂ細胞上で、ＣＤ２１は、ＣＤ１９およびＣＤ８１とＢ細胞共受容体複合体を形成する。膜ＩｇＭが抗原に結合するとき、ＣＤ２１は結合したＣ３ｄを介して抗原に結合する。

成熟ＣＤ２１は、膜貫通領域および細胞質領域に加えて、各々が約６０アミノ酸の２１個のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含む１，４０８アミノ酸である。

市販のＣＤ２１に対するモノクローナル抗体（ＭＡＢ４９０９（ＭＤＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびにＥＰ３０９３、ＳＰ１８６、Ｂｕ３２、ＳＰ１９９、１Ｆ８、およびＬＴ２１（Ａｂｃａｍ）など）が公知である。
ＣＥＡＣＡＭ５

癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリー（細胞接着に関与する非常に関連のある一連の糖タンパク質）のメンバーである。ＣＥＡＣＡＭ５は、胎児発生中に胃腸組織で産生されるが、いくつかのがん（肺がん、膵臓がん、子宮頸部がん、および消化管がんが含まれる）によっても発現される。

ＣＥＡＣＡＭ５は、６４２個のアミノ酸から構成され、およそ７０ｋＤａの分子質量を有し、２８個の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を有する。このタンパク質は、Ｉｇ可変領域（ＩｇＶ）様ドメイン（Ｎと命名）、その後に６個のＩｇ定常領域（ＩｇＣ）－タイプ２様ドメイン（Ａ１、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２、Ａ３、およびＢ３と命名）を含む。

市販のＣＥＡＣＡＭ５に対するモノクローナル抗体（ＥＰＲ２０７２１（Ａｂｃａｍ）など）が公知である。
ＭＵＣ１

ムチン１またはＭＵＣ１は、その細胞外ドメインが重度にＯ結合型グリコシル化された糖タンパク質である。ムチンは、肺、胃、小腸、眼、およびいくつかの他の臓器内の上皮細胞の頂端表面を裏打ちしている。ムチンは、細胞外ドメイン内のオリゴサッカリドに結合する病原体による感染から身体を防御し、それにより、病原体が細胞表面に到達するのを防止する。ＭＵＣ１の過剰発現は、しばしば、結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、および膵臓がんに関連する。

ＭＵＣ１は、分子量が１２０～２２５ｋＤａのコアタンパク質を有し、グリコシル化により２５０～５００ｋＤａに増加する。ＭＵＣ１は、細胞表面上の２００～５００ｎｍを被覆している。細胞外ドメインは、２０アミノ酸の高変異反復配列（ＶＮＴＲ）ドメインを含み、反復数は、個体によって２０から１２０まで変動する。最も頻度の高い対立遺伝子は、４１反復および８５反復を含む。これらの反復は、重度のｏ－グリコシル化が可能なセリン、トレオニン、およびプロリン残基が豊富である。

市販のＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体（ＥＰＲ１２０３、ＥＰ１０２４Ｙ、ＨＭＦＧ１、ＮＣＲＣ４８、ＳＭ３、ＭＨ１、および１１５Ｄ８（Ａｂｃａｍ）など）が公知である。
ＦＣＲＬ５

Ｆｃ受容体様タンパク質５（ＦＣＲＬ５）は、免疫グロブリン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｆｃ受容体様ファミリーＦＣＲＬ５は、１回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、８個の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインを含む。成熟タンパク質は、１０６ｋＤａである。

ＦＣＲＬ５は、２個の抑制性ＩＴＩＭリン酸化シグナル伝達モチーフを有する細胞質側末端を有する。ＦＣＲＬ５は、Ｂ細胞抗原受容体の共刺激の際にＳＨＰ１を動員することによってＢ細胞抗原受容体シグナル伝達を抑制し、それにより、カルシウム流入およびタンパク質チロシンリン酸化を減弱する。ＦＣＲＬ５およびＢ細胞抗原受容体を共刺激すると、ナイーブＢ細胞の増殖および分化が促進される。ＦＣＲＬ５は、成熟Ｂ細胞上および形質細胞上の両方に発現され、ＥＢＶタンパク質によって誘導される。ＦＣＲＬ５は、毛様細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫の患者の悪性Ｂ細胞上に過剰発現される。

市販のＦＣＲＬ５に対するモノクローナル抗体（ＣＤ３０７ｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＲＥＡ３９１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）など）が公知である。

本発明者らはまた、４つの新規の抗ＦＣＲＬ５抗体を生成し、そのＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲ配列を、表２にまとめている。ＣＤＲ配列は、太字で下線を引いている。
表２

ＯＲゲート
本発明のＣＡＲを、１またはそれより多くの他の賦活性または抑制性のキメラ抗原受容体と組み合わせて使用してよい。例えば、本発明のＣＡＲを、「論理ゲート」において１またはそれより多くのＣＡＲと組み合わせて使用してよく、ＣＡＲ組み合わせは、Ｔ細胞などの細胞によって発現されるとき、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができる。少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示される場合、３つの可能な選択肢は以下の通りである：
「ＯＲゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤゲート」－Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤ ＮＯＴゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａが単独で標的細胞上に存在する場合に引き起こすが、Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合に引き起こさない

これらのＣＡＲ組み合わせを発現する操作されたＴ細胞を、２またはそれより多くのマーカーのがん細胞の特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整することができる。

かかる「論理ゲート」は、例えば、ＷＯ２０１５／０７５４６９号、ＷＯ２０１５／０７５４７０号、およびＷＯ２０１５／０７５４７０号に記載されている。

「ＯＲゲート」は、標的細胞によって発現された個別の標的抗原にそれぞれ指向する２つまたはそれより多くの賦活ＣＡＲを含む。ＯＲゲートの利点は、有効性が抗原Ａ＋抗原Ｂとなるので、標的細胞上の有効に標的可能な抗原が増加することである。単一抗原のレベルが、ＣＡＲ－Ｔ細胞が有効に標的にするのに必要な閾値未満であり得るので、このことは標的細胞上に変動するか低い密度で発現される抗原に特に重要である。また、ＯＲゲートは、抗原回避現象が避けられる。例えば、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９が標的にされた後にＣＤ１９陰性になる：この現象が起こる場合、別の抗原と組み合わせてＣＤ１９を標的にするＯＲゲートを使用すると「バックアップ」抗原が得られる。

本発明のＦａｂＣＡＲは、ＯＲゲートにおいて、標的細胞によって発現される第２の標的抗原に対する第２のＣＡＲと組み合わせて使用され得る。

抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲについて、ＯＲゲートは、Ｂ細胞内に発現する第２の抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ７９など）に対するＣＡＲを含み得る。

第２のＣＡＲは、任意の適切な抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、またはＦａｂに基づいた結合ドメイン）を有し得る。

第２のＣＡＲは、膜貫通ドメインから抗原結合ドメインを立体的に分離し、可動性を付与するスペーサーを含み得る。種々の配列がＣＡＲのスペーサーとして一般に使用されている（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ（上記）、またはヒトＣＤ８ストーク）。スペーサーは、例えば、ＷＯ２０１６／１５１３１５号に記載のコイルドコイルドメインを含み得る。

第２のＣＡＲは、活性化エンドドメインを含む。第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含み得る。第２のＣＡＲは、１またはそれより多くの上記の共刺激ドメインを含み得る。例えば、第２のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、または４－１ＢＢ由来のエンドドメインを含み得る。

本発明のＦａｂＣＡＲは、標的細胞によって発現される第２の抗原に対する第２のＣＡＲおよび第３の抗原に対する第３のＣＡＲを含むトリプルＯＲゲートで使用され得る。

抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲについて、トリプルＯＲゲートは、Ｂ細胞内で発現される第２および第３の抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ７９など）に対するＣＡＲを含み得る。

特に、本発明は、以下を含むトリプルＯＲゲートを提供する：
（ｉ）抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ；
（ｉｉ）抗ＣＤ７９ ｄＡｂ ＣＡＲ）；および
（ｉｉｉ）抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ（図７ｂを参照のこと）。
デュアルＣＡＲ

本発明のＯＲゲートは、２つ（またはそれを超える）Ｆａｂ ＣＡＲを含み得る。

２つのＦａｂ ＣＡＲの発現に関連する問題は、非機能性ＣＡＲが作製される交差対合事象または誤対合事象である（図１１）。これを回避するために、図１２に模式的に示すように、「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」形式および／または「Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ」形式が使用され得る。

「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」は、一方の分子中で可変軽鎖（ＶＬ）が重鎖定常ドメイン（ＣＨ）に接続され；他方の分子中で可変重鎖（ＶＨ）が軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に接続されるように鎖間のＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを切り換えることを含む（図１２、Ｃｒｏｓｓｍａｂ１および２）。

ｃｒｏｓｓｍａｂ形式のＦａｂＣＡＲをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＨまたは
ＶＬ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＨ－ＣＬ
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。

「Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ」は、別の組み合わせを回避するために変異が導入されている。例えば、嵩高い側鎖を有するアミノ酸を、１本の鎖（例えば、ＣＬ）中へと操作して突起を生じさせることができ、正確に対合するドメイン（例えば、ＣＨ）を突起に適応するように操作することができる。あるいは、またはさらに、帯電した側鎖を１本の鎖中へと操作し（例えば、正に荷電したアミノ酸を有するように操作されたＶＨ）、正確に対合するドメイン（例えば、ＶＬ）を、負に荷電したアミノ酸を有するように操作することができる。

本発明のデュアルＦａｂＣＡＲは、野生型Ｆａｂ ＣＡＲ形式の配列番号６９～７４として示したＣＤＲを有するＣＤ１９ Ｆａｂ ＣＡＲ；およびｏｒｔｈｏＦａｂ形式またはｃｒｏｓｓｍａｂ１ Ｆａｂ ＣＡＲ形式の配列番号９３～９８として示したＣＤＲを有するＣＤ２２ Ｆａｂ ＣＡＲを含み得る。
ＣＤ７９バインダー

用語「ＣＤ７９」または「表面抗原分類７９」は、Ｂ細胞表面に存在するタンパク質を指し、このタンパク質は、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成し、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子スーパーファミリーのメンバーである２つの膜貫通タンパク質ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂを包含する。膜貫通ＣＤ７９ａタンパク質およびＣＤ７９ｂタンパク質は、５つの異なるタイプの膜貫通Ｉｇ分子（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ）（２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖から構成されるジスルフィド結合タンパク質である）のうちのいずれか１つと細胞外末端でカップリングする。Ｂ細胞表面上でのＣＤ７９と免疫グロブリンのこの組み合わせにより、Ｂ細胞シグナル伝達受容体（ＢＣＲ）が形成される。ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂの細胞質内ドメインは、抗原誘導ＢＣＲ凝集の際にＢ細胞に活性化シグナルを伝達する免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。

ＣＤ７９発現は、プレＢ細胞および成熟Ｂ細胞（形質細胞を除く）に制限される。ＣＤ７９はまた、Ｂ細胞由来悪性疾患の大部分で発現される。この発現パターンの狭さは、正常組織への標的化を最小限にしたがん標的療法有望な目標となる。

用語「ＣＤ７９ａ」または「ＣＤ７９Ａ」は、Ｉｇ－アルファとしても公知のＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖、ＭＢ－１膜糖タンパク質、膜結合型免疫グロブリン関連タンパク質、および表面ＩｇＭ関連タンパク質を指す。ＣＤ７９ａのヒトイソ型は、２０１８年４月２０日付のＵｎｉｐｒｏｔデータベース中のアクセッション番号Ｐ１１９１２．１（イソ型１または長鎖）およびＰ１１９１２．２（イソ型２または短鎖）に示されている。

用語「ＣＤ７９ｂ」または「ＣＤ７９Ｂ」は、Ｉｇ－ベータとしても公知のＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質ベータ鎖、Ｂ細胞特異的糖タンパク質Ｂ２９、および免疫グロブリン関連Ｂ２９タンパク質を指す。ＣＤ７９ｂのヒトイソ型は、２０１８年４月２０日付のＵｎｉｐｒｏｔデータベース中のアクセッション番号Ｐ４０２５９－１（イソ型長鎖）、Ｐ４０２５９－２（イソ型短鎖）、およびＰ４０２５９－３（イソ型３）に示されている。

活性化Ｂリンパ球は、短鎖または短縮されたＣＤ７９イソ型が増量している。特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ７９ａに特異的に結合するＣＡＲに関する。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、非スプライシング部分またはＣＤ７９ａエクトドメイン（すなわち、配列番号６７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１９１２．１）として以下に示したＣＤ７９ａイソ型１の残基３３～１４３）に結合する。別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合するＣＡＲに関する。別の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、非スプライシング部分またはＣＤ７９ｂエクトドメイン（すなわち、配列番号６８（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４０２５９－１）として以下に示したＣＤ７９ｂイソ型長鎖の残基２９～１５９）に結合する。
ＣＤ７９ａイソ型１－配列番号６７

ＣＤ７９ｂイソ型２－配列番号６８

本発明は、ＣＤ７９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＯＲゲートを提供する。

ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａに特異的に結合し得る。例えば、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａエクトドメインの非スプライシング部分（配列番号６７の残基３３～１４３）に結合し得る。

ＣＡＲは、ＣＤ７９Ｂに特異的に結合し得る。例えば、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ｂエクトドメインの非スプライシング部分（配列番号６８の残基２９～１５９）に結合し得る。

多数の抗ＣＤ７９抗体が当該分野で公知である（例えば、ＪＣＢ１１７、ＳＮ８、ＣＢ３．１、および２Ｆ２（ポラツズマブ））。

ＣＤ７９結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号１１－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号１２－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号１３（マウス抗カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ７９ｂ １０Ｄ１０ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号２０－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号２１－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号２２（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ－ｖ１７ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号２４－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号２１－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号２５（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ ｖ１８ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号２４－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号２７－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号２８（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ ｖ２８ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号２４－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号３０－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号３１（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ ｖ３２ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号３２－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号３３－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号３４（マウス抗ＣＤ７９ｂ ＳＮ８ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号２４－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号２７－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号２８（ヒト化抗ＣＤ７９ｂ ２Ｆ２ ｓｃＦｖ）

あるいは、抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号３６－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号３７－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ７９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号３８（マウス抗ＣＤ７９ａ ｓｃＦｖ）

ＣＤ７９結合活性に負の影響を及ぼすことなく各ＣＤＲに１またはそれより多くの変異（置換、付加、または欠失）を導入することが可能な場合がある。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸変異を有し得る。
ＣＤ１９バインダー

いくつかの抗ＣＤ１９抗体が、ＣＡＲ形式で以前に記載されている（ｆｍｃ６３、４Ｇ７、ＳＪ２５Ｃ１、ＣＡＴ１９（ＷＯ２０１６／１３９４８７号に記載）およびＣＤ１９ＡＬＡｂ（ＷＯ２０１６／１０２９６５号に記載）など）。

本発明のダブルまたはトリプルＯＲゲートで用いるための抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、抗原結合ドメイン（これらの抗ＣＤ１９抗体のうちの１つに由来するｓｃＦｖ型抗原結合ドメインなど）を含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

ＣＤ１９結合活性に負の影響を及ぼすことなく各ＣＤＲに１またはそれより多くの変異（置換、付加、または欠失）を導入することが可能な場合がある。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸変異を有し得る。

ＣＤＲは、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドが接続された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形式であり得る。ｓｃＦｖの配向はＶＨ－ＶＬであり得る（すなわち、ＶＨがＣＡＲ分子のアミノ末端側にあり、ＶＬドメインがスペーサーに連結しており、それに膜貫通ドメインおよびエンドドメインが続く）。

ＣＤＲは、ヒト抗体またはｓｃＦｖのフレームワーク上にグラフトされ得る。例えば、本発明のＣＡＲは、以下の配列のうちの１つからなるか、以下の配列のうちの１つを含むＣＤ１９結合ドメインを含み得る。

抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号７５－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列

抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号７６－マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列

抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号７７－マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖ配列

あるいは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

ＣＤ１９結合活性に負の影響を及ぼすことなく各ＣＤＲに１またはそれより多くの変異（置換、付加、または欠失）を導入することが可能な場合がある。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸変異を有し得る。

本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含み得る：
配列番号８４（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列）

配列番号８５（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列－重鎖１９、カッパ１６）

配列番号８６（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列－重鎖１９、カッパ７）

ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬの配向（配列番号８４、８５、および８６に示す）またはＶＬ－ＶＨの配向であり得る。

本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列のうちの１つを含み得る：
配列番号８７（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

配列番号８８（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る：
配列番号８９（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列）

配列番号９０（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列、カッパ１６）

配列番号９１（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列、カッパ７）

ＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号８４～９１として示した配列のバリアントを含み得るが、但し、（適切な場合に相補的なＶＬまたはＶＨドメインと併せたときに）前記バリアントの配列がＣＤ１９に結合する能力を保持していることを条件とする。

２つのポリペプチド配列の間の同一率は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。
核酸構築物

本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードする核酸構築物を提供する。

ＦａｂＣＡＲをコードする核酸構築物（図６Ａ）は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＬまたは
ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ－ｅｎｄｏ－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＨ－ＣＨ
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。

上記の両構造について、２つのポリペプチドをコードする核酸配列は、構築物中でいずれかの順序であり得る。

２つまたはそれより多くの（two of more）ＣＡＲを含み、そのうちの少なくとも１つ
が本発明のＦａｂＣＡＲであるＯＲゲートをコードする核酸構築物も提供する。

ダブルＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＬ－ＣＬ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；または
ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＨ－ＣＨ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２
ここで、
ＶＨは、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同一でも異なっていてもよく、第１のＣＡＲ；ならびに第１および第２のＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列であり；
ＶＬは、第１のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、第１のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤは、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。

上記の両方の構造物について、第１のＣＡＲの２つのポリペプチドをコードする核酸配列；第１および第２のＣＡＲをコードする核酸配列は、構築物内に任意の順序で存在し得る。

３つのＣＡＲを含み、そのうちの１つが本発明のＦａｂＣＡＲであるトリプルＯＲゲートをコードする核酸構築物も提供する。

トリプルＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＬ－ＣＬ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ２－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ３－ＡｇＢＤ３－ｓｐａｃｅｒ３－ＴＭ３－ｅｎｄｏ３；または
ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＨ－ＣＨ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ２－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ３－ＡｇＢＤ３－ｓｐａｃｅｒ３－ＴＭ３
ここで、
ＶＨは、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２、およびｃｏｅｘｐｒ３は、同一でも異なっていてもよく、第１のＣＡＲ；ならびに第１、第２、および第３のＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列であり；
ＶＬは、第１のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、第１のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤ３は、第３のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ３は、第３のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ３は、第３のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ３は、第３のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。

第２および第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。特に、一方のＣＡＲはｄＡｂ抗原結合ドメインを有し得、他方はｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有し得る。

特に、構築物は、図７ａに示す通りであり得る。構築物は、図７ｂに示すように３つのＣＡＲ（すなわち、ＣＤ２２に対するＦａｂＣＡＲ；ＣＤ７９に対するｄＡｂ ＣＡＲ、およびＣＤ１９に対するｓｃＦＶ ＣＡＲ）をコードし得る。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。

当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることを理解する。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。

本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性を強化し、寿命を延ばすために実施され得る。

ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」は、前記配列からか、前記配列への、１（またはそれより多くの）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加を含む。

上記の構造物では、「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として２つのポリペプチドの共発現が可能な核酸配列である。ｃｏｅｘｐｒは、核酸構築物が切断部位（複数可）によって連結した両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性を必要とすることなく個別のペプチドに直ちに切断されるように、切断部位は自己切断され得る。

切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。

用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。

切断部位は、例えば、フューリン切断部位、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、自己切断ペプチドをコードし得る。

「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」かまたは分離されるように機能するペプチドを指す。

自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。

「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐおよび細菌配列内の反復配列で見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））。

切断部位は、配列番号９２として示した２Ａ様配列（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）を含み得る。
ベクター

本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードする１またはそれより多くの核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、宿主細胞が本発明の第１の態様のキメラポリペプチドを発現するように宿主細胞内に核酸配列（複数可）を導入するために使用され得る。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。
細胞

本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。細胞は、２つまたはそれより多くのＣＡＲを含み得る（例えば、細胞は、上記のダブルゲートまたはトリプルゲートを含み得る。

細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。

細胞は、細胞溶解性免疫細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）であり得る。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１つの型である。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など）と区別することができる。以下にまとめているように、種々のタイプのＴ細胞が存在する。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫学的過程（Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化が含まれる）において他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されたときに活性化されるようになる。これらの細胞は、異なるタイプの免疫応答を容易にするために異なるサイトカインを分泌するいくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨ）のうちの１つに分化することができる。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ－１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。

メモリーＴ細胞は、感染から回復した後に長期間にわたって維持される抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、その同族抗原への再曝露の際に迅速に多数のエフェクターＴ細胞へと拡大増殖する（expand）ため、免疫系に過去の感染を「記憶」させている。メモリーＴ細胞は、以下の３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前は抑制性Ｔ細胞として公知であった制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。その主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫を停止させること、および胸腺内でのネガティブ選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス（内在性Ｔｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞）が記載されている。

内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺内で生じ、発生中のＴ細胞の、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との相互作用に関与している。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子を変異させると制御性Ｔ細胞の発生が阻止され、致死性自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答中に生じ得る。

細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を成し得る。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの内生シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。

ＮＫ細胞（先天性リンパ球系細胞群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ球系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に入ることが公知である。

本発明の細胞は、上記の細胞型のうちのいずれかであり得る。

本発明の第１の態様のＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植においてｅｘ ｖｉｖｏで作り出すことができる。

あるいは、本発明の第１の態様のＴ細胞またはＮＫ細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持し、かつ治療に役立つもの（therapeutic）として作用することができる不死化
Ｔ細胞株が使用され得る。

これらの全ての実施形態では、キメラポリペプチド発現細胞は、多数の手段（ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションが含まれる）のうちの１つによってキメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。

本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ ｖｉｖｏでのＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様のキメラポリペプチドが得られる分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって活性化および／または拡大増殖され得る。

本発明のＴまたはＮＫ細胞は、以下によって作製され得る：
（ｉ）上記列挙の被験体または他の供給源からのＴまたはＮＫ細胞を含む試料の単離；および
（ｉｉ）キメラポリペプチドをコードする１またはそれより多くの核酸配列でのＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション。

次いで、ＴまたはＮＫ細胞は、精製され得る（例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る）。
医薬組成物

本発明はまた、複数の本発明による細胞を含む医薬組成物に関する。

医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
処置方法

本発明は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防する方法を提供する。

疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、もしくは改善し、および／または疾患の進行を遅延、軽減、もしく遮断するために、疾患または状態を既に有する被験体に細胞を投与することができる。

疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中では、未だ罹患しておらず、および／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するためにかかる細胞を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。

本方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞を含む試料を単離するステップ；
（ｉｉ）かかる細胞を、本発明によって提供された核酸配列またはベクターで形質導入するかトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。

Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む試料は、例えば上記の被験体または他の供給源から単離され得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植において単離され得る。

本発明は、疾患の処置および／または予防で用いるための本発明のキメラポリペプチド発現細胞を提供する。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明のキメラポリペプチド発現細胞の使用に関する。

本発明の方法によって処置および／または予防されるべき疾患は、がん性疾患（膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞がん）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんなど）であり得る。

疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、神経芽細胞腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり得る。

本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることが可能であり得る。標的細胞は、標的細胞付近の腫瘍分泌性のリガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴付けられ得る。標的細胞は、標的細胞表面に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と共に可溶性リガンドが存在することによって特徴付けられ得る。

本発明の細胞および医薬組成物は、上記の疾患の処置および／または防止で使用されるためのものであり得る。
さらなる態様

本発明はまた、９Ａ８－１と名付けられた新規のＣＤ２２結合抗体を提供する。９Ａ８のＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲの配列は、上記の表１に示している。

この抗体は、ＣＡＲにおいて特に良好な有効性を示す。例えば、以下の実施例３に示すように、ＦａｂＣＡＲ形式の９Ａ８－１は、代替のＣＤ２２バインダー３Ｂ４を有する等価なＣＡＲより標的細胞殺滅およびサイトカイン放出の改善を示した。

本発明はまた、以下の番号をつけたパラグラフにまとめた態様を提供する。

１．以下を含む抗原結合ドメイン：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

２．配列番号６５として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６６として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフ１に記載の抗原結合ドメイン。

３．パラグラフ１または２に記載の抗原結合ドメインを含む抗体。

４．パラグラフ３に記載の抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。

５．パラグラフ１または２に記載の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

６．ＦａｂＣＡＲである、パラグラフ５に記載のＣＡＲ。

７．ｓｃＦｖ ＣＡＲである、パラグラフ５に記載のＣＡＲ。

８．パラグラフ１または２に記載の抗原結合ドメイン、およびパラグラフ３に記載の抗体、パラグラフ４に記載のＡＤＣもしくはＢｉＴＥ、またはパラグラフ５～７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。

９．パラグラフ５～７のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、ＧＣ含量が少なくとも６０％である、請求項８に記載の核酸配列。

１０．パラグラフ５～７のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、ＧＣ含量が約６４％である、請求項８に記載の核酸配列。

１１．伸長因子－１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターを含む、請求項８～１０のいずれかに記載の核酸配列。

１２．パラグラフ５～７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする請求項８～１１のいずれかに記載の第１の核酸配列および抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む、核酸構築物。

１３．抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインが以下のを含む、請求項１２に記載の核酸構築物：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

１４．抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７５に示したＶＨドメインおよび配列番号７６に示したＶＬドメインを含む、請求項１３に記載の核酸構築物。

１５．抗ＣＤ２２ ＣＡＲがＦａｂ形式である請求項１２～１４のいずれかに記載の核酸構築物であって、以下の一般構造を有する、核酸構築物：
ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＬ－ＣＬ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；
ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＨ－ＣＨ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；
ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ２－ＶＬ－ＣＬ；
ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ２－ＶＨ－ＣＨ
ＶＬ－ＣＬ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；
ＶＨ－ＣＨ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ２－ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；
ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ＶＬ－ＣＬ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＶＨ－ＣＨ－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１；または
ＡｇＢＤ－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ１－ＶＨ－ＣＨ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＶＬ－ＣＬ－ｓｐａｃｅｒ－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１
ここで、
ＶＨは、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同一でも異なっていてもよく、第１のＣＡＲ；および第２のＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列であり；
ＶＬは、第１のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、第１のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤは、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。

１６．抗ＣＤ２２ ＣＡＲがＳｃＦｖ形式である請求項１２～１４のいずれかに記載の核酸構築物であって、以下の一般構造を有する、核酸構築物：
ＡｇＢＤ１－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢＤ２－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２；または
ＡｇＢＤ２－ｓｐａｃｅｒ２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢＤ１－ｓｐａｃｅｒ１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１
ここで、
ＡｇＢＤ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のＣＡＲの共発現が可能な核酸配列であり；
ＡｇＢＤ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。

１７．パラグラフ８～１１のいずれかに記載の核酸配列またはパラグラフ１２～１６のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター

１８．パラグラフ１２～１６のいずれかに定義の第１の核酸配列を含む第１のベクター；およびパラグラフ１２～１６のいずれかに定義の第２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、ベクターのキット。

１９．レトロウイルスベクター（複数可）である、パラグラフ１７または１８に記載のベクターまたはベクターのキット。

２０．レンチウイルスベクター（複数可）である、パラグラフ１７または１８に記載のベクターまたはベクターのキット。

２１．パラグラフ５～７のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。

２２．パラグラフ５～７のいずれかに記載の第１のＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲである第２のＣＡＲを共発現する細胞。

２３．抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインが以下を含む、請求項２２に記載の細胞：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

２４．抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７５に示したＶＨドメインおよび配列番号７６に示したＶＬドメインを含む、パラグラフ２３に記載の細胞。

２５．パラグラフ８～１１のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列；パラグラフ１２～１６のいずれかに記載の核酸構築物またはパラグラフ１７～２０のいずれかに記載のベクターもしくはベクターのキットを細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入するステップを含む、パラグラフ２１～２４のいずれかに記載の細胞を作製する方法。

２６．パラグラフ２１～２４のいずれかに記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。

２７．パラグラフ２６に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

２８．がんがＢ細胞白血病またはリンパ腫である、パラグラフ２７に記載の方法。

２９．がんの処置で使用するためのパラグラフ２１～２４のいずれかに記載の細胞。

３０．がんを処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフ２１～２４のいずれかに記載の細胞の使用。

例えば、キメラ抗原受容体、核酸配列および構築物、ベクター、細胞、医薬組成物、ならびに前節に記載の細胞を作製および使用する方法の一般的な特徴も、上記パラグラフ中に記載の対応する構成要素に適用する。

本発明はまた、１Ｇ３－４と名付けられた新規のＣＤ２２結合抗体を提供する。１Ｇ３－４のＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲの配列は、上記の表１に示している。

この抗体は、ＣＡＲにおいて特に良好な有効性を示す。例えば、以下の実施例３に示すように、ＦａｂＣＡＲ形式の９Ａ８－１は、代替のＣＤ２２バインダー３Ｂ４を有する等価なＣＡＲより標的細胞殺滅およびサイトカイン放出の改善が示された。

本発明はまた、以下の番号をつけたパラグラフにまとめた態様を提供する。

Ａ１．以下を含む抗原結合ドメイン：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

Ａ２．配列番号９９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１００として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフＡ１に記載の抗原結合ドメイン。

Ａ３．パラグラフＡ１またはＡ２に記載の抗原結合ドメインを含む抗体。

Ａ４．パラグラフＡ３に記載の抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。

Ａ５．パラグラフＡ１またはＡ２に記載の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

Ａ６．ＦａｂＣＡＲである、パラグラフＡ５に記載のＣＡＲ。

Ａ７．パラグラフＡ１またはＡ２に記載の抗原結合ドメイン、およびパラグラフＡ３に記載の抗体、パラグラフＡ４に記載のＡＤＣもしくはＢｉＴＥ、またはパラグラフＡ５もしくはＡ６に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。

Ａ８．パラグラフＡ７に記載の核酸配列を含むベクター。

Ａ９．パラグラフＡ５またはＡ６に記載のＣＡＲを発現する細胞。

Ａ１０．パラグラフＡ７に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入するステップを含む、パラグラフＡ９に記載の細胞を作製する方法。

Ａ１１．パラグラフＡ９に記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。

Ａ１２．パラグラフＡ１１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

Ａ１３．がんがＢ細胞白血病またはリンパ腫である、パラグラフＡ１２に記載の方法。

Ａ１４．がんの処置で使用するためのパラグラフＡ９に記載の細胞。

Ａ１５．がんを処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＡ９に記載の細胞の使用。

Ｂ１．以下を含む抗原結合ドメイン：
ａｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

または
ａｉｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂｉｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

または
ａｉｉｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：

および
ｂｉｉｉ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：

。

Ｂ２．ｉ）配列番号１０７として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１０８として示した配列を有するＶＬドメイン；またはｉｉ）配列番号１０９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１１０として示した配列を有するＶＬドメイン；またはｉｉｉ）配列番号１１１として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１１２として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフ１に記載の抗原結合ドメイン。

Ｂ３．パラグラフＢ１またはＢ２に記載の抗原結合ドメインを含む抗体。

Ｂ４．パラグラフＢ３に記載の抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。

Ｂ５．パラグラフＢ１またはＢ２に記載の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

Ｂ６．ＦａｂＣＡＲである、パラグラフＢ５に記載のＣＡＲ。

Ｂ７．パラグラフＢ１またはＢ２に記載の抗原結合ドメイン、およびパラグラフＢ３に記載の抗体、パラグラフＢ４に記載のＡＤＣもしくはＢｉＴＥ、またはパラグラフＢ５もしくはＢ６に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。

Ｂ８．パラグラフＢ７に記載の核酸配列を含むベクター。

Ｂ９．パラグラフＢ５またはＢ６に記載のＣＡＲを発現する細胞。

Ｂ１０．パラグラフＢ７に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入するステップを含む、パラグラフＢ９に記載の細胞を作製する方法。

Ｂ１１．パラグラフＢ９に記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。

Ｂ１２．パラグラフＢ１１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

Ｂ１３．がんがＢ細胞白血病またはリンパ腫である、パラグラフＢ１２に記載の方法。

Ｂ１４．がんの処置で使用するためのパラグラフＢ９に記載の細胞。

Ｂ１５．がんを処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフＢ９に記載の細胞の使用。

例えば、キメラ抗原受容体、核酸配列および構築物、ベクター、細胞、医薬組成物、ならびに前節に記載の細胞を作製および使用する方法の一般的な特徴も、上記パラグラフ中に記載の対応する構成要素に適用する。

本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

嵩高い細胞外ドメイン（ＣＤ２２）を有する抗原を発現する標的細胞に対する同一の抗体に基づいて、ＦａｂＣＡＲの作用をｓｃＦｖ ＣＡＲと比較するための一連の実験を行った。２つのタイプのＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を、細胞の傷害性および増殖に関して比較した。
実施例１－ＦＡＣｓに基づく殺滅（ＦＢＫ）

ＣＡＲパネルを以下にまとめているように作製し、その細胞傷害能を、ＣＤ２２発現標的細胞と比較した。
ＮＴ：非形質導入
１０Ｃ１－Ｄ９ Ｆａｂ：１０Ｃ１ｍＡｂに基づいたＦａｂＣＡＲ

全てのＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む第２世代のエンドドメインを有していた。

Ｔ細胞を、ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と１：１の比で共培養した。ウェルあたり５×１０^４個の形質導入されたＴ細胞および等数の標的細胞を使用して、総体積が０．２ｍｌの９６ウェルプレート中でアッセイを行った。形質導入効率について正規化した後に共培養を設定した。インキュベーションから２４時間後にＦＢＫを行った。

ＦＢＫの結果を図４に示す。試験した両方のＣＤ２２バインダー：１０Ｃ１および１Ｄ９－３について、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、標的細胞殺滅に関して、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する等価なＣＡＲより優れていた。
実施例２－増殖アッセイ（ＰＡ）

増殖を測定するために、実施例１に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞の同一のパネルを、色素Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（細胞内で加水分解されて保持される蛍光色素）で標識した。ＣＴＶは４０５ｎｍ（紫色）レーザーによって励起され、蛍光をパシフィックブルーチャネルで検出することができる。ＣＴＶ色素を、ＤＭＳＯで５ｍＭに再構成した。Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で２×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁し、１ｕｌ／ｍｌのＣＴＶを添加した。Ｔ細胞を、ＣＴＶと３７℃で２０分間インキュベートした。その後に、細胞を５Ｖの完全培地を添加してクエンチした。５分間のインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、２ｍｌの完全培地に再懸濁した。室温でさらに１０分間インキュベートすると酢酸加水分解が生じ、色素が保持された。

標識したＴ細胞を、Ｒａｊｉ標的細胞と４日間共培養した。ウェルあたり５×１０^４個の形質導入されたＴ細胞および等数の標的細胞（比１：１）を使用して、総体積が０．２ｍｌの９６ウェルプレート中でアッセイを行った。その日の４つの時点で、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞が分裂するにつれて生じるＣＴＶの希釈を測定した。共培養終了時のＴ細胞の存在数を計算し、Ｔ細胞の投入数と比較した増殖を倍数として表した。

図５は、試験した両方のＣＤ２２バインダー：１０Ｃ１および１Ｄ９－３について、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現するＴ細胞がｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する等価なＣＡＲよりも多く増殖したことを示す。両ＦａｂＣＡＲ構築物の曲線下面積は、等価なｓｃＦｖＣＡＲ構築物と比較してＸ軸にそってさらにシフトした。

実施例３－ＦａｂＣＡＲ形式の抗ＣＤ２２抗体９Ａ８－１の有効性の調査。

ＣＡＲパネルを以下にまとめているように作製し、その細胞傷害能を、ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と比較した。
ＮＴ：非形質導入
３Ｂ４：３Ｂ４ｍＡｂに基づいたＦａｂＣＡＲ
９Ａ８：９Ａ８－１ｍＡｂに基づいたＦａｂＣＡＲ

全てのＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む第２世代のエンドドメインを有していた。

最初に、ＣＡＲを発現するＴ細胞が標的細胞を死滅させる能力を調査した。Ｔ細胞を、ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。ＦＡＣＳベースの殺滅アッセイを、下記のように７２時間のインキュベーション後に行った。

ＦＢＫの結果を図８に示す。９Ａ８抗原結合ドメイン有するＣＡＲは、標的細胞殺滅に関して、３Ｂ４抗原結合ドメインを有する等価なＣＡＲより優れていた。

次に、サイトカイン放出に関して２つのＣＡＲを比較した。ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と７２時間共培養した後、ＩＬ－２発現を、下記のようにＥＬＩＳＡによって調査した。結果を図９に示す。驚いたことに、ＩＬ－２放出レベルは、３Ｂ４抗原結合ドメインを有する等価なＣＡＲより９Ａ８抗原結合ドメインを有するＣＡＲで高かった。

実施例４－ＦａｂＣＡＲ形式の抗ＣＤ２２抗体１ｇ３－４の有効性の調査。
ＣＡＲパネルを以下にまとめているように作製した：
ＮＴ：非形質導入
Ｆｍｃ６３：抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（負の対照）
１０Ｃ１：１０Ｃ１ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
３Ｂ４：３Ｂ４ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
７Ｇ６：７Ｇ６ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
９Ｆ８－２：９Ｆ８－２ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
９Ａ８－１：９Ａ８－１ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
１Ｇ３－４：１Ｇ３－４ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ
９Ｆ９－６：９Ｆ９－６ｍＡｂに基づいた抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲ

全てのＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む第２世代のエンドドメインを有していた。

ＣＡＲを発現するＴ細胞がＳｕｐＴ１標的細胞を死滅させる能力を調査した。ＳｕｐＴ１細胞を、形質導入しないままにするか（図１０、パネルＡ）、ＣＤ２２を発現するように形質導入した。形質導入された標的細胞を、以下の３つの集団に分別した：ＣＤ２２発現レベルがフローサイトメトリーによって検出不可能な集団（図１０、パネルＢ）；細胞あたり平均２５５コピーのＣＤ２２発現レベルが低い集団（図１０、パネルＣ）；および細胞あたり平均７８，９１６コピーのＣＤ２２発現レベルが高い集団（図１０、パネルＤ）。

Ｔ細胞を、ＣＤ２２発現ＳｕｐＴ１標的細胞と１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。ＦＡＣＳベースの殺滅アッセイを、下記のように７２時間のインキュベーション後に行った。

ＦＢＫの結果を図１０に示す。全ての抗ＣＤ２２ ＦａｂＣＡＲは、高レベルの標的抗原を発現する標的細胞を有効に死滅させた（図１０Ｄ）。しかし、９Ａ８抗原結合ドメインまたは１Ｇ３－４抗原結合ドメインを有するＦａｂ ＣＡＲは、標的抗原発現が超低レベルですら標的細胞を死滅させた（パネルＢ）。
形質導入

Ｇｅｎｅ Ｊｕｉｃｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２９３Ｔ細胞をＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミド、およびＣＡＲＴ細胞プラスミドで一過性にトランスフェクトすることによってレトロウイルスを生成し、ウイルス上清を４８時間および７２時間で回収した。Ｔ細胞を、ＴＣ処理したＴ１７５フラスコ中で０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用して刺激し、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２中で保持した。ＴＣ未処理の６ウェルプレートを、製造者の指示（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）に従ってＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし、４℃で２４時間インキュベーション後、Ｔ細胞を形質導入した。３ｍｌのウイルス上清をプレーティング後に１ｍｌの活性化Ｔ細胞（濃度１×１０^６細胞／ｍｌ）を添加し、次いで、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加し、１０００×ｇにて室温で４０分間遠心分離し、３７℃および５％ＣＯ_２で２～３日間インキュベートした。
ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の枯渇

ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ５６ポジティブ選択キットを使用して、ＣＤ５６枯渇（ＳＴＥＭＣＥＬＬ １８０５５）を行った。
細胞傷害性アッセイ

細胞傷害性を測定するために、ＣＡＲＴ細胞を、ＴＣ処理９６ウェルプレート中にてＳｕｐＴ１－ＮＴおよびＳｕｐＴ１ ＣＤ２２とエフェクター：標的比４：１（２００，０００：５０，０００細胞）と共培養した。７２時間後にエフェクターＴ細胞と標的細胞を識別するための抗ｈＣＤ３４－ＡＰＣ（ＦＡＢ７２２７Ａ）、抗ＣＤ２－ＦＩＴＣ、および抗ＣＤ３－ＰｅＣｙ７（３００４１９）での染色によって読み取り、７－ＡＡＤ細胞生存率色素（cell viability dye）（４２０４０３）を使用して死細胞を排除し、リン酸緩衝食塩水（１００１００２３）をインキュベーションの間に使用して細胞を洗浄した。細胞傷害性を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ１０フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して読み取った。
サイトカイン放出

ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を、４：１のＥ：Ｔ比での７２時間後の共培養物から上清を回収し、－２０℃での凍結後にＥＬＩＳＡによって分析することによって測定した。ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔｓ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４３０１０６）およびＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ
Ｓｅｔｓ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４３１８０６）を製造者のプロトコールにしたがって使用して、サイトカイン分析を行った。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＥＬＩＳＡシグナルを測定した。

本出願は、２０１８年５月１５日出願の英国特許出願第１８０７８６６．７号および２０１８年６月１４日出願の英国特許出願第１８０９７７３．３号の利益を主張する。上記の両出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。

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