JP2023077143A - 細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を定量する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を容易に定量する方法を提供する。
【解決手段】細胞培地がグルコースおよびグルコースの分析に影響を及ぼす成分（ＨＥＰＥＳ）を含んでいて、細胞培地のラマンスペクトルを取得する。グルコースのための所定の波数、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示す検量線、他の波形と重ならず孤立して現れるＨＥＰＥＳに特有の波数におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示す検量線、および１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示す検量線を作成し、細胞培地の１１２０ｃｍ^-1におけるスペクトル強度およびＨＥＰＥＳに特有の波数におけるスペクトル強度と前記検量線より、細胞培地中のグルコースの濃度を算出する方法である。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を定量する方法に関する。

水溶液中に存在する、グルコース、乳酸、アンモニウムなどの測定には、一般的に液体クロマトグラフィーや、イオンクロマトグラフィー、測定専用キットなどが使われている。測定対象物によっては、複数の装置を組み合わせて測定することもある。細胞培地のような、高濃度のマトリックス下（高濃度ナトリウム、塩素など）にグルコース、乳酸、アンモニウムなどが存在した場合、一般的な分析手段として、液体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィーなどによる分離分析が行われる。

一方、一般的なラマン分光分析における、得られた測定スペクトルの処理は、得られたスペクトルをデータベースと照合し、物質の定性および同定を行っている。物質が特定でき、標準物質が入手可能であれば、さらに１成分のみの濃度を定量する場合がほとんどである。

ここで、標準物質のスペクトルは、物質の生産メーカ、公的機関、データベース販売会社から提供されている。標準物質のスペクトルは、物質の特徴を表すスペクトルのパターンをデータベース化したものであり、物質１つ１つの単独なデータとなっている。複数のマトリックスが混在したデータベースは無く、ユーザーは、得られたスペクトルデータから、波形の四則演算や差分スペクトルを求める作業を手動で行い、複合しているスペクトルより、それぞれの物質に分けて定性同定を行うことになる。

特許文献１には、ラマンスペクトルを利用した血液中の成分を分析する場合に好適な成分分析装置が記載されている。特許文献２には、ラマンスペクトルを利用した血液や間質液に含まれる成分を分析する場合に好適な分析装置が記載されている。

特許第６８２６４６３号明細書 特許第６８４２３２２号明細書

ラマン分光分析において、測定されたスペクトルは、被測定物の組成（分子結合状態、付加された官能基）により、複数のスペクトルが発現するため、すぐにどんな物質なのか判断することは難しい。特に、ラマン分光分析は、液体クロマトグラフィーのような、被測定物を分離する機能は無く、物質の分子構造、付与されている官能基からデータベースと照合し、定性、同定を行うので、重なり合うスペクトルが発現してしまうと、定性－同定はもとより、濃度演算することは難しくなってしまう恐れがある。

特に液体クロマトグラフィーでは、例えば被測定物の濃度に対し混在する測定対象ではない物質が１０倍以上存在すると、測定対象物質がカラムの選択性を変化させて分離に影響を与える恐れがある。陽イオン分析を例にすると、高濃度ナトリウム（例えば７ｇ／ｌ）中に微量（例えば０．１７ｇ／ｌ）の測定成分が存在した場合、カラムによる濃縮分析となる。しかし、測定成分を濃縮するはずがナトリウムも濃縮されるため、ナトリウムによりカラムの交換容量を超えてしまい、測定成分をトラップできない恐れがある。

本発明は、細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を容易に定量することを目的とする。

本発明に係る一実施形態の方法は、
細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を定量する方法であって、
細胞培地がグルコースおよびグルコースの分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
前記グルコース由来のグルコースのスペクトル強度分および前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分由来のグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記グルコースのための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分に特有の波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記細胞培地中の前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
前記所定の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、定量された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記所定波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
前記所定の波数における前記スペクトル強度と算出された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分を算出し、
前記所定の波数におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース検量線を用いて、算出された前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分から、前記細胞培地中のグルコースの濃度を定量することを含み、
前記グルコースのための前記所定の波数が、１１２０ｃｍ^-1である、方法である。

本発明によれば、得られたラマンスペクトルデータから細胞培地のグルコースの濃度を容易に定量することができる。

図１は、本実施形態の方法に用いられる分析装置を備えた分析機構の構成の一例を示す概念図である。 図２は、本実施形態の方法に用いられる分析装置の構成の一例を示す概念図である。 図３は、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度の関係を示す検量線である。 図４は、１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度の関係を示す検量線である。 図５は、１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度の関係を示す検量線である。 図６は、グルコースについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（StemFit）と血ガス計の比較結果である。 図７は、グルコースについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（Essential8）と血ガス計の比較結果である。 図８は、グルコースについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（CHOM）と血ガス計の比較結果である。 図９は、グルコースについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（REGM）と血ガス計の比較結果である。 図１０は、グルコースについて異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化と血ガス計の結果を比較した図である。 図１１は、１０８４ｃｍ^-1における乳酸の濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図１２は、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図１３は、乳酸についてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（StemFit）と血ガス計の比較結果である。 図１４は、乳酸についてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（Essential8）と血ガス計の比較結果である。 図１５は、乳酸についてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（CHOM）と血ガス計の比較結果である。 図１６は、乳酸についてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（REGM）と血ガス計の比較結果である。 図１７は、乳酸について異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化とイオンクロマトの結果を比較した図である。 図１８は、１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウムの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図１９は、１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２０は、１４３６ｃｍ^-1における乳酸の濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２１は、８５２ｃｍ^-1における乳酸の濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２２は、１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２３は、９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２４は、１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２５は、１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミンの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２６は、１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２７は、１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２８は、１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッドの濃度およびスペクトル強度の関係を示す検量線である。 図２９は、アンモニウムについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（StemFit）とAmmonia Assay Kitとの比較結果である。 図３０は、アンモニウムについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（Essential8）とAmmonia Assay Kitとの比較結果である。 図３１は、アンモニウムについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（CHOM）とAmmonia Assay Kitとの比較結果である。 図３２は、アンモニウムについてラマン分光計測による経時変化を示した細胞培地測定結果（REGM）とAmmonia Assay Kitとの比較結果である。 図３３は、アンモニウムについて異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化とイオンクロマトの結果を比較した図である。

以下、本発明を実施するための実施形態の例を添付図面を参照して説明する。以下に例示する実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。以下に例示する実施形態は、本発明の趣旨を逸脱することなく、適宜変更および改良することができる。

＜分析機構＞
図１は、本実施形態の方法に用いられる分析装置２６を備えた分析機構１０の構成の一例を示す概念図である。分析機構１０は、励起光の照射によってサンプル１６で生じるラマン散乱光のスペクトルを分析する機構である。分析機構１０は、光源１２、リフレクタ１４、サンプル１６、光学系１８、モノクロメーター２０、および分析装置２６を主な構成要素として備える。

光源１２は、サンプル１６に照射するための励起光を発するものである。この励起光の波長は短いほどラマン散乱の効率が高くなり空間分解能も高くなることから、光源１２として固体レーザーが好ましい。なお、ラマン散乱光のスペクトルでは、励起光の波数に対するラマン散乱光の波数の差（ラマンシフト量）が示される。そのため、励起光の波長は単一の波長であることが好ましい。励起光の波長の具体例としては、例えば、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍ、６７０ｎｍ、７８５ｎｍのなかから選択される単一の波長とすることが好ましい。

リフレクタ１４は、光源１２から発せられる励起光を反射させ、サンプル１６に導く。なお、光源１２から発せられる励起光をサンプル１６に導く限り、リフレクタ１４に代えてまたは加えて、他の部材を採用してもよい。

サンプル１６は、細胞培地と、細胞培地を収容する容器（不図示）とから構成されている。細胞培地を収容する容器は、不活性なプラスチック素材で出来ているタテ長の内容量２５～５０ｍｌの密閉ができる構造となっている。使用する測定セルは、合成石英ガラス製の容量１～１０ｍｌの角形縦長の容器形状を呈している。このような測定セルにサンプル１６を入れて測定する方法の他に、流通式測定セルを使ったサンプル１６を流しながら行う、フローセル測定方法もある。化学的に不活性な無機材料、プラスチック素材あるいは合成樹脂の他、酸アルカリに対し、耐腐食性に優れる金属でできた筐体を容器として用いてもよい。容器は、サンプル１６の出入口を備えた構造であって、ラマン散乱光を透過させる方式として、ラマン散乱光を入射する光学窓と、サンプル１６を通過したラマン散乱光を受光する光学窓を備えた構造や、ラマン散乱光を入射、受光を１つの光学系素子で行うことのできる反射型の方式による構造を有しているものを採用できる。容器は、これらの方式に限ることなく、サンプル１６の出入と、ラマン散乱光の入射、サンプル１６へ照射、照射後のラマン散乱光の受光を備えた構造を呈していれば、より好ましい。

＜細胞培地＞
細胞培地は、通常、無機物、アミノ酸、ｐＨ指示薬、ｐＨ緩衝剤、栄養源（炭素源、ミネラル源、窒素源の３種類に大別される）から構成されているがこれに限定されない。細胞培地は、その目的により成分濃度は異なっていてもよい。ラマン分光分析において、基本的に無機物の吸収はほとんど認められず、有機物に限って吸収を表す。

＜代謝産生＞
細胞が増殖を始めると、栄養源であるグルコースなどを消費し、細胞内にて産生された乳酸、アンモニウムは低分子であるため、細胞膜を通過、細胞外に放出され、細胞培地中に蓄積する。乳酸、アンモニウムなどの老廃物の蓄積は、細胞培地のｐＨの低下、細胞毒性を引き起こし、細胞の成長を妨げるため、乳酸、アンモニウムの濃度の監視が必要とされる。

＜細胞培地模擬液＞
細胞培地模擬液は、ｐＨ指示薬、ｐＨ緩衝剤、グルコース、乳酸などを混合したものとすることができる。細胞培地模擬液において、典型的にはｐＨ指示薬とｐＨ緩衝剤が配合されている。細胞培地模擬液は、経時変化を示さないため、検量線の作成に用いるのが好ましい。

＜ｐＨ指示薬＞
ｐＨ指示薬は、透明な培養容器で細胞培養を行う場合、内容物のｐＨを目視で瞬時に判断するためのものである。ｐＨ指示薬として本願ではフェノールレッドが用いられる。細胞培地にｐＨ指示薬としてフェノールレッドが含まれている場合、これは透明な培養容器で細胞培養を行う際に内容物のｐＨを目視で瞬時に判断するために用いられる。フェノールレッドは、監視するｐＨが６～８のため特に好ましい。

＜ｐＨ緩衝剤＞
ｐＨ緩衝剤は、細胞培養時に上昇してくる、乳酸による急激な変化を抑制するためのものである。ｐＨ緩衝剤として本願ではＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）が用いられる。ＨＥＰＥＳは、細胞培養時、培養細胞が好気性呼吸によって生成される二酸化炭素濃度の変化を吸収して生理学的ｐＨを維持することが優れているため特に好ましい。またりん酸生食緩衝剤は、生体内で普遍的に見出されるイオンで構成されるため無毒であり特に好ましい。

ラマン分光装置でサンプル１６を測定する前に、純水にてバックグラウンド補正を行うことが好ましい。不純物の少ない純水、精製水（蒸留水をイオン交換樹脂で精製）を用いることが望ましい。なお、バックグラウンド測定は、以後のサンプル１６の測定の健全性に大きく影響を及ぼすため、バックグラウンド測定・補正後、さらに純水の測定を行い、ベースラインができるだけ平坦化されるまで繰り返すことが好ましい。さらに、細胞培地に含まれる特定することが難しい不明のピークが存在する場合、乳酸やグルコースの主ピークの近傍に出現する場合も想定して、純水によるバックグラウンド補正のほかに、細胞培養前（培養０日目）の細胞培地を測定し、取得したスペクトルを使って、バックグラウンド補正することが好ましい。

高濃度のマトリックス成分が存在している場合、周囲温度の変動が少ない環境が望ましい。なお、ここでの周囲温度は、例えば２０～３０℃の範囲で、ごく短時間での変動は±５℃以内である。

光学系１８は、サンプル１６で生じるラマン散乱光をモノクロメーター２０に導くものである。サンプル１６に励起光が照射された場合、励起光とサンプル１６との相互作用により、サンプル１６では励起光の波長と異なる波長のラマン散乱光が生じるとともに、励起光の波長と同じ波長のレイリー散乱光が生じる。分析機構１０は、このレイリー散乱光を除去する光学系１８を導波路上に有しており、光学系１８を介して得られるラマン散乱光をモノクロメーター２０に導くようになっている。

モノクロメーター２０は、回折格子２２およびＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）検出器２４を備えている。回折格子２２は、サンプル１６から光学系１８を介して供給される励起光を波長ごとに分け、ＣＣＤ検出器２４の受光面に導く。ＣＣＤ検出器２４は、１次元または２次元に配置される複数の受光素子を受光面内に有する。このＣＣＤ検出器２４は、受光面内の受光素子に露光される各波長のラマン散乱光の強さに比例した電荷を蓄え、ラマン散乱光における波長ごとの強度分布を示すラマンスペクトルのデータを分析装置２６に出力する。ＣＣＤ検出器２４に代えて、フォトダイオード、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）などを用いた検出器を用いることができる。

＜分析装置＞
分析装置２６は、モノクロメーター２０のＣＣＤ検出器２４から与えられるデータに基づいて、サンプル１６の細胞培地に含まれる成分を検出し、検出した成分の濃度を求めるようになっている。また分析装置２６は、サンプル１６が有していた成分の種類や濃度などを必要に応じて通知するようになっている。

図２は、本実施形態の方法に用いられる分析装置２６の構成の一例を示す概念図である。分析装置２６は、入力部３０、記憶部３２、制御部３４、および表示部３６を主要な構成要素として備えている。

入力部３０は、ユーザーの操作に応じた命令や設定値などの各種の情報を入力可能な部分である。入力部３０の具体例としては、マウス、キーボード、タッチパネル、可搬型の半導体コネクタ型のメモリ、ネットワーク通信や、シリアル通信を経由して情報を授受する通信インターフェイスなどが挙げられる。半導体コネクタ型メモリとしては、ＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）メモリやＣＦ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｆｌａｓｈ）メモリなどが挙げられる。

記憶部３２は、入力部３０または制御部３４から与えられるデータを記憶し、記憶したデータを読み出す部分である。記憶部３２の具体例としては、半導体メモリ、磁気ディスク、光ディスクなどが挙げられる。

記憶部３２には、各種のプログラムを格納する第１格納領域（不図示）と、入力部３０から入力される設定データなどの各種のデータを格納する第２格納領域（不図示）と、プログラムおよびデータを展開する展開領域（不図示）とが含まれる。第１格納領域には、サンプル１６の細胞培地を分析する処理を実行するための分析プログラムが記憶されている。記憶部３２に記憶されている具体的な内容は後に詳述する。

制御部３４は、記憶部３２の第１格納領域に記憶されたプログラムおよび記憶部３２の第２格納領域に記憶されたデータに基づいて、分析装置２６を制御するようになっている。

制御部３４は、記憶部３２の第１格納領域に記憶された分析プログラムを読み出した場合、その読み出した分析プログラムを記憶部３２の展開領域に展開する。この場合、制御部３４は、取得部４０、抽出部４２、成分識別部４４、算出部４６、および通知部４８として機能し、細胞培地を分析する処理を実行する。

表示部３６は、制御部３４から与えられるデータに示される情報を表示する部分である。表示部３６の具体例としては、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＥＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ディスプレイなどが挙げられる。

取得部４０は、所望の成分を含む細胞培地である試料に単一波長の励起光が照射されることで生じるラマン散乱光の波数ごとの強度分布を示すラマンスペクトルを取得する。具体的には、取得部４０は、光源１２から発すべき励起光の強度などを適宜調整して光源１２を駆動し、光源１２、リフレクタ１４、サンプル１６、および光学系１８を順次介してモノクロメーター２０のＣＣＤ検出器２４から出力されたラマンスペクトルのデータを取得する。

本実施形態においては、取得部４０は、細胞培地が対象となる成分および分析に影響を及ぼす成分を含んでいてこの細胞培地のラマンスペクトルを取得する。分析対象となる成分は、グルコース、乳酸、アンモニウムである。

細胞培養を維持するのに必要なグルコース濃度を調整するためにグルコースの濃度を測定することが好ましい。ここで、乳酸、アンモニウムは、細胞に対し毒性を引き起こし、細胞の成長を妨げる成分として代謝産生されてくる。このような乳酸、アンモニウムなどの濃度を監視し除去するなどの操作を行い、適切な細胞培地の状態を持続させるために、乳酸、アンモニウムの測定を行うことが好ましい。

対象となる成分がグルコースの場合、影響を及ぼす成分は、ｐＨ緩衝剤であるＨＥＰＥＳであることが好ましい。ＨＥＰＥＳは、グルコースのための所定の波数である１１２０ｃｍ^-1にスペクトル強度が現れること、１１２０ｃｍ^-1においてＨＥＰＥＳのラマンスペクトルの強度と濃度との間に線形性があること、１１２０ｃｍ^-1において他に重なるスペクトル成分がないこと、のため好ましい。

対象となる成分が乳酸の場合、影響を及ぼす成分はグルコースであることが好ましい。グルコースは、乳酸のための所定の波数である１０８４ｃｍ^-1にスペクトル強度が現れること、１０８４ｃｍ^-1においてグルコースのラマンスペクトルの強度と濃度との間に線形性があること、１０８４ｃｍ^-1において他に重なるスペクトル成分がないこと、のため好ましい。

対象となる成分がアンモニウムの場合、影響を及ぼす成分はグルコース、乳酸、アセトアルデヒド、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドの少なくとも１つであることが好ましい。これらの影響を及ぼす成分は、アンモニウムのための所定の波数である１４３６ｃｍ^-1にスペクトル強度が現れること、１４３６ｃｍ^-1においてこれらの影響を及ぼす成分のラマンスペクトルの強度と濃度との間に線形性があること、１４３６ｃｍ^-1において他に重なるスペクトル成分がないこと、のため好ましい。

抽出部４２は、取得部４０で取得されたラマンスペクトルの波長をラマンシフト量に換算して、スペクトル強度を抽出する。具体的には、ラマンスペクトルにおける各波長は、単位の長さに含まれる波の数である波数に変換され、変換された各波数は、光源１２から発せられる励起光の波数との差であるラマンシフト量に変換されて、変換された各波数は、光源１２から発する励起光の波数との差であるラマンシフト量に変換される。この結果、例えば縦軸をスペクトル強度とし横軸を波数とするラマンスペクトルとなる。なお、物質はその分子構造や結晶構造に応じた特有の振動エネルギーを持つことが知られており、ラマン散乱光の波数（振動数）と入射光の波数（振動数）の差であるラマンシフト量は物質の分子構造や結晶構造を反映した特有の波形となる。

成分識別部４４は、抽出部４２で換算されたラマンスペクトルと、細胞培地の成分に応じてラマンスペクトルに出現するピークの特有の波数とに基づいて、細胞培地の成分を探索して識別する。

算出部４６は、成分識別部４４によって検出されたピークのスペクトル強度に基づいて、ピークに対応する成分の濃度を定量する。すなわち、算出部４６は、成分識別部４４によって検出されたピークに対応する成分および波数についての検量線を第２格納領域から読み出し、検量線を用いて、検出されたピークのスペクトル強度から、そのピークに対応する成分の濃度（ｍｇ／ｄｌ）を求める。算出部の成分ごとの具体的な作用については後述する。

成分識別部４４は、第２格納領域から読み出したある成分の所定の波数およびある成分に特有の波数を認識し、その波数を基準として±６ｃｍ^-1の範囲内にピークがあるか否かを探索する。この場合、上記所定の波数および特有の波数を基準とする±６ｃｍ^-1の範囲内にピークが１つでも検出された場合、当該ピークに対応する成分が細胞培地中に含まれていることを意味する。なお、本願においては、記載の簡略化および分かり易さのために所定の波数および特有の波数としてある値の波数のみが示されているが、本発明における所定の波数および特有の波数は±６ｃｍ^-1の幅を含むことを意味するものとする。例えば、「８５２ｃｍ^-1」は８５２±６ｃｍ^-1を意味し、「９２８ｃｍ^-1」は９２８±６ｃｍ^-1を意味し、「１０３８ｃｍ^-1」は１０３８±６ｃｍ^-1を意味し、「１０８４ｃｍ^-1」は１０８４±６ｃｍ^-1を意味し、「１１２０ｃｍ^-1」は１１２０±６ｃｍ^-1を意味し、「１１４０ｃｍ^-1」は１１４０±６ｃｍ^-1を意味し、「１１６２ｃｍ^-1」は１１６２±６ｃｍ^-1を意味し、「１４３６ｃｍ^-1」は１４３６±６ｃｍ^-1を意味する。

通知部４８は、成分識別部４４によって検出可能な細胞培地成分の種類と、当該種類のうち成分識別部４４によって検出され算出部４６によって定量された細胞培地の成分の濃度とを通知する。例えば、細胞培地の成分の種類と算出部４６によって定量された細胞培地の成分の濃度とが所定の表示形式で表示部３６の表示画面に表示される。なお、表示部３６に表示させることに代えてまたは加えて、細胞培地の成分の種類と算出部４６によって定量された細胞培地の成分の濃度とがスピーカから音声出力されても良い。

このような取得部４０、抽出部４２、成分識別部４４、算出部４６、および通知部４８により制御部３４が機能し、細胞培地の成分を分析する処理が実行される。

ラマン分光分析においては、サンプル１６を前処理することなく、直接容器にサンプル１６を入れて測定することができる。測定は一斉分析とすることができ、この場合は溶液中に吸収を示すものはスペクトルとして発現してくる。あらかじめ溶液の組成が判明している細胞培地においては、高濃度のマトリックスで吸収スペクトルとして検出されるもの、されないものを把握しておくことが好ましい。ｐＨ指示薬としてフェノールレッド、ｐＨ緩衝剤としてＨＥＰＥＳおよびりん酸生食緩衝剤が添加されていることが多い。これらは使い始めと培養終了後に濃度の変化しないものとして取り扱うことができるので、最初にこれらの濃度を求めておくことが好ましい。

なお、通常、ラマン分光装置で測定を始める前にバックグラウンド測定を行う。バックグラウンド測定では、通常、純水を石英セルに入れて測定し、石英セルの吸収、純水中の不純物、炭酸ガスなどのスペクトルを求める。以後は、測定するたびにバックグラウンド補正を自動的に行うことが望ましい。純水に次いで、この純水に次ぐバックグラウンドとして、例えば濃度既知のフェノールレッドやＨＥＰＥＳから、または例えば濃度未知のフェノールレッドやＨＥＰＥＳの濃度を定量し、バックグラウンド測定に使用して、スペクトル測定後の成分濃度を定量しても良い。細胞培地において、濃度の変化の少ない物質は、フェノールレッド、ＨＥＰＥＳである。また、他の成分で、濃度の変化の少ない物質などによりスペクトル吸収に影響を及ぼすものであれば、同じ処理をしてもよい。

なお、以下の各検量線を求める場合において、１００～３００ｍｇ／ｄｌのグルコース、０～４００ｍｇ／ｄｌの乳酸、０～５００ｍｇ／ｄｌのアンモニウム、３０～５０ｍｇ／ｄｌのグルタミンの全種混合液においても、それぞれ直線性を示していることが確認されている。

また、実際に本発明を実施する場合には、ＰＣで自動演算させるプログラムを構築し、演算結果を判断することが好ましいが、演算結果によっては、結果が例えばゼロ、検出不可、Ｎ．Ｄ、または‐‐‐と表示される。

なお、以下の説明において、説明を理解し易くするため、各方法の対象となる１つの成分ごとにその作用の一例が説明されている。

以下、対象となる成分ごとにその作用の一例を説明する。なお、検量線を作成する際には、細胞培地に代えて所定の成分を含む細胞培地模擬液を用いることが好ましい。細胞培地模擬液の調製は、例えば下記の表１～表４に基づいて行うことができる。

表１はｐＨ６．５の時の細胞培地模擬液のベース液の調製表である。表２はｐＨ６．８の時の細胞培地模擬液のベース液の調製表である。表３はｐＨ７．０の時の細胞培地模擬液のベース液の調製表である。表４はｐＨ７．５の時の細胞培地模擬液のベース液の調製表である。

例えば、上記表に基づき、りん酸緩衝生食ベース（フェノールレッド＋ＨＥＰＥＳ）模擬液を調製する。ｐＨ緩衝剤として、富士フィルム和光純薬工業製、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０４８－２９８０５を用いるか、上記表に基づき調製することもできる。
調製方法
・富士フィルム和光純薬工業のＳＤＳに基づき、ＫＣｌ：２０００．０ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：８００００．０ｍｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄：２０００．０ｍｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄：１１５００．０ｍｇ／Ｌで調製する。ここで１０×という意味は、１０倍濃縮液で、使用するには、１０倍希釈が必要ということである。上記構成成分の試薬を入手し、蒸留精製、ろ過している超純水を使用して、上記のりん酸緩衝液の１０倍濃縮液を１Ｌ調製し、ストック溶液として希釈して使用する。
・ＫＨ₂ＰＯ、ＮａＨＰＯ₄の配合比を変化させてｐＨが６．５～７．５になるように調製して使用する。
・ＮａＣｌ、ＫＣｌは、それぞれ１３７ｍＭ、２．７ｍＭで一定とする。
・ｐＨ指示薬のフェノールレッドは、１５ｍｇ／ｌとする。
・ｐＨ緩衝剤のＨＥＰＥＳは、３０００ｍｇ／ｌとする。
・上記溶液を基本とし、グルコースは、５０、７５、１５０、２００、３００ｍｇ／ｄｌ、乳酸は、９、４５、９０、１８０、４５０ｍｇ／ｄｌ、アンモニウムは、２６、５３、１６０、２６７、５００、７５０ｍｇ／ｄｌとし、それぞれをｐＨ緩衝剤ベースの溶液に添加し、全量が１００ｍｌになるよう純水を添加し所望の濃度になるよう調製する。

実施形態１：グルコースの分析
［グルコースの分析のための検量線］
本実施形態においては、分析に影響を及ぼす成分はｐＨ緩衝剤としてのＨＥＰＥＳである。この場合、ラマン分光分析において、細胞培地に含まれるグルコースを分析する際、ＨＥＰＥＳの影響を考慮する。グルコースの濃度を定量するためには、測定したスペクトル強度からこの影響分を減算することでグルコースのスペクトル強度の算出および濃度を定量することができる。

＜グルコース検量線＞
図３は、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示すグルコース検量線である。縦軸はスペクトル強度ｙを示し、横軸は濃度ｘを示す（以下、他の検量線についても同様とする）。

１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース検量線（式１）は、以下のとおりである：
グルコース：ｙ＝０．８０９ｘ＋２０．２１１（＠１１２０ｃｍ^-1）（式１）

グルコースが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのグルコースの所定の波数として１１２０ｃｍ^-1が設定される。上記の１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜ＨＥＰＥＳ所定検量線＞
図４は、１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示すＨＥＰＥＳ所定検量線である。

１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ所定検量線の（式２）は、以下のとおりである：
ＨＥＰＥＳ：ｙ＝０．０８ｘ＋２５．５１６（＠１１２０ｃｍ^-1）（式２）

上記の１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜ＨＥＰＥＳ特有検量線＞
ＨＥＰＥＳのラマンスペクトルにおいては、１０３８ｃｍ^-1に主スペクトルがあり、これを含む１４４８ｃｍ^-1、１２９８ｃｍ^-1、１１９０ｃｍ^-1に濃度依存性を示すスペクトルを検出した。

図５は、１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示すＨＥＰＥＳ特有検量線である。

１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ特有検量線の（式３）は、以下のとおりである：
ＨＥＰＥＳ：ｙ＝３．１１５１ｘ＋３３１．２８（＠１０３８ｃｍ^-1）（式３）

ＨＥＰＥＳが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのＨＥＰＥＳ特有の波数として１０３８ｃｍ^-1が設定される。上記の１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

ここで、取得部４０は、グルコースを含む細胞培地である試料に単一波長の励起光が照射されることで生じるラマン散乱光の波数ごとの強度分布を示すラマンスペクトルを取得する。

また、抽出部４２は、グルコースのための所定の波数である１１２０ｃｍ^-1におけるスペクトル強度であって、グルコース由来のグルコースのスペクトル強度分およびＨＥＰＥＳ由来のＨＥＰＥＳのスペクトル強度分を含む、１１２０ｃｍ^-1におけるスペクトル強度を抽出する。さらに抽出部は、他の波形と重ならず孤立して現れるＨＥＰＥＳに特有の波数である１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ特有のスペクトル強度を抽出する。

また、記憶部３２は、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース検量線と、１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示すＨＥＰＥＳ所定検量線と、１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示すＨＥＰＥＳ特有検量線を記憶する。

なお、記憶部３２は、１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示すＨＥＰＥＳ特有検量線に代えて、上記したＨＥＰＥＳの濃度依存性を示す他の波数における検量線を記憶しても良い。

算出部４６は、ＨＥＰＥＳ特有のスペクトル強度から、ＨＥＰＥＳ特有検量線を用いて、ＨＥＰＥＳの濃度を定量し、ＨＥＰＥＳの濃度から、ＨＥＰＥＳ所定検量線を用いて、１１２０ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度分を算出し、１１２０ｃｍ^-1におけるスペクトル強度とＨＥＰＥＳのスペクトル強度分から、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度分を算出し、グルコースのスペクトル強度分から、グルコース検量線を用いて、グルコースの濃度を定量する。

［実施例１：グルコースの分析］
以下、ラマンスペクトルのピークからグルコース濃度を定量した実施例を説明する。ただし、本発明は、この実施例に限定されるものではない。本実施例においては、グルコースを含む細胞培地を用いた。表５は、細胞培地の種類と主要成分を示す。

＜細胞培地サンプル１について＞
細胞培地サンプル１として、上記表５中の味の素社製StemFit AK02Nを用いた。このStemFit AK02Nをマウス胎仔から単離したＮＰＣ（Ｎｅｐｈｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の培養に用い、培養０日目の細胞培地サンプルとして本実施例１のグルコースを含む細胞培地サンプル１とした。細胞培地サンプル１に対して７８５ｎｍの単一波長のレーザー光を照射し、細胞培地サンプル１のラマンスペクトルを取得した。ラマン分析装置は、ＴＳＩ社製、型番ＰｒｏＲａｍａｎ－Ｌ－７８５－Ｂ１Ｓを用いた。血ガス分析装置（血ガス計）は、ラジオメーター（株）型式ＡＢＬ８００ ＢＡＳＩＣ ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。アンモニウムの分析は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡｍｍｏｎｉａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ＡＡ０１００）を使用した。

＜細胞培地サンプル２について＞
細胞培地サンプル２は、細胞培地サンプル１の培養７日目のものをサンプルとした。

細胞培地サンプル１において、ＨＥＰＥＳの主スペクトルの波数である１０３８ｃｍ^-1（ＨＥＰＥＳの特有の波数）におけるスペクトル強度は、６５０．０９２５であった。したがって（式３）から、
３．０３１ｘ＝６５０．０９２５－３６３．５１
ｘ＝（６５０．０９２５－３６３．５１）／３．０３１＝９４．５５
ゆえに、ＨＥＰＥＳの濃度は、９４．５５ｍｇ／ｄｌと求められた。

細胞培地サンプル１において、グルコース分析の波数である１１２０ｃｍ^-1（グルコースの所定の波数）におけるスペクトル強度は２８４．４７５６であった。

グルコース濃度は、（式１）、（式２）から、
ｘ＝（２８４．４７５６－（（（０．０８×９４．５５）＋２５．５１６）＋２０．２１１））／０．８０９＝２８５．８ｍｇ／ｄｌ
ゆえに、グルコース濃度は２８５．８ｍｇ／ｄｌであることが分かった。

図６～９は、グルコースについて表５にある幾つかの異なるメーカの細胞培地で測定を行った場合の血ガス計に対する追従性を示す。各図において、日時を変えて計４回実験を行った結果が示されている。図１０は、グルコースについて異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化と血ガス計の結果を比較した図である。ここで血ガス計の測定結果は、ラマン分光計で検出され、演算から得られた濃度とを相対的な評価を行うための比較対象を意味するため、追従性があることは相対的な指示応答性を示していることを意味する。図から異なるメーカの種類の異なる細胞培地において、日時を変えても再現性良く測定でき、血ガス計との指示傾向性も応答性の良い結果であることが分かった。

本発明により新たに見出されたグルコースのスペクトルを検出される波数は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳなどの添加有無で変わらないことが確認されている。

本発明者による鋭意検討の結果、ｐＨ緩衝剤であるＨＥＰＥＳのピークが測定対象としているグルコースのある波数におけるピークの嵩増しになっていることが判明し、これらのピークが影響し重なっていることが原因であることが見出された。

上記構成は、本発明者により見出された以下の知見に基づいている：
［１］細胞培地におけるグルコースのスペクトルの強度と濃度との間に、１１２０ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるグルコースの１１２０ｃｍ^-1でのスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［２］細胞培地におけるＨＥＰＥＳのスペクトルの強度と濃度との間に、１１２０ｃｍ^-1と１０３８ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるＨＥＰＥＳの１１２０ｃｍ^-1と１０３８ｃｍ^-1でのスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［３］細胞培地における１１２０ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度は、グルコースおよびＨＥＰＥＳの各スペクトル強度を実質的に加算されたものであることが判明した。すなわち、細胞培地における１１２０ｃｍ^-1でのスペクトルの強度からＨＥＰＥＳのスペクトル強度を差し引けば、１１２０ｃｍ^-1でのグルコースのスペクトル強度を実質的に算出できることが判明した。

実施形態２：乳酸の分析
［乳酸の分析のための検量線］
本実施形態においては、影響を及ぼす成分はグルコースである。この場合、ラマン分光分析において、細胞培地に含まれる乳酸を分析する際、グルコースによる嵩増しの影響分を考慮する。乳酸の濃度を定量するためには、測定したスペクトル強度からこの影響分を減算することで乳酸のスペクトル強度の算出および濃度を定量することができる。

＜乳酸検量線＞
図１１は、１０８４ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す乳酸検量線である。

１０８４ｃｍ^-1における乳酸検量線の（式４）は、以下のとおりである：
乳酸：ｙ＝０．２６２６ｘ＋１７．０５４（＠１０８４ｃｍ^-1）（式４）

乳酸が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの乳酸の所定の波数として１０８４ｃｍ^-1が設定される。上記の１０８４ｃｍ^-1における乳酸検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルコース所定検量線＞
図１２は、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示すグルコース所定検量線である。

１０８４ｃｍ^-1におけるグルコース所定検量線の（式５）は、以下のとおりである：
グルコース：ｙ＝０．２９５９ｘ＋１８．００３（＠１０８４ｃｍ^-1）（式５）

上記の１０８４ｃｍ^-1におけるグルコース所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルコース特有検量線＞
グルコースのラマンスペクトルにおいては、１１２０ｃｍ^-1に主スペクトルがあり、これを含む１１２０ｃｍ^-1、１０５８ｃｍ^-1、９０４ｃｍ^-1に濃度依存性を示すスペクトルを検出した。

１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース特有検量線については、図３で示したものと同じであるため、その説明を省略する。

グルコースが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのグルコース特有の波数として１１２０ｃｍ^-1が設定される。上記の１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

ここで、取得部４０は、乳酸を含む細胞培地である試料に単一波長の励起光が照射されることで生じるラマン散乱光の波数ごとの強度分布を示すラマンスペクトルを取得する。

また、抽出部４２は、乳酸のための所定の波数である１０８４ｃｍ^-1におけるスペクトル強度であって、乳酸由来の乳酸のスペクトル強度分とグルコース由来のグルコースのスペクトル強度分とを含む、１０８４ｃｍ^-1におけるスペクトル強度を抽出する。さらに抽出部４２は、他の波形と重ならず孤立して現れるグルコースに特有の波数である１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース特有のスペクトル強度とを抽出する。

また、記憶部３２は、１０８４ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸検量線と、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース所定検量線と、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース特有検量線とを記憶する。

なお、記憶部３２は、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース特有検量線に代えて、上記したグルコースの濃度依存性を示す他の波数における検量線を記憶しても良い。

算出部は、グルコース特有のスペクトル強度から、グルコース特有検量線を用いて、グルコースの濃度を定量し、グルコースの濃度から、グルコース所定検量線を用いて、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度分を算出し、１０８４ｃｍ^-1におけるスペクトル強度とグルコースのスペクトル強度分から、１０８４ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度分を算出し、乳酸のスペクトル強度分から、乳酸検量線を用いて、乳酸の濃度を定量する。

［実施例２：乳酸の分析］
以下、ラマンスペクトルのピークから乳酸濃度を定量した実施例を説明する。ただし、本発明は、この実施例に限定されるものではない。なお、細胞培地サンプル１は、グルコースの分析と同時分析したサンプルと同じであるので、説明を省略する。

乳酸を含む細胞培地サンプル１、２に対して７８５ｎｍの単一波長のレーザー光を照射し、細胞培地サンプル１、２のラマンスペクトルを取得した。分析装置は、ＴＳＩ社製、型番ＰｒｏＲａｍａｎ－Ｌ－７８５－Ｂ１Ｓを用いた。血液ガス分析装置（血ガス計）は、ラジオメーター（株）型式ＡＢＬ８００ ＢＡＳＩＣ ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。イオンクロマトは、日機装（株）７３２０可搬型イオンクロマト装置で、乳酸を所定の測定条件で測定した。

＜細胞培地サンプル１の乳酸濃度＞
上記グルコースの分析の実施例の結果から、細胞培地サンプル１のグルコース濃度は、２８５．８ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式５）から、
０．２９５９×２８５．８＋１８．００３＝１０２．５７１２２
ゆえに、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度は、１０２．５７１２２と算出された。

細胞培地サンプル１において、乳酸分析のための波数である１０８４ｃｍ^-1（乳酸の所定の波数）におけるスペクトル強度は、１２０．５３８３であった。したがって、
１２０．５３８３－１０２．５７１２２＝１７．９６７０８
ゆえに、１０８４ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度は、１７．９６７０８と算出された。

乳酸濃度は、（式４）から、
ｘ＝（（１７．９６７０８－１７．０５４）／０．２６２６＝３．４７７ｍｇ／ｄｌ
乳酸モル質量＝１７８ｇ／ｍｏｌとして、
３．４７７（ｍｇ／ｄｌ）＝３．４７７×１０／１７８（ｍＭ）＝０．２（ｍＭ）
ゆえに、細胞培地サンプル１の乳酸濃度は０．２ｍＭであることが分かった。

＜細胞培地サンプル２の乳酸濃度＞
細胞培地サンプル２のグルコース濃度は、１３７ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式５）から、
０．２９５９×１３７＋１８．００３＝５８．５４１３
ゆえに、１０８４ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度は、５８．５４１３と算出された。

細胞培地サンプル２において、乳酸分析のためのスペクトルの波数である１０８４ｃｍ^-1（乳酸の所定の波数）におけるスペクトル強度は１５５．７７２であった。したがって、
１５５．７７２－５８．５４１３＝９７．２３０７
ゆえに、１０８４ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度は、９７．２３０７と算出された。

乳酸濃度は、（式４）から、
ｘ＝（９７．２３０７－１７．０５４）／０．２６２６＝３０５．３２ｍｇ／ｄｌ
乳酸モル質量＝１７８ｇ／ｍｏｌとして、
３０５．３２（ｍｇ／ｄｌ）＝３０５．３２×１０／１７８（ｍＭ）＝１７．２（ｍＭ）
ゆえに、細胞培地サンプル２の乳酸濃度は１７．２ｍＭであることが分かった。

図１３～１６は、乳酸について表５にある幾つかの異なるメーカの細胞培地で測定を行った場合の血ガス計に対する追従性を示す。各図において、日時を変えて計４回実験を行った結果が示されている。図１７は、乳酸について異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化とイオンクロマトの結果を比較した図である。図から異なるメーカの種類の異なる細胞培地において、日時を変えても再現性良く測定でき、血ガス計やイオンクロマトとの指示傾向性も応答の良い結果であることが分かった。

なお、本発明により新たに見出された乳酸のスペクトル検出の波数は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳなどの添加有無で変わらないことが確認されている。

上記構成は、本発明者により見出された以下の知見に基づいている：
［１］細胞培地における乳酸のスペクトルの強度と濃度との間に、１０８４ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地における乳酸の１０８４ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［２］細胞培地におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との間に、１０８４ｃｍ^-1と１１２０ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるグルコースの１０８４ｃｍ^-1と１１２０ｃｍ^-1でのスペクトル強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［３］細胞培地における１０８４ｃｍ^-1でのスペクトル強度は、乳酸のスペクトル強度とグルコースのスペクトル強度とを実質的に加算されたものであることが判明した。すなわち、細胞培地における１０８４ｃｍ^-1でのスペクトル強度からグルコースのスペクトル強度を差し引けば、１０８４ｃｍ^-1での乳酸のスペクトル強度を実質的に算出できることが判明した。

実施形態３：アンモニウムの分析
［アンモニウムの分析のための検量線］
本実施形態においては、分析に影響を及ぼす成分はグルコース、乳酸、アセトアルデヒド、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドのうちの少なくとも１つである。ラマン分光分析において、細胞培地に含まれるアンモニウム（ＮＨ₄）を分析する際、上記分析に影響を及ぼす成分の影響を考慮する。アンモニウムの濃度を定量するためには、測定したスペクトル強度から上記分析に影響を及ぼす成分の影響分を減算することでアンモニウムのスペクトル強度および濃度を定量することができる。

＜アンモニウム検量線＞
図１８は、１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウムのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウム検量線の（式６）は、以下のとおりである：
アンモニウム：ｙ＝０．０９６１ｘ＋７０．７５２（＠１４３６ｃｍ^-1）（式６）

アンモニウムが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのアンモニウムの所定の波数として１４３６ｃｍ^-1が設定される。上記の１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウム検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルコース所定検量線＞
図１９は、１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるグルコース所定検量線の（式７）は、以下のとおりである：
グルコース：ｙ＝０．１２３４ｘ＋７１．８７８（＠１４３６ｃｍ^-1）（式７）

上記の１４３６ｃｍ^-1におけるグルコース所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルコース特有検量線＞
グルコース特有検量線については、乳酸の分析で用いたグルコース特有検量線を用いることができるため、説明を省略する。

＜乳酸所定検量線＞
図２０は、１４３６ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1における乳酸所定検量線の（式８）は、以下のとおりである：
乳酸：ｙ＝０．２５７２ｘ＋７３．４０９（＠１４３６ｃｍ^-1）（式８）

上記の１４３６ｃｍ^-1における乳酸所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜乳酸特有検量線＞
乳酸のラマンスペクトルにおいては、８５２ｃｍ^-1に主スペクトルがあり、これを含む８５２ｃｍ^-1、１０３８ｃｍ^-1、１０８４ｃｍ^-1に濃度依存性を示すスペクトルを検出した。

図２１は、８５２ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

主スペクトルである８５２ｃｍ^-1における乳酸特有検量線の（式９）は、以下のとおりである：
乳酸：ｙ＝０．７６２６ｘ＋５．１２（＠８５２ｃｍ^-1）（式９）

乳酸が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの乳酸特有の波数として８５２ｃｍ^-1が設定される。上記の８５２ｃｍ^-1における乳酸特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜アセトアルデヒド所定検量線＞
図２２は、１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒド所定検量線の（式１０）は、以下のとおりである：
アセトアルデヒド：ｙ＝０．４９５５ｘ＋３３．８３７（＠１４３６ｃｍ^-1）（式１０）

上記の１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒド所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜アセトアルデヒド特有検量線＞
アセトアルデヒドのラマンスペクトルにおいては、９２８ｃｍ^-1に主スペクトルがあり、これを含む８５８ｃｍ^-1、９２８ｃｍ^-1、１４３６ｃｍ^-1に濃度依存性を示すスペクトルを検出した。

図２３は、９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

主スペクトルである９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒド特有検量線の（式１１）は、以下のとおりである：
アセトアルデヒド：ｙ＝０．３０７１ｘ＋２１．０３５（＠９２８ｃｍ^-1）（式１１）

アセトアルデヒドが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのアセトアルデヒド特有の波数として９２８ｃｍ^-1が設定される。上記の９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒド特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルタミン所定検量線＞
図２４は、１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミン所定検量線の（式１２）は、以下のとおりである：
グルタミン：ｙ＝０．０９４７ｘ＋１２４．７８（＠１４３６ｃｍ^-1）（式１２）

上記の１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミン所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜グルタミン特有検量線＞
グルタミンのラマンスペクトルにおいては、１１４０ｃｍ^-1に主スペクトルがあり、これを含む９００ｃｍ^-1、１１４０ｃｍ^-1、１４３６ｃｍ^-1に濃度依存性を示すスペクトルを検出した。

図２５は、１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度（ｙ）と濃度の関係を示す検量線である。

１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミン特有検量線の（式１３）は、以下のとおりである：
グルタミン：ｙ＝０．２８３９ｘ＋２３．０７４（＠１１４０ｃｍ^-1）（式１３）

グルタミンが細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルのグルタミン特有の波数として１１４０ｃｍ^-1が設定される。上記の１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミン特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜ＨＥＰＥＳ所定検量線＞
図２６は、１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ所定検量線の（式１４）は、以下のとおりである：
ＨＥＰＥＳ：ｙ＝１．０７３７ｘ＋１１８．７８（＠１４３６ｃｍ^-1）（式１４）

上記の１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ所定検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜ＨＥＰＥＳ特有検量線＞
ＨＥＰＥＳ特有検量線については、グルコースの分析で用いたＨＥＰＥＳ特有検量線を用いることができるため、説明を省略する。

＜フェノールレッド所定検量線＞
図２７は、１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッド所定検量線の（式１５）は、以下のとおりである：
フェノールレッド：ｙ＝５．９１０７ｘ＋３４．７２４（＠１４３６ｃｍ^-1）（式１５）

上記の１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッド所定検量線入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

＜フェノールレッド特有検量線＞
図２８は、１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度（ｙ）と濃度（ｘ（ｍｇ／ｄｌ））の関係を示す検量線である。

１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッド特有検量線の（式１６）は、以下のとおりである：
フェノールレッド：ｙ＝１０．３０４ｘ＋３３．４４１（＠１１６２ｃｍ^-1）（式１６）

上記の１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッド特有検量線は入力部３０から入力され、記憶部３２の第２格納領域に格納されている。

ここで、本実施形態において、取得部４０は、アンモニウムを含む細胞培地である試料に単一波長の励起光が照射されることで生じるラマン散乱光の波数ごとの強度分布を示すラマンスペクトルを取得する。

また、本実施形態において、抽出部４２は、アンモニウムのための所定の波数である１４３６ｃｍ^-1におけるスペクトル強度であって、アンモニウム由来のアンモニウムのスペクトル強度分と、グルコース由来のグルコースのスペクトル強度分、乳酸由来の乳酸のスペクトル強度分、アセトアルデヒド由来のアセトアルデヒドのスペクトル強度分、グルタミン由来のグルタミンのスペクトル強度分、ＨＥＰＥＳ由来のＨＥＰＥＳのスペクトル強度分、フェノールレッド由来のフェノールレッドのスペクトル強度分のうちの少なくとも１つを含む、１４３６ｃｍ^-1におけるスペクトル強度と、他の波形と重ならず孤立して現れる、グルコースに特有の波数である１１２０ｃｍ^-1におけるグルコース特有のスペクトル強度、乳酸に特有の波数である８５２ｃｍ^-1における乳酸特有のスペクトル強度、アセトアルデヒドに特有の波数である９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒド特有のスペクトル強度、グルタミンに特有の波数である１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミン特有のスペクトル強度、ＨＥＰＥＳに特有の波数である１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳ特有のスペクトル強度、およびフェノールレッドに特有の波数である１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッド特有のスペクトル強度のうちの少なくとも１つを抽出する。

また、本実施形態において、記憶部３２は、１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウムのスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウム検量線、１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース所定検量線、１１２０ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース特有検量線、１４３６ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸所定検量線、８５２ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸特有検量線、１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度と濃度との関係を示すアセトアルデヒド所定検量線、９２８ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度と濃度との関係を示すアセトアルデヒド特有検量線、１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルタミン所定検量線、１１４０ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルタミン特有検量線、１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示すＨＥＰＥＳ所定検量線、１０３８ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度と濃度との関係を示すＨＥＰＥＳ特有検量線、１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度と濃度との関係を示すフェノールレッド所定検量線、１１６２ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度と濃度との関係を示すフェノールレッド特有検量線のうちの少なくとも１つ、を記憶する。

また、本実施形態において、算出部４６は、グルコース特有のスペクトル強度からグルコース特有検量線を用いたグルコースの濃度、乳酸特有のスペクトル強度から乳酸特有検量線を用いた乳酸の濃度、アセトアルデヒド特有のスペクトル強度からアセトアルデヒド特有検量線を用いたアセトアルデヒドの濃度、グルタミン特有のスペクトル強度からグルタミン特有検量線を用いたグルタミンの濃度、ＨＥＰＥＳ特有のスペクトル強度からＨＥＰＥＳ特有検量線を用いたＨＥＰＥＳの濃度、フェノールレッド特有のスペクトル強度からフェノールレッド特有検量線を用いたフェノールレッドの濃度の少なくとも１つを算出し、グルコースの濃度からグルコース所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度分、乳酸の濃度から乳酸所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度分、アセトアルデヒドの濃度からアセトアルデヒド所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度分、グルタミンの濃度からグルタミン所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度分、ＨＥＰＥＳの濃度からＨＥＰＥＳ所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度分、フェノールレッドの濃度からフェノールレッド所定検量線を用いた１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度分の少なくとも１つを算出し、１４３６ｃｍ^-1におけるスペクトル強度と、グルコースのスペクトル強度分、乳酸のスペクトル強度分、アセトアルデヒドのスペクトル強度分、グルタミンのスペクトル強度分、ＨＥＰＥＳのスペクトル強度分、およびフェノールレッドのスペクトル強度分の少なくとも１つとから、１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウムのスペクトル強度分を算出し、アンモニウムのスペクトル強度分から、アンモニウム検量線を用いて、アンモニウムの濃度を定量する。

［実施例３：アンモニウムの分析］
以下、ラマンスペクトルのピークからアンモニウムの濃度を定量した実施例を説明する。ただし、本発明は、この実験例に限定されるものではない。なお、細胞培地サンプル１は、グルコースの分析と同時分析したサンプルと同じであるので、説明を省略する。

アンモニウムを含む細胞培地サンプル１に対して７８５ｎｍの単一波長のレーザー光を照射し、細胞培地サンプル１のラマンスペクトルを取得した。分析装置は、ＴＳＩ社製、型番ＰｒｏＲａｍａｎ－Ｌ－７８５－Ｂ１Ｓを用いた。アンモニウムの分析は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡｍｍｏｎｉａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ＡＡ０１００）を使用した。イオンクロマトは、日機装（株）７３２０可搬型イオンクロマト装置で、アンモニウムを所定の測定条件で測定した。

＜細胞培地サンプル１のアンモニウム濃度＞
上記グルコースの分析の実施例の結果から、細胞培地サンプル１のグルコース濃度は、２８５．８ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式８）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度＝０．１２３４×２８５．８＋７１．８７８＝１０７．１４５７２

細胞培地において、細胞を培養する前の細胞培地には、乳酸は入っていない。細胞培地サンプル１は培養日数０日のサンプルであり、乳酸は代謝物であるため、細胞培地サンプル１の乳酸濃度を、０ｍｇ／ｄｌとした。したがって（式９）から、
１４３６ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度＝０．２５７２×０＋７３．４０９＝７３．４０９

細胞培地において、細胞を培養する前の細胞培地には、アセトアルデヒドは入っていない。細胞培地サンプル１は培養日数０日のサンプルであり、アセトアルデヒドは代謝物であるため、細胞培地サンプル１のアセトアルデヒド濃度を、０ｍｇ／ｄｌとした。したがって（式１１）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度＝０．４９５５×０＋３３．８３７＝３３．８３７

細胞培地サンプル１のグルタミン濃度は２９．１ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１２）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度＝０．０９４７×２９．１＋１２４．７８＝１２７．５２７

細胞培地サンプル１のＨＥＰＥＳ濃度は、９４．５５ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１４）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度＝１．０７３７×９４．５５＋１１８．７８＝２２０．２９８３５５

細胞培地サンプル１のフェノールレッド濃度は、１０ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１５）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度＝５．９１０７×１０＋３４．７２４＝９３．８３１

細胞培地サンプル１において、アンモニウム分析の波数である１４３６ｃｍ^-1におけるスペクトル強度は６８８．２８８１であった。したがって、アンモニウム濃度は、アンモニウムモル質量＝１８．０３ｇ／ｍｏｌとして、（式７）から、
ｘ＝（６８８．２８８１－１０７．１４５－７３．４０９－３３．８３７－１２７．５２７－２２０．２９８３５５－９３．８３１－７０．７５２）／（０．０９６１×１０×１８．０３）＝－２．２ｍＭ
ゆえに、細胞培地サンプル１のアンモニウム濃度は－２．２ｍＭであることが分かった。

＜細胞培地サンプル２のアンモニウム濃度＞
細胞培地サンプル２のグルコース濃度は、１３７ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式８）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるグルコースのスペクトル強度＝０．１２３４×１３７＋７１．８７８＝８８．７８３８

細胞培地サンプル２の乳酸濃度は、２９．７ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式９）から、
１４３６ｃｍ^-1における乳酸のスペクトル強度＝０．２５７２×２９．７＋７３．４０９＝８１．０４７８４

細胞培地サンプル２のアセトアルデヒド濃度は２４．５ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１１）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるアセトアルデヒドのスペクトル強度＝０．４９５５×２４．５＋３３．８３７＝４５．９７６７５

細胞培地サンプル２のグルタミン濃度は１７．６ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１２）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるグルタミンのスペクトル強度＝０．０９４７×１７．６＋１２４．７８＝１２６．４４６７２

細胞培地サンプル２のＨＥＰＥＳ濃度は、９４．５５ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１４）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるＨＥＰＥＳのスペクトル強度＝１．０７３７×９４．５５＋１１８．７８＝２２０．２９８

細胞培地サンプル２のフェノールレッド濃度は、１０ｍｇ／ｄｌであった。したがって（式１５）から、
１４３６ｃｍ^-1におけるフェノールレッドのスペクトル強度＝５．９１０７×１０＋３４．７２４＝９３．８３１

細胞培地サンプル２において、アンモニウム分析のためのスペクトルの波数である１４３６ｃｍ^-1におけるスペクトル強度は８２９．５３２７であった。したがって、アンモニウム濃度は、アンモニウムモル質量＝１８．０３ｇ／ｍｏｌとして、（式７）から、
ｘ＝（８２９．５３２７－８８．７８３８－８１．０４７８４－４５．９７６７５－１２６．４４６７２－２２０．２９８－９３．８３１－７０．７５２）／（０．０９６１×１０×１８．０３）＝５．９ｍＭ
ゆえに、細胞培地サンプル２のアンモニウム濃度は５．９ｍＭであることが分かった。

図２９～３２は、アンモニウムについて表５にある幾つかの異なるメーカの細胞培地で測定を行った場合のアンモニウムＡｓｓａｙに対する追従性を示す。各図において、日時を変えて計４回実験を行った結果が示されている。図３３は、アンモニウムについて異なるメーカの細胞培地（REGM、StemFit、DMEM/F12、Essential6）のラマン分光計測による経時変化とイオンクロマトの結果を比較した図である。図から異なるメーカの種類の異なる細胞培地において、日時を変えても再現性良く測定でき、イオンクロマトとの指示傾向性も応答の良い結果であることが分かった。

本発明の実験により、アンモニウムのピークが他のピーク（グルコース、乳酸、アセトアルデヒド、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド）に嵩増しした形で検出されていることが分かっている。

上記構成は、本発明者により見出された以下の知見に基づいている：
［１］細胞培地におけるアンモニウムのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、１４３６ｃｍ^-1におけるアンモニウムのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［２］細胞培地におけるグルコースのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と１１２０ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるグルコースの１４３６ｃｍ^-1と１１２０ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［３］細胞培地における乳酸のラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と８５２ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地における乳酸の１４３６ｃｍ^-1と８５２ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［４］細胞培地におけるアセトアルデヒドのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と９２８ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるアセトアルデヒドの１４３６ｃｍ^-1と９２８ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［５］細胞培地におけるグルタミンのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と１１４０ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるグルタミンの１４３６ｃｍ^-1と１１４０ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［６］細胞培地におけるＨＥＰＥＳのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と１０３８ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるＨＥＰＥＳの１４３６ｃｍ^-1と１０３８ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。
［７］細胞培地におけるフェノールレッドのラマンスペクトルの強度と濃度との間に、１４３６ｃｍ^-1と１１６２ｃｍ^-1において線形性があることが判明した。すなわち、細胞培地におけるフェノールレッドの１４３６ｃｍ^-1と１１６２ｃｍ^-1でのラマンスペクトルの強度と濃度の一方から他方を算出できることが判明した。

本発明の第１の実施の態様は、
細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を定量する方法であって、
細胞培地がグルコースおよびグルコースの分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
前記グルコース由来のグルコースのスペクトル強度分および前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分由来のグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記グルコースのための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分に特有の波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記細胞培地中の前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
前記所定の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、定量された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記所定波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
前記所定の波数における前記スペクトル強度と算出された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分を算出し、
前記所定の波数におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース検量線を用いて、算出された前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分から、前記細胞培地中のグルコースの濃度を定量することを含み、
前記グルコースのための前記所定の波数が、１１２０ｃｍ^-1である、方法である。

これにより、得られたラマンスペクトルデータから細胞培地に含まれるグルコースの成分濃度を定量することができる。また得られたラマンスペクトルデータから細胞培地中のグルコース濃度を短時間で把握することができる。測定時に試薬などを使用しないため、消耗品が発生せず、ランニングコストの低減が期待できる。複数の濃度の異なるマトッリクスを含有する溶液を前処理せずにそのまま測定し、検出されたスペクトルから細胞培地中のグルコースの定量分析を行うことができる。ラマン分光分析では、一般的には、液体クロマトグラフィーのように測定対象物を分離することはなく、物質の分子構造や付与されている官能基から標準物質のスペクトルのデータベースと照合して定性および同定を行っている。これにより、混在する測定対象ではない物質の影響分を減算して細胞培地中のグルコース濃度を定量できる。

本発明の第２の実施の態様は、前記第１の実施の態様において、前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分がＨＥＰＥＳであり、前記ＨＥＰＥＳに特有の波数が、１０３８ｃｍ^-1であることである。

これにより、ＨＥＰＥＳ成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１０３８ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のＨＥＰＥＳ成分の有無を確認でき、細胞培地中のＨＥＰＥＳを正確に定量することができる。

本発明の第３の実施の態様は、
前記第１または第２の実施の態様において、グルコース濃度の定量に加えて、乳酸の濃度をも定量する方法であって、前記乳酸の濃度を定量する方法が、
細胞培地が乳酸および乳酸の分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
前記乳酸由来の乳酸のスペクトル強度分および前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分由来の乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記乳酸のための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記乳酸のための所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分に特有の波数における乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分に特有の波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸の分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記乳酸のための所定波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
前記乳酸のための所定の波数における前記スペクトル強度と前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸のスペクトル強度分を算出し、
前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸検量線を用いて、前記乳酸のスペクトル強度分から、前記乳酸の濃度を定量することを含み、
前記乳酸のための前記所定の波数が、１０８４ｃｍ^-1である、方法である。

これにより、得られたラマンスペクトルデータから細胞培地に含まれる乳酸の成分濃度を定量することができる。また得られたラマンスペクトルデータから細胞培地中の乳酸濃度を短時間で把握することができる。測定時に試薬などを使用しないため、消耗品が発生せず、ランニングコストの低減が期待できる。複数の濃度の異なるマトリックスを含有する溶液を前処理せずにそのまま測定し、検出されたスペクトルから細胞培地中の乳酸の定量分析を行うことができる。ラマン分光分析では、一般的には、液体クロマトグラフィーのように測定対象物を分離することはなく、物質の分子構造や付与されている官能基から標準物質のスペクトルのデータベースと照合して定性および同定を行っている。これにより、混在する測定対象ではない物質の影響分を減算して細胞培地中の乳酸濃度を定量できる。

本発明の第４の実施の態様は、前記第３の実施の態様において、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分がグルコースであり、前記グルコースの前記特有の波数が、１１２０ｃｍ^-1であることである。

これにより、グルコース成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１１２０ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のグルコース成分の有無を確認でき、細胞培地中のグルコースを正確に定量することができる。

本発明の第５の実施の態様は、
前記第１～３のいずれか１つの実施の態様において、グルコース濃度の定量、またはグルコース濃度および乳酸濃度の定量に加えて、アンモニウムの濃度をも定量する方法であって、前記アンモニウムの濃度を定量する方法が、
細胞培地がアンモニウムおよびアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
前記アンモニウム由来のアンモニウムのスペクトル強度分および前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分由来のアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記アンモニウムのための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分に特有の波数におけるアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度と前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度分を算出し、
前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウム検量線を用いて、前記アンモニウムのスペクトル強度分から、前記アンモニウムの濃度を定量することを含み、
前記アンモニウムのための前記所定の波数が、１４３６ｃｍ^-1である、方法である。

これにより、得られたラマンスペクトルデータから細胞培地に含まれるアンモニウムの成分濃度を定量することができる。また得られたラマンスペクトルデータから細胞培地中のアンモニウム濃度を短時間で把握することができる。測定時に試薬などを使用しないため、消耗品が発生せず、ランニングコストの低減が期待できる。複数の濃度の異なるマトリックスを含有する溶液を前処理せずにそのまま測定し、検出されたスペクトルから細胞培地中のアンモニウムの定量分析を行うことができる。ラマン分光分析では、一般的には、液体クロマトグラフィーのように測定対象物を分離することはなく、物質の分子構造や付与されている官能基から標準物質のスペクトルのデータベースと照合して定性および同定を行っている。これにより、混在する測定対象ではない物質の影響分を減算して細胞培地中のアンモニウム濃度を定量できる。

本発明の第６の実施の態様は、第５の実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がグルコースを含み、前記グルコースの前記特有の波数が１１２０ｃｍ^-1であることである。

これにより、グルコース成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１１２０ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のグルコース成分の有無を確認でき、細胞培地中のグルコースを正確に定量することができる。

本発明の第７の実施の態様は、第５または第６の実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分が乳酸を含み、前記乳酸の前記特有の波数が８５２ｃｍ^-1であることである。

これにより、乳酸成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの８５２ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中の乳酸成分の有無を確認でき、細胞培地中の乳酸を正確に定量することができる。

本発明の第８の実施の態様は、前記第５～７の実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がアセトアルデヒドを含み、前記アセトアルデヒドの前記特有の波数が９２８ｃｍ^-1であることである。

これにより、アセトアルデヒド成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの９２８ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のアセトアルデヒド成分の有無を確認でき、細胞培地中のアセトアルデヒドを正確に定量することができる。

本発明の第９の実施の態様は、前記第５～８の実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がグルタミンを含み、前記グルタミンの前記特有の波数が１１４０ｃｍ^-1であることである。

これにより、グルタミン成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１１４０ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のグルタミン成分の有無を確認でき、細胞培地中のグルタミンを正確に定量することができる。

本発明の第１０の実施の態様は、前記第５～９のいずれか１つの実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がＨＥＰＥＳを含み、前記ＨＥＰＥＳの前記特有の波数が１０３８ｃｍ^-1であることである。

これにより、ＨＥＰＥＳ成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１０３８ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のＨＥＰＥＳ成分の有無を確認でき、細胞培地中のＨＥＰＥＳを正確に定量することができる。

本発明の第１１の実施の態様は、前記第５～１０のいずれか１つの実施の態様において、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がフェノールレッドを含み、前記フェノールレッドの前記特有の波数が１１６２ｃｍ^-1であることである。

これにより、フェノールレッド成分が細胞培地に含まれている場合、ラマンスペクトルの１１６２ｃｍ^-1に特有のピークが出現しその再現性もあることが実験により確認されている。これにより、細胞培地中のフェノールレッド成分の有無を確認でき、細胞培地中のフェノールレッドを正確に定量することができる。

本発明の第１２の実施の態様は、前記第３または４の実施の態様において、グルコース濃度の定量および乳酸濃度の定量を、１つの分析装置において行うことである。

これにより、グルコースおよび乳酸の２つの成分を同時分析して検出し、これらを区別して濃度を定量することができる。一般的なラマン分光分析におけるスペクトルの処理では、得られたスペクトル強度とデータベースを照合し、物質の定性、もしくは、１成分毎に濃度算出をさせなければならない、という従来の課題を解決できる。高濃度のマトリックスが存在している細胞培地の成分分析を行うに際し、一斉分析にてグルコースおよび乳酸の２つの検出および濃度演算が可能となる。さらに、１回の測定でグルコース濃度、乳酸濃度を把握することができることから、イオンクロマトグラフィーや、血ガス計を用いなくても、１つの分析装置でグルコース濃度および乳酸濃度の定量分析を実施することができるため、消耗品が発生せず、ランニングコスト低減が期待できる。

本発明の第１３の実施の態様は、前記第５～１１のいずれか１つの実施の態様において、グルコース濃度の定量またはグルコース濃度および乳酸濃度の定量に加えて、アンモニウム濃度の定量を、１つの分析装置において行うことである。

これにより、グルコースおよびアンモニウム、またはグルコース、乳酸、およびアンモニウムを同時分析して検出し、これらを区別して濃度を定量することができる。一般的なラマン分光分析におけるスペクトルの処理では、得られたスペクトル強度とデータベースを照合し、物質の定性、もしくは、１成分毎に濃度算出をさせなければならない、という従来の課題を解決できる。高濃度のマトリックスが存在している細胞培地の成分分析を行うに際し、一斉分析にてグルコースおよびアンモニウム、またはグルコース、乳酸、およびアンモニウムの検出および濃度演算が可能となる。さらに１回の測定でグルコース濃度、乳酸濃度、アンモニウム濃度を把握することができることから、液体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィーや、Ammonia Assay Kitなどを使用しなくて済むので、消耗品が発生せず、１つの分析装置で短時間でグルコース濃度、乳酸濃度、アンモニウム濃度を把握することができるため、コスト低減が期待できる。

１０ 分析機構
１２ 光源
１４ リフレクタ
１６ サンプル
１８ 光学系
２０ モノクロメーター
２２ 回折格子
２４ ＣＣＤ検出器
２６ 分析装置
３０ 入力部
３２ 記憶部
３４ 制御部
３６ 表示部
４０ 取得部
４２ 抽出部
４４ 成分識別部
４６ 算出部
４８ 通知部

Claims (13)

1. 細胞培地のラマンスペクトルからグルコースの濃度を定量する方法であって、
   細胞培地がグルコースおよびグルコースの分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
   前記グルコース由来のグルコースのスペクトル強度分および前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分由来のグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記グルコースのための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分に特有の波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
   前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記特有の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記細胞培地中の前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
   前記所定の波数における前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコースの分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、定量された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記所定波数におけるグルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
   前記所定の波数における前記スペクトル強度と算出された前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分を算出し、
   前記所定の波数におけるグルコースのスペクトル強度と濃度との関係を示すグルコース検量線を用いて、算出された前記所定の波数における前記グルコースのスペクトル強度分から、前記細胞培地中のグルコースの濃度を定量することを含み、
   前記グルコースのための前記所定の波数が、１１２０ｃｍ^-1である、方法。
2. 前記グルコースの分析に影響を及ぼす成分がＨＥＰＥＳであり、前記ＨＥＰＥＳに特有の波数が、１０３８ｃｍ^-1である、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１または２に記載の方法において、グルコース濃度の定量に加えて、乳酸の濃度をも定量する方法であって、前記乳酸の濃度を定量する方法が、
   細胞培地が乳酸および乳酸の分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
   前記乳酸由来の乳酸のスペクトル強度分および前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分由来の乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記乳酸のための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記乳酸のための所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分に特有の波数における乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
   前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分に特有の波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
   前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸の分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記乳酸のための所定波数における前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
   前記乳酸のための所定の波数における前記スペクトル強度と前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸のスペクトル強度分を算出し、
   前記乳酸のための所定の波数における前記乳酸のスペクトル強度と濃度との関係を示す乳酸検量線を用いて、前記乳酸のスペクトル強度分から、前記乳酸の濃度を定量することを含み、
   前記乳酸のための前記所定の波数が、１０８４ｃｍ^-1である、方法。
4. 前記乳酸の分析に影響を及ぼす成分がグルコースであり、前記グルコースの前記特有の波数が、１１２０ｃｍ^-1である、請求項３に記載の方法。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の方法において、グルコース濃度の定量、またはグルコース濃度および乳酸濃度の定量に加えて、アンモニウムの濃度をも定量する方法であって、前記アンモニウムの濃度を定量する方法が、
   細胞培地がアンモニウムおよびアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分を含んでいて、前記細胞培地のラマンスペクトルを取得し、
   前記アンモニウム由来のアンモニウムのスペクトル強度分および前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分由来のアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を含む、前記アンモニウムのための所定の波数におけるスペクトル強度と、前記所定の波数とは異なり、他の波形と重ならず孤立して現れる前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分に特有の波数におけるアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度を抽出し、
   前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有検量線を用いて、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分特有のスペクトル強度から、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分の濃度を定量し、
   前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウムの分析に影響を及ぼす成分所定検量線を用いて、前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分の濃度から、前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分を算出し、
   前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度と前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分のスペクトル強度分から、前記所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度分を算出し、
   前記アンモニウムのための所定の波数における前記アンモニウムのスペクトル強度と濃度との関係を示すアンモニウム検量線を用いて、前記アンモニウムのスペクトル強度分から、前記アンモニウムの濃度を定量することを含み、
   前記アンモニウムのための前記所定の波数が、１４３６ｃｍ^-1である、方法。
6. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がグルコースを含み、前記グルコースの前記特有の波数が１１２０ｃｍ^-1である、請求項５に記載の方法。
7. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分が乳酸を含み、前記乳酸の前記特有の波数が８５２ｃｍ^-1である、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がアセトアルデヒドを含み、前記アセトアルデヒドの前記特有の波数が９２８ｃｍ^-1である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がグルタミンを含み、前記グルタミンの前記特有の波数が１１４０ｃｍ^-1である、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がＨＥＰＥＳを含み、前記ＨＥＰＥＳの前記特有の波数が１０３８ｃｍ^-1である、請求項５～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記アンモニウムの分析に影響を及ぼす成分がフェノールレッドを含み、前記フェノールレッドの前記特有の波数が１１６２ｃｍ^-1である、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. グルコース濃度の定量および乳酸濃度の定量を、１つの分析装置において行う、請求項３または４に記載の方法。
13. グルコース濃度の定量またはグルコース濃度および乳酸濃度の定量に加えて、アンモニウム濃度の定量を、１つの分析装置において行う、請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法。

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