JP2023068099A - 線維輪を修復する方法及びコラーゲンゲル組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】線維輪を修復する方法の提供。【解決手段】コラーゲンゲル、及び架橋剤を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階を含む線維輪の修復方法であって、コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる方法。【選択図】図2
Description
本願は、2013年12月3日に出願された米国特許仮出願第61/911,325号の優先権を主張するものであり、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国立衛生研究所により与えられた認可番号1F31ARO64695-01で、政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、線維輪を修復する方法及びコラーゲンゲル組成物に関する。
本発明は、線維輪を修復する方法及びコラーゲンゲル組成物に関する。
発明の背景
腰痛は、しばしば、椎間板の膨隆または椎間板ヘルニア(「IVD」)によってもたらされる。部分的な椎間板切除は、損傷したIVDの痛みを緩和するが、結果として得られる線維輪の欠損は、しばしば治療せずに放置される。これにより、開放性欠損を経て、再発性椎間板ヘルニアの可能性が増大する。線維輪の修復方法が、損傷したAF生物組織における欠損領域に対処するために発明されている。これらの治療は、脱出を防ぎ、かつあるいは変性を遅くしたり抑制したりするために、AF中の損傷を力学的に閉じることを目標とする。
腰痛は、しばしば、椎間板の膨隆または椎間板ヘルニア(「IVD」)によってもたらされる。部分的な椎間板切除は、損傷したIVDの痛みを緩和するが、結果として得られる線維輪の欠損は、しばしば治療せずに放置される。これにより、開放性欠損を経て、再発性椎間板ヘルニアの可能性が増大する。線維輪の修復方法が、損傷したAF生物組織における欠損領域に対処するために発明されている。これらの治療は、脱出を防ぎ、かつあるいは変性を遅くしたり抑制したりするために、AF中の損傷を力学的に閉じることを目標とする。
線維輪の閉鎖治療のタイプは、成功の程度は種々だが、完全に力学的な方法から、生物組織が導く方法にまでわたって開発されている。多くの力学的方法は、すでに商業的に実施されている(すなわち、縫合、バリヤー、栓子である)。線維輪を閉鎖するための巾着縫合(「MPSS」)法では、残った生物組織を一緒に引っ張るために、縫合糸及びアンカーによる手順を使用する。このMPSSは、Xcloseという製品へ発展されている。Intrinsic社のBarricaid、及びNew-Vert社のOSAシステムなどの物理的に欠損を埋めるような、移植可能なバリヤーも存在する。研究グループは、線維輪の欠損へ挿入することが可能な、かかりのついた栓子も開発している。これらの方法は、商業的に利用されているが、多数の欠点及び制約を有している。縫合法では、アンカーの導入を介して、初期欠損の周辺に小さな穿刺が導入される。縫合という性質により、この小さい穿刺は張力下に置かれる。また、初期欠損が大きい場合は、縫合は線維輪中の裂け目を完全に閉鎖するのには十分ではないかもしれない。バリヤーで欠損を覆うためには、作製物が力学的に周囲の生物組織へ固定されることが必要で、隣接した脊椎へ通常挿入されるので骨へ損傷を与え、そしておそらく損傷した椎間板における負荷を変化させる。バリヤー及び栓子などの修復方法では、破局的な失敗の危険性が常に伴う、金属及びプラスティックを用いて作製されている。かかりのついた栓子は、ヒツジのモデルで試験をしたときには、粉々に砕けた。その結果生じた破片は、周囲の椎間板隙と同様に、残った椎間板にもさらなる損傷を与え得る。これらの力学的方法は欠損部分に喪失した生物組織をもたらすこともなければ、生物組織の増殖用の基質をもたらしたりすることもない。
生物組織を加工したフィブリンハイドロゲルは、線維輪の修復向けに開発されている。これらのゲルは付着することが可能であるが、生物学的治療に関するその可能性は、未知である。さらに、天然の線維輪はI型コラーゲンからなっており、そのためフィブリン(血液凝固及び瘢痕組織に共通して関連する因子)の導入が、in vivoで試験したときに、望まない副作用を誘導した。
輪の欠損の修復が、変性脊髄疾患に対する治療を顕著に改善することを可能にした(Bron et al., "Repair, Regenerative and Supportive Therapies of the Annulus Fibrosus: Achievements and Challenges," Eur. Spine J. 18:301-13 (2009)(非特許文献1))。開放性欠損は、椎間板隙の核組織を含むため、AFの能力を損ない、それによって椎間板切除後、ヘルニアの再発及び進行性変性のおそれが増大する(Lebow et al., "Asymptomatic Same-Site Recurrent Disc Herniation After Lumbar Discectomy: Results of a Prospective Longitudinal Study with 2-Year Serial Imaging," Spine 36:2147-51 (2011)(非特許文献2); Ambrossi et al., "Recurrent Lumbar Disc Herniation After Single-Level Lumbar Discectomy: Incidence and Health Care Cost Analysis," Neurosurgery 65:574-8 (2009)(非特許文献3); McGirt et al., "A Prospective Cohort Study of Close Interval Computed Tomography and Magnetic Resonance Imaging After Primary Lumbar Discectomy: Factors Associated with Recurrent Disc Herniation and Disc Height Loss," Spine 34:2044-51 (2009)(非特許文献4); Carragee et al., "A Prospective Controlled Study of Limited Versus Subtotal Posterior Discectomy: Short-Term Outcomes in Patients with Herniated Lumbar Intervertebral Discs and Large Posterior Anular Defect," Spine 31:653-7 (2006)(非特許文献5); Carragee et al., "Clinical Outcomes After Lumbar Discectomy for Sciatica: The Effects of Fragment Type and Anular Competence," J. Bone Joint Surg. Am. 85-A:102-8 (2003)(非特許文献6))。さらに、治療工程、または診断工程における線維輪への穿刺が、変性椎間板疾患の進行を加速したり、核組織の突出を促進したりすることが、懸念されてきた(Carragee et al., "2009 ISSLS Prize Winner: Does Discography Cause Accelerated Progression of Degeneration Changes in the Lumbar Disc: A Ten-Year Matched Cohort Study," Spine 34:2338-45 (2009)(非特許文献7))。穿刺欠損の治療の成功が、それらの変性変化を抑制することを可能にした。
AFの本来備わっている極めて限定された治癒力のために、線維輪の欠損が持続され、単純な力学的な閉鎖では顕著に改善しない(Bron et al., "Repair, Regenerative and Supportive Therapies of the Annulus Fibrosus: Achievements and Challenges," Eur. Spine J. 18:301-13 (2009)(非特許文献1); Melrose et al., "Recent Advances in Annular Pathobiology Provide Insights into Rim-Lesion Mediated Intervertebral Disc Degeneration and Potential New Approaches to Annular Repair Strategies," Eur. Spine J. 17:1131-48 (2008)(非特許文献8); Bron et al., "Biomechanical and In Vivo Evaluation of Experimental Closure Devices of the Annulus Fibrosus Designed for a Goat Nucleus Replacement Model," Eur. Spine J. 19:1347-55 (2010)(非特許文献9); Fazzalari et al., "Mechanical and Pathologic Consequences of Induced Concentric Anular Tears in an Ovine Model," Spine 26:2575-81 (2001)(非特許文献10); Hampton et al., "Healing Potential of the Anulus Fibrosus," Spine 14:398-401 (1989)(非特許文献11))。この結果、多くの研究グループが、線維輪の修復に生物材料を用いることを研究してきた。
あるグループによって(Vadala et al., "Bioactive Electrospun Scaffold for Annulus Fibrosus Repair and Regeneration," Eur. Spine J. 21(suppl 1):S20-6 (2012)(非特許文献12))、in vitroで生物組織を加工したAF作製物を用いた剛性インプラントが研究されており、別のグループによって(Ledet et al., "Small Intestinal Submucosa for Anular Defect Closure: Long-Term Response in an In Vivo Sheep Model," Spine 34:1457-63 (2009)(非特許文献13))、in vivoで小さい腸粘膜下組織を用いた、剛性インプラントの研究がされている。移植された粘膜下組織が、ヒツジの脊椎のアニュロトミー(annulotomy)後の変性変化を低減させた。Schekらによる、"Genipin-Crosslinked Fibrin Hydrogels as a Potential Adhesive to Augment Intervertebral Disc Annulus Repair," Eur. Cell. Mater. 21:373-83 (2011)(非特許文献14)は、ゲニピンが架橋したフィブリンハイドロゲルを伴う、注入可能な生体材料について研究した。フィブリンはヒトAF組織の切片と融合させると、in vitroで、有望な生体力学的かつ細胞播種の特性を示した。注入可能な高密度コラーゲン("HDC")ゲルが試験され、HDCがin vitroで針穿刺をしたラットの尾のAFに力学的機能を部分的に復活させることが可能であることが見いだされた(Orthopedic Research Society, Annual Meeting; San Francisco, CA (2012)で報告された論文、Borde et al., "Repair of Defects in the Rat Tail Annulus Fibrosus Using Injectable High Density Collagen Gels"(非特許文献15))。しかし、in vivoで輪の欠損を治療するための、注入可能な生体材料の利用を報告した研究は存在しない。
針穿刺により導入された輪の欠損は、ラットの尾の脊椎中にある椎間板の変性における予測可能なパターンを導く(Keorochana et al., "The effect of Needle Size Inducing Degeneration in the Rat Caudal Disc: Evaluation Using Radiograph, Magnetic Resonance Imaging, Histology, and Immunohistochemistry," Spine J. 10:1014-23 (2010)(非特許文献16); Han et al., "A Simple Disc Degeneration Model Induced by Percutaneous Needle Puncture in the Rat Tail," Spine 33:1925-34 (2008)(非特許文献17))。そうしたモデルにおいては、穿刺による欠損を介した、髄核の生物組織の突出により変性が始まる。針穿刺のモデルは、椎間板再生のための生物材料を検査するために頻繁に用いられているが(Zou et al., "Efficacy of Intradiscal Hepatocyte Growth Factor Injection for the Treatment of Intervertebral Disc Degeneration," Mol. Med. Rep. 8:118-22 (2013)(非特許文献18); Zhang et al., "Intradiscal Injection of Simvastatin Retards Progression of Intervertebral Disc Degeneration Induced by Stab Injury," Arthritis Res. Ther. 11:R172 (2009)(非特許文献19); Gullung et al., "Platelet-Rich Plasma Effects on Degenerative Disc Disease: Analysis of Histology and Imaging in an Animal Model," Evid. Based Spine Care J. 2:13-8 (2011)(非特許文献20); Sheikh et al., "In Vivo Intervertebral Disc Regeneration Using Stem Cell-Derived Chondroprogenitors," J. Neurosurg. Spine 10:265-72 (2009)(非特許文献21))、椎間板の変性を防ぐために、導入された欠損の修復について検討するような、このモデルを用いた研究は、今のところ存在しない。
本発明は、当技術分野において、これら及びその他の欠陥を克服することを対象にする。
Bron et al., "Repair, Regenerative and Supportive Therapies of the Annulus Fibrosus: Achievements and Challenges," Eur. Spine J. 18:301-13 (2009)
Lebow et al., "Asymptomatic Same-Site Recurrent Disc Herniation After Lumbar Discectomy: Results of a Prospective Longitudinal Study with 2-Year Serial Imaging," Spine 36:2147-51 (2011)
Ambrossi et al., "Recurrent Lumbar Disc Herniation After Single-Level Lumbar Discectomy: Incidence and Health Care Cost Analysis," Neurosurgery 65:574-8 (2009)
McGirt et al., "A Prospective Cohort Study of Close Interval Computed Tomography and Magnetic Resonance Imaging After Primary Lumbar Discectomy: Factors Associated with Recurrent Disc Herniation and Disc Height Loss," Spine 34:2044-51 (2009)
Carragee et al., "A Prospective Controlled Study of Limited Versus Subtotal Posterior Discectomy: Short-Term Outcomes in Patients with Herniated Lumbar Intervertebral Discs and Large Posterior Anular Defect," Spine 31:653-7 (2006)
Carragee et al., "Clinical Outcomes After Lumbar Discectomy for Sciatica: The Effects of Fragment Type and Anular Competence," J. Bone Joint Surg. Am. 85-A:102-8 (2003)
Carragee et al., "2009 ISSLS Prize Winner: Does Discography Cause Accelerated Progression of Degeneration Changes in the Lumbar Disc: A Ten-Year Matched Cohort Study," Spine 34:2338-45 (2009)
Melrose et al., "Recent Advances in Annular Pathobiology Provide Insights into Rim-Lesion Mediated Intervertebral Disc Degeneration and Potential New Approaches to Annular Repair Strategies," Eur. Spine J. 17:1131-48 (2008)
Bron et al., "Biomechanical and In Vivo Evaluation of Experimental Closure Devices of the Annulus Fibrosus Designed for a Goat Nucleus Replacement Model," Eur. Spine J. 19:1347-55 (2010)
Fazzalari et al., "Mechanical and Pathologic Consequences of Induced Concentric Anular Tears in an Ovine Model," Spine 26:2575-81 (2001)
Hampton et al., "Healing Potential of the Anulus Fibrosus," Spine 14:398-401 (1989)
Vadala et al., "Bioactive Electrospun Scaffold for Annulus Fibrosus Repair and Regeneration," Eur. Spine J. 21(suppl 1):S20-6 (2012)
Ledet et al., "Small Intestinal Submucosa for Anular Defect Closure: Long-Term Response in an In Vivo Sheep Model," Spine 34:1457-63 (2009)
Schek et al.,"Genipin-Crosslinked Fibrin Hydrogels as a Potential Adhesive to Augment Intervertebral Disc Annulus Repair," Eur. Cell. Mater. 21:373-83 (2011)
Borde et al., "Repair of Defects in the Rat Tail Annulus Fibrosus Using Injectable High Density Collagen Gels"
Keorochana et al., "The effect of Needle Size Inducing Degeneration in the Rat Caudal Disc: Evaluation Using Radiograph, Magnetic Resonance Imaging, Histology, and Immunohistochemistry," Spine J. 10:1014-23 (2010)
Han et al., "A Simple Disc Degeneration Model Induced by Percutaneous Needle Puncture in the Rat Tail," Spine 33:1925-34 (2008)
Zou et al., "Efficacy of Intradiscal Hepatocyte Growth Factor Injection for the Treatment of Intervertebral Disc Degeneration," Mol. Med. Rep. 8:118-22 (2013)
Zhang et al., "Intradiscal Injection of Simvastatin Retards Progression of Intervertebral Disc Degeneration Induced by Stab Injury," Arthritis Res. Ther. 11:R172 (2009)
Gullung et al., "Platelet-Rich Plasma Effects on Degenerative Disc Disease: Analysis of Histology and Imaging in an Animal Model," Evid. Based Spine Care J. 2:13-8 (2011)
Sheikh et al., "In Vivo Intervertebral Disc Regeneration Using Stem Cell-Derived Chondroprogenitors," J. Neurosurg. Spine 10:265-72 (2009)
本発明の第1の態様は、線維輪を修復する方法に関する。この方法は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することを含む。このコラーゲンゲル組成物は、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、コラーゲンゲルと共に含まれたり、または加えられたりする。
本発明の第2の態様は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することに関する。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、組成物に含まれる、及び/または加えられる。
本発明のコラーゲンゲル組成物を注入する方法は、他の方法及び組成物がなし得なかった場所で成功することが可能である。このゲル組成物は、注入可能であり、そして送達時に粘度が低い。このため、部分的に、または完全に線維輪の欠損を密閉するために、種々の形状や大きさで送達し得る。ゲル組成物の送達は、任意の周辺の生物組織へ損傷を与えず、隣接する天然の椎間板組織と融合することを示した。さらに、この方法は生物材料のゲル組成物を注入することを含むので、周辺の椎間板隙中に破壊性破片を残すような、破局的な失敗の可能性がない。上に示したように、本来の線維輪は、概してI型コラーゲンからなり、それゆえに、その領域を修復するための架橋I型コラーゲンゲルの送達は、長期にわたる生物組織の増殖及び欠損の生物学的な修復のための基質を提供する。
以下で説明される実施例において、高密度のI型コラーゲンが、ラットの尾にある脊椎のAFにおける針穿刺欠損の導入後、5週に至るまで線維輪の欠損を修復するために示されている。この性能は、RFによる架橋と明らかに相関する。針穿刺を行ったラットの尾が、線維輪の修復向けの生体材料を研究するために好適なin vivoモデルであると示されてきた。以下の実施例において説明される、この実験の目的は、ラットの尾の脊椎における、針穿刺によるAF欠損を修復するためのHDCの能力を評価することであった。具体的にいうと、この目的は、組織学的結果及び放射性学的結果によって決められるように、注入されたHDCゲルが、核組織の突出及び/または、結果として生じるIVDの変性を防ぐことが可能であるかどうかを試験することであった。さらに、注入されたコラーゲンの架橋が、修復の工程に影響するかどうかが評価された。この目的のために、コラーゲン架橋の光活性開始剤であるリボフラビン(「RF」)が、異なる濃度で加えられた。ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物をスクリーニングするために用いられた。
発明の詳細な説明
本発明は、線維輪を修復する方法に関する。この方法は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することを含む。このコラーゲンゲル組成物は、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、コラーゲンゲルと共に含まれるか、または加えられる。
本発明は、線維輪を修復する方法に関する。この方法は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することを含む。このコラーゲンゲル組成物は、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、コラーゲンゲルと共に含まれるか、または加えられる。
本発明は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物にも関する。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量の組成物に、この架橋剤は、含まれる、及び/または加えられる。
椎間板は、脊髄の椎骨を1つずつ分け、衝撃を和らげたり、脊柱に伝わった応力及びひずみを吸収したりすることで、天然の緩衝材の役割を努めている。椎間板組織は、主に3つの部位である、終板、線維輪(「AF」)、及び髄核(「NP」)からなる。線維輪は、低密度である線維軟骨、及び移行領域を包囲しているI型コラーゲン線維の外輪を有する、強靱なコラーゲン線維の複合体である。それらのコラーゲン線維は、円筒の層を形成している。各層において、線維は互いに平行であるが、層と層の間にある線維の配向は、30度~60度の間で変化する。この組織は、脊椎における、ねじれ、曲げ、及び圧縮応力がかかっている際に支援をする。終板は、椎間板における上部及び下部の表面に見られ、線維輪と協働して、椎間板の中の髄核のゲル状マトリックスを含んでいる。髄核は、プロテオグリカンと、水中で無作為に配向したII型コラーゲン線維の柔和なマトリックスでできている。プロテオグリカン及び水の含量は、椎間板の中央で最も多く、椎間板の外縁に向かって減少する。
本発明の方法は、例えばIVDの線維輪構造を修復するために実行される。本明細書で使用される、「修復する」という用語は、機能及び/または構造を、復元したり、保持したり、及び/または、増大させたりするような、任意の補正、補強、再生、改善、補給、健全、回復、修繕、補修などを示す。従って、「修復する」という用語は、修正すること、補強すること、再調整すること、改善すること、補給すること、健全にすること、補充すること、修繕すること、補修すること、保持すること(すなわち、さらなる損傷、または分解などからである)、ないしは別の方法で、機能及び/または構造を復元することも意味し得る。「修復する」は、椎間板線維輪の欠損の完全な修復及び、部分的な修復を含む。さらに、「修復する」という用語は、椎間板線維輪の欠損に関連する、または椎間板線維輪の欠損によって起こる、少なくとも1つの症状の、治療、予防、または回復も含む。「治療」、「予防」、または「回復」は、発症を遅らせたりまたは予防したり、椎間板線維輪の欠損または損傷に関連する症状の、進行、悪化、または変質、または進行または重症度を逆転させたり、軽減したり、改良したり、抑制したり、進行する速度を落としたり、または止めたりすることを意味する。
一実施形態において本発明の方法は、椎間板のAFを「修復」するために、及びその後の、線維輪を修復する治療のために実行され、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、またはそれ以上の椎間板の高さが、数日間、数週間、数カ月、または数年間の後にも維持される。
本発明の方法を実行するにあたり、コラーゲンゲル組成物(以下に述べる)は、線維輪を有効に修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。組成物の注入は、例えば、病気に冒されている椎間板の線維輪へ挿入されたガイド針を用いて(しかし、ガイド針が必要ということではない)、実施され得る。その後、注入針がガイド針を介して挿入され得る。注入針で線維輪を貫通することが必要な場合もあり、必要でない場合もある。ガイド針の先端の位置、または注入針の先端の位置は、例えば蛍光透視法、磁気共鳴画像法、コンピューター断層切断法、または当技術分野において既知で任意である他の同様の技術などの画像診断を用いて、確認することが可能である。
一実施形態では、注入は周辺の生物組織に損傷を与えない。
別の実施形態において、注入は、線維輪の天然の組織と融合した、注入されたゲル組成物をもたらす。
本発明の方法は、ヒトを含む任意の哺乳動物で実行されてもよい。
本発明のコラーゲンゲル組成物は、脊椎硬膜の閉鎖と同様に、硬膜半月板、関節唇、及び靱帯/腱用の挿入物などの、線維軟骨用構造物における欠損を修復するためにも用いられ得る。
示してきたように、本発明の方法は、コラーゲンゲル組成物を提供すること、及び注入することを含む。こうした組成物を、これから記載する。複数のコラーゲンの型が存在する。主に、I型、II型、III型、及びIV型コラーゲンが、生体材料の原料として用いられている。I型コラーゲンはほとんど結合組織内で見ることができ、生体内に最も多量に存在するコラーゲンの型である。そして、腱、真皮及び骨に存在する。工業的には、コラーゲンは、生物のそれらの部位から抽出される場合が多い。II型は軟骨を形成するコラーゲンである。III型コラーゲンは、I型コラーゲンと同様の生物組織中に少量見られる。IV型コラーゲンは基底膜を形成する。I型、II型、及びIII型は、生体内にコラーゲン線維として存在し、生物組織または器官の強度を維持する主な機能を有している。IV型は線維形成能力を有していないが、4つの分子で構成される網目状の集合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与し得る。本明細書で使用する場合、「コラーゲン」という用語は、当技術分野で既知である、または発見されるような、1種または複数種の任意のコラーゲン型を示す。
一実施形態では、コラーゲンゲル組成物中のコラーゲンは、I型コラーゲンである。これは、天然のAFと同様のコラーゲン型である。I型コラーゲンが、I型コラーゲンをすでに含んでいる生物組織へ送達されるとき、ゲル組成物に対する免疫応答(注入に続く)、及び周辺の生物組織への何らかの否定的な作用の可能性が取り除かれる。
このコラーゲンは、可溶性であっても、または不溶性であってもよく、任意の動物における、任意の生物組織に由来し得る。例えば、コラーゲンゲルは、ラットの尾腱、子牛の皮膚コラーゲン、及び/または子牛の伸筋腱を含む、皮膚及び腱由来のコラーゲンを用いて作製され得る。
一実施形態では、コラーゲンゲルは、約1~200mg/ml、約10~180mg/ml、約20~160mg/ml、約30~140mg/ml、約40~120mg/ml、約50~100mg/ml、約60~80mg/ml、約50mg/mlより高い、約100mg/mlより高い、約150mg/mlより高い、約200mg/mlより低い、約150mg/mlより低い、約100mg/mlより低い、または約50mg/mlより低い濃度で、本発明の組成物中に含まれる。
本発明の組成物には架橋剤が含まれ、この架橋剤は、コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために十分な量で含有される。この架橋剤は、周辺のコラーゲン線維といくらかの架橋を引き起こす場合もある。例えば、これは、欠損部を包囲する生物組織と、注入されたゲルの良好な接着があるということを意味している。言い換えれば、本発明の組成物は、注入時に周囲の細胞組織へ安定して融合する。一実施形態によると、これは、本発明の組成物が線維輪の修復部位への注入で、修復部位でその位置に留まることが可能であることを意味する。これは、周辺の生物組織と融合するためである。
一実施形態では、コラーゲン系物質の架橋剤は、超急性拒絶反応を防ぐために、物質の抗原性を抑制するよう用いられる。
架橋は、力学的特性を改善するため、及び分解に対する抵抗性を向上させるためにも用いられる。
種々の架橋に関する方法論が、本発明におけるコラーゲンゲル組成物を架橋するために用いられ得る。この架橋は、UV処理または可視光処理を用いた、光誘起性のものであってもよい。露光における種々の態様では、光の露出時間(0~600秒、またはそれ以上の秒数)、及び光の照度(2,000mw/cm2まで)などを変えることができる。UV照射(例えば、200~300nmで)は、コラーゲン原線維の力学的強度を増大する、迅速かつ容易に制御される手法であり、後に生体材料を洗って除去することが必要な任意の有毒な副生成物を生成しない。コラーゲンゲルは、UV及び/または可視光による架橋処理を最適化し得るような、多糖、またはGAGなどの構成成分を含有するヒドロキシ基を含む場合がある。コラーゲンは、メチレンブルー及びローズベンガルによる染色などの光増感剤の染色剤存在下で、可視光を用いて架橋され得る。
架橋は、電子線及び/またはガンマ線を用いた放射線処理によっても実行される場合がある。放射線誘発架橋は、細胞毒性架橋剤の使用を必要とせず、そしてその後の処理工程を必要としない。放射線誘発架橋剤の別の利点は、ガンマ線が可視光またはUVの光誘発架橋のような、別の手順を用いては達成し得ないような深さへ生体材料を貫通することができる点である。
1種または複数種の架橋剤を、本発明におけるコラーゲンゲル組成物を架橋するために用いることができる。架橋剤は、タンパク質の特定の官能基(第1級アミン、スルフヒドリル、など)に化学的に結合することが可能な、2つ以上の反応性末端を含む分子である。好ましくは、この架橋剤は不揮発性の副生物を生成するべきではない。架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはヘキサメチルジイソシアネートを含み得るが、限定されない。この架橋剤は、カルボジイミド、ポリアルデヒド、ポリスルホン、活性化PEG、エポキシド、イミダゾールまたはジイソシアネートであってもよい。架橋はグルタルアルデヒド、またはホルムアルデヒド(リジン残基を架橋することができる)などのアルデヒド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(アミノ基及びカルボキシル基を架橋することができる)、またはグリセロールポリ(グリシジルエーテル)、及びポリ(エチレングリコールジグリシジルエーテル)などのポリエポキシ化合物との処理を含み得る。この架橋剤は、アミノ基を架橋することができる、ヘキサメチレンジイソシアネート(HMDI)であってもよい。
一実施形態において、架橋剤は、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の一実施形態によると、架橋剤は、リボフラビンである。ゲルに混合する架橋剤(例えば、リボフラビン)は、コラーゲンゲル中だけでなく、周囲の天然コラーゲン線維との架橋も促進する助けをする。本発明のコラーゲンゲル組成物は欠損部位で重合して、組成物中のコラーゲンと周囲の天然コラーゲンとの自然な相互作用を利用することを可能にし、欠損部位での結合及び力学的治癒を促進する。欠損部位での重合反応によって、異なる欠損の形状及び大きさへゲルが広がったり、適合したりすることも可能になる。
架橋剤は、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、もしくは約7.5mMまでの濃度、または約7.5mMより高い濃度で、組成物に含まれ得る。
本発明のコラーゲンゲル組成物は、高度に力学的、化学的、及び生物学的に調節可能である。コラーゲンは、コラーゲンの密度、及び架橋剤の濃度を変えることが可能な方法で調整され、それらの両方が力学的特性に影響を与える。混合する工程の間、前、及び/または後に、細胞を加えることもでき、組成物の多用途性が増大する。治療薬を含む、種々の成長因子及び剤を、細胞及びその周囲の生物組織から特定の応答を誘発するために、組成物に加えることができる。
本発明のコラーゲンゲル組成物は、さらに生細胞も含み得る。この細胞は、幹細胞、始原細胞、分化した細胞、最終分化した細胞、またはそれらの混合物であり得る。この細胞は、分化全能性、多能性、もしくは単能性の幹細胞、または、人工多能性幹細胞であり得る。この細胞は、例えば、樹立されている細胞株を介したような、ヒトの胚細胞の破壊を必要としない技術によって誘導された、ヒト胚性幹細胞であってもよい。間葉系幹細胞(骨髄間質細胞、多機能性間質細胞、またはMSCともいう)は、骨芽細胞、腱細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞を含む種々の細胞型に分化することができる、多能性幹細胞である。これらの細胞型は、骨、腱、靱帯、軟骨、筋肉、及び脂肪を作製する能力を有している。この細胞は、MSCまたはMSC系列中の任意の細胞であってもよい。始原細胞は、成熟細胞へ末端で分化する前に、複数回の細胞分裂を経ることができ、そして、その細胞は、それらの中間の細胞であってもよい。この細胞は、MSC(骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、多機能性間質細胞)、軟骨細胞、線維軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、骨髄細胞、間葉細胞、間質細胞、遺伝的に形質転換された細胞、またはそれらの混合物から選択され得る。この細胞は、自己の、または異種性のものであってよい。
この細胞は、以下の、胚性幹細胞、脂肪組織及び/または骨髄由来の前駆細胞、末梢血始原細胞、成体組織及び/または若年性組織から単離された幹細胞及び/または非幹細胞、遺伝的に形質転換した細胞、軟骨細胞及び他の細胞の組み合わせ、骨細胞と他の細胞の組み合わせ、滑膜細胞及び他の細胞の組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞の組み合わせ、間葉細胞と他の細胞の組み合わせ、間質細胞と他の細胞の組み合わせ、幹細胞及び他の細胞の組み合わせ、胚性幹細胞及び他の細胞の組み合わせ、成体組織及び他の細胞から単離された前駆細胞の組み合わせ、末梢血始原細胞と他の細胞の組み合わせ、成体組織及び他の細胞から単離された幹細胞の組み合わせ、及び遺伝的に形質転換した細胞と他の細胞の組み合わせの、1種または複数種を含み得る。
ヒト細胞は本発明の組成物及び方法での利用において好ましいが、この細胞は、ヒト原料由来の細胞に限定されない。ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、及びヒツジの原料を含むがそれらに限定されない、他の哺乳類由来の細胞が用いられ得る。げっ歯動物原料由来の細胞である、ラットの細胞も含み得る。細胞のドナーは、発育及び年齢の点で変動してもよい。細胞は、胚、新生児、または成体を含む高齢個体の移植用提供組織由来であってもよい。
一実施形態では、生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される。
一実施形態によると、本発明のコラーゲンゲル組成物に含まれる細胞は、例えば、特定のタンパク質を発現させるために操作されてもよい。例えば、特定のタンパク質をコードする核酸分子は、従来の組換えDNA技術を用いて宿主細胞に取り込まれ得る。一般に、これは、DNA分子をそのDNA分子が異種性である(すなわち、通常存在しない)発現系へ挿入することを含む。異種性DNA分子は、センス配向及び正確な読み枠で発現系またはベクターへ挿入される。ベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写、及び翻訳のために必要な要素(プロモーター、サプレッサー、オペレーター、転写終結配列など)を含む。組換え遺伝子またはDNAコンストラクトを、発現ベクターへの挿入の前に調製することができる。例えば、従来の組換えDNA技術を用いた、プロモーターが有効なDNA分子を、タンパク質をコードするDNA分子の5'側に機能的に結合することができ、転写終結部(すなわち、ポリアデニル化配列)をそれらの3'側に機能的に結合することができる。
所望のタンパク質をコードしたポリヌクレオチドは、その分子が異種性であるような発現系またはベクターへ挿入され得る。異種性である核酸分子は、プロモーター及び他の任意の5'調節分子に対して本来のセンス(5'→3')の配向及び正確な読み枠で、発現系またはベクターへ挿入される。核酸コンストラクトの調製は、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001)に記載されている通り、当技術分野でよく知られている標準的なクローニング方法を用いて実施することができ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。コーヘン及びボイヤーによる米国特許第4,237,224号においても、制限酵素での切断及びDNAリガーゼによるライゲーションを用いた、組換えプラスミドの形態の発現系の生成が記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
好適な発現ベクターは、宿主細胞に適合可能な種由来である、レプリコン及び制御配列を含有するベクターを含む。例えば、大腸菌が宿主細胞として用いられる場合は、pUC19、pUC18、またはpBR322などのプラスミドが用いられ得る。昆虫の宿主細胞を用いる場合に、昆虫の宿主細胞に適合可能である適切なトランスファーベクターは、所望のタンパク質に結合した分泌シグナルが取り込まれている、pVL1392、pVL1393、pAcGP67、及びpAcSecG2T、ならびに、GST及び6xHisタグ(BD バイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を含有する、pAcGHLT及びpAcHLTを含む。好適なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ノダウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターを含む。他の好適な発現ベクターは、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Laboratory Press, 2001)に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。核酸操作に関する多くの技術及びプロトコルが知られており、例えば核酸コンストラクトの調製においては、突然変異生成、シークエンシング、細胞へのDNAの導入、及び遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析について、Current Protocols in Molecular Biology (Fred M. Ausubel et al. eds., 2003)の中で詳細に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
異なる遺伝子シグナル及びプロセシング事象は多くのレベルの遺伝子発現(例えば、DNA転写、及びメッセンジャーRNA(「mRNA」)翻訳)を制御し、そしてその後、所望のタンパク質量が生成されて、宿主細胞によって発現される。DNAの転写はプロモーターの存在に依存し、このプロモーターはRNAポリメラーゼの結合を導くDNA配列であって、それによってmRNAの合成を促進する。プロモーターは、その"強さ"(すなわち、転写を促進する能力)の点で変動する。クローニングした遺伝子を発現させることを目的として、高レベルの転写、従って発現を得るための強いプロモーターを用いることが望ましい。利用した宿主系に依って、多数の好適なプロモーターのうちいずれか1つを用いてよい。哺乳類の細胞において、発現を指示するために好適な一般的なプロモーターは、SV40、MMTV、メタロチオネイン-1、アデノウイルスEla、CMV、即時性免疫グロブリン重鎖プロモーター及びエンハンサー、ならびにRSV-LTRを含むが、限定されない。プロモーターは、常時発現性のもの、または代わりに、生物組織特異的なものまたは誘導可能なものであり得る。
本発明の組成物は、一実施形態によると注入可能である。本発明のコラーゲンゲル組成物が注入可能であるため、この組成物を最小限の侵襲的外科的手法及び標準的な医療機器で、異なる欠損部位へ送達することができる。他のAF修復組成物及び技術は、周囲の生物組織への固着を可能にするためにより大きな手術部位を必要とする。また本発明の組成物とは異なり、他に存在するAF修復技術は、異なる欠損の形状及び大きさに適合することができず、外科医に、均一の欠損を作るために天然の生物組織をさらに除去させる。
本発明のコラーゲンゲル組成物の一実施形態において、コラーゲンゲル組成物は送達時に低粘度を有し、欠損の大きさ及び形の影響を受けずに任意の欠損部において重合する。さらに、in situで架橋するための、例えばリボフラビンの利用は、ゲル/AFの境界面を感染の危険にさらすことなく、より力学的に安定なゲルを形成することのできる、新規かつ独特のものである。
以下の例は、本発明の実施を例証することを意図したものであるが、それらの範囲を限定することを決して意図しない。
材料と方法
研究群
42体のオス、10~12週齢、純系、ヌード、無胸腺のラットを、本研究に用いた。動物を4つのグループに分けた。第1のグループの14体には針穿刺をして、15mg/mlの濃度のHDCを注入した。第2のグループの15体には穿刺をして、RF架橋をしたHDC(15mg/ml)を注入した。そのうち、9体には0.25mMのRFを、そして6体には0.5mMのRFを注入した。第3のグループの6体には、穿刺をし、対照標準として未処理で放置した。これらの3つのグループの全ての動物を、5週間後に屠殺した。尾部を回収して組織学的分析に用いた。第4のグループの6体の動物は屠殺し、尾部を回収し、その後針穿刺をして、HDCを注入した。このグループは、注入直後のコラーゲンについて、形態及び分布を調査するために用いた。
研究群
42体のオス、10~12週齢、純系、ヌード、無胸腺のラットを、本研究に用いた。動物を4つのグループに分けた。第1のグループの14体には針穿刺をして、15mg/mlの濃度のHDCを注入した。第2のグループの15体には穿刺をして、RF架橋をしたHDC(15mg/ml)を注入した。そのうち、9体には0.25mMのRFを、そして6体には0.5mMのRFを注入した。第3のグループの6体には、穿刺をし、対照標準として未処理で放置した。これらの3つのグループの全ての動物を、5週間後に屠殺した。尾部を回収して組織学的分析に用いた。第4のグループの6体の動物は屠殺し、尾部を回収し、その後針穿刺をして、HDCを注入した。このグループは、注入直後のコラーゲンについて、形態及び分布を調査するために用いた。
動物は全て、米国獣医学会の標準プロトコルに基づき、二酸化炭素で屠殺した。
本研究は、特別手術施設病院動物管理使用委員会(Hospital of Special Surgery Institutional Animal Care and Use Committee)及びニューヨーク州によって概説されるガイドラインにより承認され、着手された。
コラーゲンゲルの調製
コラーゲンは、前述の通り(Cross et al., "Dense Type I Collagen Matrices That Support Cellular Remodeling and Microfabrication for Studies of Tumor Angiogenesis and Vasculogenesis In Vitro," Biomaterials 31:8596-607 (2010); Bowles et al., "Self-Assembly of Aligned Tissue-Engineered Annulus Fibrosus and Intervertebral Disc Composite Via Collagen Gel Contraction," Tissue Eng Part A 16:1339-48 (2010)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)、ラットの尾腱から採取され、再構成された。線維は、0.1%酢酸で温浸し、48時間凍結させ、凍結乾燥させて、20mg/mLの0.1%酢酸で再構成した。送達直前に酸性コラーゲン溶液を、10×ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(「DPBS」)、1N NaOH、及び1×DPBSを含む使用液と混合し、15mg/mLで最終のコラーゲンゲルの重合反応を開始した。RF群に関しては、RFは所望の濃度で1×DPBSに加えた。RFを加えたゲルには、架橋を開始する注入後に、40秒間、480nmの波長の青色光を露光した。
コラーゲンは、前述の通り(Cross et al., "Dense Type I Collagen Matrices That Support Cellular Remodeling and Microfabrication for Studies of Tumor Angiogenesis and Vasculogenesis In Vitro," Biomaterials 31:8596-607 (2010); Bowles et al., "Self-Assembly of Aligned Tissue-Engineered Annulus Fibrosus and Intervertebral Disc Composite Via Collagen Gel Contraction," Tissue Eng Part A 16:1339-48 (2010)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)、ラットの尾腱から採取され、再構成された。線維は、0.1%酢酸で温浸し、48時間凍結させ、凍結乾燥させて、20mg/mLの0.1%酢酸で再構成した。送達直前に酸性コラーゲン溶液を、10×ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(「DPBS」)、1N NaOH、及び1×DPBSを含む使用液と混合し、15mg/mLで最終のコラーゲンゲルの重合反応を開始した。RF群に関しては、RFは所望の濃度で1×DPBSに加えた。RFを加えたゲルには、架橋を開始する注入後に、40秒間、480nmの波長の青色光を露光した。
開放性針穿刺及びコラーゲン注入
尾部の第3脊椎と第4脊椎の間の標的レベルは、X線写真の対照下で特定した。動物に麻酔をかけて、うつぶせにして置いた。2cmの縦の皮膚切開を、印のついたレベルまで行った。次いで、AFに露光し、これを損傷しないようにするために細心の注意を払った。その後、コラーゲンゲルが入ったシリンジに装着した18ゲージの針を用いてAFを穿刺した。穿刺直後に、欠損部の周りに約0.5mlのゲルを注入した。RFをコラーゲンに加えると、ゲルは、in situで硬化した。対照群は穿刺し、未処理で放置した。穿刺技術を標準化するために、針を常に、同じ方向(針のベベルが上向きの状態)、及び同じ深度(ベベルが、完全にAFを貫通するまで)で挿入した。
尾部の第3脊椎と第4脊椎の間の標的レベルは、X線写真の対照下で特定した。動物に麻酔をかけて、うつぶせにして置いた。2cmの縦の皮膚切開を、印のついたレベルまで行った。次いで、AFに露光し、これを損傷しないようにするために細心の注意を払った。その後、コラーゲンゲルが入ったシリンジに装着した18ゲージの針を用いてAFを穿刺した。穿刺直後に、欠損部の周りに約0.5mlのゲルを注入した。RFをコラーゲンに加えると、ゲルは、in situで硬化した。対照群は穿刺し、未処理で放置した。穿刺技術を標準化するために、針を常に、同じ方向(針のベベルが上向きの状態)、及び同じ深度(ベベルが、完全にAFを貫通するまで)で挿入した。
定量的磁気共鳴画像法
定量的画像法は、それを構成する磁気共鳴画像法(「MRI」)のボクセルの数によって、NPの大きさを評価するために用いた。このボクセルの数を、ここではNPボクセル値と呼ぶ。磁気共鳴画像は、穿刺1週、2週、及び5週後の時点で、7T MRI(Bruker社 7T USR前臨床MRIシステム)で得た(図1A)。
定量的画像法は、それを構成する磁気共鳴画像法(「MRI」)のボクセルの数によって、NPの大きさを評価するために用いた。このボクセルの数を、ここではNPボクセル値と呼ぶ。磁気共鳴画像は、穿刺1週、2週、及び5週後の時点で、7T MRI(Bruker社 7T USR前臨床MRIシステム)で得た(図1A)。
矢状断面マルチスライスマルチエコー・パルスシーケンス(TR=2000ms、TE=12ms、NEX=2、エコー数=12、エコースペーシング=12ms、スライス厚=1mm、及びマトリックスサイズ=320×320、分解能:125μm×125μm×1mm)を、12の取得されたエコーに対して、T2信号強度対緩和時間の適合する片対数プロットに基づきT2マップを作成するために用いた。Bruker社(Bruker BioSpin Corporation、ビレリカ、マサチューセッツ州)の所有するプログラムであるTopSpinを、適合工程に用いた。得られたT2マップにカラーマップを割り当てた(図1B)。次に、約1mm2の大きさである、対象となる標準部位(「ROI」)を、穿刺されるIVDに近くて健常な椎間板のNPの中心に描いた。ROIが測定された、標準的なT2緩和時間(T2-RT)、そして、この値-2標準偏差を、スライス時の全てのボクセルにおける差分閾値を設定するために用いた。(図1B)。続いて、閾値より低いT2値をもつボクセルを減算した(図1C)。その結果、NP組織を示す、T2値をもつボクセルのみが椎間板隙に残り、その後ボクセルを算出した。各時点において、穿刺された椎間板の平均ボクセル値を、近接した健常なIVDの平均ボクセル値と比較した。
定性的MRI分析
矢状断面TurboRareシーケンス(TR=2017ms、TE=60ms、NEX=6、エコートレインレングス=12、スライス厚=1mm、及びマトリックスサイズ=320×320、及び分解能:125μm×125μm×1mm)を、定性的評価のために用いた。改変したフィルマン・スケール(Pfirrmann scale)(Yu et al., "MRI Assessment of Lumbar Intervertebral Disc Degeneration with Lumbar Degenerative Disease Using the Pfirrmann Grading Systems," PLoS One 7:e48074 (2012)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)を、NP信号強度、均一性、椎間板の高さの減少によって明らかにされる、変性の4つの段階をはっきりさせるために用いた(表1)。
矢状断面TurboRareシーケンス(TR=2017ms、TE=60ms、NEX=6、エコートレインレングス=12、スライス厚=1mm、及びマトリックスサイズ=320×320、及び分解能:125μm×125μm×1mm)を、定性的評価のために用いた。改変したフィルマン・スケール(Pfirrmann scale)(Yu et al., "MRI Assessment of Lumbar Intervertebral Disc Degeneration with Lumbar Degenerative Disease Using the Pfirrmann Grading Systems," PLoS One 7:e48074 (2012)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)を、NP信号強度、均一性、椎間板の高さの減少によって明らかにされる、変性の4つの段階をはっきりさせるために用いた(表1)。
椎間板の高さの測定
椎間板の高さを、デジタル放射線写真のキャビネ版で得た。指標部分の正確な側面の放射線写真を得るために、細心の注意を払った。IVDの高さは椎間板の高さの指数として表され、Luらによる、"Effects of Chondroitinase ABC and Chymopapain on Spinal Motion Segment Biomechanicsの改変した方法に基づき、隣接する椎体の高さで椎間板の高さを割ることで計算される。An In Vivo Biomechanical, Radiologic, and Histologic Canine Study," Spine 22:1828-34 (1997)は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。椎間板の高さは、1週、2週、5週時点において、術前かつ術後に測定した。
椎間板の高さを、デジタル放射線写真のキャビネ版で得た。指標部分の正確な側面の放射線写真を得るために、細心の注意を払った。IVDの高さは椎間板の高さの指数として表され、Luらによる、"Effects of Chondroitinase ABC and Chymopapain on Spinal Motion Segment Biomechanicsの改変した方法に基づき、隣接する椎体の高さで椎間板の高さを割ることで計算される。An In Vivo Biomechanical, Radiologic, and Histologic Canine Study," Spine 22:1828-34 (1997)は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。椎間板の高さは、1週、2週、5週時点において、術前かつ術後に測定した。
組織学
適切な固定の後に尾部を脱灰し、正中矢状面で切断し、75%のエタノールに移した。切片をパラフィンに包埋し、次いで5μmの厚さに切断し、アルシアンブルー及びサフラニンOで染色した。NPの大きさは、あるROIを核の周囲に描くことで測定し、その後、そのROIの断面部分をBioquantの画像システムを用いて測定した(図2)。穿刺した椎間板において、断面部分の平均測定値を近接した健常なIVDの値と比較した。Hanの分類システムを、穿刺したIVDの変性段階について記載するために用いた。このシステムは、AF/NPの細胞充実性、形態、及び境界に基づくものである(Han et al., "A Simple Disc Degeneration Model Induced by Percutaneous Needle Puncture in the Rat Tail," Spine 33:1925-34 (2008)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。この分類システムは、5(健常な椎間板)から15(末期まで変性した椎間板)にまで及ぶ。
適切な固定の後に尾部を脱灰し、正中矢状面で切断し、75%のエタノールに移した。切片をパラフィンに包埋し、次いで5μmの厚さに切断し、アルシアンブルー及びサフラニンOで染色した。NPの大きさは、あるROIを核の周囲に描くことで測定し、その後、そのROIの断面部分をBioquantの画像システムを用いて測定した(図2)。穿刺した椎間板において、断面部分の平均測定値を近接した健常なIVDの値と比較した。Hanの分類システムを、穿刺したIVDの変性段階について記載するために用いた。このシステムは、AF/NPの細胞充実性、形態、及び境界に基づくものである(Han et al., "A Simple Disc Degeneration Model Induced by Percutaneous Needle Puncture in the Rat Tail," Spine 33:1925-34 (2008)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。この分類システムは、5(健常な椎間板)から15(末期まで変性した椎間板)にまで及ぶ。
統計データ
NPボクセル数及び椎間板の高さのデータは、穿刺した健常な隣接したレベル、未処理の穿刺対コラーゲン注入、及びRF濃度でネストし、分散モデリングのネストされたマルチレベル分析を用いて評価した。分析は、JMP 9.0(SAS Institute Inc.,SASキャンパスドライブケーリー、ノースカロライナ州)で行った。p≦0.05の場合、変数と測定結果の間の統計的に有意な相関関係を示した。
NPボクセル数及び椎間板の高さのデータは、穿刺した健常な隣接したレベル、未処理の穿刺対コラーゲン注入、及びRF濃度でネストし、分散モデリングのネストされたマルチレベル分析を用いて評価した。分析は、JMP 9.0(SAS Institute Inc.,SASキャンパスドライブケーリー、ノースカロライナ州)で行った。p≦0.05の場合、変数と測定結果の間の統計的に有意な相関関係を示した。
実施例1-定性的なMRI
0.5mMのRF群について、6体中5体の動物では、5週のMR画像において変性が変化しているような明白な形跡は見られなかった(図2)。この群の改変したフィルマングレードは、IからIIIに及んだ(平均:1.3)。同じ時点において、0.25mMのRF群の動物は全て、NPの大きさの減少を示し、核酸はまだ均質かつ高信号の状態であった(図2)。フィルマングレードは、IIからIIIに及んだ(平均:2.6)。非架橋コラーゲン群では、より不均質性で、顕著に増大したAF/NP比を有する、より小さいNPを示した(図2)。AFは核の方へ膨れ出ており、砂時計のような形を示した。動物は、全てフィルマングレードIIIを有した。未処理群について、6体の検体中5体は黒いIVDを示し、末期である椎間板の変性を示していた(図2)。フィルマングレードは、IIIからIVに及んだ(平均:3.8)。
0.5mMのRF群について、6体中5体の動物では、5週のMR画像において変性が変化しているような明白な形跡は見られなかった(図2)。この群の改変したフィルマングレードは、IからIIIに及んだ(平均:1.3)。同じ時点において、0.25mMのRF群の動物は全て、NPの大きさの減少を示し、核酸はまだ均質かつ高信号の状態であった(図2)。フィルマングレードは、IIからIIIに及んだ(平均:2.6)。非架橋コラーゲン群では、より不均質性で、顕著に増大したAF/NP比を有する、より小さいNPを示した(図2)。AFは核の方へ膨れ出ており、砂時計のような形を示した。動物は、全てフィルマングレードIIIを有した。未処理群について、6体の検体中5体は黒いIVDを示し、末期である椎間板の変性を示していた(図2)。フィルマングレードは、IIIからIVに及んだ(平均:3.8)。
実施例2-NPボクセル数
対照のIVDでは、1週、2週、及び5週で140から153ボクセルに及ぶ平均的なNPボクセル数を有していた。そして、0.5mMのRF群のボクセル数は、129(SD+/-16.3)~140(SD+/-22.5)の間であった。0.25mMのRF群は、低い値:1週で71ボクセル(SD+/-59.14)、そして第2週及び第5週で57ボクセル(SD+/-56.40)を示した。2つのRF群のNPボクセル数は、2週~5週の間、一定であった。
対照のIVDでは、1週、2週、及び5週で140から153ボクセルに及ぶ平均的なNPボクセル数を有していた。そして、0.5mMのRF群のボクセル数は、129(SD+/-16.3)~140(SD+/-22.5)の間であった。0.25mMのRF群は、低い値:1週で71ボクセル(SD+/-59.14)、そして第2週及び第5週で57ボクセル(SD+/-56.40)を示した。2つのRF群のNPボクセル数は、2週~5週の間、一定であった。
非架橋コラーゲン群では、1週で46(SD+/-25)ボクセルを示し、この値は5週で14(SD+/-15.6)へ連続的に低下した。未処理群では、各時点において、最も低いボクセル数の値を示し、5週間後には、5(SD+/-4.17)へ減少している(図3A)。全体として、HDCゲル注入は、未処理の椎間板と比較して、ボクセル数の値(P<0.0001)が顕著に増大した。増大したRF濃度(0mM、0.25mM、及び0.5mM)が、NPボクセル数の値が顕著に増大していることを示している(P<0.0001)。
実施例3-椎間板の高さの測定
針穿刺した全てのIVDは、針穿刺後に椎間板の高さが急降下したが、2週~5週の間では一定の状態であった(図3B)。0.5mMのRF群では、初期の椎間板の高さの平均84%(SD+/-8.77)を維持し、0.25mMのRF群では、平均77%(SD+/-8.72)を維持していた。
針穿刺した全てのIVDは、針穿刺後に椎間板の高さが急降下したが、2週~5週の間では一定の状態であった(図3B)。0.5mMのRF群では、初期の椎間板の高さの平均84%(SD+/-8.77)を維持し、0.25mMのRF群では、平均77%(SD+/-8.72)を維持していた。
非架橋コラーゲン群では、67%(SD+/-16.86)を維持し、未処理群では椎間板の高さの53%(SD+/-13.82)を維持していた。全体として、HDC処理ゲルは、椎間板の高さ指数を顕著に改善した(P=0.0264)。
実施例4-輪の欠損
針穿刺による欠損は、AFラメラ層を全て貫通しており(図4A、4B、及び5A-5C)、そして動物全てで、5週間後であっても見られた。対照及び非架橋群では、AF線維が周辺の瘢痕組織を分離させ、かつ侵入した状態であった。(図4D)。線維輪の修復の進行を示す、細胞充実性または血管分布が増大した肉芽組織は見られなかった。0.5mMのRF群は、両末端をつなぐ輪状線維が崩壊している、外側の第3のAFで線維性被膜の形成を示した(図5A-5F)。この線維性被膜は、周囲のAF及び瘢痕組織よりも、サフラニンO及びアルシアンブルーでより強く染色されている密なコラーゲンマトリックスで包埋された線維芽細胞で構成されていた。0.25mMのRF群では、同様の被膜(図4A及び4B)か、AFの外側の部分を修復している厚い線維性の線か、のいずれかの形成を示した(図4C)。2つの架橋された群において、AFの内側の3分の2では、生物組織の修復の形跡は見られなかった。
針穿刺による欠損は、AFラメラ層を全て貫通しており(図4A、4B、及び5A-5C)、そして動物全てで、5週間後であっても見られた。対照及び非架橋群では、AF線維が周辺の瘢痕組織を分離させ、かつ侵入した状態であった。(図4D)。線維輪の修復の進行を示す、細胞充実性または血管分布が増大した肉芽組織は見られなかった。0.5mMのRF群は、両末端をつなぐ輪状線維が崩壊している、外側の第3のAFで線維性被膜の形成を示した(図5A-5F)。この線維性被膜は、周囲のAF及び瘢痕組織よりも、サフラニンO及びアルシアンブルーでより強く染色されている密なコラーゲンマトリックスで包埋された線維芽細胞で構成されていた。0.25mMのRF群では、同様の被膜(図4A及び4B)か、AFの外側の部分を修復している厚い線維性の線か、のいずれかの形成を示した(図4C)。2つの架橋された群において、AFの内側の3分の2では、生物組織の修復の形跡は見られなかった。
実施例5-椎間板の変性
0.5mMのRF群では、変性の明白な形跡は見られなかった。IVDは、平均してHan変性グレード6.8を示した。0.25mMのRF群におけるIVDは、クラスター形成を伴うNP細胞で減少を示し、平均してHanグレード9.3に到達した。
0.5mMのRF群では、変性の明白な形跡は見られなかった。IVDは、平均してHan変性グレード6.8を示した。0.25mMのRF群におけるIVDは、クラスター形成を伴うNP細胞で減少を示し、平均してHanグレード9.3に到達した。
非架橋コラーゲン群の全てのIVDでは、椎間板隙で見られた残存したNP組織でのみ、変性変化が進行している形成が見られた(図2)。穿刺欠損は、AFへ分岐し、複数の亀裂が形成された。NP組織は、開放性欠損を通過して、ヘルニアを起こしていた(図4E)。椎間板は、Hanグレード12.8を示した。
未処理群の全ての動物では、重大な変性の形跡が見られ、つまりNPが結合組織と完全に入れ替わっていた。AFは破裂し、かつ組織が崩壊しているように見えた(図4F)。複数の検体では、顕著な終板の損傷が見られた(図2)。平均してHanグレードは、14.3であった。
実施例6-組織学的断面の領域
5週後、穿刺したIVDに近位の健常なNPでは、平均して1.59mm2のNPの断面部分を有していた。0.5mMのRF、0.25mMのRF、及び非架橋コラーゲン群の平均値は、それぞれ1.29mm2、0.78mm2、及び0.78mm2であった。未処理のIVDの椎間板隙には測定できるNP組織が残っていなかった。
5週後、穿刺したIVDに近位の健常なNPでは、平均して1.59mm2のNPの断面部分を有していた。0.5mMのRF、0.25mMのRF、及び非架橋コラーゲン群の平均値は、それぞれ1.29mm2、0.78mm2、及び0.78mm2であった。未処理のIVDの椎間板隙には測定できるNP組織が残っていなかった。
実施例7-注入されたコラーゲンの運命
注入直後、コラーゲンは輪の欠損の外側部分を覆っている脊椎傍隙に分散したが、欠損部へは移動しなかった(図6A-6B)。HDCはアルシアンブルーまたはサフラニンOで薄く染色された、均質の非結晶組織として見えた。5週後、残ったコラーゲンは、依然として均質かつ非結晶に見え、また、宿主の線維芽細胞が様々な度合いで侵入していた。吸収帯を確認でき、注入された物質の宿主細胞による再構成を示していた。(図7)。炎症性または異物反応の形跡は、見られなかった。
注入直後、コラーゲンは輪の欠損の外側部分を覆っている脊椎傍隙に分散したが、欠損部へは移動しなかった(図6A-6B)。HDCはアルシアンブルーまたはサフラニンOで薄く染色された、均質の非結晶組織として見えた。5週後、残ったコラーゲンは、依然として均質かつ非結晶に見え、また、宿主の線維芽細胞が様々な度合いで侵入していた。吸収帯を確認でき、注入された物質の宿主細胞による再構成を示していた。(図7)。炎症性または異物反応の形跡は、見られなかった。
実施例1-7についての考察
本研究の第1の目的は、針穿刺したネズミの尾のモデルにおける線維輪の欠損を修復するHDCの能力を試験することであった。コラーゲンは、椎間板隙の核組織を維持するAFの能力を保持することができ、それによってIVDへの変性変化を防ぐことが可能であることを見いだした。輪の完全性を部分的に回復させるような線維性組織の形成を誘発するコラーゲンゲルの可能性も認められた。第2の目的は、RFの追加がAF修復の特質に影響を及ぼすかどうかを評価することであった。RFは、針穿刺後最長5週まで、またはそれ以上、NPの大きさ及び椎間板の高さの保持を改善することを見いだした。
本研究の第1の目的は、針穿刺したネズミの尾のモデルにおける線維輪の欠損を修復するHDCの能力を試験することであった。コラーゲンは、椎間板隙の核組織を維持するAFの能力を保持することができ、それによってIVDへの変性変化を防ぐことが可能であることを見いだした。輪の完全性を部分的に回復させるような線維性組織の形成を誘発するコラーゲンゲルの可能性も認められた。第2の目的は、RFの追加がAF修復の特質に影響を及ぼすかどうかを評価することであった。RFは、針穿刺後最長5週まで、またはそれ以上、NPの大きさ及び椎間板の高さの保持を改善することを見いだした。
RFの有利な効果は、投与量に依存した。RFが存在しない場合、コラーゲンゲルは未処理のIVDと比較して、NPの大きさ及び椎間板の高さにほんのわずかな増大を生じたのみであった。NPボクセル値及び組織学的断面の測定によると、0.5mMのRF群は、その核組織の大部分を保持していた。椎間板の高さの平均84%を維持していた。MRI分析も組織学的評価のどちらでも顕著な変性変化を示さなかった。
複数の可能性のある仕組みが存在し、それによって、架橋はAF修復に確かに影響を及ぼし得る。化学的架橋により堅さが増大し、コラーゲンゲルの水力学的透過率が減少することが知られている(Cheng et al., "Genipin-Crosslinked Cartilage-Derived Matrix as a Scaffold for Human Adipose-Derived Stem Cell Chondrogenesis," Tissue Eng. Part A 19:484-96 (2013); Stewart et al., "Collagen Cross-Links Reduce Corneal Permeability," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:1606-12 (2009); Tirella et al., "Riboflavin and Collagen: New Crosslinking Methods to Tailor the Stiffness of Hydrogels," Mater. Lett. 74:58-61 (2012)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。堅さの増大により、欠損部を塞ぐためのより頑強なバリヤーの形成を助け得る。水力学的透過率の減少は、高度に水和したNP物質が欠損部を通って失われることを制限する(Orthopedic Research Society、Annual Meeting、サンフランシスコ、カリフォルニア州、(2012)で発表された論文である、Borde et al., "Repair of Defects in the Rat Tail Annulus Fibrosus Using Injectable High Density Collagen Gels"は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。さらに、架橋は、他の生体高分子ゲルに見られるような、AF組織へのコラーゲンの接着を補強し得る。(Schek et al., "Genipin-Crosslinked Fibrin Hydrogels as a Potential Adhesive to Augment Intervertebral Disc Annulus Repair," Eur. Cell. Mater. 21:373-83 (2011)、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。これは、線維輪からの移植された物質の脱離、及びNP組織のその後の損失を防ぐ。
注目すべき組織学的知見は、2つの架橋群両方での線維輪の欠損部の外側部分を覆う線維性被膜の形成である。コラーゲンゲルが、生物組織の再構成の形跡を伴う、宿主線維芽細胞の侵入のレベルを変えることを示し、これにより、その線維性組織が形成されていることを説明することができた。コラーゲンゲルのその後の組織修復を伴う、宿主細胞の侵入の仕組みは、すでにこの文献に記載されている(Guidry et al., "Studies on the Mechanism of Hydrated Collagen Gel Reorganization by Human Skin Fibroblasts," J. Cell. Sci. 79:67-81 (1985); Staskowski et al., "The Histologic Fate of Autologous Collagen Injected Into the Canine Vocal Fold," Otolaryngol Head Neck Surg. 118:187-90 (1998)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。スタコフスキーらは、イヌのモデルにI型コラーゲンを注入し、これに続く線維芽細胞の侵入が、ゲル中で新しい宿主コラーゲンの付着を引き起こすことを記載している。この研究によると、細胞の侵入は、架橋コラーゲンの調製物においてより迅速に進行しており、これによって、線維性被膜の形成が架橋群でのみ起こったのはなぜなのかを説明することができた。さらに、架橋は分解を遅らせ、コラーゲンの骨格を持続する時間が増加することが知られており、これは、細胞の移動及び組織修復も補助するであろう(Harriger et al., "Glutaraldehyde Crosslinking of Collagen Substrates Inhibits Degradation in Skin Substitutes Grafted to Athymic Mice," J. Biomed. Mater. Res. 35:137-45 (1997); Jarman-Smith et al., "Porcine Collagen Crosslinking, Degradation and its Capability for Fibroblast Adhesion and Proliferation," J. Mater. Sci. Mater. Med. 15:925-32 (2004)、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。
RFは、円錐角膜の治療において、角膜のコラーゲン線維を架橋するために、臨床的にすでに用いられている(Hashemi et al., "Corneal Collagen Cross-Linking with Riboflavin and Ultraviolet Irradiation for Keratoconus: Long-Term Results," Ophthalmology 120:1515-20 (2013)、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)、しかし、それはIVD組織の修復には適用されていない。RFは、酸素ラジカルの生成を誘発する光増感剤として役立ち、次いでコラーゲンの原線維の間の化学結合を誘導し、それによってそれらを架橋する(Tirella et al., "Riboflavin and Collagen: New Crosslinking Methods to Tailor the Stiffness of Hydrogels," Mater. Lett. 74:58-61 (2012)、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。複数の異なる物質が、生体高分子ゲルを架橋するために用いられている(Schek et al., "Genipin-Crosslinked Fibrin Hydrogels as a Potential Adhesive to Augment Intervertebral Disc Annulus Repair," Eur. Cell. Mater. 21:373-83 (2011); Harriger et al., "Glutaraldehyde Crosslinking of Collagen Substrates Inhibits Degradation in Skin Substitutes Grafted to Athymic Mice," J. Biomed. Mater. Res. 35:137-45 (1997); Jarman-Smith et al., "Porcine Collagen Crosslinking, Degradation and its Capability for Fibroblast Adhesion and Proliferation," J. Mater. Sci. Mater. Med. 15:925-32 (2004)、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。RFを用いることは、RFがin situで青色光によって活性化した後にのみ線維を架橋し、注入前にはコラーゲンゲルが液体の状態のままであることを可能にするため有利である。注入可能な生体材料は、強固である生体埋め込み物よりも、脊髄での手順における利用において、技術的により実現可能であるということも立証し得る。これは、それらの生体材料がAFまたは椎体への固着が必要でないためである。また、注入可能な物質のみを経皮的に適用することができる。
ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物を検査するために好適であることが立証された。18ゲージの針は、ラットの尾の椎間板のAFの後壁のほぼ全体を含む大きな欠損を形成する。この欠損は、椎間板造影法のために椎間板が除去または穿刺される際、アニュロトミーによって引き起こされた欠損より、比例してさらに大きいものである。未処理で放置された場合は、NPの液体粘稠度と相まって、高い椎間板内圧が核組織の迅速な突出を引き起こす。
未処理のIVDは、経皮的な手法で同様のモデルを用いている他の研究で記載されている場合よりも、より迅速に変質した(Keorochana et al., "The Effect of Needle Size Inducing Degeneration in The Rat Caudal Disc: Evaluation Using Radiograph, Magnetic Resonance Imaging, Histology, and Immunohistochemistry," Spine J 10:1014-23 (2010)、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる)。これは、その研究で用いられた公にされた手法によるものであってよく、その手法において傍脊柱筋がAFを解離させ、大きな生物組織の欠損が生じる。
好ましい実施形態を本明細書に詳細に描写及び記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改良、追加、置き換えなどが行えることは、関連技術分野の当業者には明白であろう。そしてそれゆえに、それらは下記の請求項に規定する本発明の範囲内であると考えられる。
以下で説明される実施例において、高密度のI型コラーゲンが、ラットの尾にある脊椎のAFにおける針穿刺欠損の導入後、5週に至るまで線維輪の欠損を修復するために示されている。この性能は、RFによる架橋と明らかに相関する。針穿刺を行ったラットの尾が、線維輪の修復向けの生体材料を研究するために好適なin vivoモデルであると示されてきた。以下の実施例において説明される、この実験の目的は、ラットの尾の脊椎における、針穿刺によるAF欠損を修復するためのHDCの能力を評価することであった。具体的にいうと、この目的は、組織学的結果及び放射性学的結果によって決められるように、注入されたHDCゲルが、核組織の突出及び/または、結果として生じるIVDの変性を防ぐことが可能であるかどうかを試験することであった。さらに、注入されたコラーゲンの架橋が、修復の工程に影響するかどうかが評価された。この目的のために、コラーゲン架橋の光活性開始剤であるリボフラビン(「RF」)が、異なる濃度で加えられた。ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物をスクリーニングするために用いられた。
[本発明1001]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、
線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階
を含む線維輪の修復方法であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる、方法。
[本発明1002]
コラーゲンがI型コラーゲンである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生細胞をコラーゲンゲル組成物へ加える段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
注入する段階が、周囲の生物組織に損傷を引き起こさない、本発明1001の方法。
[本発明1010]
融合が、線維輪の天然組織を伴う、本発明1009の方法。
[本発明1011]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が該組成物に含まれる、組成物。
[本発明1012]
コラーゲンがI型コラーゲンである、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
生細胞をさらに含む、本発明1011の組成物。
[本発明1014]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1016]
架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1017]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1011の組成物。
[本発明1018]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
注入可能である、本発明1011の組成物。
[本発明1001]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、
線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階
を含む線維輪の修復方法であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる、方法。
[本発明1002]
コラーゲンがI型コラーゲンである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生細胞をコラーゲンゲル組成物へ加える段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
注入する段階が、周囲の生物組織に損傷を引き起こさない、本発明1001の方法。
[本発明1010]
融合が、線維輪の天然組織を伴う、本発明1009の方法。
[本発明1011]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が該組成物に含まれる、組成物。
[本発明1012]
コラーゲンがI型コラーゲンである、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
生細胞をさらに含む、本発明1011の組成物。
[本発明1014]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1016]
架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1017]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1011の組成物。
[本発明1018]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
注入可能である、本発明1011の組成物。
Claims (19)
- コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、
線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階
を含む線維輪の修復方法であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる、方法。 - コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項1に記載の方法。
- 生細胞をコラーゲンゲル組成物へ加える段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項3に記載の方法。
- コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 架橋剤がリボフラビンである、請求項7に記載の方法。
- 注入する段階が、周囲の生物組織に損傷を引き起こさない、請求項1に記載の方法。
- 融合が、線維輪の天然組織を伴う、請求項9に記載の方法。
- コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が該組成物に含まれる、組成物。 - コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項11に記載の組成物。
- 生細胞をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- 生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項13に記載の組成物。
- コラーゲンが、約1~200mg/mlの濃度で組成物中に含まれる、請求項11に記載の組成物。
- 架橋剤が、約7.5mMまでの濃度で組成物中に含まれる、請求項11に記載の組成物。
- 架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項11に記載の組成物。
- 架橋剤がリボフラビンである、請求項17に記載の組成物。
- 注入可能である、請求項11に記載の組成物。
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