JP2023062897A

JP2023062897A - コラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤及びシワ改善剤

Info

Publication number: JP2023062897A
Application number: JP2021173065A
Authority: JP
Inventors: 宏行山羽; Hiroyuki Yamaha; 浩章足立; Hiroaki Adachi
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2023-05-09

Abstract

【課題】コラーゲン産生促進作用及び細胞増殖促進作用に優れた新規なシワ改善剤及び皮膚外用剤を提供する。【解決手段】本発明のＬ－アルギニノコハク酸は、優れたコラーゲン産生促進作用及び細胞増殖促進作用を有していた。よって、コラーゲンの減少及び細胞増殖の低下によって生じる皮膚のシワの改善に有効であり、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品におけるコラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤、シワ改善剤及びそれらの剤を配合した皮膚外用剤として応用が可能である。【選択図】なし

Description

本発明は、コラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤及びシワ改善剤に関する。

皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つにシワがある。シワには、表皮性のシワと、真皮性のシワの二種類が存在することが知られている。表皮性のシワは小ジワと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質中の水分量が低下することによって生じるシワである。一方、真皮性のシワは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるシワである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下が挙げられる。

これまでに、真皮性のシワを改善することを目的として、エゴマ発酵抽出物を有効成分として配合するコラーゲン産生促進剤（特許文献１）、グルコラファニン又はスルフォラファンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤（特許文献２）が報告されている。

表皮では、紫外線、著しい空気の乾燥、過度の皮膚洗浄、喫煙等の外的因子の影響を受けたり、加齢が進んだりすると、表皮細胞の活動や増殖能が低下し、それに伴い表皮のターンオーバー速度が遅延するため、表皮の菲薄化や角質層肥厚などの分化不全が引き起こされる。その結果、皮膚の保湿機能やバリア機能が低下し、シワ、くすみの発生、きめの消失等の変化が生じる。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮細胞の増殖を促進させる成分の探索が多くなされてきた。従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、タイソウからの抽出物（特許文献３）、土貝母からの抽出物（特許文献４）等が知られている。

本発明で用いられるＬ－アルギニノコハク酸は、生体の代謝経路の一つである尿素サイクルを構成する代謝中間体で、アルギニノコハク酸シンターゼによりシトルリンとアスパラギン酸との縮合反応によって生成する化合物である。Ｌ－アルギニノコハク酸の用途としては、局所適用後に哺乳類の毛髪の成長を増大させ、増進し、又は維持することへのアルギニノコハク酸の使用（特許文献５）が報告されている。しかし、Ｌ－アルギニノコハク酸がコラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤及びシワ改善剤として利用されていることは知られていない。

特開２０１９－１４２８１７号特開２０１９－０５２１１４号特開２００６－３１６０２８号特開２００６－０５６８５４号ＷＯ９４／００９７５０

コラーゲン産生促進作用、細胞増殖促進作用、シワ改善作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、アルギニノコハク酸が優れたコラーゲン産生促進作用、細胞増殖促進作用、シワ改善作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（２）Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
（３）Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とするシワ改善剤。
（４）（１）～（３）いずれか一項記載の剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。

本発明に用いるＬ－アルギニノコハク酸（英名：Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃａｃｉｄ）は、別名としてＬ－アルギノコハク酸、Ｎ－［［（Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシブチル］アミノ（イミノ）メチル］－Ｌ－アスパラギン酸である。また、コラーゲン産生促進作用、細胞増殖促進作用、シワ改善作用を損なわないことを条件として、塩又は誘導体を使用してもよい。塩は、金属塩やアミン塩等があり、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩、リチウム塩がよい。誘導体は、アミノ基かカルボニル基、側鎖いずれかにおいて原子団と共有結合したものを指す。前記原子団は、Ｎ－フェニルアセチル基、４，４‘－ジメトキシトリチル基等の保護基、メチルエステル、エチルエステル、脂肪族エステル、芳香族エステル等のエステル基が含まれる。Ｌ－アルギニノコハク酸は、市販されている試薬を使用してもよく、合成や生体からの抽出、精製したものが使用できる。

本発明のコラーゲン産生促進剤におけるコラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつで、細胞外基質（細胞外マトリクス）の主成分である。コラーゲンは機能や構造により型で分類されており、本発明におけるコラーゲンの型は特に限定されないが、好ましくは皮膚に存在するＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＸＩＩ及びＸＩＶ型のコラーゲンである。さらに好ましくは、皮膚に多く存在するＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンがよい。

本発明の細胞増殖促進剤における細胞は特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞又はこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、又は培養細胞、遺伝子を導入した細胞のいずれでもよい。また細胞の種類も、特に限定されず、外胚葉由来（皮膚表皮、神経など）、内胚葉由来（消化管、臓器組織など）、中胚葉由来（皮膚の真皮、結合組織、心臓・血管、筋肉など）、神経冠由来（末梢神経など）のいずれでもよい。好ましくは、皮膚を構成するケラチノサイト及び線維芽細胞が好ましい。

本発明におけるシワ改善剤は、皮膚におけるコラーゲン産生を促進すること、及び皮膚を構成する細胞の増殖を促進することで皮膚に生じるシワを改善することができるものである。

本発明は、コラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤及びシワ改善効果を損なわない範囲内で、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていてもよい。

本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、軟膏、パップ剤、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、錠菓、カプセル剤、チョコレート、ガム、飴、飲料等が挙げられる。好ましくは、患部における試料局所濃度を高められるため、外用剤の形態がよい。

外用の場合、本発明に用いるＬ－アルギニノコハク酸の含有量は、固形物に換算して０．０００１μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）以上が好ましく、０．００３μＭ～１０００ｍＭがより好ましい。さらに、０．０３μＭ～１００ｍＭが最も好ましい。０．０００１μＭ未満では十分な効果は望みにくい。１０００ｍＭを越えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるコラーゲン産生促進剤、細胞増殖促進剤及びシワ改善剤の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。処方例に示す％とは重量％を示す。

（処方例１）ローション
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸０．１
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料０．１
１１．精製水残量
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過しローションを調製する。

（処方例２）クリーム
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸ジナトリウム塩０．１
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル０．０５
１３．１，３－ブチレングリコール８．５
１４．精製水残量
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～1４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例３）乳液
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸リチウム塩０．１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水残量
［製造方法］成分２～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）ゲル剤
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸０．１
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水残量
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５）軟膏
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸ジナトリウム塩２．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
３．モノステアリン酸グリセリン１０．０
４．流動パラフィン５．０
５．セタノール６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．１
７．プロピレングリコール１０．０
８．精製水残量
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化し、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例６）パック
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸リチウム塩０．１
２．ポリビニルアルコール１２．０
３．エタノール５．０
４．１，３－ブチレングリコール８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
７．クエン酸０．１
８．クエン酸ナトリウム０．３
９．香料適量
１０．精製水残量
［製造方法］成分１～１０を均一に溶解し製品とする。

（処方例７）ファンデーション
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．パラオキシ安息香酸ブチル０．１
１０．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１１．ベントナイト０．５
１２．プロピレングリコール４．０
１３．トリエタノールアミン１．１
１４．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１５．二酸化チタン８．０
１６．タルク４．０
１７．ベンガラ１．０
１８．黄酸化鉄２．０
１９．香料適量
２０．精製水残量
［製造方法］成分２～９を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２０に成分１０をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１１～１４を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１５～１８を加え、水相とする。水相を８０℃に昇温し、油相に水相を徐々に加え乳化する。その後、撹拌しながら冷却し、４５℃で成分１９を加え、３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例８）固形石鹸
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸ジナトリウム塩０．１
２．石鹸素地（＊）８０．０
３．グリセリン１０．０
４．ソルビトール１．０
５．エデト酸０．１
６．酸化チタン０．１
７．香料適量
８．精製水残量
（＊）ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウムを含む高級脂肪酸ナトリウム混合物
［製造方法］全成分を混合して、ミキサー及びローラーで混練し、プロッダーで圧縮することによって棒状の成型物に型打ちし、次いで、成形物を冷却し、乾燥することによって、製品を得る。

（処方例９）ボディ用洗浄料
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸リチウム塩０．２
２．ステアリン酸１０．０
３．パルミチン酸８．０
４．ミリスチン酸１２．０
５．ラウリン酸４．０
６．オレイルアルコール１．５
７．精製ラノリン１．０
８．ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド１．０
９．グリセリン１０．０
１０．水酸化カリウム６．０
１１．香料適量
１２．防腐剤適量
１３．金属イオン封鎖剤適量
１４．精製水残量
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１４の適量に成分１０を溶解し、油相に添加しケン化を行う。続いて、成分６～９をケン化物に添加し、室温でさらに成分１、１１～１３及び残りの成分１４を添加する。

（処方例１０）浴用剤
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸５．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号適量
４．香料適量
５．無水硫酸ナトリウム残量
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例１１）錠剤
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸ジナトリウム塩１．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２４．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１２）飲料
処方含有量（重量％）
１．Ｌ－アルギニノコハク酸リチウム塩０．１
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．アスコルビン酸ナトリウム１．０
５．香料０．１
６．精製水残量
［製造方法］成分１～５を成分６の一部の精製水に撹拌溶解する。次いで、成分６の残りの精製水を加えて混合し、９０℃に加熱して５０ｍＬのガラス瓶に充填する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例コラーゲン産生促進効果の測定
ヒト線維芽細胞をφ６０ｍｍｄｉｓｈに播種し、コンフルエントになった後に、終濃度が０．３、３、３０、３００μＭになるように試料を添加した培地で培養した。比較物質として、アルギニン及びコハク酸を同濃度添加した。コントロールは試料未添加の培地を使用した。２４時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉ）及びｃｏｌｌａｇｅｎ（ＩＩＩ）ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。コラーゲン産生促進率を、コントロールのｃｏｌｌａｇｅｎｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のｃｏｌｌａｇｅｎｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

Ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉ）用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
Ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＩＩＩ）用のプライマーセット
ＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧ（配列番号３）
ＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号５）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号６）

これらの実験結果を表１に示した。その結果、本発明のＬ－アルギニノコハク酸には、顕著なｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉ）及び（ＩＩＩ）発現促進効果が認められた。一方、比較としてアルギニン又はコハク酸を添加した場合は、ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉ）及び（ＩＩＩ）発現は変化しなかった。

実験例細胞増殖促進効果の測定
ヒト線維芽細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり３×１０^３個播種し、各試料を最終濃度が０．００３～３００μＭとなるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて５日間培養した。細胞数の測定は、染色法により行った。即ち、培養終了後、培養液を除き、メタノールを用いて細胞を固定した。続いて、０．１％メチレンブルーを加え、１時間細胞の染色を行った。乾燥させた後、０．１ＮＨＣｌを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加えてよく撹拌させ、マイクロプレートリーダーを用いて６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖率は、コントロール（試料未添加）群の細胞量に対する試料添加群の細胞量の比率として算出した。

これらの実験結果を表２に示した。その結果、本発明のＬ－アルギニノコハク酸は優れた細胞増殖促進作用を示した。一方、アルギニン又はコハク酸を添加した場合、細胞数は変化しなかった。

以上のことから、本発明のＬ－アルギニノコハク酸は、優れたコラーゲン産生促進作用、細胞増殖促進作用を有していた。よって、コラーゲンの産生を促進すること及び皮膚の細胞の増殖を促進することにより、皮膚のシワ・タルミ等の疾患を抑制することができる。

Claims

Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
Ｌ－アルギニノコハク酸を含有することを特徴とするシワ改善剤。
請求項１～３いずれか一項記載の剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。