JP2023056457A - 美白剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新規美白剤を提供する。【解決手段】（Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．５である、美白剤。当該剤には、好ましくは更にトラネキサム酸及び／又はニコチン酸アミドが含有される。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト等に用いるロスマリン酸及びルテオニングルクロニドを含有する新規美白剤などに関する。

大気汚染やオゾン層の破壊により表皮に届く紫外線量は年々増加する傾向にあり、それに伴い、紫外線による肌のシミ、ソバカス、色黒などの肌悩みが大きくなっている状況である。 この状況の下、白く美しい肌を実現するために種々の美白剤が開発されている。美白剤としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド等のアスコルビン酸誘導体、ハイドロキノングルコシド等のハイドロキノン類の配糖体、トラネキサム酸、トラネキサム酸エステル等のトラネキサム酸類などが知られている（特許文献１、特許文献２）。

特開２００４－１１５３８１ 特開２０２１－８０２３６ 特許６７８６１９３

本発明が解決しようとする課題は、新規美白剤を提供すること、などである。

そこで、本発明の発明者は、鋭意検討を重ねた結果、ロスマリン酸及びルテオニングルクロニドを含有する組成物がメラニン生成抑制作用を新たに確認できたことから、本発明を完成した。

本発明は、以下の項を含む。
〔項１〕（Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．５である、美白剤。
〔項２〕トラネキサム酸を含有する、〔項１〕記載の美白剤。
〔項３〕ニコチン酸アミドを含有する、〔項１〕又は〔項２〕に記載の美白剤。
〔項４〕皮膚外用剤の形態である、〔項１〕から〔項３〕のいずれか１項に記載の組成物。

本発明により、新規美白剤を提供できる。

以下、本発明を実施するための形態について説明する。

（ペパーミント、ロスマリン酸、ルテオニングルクロニド）
本発明で用いられるロスマリン酸及びルテオニングルクロニドは、例えばペパーミント抽出物に含有されている（特許文献３）。

ペパーミント（別名：セイヨウハッカ、コショウハッカ）は、シソ科ハッカ属植物：ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ Ｌ．）である。「ペパーミント」の抽出物を製造する際には、材料として、例えば、根、根茎、葉、茎、花全草、又はこれらの混合物を用いるが、有効成分も葉に多くあると考えられることから、材料として葉を用いるのが好ましいと考えられる。

ペパーミントの抽出物は、例えば、材料を生のまま又は乾燥したものを粉砕後搾取して作製、材料を生のまま又は乾燥したものを粉砕後溶媒で抽出して作製、する。例えば、以下製造例により、ペパーミントの抽出物を製造する。なお、以下実施例で用いるペパーミントの抽出物は、以下製造例に従い、製造された。
以下実施例で用いられるペパーミントの抽出物中には、ロスマリン酸４０３．５５ｐｐｍ、ルテオニングルクロニド１６６．３５ｐｐｍが含有され、（Ａ）ロスマリン酸と（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．４１、であった。

本発明の剤に含有されるペパーミント抽出物は、例えば、所望の効果（美白効果など）を発揮するために、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．２％以上、更に好ましくは０．５％以上含有される。また、本発明の剤に含有されるペパーミント抽出物は、例えば、所望の毒性などを考慮して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下含有される。

本発明の剤に含有されるペパーミント抽出物が１％の場合、剤における（Ａ）ロスマリン酸と（Ｂ）ルテオニングルクロニドの含有量を算出した結果を以下表１に記載する。

本発明の剤に含有されるペパーミント抽出物が０．５％の場合、剤における（Ａ）ロスマリン酸と（Ｂ）ルテオニングルクロニドの含有量を算出した結果を以下表２に記載する。

（ペパーミントの抽出物の製造例）
ペパーミントの葉を粉砕し、粉砕物を作製する。この粉砕物１００ｇを５０％エタノール溶液２ｋｇに浸漬する。約１０℃～約３０℃の環境で、５～１０日間、この浸漬を行う。この浸漬を経て得られる溶液を、カラム（ＨＰ－２０）にて分画して、ロスマリン酸とルテオニングルクロニドとが含有されている画分を取り出す。この取り出す画分を、更にカラム（ＨＰ－２０）にて精製する。
精製後の溶液は、好ましくは「（Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．５（（Ａ）が１の際に、（Ｂ）が０．２以上１．５以下）」となっている。
なお、下記実施例で用いるペパーミントの抽出物は、（Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．４６である。

（ロスマリン酸）
ロスマリン酸（Ｒｏｓｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）は、ポリフェノール類で、エタノールに可溶性である。本発明の剤に含有されるロスマリン酸は、例えば、所望の効果（美白効果など）を発揮するために、好ましくは０．１ｐｐｍ以上、より好ましくは０．２ｐｐｍ以上、更に好ましくは０．５ｐｐｍ以上含有される。また、本発明の剤に含有されるロスマリン酸は、例えば、所望の毒性などを考慮して、好ましくは２０ｐｐｍ以下、より好ましくは１５ｐｐｍ以下、更に好ましくは１０ｐｐｍ以下含有される。

（ルテオニングルクロニド）
ルテオリングルクロニド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）は、フラボノイドで、例えば、ルテオリン７－グルクロニドや、ルテオリン３′‐グルクロニドが挙げられる。本発明の剤に含有されるルテオリングルクロニドは例えば、所望の効果（美白効果など）を発揮するために、好ましくは０．０８ｐｐｍ以上、より好ましくは０．１６ｐｐｍ以上、更に好ましくは０．４０ｐｐｍ以上含有される。また、本発明の剤に含有されるペパーミント抽出物は、例えば、所望の毒性などを考慮して、好ましくは１６ｐｐｍ以下、より好ましくは１２ｐｐｍ以下、更に好ましくは８ｐｐｍ以下含有される。

（ロスマリン酸とルテオニングルクノニドとの含有比率）
本発明の剤は、活性を発揮させる観点で、好ましくは、（Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．５（（Ａ）が１の際に、（Ｂ）が０．２以上１．５以下）、より好ましくは（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．２（（Ａ）が１の際に、（Ｂ）が０．２以上１．２以下）、より好ましくは（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２５～１．１８（（Ａ）が１の際に、（Ｂ）が０．２５以上１．１８以下）、更に好ましくは（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．３～１．１６（（Ａ）が１の際に、（Ｂ）が０．３以上１．１６以下）である。

（ペパーミントの抽出物の製造の際に用いる抽出溶媒）
抽出溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、１，２－ブチレングリコール、１，４－ブチレングリコール、１，５－ペンタンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，３－ペンタンジオール、１，４－ペンタンジオール、１，３，５－ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量１００～１０万）等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液が挙げられるが、溶媒を置換するケースも想定できるようにする観点で、エタノールを用いるのが好ましい。

（その他）
本発明で用いるペパーミントの抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことも可能である。精製操作は、例えば、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等であり、これらを任意に選択し、組合わせた処理を行うことも可能である。

（トラネキサム酸）
本発明の剤には、より効果を発揮するために、好ましくは更にトラネキサム酸を含有することができる。トラネキサム酸は、トランス－４－アミノメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸の略称である。トラネキサム酸類は、トラネキサム酸、トラネキサム酸塩、トラネキサム酸エステル、トラネキサム酸アミド、及びトラネキサム酸の多量体などを意味する。トラネキサム酸塩における塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩が挙げられる。トラネキサム酸エステルにおけるエステルとしては、例えば、ビタミンＡエステル、ビタミンＥエステル、ビタミンＣエステル等のビタミンエステル、アルキルエステルが挙げられる。また、トラネキサム酸アミドにおけるアミドとしては、例えば、メチルアミド等が挙げられる。

（ニコチン酸アミド）
本発明の剤には、より効果を発揮するために、好ましくは更にニコチン酸アミドを含有することができる。ニコチン酸（ビタミンＢ３、ナイアシン）のアミド化合物であり、ニコチンアミド、ナイアシンアミドともよばれる、ニコチン酸の誘導体である。ニコチン酸アミドは水溶性ビタミンで、ビタミンＢ群の一つである物質であり、例えば、天然物（米ぬかなど）から抽出されたり、あるいは公知の方法によって合成することができる。具体的には、第１５改正日本薬局方２００８に収載されているものを用いることが出来る。

（美白）
美白とは、色素沈着の予防及び／又は改善をいい、より具体的には、シミ、くすみ、そばかす、日焼け、皮膚の炎症や刺激による黒ずみ等のメラニン産生亢進、過剰蓄積、及び沈着異常等により生じる色素沈着症状、並びにステロイド等の薬物による皮膚の黒化症等の色素沈着をもたらす疾患等による色素沈着症状などの、予防及び／又は改善をいう。

（剤の形態）
本発明による剤（皮膚外用剤など）は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。

（剤の構成成分）
また、このような剤には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲で以下に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。なお、トラネキサム酸及びニコチン酸アミドは上述の記載の通りである。

（１）各種油脂類
アボカド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等。

（２）ロウ類
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等。

（３）鉱物油
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等。

（４）脂肪酸類
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、２－エチルブタン酸、イソペンタン酸、２－メチルペンタン酸、２－エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸。

（５）アルコール類
エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、２－ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２－オクチルドデカノール等の合成アルコール。

（６）多価アルコール類
酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等。

（７）エステル類
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等。

（８）金属セッケン類
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛等。

（９）ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物
アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン（Ｃ_２～Ｃ_４）オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル（Ｃ_２～Ｃ_４）キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等。

（１０）界面活性剤
アニオン界面活性剤（アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤：カルボン酸型両性界面活性剤（アミノ型、ベタイン型）、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤）等。

（１１）各種ビタミン類
ビタミンＡ群：レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群：チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群：ビタミンＣ酸又はその誘導体、ビタミンＤ群：エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ群：ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類、ビタミンＫ群：フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）、その他、必須脂肪酸（ビタミンＦ）、カルニチン、フェルラ酸、γ－オリザノール、オロット酸、ビタミンＰ類（ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン）、ビタミンＵ等。

（１２）各種アミノ酸類
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等。

（１３）添加物
添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、ｐＨ調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組み合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。

尚、抽出に用いる溶媒については、供する製品の使用目的、種類、或いは後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、通常では、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル等の各種有機溶媒の中から選ばれる１種若しくは２種以上の混液を用いるのが望ましい。但し、用途により有機溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、若しくは抽出後に除去しやすいエタノールを採用し、単独又は水との任意の混液で用いたりすれば良く、又、搾取抽出したものでも良い。

尚、植物又は動物系原料由来の添加物を、全身用又は局所用の外用剤、化粧品類に供する場合、皮膚や頭髪の保護をはじめ、保湿、感触・風合いの改善、柔軟性の付与、刺激の緩和、芳香によるストレスの緩和、細胞賦活（細胞老化防止）、炎症の抑制、肌質・髪質の改善、肌荒れ防止及びその改善、発毛、育毛、脱毛防止、光沢の付与、清浄効果、疲労の緩和、血流促進、温浴効果等の美容的効果のほか、香付け、消臭、増粘、防腐、緩衝等の効果も期待できる。

さらにこの他にも、これまでに知られている各原料素材の様々な美容的、薬剤的効果を期待し、これらを組み合わせることによって、本発明の目的とする効果の増進を図り、多機能的な効果を期待した製品とすることも可能である。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

以下、本発明の実施例について、説明する。以下、実施例で挙げる実験で用いた実験材料は次の通りである。
・Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（メラノーマ細胞）：Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ ４Ａ５、理化学研究所ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ
・当該細胞の前培養培地：５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地
・ＭＥＭ培地：Ｅ－ＭＥＭ（０５１－０７６１５）、富士フイルム和光純薬株式会社
・ウシ胎児血清：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
・本培養培地：デフォリン０．０３６％を含むＭＥＭ培地
・テオフィリン（１，３－ジメチルキサンチン）：東京化成工業株式化会社、ＣＡＳ ＲＮ： ５８－５５－９ 、製品コード： Ｔ０１７９
・ペパーミントの抽出物：ロスマリン酸４０３．５５ｐｐｍ、ルテオニングルクロニド１６６．３５ｐｐｍが含有され、（Ａ）ロスマリン酸と（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．４１
・ニコチン酸アミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）：製品コード０００－５４２２５、ＣＡＳ ＲＮ^ＴＭ９８－９２－０、キシダ化学株式会社
・トラネキサム酸：日本薬局方トラネキサム酸
・Ａｒｂｕｔｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ：Ａ６８０４、ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ

・正常ヒト新生児包皮皮膚繊維芽細胞：クラボウ、ＫＦ－４００９
・ＴＮＦ－α：富士フイルム和光純薬、２０３－１５２６３（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒα Ｈｕｍａｎ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）
・Ｄ－ＭＥＭ：富士フイルム和光純薬、０４１－２９７７５
・ＭＭＰ－１量の測定で用いたＥＬＩＳＡキット（ＭＭＰ－１のＥＬＩＳＡキット）：Ｈｕｍａｎ ＭＭＰ１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ：ａｂ１００６０４）

（実験１：メラニン生成抑制試験）
所定の細胞（上述のメラノーマ細胞）に対して試料を添加することにより、所定の細胞において、メラニン生成に変化があるかを確認した。試料を添加する細胞として、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた。

（１）メラノーマ細胞の前培養工程
上述のメラノーマ細胞を上述の前培養培地（５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

（２）試料を添加しての本培養工程
当該（１）の前培養後、８．５×１０^４個／ウェルという細胞数で、メラノーマ細胞を各ウェル（本培養培地が存在するウェル、２４Ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に播種した。当該播種後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

この培養後、各ウェルの培地を新鮮な本培養培地に置換した。当該置換された培地（当該細胞が含有）に、表３に示す下記試料を添加した。なお、この試料の添加は、以下の群を作製するように行った。なお、この実験１では、アルブチンのメラニン生成抑制作用が知られていることから（日皮会誌：１０１（６）、６０９－６１３，１９９１）、ポジティブコントロールの試験例（試験例２）として、アルブチンを添加する群を設定した。

当該添加後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、７２時間（３日間）培養した。この７２時間の培養後、各群において、下記測定１で用いるための当該培養したサンプル及び下記測定２で用いるための当該培養したサンプルに分けた。

（測定１：メラニン量測定）
この測定１で用いるための当該培養したサンプルをトリプシン処理によって細胞を回収した。回収した細胞を溶液（１Ｎ ＮａＯＨ、１０％ＤＭＳＯ含有）に溶解した。４２０ｎｍの吸光度にて当該溶解した液の吸光度（試験例１から試験例７の吸光度）を各々測定した。当該測定した値をメラニン量とした。当該測定結果を表４に示す。

表４に示す数値（相対値）を次のように算出した。先ず、各群（ｎ＝３）の測定結果の吸光度を算出した。次に、当該平均値について、各群のコントロール群の数値を１００として、各群の数値はコントロール群と比較しての相対値を算出した。表２中の＊印は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、試験例１（数値を１００）との比較による有意差（ｐ＜０．０５）を示す。表２中の†印は、試験例３と試験例４との比較を行った場合、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定において、試験例４と比べての有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

試験例３、５及び７においては、試験例２（ポジティブコントロール）と同様に、有意に、メラニン生成抑制が確認できた。試験例３と試験例４との比較においては、試験例３では試験例４と比べ有意にメラニン生成抑制が確認できた。

（測定２：ＷＳＴ法によるメラノーマ細胞の細胞数測定）
Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて当該測定を行った。測定２で用いるための当該培養したサンプルに当該ｋｉｔ－８を入れた。当該入れた後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２時間培養した。当該培養後、「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）」の説明書に沿って４５０ｎｍの吸光度で、各群の発色を確認した。各群（ｎ＝４）で行った。当該確認したところ、各群において、コントロール群と比べて、発色の変化が見られなかった。この見られなかったことで、表２で示す結果が、培養した細胞において試料の添加等により細胞毒性が起きなかったことを示している。

（実験２：メラニン生成抑制試験）
所定の細胞（上述のメラノーマ細胞）に対して、試料（ロスマリン酸及び／又はルテオニングルクノニド）を添加することにより、所定の細胞において、メラニン生成に変化があるかを確認した。試料を添加する細胞として、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた。

（１）メラノーマ細胞の前培養工程
上述のメラノーマ細胞を上述の前培養培地（５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

（２）試料を添加しての本培養工程
当該（１）の前培養後、８．５×１０^４個／ウェルという細胞数で、メラノーマ細胞を各ウェル（本培養培地が存在するウェル、２４Ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に播種した。当該播種後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

この培養後、各ウェルの培地を新鮮な本培養培地に置換した。当該置換された培地（当該細胞が含有）に、表５に示す下記試料を添加した。なお、この試料の添加は、以下の群を作製するように行った。なお、この実験２では、アルブチンのメラニン生成抑制作用が知られていることから（日皮会誌：１０１（６）、６０９－６１３，１９９１）、ポジティブコントロールの試験例（試験例７）として、アルブチンを添加する群を設定した。

当該添加後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、７２時間（３日間）培養した。この７２時間の培養後、各群において、下記測定１で用いるための当該培養したサンプル及び下記測定２で用いるための当該培養したサンプルに分けた。

（測定２－１：メラニン量測定）
この測定１で用いるための当該培養したサンプルをトリプシン処理によって細胞を回収した。回収した細胞を溶液（１Ｎ ＮａＯＨ、１０％ＤＭＳＯ含有）に溶解した。４２０ｎｍの吸光度にて当該溶解した液の吸光度（試験例１から試験例７の吸光度）を各々測定した。当該測定した値をメラニン量とした。当該測定結果を表４に示す。

表６に示す数値（相対値）を次のように算出した。先ず、各群（ｎ＝３）の測定結果の吸光度を算出した。次に、当該平均値について、各群のコントロール群の数値を１００として、各群の数値はコントロール群と比較しての相対値を算出した。表２中の＊印は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、試験例６（数値を１００）との比較による有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

試験例８において、有意に、メラニン生成抑制が確認できた。

（実験３：メラニン生成抑制試験）
所定の細胞（上述のメラノーマ細胞）に対して、試料（ロスマリン酸及び／又はルテオニングルクノニド）を添加することにより、所定の細胞において、メラニン生成に変化があるかを確認した。試料を添加する細胞として、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた。

（１）メラノーマ細胞の前培養工程
上述のメラノーマ細胞を上述の前培養培地（５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

（２）試料を添加しての本培養工程
当該（１）の前培養後、８．５×１０^４個／ウェルという細胞数で、メラノーマ細胞を各ウェル（本培養培地が存在するウェル、２４Ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に播種した。当該播種後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で２４時間培養した。

この培養後、各ウェルの培地を新鮮な本培養培地に置換した。当該置換された培地（当該細胞が含有）に、表７に示す下記試料を添加した。なお、この試料の添加は、以下の群を作製するように行った。なお、この実験３では、アルブチンのメラニン生成抑制作用が知られていることから（日皮会誌：１０１（６）、６０９－６１３，１９９１）、ポジティブコントロールの試験例（試験例１０）として、アルブチンを添加する群を設定した。

当該添加後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、７２時間（３日間）培養した。この７２時間の培養後、各群において、下記測定１で用いるための当該培養したサンプル及び下記測定２で用いるための当該培養したサンプルに分けた。

（測定３－１：メラニン量測定）
この測定１で用いるための当該培養したサンプルをトリプシン処理によって細胞を回収した。回収した細胞を溶液（１Ｎ ＮａＯＨ、１０％ＤＭＳＯ含有）に溶解した。４２０ｎｍの吸光度にて当該溶解した液の吸光度（試験例１から試験例７の吸光度）を各々測定した。当該測定した値をメラニン量とした。当該測定結果を表８に示す。

表８に示す数値（相対値）を次のように算出した。先ず、各群（ｎ＝３）の測定結果の吸光度を算出した。次に、当該平均値について、各群のコントロール群の数値を１００として、各群の数値はコントロール群と比較しての相対値を算出した。表２中の＊印は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、試験例９（数値を１００）との比較による有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

試験例１１において、有意に、メラニン生成抑制が確認できた。

（実験４：ＭＭＰ－１の産生量の評価）
所定の細胞（正常ヒト新生児包皮皮膚繊維芽細胞）に対して、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α）の刺激を与え、その刺激後に、試料（ペパーミント抽出物及びニコチン酸アミドなど）を添加することにより、所定の細胞において、ＭＭＰ－１（マトリックスメタロプロテアーゼ）の産生量の変化を確認した。特許文献３に記載のように、ヒトの皮膚の菲薄化において、マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、ＭＭＰｓという）による細胞外マトリックスの分解が亢進されることが知られている。皮膚の菲薄化は、加齢により表皮および真皮が薄くなる肌老化の代表的な現象の一つである。当該ＭＭＰ－１の産生量が多いということは、皮膚の菲薄化が起こっていることが予想される。

行った実験手順を記載する。
５×１０^４個の正常ヒト表皮角化細胞を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、所定の条件（５％ＣＯ_２、３７℃）で、７５％コンフルエント状態になるまで前培養した。

この前培養後、０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換し、当該置換された培地（当該細胞が含有）に、表９示す下記試料を添加した。なお、当該試料の添加は、以下の群を作製するように行った。

当該試料の添加後、所定の条件（５％ＣＯ_２、３７℃）で７２時間の培養を行った。当該７２時間の培養後、培養液の上清を回収した。回収した上清中のＭＭＰ－１を、ＭＭＰ－１のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＭＭＰ－１の産生量を測定した。

ＭＭＰ－１の産生量を測定した結果を表１０に示す。表１０では、試験例１３の群の値を１００．００として、その他の群の数値は試験例１３の群と比較しての相対値を記載する。
表１０中の＊印は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、試験例１３の群（数値を１００．００）との比較による有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
表１０中の†印は、試験例１５の群と試験例１６の群について、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、試験例１４の群と比べての有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

表１０に示すように、特に試験例１５から１７においては、試験例１４に比べ、ＴＮＦ－αの刺激を受けた細胞における更なるＭＭＰ－１の産生量の抑制、が確認できた。

以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面を参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。

本発明は、例えば、主にヒトなどの皮膚での美白効果を発揮する剤などとして利用される。

Claims (3)

1. （Ａ）ロスマリン酸と、（Ｂ）ルテオニングルクロニドとの含有比率が、重量比にて、（Ａ）：（Ｂ）＝１：０．２～１．５である、美白剤。
2. トラネキサム酸を含有する、請求項１記載の美白剤。
3. ニコチン酸アミドを含有する、請求項１又は２に記載の美白剤。