JP2023052426A - 操作された免疫調節エレメントおよび変更された免疫 - Google Patents

操作された免疫調節エレメントおよび変更された免疫 Download PDF

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Abstract

【課題】養子免疫療法に使用される、操作された免疫細胞を提供する。【解決手段】本発明は、人工的に操作された免疫調節エレメントおよびそれを含む細胞を含む、人工的に変更された機能を有する免疫系に関する。特定の実施形態によれば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、ＤＧＫａ、ＤＧＫＱ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＰＰＰＺＲＺＤ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、ＴＥＴＺなどの人工的に操作された免疫調節遺伝子、および／または、それらの発現産物を含む免疫系が考えられる。【選択図】図１５

Description

本発明は、免疫効果が改善された、人工的に設計された免疫系に関する。より具体的には、本発明は、人工的に設計された免疫操作エレメントおよびそれを含む免疫細胞を含む、人工的に改変された免疫系に関する。
細胞治療剤は、再生を誘導する医薬品であり、生細胞を使用して、損傷または病変した細胞／組織／実体を回復する。これらは、自己細胞、同種異系細胞、または、異種細胞の物理的、化学的または生物学的操作（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ培養、増殖、選択または同様のものなど）によって生成される医薬品である。
それらのうち、免疫調節細胞治療剤は、免疫細胞（例えば、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞など）を使用して身体の免疫応答を調節することによって、疾患を治療する目的で使用される医薬品である。
現在、免疫調節細胞治療剤は主に、適応として癌治療を標的に開発されている。癌治療に従来使用されてきた外科療法、抗癌剤および放射線療法とは異なり、免疫調節細胞治療剤は、免疫細胞を患者に直接投与することを通して免疫機能を活性化することによって治療効果を獲得するという治療機構および治療有効性を有し、将来の新しい生物製剤の大部分を占めると予想される。
細胞に導入される抗原の物理的および化学的特性は、免疫調節細胞治療剤の種類に応じて互いに異なる。外来遺伝子がウイルスベクターなどの形態で免疫細胞に導入されるとき、これらの細胞は細胞治療剤および遺伝子治療剤の両方の特性を有することが可能になるであろう。
免疫調節細胞治療剤の投与は、様々な抗体およびサイトカインで様々な免疫細胞（例えば、アフェレシスで患者から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）を活性化し、次いで、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、患者に再度注入する、または、遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））が導入された免疫細胞を患者に再度注入することによって実行され得る。
ｅｘ ｖｉｖｏで生成される自己抗原特異的免疫細胞（例えばＴ細胞）の移入を伴う養子免疫療法は、様々な免疫疾患および癌を治療するための有望な手段になり得る。
近年、免疫細胞治療剤が、例えば自己免疫阻害剤としてなど様々に使用できること、および、抗癌機能を発揮することが報告された。このため、免疫細胞治療剤は、免疫応答を調整することによって様々な適応において使用できる。したがって、養子免疫療法に使用される、操作された免疫細胞の治療有効性の改善および発展に対する大きい需要がある。
例示的な実施形態として、本発明は、免疫効果が改善された、人工的に設計された免疫系を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された免疫調節因子およびそれを含む細胞を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、免疫細胞の機能を改変（例えば、増強または阻害）するための方法を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、有効成分として免疫調節因子および／または免疫機能が改変された免疫細胞を含む、免疫学的異常を伴う疾患の治療用途および／または予防的用途を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、免疫細胞の増殖、生存、細胞傷害性、透過、サイトカイン放出を増強することによって抗癌機能を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、ＤＧＫα、ＤＧＫζ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、ＴＥＴ２など、および／または、それらから発現される産物などの免疫調節遺伝子を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、免疫調節遺伝子の活性の調節に適用できるガイド核酸－エディタータンパク質複合体を含む免疫細胞のゲノムを編集するための組成物と、それを使用する方法とを提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、ＤＧＫα、ＤＧＫζ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、ＴＥＴ２などの免疫調節遺伝子を操作するために使用できるガイド核酸－エディタータンパク質複合体を提供する。
これらの課題を解決すべく、本発明は、免疫効果が改善された、人工的に設計された免疫系を提供する。より具体的には、本発明は、人工的に設計された免疫調節因子およびそれらを含む免疫細胞を含む、人工的に設計された免疫系に関する。
本発明は、特定の目的のために遺伝子操作または遺伝子改変された免疫調節因子を提供する。
「免疫調節因子」という用語は、免疫応答の形成および性能に関連して機能する物質であり、非天然、すなわち、人工的に設計されたものであり得る、免疫応答調節機能を有する様々な物質をすべて含む。例えば、免疫細胞において発現される、遺伝子設計または遺伝子改変された遺伝子またはタンパク質であり得る。
免疫調節因子は、免疫細胞の活性化または不活性化において機能し得る。免疫調節因子は、免疫応答を促進するように機能し得る（例えば、免疫細胞増殖調節因子、免疫細胞死調節因子、免疫細胞機能減失因子、または、サイトカイン分泌エレメントなど）。
本発明の例示的な実施形態において、免疫調節因子は、例えば、遺伝子設計または遺伝子改変された、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子またはＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
本発明の例示的な実施形態において、免疫調節因子は、２つ以上の遺伝子操作または遺伝子改変された遺伝子を含み得る。例えば、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子またはＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される２つ以上の遺伝子が人工的に操作または改変され得る。
本発明の好適な例として、免疫調節因子は、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子またはＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
このため、本発明の例示的な実施形態において、核酸配列における改変を受けた、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される、１または複数の人工的に操作された免疫調節因子が提供される。
核酸配列における改変は、これに限定されないが、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作され得る。
「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を通して形成される複合体を指し、核酸－タンパク質複合体は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含む。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は対象を改変するように機能し得る。対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
例えば、遺伝子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作された免疫調節遺伝子であり得る。
人工的に操作された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する１ｂｐ～５０ｂｐの連続塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子と異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、および、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、核酸の１または複数の改変を含む。
核酸の改変は、遺伝子のプロモーター領域において生じ得る。
核酸の改変は、遺伝子のエクソン領域において生じ得る。例示的な一実施形態において、改変の５０％は、遺伝子のコード領域の上流部分において生じ得る。
核酸の改変は、遺伝子のイントロン領域において生じ得る。
核酸の改変は、遺伝子のエンハンサー領域において生じ得る。
ＰＡＭ配列は、例えば、ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎの各々は独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎの各々は独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎの各々は独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎの各々は独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）の配列のうちの１または複数であり得る（５'から３'の方向で記述する）。
加えて、別の実施形態において、本発明は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸を提供する。
例えば、本発明は、以下で説明されるような群から選択される１または複数のガイド核酸を提供し得る。その群には、Ａ２０遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および１１の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、Ｄｇｋα遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１および２３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、ＰＤ－１遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、Ｄｇｋζ遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、１１０、１１１、１１２および１１３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、Ｔｅｔ－２遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、１２８および１２９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、ＰＳＧＬ－１遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２、２５４、２５７および２６４の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸がある。
ガイド核酸は、これに限定されないが、１８～２５ｂｐ、１８～２４ｂｐ、１８～２３ｂｐ、１９～２３ｂｐ、または、２０～２３ｂｐのヌクレオチドであり得る。
加えて、本発明は、１または複数の人工的に設計された免疫調節遺伝子と、それから発現された産物とを含む、人工的に操作された免疫細胞を提供する。
細胞は、これに限定されないが、免疫細胞および幹細胞である。免疫細胞は、免疫応答に関与する細胞であり、免疫応答に直接的に関与または間接的に関与するすべての細胞、および、その分化細胞が含まれる。
幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または、人工多能性幹細胞に由来する細胞（例えば、対象から生成され、操作されて変更され（例えば、変異を誘導され）、自己複製および分化能を有するｉＰＳ細胞）であり得る。
免疫細胞は、ＣＤ３陽性細胞であり得る。例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。
免疫細胞はＣＤ５６陽性細胞であり得る。例えば、ＮＫ９２一次ＮＫ細胞などのＮＫ細胞であり得る。
一実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ３およびＣＤ５６二重陽性細胞（ＣＤ３／ＣＤ５６二重陽性細胞）であり得る。例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞またはサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）であり得る。
具体的には、例えば、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、調節性Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ球系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、樹状細胞、サイトカイン誘導細胞（ＣＩＫ）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、および同様のものなどのＴ細胞から成る群から選択される少なくとも１つの種である。好ましくは、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞であり得る。
免疫細胞は、免疫調節遺伝子の活性を抑制または不活性化するように人工的に操作できる。
免疫細胞は更に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。
例として、Ｔ細胞は更に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または設計されたＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を含み得る。
免疫細胞は更に、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体、または、それをコードする核酸配列を含む。
エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである。例として、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質またはカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
ガイド核酸は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、ＤＧＫα、ＤＧＫζ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列の一部との相補結合を形成し得る。それにより、０～５、０～４、０～３または０～２個のミスマッチが生じ得る。好適な例として、ガイド核酸は、表１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列のうち１または複数との相補結合を形成するヌクレオチドであり得る。
例示的な例として、ガイド核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～１１（Ａ２０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１および２３（ＤＧＫＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（ＥＧＲ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８９（ＰＤ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、１１０、１１１、１１２および１１３（ＤＧＫζ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、１２８および１２９（Ｔｅｔ－２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２（ＰＳＧＬ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２、２５４、２５７および２６４（ＦＡＳ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５（ＫＤＭ６Ａ）の標的配列のうち１または複数との相補結合をそれぞれ形成するヌクレオチドであり得る。
本発明の例示的な実施形態において、免疫細胞は、核酸配列において改変を受けた、ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子から選択される少なくとも１つの人工的に設計された遺伝子を含む。
本発明の他の例示的な実施形態において、免疫細胞は、核酸配列において改変を受けた、人工的に設計されたＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子を含む。
例示的な実施形態において、本発明は、所望の免疫反応を引き起こすための組成物を提供する。それは、医薬組成物または治療用組成物と称され得る。
例示的な実施形態において、本発明は、遺伝子操作のための組成物を提供する。ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、および、エディタータンパク質またはそれをコードする核酸を含む。
関連する構成の説明は上記で説明されたものと同一である。
例示的な実施形態において、本発明は、免疫細胞を人工的に操作するための方法を提供する。当該方法は、人体から単離された免疫細胞を、（ａ）ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つであるエディタータンパク質とから選択される少なくとも１つに接触させる段階を含む。
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、各々が核酸配列の形態で１または複数のベクターに存在し得る、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の結合によって複合体を形成することによって存在し得る。
接触させる段階は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実行される。
接触させる段階は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、タンパク質移行ドメイン融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって実行される。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純疱疹ウイルスの群から選択される少なくとも１つである。
例示的な実施形態において、本発明は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２の群から選択される少なくとも１つの遺伝子をシーケンシングすることによって、対象における免疫細胞標的位置の配列に関する情報を提供するための方法を提供する。
加えて、本発明は、当該方法を通して提供される情報を使用してライブラリを構築するための方法を提供する。
例示的な実施形態において、本発明は、（ａ）ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、Ｔｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含むエディタータンパク質との成分を含む、遺伝子操作のためのキットを提供する。
これらのキットは、所望の遺伝子を人工的に操作するために使用できる。
例示的な一実施形態において、本発明は、遺伝子設計された免疫細胞または幹細胞などの人工的に操作された免疫細胞の対象への投与を含む免疫治療アプローチを使用する、疾患の治療用途のすべての態様を提供する。これは特に、養子免疫療法に有用である。
治療の標的は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳類であり得る。
［発明の有利な効果］
効果的な免疫細胞療法の産物は、人工的に操作された免疫調節因子およびそれを含む細胞によって機能が人工的に操作された免疫系によって取得できる。
例えば、免疫調節因子が、本発明の方法または組成物によって人工的に制御されるとき、免疫細胞の生存、増殖、持続性、細胞傷害性、サイトカイン放出および／または透過などに関与する免疫効果が改善され得る。
細胞におけるＣＤ２５の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示すグラフであり、ＤＧＫ－アルファ遺伝子は、ＤＧＫ－アルファのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ＃１１として示される）を使用してノックアウトされている。
細胞におけるＣＤ２５のＭＦＩを示すグラフであり、Ａ２０遺伝子は、Ａ２０のｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０＃１１として示される）を使用してノックアウトされている。
細胞におけるＣＤ２５のＭＦＩを示すグラフであり、ＥＧＲ２遺伝子は、ＥＧＲ２のｓｇＲＮＡ（＃１、ＥＧＲ２＃１として示される）を使用してノックアウトされている。
細胞におけるＣＤ２５のＭＦＩを示すグラフであり、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子は、ＰＰＰ２Ｒ２ＤのｓｇＲＮＡ（＃１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ＃１０として示す）を使用してノックアウトされている。
それぞれ、ＤＧＫ－アルファ遺伝子が、ＤＧＫアルファのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ＃１１として示される）を使用してノックアウトされている細胞と、Ａ２０遺伝子が、Ａ２０のｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０＃１１として示される）を使用してノックアウトされている細胞と、ＥＧＲ２遺伝子が、ＥＧＲ２のｓｇＲＮＡ（＃１、ＥＧＲ２＃１として示される）を使用してノックアウトされている細胞とにおける培地のＩＦＮ－ガンマレベルを示すグラフである（ＩＦＮ－ガンマレベルの単位：ｐｇ／ｍＬ）。
それぞれ、ＤＧＫアルファ遺伝子がＤＧＫアルファのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ＃１１として示される）を使用してノックアウトされている細胞と、ＤＧＫ－アルファ遺伝子がＤＧＫアルファのｓｇＲＮＡ（＃８および＃１１を組み合わせて使用、ＤＧＫ－アルファ＃８＋１１として示される）を使用してノックアウトされている細胞と、ＤＧＫ－ゼータ遺伝子がＤＧＫ－ゼータのｓｇＲＮＡ（＃５、ＤＧＫ－ゼータ＃５として示される）を使用してノックアウトされている細胞と、Ａ２０遺伝子がＡ２０のｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０＃１１として示される）を使用してノックアウトされている細胞とにおける培地のＩＦＮ－ガンマレベルを示すグラフである（ＩＦＮ－ガンマレベルの単位：ｐｇ／ｍＬ）。
それぞれ、ＤＧＫ－アルファ遺伝子がＤＧＫ－アルファ＃１１を使用してノックアウトされている細胞と、ＤＧＫ－アルファ遺伝子がＤＧＫ－アルファ＃８＋１１を使用してノックアウトされている細胞と、ＤＧＫ－ゼータ遺伝子がＤＧＫ－ゼータ＃５を使用してノックアウトされている細胞と、Ａ２０遺伝子がＡ２０＃１１を使用してノックアウトされている細胞とにおける培地のＩＬ－２レベルを示すグラフである（ＩＬ－２レベルの単位：ｐｇ／ｍＬ）。
ヒト一次Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＤＧＫ遺伝子のノックアウト結果を示す。（Ａ）では、ヒト一次Ｔ細胞における遺伝子ノックアウトのタイムライン（ＣＤ３／ＣＤ２８ビードによる細胞活性化、１３９ＣＡＲのレンチウイルス移入、エレクトロポレーションｄを使用したＤＧＫ遺伝子のノックアウト）が確認され、（Ｂ）では、Ｍｉ－ｓｅｑシステムを使用してＤｇｋαおよびＤｇｋζのインデル効率が確認される。 オフターゲット解析の結果を示すグラフを示す。
ＤＧＫ遺伝子のノックアウトによる、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクターおよび増殖の改善の効果を示すグラフを示す。（Ａ）フローサイトメトリーを使用した、７－ＡＡＤ陽性Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞の測定による、１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性の評価結果、および、（Ｂ）ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２キット、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によるサイトカイン分泌能アッセイの結果が示される。 フローサイトメトリーを使用した、１３９ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能の評価結果を示すグラフを示す。
ＤＧＫノックアウトの抗原曝露後の１３９ＣＡＲ発現の増強、および、ＣＤ３末端におけるシグナリングの増幅の結果を示す。（Ａ）は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビードで刺激された１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞のリン酸化ＥＲＫシグナルに関するウエスタンブロット結果を示し、（Ｂ）は、フローサイトメトリーを使用した１３９ＣＡＲ発現の結果を示す（左：抗原の曝露の存在に応じたＣＡＲ発現、右：抗原曝露３日後のＣＡＲ発現の比較）。
ＤＧＫノックアウトがトニック活性およびＴ細胞疲弊を誘導しない結果を示すグラフを示す。（Ａ）は、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γ分泌能の評価を示し、（Ｂ）は、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞（すなわちＰＤ－１（左）およびＴＩＭ－３（右））における疲弊マーカーの解析結果を示す。
ＤＧＫノックアウトＴ細胞がＴＧＦ－βおよびＰＧＥ２の免疫抑制効果を回避する結果を示すグラフを示す。（Ａ）は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在に応じた、１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞および１３９ＤＧＫαζ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性、ＩＦＮ－γ分泌能、ＩＬ－２分泌能の評価を示し、（Ｂ）は、ＰＧＥ２（０．５μｇ／ｍＬ）の存在に応じた、１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞および１３９ＤＧＫαζ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性、ＩＦＮ－γ分泌能、および、ＩＬ－２分泌能の評価を示す。
ＤＧＫαのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト効率、および、ヒトＮＫ細胞におけるエフェクター機能への効果の結果を示すグラフを示す。（Ａ）および（Ｂ）は、Ｍｉ－ｓｅｑシステムを使用した、ＮＫ－９２細胞およびヒト一次ＮＫ細胞におけるノックアウト効率解析を示すグラフを示し、（Ｃ）は、７－ＡＡＤ陽性Ｒａｊｉ細胞の測定による、ＮＫ－９２の殺傷活性を示すグラフを示す。
ヒトＮＫＴ細胞におけるＤＧＫαおよびＤＧＫζのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト効率の結果を示す。（Ａ）はインデル効率の評価結果を示し、（Ｂ）は細胞増殖の評価結果を示し、（Ｃ）は細胞生存能力の評価結果を示し、（Ｄ）はタンパク質のレベルで発現の存在を識別するためのウエスタンブロット実験結果を示す。
ヒトＮＫＴ細胞におけるエフェクター機能に対するＤＧＫαおよびＤＧＫζの効果を示すグラフを示す。ＤＧＫαおよびＤＧＫζのそれぞれのノックアウトおよび同時のノックアウトの、（Ａ）殺傷活性と、（Ｂ）ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ－キット、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によるＩＦＮ－γ分泌能とに対する効果が確認された。
ヒトＮＫＴ細胞におけるＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトの機能性評価のために、ＮＫＴ細胞においてＰＡ－１がノックアウトされた後の（Ａ）インデル効率および（Ｂ）細胞傷害性の改善（すなわち、殺傷活性の改善）を示すグラフを示す。
ジャーカット細胞におけるｈＰＳＧＬ－１ ｓｇＲＮＡのスクリーニングについての解析結果を示すグラフを示す。インデル効率、および、ノックアウト後にＰＳＧＬ－１が発現されないジャーカット細胞の程度を示す。 ノックアウト後にジャーカット細胞の表面上で発現されるＰＳＧＬ－１発現の程度を示す。 ノックアウト後にジャーカット細胞の表面上で発現されるＰＳＧＬ－１発現の程度を示す。
ヒト一次Ｔ細胞におけるｈＰＳＧＬ－１ノックアウト（ＫＯ）実験の結果を示すグラフを示す。（Ａ）はインデル効率を示し、（Ｂ）は、ノックアウト後にＰＳＧＬ－１が発現されないＴ細胞の程度を示す。（Ｃ）は、ノックアウト後にＴ細胞の表面上で発現されるＰＳＧＬ－１発現の程度を示す。
特別の定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味と同一である。本明細書で説明されるものと同様または同一の方法および物質を、本発明の実施または試験において使用できるが、以下では好適な方法および物質を説明する。本明細書で言及されるすべての公報、特許出願、特許、および、他の参照文献は、参照によって全体が組み込まれる。加えて、物質、方法、例は、説明を目的とするものに過ぎず、これらに限定されることを意図するものではない。
本発明は、免疫効果が改善された、人工的に操作された免疫系に関する。より具体的には、人工的に操作された免疫調節因子、および、それを含む細胞を含む、人工的に改変された免疫系に関する。
［免疫調節因子］
「免疫調節因子」という用語は、免疫応答の形成および性能に関連して機能する物質のことであり、非天然、すなわち、人工的に操作されたものであり得る、調節免疫応答が可能な様々な物質すべてを含む。例えば、免疫調節因子は、免疫細胞において発現される、遺伝子操作または遺伝子改変された遺伝子またはタンパク質であり得る。
「人工的に操作された」という用語は、天然状態で生じるそのまままの状態ではなく、人工的改変が適用された状態を意味する。
「遺伝子操作」という用語は、遺伝子改変の人工的適用の操作が、本発明において言及される生物学的または非生物学的物質に対して実行される場合を意味し、例えば、特定の目的でゲノムが人工的に改変された遺伝子および／または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、タンパク質など）であり得る。
好適な例として、本発明は、特定の目的のために遺伝子操作または遺伝子改変された免疫調節因子を提供する。
以下で列挙するエレメントは、免疫調節因子の例に過ぎず、従って、本発明が包含する免疫調節因子の種類を限定するものではない。以下で列挙される遺伝子またはタンパク質は、１種類のみの免疫調節機能を有しなくてよく、複数の種類の機能を有し得る。加えて、必要な場合、２つ以上の免疫調節因子が提供され得る。
［免疫細胞活性調節エレメント］
「免疫細胞活性調節エレメント」という用語は、免疫応答の程度または活性を調節するように機能するエレメントのことであり、例えば、免疫応答の程度または活性を調節するように機能する、遺伝子操作または遺伝子改変された遺伝子またはタンパク質であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントは、免疫細胞の活性または不活性に関連する機能を実行できる。
免疫細胞活性調節エレメントは、免疫応答を刺激または改善するように機能できる。
免疫細胞活性調節エレメントは免疫応答を抑制するように機能できる。
免疫細胞活性調節エレメントは、細胞膜のチャネルタンパク質および受容体に結合でき、それにより、免疫応答を調節するシグナル伝達に関連する機能、および、タンパク質の合成および分解に関連する機能を実行できる。
例えば、免疫細胞活性調節エレメントは、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈタンパク質（ＰＤ－１）であり得る。
ＰＤ－１遺伝子（ＰＤＣＤ１遺伝子とも称され、以降、ＰＤ－１遺伝子およびＰＤＣＤ１遺伝子は、同一遺伝子を意味するように使用される）とは、分化抗原群２７９（ＣＤ２７９）とも称されるタンパク質ＰＤ－１をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＰＤ－１遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５０１８．２、ＮＧ＿０１２１１０．１などとして表現されるＰＤ－１遺伝子など、ヒトＰＤ－１をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２など）の遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）であり得る。
ＣＴＬＡ－４遺伝子とは、分化抗原群１５２（ＣＤ１５２）とも称されるタンパク質ＣＴＬＡ－４をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＣＴＬＡ－４遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１０３７６３１．２、ＮＭ＿００５２１４．４、ＮＧ＿０１１５０２．１などとして表現されるＣＴＬＡ－４遺伝子など、ヒトＣＴＬＡ－４をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３２７２０．１、ＮＰ＿００５２０５．２など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントはＣＢＬＢであり得る。
免疫細胞活性調節エレメントはＰＳＧＬ－１であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントはＩＬＴ２であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントはＫＩＲ２ＤＬ４であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントはＳＨＰ－１であり得る。
上記の遺伝子は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳類に由来し得る。
一実施形態において、免疫細胞活性調節エレメントは、免疫応答を刺激するように機能し得る。
免疫細胞活性調節エレメントは免疫細胞増殖調節エレメントであり得る。
「免疫細胞増殖調節エレメント」という用語は、例えば、免疫細胞において発現される遺伝子またはタンパク質など、免疫細胞におけるタンパク質合成を調節することなどによって免疫細胞の増殖を調節するように機能するエレメントを指す。
免疫細胞増殖調節エレメントは、ＤＮＡ転写、ＲＮＡ翻訳、および、細胞分化において機能し得る。
免疫細胞増殖調節エレメントの例は、ＮＦＡＴ、ＩκＢ／ＮＦ－κＢ、ＡＰ－１、４Ｅ－ＢＰ１、ｅＩＦ４ＥおよびＳ６の発現経路に関与する遺伝子またはタンパク質であり得る。
例えば、免疫細胞増殖調節エレメントはＤＧＫ－アルファであり得る。
ＤＧＫＡ（Ｄｇｋ－アルファ）遺伝子は、タンパク質ジアシルグリセロールキナーゼアルファ（ＤＧＫＡ）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＤＧＫＡ遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３４５．４、ＮＭ＿２０１４４４．２、ＮＭ＿２０１４４５．１、ＮＭ＿２０１５５４．１、ＮＣ＿００００１２．１２などとして表現されるＤＧＫＡ遺伝子など、ヒトＤＧＫＡをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１３３６．２、ＮＰ＿９５８８５２．１、ＮＰ＿９５８８５３．１、ＮＰ＿９６３８４８．１など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＤＧＫ－ゼータであり得る。
ＤＧＫＺ（Ｄｇｋ－ゼータ）遺伝子は、タンパク質ジアシルグリセロールキナーゼゼータ（ＤＧＫＺ）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＤＧＫＺ遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１０５５４０．１、ＮＭ＿００１１９９２６６．１、ＮＭ＿００１１９９２６７．１、ＮＭ＿００１１９９２６８．１、ＮＭ＿００３６４６．３、ＮＭ＿２０１５３２．２、ＮＭ＿２０１５３３．３、ＮＧ＿０４７０９２．１などとして表現されるＤＧＫＺ遺伝子など、ヒトＤＧＫＺをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０９９０１０．１、ＮＰ＿００１１８６１９５．１、ＮＰ＿００１１８６１９６．１、ＮＰ＿００１１８６１９７．１、ＮＰ＿００３６３７．２、ＮＰ＿９６３２９０．１、ＮＰ＿９６３２９１．２など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＥＧＲ２であり得る。
ＥＧＲ２遺伝子は、初期増殖応答タンパク質２（ＥＧＲ２）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＥＧＲ２遺伝子は、これに限定されないが、以下から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＥＧＲ３であり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＰＰＰ２Ｒ２Ｄであり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）であり得る。
免疫細胞増殖調節エレメントはＰＳＧＬ－１であり得る。
上記遺伝子は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳類に由来し得る。
免疫細胞活性調節エレメントは免疫細胞死調節エレメントであり得る。
「免疫細胞死調節エレメント」という用語は、免疫細胞の死に関して機能するエレメントを指し、そのような機能を実行する、免疫細胞において発現する遺伝子またはタンパク質であり得る。
免疫細胞死調節エレメントは、免疫細胞のアポトーシスまたはネクローシスに関連する機能を実行できる。
一実施形態において、免疫細胞死調節エレメントは、カスパーゼカスケード関連タンパク質または遺伝子であり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＦａｓであり得る。以降、タンパク質または遺伝子に言及するとき、タンパク質もしくは遺伝子が作用する受容体または結合領域を操作できることは、当業者にとって明らかである。
別の実施形態において、免疫細胞死調節エレメントは、細胞死ドメイン関連タンパク質または遺伝子であり得る。特に、免疫細胞死調節エレメントはＤａｘｘであり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＢｃｌ－２ファミリータンパク質であり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＢＨ－３のみのファミリータンパク質であり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＢｉｍであり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＢｉｄであり得る。
免疫細胞死調節エレメントはＢＡＤであり得る。
免疫細胞死調節エレメントは、リガンド、または、免疫細胞外膜に位置する受容体であり得る。
特に、免疫細胞死調節エレメントはＰＤ－１であり得る。
追加的に、免疫細胞死調節エレメントはＣＴＬＡ－４であり得る。
免疫細胞活性調節エレメントは免疫細胞疲弊調節エレメントであり得る。
「免疫細胞疲弊調節エレメント」という用語は、免疫細胞の機能の進行性消失に関連する機能を実行するエレメントであり、そのような機能を実行する免疫細胞において発現される遺伝子またはタンパク質であり得る。
免疫細胞疲弊調節エレメントは、免疫細胞の不活性化に関与する遺伝子の転写または翻訳を助けるように機能できる。
特に、転写を支援する機能は、対応する遺伝子を脱メチル化する機能であり得る。
加えて、免疫細胞の不活性化に関与する遺伝子は、免疫細胞活性調節エレメントの遺伝子を含む。
特に、免疫細胞疲弊調節エレメントはＴＥＴ２であり得る。
例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１２７２０８．２、ＮＭ＿０１７６２８．４、ＮＧ＿０２８１９１．１などとして表現されるＴＥＴ２遺伝子など、ヒトをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２０６８０．１、ＮＰ＿０６００９８．３など）。
免疫細胞疲弊調節エレメントは、免疫細胞の過剰成長に参加するように機能できる。過剰成長を経て再生しない免疫細胞は、機能を消失する。
特に、免疫細胞疲弊調節エレメントはＷｎｔであり得る。以降、タンパク質または遺伝子が言及されるとき、シグナル伝達経路におけるタンパク質または遺伝子（当該シグナル伝達経路には、当該タンパク質が含まれ、受容体には当該遺伝子が作用する）、および、結合領域を操作できることは、当業者にとって明らかである。
加えて、免疫細胞疲弊調節エレメントはＡｋｔであり得る。以降、タンパク質または遺伝子が言及されるとき、シグナル伝達経路におけるタンパク質または遺伝子（当該シグナル伝達経路には、当該タンパク質が含まれ、受容体には当該遺伝子が作用する）、および、結合領域を操作できることは、当業者にとって明らかである。
免疫細胞活性調節エレメントはサイトカイン産生調節エレメントであり得る。
「サイトカイン産生調節エレメント」という用語は、免疫細胞のサイトカインの分泌に関与する遺伝子またはタンパク質であり、そのような機能を実行する、免疫細胞において発現する遺伝子またはタンパク質であり得る。
サイトカインとは、免疫細胞によって分泌されるタンパク質を指す総称であり、ｉｎ ｖｉｖｏで重要な役割を果たすシグナルタンパク質である。サイトカインは、感染、免疫、炎症、外傷、腐敗、癌などに関与する。サイトカインは細胞から分泌され、次いで、他の細胞またはそれらを分泌する細胞に影響を与えることができる。例えば、マクロファージの増殖を誘導でき、または、分泌細胞自体の分化を促進できる。しかしながら、過剰な量のサイトカインが分泌されるとき、正常細胞を攻撃するなどの問題を引き起こし得るので、サイトカインの適切な分泌も免疫応答において重要である。
サイトカイン産生調節エレメントは、好ましくは、例えば、ＴＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－αの経路における遺伝子またはタンパク質であり得る。
代替的に、サイトカインは他の免疫細胞にシグナルを伝達することにより、認識された抗原を有する細胞を傷害するように免疫細胞を誘導する、または、分化を支援するように機能し得る。特に、サイトカイン産生調節エレメントは、好ましくは、ＩＬ－２分泌に関する遺伝子経路における遺伝子またはタンパク質であり得る。
一実施形態において、免疫調節因子は、免疫細胞において発現される分子の群を指し得る。これらの分子は、免疫応答を下方制御／上方制御する、または、阻害／促進するように効果的に機能できる。
例えば、Ｔ細胞が発現する分子の群として、「免疫チェックポイント」は、これらに限定されないが、免疫細胞を直接阻害する、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９、アクセッション番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４またはＣＤ１５２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３、アクセッション番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２、アクセッション番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＩＶＳＴＭ３、アクセッション番号：ＮＭ＿１７３７９９）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、アクセッション番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ，ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ，ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３であり得る。
本発明の一実施形態において、免疫調節因子は、例えば、遺伝子操作または遺伝子改変されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
本発明の一実施形態において、免疫調節因子は、２つ以上の遺伝子操作または遺伝子改変された遺伝子を含み得る。例えば、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される２つ以上の遺伝子が操作または改変され得る。
本発明のこれらの遺伝子の好適な例は、遺伝子操作または遺伝子改変されたＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＰＳＧＬ－１およびＫＤＭ６Ａ遺伝子を含み得る。
遺伝子操作または遺伝子改変は、野性型遺伝子のゲノム配列のすべての領域または部分領域に人工的な挿入、欠失、置換、逆位の変異を誘導することによって実現され得る。加えて、遺伝子操作または遺伝子改変は、２つ以上の遺伝子の遺伝子操作または遺伝子改変の融合によっても実現され得る。
例えば、これらの遺伝子は、そのような遺伝子操作または遺伝子改変によって不活性化され得て、その結果、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質が、元の機能を有するタンパク質の形態で発現されることが防止される。
例えば、これらの遺伝子は更に、そのような遺伝子操作または遺伝子改変によって活性化され得て、それにより、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質が、元の機能と比較してより改善された機能を有するタンパク質の形態で発現される。一例として、特定の遺伝子によりコードされるタンパク質の機能がＡであるとき、操作された遺伝子によって発現されるタンパク質の機能は、Ａとは完全に異なってよく、または、Ａを含む追加の機能（Ａ＋Ｂ）を有し得る。
例えば、遺伝子操作または遺伝子改変は、互いに異なる、または、互いに相補的な機能を有する２つ以上の遺伝子を使用することによって、２つ以上のタンパク質が融合形態で発現されるというものであり得る。
例えば、遺伝子操作または遺伝子改変は、互いに異なる、または、互いに相補的な機能を有する２つ以上の遺伝子を使用することによって、２つ以上のタンパク質が、分離した独立の形式で細胞内で発現されるというものであり得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
一実施形態において、遺伝子の操作または改変は、改変される遺伝子（以降、「標的遺伝子」）の全部または一部の欠失、例えば、標的遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド（例えば、１～３０ヌクレオチド、１～２７ヌクレオチド、１～２５ヌクレオチド、１～２３ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１５ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、または１ヌクレオチド）の欠失と、標的遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド（例えば、元（野性型）と１～３０ヌクレオチド、１～２７ヌクレオチド、１～２５ヌクレオチド、１～２３ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１５ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、または、１ヌクレオチド異なる）の置換と、標的遺伝子の任意の場所への１または複数のヌクレオチド（例えば、１～３０ヌクレオチド、１～２７ヌクレオチド、１～２５ヌクレオチド、１～２３ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１５ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、または、１ヌクレオチド）の挿入とのうち１または複数によって誘導され得る。
改変される標的遺伝子の部分（「標的領域」）は、遺伝子における、１ｂｐ以上、３ｂｐ以上、５ｂｐ以上、７ｂｐ以上、１０ｂｐ以上、１２ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、２０ｂｐ以上（例えば、１ｂｐ～３０ｂｐ、３ｂｐ～３０ｂｐ、５ｂｐ～３０ｂｐ、７ｂｐ～３０ｂｐ、１０ｂｐ～３０ｂｐ、１２ｂｐ～３０ｂｐ、１５ｂｐ～３０ｂｐ、１７ｂｐ～３０ｂｐ、２０ｂｐ～３０ｂｐ、１ｂｐ～２７ｂｐ、３ｂｐ～２７ｂｐ、５ｂｐ～２７ｂｐ、７ｂｐ～２７ｂｐ、１０ｂｐ～２７ｂｐ、１２ｂｐ～２７ｂｐ、１５ｂｐ～２７ｂｐ、１７ｂｐ～２７ｂｐ、２０ｂｐ～２７ｂｐ、１ｂｐ～２５ｂｐ、３ｂｐ～２５ｂｐ、５ｂｐ～２５ｂｐ、７ｂｐ～２５ｂｐ、１０ｂｐ～２５ｂｐ、１２ｂｐ～２５ｂｐ、１５ｂｐ～２５ｂｐ、１７ｂｐ～２５ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、１ｂｐ～２３ｂｐ、３ｂｐ～２３ｂｐ、５ｂｐ～２３ｂｐ、７ｂｐ～２３ｂｐ、１０ｂｐ～２３ｂｐ、１２ｂｐ～２３ｂｐ、１５ｂｐ～２３ｂｐ、１７ｂｐ～２３ｂｐ、２０ｂｐ～２３ｂｐ、１ｂｐ～２０ｂｐ、３ｂｐ～２０ｂｐ、５ｂｐ～２０ｂｐ、７ｂｐ～２０ｂｐ、１０ｂｐ～２０ｂｐ、１２ｂｐ～２０ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、１７ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、１８ｂｐ～２２ｂｐ、または、２１ｂｐ～２３ｂｐ）の連続ヌクレオチド配列領域であり得る。
［免疫調節因子を含む細胞］
本発明の一態様は、人工的に操作された免疫調節因子を含む細胞に関する。
細胞は、これに限定されないが、免疫細胞および幹細胞である。
本発明の「免疫細胞」とは、免疫応答に関与する細胞であり、免疫応答に直接的または間接的に関与するすべての細胞と、それらの分化前細胞とを含む。
免疫細胞は、サイトカイン分泌、他の免疫細胞への分化、および、細胞傷害性の機能を有し得る。免疫細胞は、天然状態からの変異を経た細胞も含む。
免疫細胞は、骨髄における造血幹細胞から分化し、概ね、リンパ球系前駆細胞および骨髄前駆細胞を含み、また、リンパ球系前駆細胞が分化する、獲得免疫を担うＴ細胞およびＢ細胞のすべてと、骨髄前駆細胞から分化する、マクロファージ、好酸球、好中球、好塩基、巨核球、赤血球などとを含む。
具体的には、細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ球系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、樹状細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞などから成る群から選択される少なくとも１つであり得る。マクロファージおよび樹状細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と称され得て、その細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞表面上のＴＣＲと相互作用するとき、Ｔ細胞を活性化することが可能な特殊化した細胞である。代替的に、任意の造血幹細胞または免疫系細胞は、ＴＣＲまたは他の抗原結合タンパク質（例えばＣＡＲ）によって認識される抗原発現核酸分子を導入することによってＡＰＣに変換できる。
一実施形態において、免疫細胞は、ＭＨＣ認識および／または免疫機能に関連するタンパク質（例えば免疫チェックポイントタンパク質）を合成する遺伝子の不活性化または交換によって免疫療法として使用される細胞であり得る。
一実施形態において、免疫細胞は更に、短鎖をコードするポリヌクレオチド、および、特異的な細胞認識のためのマルチサブユニット受容体（例えばＣＡＲ、ＴＣＲなど）を含み得る。
一実施形態において、本発明の免疫細胞は、健康なドナーまたは患者の血液（例えば末梢血）、幹細胞（例えば胚性幹細胞、人工多能性幹細胞など）、臍帯血、骨髄などに由来するものであり得る、または、ｅｘ ｖｉｖｏで操作されたものであり得る。
一実施形態において、免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞などのＣＤ３陽性細胞であり得る。ＣＤ３は、Ｔ細胞表面上でＴＣＲおよび様々なタンパク質が複合体として存在する受容体である。γ、δ、ε、ζ、η鎖と称される５種類のタンパク質がＣＤ３を構成し、これらは、ＴＣＲと共に、αβ:γδεζζまたはαβ:γδεζηの状態でＴＣＲ／ＣＤ３複合体として存在する。これらは、Ｔ細胞の抗原認識中に細胞内へシグナル伝達する機能を有することが知られている。
一実施形態において、免疫細胞は、例えば、ＮＫ細胞（例えば、ＮＫ９２細胞および一次ＮＫ細胞）などのＣＤ５６陽性細胞であり得る。
ＮＫ細胞の数は、免疫細胞の中で３番目に大きく、末梢血免疫細胞の約１０％はＮＫ細胞である。ＮＫ細胞はＣＤ５６およびＣＤ１６を有し、肝臓または骨髄において成熟する。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を攻撃する。ＮＫ細胞は異常細胞を認識したとき、穿孔されるべき細胞膜を溶解するために細胞膜に対してパーフォリンを噴霧し、細胞質を分解してアポトーシスを引き起こすためにグランザイムを細胞膜の内側に噴霧し、ネクローシスを引き起こすために水および生理食塩水を細胞に注入する。ＮＫ細胞は様々な種類の癌細胞を傷害する能力を有する。特に、ＮＫ細胞は、外来遺伝子物質が容易に導入されない細胞として知られている。
一実施形態において、ＮＫ細胞は、二重陽性細胞、例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞またはサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞であり得る。
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞またはサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞は、ＣＤ３（すなわちＴ細胞マーカー）およびＣＤ５６（すなわちナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）マーカー）分子を同時に発現する免疫細胞である。ＮＫＴ細胞またはＣＩＫ細胞は、Ｔ細胞に由来し、両方ともＮＫ細胞の特性および機能を有するため、これらの細胞は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に関係なく腫瘍細胞を傷害する。特に、ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＮＫ細胞特異的表面マーカーＮＫ１．１またはＮＫＲ－Ｐ１Ａ（ＣＤ１６１）を発現する細胞である。
一例において、ＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩと同様の構造を有する単形性タンパク質であるＣＤ１ｄによって提示される糖脂質を認識できる。ＮＫＴ細胞は、α－ＧａｌＣｅｒなどのリガンドによって活性化されるとき、幅広い様々なサイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－γ）を分泌する。加えて、ＮＫＴ細胞は抗腫瘍活性を有する。
別の例において、ＣＩＫ細胞は、採取した血液をインターロイキン２およびＣＤ３抗体で処理してｅｘ ｖｉｖｏで２～３週間培養したときに増殖する免疫細胞の一種であり、ＣＤ３およびＣＤ５６陽性細胞である。ＣＩＫ細胞は大量のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αを生成する。
一実施形態において、細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または、自己複製および分化能を有する人工多能性幹細胞に由来する細胞（例えば、ｉＰＳ細胞由来細胞）であり得る。
本発明の好適な実施形態として、細胞は、免疫調節因子である、操作または改変された遺伝子を含み得る。
細胞は、操作または改変された遺伝子の全部または一部、または、その発現産物を含み得る。
例えば、細胞は、遺伝子操作または遺伝子改変を介して、対応する遺伝子を不活性化することにより、遺伝子によってコードされるタンパク質が、その元の機能を有するタンパク質の形態で発現されないものであり得る。
例えば、細胞は、そのような遺伝子操作または遺伝子改変を介して、対応する遺伝子を更に活性化することにより、遺伝子によってコードされるタンパク質が、その元の機能と比較して機能が改善されたタンパク質の形態で発現されるものであり得る。
例えば、細胞は、そのような遺伝子操作または遺伝子改変を介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が、その元の機能および／または追加の機能を発揮するタンパク質の形態で発現されるものであり得る。
例えば、細胞は、そのような遺伝子操作または遺伝子改変を介して、２つ以上のタンパク質が、互いに異なる、または、互いに相補的な２つ以上の遺伝子を使用して、改変形態で発現されるものであり得る。
例えば、細胞は、そのような遺伝子操作または遺伝子改変を介して、３種類のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の高いサイトカイン産生能または分泌能を有する免疫細胞であり得る。
一例において、本発明の細胞は更に、以下の構成を含み得る。
［受容体］
本発明の細胞は「免疫受容体」を含み得る。
人工的に操作または改変された免疫細胞の表面上に存在する受容体である「免疫受容体」という用語は、例えば、抗原を認識し特定の機能を実行する機能実体など、免疫応答に関与する物質を指す。
受容体は野性型または人工的に操作された状態であり得る。
受容体は抗原への親和性を有し得る。
受容体は、ＭＨＣ構造タンパク質と当該構造タンパク質において曝されている抗原とによって形成される構造への認識能力を有し得る。
受容体は免疫応答シグナルを生成し得る。
「免疫応答シグナル」という用語は、免疫応答プロセスを生じさせる任意のシグナルを指す。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の増殖および分化に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の細胞死に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは免疫細胞の活性に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の補助に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、関心のある遺伝子の発現を調節するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、サイトカインの合成を促進または阻害するものであり得る。
免疫応答シグナルは、サイトカインの分泌を促進または阻害するものであり得る。
免疫応答シグナルは、他の免疫細胞の増殖または分化を助けるシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、他の免疫細胞の活性を調節するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、シグナルが生じる位置に他の免疫細胞を引き付けるシグナルであり得る。
一実施形態において、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
一実施形態において、細胞は、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）を細胞が含むことができるように改変されたものであり得る。別の実施形態において、ＴＣＲは、腫瘍関連抗原（例えば、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、ＮＹ－ＥＳＯ１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＰ１００など）に対する結合特異性を有するものであり得る。
一実施形態において、受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）であり得る。 受容体は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞活性化に関与する共受容体であるＣＤ４およびＣＤ８であり得る。受容体はＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）であり得る。受容体はＣＤ２８であり得る。受容体は、Ｔ細胞の応答を増幅する受容体であるＣＤ１３７および４－１ＢＢであり得る。受容体は、Ｔ細胞抗原受容体のシグナル伝達エレメントであるＣＤ３ζであり得る。受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
本発明の一実施形態において、受容体は、人工的に操作された人工受容体であり得る。
「人工受容体」というという用語は、野性型受容体ではなく人工的に調製された、抗原を認識し特定の機能を実行する特定の能力を有する機能実体を指す。
そのような人工受容体は、特定の抗原に対する認識が改善または増強された免疫応答シグナルを生成でき、免疫応答の改善に貢献できる。
人工受容体は、一例として、以下の構成を有し得る。
（ｉ）抗原認識部分
人工受容体は抗原認識部分を含む。
「抗原認識部分」という用語は、抗原を認識する領域を指す人工受容体の部分である。
抗原認識部分は、野性型受容体と比較して、特定の抗原の認識が改善されたものであり得る。特に、特定の抗原は、癌細胞の抗原であり得る。加えて、特定の抗原は、身体における一般的な細胞の抗原であり得る。
抗原認識部分は、抗原に対する結合親和性を有し得る。
抗原認識部分は、抗原に結合している間にシグナルを生成し得る。シグナルは電気的シグナルであり得る。シグナルは化学的シグナルであり得る。
抗原認識部分はシグナル配列を含み得る。
シグナル配列は、タンパク質合成のプロセス中に、タンパク質を特定の部位に移送することを可能にするペプチド配列を指す。
シグナル配列は、抗原認識部分のＮ末端の近くに位置し得る。特に、Ｎ末端からの距離は、約１００アミノ酸であり得る。シグナル配列は、抗原認識部分のＣ末端の近くに位置し得る。特に、Ｃ末端からの距離は、約１００アミノ酸であり得る。
抗原認識部分は、第１シグナル生成部分と有機的な機能関係を有し得る。
抗原認識部分は、抗体の断片抗原結合（Ｆａｂ）ドメインと相同であり得る。
抗原認識部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
抗原認識部分は、それ自体によって、または、抗原認識構造を形成することによって抗原を認識し得る。
抗原認識構造は、特異的な構造を確立することによって抗原を認識でき、当業者であれば、特異的な構造を構成する単量体単位と、単量体単位の結合とを容易に理解できる。加えて、抗原認識構造は１または２またはそれ以上の単量体単位から成り得る。
抗原認識構造は、単量体単位が直列に接続された構造であり得る、または、単量体単位が並列に接続された構造であり得る。
直列に接続された構造とは、２つ以上の単量体単位が１方向に連続的に接続された構造を指し、一方で、並列に接続された構造とは、２つ以上の単量体単位の各々が、例えば異なる方向で、１つの単量体単位の遠位末端において並列に接続された構造を指す。
例えば、単量体単位は、無機物質であり得る。
単量体単位は、生化学的リガンドであり得る。
単量体単位は、野性型受容体の抗原認識部分と相同であり得る。
単量体単位は、抗体タンパク質と相同であり得る。
単量体単位は、免疫グロブリンの重鎖であり得て、または、それと相同であり得る。
単量体単位は、免疫グロブリンの軽鎖であり得て、または、それと相同であり得る。
単量体単位はシグナル配列を含み得る。
一方、単量体単位は、化学的結合によって結合され得て、または、特定の結合部分を通して結合され得る。
「抗原認識ユニット結合部分」という用語は、抗原認識ユニットが互いに接続される領域であり、２つ以上の抗原認識ユニットから成る抗原認識構造が存在するときに存在する任意の構成であり得る。
抗原認識ユニット結合部分はペプチドであり得る。特に、結合部分は、高い割合のセリンおよびスレオニンを有し得る。
抗原認識ユニット結合部分は化学的結合であり得る。
抗原認識ユニット結合部分は、特定の長さを有することによって、抗原認識ユニットの３次元構造の発現を助けることができる。
抗原認識ユニット結合部分は、抗原認識ユニット間の特定の位置関係を有することによって、抗原認識構造の機能を助けることができる。
（ｉｉ）受容体ボディ
人工受容体は受容体ボディを含む。
「受容体ボディ」という用語は、抗原認識部分とシグナル生成部分との間の接続が媒介される領域のことであり、抗原認識部分およびシグナル生成部分は物理的に接続され得る。
受容体ボディの機能は、抗原認識部分またはシグナル生成部分において生成されるシグナルを伝達することであり得る。
受容体ボディの構造は、場合に応じて、同時にシグナル生成部分の機能を有し得る。
受容体ボディの機能は、人工受容体を免疫細胞上に固定化することを可能にすることであり得る。
受容体ボディはアミノ酸らせん構造を含み得る。
受容体ボディの構造は、身体に存在する一般的な受容体タンパク質の一部と相同である部分を含み得る。相同性は５０％～１００％の範囲内であり得る。
受容体ボディの構造は、免疫細胞上のタンパク質と相同である部分を含み得る。相同性は５０％～１００％の範囲内であり得る。
例えば、受容体ボディは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。
受容体ボディはＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。特に、第２シグナル生成部分がＣＤ２８であるとき、ＣＤ２８は、第２シグナル生成部分および受容体ボディの機能を実行できる。
（ｉｉｉ）シグナル生成部分
人工受容体はシグナル生成部分を含み得る。
「第１シグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、免疫応答シグナルを生成する部分を指す。
「第２シグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、第１シグナル生成部分と相互作用することによって、または独立に免疫応答シグナルを生成する部分を指す。
人工受容体は第１シグナル生成部分および／または第２シグナル生成部分を含み得る。
人工受容体は、第１および／または第２シグナル生成部分それぞれのうち２つ以上を含み得る。
第１および／または第２シグナル生成部分は特定の配列モチーフを含み得る。
配列モチーフは、分化抗原群（ＣＤ）タンパク質のモチーフと相同であり得る。
特に、ＣＤタンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ２４７、ＣＤ７９であり得る。
配列モチーフは、ＹｘｘＬ／Ｉのアミノ酸配列であり得る。
配列モチーフは第１および／または第２シグナル生成部分に複数存在し得る。
特に、第１配列モチーフは、第１シグナル生成部分の開始位置から１～２００アミノ酸の距離に位置し得る。第２配列モチーフは、第２シグナル生成部分の開始位置から１～２００アミノ酸の距離に位置し得る。
加えて、各配列モチーフ間の距離は１～１５アミノ酸であり得る。
特に、各配列モチーフ間の距離な好適は６～８アミノ酸である。
例えば、第１および／または第２シグナル生成部分はＣＤ３ζであり得る。
第１および／または第２シグナル生成部分はＦｃεＲＩγであり得る。
第１および／または第２シグナル生成部分は、特定の条件が満たされたときのみ、免疫応答を生成するものであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原を認識することであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原との結合を形成することであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原との結合を形成するとき、生成されるシグナルが伝達されることであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原を認識する、または、抗原認識部分が抗原に結合している間に抗原から離れることであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の増殖および分化に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の細胞死に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の活性に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の補助に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、抗原認識部分において生成されるシグナルに対して特異的となるように活性化され得る。
免疫応答シグナルは、関心のある遺伝子の発現を調節するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫応答を抑制するシグナルであり得る。
一実施形態において、シグナル生成部分は、追加のシグナル生成部分を含み得る。
「追加のシグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、第１および／または第２シグナル生成部分によって生成される免疫応答シグナルに関して追加の免疫応答シグナルを生成する領域を指す。
以降、追加のシグナル生成部分は、順序に従って、第ｎシグナル生成部分（ｎ≠１）と称される。
人工受容体は、第１シグナル生成部分に加えて、追加のシグナル生成部分を含み得る。
２つ以上の追加のシグナル生成部分は、人工受容体に含めることができる。
追加のシグナル生成部分は、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０の免疫応答シグナル、または、その他のシグナルが生成され得る構造であり得る。
追加のシグナル生成部分が免疫応答シグナルを生成する条件、および、それによって生成される免疫応答シグナルの特性は、第１および／または第２シグナル生成部分の免疫応答シグナルに対応する詳細を含む。
免疫応答シグナルは、サイトカインの合成を促進するものであり得る。免疫応答シグナルは、サイトカインの分泌を促進または阻害するものであり得る。特に、サイトカインは好ましくは、ＩＬ－２、ＴＮＦα、または、ＩＦＮ－γであり得る。
免疫応答シグナルは、他の免疫細胞の増殖または分化に役立つシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、他の免疫細胞の活性を調節するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、シグナルが生じる場所に他の免疫細胞を引き付けるシグナルであり得る。
本発明は、人工受容体の可能な結合関係をすべて含む。したがって、本発明の人工受容体の態様は、本明細書に記載されるものに限定されない。
人工受容体は、抗原認識部分－受容体ボディ－第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。
人工受容体は、抗原認識部分－受容体ボディ－第２シグナル生成部分－第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。特に、第１シグナル生成部分および第２シグナル生成部分の位置は変化し得る。
人工受容体は、抗原認識部分－受容体ボディ－第２シグナル生成部分－第３シグナル生成部分－第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。特に、第１シグナル生成部分から第３シグナル生成部分までの位置は変化し得る。
人工受容体において、シグナル生成部分の数は、１～３に限定されず、３より多くのものが含まれ得る。
上記の実施形態に加えて、人工受容体は、抗原認識部分－シグナル生成部分－受容体ボディの構造を有し得る。当該構造は、人工受容体を有する細胞の外で作用する免疫応答シグナルを生成する必要があるときに有利であり得る。
人工受容体は、野性型受容体に対応する方式で機能し得る。
人工受容体は、特定の抗原との結合を形成することによって、特定の位置関係を形成するように機能し得る。
人工受容体は、抗原を認識し、特定の抗原に対する免疫応答を促進する免疫応答シグナルを生成するように機能し得る。
人工受容体は、身体における一般的な細胞の抗原を認識し、身体における細胞に対する免疫応答を阻害するように機能し得る。
（ＩＶ）シグナル配列
一実施形態において、人工受容体は任意でシグナル配列を含み得る。
人工受容体が特定のタンパク質のシグナル配列を含むとき、これは、人工受容体が免疫細胞の膜上に容易に配置されることを助け得る。好ましくは、人工受容体が膜貫通タンパク質のシグナル配列を含むとき、これは、人工受容体が免疫細胞の膜を貫通して免疫細胞の外側の膜上に配置されることを助け得る。
人工受容体は、１または複数のシグナル配列を含み得る。
シグナル配列は、多くの正荷電アミノ酸を含み得る。
シグナル配列は、ＮまたはＣ末端に近い場所にある正荷電アミノ酸を含み得る。
シグナル配列は、膜貫通タンパク質のシグナル配列であり得る。
シグナル配列は、免疫細胞の外側の膜上に配置されるタンパク質のシグナル配列であり得る。
シグナル配列は、人工受容体が保持する構造、すなわち、抗原認識部分、受容体ボディ、第１シグナル生成部分、追加のシグナル生成部分に含まれ得る。
特に、シグナル配列は、各構造のＮまたはＣ末端の近くの位置に配置され得る。
特に、ＮまたはＣ末端からのシグナル配列の距離は、約１００アミノ酸であり得る。
一実施形態において、細胞は、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子が含まれるように改変されたものであり得る。
別の実施形態において、ＴＣＲは、腫瘍関連抗原（例えば、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、ＮＹ－ＥＳＯ１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＧＰ１００など）、黒色腫）に対する結合特異性を有するものであり得る。
更に別の実施形態において、細胞は、特定のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれるように改変されたものであり得る。一実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＧＤ２、アルファ‐葉酸受容体、ルイスＹ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２））に対する結合特異性を有するものであり得る。
更に別の実施形態において、細胞は例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲによって細胞を以下の腫瘍抗原のうち１または複数と結合させることができるように改変されたものであり得る。
腫瘍抗原は、これらに限定されないが、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ－７、ＣＴ８／ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ｃＴＡＧＥ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ファイブリン－１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ－Ｃ２、ｈＣＡＰ－Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ｃｗ、ＨＯＭ－ＨＤ－２１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＨＯＭ－ＭＥＥＬ－４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ－ＲＣＣ－３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ １、ＫＭ－ＨＮ－３、ＫＭ－ＫＮ－１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－４ａ、ＭＰＰｌ １、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＢＲ－６２、ＮＹ－ＢＲ－８５、ＮＹ－ＣＯ－３７、ＮＹ－ＣＯ－３８、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－５、ＮＹ－ＬＵ－１２、ＮＹ－ＲＥＮ－１０、ＮＹ－ＲＥＮ－１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１ １、ＮＹ－ＲＥＮ－２１、ＮＹ－ＲＥＮ－２６／ＢＣＲ、ＮＹ－ＲＥＮ－３／ＮＹ－ＣＯ－３８、ＮＹ－ＲＥＮ－３３／ＳＮＣ６、ＮＹ－ＲＥＮ－４３、ＮＹ－ＲＥＮ－６５、ＮＹ－ＲＥＮ－９、ＮＹ－ＳＡＲ－３５、ＯＧＦｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ ＰＬＵ－１、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪカッパ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ－１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、チロシナーゼを含み得る。
抗原結合関連エレメント
本発明の細胞は更に、「抗原結合関連エレメント」を含み得る。
「抗原結合関連エレメント」は、受容体と抗原との間の結合を可能にするエレメントであり、そのような機能を実行する遺伝子またはタンパク質であり得る。
免疫応答は、そのような抗原結合関連エレメントを使用して調節され得る。例えば、外部操作を受けた細胞を生体に追加することによって治療が実行されるとき、および、外部操作を受けた細胞に関連する免疫応答が活性化されることにより治療の有効性が消失するＨＶＧＤ（宿主ＨＶＧＤ（移植片疾患、移植片対宿主疾患、ＨｏｓｔＧｒａｆｔ））が問題になるとき、問題は、免疫細胞受容体の抗原結合能を抑制することによって解決され得る。
抗原結合関連エレメントは、受容体の構造に関連するタンパク質または遺伝子であり得る。
抗原結合関連エレメントは、受容体の構造と相同であるタンパク質または遺伝子であり得る。
例えば、抗原結合関連エレメントはｄＣＫであり得る。
抗原結合関連エレメントはＣＤ５２であり得る。
抗原結合関連エレメントはＢ２Ｍであり得る。
抗原結合関連エレメントは、受容体が認識する構造に関連するタンパク質または遺伝子であり得る。
例えば、抗原結合関連エレメントは、ＭＨＣタンパク質であり得る。
一実施形態において、本発明は、人工的に操作された免疫調節遺伝子、または、これらの遺伝子によって発現されるタンパク質を含む免疫細胞に関する。
別の実施形態において、本発明は、人工的に操作された免疫調節遺伝子またはこれらの遺伝子によって発現されるタンパク質、および、受容体を含む免疫細胞に関する。
更に別の実施形態において、本発明は、人工的に操作された免疫調節遺伝子またはこれらの遺伝子によって発現されるタンパク質、受容体、および、抗原結合関連エレメントを含む免疫細胞に関する。
本発明の細胞の代表例は免疫細胞である。
本発明のいくつかの例示的な実施形態において、免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、単球、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）など、好ましくは、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）から成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
遺伝子操作された免疫細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）の有効性を限定する因子には、以下が含まれる。
（１）免疫細胞増殖（例えば、養子移入後の免疫細胞の限定的な伝播）
（２）免疫細胞の生存（例えば、腫瘍環境における因子による免疫細胞のアポトーシスの誘導）
（３）免疫細胞機能（例えば、宿主免疫細胞および癌細胞によって分泌される阻害因子による、細胞傷害性免疫細胞機能の阻害）
この目的のために、上記の限定因子は、免疫細胞において発現する１または複数の遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、ＴＥＴ２から成る群から選択される１または複数の遺伝子）が不活性化される免疫細胞を通して調節される。
一例において、免疫細胞において発現される１または複数の遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子）が、各々独立にノックアウト、ノックダウンまたはノックインされるように標的化および操作され得て、それにより、１または複数の免疫細胞の増殖、生存、機能に影響を及ぼす。
一例において、免疫細胞において、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子から成る群から選択される２つ以上の遺伝子が、同時にノックアウト、ノックダウンまたはノックインされるように標的化および操作され得る。一実施形態において、ＤＧＫＡおよびＤＧＫＺは同時にノックアウトされた。
一例において、非コード領域またはコード領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー、３'ＵＴＲ、および／または、ポリアデニル化シグナル配列、または、転写配列（例えば、イントロンまたはエクソン配列））を標的化することによって、免疫細胞を発現する１または複数の遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子）は、各々独立にノックアウト、ノックダウン、または、ノックインされるように標的化および操作され得て、それにより、１または複数の免疫細胞の増殖、生存、機能に影響を及ぼす。
一例において、配列の１または複数の領域における欠失、置換、挿入または変異を含む変更を誘導することにより、免疫細胞において発現される１または複数の遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子）は、各々独立にノックアウト、ノックダウン、または、ノックインされるように標的化および操作され得て、それにより、１または複数の免疫細胞の増殖、生存、機能に影響を及ぼす。
特に、本明細書において開示されない免疫調節遺伝子を組み合わせて標的化できることは明らかである。
［免疫系］
追加的に、本発明の別の態様は、人工的に操作された免疫調節因子および／またはそれを含む細胞が関与する免疫応答機構を形成する免疫系を提供する。
本発明の「免疫系」とは、操作された免疫調節因子の機能の変化によってｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答に影響する（すなわち、新規の免疫効果を発揮する機構に関与する）すべての現象を含む用語であり、そのような免疫系に直接的または間接的に関与するすべての物質、組成物、方法、用途を含む。例えば、自然免疫、適応免疫、細胞性免疫、体液性免疫、能動免疫、受動免疫応答に関与する、すべての遺伝子、免疫細胞、免疫器官／組織を含む。
そのような免疫系を構成するエレメントは、「免疫系因子」と総称されることが多い。
本発明の免疫系には、操作された免疫細胞が含まれる。
操作された免疫細胞とは、免疫細胞が天然状態ではなく、人為的操作にさらされたことを意味する。近年、身体から免疫細胞を抽出して人為的操作を適用することによって免疫を増強するための技法が活発に研究されている。そのような操作された免疫細胞は、特定の疾患に対して優れた免疫効果を有することから、新規の治療方法であることが示されている。特に、操作された免疫細胞に関する研究は、癌治療に関連して活発に行われている。
操作された免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞または人工構造を補足した免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞
本発明の「機能的に操作された免疫細胞」は、野性型受容体または免疫調節因子が性質に関して操作された免疫細胞を指す。
以降、操作とは、遺伝子の開裂、ライゲーション、除去、挿入、改変、または、タンパク質の除去、追加もしくは改変を含むすべての種類の操作を指し、当業者であれば、タンパク質および遺伝子を操作するようにこれらを利用できる。以降、免疫細胞は、分化した免疫細胞だけでなく、分化前細胞（例えば、幹細胞）も含む。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体が操作された免疫細胞であり得る。特に、野性型受容体はＴＣＲであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、表面上に野性型受容体が無い、または、より低い割合で存在するものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、表面上に野性型受容体がより高い割合で存在するものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体が特定の抗原に対する増強された認識能力を有するものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子が操作された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞活性調節エレメントが操作されたものであり得る。
特に、機能的に操作された免疫細胞は、ＳＨＰ－１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＢＬＢ、ＩＬＴ－２、ＫＩＲ２ＤＬ４およびＰＳＧＬ－１から成る群から選択される１または複数が不活性化された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞増殖調節エレメントが操作されたものであり得る。
特に、機能的に操作された免疫細胞は、ＤＧＫ－アルファ、ＤＧＫ－ゼータ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、Ｅｇｒ３、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、Ａ２０から成る群から選択される１または複数が不活性化された免疫細胞であり得る。好適な実施形態において、ＤＧＫ－アルファ、ＤＧＫ－ゼータ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、Ａ２０から成る群から選択される１または複数が不活性化される。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞死調節エレメントが操作されたものであり得る。
特に、機能的に操作された免疫細胞は、Ｄａｘｘ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、ＢＡＤ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４から成る群から選択される１または複数が不活性化された免疫細胞であり得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、自己の細胞死を誘導するエレメントが挿入された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞疲弊調節エレメントが操作されたものであり得る。
特に、機能的に操作された免疫細胞は、ＴＥＴ２、Ｗｎｔ、Ａｋｔから成る群から選択される１または複数が不活性化された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、サイトカイン産生調節エレメントが操作されたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、抗原結合関連エレメントが操作されたものであり得る。
特に、機能的に操作された免疫細胞は、ｄＣＫ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＭＨＣから成る群から選択される１または複数が不活性化された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、上記とは異なる免疫調節因子が操作されたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の免疫調節因子が同時に操作されたものであり得る。特に、１または複数の種類の免疫調節因子が操作され得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体および免疫調節因子を操作することによって、新規の免疫学的有効性を有し得る。
特に、１つの免疫調節因子を操作するとき、このことは、新規の免疫調節効果が発揮される必要があることを必ずしも意味するわけではない。１つの免疫調節因子の操作は、様々な新規の免疫効果を引き起こす、または、阻害し得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が調節されたものであり得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が改善されたものであり得る。
特に、特定の抗原は、例えば癌細胞の抗原など、疾患の抗原であり得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が低下したものであり得る。
新規の免疫効果は、新規の免疫効果が改善されたものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の増殖が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、増殖および分化が促進または遅延されるものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の細胞死が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、免疫細胞の細胞死を防止するためのものであり得る。追加的に、免疫効果は、適切な時間が経過したとき、免疫細胞の細胞死を引き起こすためのものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の機能の消失が緩和されたものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞のサイトカイン分泌が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、サイトカインの分泌を促進または阻害するためのものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞における野性型受容体の抗原結合能を調節するためのものであり得る。特に、免疫効果は、特定の抗原に対する野性型受容体の特異性を改善するためのものであり得る。
人工構造を補足した免疫細胞
「人工構造を補足した免疫細胞」という用語は、人工構造が免疫細胞において補足されるものを意味する。
例えば、人工構造を補足した免疫細胞は、人工受容体が補足された免疫細胞であり得る。
人工受容体は、特定の抗原を認識する能力を有するものであり得る。一例において、人工構造を補足した免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。
追加的に、人工受容体は、特定の疾患によって引き起こされる２つ以上の抗原の各々を認識する能力を有する人工受容体が補足されたものであり得る。特に、人工受容体の各々は、条件に従って、時間依存的方式で発現されるものであり得る。
例えば、癌治療のために操作された免疫細胞の場合、第１人工受容体が、第２人工受容体遺伝子の発現を開始する免疫応答シグナルを生成し得て、次いで、第２人工受容体が発現され得る。第２人工受容体は、癌細胞に対する免疫応答を誘導する免疫応答シグナルを生成し得る。この場合、癌細胞を攻撃する、操作された免疫細胞の能力が改善され得る。
人工受容体は、操作された免疫細胞を認識する能力を有するものであり得る。
人工受容体は、身体における一般的な細胞を認識する能力を有するものであり得る。一例において、人工構造を補足した免疫細胞はｉＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。
人工受容体は、第３の材料を認識する能力を有するものであり得る。特に、第３の材料は、特定の疾患の抗原に対する結合能力を有し得る。
特に、第３の材料は、人工受容体に結合し、同時に、特定の疾患の抗原に結合することが可能であり得る。例えば、第３の材料は、人工受容体、および、癌細胞に関連する抗原に同時に結合する能力を有し得る。
別の例において、人工構造を補足した免疫細胞は、人工受容体に加えて、特定の機能を有する人工構造を補足した免疫細胞であり得る。
天然状態とは異なる人工構造が免疫細胞に補足される場合、人工構造を補足した免疫細胞は新規の免疫効果を有し得る。
例えば、新規の免疫効果は、免疫細胞が抗原と特定の位置関係にあるように、免疫細胞が特定の抗原に結合するものであり得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原に対する免疫応答を認識および促進する機能であり得る。
新規の免疫効果は、過剰免疫応答を阻害する機能であり得る。
新規の免疫効果は、免疫応答のシグナル伝達経路を調節する機能であり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞が第３の材料との結合を形成し、特定の疾患を確認する機能であり得る。特に、第３の材料は、特定の疾患のためのバイオマーカーであり得る。
上記の特定の抗原の１つの好適な例は、癌細胞の抗原であり得る。
癌細胞の抗原は、これらに限定されないが、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ－７、ＣＴ８／ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ｃＴＡＧＥ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ファイブリン－１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ－Ｃ２、ｈＣＡＰ－Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ｃｗ、ＨＯＭ－ＨＤ－２１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＨＯＭ－ＭＥＥＬ－４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ－ＲＣＣ－３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ １、ＫＭ－ＨＮ－３、ＫＭ－ＫＮ－１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－４ａ、ＭＰＰｌ １、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＢＲ－６２、ＮＹ－ＢＲ－８５、ＮＹ－ＣＯ－３７、ＮＹ－ＣＯ－３８、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－５、ＮＹ－ＬＵ－１２、ＮＹ－ＲＥＮ－１０、ＮＹ－ＲＥＮ－１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１ １、ＮＹ－ＲＥＮ－２１、ＮＹ－ＲＥＮ－２６／ＢＣＲ、ＮＹ－ＲＥＮ－３／ＮＹ－ＣＯ－３８、ＮＹ－ＲＥＮ－３３／ＳＮＣ６、ＮＹ－ＲＥＮ－４３、ＮＹ－ＲＥＮ－６５、ＮＹ－ＲＥＮ－９、ＮＹ－ＳＡＲ－３５、ＯＧＦｒ、ＰＬＵ－１、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪカッパ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ－１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＲＯＲ－１、チロシナーゼを含み得る。
操作されたハイブリッド免疫細胞
「操作されたハイブリッド免疫細胞」という用語は、免疫調節因子の操作、および、人工構造の補足の両方が実現される免疫細胞を指す。
操作されたハイブリッド免疫細胞において、免疫調節因子の操作は、機能的に操作された免疫細胞において上記されたものと同一であり得る。追加的に、人工構造の補足は、人工構造を補足した免疫細胞において上記されたものと同一である。
免疫細胞の機能の操作が遺伝子操作であるとき、人工構造が補足される場所は、機能の操作が生じた遺伝子の位置と同一であり得る。
操作されたハイブリッド免疫細胞の新規の免疫効果は、機能的に操作された免疫細胞および人工構造を補足した免疫細胞の新規の免疫効果を含むものであり得て、これらの細胞間の相互作用によってより改善された免疫効果を発揮する。
改善された免疫効果は、特定の疾患に対する特異性および免疫応答が改善されるものであり得る。好適な例において、操作されたハイブリッド免疫細胞は、癌特異性および免疫応答の両方における改善を有するものであり得る。
本発明の免疫系は、操作された免疫調節因子および／または操作された免疫細胞によって実現される、所望の免疫反応、および、それによる疾患治療機構を含む。
一実施形態において、免疫細胞の増殖を阻害する遺伝子が不活性化される免疫調節因子および／または操作された免疫細胞は、免疫細胞の増殖に影響を及ぼすために使用され得る。
一実施形態において、免疫細胞の細胞死を媒介する遺伝子が不活性化された免疫調節因子および／または操作された免疫細胞は、免疫細胞の生存に影響を及ぼすために使用され得る。
一実施形態において、免疫を抑制および阻害するためのシグナル伝達因子をコードする遺伝子が不活性化された免疫調節因子および／または操作された免疫細胞は、免疫細胞の機能に影響を及ぼすために使用され得る。
本明細書において説明される方法および組成物は、遺伝子操作された免疫細胞の、特定の疾患に対する治療処置としての有効性を限定する１または複数の因子（例えば、免疫細胞増殖、免疫細胞の生存、免疫細胞機能またはその任意の組み合わせ）に影響を及ぼすように、単独で、または、それらを組み合わせ使用され得る。
一方で、「免疫調節療法」という用語は、操作された免疫調節因子および／または操作された免疫細胞を使用して身体における免疫応答を調節することによる疾患の治療を指す。
例えば、免疫細胞（例えば、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞など）は、身体における免疫応答を活性化または不活性化することによって疾患を治療するために使用され得る。
そのような免疫調節療法は主に、癌療法の適応として開発されてきた。当該免疫調節療法は、既存の癌治療に使用される外科療法、抗癌剤または放射線療法とは区別される治療機構である。なぜなら、免疫機能は、免疫細胞を患者に直接投与することによって活性化され、それにより治療効果を引き出すからである。
免疫調節療法の一実施形態において、使用される免疫細胞の特性、および、生産プロセスにおいて細胞に導入される遺伝子に応じて、免疫調節療法は、樹状細胞免疫調節細胞治療剤、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）などを含む。
［遺伝子操作または遺伝子改変］
本発明の免疫調節因子、免疫細胞、免疫系に関与する物質の操作または改変は、好ましくは、遺伝子操作によって実現され得る。
一態様において、遺伝子操作のための組成物および方法は、免疫細胞の増殖、生存、および／または機能に影響を及ぼす免疫調節遺伝子の非コードおよびコード領域の全部または一部を標的化することによって提供され得る。
一実施形態において、所望の免疫系を形成すべく、組成物および方法は、免疫系に関与する１または複数の免疫調節遺伝子を操作または改変できる。これは、遺伝子を構成する核酸の改変によって実現され得る。操作の結果、ノックダウン、ノックアウト、ノックインの形態のすべてが含まれる。
一実施形態において、プロモーター領域または転写配列（例えばイントロン配列、エクソン配列）が標的化され得る。コード配列（例えば、コード領域および初期コード領域）は、発現の変更およびノックアウトのために標的化できる。
一実施形態において、核酸の変更は、例えば、１ｂｐ～３０ｂｐ、１ｂｐ～２７ｂｐ、１ｂｐ～２５ｂｐ、１ｂｐ～２３ｂｐ、１ｂｐ～２０ｂｐ、１ｂｐ～１５ｂｐ、１ｂｐ～１０ｂｐ、１ｂｐ～５ｂｐ、１ｂｐ～３ｂｐまたは１ｂｐの範囲のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入であり得る。
一実施形態においてにおいて、免疫調節遺伝子のうち、１または複数の遺伝子のノックアウト、または、１または複数の発現の除去、または、１つのアレルまたは２つのアレルのうち１または複数のノックアウトについては、遺伝子は、欠失または変異が免疫調節遺伝子の１または複数のに含まれ得るように標的化され得る。
一実施形態において、遺伝子ノックダウンは、不要なアレルまたは転写産物の発現を低減するために使用され得る。
一実施形態において、ポリアデニル化シグナルのプロモーター、エンハンサー、イントロン、３'ＵＴＲ、および／または、非コード配列の標的化は、免疫細胞の機能に影響を及ぼす免疫調節遺伝子を変更するために使用され得る。
一実施形態において、免疫調節遺伝子の活性の調節（例えば、活性化、不活性化）は、遺伝子の核酸の変更によって誘導され得る。
一実施形態において、遺伝子の核酸の変更は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体を介する、標的遺伝子の特定の領域における一本鎖または二本鎖の開裂によって、すなわち、核酸鎖の切断を触媒することによって、標的遺伝子を不活性化することであり得る。
一実施形態において、核酸鎖の切断部は、複数の機構（例えば、相同組換え、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）など）を介して修復され得る。
この場合、ＮＨＥＪ機構が生じるとき、ＤＮＡ配列の変更が開裂部位に誘導され、遺伝子はそれによって不活性化され得る。ＮＨＥＪを介する修復は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を引き起こし得て、対応する遺伝子ノックアウトを誘導するために使用され得る。
別の態様において、本発明は、上記の遺伝子操作のための位置を提供し得る。
一実施形態において、変更がＮＨＥＪを介した変更によって実現されるとき、遺伝子操作の位置は、免疫調節遺伝子産物の発現を低減または除去する結果につながる遺伝子内の位置を指す。
例えば、遺伝子内の位置は初期コード領域、５０％上流コード領域、プロモーター配列、特定のイントロン配列、特定のエクソン配列にあり得る。
当該位置は、免疫細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼす、遺伝子内の特定の位置であり得る。
当該位置は、免疫応答に関与するタンパク質の機能に影響する、遺伝子内の特定の位置であり得る。
当該位置は、特定の抗原に対する認識能力に影響を及ぼす、遺伝子内の特定の位置であり得る。
当該位置は、免疫細胞におけるサイトカイン分泌を調節する機能に影響を及ぼす、遺伝子内の特定の位置であり得る。
当該位置は、免疫細胞における受容体の抗原結合能を調節する機能に影響を及ぼす、遺伝子内の特定の位置であり得る。
遺伝子操作は、遺伝子発現の調節プロセスを考慮して実行され得る。
一実施形態において、遺伝子操作は、各段階に好適な操作方法を選択することによって、転写調節、ＲＮＡプロセシング調節、ＲＮＡ輸送調節、ＲＮＡ分解調節、翻訳調節、または、タンパク質改変調節の段階において実行され得る。
一実施形態において、遺伝情報の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングを使用してスモールＲＮＡ（ｓＲＮＡ）によりｍＲＮＡの安定性を妨害または低減することによって、および、いくつかの場合、中間段階中にタンパク質合成の情報の伝達を妨害するように破壊することによって制御され得る。
一実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子における核酸の間の結合の加水分解（開裂）を触媒可能な野性型または変異型酵素が使用され得る。ガイド核酸－エディタータンパク質複合体が使用され得る。
例えば、遺伝情報の発現は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）およびＴＡＬＥ－ヌクレアーゼから成る群から選択される１または複数を使用して遺伝子を操作することによって制御され得る。
好適な例において、限定するものではないが、遺伝子操作は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって媒介され得る。
一実施形態において、免疫細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼす免疫調節遺伝子の例は、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を含み得る。
上記の遺伝子の標的配列領域（すなわち、核酸改変が生じ得る部位）は、下の表１にまとめられている（表１に示される標的配列部分は、３'末端にＰＡＭ配列５'－ＮＧＧ－３'を含むものとして説明される）。
標的配列は２種類以上を同時に標的化し得る。
遺伝子は２種類以上を同時に標的化し得る。
相同遺伝子における２つ以上の標的配列、または、異種遺伝子における２つ以上の標的配列は、同時に標的化され得る。
例示的な実施形態において、ＤＧＫａまたはＤＧＫｚはそれぞれ標的化され得る。
例示的な実施形態において、ＤＧＫａおよびＤＧＫｚは同時に標的化され得る。
［表１］
標的配列
Figure 2023052426000002
Figure 2023052426000003
Figure 2023052426000004
Figure 2023052426000005
Figure 2023052426000006
Figure 2023052426000007
Figure 2023052426000008
Figure 2023052426000009
Figure 2023052426000010
Figure 2023052426000011
［遺伝子はさみ（設計されたヌクレアーゼ）システム］
本発明の免疫調節因子、免疫細胞、免疫系に関与する物質の遺伝子操作または遺伝子改変は、「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」を使用して実現され得る。
［ガイド核酸－エディタータンパク質複合体］
「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用によって形成される複合体を指し、核酸－タンパク質複合体はガイド核酸およびエディタータンパク質を含む。
「ガイド核酸」という用語は、ガイド核酸－タンパク質複合体によって標的化される核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識するよう構成される。
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在し得て、５～１５０の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は１または複数のドメインを含み得る。
ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインまたは尾部ドメインであり得る。
ガイド核酸は、同一のドメイン反復または異なるドメインであり得る、２つ以上のドメインを含み得る。
ガイド核酸は１つの連続核酸配列であり得る。
例えば、１つの連続核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１～１５０の整数である。
ガイド核酸は２つ以上の連続核酸配列であり得る。
例えば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは、１～１５０の整数であり、互いに同一である、または、異なり得る。
「エディタータンパク質」という用語は、核酸に直接的に結合すること、または、直接結合無しで相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。エディタータンパク質はまた、概念的に、「遺伝子はさみ」、または、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）と称され得る。
エディタータンパク質は酵素であり得る。
エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
ここで、「融合タンパク質」とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
「酵素」という用語は、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を開裂可能なドメインを含むタンパク質を指す。
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
融合タンパク質は、酵素のアミノ末端（Ｎ末端）またはその付近、カルボキシル末端（Ｃ末端）またはその付近、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその付近、Ｃ末端またはその付近、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、対象を改変するように機能し得る。
対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
例えば、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、関心のあるタンパク質の発現、タンパク質の除去、または、新規のタンパク質の発現の最終的な調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）をもたらし得る。
ここで、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体のレベルで作用し得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体はタンパク質のレベルで作用し得る。
［１．ガイド核酸］
ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識することが可能な核酸であり、ガイド核酸－タンパク質複合体を形成する。
ここで、ガイド核酸は、ガイド核酸－タンパク質複合体によって標的化される核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識または標的化するよう構成される。
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在し得て、５～１５０の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は鎖状または環状に存在し得る。
ガイド核酸は１つの連続核酸配列であり得る。
例えば、１つの連続核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１～１５０の整数である。
ガイド核酸は２つ以上の連続核酸配列であり得る。
例えば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは１～１５０の整数であり、互いに同一であるか、または、異なり得る。
ガイド核酸は１または複数のドメインを含み得る。
ここで、ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインまたは尾部ドメインであり得る。
ガイド核酸は、同一ドメインの反復または異なるドメインであり得る２つ以上のドメインを含み得る。ドメインは以下で説明する。
ｉ）ガイドドメイン
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を有するドメインであり、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用するように機能する。
ガイド配列は、例えば、少なくとも５０％以上、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相補性または完全相補性を有する、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的な核酸配列である。
ガイドドメインは５～５０塩基の配列であり得る。
一例において、ガイドドメインは、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０または４５～５０の塩基の配列であり得る。
別の例において、ガイドドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５または４５～５０の塩基の配列であり得る。
ガイドドメインはガイド配列を有し得る。
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
ガイド配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的な核酸配列であり得る。
ガイド配列は５～５０塩基配列であり得る。
一例において、ガイドドメインは、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０または４５～５０の塩基配列であり得る。
別の例において、ガイド配列は１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５または４５～５０の塩基配列であり得る。
加えて、ガイドドメインはガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
追加の塩基配列は、ガイドドメインの機能を改善または低減するために利用され得る。
追加の塩基配列は、ガイド配列の機能を改善または低減するために利用され得る。
追加の塩基配列は１～３５の塩基配列であり得る。
一例において、追加の塩基配列は、５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５または３０～３５の塩基配列であり得る。
別の例において、追加の塩基配列は、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０または３０～３５の塩基配列であり得る。
追加の塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
追加の塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
ｉｉ）第１相補ドメイン
「第１相補ドメイン」という用語は、第２相補ドメインと相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、十分な相補性を有するので、第２相補ドメインと二本鎖を形成する。
第１相補ドメインは、５～３５の塩基配列であり得る。
一例において、第１相補ドメインは、５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５または３０～３５の塩基配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０または３０～３５の塩基配列であり得る。
ｉｉｉ）リンカドメイン
「リンカドメイン」という用語は、２つ以上の同一または異なるドメインである２つ以上のドメインを接続する核酸配列である。リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインに接続され得るか、または、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインを接続し得る。
リンカドメインは１～３０の塩基配列であり得る。
一例において、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５～３０の塩基配列であり得る。
別の例において、リンカドメインは、１～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０または２５～３０の塩基配列であり得る。
ｉｖ）第２相補ドメイン
「第２相補ドメイン」という用語は、第１相補ドメインと相補的な核酸配列を含む核酸配列のことであり、十分な相補性を有するので、第１相補ドメインと二本鎖を形成する。
第２相補ドメインは第１相補ドメインと相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインと相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を有し得るので、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
第２相補ドメインは５～３５の塩基配列を有し得る。
一例において、第２相補ドメインは、１～３５、５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５または３０～３５の塩基配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０または３０～３５の塩基配列であり得る。
ｖ）近位ドメイン
「近位ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに隣接して配置される核酸配列である。
近位ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して二本鎖に形成され得る。
近位ドメインは、１～２０塩基配列であり得る。
一例において、近位ドメインは、１～２０、５～２０、１０～２０、または、１５～２０塩基配列であり得る。
別の例において、近位ドメインは、１～２０、５～２０、１０～２０、または１５～２０塩基配列であり得る。
ｖｉ）尾部ドメイン
「尾部ドメイン」という用語は、ガイド核酸の両方の末端のうち１または複数の末端に位置する核酸配列である。
尾部ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して、二本鎖に形成され得る。
尾部ドメインは、１～５０塩基配列であり得る。
一例において、尾部ドメインは、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、または、４５～５０塩基配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または、４５～５０塩基配列であり得る。
一方、ドメインに含まれる核酸配列、すなわち、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインの一部または全部は、選択的に、または、追加的に化学修飾を含み得る。
化学修飾は、これらに限定されないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。
ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。
ガイド核酸はガイドドメインを含み得る。
ガイド核酸は第１相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸はリンカドメインを含み得る。
ガイド核酸は第２相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は近位ドメインを含み得る。
ガイド核酸は尾部ドメインを含み得る。
ここでは、１、２、３、４、５、６またはより多くのドメインがあり得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのガイドドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第１相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのリンカドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第２相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの近位ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの尾部ドメインを含み得る。
ここで、ガイド核酸において、１種類のドメインが重複し得る。
ガイド核酸は、重複を有する、または、有しないいくつかのドメインを含み得る。
ガイド核酸は、同じ種類のドメインを含み得る。ここで、同じ種類のドメインは、同一の核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］から成り得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なる、または、同一の標的に対するガイド配列を含み得て、２つの第１相補ドメインおよび２つの第２相補ドメインは、同一または異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが、異なる標的に対するガイド配列を含むとき、ガイド核酸は、２つの異なる標的に特異的に結合し得て、ここでは、特異的結合は、同時または順番に実行され得る。加えて、リンカドメインは、特異的酵素によって開裂され得て、ガイド核酸は、特定の酵素の存在下で、２または３つの部分に区分され得る。
本明細書におけるガイド核酸の特定の例として、ガイド核酸を以下で説明する。
［ｇＲＮＡ］
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子または核酸に関して、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化可能な核酸を指す。加えて、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または核酸へ誘導し得る核酸特異的ＲＮＡである。
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに起因して、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性形態において、または、これらの鎖の間で、相互作用が生じ得る。
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、リンカドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインと、近位ドメインと、任意で、尾部ドメインとを含み得る。
別の実施形態において、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメイン、および、第１相補ドメインを含む第１鎖と、５'から３'の方向に、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、任意で、尾部ドメインを含む第２鎖とを含み得る。
ここで、第１鎖は、ｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインおよび第１相補ドメインを含み得て、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２相補ドメイン、近位ドメイン、任意で尾部ドメインを含み得る。
更に別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、３'から５'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインとを含み得る。
［ガイドドメイン］
ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する核酸配列であり得る。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
ガイドドメインは、５～５０塩基配列であり得る。
例示的な実施形態として、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
例示的な実施形態として、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
ここで、ガイドドメインは、ガイド配列を含み得る。
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
ガイド配列は、５～５０塩基配列であり得る。
例示的な実施形態において、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
ここで、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
追加の塩基配列は、１～３５塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
例えば、追加の塩基配列は、単一の塩基配列グアニン（Ｇ）、または、２つの塩基の配列ＧＧであり得る。
追加の塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
追加の塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
選択的に、ガイドドメインの塩基配列の一部または全部は化学修飾を含み得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
［第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインと共に二本鎖を形成することが可能なように十分な相補性を有する。
ここで、第１相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得る。第１相補ドメインは、５～３５塩基配列を含み得る。
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
別の実施形態において、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得るか、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメインとの、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、もしくは、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧであり得る。
別の実施形態において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上、または、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、５～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'－ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ－３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１～５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
選択的に、第１相補ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
［リンカドメイン］
リンカドメインは、２つ以上のドメインを接続する核酸配列であり、２つ以上の同一または異なるドメインを接続する。リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、２つ以上のドメインに接続され得る、または、２つ以上のドメインを接続し得る。
リンカドメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列であり得る。
リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る。
リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
リンカドメインは、１～３０塩基配列であり得る。リンカドメインは、１～３０塩基配列を含み得る。
例示的な実施形態において、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５～３０塩基配列であり得る。
例示的な実施形態において、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５～３０塩基配列を含み得る。
リンカドメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子において使用されるのに好適であり、共有結合または非共有結合により、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖と接続されることによって、または、第１鎖を第２鎖と接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するのに使用され得る。リンカドメインは、共有結合または非共有結合により、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと接続されることによって、または、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するのに使用され得る。
リンカドメインは、天然配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分的配列との相同性を有し得る、または、それに由来し得る。
選択的に、リンカドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）または２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
［第２相補ドメイン］
第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成するように十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、第１相補ドメインとの相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
ここで、第２相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得る。第１相補ドメインは５～３５塩基配列を含み得る。
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
加えて、第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有する第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインを有し得る。
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'－（Ｘ）ｎ ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１５の整数であり得て、ｍは、１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'－（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１５の整数であり得て、ｍは１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'－ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ－３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'－（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１０の整数であり得て、ｍは１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
選択的に、第２相補ドメインの塩基配列の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
［近位ドメイン］
近位ドメインは、第２相補ドメインの３'末端方向に配置されたドメインである第２相補ドメインに隣接して配置された１～２０塩基の配列である。ここで、近位ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖を形成するのに使用され得る。
例示的な一実施形態において、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基配列であり得る。
別の実施形態において、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基配列を含み得る。
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従って、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在したｎ個の塩基を表し得る。
更なる別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１～４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
選択的に、近位ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
［尾部ドメイン］
尾部ドメインは、一本鎖ｇＲＮＡまたは二本鎖ｇＲＮＡの３'末端に選択的に追加可能なドメインである。尾部ドメインは、１～５０塩基配列であり得る、または、１～５０塩基配列を含み得る。ここで、尾部ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖を形成するのに使用され得る。
例示的な実施形態において、尾部ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または、４５～５０塩基配列であり得る。
例示的な実施形態において、尾部ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または、４５～５０塩基配列を含み得る。
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインと相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと、部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧなどの混在したｎ個の塩基を表し得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ－３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写方法に関与する１～１０塩基配列を含み得る。
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
選択的に、尾部ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
ｇＲＮＡは、上記の複数のドメインを含み得て、このため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され得て、各ドメインに起因して、ｇＲＮＡの３次元構造または活性形態の鎖において、または、これらの鎖の間で相互作用が生じ得る。
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
［二本鎖ｇＲＮＡ］
二本鎖ｇＲＮＡは第１鎖および第２鎖から成る。ここで、第１鎖は、５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－３'から成り得る。 第２鎖は、５'－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－３'または ５'－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－［尾部ドメイン］－３'から成り得る。
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。
［第１鎖］
［ガイドドメイン］
第１鎖において、ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
ここで、ガイドドメインは、５～５０塩基配列であり得る、または、５～５０塩基配列を含み得る。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
加えて、ガイドドメインはガイド配列を含み得る。
ここで、ガイド配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性、または、完全相補性を有する標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
ここで、ガイド配列は、５～５０塩基配列であり得る、または、５～５０塩基配列を含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
選択的に、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
ここで、追加の塩基配列は、１～３５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、１つの塩基グアニン（Ｇ）、または、２つの塩基ＧＧを含み得る。
ここで、追加の塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、または、ガイド配列の５'末端に配置され得る。
追加の塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、または、ガイド配列の３'末端に配置され得る。
［第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインとの二本鎖を形成するように、十分な相補性を有するドメインである。
ここで、第１相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得る、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
選択的に、第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
ここで、追加の塩基配列は、１～１５塩基の配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１～５、５～１０、または、１０～１５塩基の配列であり得る。
選択的に、ガイドドメインおよび／または第１相補ドメインの塩基配列の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
このため、第１鎖は、上記のような５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－３'から成り得る。
加えて、第１鎖は任意で、追加の塩基配列を含み得る。
一例において、第１鎖は、５'－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｑ）ｍ－３'、または、５'－（Ｘ）ａ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｘ）ｂ－（Ｑ）ｍ－（Ｘ）ｃ－３'であり得る。
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第１相補ドメインは、ストレブトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され、ａ、ｂ、ｃの各々は塩基の数であり得て、０または１～２０の整数であり得る。
［第２鎖］
第２鎖は、第２相補ドメインおよび近位ドメインから成り得て、選択的に尾部ドメインを含み得る。
［第２相補ドメイン］
第２鎖において、第２相補ドメインは、第１鎖の第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと二本鎖を形成するように、十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインに相補的でない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
ここで、第２相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得て、または、５～３５塩基配列を含み得る。例えば、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得るが、本発明はこれに限定されない。
第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、その塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
選択的に、第２相補ドメインは更に、追加の塩基配列を含み得て、第１鎖の第１相補ドメインとの相補的結合を経ない。
ここで、追加の塩基配列は、１～２５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０または２０～２５塩基配列であり得る。
［近位ドメイン］
第２鎖において、近位ドメインは、１～２０塩基の配列であり、第２相補ドメインの３'末端方向に位置するドメインである。例えば、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基の配列であり得る、または、それを含み得る。
ここで、近位ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖結合を有し得る。
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に応じて塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種の近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
［尾部ドメイン］
選択的に、第２鎖において、尾部ドメインは、第２鎖の３'末端に選択的に追加されるドメインであり得て、尾部ドメインは、１～５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、尾部ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５または４５～５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
ここで、尾部ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖結合を有し得る。
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインとの相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレブトコッカス・サーモフィラス、ストレブトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それらに由来する尾部ドメインと部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写方法に関与する１～１０塩基の配列を含み得る。
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、いくつかのウラシル塩基または代替的塩基を含み得る。
選択的に、第２相補ドメイン、近位ドメイン、および／または、尾部ドメインの塩基配列の各々の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
このため、第２鎖は、上記のように５'－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－３'または５'－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－［尾部ドメイン］－３'から成り得る。
加えて、第２鎖は選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
例示的な一実施形態において、第２鎖は、５'－（Ｚ）ｈ－（Ｐ）ｋ－３'、または、５'－（Ｘ）ｄ－（Ｚ）ｈ－（Ｘ）ｅ－（Ｐ）ｋ－（Ｘ）ｆ－３'であり得る。
別の実施形態において、第２鎖は、５'－（Ｚ）ｈ－（Ｐ）ｋ－（Ｆ）ｉ－３'、または、５'－（Ｘ）ｄ－（Ｚ）ｈ－（Ｘ）ｅ－（Ｐ）ｋ－（Ｘ）ｆ－（Ｆ）ｉ－３'であり得る。
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５～５０の整数である。
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレブトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１～２０の整数である。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、近位ドメインが、ストレブトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１～５０の整数である。
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、尾部ドメインがストレブトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写方法に関与する１～１０塩基の配列を含み得る。
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｄ、ｅ、ｆの各々は、塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
［一本鎖ｇＲＮＡ］
一本鎖ｇＲＮＡは２種類に分類され得る。
［ｉ）一本鎖ｇＲＮＡ］
第１に、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカドメインによって結合される一本鎖ｇＲＮＡがあり、ここで、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－［第１鎖］－［リンカドメイン］－［第２鎖］－３'から成る。
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－３'、または、５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－［尾部ドメイン］－３'から成り得る。
リンカドメインを除く各ドメインは、二本鎖ｇＲＮＡの第１および第２鎖の各ドメインの説明と同一である。
［リンカドメイン］
一本鎖ｇＲＮＡにおいて、リンカドメインは、第１鎖および第２鎖を接続するドメインであり、具体的には、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列である。ここで、リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る、または、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
リンカドメインは、１～３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５～３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
リンカドメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子に使用するのに好適であり、一本鎖ｇＲＮＡの生成に使用される共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖に接続され得る、または、第１鎖を第２鎖に接続し得る。リンカドメインは、一本鎖ｇＲＮＡの生成に使用される共有結合または非共有結合によって二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに接続され得る、または、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続し得る。
リンカドメインは、天然配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分的配列との相同性を有し得る、または、それに由来し得る。
選択的に、リンカドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
このため、一本鎖ｇＲＮＡは、上記のように５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－３'、または、５'－［ガイドドメイン］－［第１相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第２相補ドメイン］－［近位ドメイン］－［尾部ドメイン］－３'から成り得る。
加えて、一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
例示的な一実施形態において一本鎖ｇＲＮＡは、５'－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｑ）ｍ－（Ｌ）ｊ－（Ｚ）ｈ－（Ｐ）ｋ－３'、または、５'－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｑ）ｍ－（Ｌ）ｊ－（Ｚ）ｈ－（Ｐ）ｋ－（Ｆ）ｉ－３'であり得る。
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－（Ｘ）ａ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｘ）ｂ－（Ｑ）ｍ－（Ｘ）ｃ－（Ｌ）ｊ－（Ｘ）ｄ－（Ｚ）ｈ－（Ｘ）ｅ－（Ｐ）ｋ－（Ｘ）ｆ－３'、または、５'－（Ｘ）ａ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－（Ｘ）ｂ－（Ｑ）ｍ－（Ｘ）ｃ－（Ｌ）ｊ－（Ｘ）ｄ－（Ｚ）ｈ－（Ｘ）ｅ－（Ｐ）ｋ－（Ｘ）ｆ－（Ｆ）ｉ－３'であり得る。
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化可能であり得る塩基配列領域である。
（Ｑ）ｍは、第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第１相補ドメインがストレブトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカドメインを含み、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し、それにより一本鎖ｇＲＮＡを生成する塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１～３０の整数である。
（Ｚ）ｈは、第１相補ドメインとの相補結合を有することが可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり、５～５０の整数であり得る。
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレブトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'－ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｐ）ｋは天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は起源の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１～２０の整数である。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、近位ドメインが、ストレブトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'－ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含み、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する塩基配列であり得て、尾部ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１～５０の整数である。
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'であり得る、または、５'－ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、尾部ドメインがストレブトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'－ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写方法に関与する１～１０塩基の配列を含み得る。
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆの各々は塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
［ｉｉ）一本鎖ｇＲＮＡ］
第２に、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、第２相補ドメインから成る一本鎖ｇＲＮＡであり得て、ここで、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－［第２相補ドメイン］－［第１相補ドメイン］－［ガイドドメイン］－３'、または、５'－［第２相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第１相補ドメイン］－［ガイドドメイン］－３'から成り得る。
［ガイドドメイン］
一本鎖ｇＲＮＡにおいて、ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する核酸配列であり得る。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
ここで、ガイドドメインは、５～５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
加えて、ガイドドメインはガイド配列を含み得る。
ここで、ガイド配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
ここで、ガイド配列は、５～５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それらを含み得る。
選択的に、ガイドドメインはガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
ここで、追加の塩基配列は、１～３５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、単一の塩基配列グアニン（Ｇ）、または、２つの塩基の配列ＧＧであり得る。
ここで、追加の塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、または、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
追加の塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、または、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
［第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは、第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインとの二本鎖を形成するように十分な相補性を有するドメインである。
ここで、第１相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
選択的に、第１相補ドメインは、第２相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
ここで、追加の塩基配列は、１～１５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１～５、５～１０、または、１０～１５塩基配列であり得る。
［第２相補ドメイン］
第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成するように、十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインとの相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
ここで、第２相補ドメインは、５～３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
第２相補ドメインは天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に従って、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第２相補ドメイン、または、それらに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
選択的に、第２相補ドメインは、第１相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
ここで、追加の塩基配列は１～１５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１～５、５～１０、または、１０～１５塩基配列であり得る。
［リンカドメイン］
選択的に、リンカドメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列である。ここで、リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る、または、第１および第２相補ドメインを接続し得る。
リンカドメインは、１～３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５または２５～３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
選択的に、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、第２相補ドメインおよびリンカドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ－メチル３'スホロチオエート（ＭＳ）、または、２'－Ｏ－メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
このため、一本鎖ｇＲＮＡは、上記のように５'－［第２相補ドメイン］－［第１相補ドメイン］－［ガイドドメイン］－３'、または、５'－［第２相補ドメイン］－［リンカドメイン］－［第１相補ドメイン］－［ガイドドメイン］－３'から成り得る。
加えて、一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－（Ｚ）ｈ－（Ｑ）ｍ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－３'、または、５'－（Ｘ）ａ－（Ｚ）ｈ－（Ｘ）ｂ－（Ｑ）ｍ－（Ｘ）ｃ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－３'であり得る。
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'－（Ｚ）ｈ－（Ｌ）ｊ－（Ｑ）ｍ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－３'、または、
５'－（Ｘ）ａ－（Ｚ）ｈ－（Ｌ）ｊ－（Ｑ）ｍ－（Ｘ）ｃ－（Ｎｔａｒｇｅｔ）－３'であり得る。
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。
（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'－ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ－３'であり得る、または、５'－ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ－３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５～５０の整数である。
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは５'－ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ－３'であり得る、または、５'－ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ－３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｌ）ｊは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続するリンカドメインを含む塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１～３０の整数である。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂ、ｃは塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
［２．エディタータンパク質］
エディタータンパク質とは、核酸と直接的に結合、または、直接結合することなく相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。概念的に、「遺伝子はさみ」またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ）と称されることもある。
核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。
核酸はガイド核酸であり得る。エディタータンパク質は酵素であり得る。エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
ここで、融合タンパク質とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
酵素とは、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を開裂可能なドメインを含むタンパク質を指す。
酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼまたは制限酵素であり得る。
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその近接部位、酵素のＣ末端またはその近接部位、酵素の中央領域、および、それらの組み合わせのうちの１または複数に、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその近接部位、酵素のＣ末端またはその近接部位、酵素の中央領域、および、その組み合わせのうちの１または複数に、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
ここで、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。
機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、核質に由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質双極型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
エディタータンパク質は完全活性酵素を含み得る。
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の機能と同一の機能を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を開裂する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖を完全に開裂する完全な酵素活性を有する。
加えて、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して改善された機能を有する酵素を含み、例えば、ＤＮＡの二本鎖を開裂する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、野性型酵素と比較して改善された完全な酵素活性、すなわち、ＤＮＡの二本鎖を開裂する活性を有する。
エディタータンパク質は、不完全または部分的な活性酵素を含み得る。
ここで、「不完全または部分的な活性酵素」とは、野性型酵素の機能の一部を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を開裂する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、二本鎖の一部、すなわち、ＤＮＡの一本鎖を開裂する不完全または部分的な酵素活性を有する。
エディタータンパク質は不活性酵素を含み得る。
ここで、「不活性酵素」は、野性型酵素の機能が完全に不活性化された酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を開裂する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、ＤＮＡ二本鎖を完全に開裂しないように、不活性を有する。
エディタータンパク質は、天然の酵素または融合タンパク質であり得る。
エディタータンパク質は、部分的に改変された天然の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
エディタータンパク質は、天然に存在しない人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。
エディタータンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
ここで、改変は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
加えて、改変は、エディタータンパク質をコードする塩基配列におけるいくつかの塩基の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
本発明のエディタータンパク質の例示的な一実施形態として、ＣＲＩＳＰＲ酵素を以下で説明する。
［ＣＲＩＳＰＲ酵素］
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の主なタンパク質成分であり、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をもたらす。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり、代表的なものとして、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が広く使用されている。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、放線菌（例えばアクチノマイセス・ネスランディ）Ｃａｓ９、アクウィフェクスＣａｓ９、バクテロイデスＣａｓ９、クラミジアＣａｓ９、クロロフレクサスＣａｓ９、シアノバクテリアＣａｓ９、エルシミクロビウムＣａｓ９、フィブロバクターＣａｓ９、フィルミクテスＣａｓ９（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９）、ストレブトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９、リステリア・イノキュアＣａｓ９、ストレプトコッカス・アガラクチアＣａｓ９、ストレプトコッカス・ミュータンスＣａｓ９、エンテロコッカス・フェシウムＣａｓ９、フソバクテリウムＣａｓ９、プロテオバクテリア（例えば、ナイセリア・メニンジティディス、カンピロバクター・ジェジュニ）Ｃａｓ９、スピロヘータ（例えば、トレポネーマ・デンティコラ）Ｃａｓ９など、様々な微生物に由来し得るＣａｓ９である。
「Ｃａｓ９」という用語は、標的遺伝子または核酸上の標的配列または位置を開裂または改変するようにｇＲＮＡに結合する酵素であり、核酸鎖を開裂してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＨＮＨドメインと、核酸鎖を開裂してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＲｕｖＣドメインと、標的を認識するＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｃａｓ９の具体的な構造特性については、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｅｌｌ １５６：９３５－９４９を参照されたい。
加えて、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクラム、ローズブリア、ナイセリア、グルコアセトバクター、アゾスピリラム、スフェロケタ、ラクトバシラス、ユーバクテリウム、コリネバクター、カルノバクテリウム、ロドバクター、リステリア、パルディバクター、クロストリジウム、ラクノスピラ、クロストリジウム、レプトトリキア、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス、メタノメチオフィラス、ポルフィロモナス、プレボテラ、バクテロイデス、ヘルココッカス、レトスピラ、デススルホビブリオ、デスルフォナトロナム、オピトゥトゥス、チュベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、メチロバクテリウムまたはアシダミノコッカスに由来し得るＣｐｆ１であり得る。
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様の、および、対応するＲｕｖＣドメインと、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインが無いＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣドメインと、ＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｃｐｆ１の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｅｌｌ １６５：９４９－９６２を参照されたい。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質のＣＲＩＳＰＲ酵素は、天然に存在する微生物から単離され得る、または、組み換えまたは合成方法によって非天然に生成され得る。
［ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素］
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然の微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４３（６１７６）：１２４７９９７， ２０１４）、および、ｇＲＮＡと複合化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５６：９３５－９４９， ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２０１４， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つのローブ．すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジへリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメインおよびＲＥＣ２ドメインを含む。
ここで、ＢＨドメインは、ロングαへリックスおよびアルギニンリッチ領域であり、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインは、例えば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなど、ｇＲＮＡに形成される二本鎖の認識において重要な役割を果たす。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインはＲｕｖＣ様ドメインを含む、または、ＨＮＨドメインはＨＮＨ様ドメインを含むために使用される。
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する、天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造類似性を共有し、例えば、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖などの一本鎖を開裂する。ＲｕｖＣドメインは、当技術分野において、ＲｕｖＣ Ｉドメイン、ＲｕｖＣ ＩＩドメイン、または、ＲｕｖＣ ＩＩＩドメインと称されることがあり、一般的には、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩまたはＲｕｖＣ ＩＩＩと称される。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＲｕｖＣドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１～５９、７１８～７６９、９０９～１０９８の配列にそれぞれ位置する、３つの区分されたＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ）の各々から組み立てられる。
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖など、一本鎖を開裂する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩとＩＩＩモチーフとの間に位置する。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＨＮＨドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列７７５～９０８に位置する。
ＰＩドメインは、標的遺伝子または核酸における特定の塩基配列、すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、または、ＰＡＭと相互作用する。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０９９～１３６８の配列に配置する。
ここで、ＰＡＭは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは、５'－ＮＧＧ－３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレブトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'－ＮＮＡＧＡＡＷ－３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンジティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'－ＮＮＮＶＲＹＡＣ－３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。
［Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素］
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりにＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｅｌｌ １６５：９４９－９６２を参照されたい。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子または核酸との相互作用のためのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または核酸に存在する配列であり、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。すなわち、種に応じて特異的に認識されることが可能な異なるＰＡＭ配列がある。
一例、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は、５'－ＴＴＮ－３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得る。
［ＣＲＩＳＰＲ酵素活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を開裂し、二本鎖または一本鎖の切断または除去を引き起こすヌクレアーゼ活性を有する。一般的に、野性型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を開裂する。
ＣＲＩＳＰＲ酵素の上述のヌクレアーゼ活性を操作または改変するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素は操作または改変され得て、そのような操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的活性または不活性酵素となるように改変され得る。
［不完全または部分活性酵素］
酵素活性を変化させ、それにより、不完全または部分的な活性を発揮するよう改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと称される。
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち一本鎖のみを開裂するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、例えば、標的遺伝子または核酸のｇＲＮＡと相補的でない、または、相補的な鎖である一本鎖を開裂するヌクレアーゼ活性を有する。このため、二本鎖を開裂するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
例えば、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されるニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸、すなわちｇＲＮＡの非相補鎖との相補結合を形成しない鎖を開裂可能である。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されるニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を開裂可能である。
例えば、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＲｕｖＣドメインは操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されたニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を開裂可能である。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されるニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を開裂可能である。
［不活性酵素］
酵素活性を完全に不活性にするように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と称される。
「不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に開裂しないように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインにおける変異に起因するヌクレアーゼ不活性を有する。不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたものであり得る。
例えば、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性を不活性するように、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインにおいて操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０がそれぞれアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に開裂しないことがあり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に開裂しないことがあり得る。
［他の活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上述のヌクレアーゼ活性に加えて、エンドヌクレアーゼ活性、エクソヌクレアーゼ活性、または、ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のへリックス構造をアニールする能力を有し得る。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、エンドヌクレアーゼ活性、エクソヌクレアーゼ活性、または、ヘリカーゼ活性を完全に、不完全に、または、部分的に活性化するように改変され得る。
［ＣＲＩＳＰＲ酵素の標的化］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近するように誘導する。ここで、標的遺伝子または核酸と相互作用するＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る、標的遺伝子または核酸に存在する配列である。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて変動し得る。すなわち、種に従って特異的に認識されることが可能な様々なＰＡＭ配列がある。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＧＧ－３'、５'－ＮＡＧ－３'、および／または、５'－ＮＧＡ－３'であり得て、ＳｔＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＧＧＮＧ－３'、および／または、５'－ＮＮＡＧＡＡＷ－３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＮｍＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３'、および／または５'－ＮＮＮＧＣＴＴ－３'であり得て、ＣｊＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＮＶＲＹＡＣ－３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ストレブトコッカス・ミュータンスＣａｓ９（ＳｍＣａｓ９）の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＧＧ－３'、および／または、５'－ＮＡＡＲ－３'（Ｒ＝ＡまたはＧ）であり得て、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＧＲＲ－３'、５'－ＮＮＧＲＲＴ－３'、および／または、５'－ＮＮＧＲＲＶ－３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ）であり得る。別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素ならば、Ｃｐｆ１の場合、ＰＡＭ配列は、５'－ＴＴＮ－３'であり得る。
ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。
特異的なＰＡＭ配列を認識可能なＣＲＩＳＰＲ酵素は、種に従って特異的に認識されることが可能なＰＡＭ配列を使用して操作または改変され得る。例えば、ＳｐＣａｓ９のＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を有し、かつ、ＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するように、ＣｊＣａｓ９のＰＩドメインと置換され得て、それにより、ＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するＳｐＣａｓ９が生成される。具体的には、認識されるＰＡＭ配列は、ＰＩドメインの置換または交換によって変化され得る。
［ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、標的遺伝子または核酸に接近する能力、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＡＭ認識能力など、様々な特性を改善または阻害するように改変され得る。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡと相互作用してｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素であり得て、標的遺伝子または核酸に接近または局在化するとき、標的特異性を改善するように改変または操作され、それにより、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を開裂することなく、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖のみが開裂される。
ここで、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を開裂する効果は、オフターゲット効果と称され、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸の位置または塩基配列、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸は、オフターゲットと称される。ここで、１または複数のオフターゲットがあり得る。他方で、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖の開裂効果は、オンターゲット効果と称され、標的遺伝子または核酸の場所または標的配列はオンターゲットと称される。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸の少なくとも１つにおいて改変され、例えば、改変されていないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、標的遺伝子または核酸に接近する能力、標的特異性などの様々な特性のうち１または複数が改善または阻害されるように改変され得る。ここで、改変は、アミノ酸の置換、欠失、追加、または、それらの混在であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、正電荷を有するアミノ酸から成る領域に位置する１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）など、正電荷アミノ酸のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正電荷アミノ酸から構成される領域に配置された１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正電荷アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
別の例において、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非荷電アミノ酸、すなわち、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうちの１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、疎水性残基を有するアミノ酸ｌのうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうちの１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、極性残基を有するアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の置換であり得る。
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の置換であり得る。
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の置換であり得る。
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７以上の改変であり得る。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩまたはＲｕｖＣ ＩＩＩドメインであり得る。
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインに存在するアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインに存在するアミノ酸のうち１または２またはそれ以上であり得る。
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインのうち少なくとも２つ以上のドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＲｕｖＣドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＲｕｖＣドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５、Ｆ１０３８アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸のうち２つ以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＨＮＨドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｋ８９０アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸の３つ以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素に含まれるＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸のうち少なくとも３つ以上の改変であり得る。
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｋ８９０、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の４以上の改変であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも４以上の改変であり得る。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性に関与するアミノ酸のうち１または２またはそれ以上の改変であり得る。
例えば、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、アミノ酸Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３およびＤ９８６から成る群のうち１または２またはそれ以上、または、他のＣａｓ９オーソログに対応するアミノ酸から成る群の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性の部分的不活性化のための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体はニッカーゼであり得る。
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を開裂しないことがあり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異するとき、すなわち、Ｄ１０Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、それにより、ＳｐＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を開裂しないことがあり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異するとき、すなわち、Ｄ８Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、したがって、ＣｊＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより、生成されたニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を開裂しないことがあり得る。
加えて、ここでは、改変はＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を開裂しないことがあり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、Ｈ８４０Ａに変異するとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、ＳｐＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を開裂しないことがあり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、Ｈ５５９Ａに変異するとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがって、ＣｊＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を開裂しないことがあり得る。
加えて、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を開裂しないことがあり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、それぞれＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、標的遺伝子または核酸の二本鎖は完全に開裂されないことがあり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、それぞれＤ８ＡおよびＨ５５９Ａに変異するとき、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、標的遺伝子または核酸の二本鎖は完全に開裂されないことがあり得る。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は更に、ＣＲＩＳＰＲ酵素の先天的特性に加え、機能ドメインを任意で含み得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、先天的特性に加えて追加的特性を有し得る。
ここで、機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、または、核酸結合活性を有するドメイン、または、タンパク質（ペプチドを含む）を単離および精製するためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
例えば、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを追加的に含み得る。例示的な一実施形態において、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を生成する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］－［ＡＰＯＢＥＣ１］は、塩基修復、または、ＣをＴもしくはＵにする編集、または、ＧをＡにする編集において使用され得る。
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
加えて、機能ドメインは、核局在配列またはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１または複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１または複数のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端またはその近接部位、酵素のＣ末端またはその近接部位、または、その組み合わせに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳ、すなわち、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、核質からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質双極型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤもしくはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンαのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することによって調製されたスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質を機能的または構造的に分割する、または、タンパク質をランダムに分割することにより２つ以上の部分にすることを指す。
ここで、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全に、不完全に、または、部分的に、活性酵素または不活性酵素であり得る。
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６チロシンと残基６５７スレオニンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。
加えて、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は選択的に、再構成のために、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
ここで、「再構成」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と構造的に同一または同様となるようにスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を形成することを指す。
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量体化ドメイン、インテイン、ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン、または、特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３セリンと残基７１４グリシンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。ＦＲＢドメインは、２つの部分のうち１つに接続され得て、ＦＫＢＰドメインは、他方に接続され得る。それにより生成されるスプリット型ＳｐＣａｓ９において、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体として形成され得て、それにより、再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素を生成する。
本発明において説明されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ポリペプチド、タンパク質、または、それをコードする配列を有する核酸であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するべく対象に対してコドン最適化され得る。
「コドン最適化」という用語は、宿主細胞における発現を改善するように、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより頻繁にまたはもっとも頻繁に使用されるコドンと置換しながら、天然アミノ酸配列を維持することによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンへの特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間におけるコドン使用率の差異）は、翻訳されるコドンの特徴、および、特定のｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる、ｍＲＮＡの翻訳の効率と頻繁に相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）は一般的に、ペプチド合成においてもっとも頻繁に使用されるコドンを反映する。このため、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現によりカスタマイズされ得る。
［３．標的配列］
「標的配列」という用語は、標的遺伝子または核酸に存在する塩基配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸に従って様々な形態で設計され得る標的遺伝子または核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に従って変動し得る塩基配列である。
標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相補結合を形成し得て、標的配列の長さは、ガイド配列と同一であり得る。
標的配列は５～５０塩基配列であり得る。
一実施形態において、標的配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
標的配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％以上の相補性または完全相補性を有し得る、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的な核酸配列であり得る。
一例において、標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない１～８塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
加えて、標的配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列に隣接する塩基配列であり得る。
一例において、標的配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する５～５０塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的配列は以下で説明される。
標的遺伝子または核酸がｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって標的化されるとき、標的配列は、ｇＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列との相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸に従って様々な形態に設計され得る標的遺伝子または核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に従って変動する塩基配列である。
加えて、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１によって認識されることが可能なＰＡＭ配列に隣接する塩基配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する５～５０の塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＧＧ－３'、５'－ＮＡＧ－３'、および／または、５'－ＮＧＡ－３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５の塩基配列であり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＧＧＮＧ－３'、および／または、５'－ＮＮＡＧＡＡＷ－３'（Ｗ＝ＡもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５塩基配列であり得る。
更に他の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３'、および／または、５'－ＮＮＮＧＣＴＴ－３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５の塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＮＮＶＲＹＡＣ－３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５塩基配列であり得る。
他の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｍＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＧＧ－３'および／または５'－ＮＡＡＲ－３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５の塩基配列であり得る。
更なる他の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'－ＮＮＧＲＲ－３'、５'－ＮＮＧＲＲＴ－３' および／または５'－ＮＮＧＲＲＶ－３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５の塩基配列であり得る。
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１であるとき、標的配列は、５'－ＴＴＮ－３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６～２５の塩基配列であり得る。
［４．ガイド核酸－エディタータンパク質複合体およびその使用］
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は標的を改変し得る。
標的は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
例えば、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、関心のあるタンパク質の発現を最終的に調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、新規のタンパク質を発現させるために使用され得る。
ここで、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
例えば、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的ＤＮＡの操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
別の例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的ＲＮＡの操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
一例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的遺伝子の操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
別の例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的染色体の操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。
一例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
別の例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、タンパク質のレベルで作用し得る。
一例において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、標的タンパク質を操作または改変し得て、それにより、標的タンパク質を除去し、または、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
本発明のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の使用の特定の例として、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用する、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体の操作または改変を以下で説明する。
［遺伝子操作］
標的遺伝子または核酸は、上述のｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修正され得る。ここで、標的遺伝子または核酸の操作または修正は、ｉ）標的遺伝子または核酸の開裂または損傷、および、ｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸の修復の段階のすべてを含む。
［ｉ）標的遺伝子または核酸の開裂または損傷］
ｉ）標的遺伝子または核酸の開裂または損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の開裂または損傷、特に、標的遺伝子または核酸における標的配列の開裂または損傷であり得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の開裂または損傷は、標的配列の二本鎖に対する完全な開裂または損傷であり得る。
例示的な一実施形態において、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は完全に開裂され得る。
他の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、開裂は、順番または同時に起き得る。
更に他の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）、ならびに、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡが使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、開裂は、順番または同時に起き得る。
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の開裂または損傷は、標的配列の一本鎖のみに対する開裂または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖、または、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖であり得る。
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、開裂されないことがあり得る。
他の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、開裂されないことがあり得る。
更なる別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の開裂または損傷は、核酸断片の部分的除去であり得る。
例示的な一実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、および、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は開裂され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、ならびに、ＳｐＣａｓ９による、核酸断片の除去をもたらす。
他の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
更に他の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補的二本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、ならびに、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
更なる他の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する３つのｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、第３ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第１ｇＲＮＡ、第２ｇＲＮＡ、第３ｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
更なる他の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する４つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第３ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって開裂され得て、第４ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって開裂され得て、第１ｇＲＮＡ、第２ｇＲＮＡ、第３ｇＲＮＡ、第４ｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
［ｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸の修復または復元］
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって開裂または損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）を通して修復または復元され得る。
［非相同末端結合（ＮＨＥＪ）］
ＮＨＥＪは、開裂された二本鎖または一本鎖の両方の末端を共に結合することによって、ＤＮＡにおける二本鎖の切断を復元または修復する方法である。一般的に、二本鎖の切断（例えば開裂）によって形成される２つの適合する末端が、頻繁に互いに接触して、２つの末端を完全に連結するとき、切断された二本鎖が回復する。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用されることが可能な復元方法であり、通常、Ｇ１期など、鋳型として使用される相同ゲノムが細胞に無いときに生じる。
ＮＨＥＪを使用する、損傷した遺伝子または核酸の修復プロセスにおいて、核酸配列におけるいくつかの挿入および／または欠失（インデル）がＮＨＥＪ修復領域において生じ、そのような挿入および／または欠失は、リーディングフレームのシフトを引き起こし、トランスクリプトームｍＲＮＡのフレームシフトをもたらす。結果として、ナンセンス媒介分解、または、正常タンパク質の合成の失敗が原因で、先天的機能が失われる。加えて、リーディングフレームが維持される一方で、大量の配列の挿入または欠失が生じ得る変異は、タンパク質の機能性を破壊する。重要な機能ドメインにおける変異は、タンパク質の非重要領域における変異より、おそらく許容性が低いので、変異は座位依存的である。
天然状態においてＮＨＥＪによりインデル変異が生じると予期するのは不可能であるが、所与の切断された領域では特定のインデル配列が好適であり、マイクロホモロジーの小さい領域に由来し得る。従来、欠失の長さは、１ｂｐ～５０ｂｐの範囲に及び、挿入は、より短い傾向があり、切断された領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
加えて、ＮＨＥＪは、変異を引き起こすプロセスであり、特定の最終的な配列を生成する必要がないとき、小さい配列のモチーフの除去に使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的化される遺伝子の特異的なノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して実行され得る。標的遺伝子または核酸の二本鎖または２つの一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して開裂され得て、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または２つの一本鎖は、ＮＨＥＪを通してインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または核酸の特異的なノックアウトを誘導する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって開裂される標的遺伝子または核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得て、加えて、ＮＨＥＪにより復元される標的遺伝子または核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得る。
［相同組換え修復（ＨＤＲ）］
ＨＤＲは、エラーが無い修正方法であり、相同配列を鋳型として使用して、損傷した遺伝子または核酸を修復または復元し、一般的に、切断されたＤＮＡを修復または復元する、すなわち、細胞の先天的情報を回復し、切断されたＤＮＡは、改変されていない相補的塩基配列の情報または姉妹染色分体の情報を使用して修復される。もっとも一般的な種類のＨＤＲは、相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、活発に分裂している細胞のＳまたはＧ２／Ｍ期に通常生じる修復または復元方法である。
細胞の相補的塩基配列または姉妹染色分体を使用する代わりにＨＤＲを使用して、損傷したＤＮＡを修復または復元するために、相補的塩基配列または相同塩基配列の情報を使用して人工的に合成されるＤＮＡ鋳型、すなわち、相補的塩基配列または相同塩基配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得て、それにより、切断されたＤＮＡを修復する。ここで、切断されたＤＮＡを修復するために核酸配列または核酸断片が核酸鋳型に更に追加されるとき、切断されたＤＮＡに更に追加される核酸配列または核酸断片は、ノックインの対象になり得る。更に追加される核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
一例において、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して開裂され得て、開裂部位に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され得て、標的遺伝子または核酸の開裂された塩基配列は、ＨＤＲを通して修復または復元され得る。
ここで、相補的塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、相補的塩基配列の開裂された二本鎖または一本鎖を有し得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的塩基配列に挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡの開裂部位、すなわち、標的遺伝子または核酸に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡとの相補結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の開裂された二本鎖または一本鎖の左右の塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡとの相補結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の開裂された二本鎖または一本鎖の３'末端および５'末端であり得る。相補的塩基配列は、１５～３０００塩基配列であり得て、相補的塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子のサイズに従って好適に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得る、または、核酸鋳型は鎖状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
別の例において、二本鎖または一本鎖の標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して開裂され、開裂部位に隣接する塩基配列を有する相同塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され、標的遺伝子または核酸の開裂された塩基配列は、ＨＤＲによって修復または復元され得る。
ここで、相同塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、開裂された二本鎖または一本鎖相同塩基配列であり得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含む。追加の核酸配列または核酸断片は、相同塩基配列、および、挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または核酸の開裂部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、開裂された二本鎖塩基配列、または、標的遺伝子または核酸の左右の一本鎖塩基配列との相同性を有する塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または核酸の開裂された二本鎖または一本鎖の３'末端および５'末端との相同性を有する塩基配列であり得る。相同塩基配列は、１５～３０００塩基配列であり得て、相同塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型のサイズ、または、標的遺伝子または核酸に従って好適に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖核酸が使用され得て、鎖状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外にも、切断されたＤＮＡを修復または復元する方法がある。
［一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）］
ＳＳＡは、標的核酸に存在する２つの反復配列の間の二本鎖の切断を修復する方法であり、一般的に、３０より多くの塩基の反復配列を使用する。反復配列は、切断末端の各々において、標的核酸の二本鎖に関して、一本鎖を有するように（付着末端を有するように）開裂され、開裂後、反復配列を含む一本鎖のオーバーハングは、ＲＰＡタンパク質でコーティングされ、それにより、反復配列が互いに不適切にアニーリングすることを防止する。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的反復配列をアニーリング可能な配列が構成される。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップが開裂され、新規のＤＮＡの合成が特定のギャップを満たし、ＤＮＡ二本鎖を復元する。この修復の結果、２つの反復の間のＤＮＡ配列は除去され、除去される長さは、本明細書において使用される２つの反復の場所、および、開裂の進捗の経路または程度を含む、様々な因子に依存し得る。
ＨＤＲと同様に、ＳＳＡは相補的配列、すなわち、相補的反復配列を利用し、対照的に、標的核酸配列を改変または修正するために核酸鋳型を必要としない。
［一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）］
ゲノムにおける一本鎖切断は、上述の修復機構とは別個の機構であるＳＳＢＲを通して修復される。一本鎖ＤＮＡ切断の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識し、修復機構を集める。ＤＮＡ切断部に関するＰＡＲＰ１の結合および活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域におけるＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することによって促進される。ＳＳＢＲ複合体におけるもっとも重要なタンパク質は、ＤＮＡの３'末端および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化するＸＲＣＣ１である。末端処理は一般的に、損傷３'末端をヒドロキシル化状態に、および／または、損傷５'末端をリン酸塩部分に修復することに関与し、末端の処理後、ＤＮＡギャップフィリングが起きる。ＤＮＡギャップフィリングには２つの方法、すなわち、短いパッチの修復、および長いパッチの修復があり、短いパッチの修復は、単一の塩基の挿入を伴う。ＤＮＡギャップフィリング後、ＤＮＡリガーゼは末端の連結を促進する。
［ミスマッチ修復（ＭＭＲ）］
ＭＭＲは、ミスマッチしたＤＮＡ塩基に作用する。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体の各々は、ＡＴＰａｓｅ活性を有し、したがって、ミスマッチの認識および修復の開始において重要な役割を果たす。ＭＳＨ２／６は主に、塩基と塩基とのミスマッチを認識し、１または２つの塩基ミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は主に、より大きいミスマッチを認識する。
［塩基除去修復（ＢＥＲ）］
ＢＥＲは、細胞周期全体を通してはたらく修復方法であり、小さい非らせん歪み塩基損傷領域をゲノムから除去するのに使用される。損傷したＤＮＡにおいては、塩基をリン酸デオキシリボース主鎖に連結するＮグリコシド結合を開裂することによって、損傷した塩基が除去され、次いで、ホスホジエステル主鎖が開裂され、それにより、一本鎖ＤＮＡにおける切断部を生成する。形成される切断された一本鎖末端はそれにより除去され、除去された一本鎖に起因して生成されるギャップは新規の相補的塩基で充填され、次いで、新規に充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、損傷したＤＮＡの修復がもたらされる。
［ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）］
ＮＥＲは、ＤＮＡから大きいへリックス歪み損傷を除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されるとき、損傷した領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２～３０塩基の一本鎖ギャップがもたらされる。生成されたギャップは、新規の相補的塩基で充填され、新規に充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、損傷したＤＮＡの修復がもたらされる。
［遺伝子操作効果］
標的遺伝子または核酸の操作または修正は概ね、ノックアウト、ノックダウン、ノックインの効果をもたらし得る。
［ノックアウト］
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳が生じない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子、または、異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを通して阻害され得て、タンパク質発現の防止がもたらされる。
例えば、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、標的遺伝子または核酸はＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して開裂され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＮＨＥＪを通して修復され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または核酸に対する特異的なノックアウトが誘導され得る。
［ノックダウン］
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳、または、標的タンパク質の発現の減少を指す。ノックダウンを通して遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することによって、疾患の発現は防止され得る、または、疾患は治療され得る。
例えば、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素－転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち、転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して、標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は具体的には、標的遺伝子または核酸に結合し得て、標的遺伝子または核酸の転写は、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され得て、それにより、対応する遺伝子または核酸の発現が阻害されるノックダウンを誘導する。
［ノックイン］
「ノックイン」という用語は、特定の核酸または遺伝子を標的遺伝子または核酸に挿入することを指し、特に、「特定の核酸」という用語は、挿入される、または、発現されることが所望される遺伝子または核酸を指す。ノックインは、正常な遺伝子を挿入することにより、疾患を引き起こす変異遺伝子を正確に修正する、または、正常な遺伝子発現を誘導することによって、疾患の治療に使用され得る。
加えて、ノックインは追加のドナーを必要とし得る。
例えば、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体）を使用して標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して開裂され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＨＤＲを介して修復され得る。特に、特定の核酸は、ドナーを使用して、損傷した遺伝子または核酸に挿入され得る。
「ドナー」という用語は、ＨＤＲを介して、損傷した遺伝子または核酸を修復することを助ける核酸配列を指し、特に、鋳型は特定の核酸を含み得る。
ドナーは、二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。
ドナーは鎖状または環状であり得る。
ドナーは、標的遺伝子または核酸との相同性を有する核酸配列を含み得る。
例えば、ドナーは、特定の核酸が挿入される位置（例えば、損傷した核酸の上流および下流）でヌクレオチド配列との相同性を有する核酸配列をそれぞれ含み得る。特に、挿入される特定の核酸は、損傷した核酸の下流の核酸配列との相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の核酸配列との相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。特に、上記の相同性を有する核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
ドナーは任意で追加の核酸配列を含み得る。特に、追加の核酸配列は、ドナーの安定性、ノックイン効率、または、ＨＤＲ効率を増強する役割を有し得る。
例えば、追加の核酸配列は、ＡおよびＴ塩基が豊富な核酸配列（すなわち、Ａ－Ｔリッチドメイン）であり得る。代替的に、追加の核酸配列は、足場／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）であり得る。
［５．他の追加の成分］
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の効率を増加させる、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するため、追加の成分が選択的に追加され得る。
追加の成分は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の効率を改善するために選択的に使用され得る。
［活性化因子］
追加の成分は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の、標的核酸、遺伝子または染色体の開裂効率を増加させるために、活性化因子として使用され得る。
「活性化因子」という用語は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させるように、または、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体がより容易に標的核酸、遺伝子または染色体に接近することを可能にするように機能する核酸を指す。
活性化因子は二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。
活性化因子は鎖状または環状であり得る。
活性化因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させる「ヘルパー」と、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体がより容易に標的核酸、遺伝子または染色体に接近することを可能にするように機能する「エスコーター」とに区分され得る。
ヘルパーは、標的核酸、遺伝子または染色体に関するガイド核酸－エディタータンパク質複合体の開裂効率を増加させ得る。
例えば、ヘルパーは、標的核酸、遺伝子または染色体との相同性を有する核酸配列を含む。このため、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体が標的核酸、遺伝子または染色体に結合するとき、ヘルパーに含まれる相同核酸配列は、標的核酸、遺伝子または染色体との追加の相補結合を形成し得て、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させる。
エスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体に関するガイド核酸－エディタータンパク質複合体の開裂効率を増加させ得る。
例えば、エスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体との相同性を有する核酸配列を含む。ここで、エスコーターに含まれる相同核酸配列は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体のガイド核酸との相補結合を部分的に形成し得る。このため、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体との相補結合を部分的に形成するエスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体との相補結合を部分的に形成し得て、結果として、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体が標的核酸、遺伝子または染色体の位置に正確に接近することを可能にし得る。
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
加えて、追加の成分は、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するために選択的に使用され得る。
［アシスタ］
損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するためのアシスタとして、追加の成分が使用され得る。
「アシスタ」という用語は、修復プロセスに参加する、または、例えば、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される遺伝子または核酸など、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を増加させるように機能する核酸を指す。
アシスタは、二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。
アシスタは鎖状または環状で存在し得る。
「アシスタ」は、ＮＨＥＪを使用する修復プロセスに参加する、または、修復効率を改善する「ＮＨＥＪアシスタ」と、ＨＤＲを使用する修復プロセスに参加する、または、修復方法に従って修復効率を改善する「ＨＤＲアシスタ」とに区分され得る。
ＮＨＥＪアシスタは、ＮＨＥＪを使用して、修復プロセスに参加し得る、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善し得る。
例えば、ＮＨＥＪアシスタは、損傷した核酸配列の一部との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の一端（例えば、３'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得て、損傷した核酸配列の他端（例えば、５'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得る。加えて、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列が含まれ得る。そのような相同性を有する核酸配列は、損傷した核酸配列の２つの部分が近接して配置されるように支援し得て、それにより、ＮＨＥＪによる、損傷した核酸の修復効率を増加させる。
ＨＤＲアシスタは、ＨＤＲを使用する修復プロセスに参加し得る、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善し得る。
例えば、ＨＤＲアシスタは、損傷した核酸配列の一部との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の一端（例えば、３'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列、および、損傷した核酸配列の他端（例えば、５'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得る。代替的に、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列が含まれ得る。そのような相同性を有する核酸配列は、損傷した核酸配列の鋳型として機能し得て、ＨＤＲによる、損傷した核酸の修復効率を増加させる。
別の例において、ＨＤＲアシスタは、損傷した核酸配列の一部、および、特定の核酸、例えば、挿入される核酸または遺伝子との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列を含み得る。特定の核酸は、損傷した核酸の下流の塩基配列との相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の塩基配列との相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。そのような相同性を有する核酸配列、および、特定の核酸は、特定の核酸を損傷した核酸に挿入するドナーとして機能し得て、それにより、ノックインのためのＨＤＲ効率を増加させる。
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％。７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
［６．対象］
「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体がはたらく生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
対象は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物であり得る。
生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。
細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。
真核細胞は、植物細胞、動物細胞、または、ヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳または筋肉組織など、動物または人体の組織であり得る。
対象は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む標本または試料であり得る。
標本または試料は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物から取得され得て、唾液、血液、皮膚組織、癌細胞または幹細胞であり得る。
本発明における対象の実施形態として、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の標的遺伝子または核酸を含む対象を以下で説明する。
例えば、ＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子および／またはＴＥＴ２遺伝子は標的遺伝子であり得る。
一実施形態において、上記遺伝子の各々の標的配列は、ＰＡＭ配列（ＴがＵに変化している）を除き、表１において説明されている配列から選択される１または複数であり得る。この標的配列は、ガイド核酸の設計において基準として機能し得る。
すなわち、各遺伝子の標的配列領域、および、ガイドＲＮＡの対応する標的配列領域（ガイドＲＮＡの標的配列領域、および、標的配列領域とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するガイドＲＮＡの標的配列領域）のヌクレオチド配列は、上記の表１にまとめられている（表１に示される標的配列領域は、ＰＡＭ配列（５'－ＮＧＧ－３'）が３'末端に含まれる状態で説明されている）。
これらの標的配列領域は、標的配列を除いて、遺伝子のゲノムに任意の０ｂｐ～２ｂｐのミスマッチ領域が無い配列であり、低いオフターゲット効果、および、高効率の遺伝子修正を有することを特徴とする。
標的配列は、同時に２種類以上を標的とし得る。
遺伝子は、同時に２種類以上を標的とし得る。
相同遺伝子における２つ以上の標的配列、または、異種遺伝子における２つ以上の標的配列が同時に標的化され得る。
遺伝子における非コード領域またはコード領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー、３'ＵＴＲ、および／または、ポリアデニル化シグナル配列、または、転写配列（例えばイントロンまたはエクソン配列））が標的化され得る。
遺伝子のコード領域の上流の５０％が標的化され得る。
例示的な実施形態において、ＤＧＫａまたはＤＧＫｚがそれぞれ標的化され得る。
例示的な実施形態において、ＤＧＫａおよびＤＧＫｚが同時に標的化され得る。
本発明の一実施形態において、各遺伝子の人為的操作のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列に対応するガイド核酸配列が提供される。
本発明の一実施形態において、各遺伝子の人為的操作のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列に対応するガイド核酸配列と相互作用するエディタータンパク質（例えば、複合体を形成するタンパク質）が提供される。
本発明の一実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列領域に人為的操作が生じた、各遺伝子の核酸改変産物、および、その発現産物が提供される。
本発明の一実施形態において、各遺伝子の人為的操作のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および１１（Ａ２０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１および２３（ＤＧＫａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（ＥＧＲ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８９（ＰＤ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、１１０、１１１、１１２および１１３（Ｄｇｋζ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、１２８および１２９（Ｔｅｔ－２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２（ＰＳＧＬ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２、２５４、２５７および２６４（ＦＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５（ＫＤＭ６Ａ）のうち、１または複数の標的配列に対応するガイド核酸配列と、これらと相互作用するエディタータンパク質との間の複合体が提供される。
本発明の一実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および１１（Ａ２０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１および２３（ＤＧＫａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（ＥＧＲ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８９（ＰＤ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、１１０、１１１、１１２および１１３（Ｄｇｋζ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、１２８および１２９（Ｔｅｔ－２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２（ＰＳＧＬ－１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２、２５４、２５７および２６４（ＦＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５（ＫＤＭ６Ａ）の標的配列領域において人為的操作が生じた、各遺伝子の核酸改変産物、および、その発現産物が提供される。
［７．移入］
ガイド核酸、エディタータンパク質、または、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、様々な移入方法および様々な形態によって、対象に移入または導入され得る。
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態、または、その混合物の形態で対象に移入または導入され得る。
エディタータンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、エディタータンパク質をコードするポリペプチド、または、タンパク質の形態で対象に移入または導入され得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、各成分、すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態で標的に移入または導入され得る。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態を有するガイド核酸と、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態を有するエディタータンパク質との複合体として対象に移入または導入され得る。
加えて、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の効率を増加させる、または、阻害することが可能な追加の成分は、様々な移送方法によって、および、様々な形態で対象に移送または導入され得る。
［ｉ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態での移入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態は、当技術分野において既知の方法によって対象に移入または導入され得る。
または、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、ベクター、非ベクターまたはその組み合わせによって対象に移入または導入され得る。
ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。
非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
［ベクターに基づく導入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に移入または導入され得る。
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
例えば、ベクターは、ガイド核酸およびエディタータンパク質をそれぞれコードする複数の核酸配列を同時に含み得る。
例えば、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
例として、ガイド核酸に含まれるドメインはすべて１つのベクターに含まれ得る、または、分割されて、次いで、異なるベクターに含まれ得る。
例えば、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
一例において、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。
ベクターは、１または複数の調節／制御成分を含み得る。
ここで、調節／制御成分は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に従って好適なプロモーターを使用し得る。
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ－１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ－１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。
ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純疱疹ウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
一般的に、ウイルスは、宿主（例えば細胞）に感染し得て、それにより、ウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入する、または、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において一時的に発現され得る。代替的に、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において連続的に長時間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９か月、１または２年、または、恒久的）発現され得る。
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂ～５０ｋｂ変動し得る。そのようなパッケージング能力に応じて、ガイド核酸またはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質、および、追加の成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
一例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が、組み換えレンチウイルスによって移入または導入され得る。
別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって移入または導入され得る。
更に別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって移入または導入され得る。
更なる別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルスによって、例えば、本明細書において列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって、移入または導入され得る。
［非ベクターに基づく導入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターを使用して対象に移入または導入され得る。
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
非ベクターは、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメント、ソノポレーション、マグネットフェクション、一過性細胞圧縮またはスクイ―ジング（例えば、文献Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２－６３２７］において説明されている）、脂質を介したトランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、または、それらの組み合わせによって対象に移入または導入され得る。
例として、エレクトロポレーションを通した移入は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とをカートリッジ、チャンバー、または、キュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
別の例において、非ベクターは、ナノ粒子を使用して移入され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子、シリカなど）、または、有機ナノ粒子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた脂質など）であり得る。ナノ粒子の外側表面には、付着可能な正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）が結合され得る。
［ｉｉ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態での移入］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態のエディタータンパク質は、当技術分野において既知の方法によって対象に移入または導入され得る。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイ―ジング（例えば、文献［Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２－６３２７］において説明される）、脂質を介したトランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチドを媒介した移入、または、それらの組み合わせによって、対象に移入または導入され得る。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と共に移入され得る。
一例において、エレクトロポレーションを通した移入は、エディタータンパク質がガイド核酸と共に、または、ガイド核酸無しで導入されることになる細胞をカートリッジ、チャンバー、または、キュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
［ｉｉｉ）核酸－タンパク質混合物の形態での移入］
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の形態で、対象に移入または導入され得る。
例えば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物であり得る。エディタータンパク質はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
一例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸、および、タンパク質型エディタータンパク質、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むガイド核酸－エディタータンパク質複合体の形態で対象に移入または導入され得る。
本発明において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を対象に移入するための方法の実施形態として、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素、または、ｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の移入は以下で説明される。
［８．形質転換体］
「形質転換体」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が発現される生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質、または、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体がＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物の形態で導入された生物であり得る。
例えば、形質転換体は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含むベクターが導入された生物であり得る。ここで、ベクターは、非ウイルスベクター、ウイルスベクター、または、組み換えウイルスベクターであり得る。
別の例において、形質転換体は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が非ベクターの形態で導入された生物であり得る。ここで、非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ、または、それらの混合物であり得る。
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で導入された生物であり得る。
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または、それらの混合物の形態で導入された生物であり得る。
例えば、形質転換体は、ＲＮＡ型ガイド核酸およびタンパク質型エディタータンパク質を含むガイド核酸－エディタータンパク質複合体が導入された生物であり得る。
形質転換体は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体、またはタンパク質を含む生物であり得る。
生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。
細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。
真核細胞は植物細胞、動物細胞、または、ヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳または筋肉組織などの動物または人体組織であり得る。
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸－エディタータンパク質複合体が導入または発現される生物、または、当該生物から取得される標本または試料であり得る。
標本または試料は、唾液、血液、皮膚組織、癌細胞または幹細胞であり得る。
追加的に、一実施形態において、本発明は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子の標的部位における核酸改変に使用されるガイド核酸－エディタータンパク質複合体を提供する。
特に、遺伝子の標的部位との相補結合を形成可能なドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、単離された、または、非天然に生じるｇＲＮＡ分子およびそれをコードするＤＮＡ）が提供され得る。ｇＲＮＡ分子およびそれをコードするＤＮＡの配列は、これらの配列が表１の標的部位配列との相補的結合を有することができるように設計され得る。
追加的に、ｇＲＮＡ分子の標的部位は、第３の免疫調節因子が提供されるように構成され、第３の免疫調節因子は、免疫細胞の標的位置（例えば、二本鎖の切断部または一本鎖の切断部）の変化に関連する、または、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子における標的位置における特定の機能を有する。
追加的に、標的核酸における２つ以上の開裂イベント（例えば、二本鎖または一本鎖の切断）を見つけるために２つ以上のｇＲＮＡが使用されるとき、２つ以上の開裂イベントは、同一または異なるＣａｓ９タンパク質によって生成され得る。
ｇＲＮＡは、例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子のうち２つ以上の遺伝子を標的化可能であり得て、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、および／または、ＴＥＴ２遺伝子の各々における２つ以上の部位を標的化可能であり得て、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、および／または、ＴＥＴ２遺伝子の二本鎖および／または一本鎖の開裂を独立に誘導可能であり得て、または、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、および／または、ＴＥＴ２遺伝子の開裂部位に、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入を誘導可能であり得る。
追加的に、本発明の別の実施形態において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体を構成する核酸は、（ａ）本明細書において開示されるような、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、および／または、ＴＥＴ２遺伝子における標的部位配列に相補的なガイドドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードする配列、および、（ｂ）エディタータンパク質をコードする配列を含み得る。
特に、標的部位に応じて、２つ以上が（ａ）に存在し得て、相同性または２つ以上のエディタータンパク質が（ｂ）において使用され得る。
一実施形態において、核酸は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子の発現を低減、減少、または、阻害するために、免疫細胞のノックダウン標的位置に十分に近い酵素不活性エディタータンパク質またはその融合タンパク質（例えば、転写抑制ドメインの融合物）を標的化するように構成される。
追加的に、本発明の一実施形態において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体による免疫細胞発現遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２遺伝子）の操作は、任意の機構によって媒介され得る。
機構の例は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、合成依存的鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、または、一本鎖透過を含むが、これらに限定されない。
加えて、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の構造、機能、利用のすべての特徴は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、および／または、ＴＥＴ２遺伝子の操作に使用され得ることは明らかであろう。
本発明の一実施形態において、「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」を使用して取得される結果としての生成物である免疫系因子は、例えば、操作された遺伝子、操作された遺伝子により発現される産物、それを含む細胞、組成物、形質転換体などであり得る。
本発明の一実施形態において、免疫系因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作された免疫調節遺伝子、または、その発現タンパク質、および、それを含む細胞である。
本発明の一実施形態において、免疫系因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって遺伝子操作された免疫調節遺伝子、または、その発現タンパク質、および、それを含む細胞である。
本発明の一実施形態において、免疫系因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって操作された免疫調節遺伝子遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
本発明の一実施形態において、免疫系因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって遺伝子操作された免疫調節遺伝子、その発現タンパク質、操作された免疫調節因子および／またはタンパク質を含む細胞、または、操作された免疫調節因子、タンパク質および／または細胞を含む組成物である。
本発明の一実施形態において、免疫系因子は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって遺伝子操作された免疫調節遺伝子、その発現タンパク質、操作された免疫調節因子および／またはタンパク質を含む細胞、または、操作された免疫調節因子、タンパク質および／または細胞を含む組成物のうち１または複数の導入によって形成される形質転換体である。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体を使用して取得される結果としての生成物である免疫因子は、独立に、因子の各々の２つ以上を含み得て、更に、因子あたり２つ以上を含み得る。
例えば、免疫因子は、人工的に操作された免疫調節遺伝子、その発現タンパク質、および、それを含む細胞のうち２つ以上を同時に含む形態で提供され得て、人工的に操作された、１または２またはそれ以上の種類の免疫調節遺伝子が同時に提供され得て、人工的に操作された、１または２またはそれ以上の種類の免疫調節タンパク質が同時に提供され得て、人工的に操作された、１または２またはそれ以上の種類の免疫細胞が同時に提供され得て、人工的に操作された免疫因子のうち２つ以上の組み合わせが同時に提供され得る。
「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」を使用して取得される産物である免疫系因子の好適な例は、以下の構成を有し得る。
一実施形態において、免疫調節因子が遺伝子であるとき、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作される免疫調節遺伝子の構成は、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは、３ｂｐ～２５ｂｐヌクレオチド配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、および、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち１または複数の核酸改変を含み得る。
追加的に、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作される免疫調節遺伝子の構成は、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾を含み得る。
特に、「外来ヌクレオチド」という用語は、免疫調節遺伝子が保持するヌクレオチドではなく、外部で生成されるものすべて（例えば、異種生物に由来するヌクレオチド、または、人工的に合成されたヌクレオチド）を含む概念である。外来ヌクレオチドは、５０ｂｐ以下の小さいサイズのオリゴヌクレオチドだけでなく、特定の機能のタンパク質の発現のために、大きいサイズ（例えば、数百、数千、または、数万ｂｐ）のヌクレオチドも含む。そのような「外来ヌクレオチド」はドナーと称され得る。
化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化、グリコシル化を含み、例えば、ヌクレオチドの官能基の一部は、これらに限定されないが、水素原子、フッ素原子、－Ｏ－アルキル基、－Ｏ－アシル基、および、アミノ基のうち任意の１つと置換される。追加的に、核酸分子を移入する能力を増加させるために、ヌクレオチドの官能基の一部は、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｒ、－Ｒ'ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－Ｎ３および－ＣＮ（Ｒ＝アルキル、アリール、アルキレン）のうち任意の１つと置換され得る。追加的に、少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸主鎖は、アルキルホスホン酸形態、ホスホロアミド酸形態、ボラノリン酸形態のうち任意の１つと置換される。追加的に、化学修飾は、核酸分子に含まれる少なくとも１つのヌクレオチドが、架橋型核酸（ＬＮＡ）、非架橋型核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のうち任意の１つに置換されることを特徴とし得て、化学修飾は、核酸分子が、脂質、細胞膜透過ペプチド、細胞標的化リガンドから成る群から選択される１または複数に結合されることを特徴とし得る。
所望の免疫系を形成するべく、免疫調節遺伝子を人工的に構成する核酸は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって改変され得る。
免疫調節遺伝子の核酸の改変を含む、所望の免疫系を形成可能な部位は、標的配列または標的部位と称される。
「標的配列」は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の標的であり得て、標的配列は、これに限定されないが、エディタータンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含み得る。標的配列は、ガイド核酸の設計のための重要な基準を専門家に提供し得る。
核酸のそのような改変には、核酸の「開裂」が含まれる。
標的部位における「開裂」は、ポリヌクレオチドの共有結合主鎖の切断を指す。開裂は、これらに限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含み得て、様々な他の方法によって実行され得る。一本鎖の開裂および二本鎖の開裂の両方が可能であり得て、二本鎖の開裂は、２つの別個の一本鎖の開裂の結果として生じ得る。二本鎖の開裂は、平滑末端または付着末端を生成し得る。
不活性化されたエディタータンパク質が使用されるとき、特定の機能を保持する因子は、開裂処理無しで、標的部位または免疫調節遺伝子の任意の部分の近くに配置されるように誘導され得る。この特定の機能に応じて、１または複数のヌクレオチドの化学修飾は、免疫調節遺伝子の核酸配列に含まれ得る。
一実施形態において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体により形成される核酸の開裂を通して、標的および非標的活性に起因して、様々な挿入および欠失（インデル）が生じ得る。
「インデル」という用語は、いくつかのヌクレオチドがＤＮＡのヌクレオチド配列において挿入される、または、欠失する変異をまとめて指す。
上記のように、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体が免疫調節遺伝子の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を開裂するとき、インデルは、相同組換えまたは非相同末端連結（ＮＨＥＪ）機構による修復のプロセスにおいて標的配列に導入されるものであり得る。
本発明の人工的に操作された免疫調節遺伝子は、元の遺伝子の核酸配列が、核酸の開裂およびインデル、ドナーの挿入などによって改変されたものを意味し得て、人工的に操作された免疫調節遺伝子は、所望の免疫系の確立に貢献する（例えば、特定の免疫機能を促進または抑制または補足する効果の発揮）。
例えば、特定のタンパク質の発現および活性は、人工的に操作された免疫調節遺伝子によって促進され得る。
特定のタンパク質は、人工的に操作された免疫調節遺伝子によって不活性化され得る。
一例において、ゲノムにおける、免疫応答を下方制御する免疫調節遺伝子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１および／またはＴＥＴ２遺伝子）の特定の標的部位が、これらの遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするために開裂され得る。
別の例において、転写の変更のために、例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１および／またはＴＥＴ２遺伝子の転写の阻害、減少、または、低減のために、エディタータンパク質を標的化することによって、標的ノックダウンが媒介され得て、エディタータンパク質は、転写抑制剤ドメインまたはクロマチン改変タンパク質と融合し、酵素的に不活性である。
免疫細胞の活性は、人工的に操作された免疫調節遺伝子によって調節され得る。免疫細胞の増殖、生存、細胞傷害性、透過、サイトカイン放出などは調節できる。
治療効果（例えば、免疫機能、抗癌機能、抗炎症機能など）は、人工的に操作された免疫調節遺伝子によって実現できる。
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の構成的特徴に応じて、免疫調節遺伝子の標的部位によって保持される主なＰＡＭ配列は変動し得る。
以降、本発明は、エディタータンパク質および免疫調節遺伝子の代表例に関して説明するが、これらの実施形態は、具体的な説明を目的とするものに過ぎず、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
例えば、エディタータンパク質がストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＧＧ－３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）であり得て、開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＮＧＧ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ、または、２１ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
免疫調節遺伝子における以下の改変、すなわち、ａ）ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ）ＮＧＧ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ）ＮＧＧ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ）ａ）～ｃ）から選択された２つ以上の組み合わせに起因して、人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
例えば、エディタータンパク質がカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３'（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり得て、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）であり得る。開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ、または、２１ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
免疫調節遺伝子における、以下の改変、すなわち、ａ'）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'）ＮＮＮＮＲＹＡＣ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'）ＮＮＮＮＲＹＡＣ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'）ａ'）～ｃ'）から選択された２つ以上の組み合わせに起因する人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
例えば、エディタータンパク質がストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＡＧＡＡＷ－３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）であり得て、開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＮＮＡＧＡＡＷ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐまたは２１ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
免疫調節遺伝子における、以下の改変、すなわち、ａ''）ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ''）ＮＮＡＧＡＡＷ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ''）ＮＮＡＧＡＡＷ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ''）ａ''）～ｃ''）から選択された２つ以上の組み合わせに起因して、人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
例えば、エディタータンパク質がナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得て、開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐまたは２１ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
免疫調節遺伝子における、以下の改変、すなわち、ａ'''）ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'''）ＮＮＮＮＧＡＴＴ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'''）ＮＮＮＮＧＡＴＴ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して配置される、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'''）ａ'''）～ｃ'''）から選択された２つ以上の組み合わせに起因して、人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
例えば、エディタータンパク質がストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＮＮＧＲＲ（Ｔ）－３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、（Ｔ）は任意で含めることができる任意の配列）であり得て、開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＮＮＧＲＲ（Ｔ）－３'配列の５'末端または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ、または、２１ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
免疫調節遺伝子における、以下の改変、すなわち、ａ''''）５'－ＮＮＧＲＲ（Ｔ）－３'（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ''''）５'－ＮＮＧＲＲ（Ｔ）－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ''''）５'－ＮＮＧＲＲ（Ｔ）－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接して配置される、連続する１ｂｐ～２５ｂｐ（例えば、１７ｂｐ～２３ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ''''）ａ''''）～ｃ''''）から選択された２つ以上の組み合わせに起因して、人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
例えば、Ｃｐｆ１タンパク質がエディタータンパク質として使用されるとき、ＰＡＭ配列は、５'－ＴＴＮ－３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得て、開裂されるヌクレオチド配列領域（標的部位）は、標的遺伝子における５'－ＴＴＮ－３'配列の５'末端または３'末端に隣接する、連続する１０ｂｐ～３０ｂｐ（例えば、１５ｂｐ～２６ｂｐ、１７ｂｐ～３０ｂｐ、または、１７ｂｐ～２６ｂｐ）のヌクレオチド配列領域であり得る。
Ｃｐｆ１タンパク質は、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ、（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、ユーバクテリウム・エリゲンス、などの微生物に由来するもの、例えば、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユーバクテリウム・エリゲンスに由来するものであり得るが、微生物はこれに限定されない。
免疫調節遺伝子における、以下の改変、すなわち、ａ'''''）５'－ＴＴＮ－３'（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１０ｂｐ～３０ｂｐ（例えば、１５ｂｐ～２６ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'''''）５'－ＴＴＮ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１０ｂｐ～３０ｂｐ（例えば、１５ｂｐ～２６ｂｐ）のヌクレオチド配列領域における、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'''''）５'－ＴＴＮ－３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接して配置される、連続する１０ｂｐ～３０ｂｐ（例えば、１５ｂｐ～２６ｂｐ）のヌクレオチド配列領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'''''）ａ'''''）～ｃ'''''）から選択された２つ以上の組み合わせに起因して、人工的に操作された免疫調節遺伝子（例えば、人工的に操作されたＰＤ－１遺伝子、ＣＴＬＡ－４遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、Ｆａｓ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子、ＰＳＧＬ－１遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子）が提供され得る。
別の実施形態において、免疫調節因子がタンパク質であるとき、人工的に操作されたタンパク質は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体による直接的／間接的作用によって形成される、新規の、または、変更された免疫応答に関与するタンパク質のすべてを含み得る。
例えば、免疫調節因子は、これに限定されないが、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作された免疫調節遺伝子によって発現されるタンパク質、または、当該タンパク質の活性の影響によって、発現が増加または低下する他のタンパク質であり得る。
人工的に操作された免疫調節タンパク質は、人工的に操作された免疫調節遺伝子に対応するアミノ酸構成および活性を有し得る。
一実施形態において、（ｉ）発現の特性が変更された、人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
例えば、以下の特性、すなわち、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に起因する発現量の増減、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換に起因する発現量の増減、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入に起因する発現量の増減、または、融合タンパク質の発現もしくは特定のタンパク質の独立した発現、上記タンパク質の発現特性によって影響される第３のタンパク質の発現量の増減の１つを有するタンパク質改変が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に位置する、または、免疫調節遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、および、好ましくは３ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
（ｉｉ）構造特性が変化する人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
例えば、以下の特性、すなわち、
１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に起因する、コドンの変化、アミノ酸の変化、３次元構造の変化、
野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換に起因する、コドンの変化、アミノ酸の変化、および、３次元構造のその後の変化、
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入、または、特定のタンパク質との融合構造、または、特定のタンパク質が分離された独立構造に起因する、コドンの変化、アミノ酸の変化、３次元構造の変化、
上記の構造特性が変化するタンパク質による影響を受ける、コドンの変化、アミノ酸の変化、第３のタンパク質の３次元構造の変化
の１つを有するタンパク質改変が、免疫調節遺伝子の核酸配列における、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に位置する、またはＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは３ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
（ｉｉｉ）免疫機能の特性が変化した、人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
例えば、以下の特性、すなわち、
１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に起因するタンパク質改変による、特定の免疫機能の活性化または不活性化、または、新規の免疫機能の導入、
野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換に起因するタンパク質改変による、特定の免疫機能の活性化または不活性化、または、新規の免疫機能の導入、
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入に起因するタンパク質改変による、特定の免疫機能の活性化または不活性化、または、新規の免疫機能の導入（特に、特定のタンパク質の融合発現または独立発現によって、第３の機能が既存の免疫機能に導入され得る）、
上記の免疫機能の特性が変化したタンパク質によって影響される、第３のタンパク質の機能の変化
の１つを有するタンパク質改変が、免疫調節遺伝子の核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に位置する、または、ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは３ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
追加的に、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾によって人工的に操作されるタンパク質が含まれ得る。
例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化、グリコシル化により、タンパク質の発現特性、構造特性、免疫機能特性のうち１または複数の特性が、変化し得る。
例えば、ヌクレオチドの化学修飾により第３のタンパク質を遺伝子の核酸配列に結合させることによって、第３の構造および機能が、付与され得る。
別の実施形態において、「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」を使用して取得される産物としての免疫系因子である、人工的に操作された細胞が提供される。
人工的に操作された細胞は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作された免疫調節遺伝子と、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の直接的／間接的作用によって形成される、新規の、または、変更された免疫応答に関与するタンパク質とのうち１または複数を含む細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、免疫細胞または幹細胞であり得る。
これらの細胞は、上記の人工的に操作された免疫調節遺伝子および／またはタンパク質によって発揮される免疫機能、および、その細胞内機構に関与する後続の機能を保持する。
更に別の実施形態において、「ガイド核酸－エディタータンパク質複合体」を使用して取得される産物としての免疫系因子である、所望の免疫反応を誘導する組成物が提供される。この組成物は、医薬組成物または治療用組成物と称され得る。
所望の免疫反応を誘導する組成物は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作される免疫調節遺伝子と、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体の直接的／間接的作用によって形成される、新規の、または、変更された免疫応答に関与するタンパク質と、免疫調節遺伝子および／またはタンパク質を含む細胞とのうち１または複数を活性成分として含み得る。
これらの組成物は、上記の人工的に操作された免疫調節遺伝子、タンパク質、および／または、細胞によって発揮される免疫機能、および、身体におけるそれらの様々な機構に関与する後続の機能を保持する。
組成物（例えば細胞治療剤）は、免疫関連疾患（例えば癌）の防止および／または治療に使用され得る。
［調製方法］
本発明の一実施形態として、人工的に操作された免疫調節因子、および、それを含む免疫細胞を調製するための方法が提供される。
人工的に操作された免疫調節因子の説明については、上記の説明を参照されたい。以降、上記の方法は、操作された免疫細胞の代表的実施形態に注目して説明される。
［細胞培養］
操作された免疫細胞を生成するべく、まず、健康なドナーから細胞が採取されて培養される。例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など）は、既知の方法を使用してドナーから採取され、適切な細胞培養液で培養される。
後に説明されるように、培養される免疫細胞によって発現される免疫調節因子のいくつかが選択され、人工的に操作される。例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、および／または、ＴＥＴ２遺伝子が遺伝子操作される。遺伝子操作の詳細な説明については、上記を参照されたい。
代替的に、免疫細胞がトランスフェクトされ、次いで、操作された免疫細胞を生成するために培養される。
［機能的に操作された免疫細胞を生成する方法］
機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子としてのタンパク質を挿入または除去することによって生成され得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子としての遺伝子を改変することによって生成され得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体または免疫調節遺伝子のノックダウン（ＫＤ）またはノックアウト（ＫＯ）によって生成され得る。ノックダウンまたはノックアウトとは、標的遺伝子の開裂、ＤＮＡの転写阻害剤、ＲＮＡ翻訳阻害剤（例えば、相補的マイクロＲＮＡなど）などを介した遺伝子発現の抑制を指す。
ノックダウンまたはノックアウトは、マイクロＲＮＡを介して実現され得る。
ノックダウンまたはノックアウトは、好ましくは、本発明のガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって実現され得る。
ノックダウンまたはノックアウトは、遺伝子はさみを使用して、ＮＨＥＪを介して実現され得る。
ノックダウンまたはノックアウトは、遺伝子はさみ、および、ヌクレオチドの鋳型を使用するＨＲを介して実現され得る。
一例において、ノックダウンまたはノックアウトは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、および／または、ＴＥＴ２遺伝子の特定の標的部位を開裂することによって実現され得る。
機能的に操作された免疫細胞は、標的領域の改変、例えば、遺伝子のコード領域に非常に近い、または、その中にあるコード領域における１または複数のヌクレオチドの挿入または欠失（例えば、ＮＨＥＪを介した挿入または欠失）、遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失（例えば、ＮＨＥＪを介した欠失）、遺伝子の非コード領域を標的化することによる、酵素的に不活性のエディタータンパク質によって媒介される遺伝子のノックダウンまたはノックアウトの改変（例えば、プロモーター領域）を含み得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体または免疫調節遺伝子のトランスフェクションによって生成され得る。
トランスフェクションの方法は、標的遺伝子を含むエピソームの挿入、または、ゲノムへの融合を含む。
トランスフェクションは、エピソームの挿入により達成され得る。エピソームベクターとは、真核細胞生物の核において外来遺伝子として作用し、ゲノムに融合しないベクターを指す。特に、エピソームはプラスミドであり得る。
トランスフェクションは、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体およびヌクレオチドの鋳型を使用するＨＲを介して達成され得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、同時に野性型受容体または免疫調節遺伝子をノックアウトしながら、異なる野性型受容体または免疫調節遺伝子のトランスフェクションによって生成され得る。トランスフェクション方法は、標的遺伝子を含むエピソームの挿入、または、ゲノムへの融合を含む。
特に、トランスフェクトされる遺伝子は、ノックアウトされる遺伝子の位置に融合され得る。
トランスフェクションは、エピソームの挿入により達成され得る。
トランスフェクションは、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体、および、ヌクレオチドの鋳型を使用したＨＲによって達成され得る。
［人工構造を補足した免疫細胞を生成する方法］
人工構造を補足した免疫細胞は、タンパク質の形態で、人工構造を免疫細胞に直接補足することによって生成され得る。
人工構造を補足した免疫細胞は、人工構造をコードする遺伝子のトランスフェクションによって生成され得る。
トランスフェクションの方法は、標的遺伝子を含むエピソームの挿入、または、ゲノムへの融合を含む。
トランスフェクションは、エピソームの挿入によって達成され得る。
トランスフェクションは、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体およびヌクレオチドの鋳型を使用するＨＲを介して達成され得る。
一実施形態において、免疫細胞における１または複数の免疫調節遺伝子を不活性化する方法が提供され、当該方法は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を免疫細胞に導入すること（トランスフェクション）を含む。
一実施形態において、トランスフェクトされた免疫細胞を調製する方法が提供され、当該方法は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を免疫細胞に導入すること（トランスフェクション）を含む。
［操作されたハイブリッド免疫細胞を生成する方法］
操作されたハイブリッド免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞を生成する方法、および、人工構造を補足した免疫細胞を生成する方法で説明されるタンパク質または遺伝子を操作する方法によって調製され得る。
操作されたハイブリッド免疫細胞を生成する方法は、野性型受容体または免疫調節因子をノックアウトすること、または、トランスフェクションを実行することを含む。この段階は、機能的に操作された免疫細胞を生成する方法において説明される方法に従って実現され得る。
操作されたハイブリッド免疫細胞を生成する方法は、人工構造をトランスフェクトすることを含む。この段階は、人工構造を補足した免疫細胞を生成する方法において説明される方法に従って実現され得る。
操作されたハイブリッド免疫細胞を生成する方法の好適な態様は、同時に免疫細胞の野性型受容体をノックアウトしながら、人工構造のトランスフェクションを実行することである。
一例において、方法は、同時に免疫細胞のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４をノックアウトしながら、人工構造のトランスフェクションを実行することである。
別の例において、操作されたハイブリッド免疫細胞を生成する方法は、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）、ＤＧＫ－アルファ、ＤＧＫ－ゼータ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａおよび／またはＴＥＴ２をノックアウトしながら、人工構造のトランスフェクションを実行することである。
特に、トランスフェクトされる遺伝子は、ノックアウトされる遺伝子と同一位置に融合し得る。
上記の操作される免疫は、既知の方法を使用して、例えば、一般的に組み換えベクターを採用して生成され得る。
［免疫細胞のための組み換え発現ベクター］
「発現標的配列」という用語は、標的細胞のタンパク質または遺伝子、または、新規に発現される遺伝子をコードするヌクレオチド配列を改変するための手段を指す。本発明の一実施形態において、発現標的配列は、ガイド核酸およびエディタータンパク質をコードする配列、および、ガイド核酸およびエディタータンパク質を発現するための追加配列を含み得る。
「組み換えベクター」という用語は、発現標的配列を標的細胞に輸送するように機能するトランスポーターを指し、例えば、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクターなどを含む。
組み換えベクターの実施形態である「組み換え発現ベクター」という用語は、標的細胞において発現される組み換えベクターに結合する発現標的配列の機能を更に発揮する人工的に構築されたベクターを指す。
組み換え発現ベクターである、免疫細胞のための組み換え発現ベクターは、操作された免疫細胞として免疫細胞を発現させるように免疫細胞のタンパク質または遺伝子を改変するための手段である、または、新規に発現される遺伝子をコードする組み換え発現ベクターである。
免疫細胞のための組み換え発現ベクターは、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の発現のための組み換え発現ベクターを含む。
一実施形態において、操作された免疫細胞は、免疫細胞のための組み換え発現ベクターの１種をトランスフェクトすることのみによって取得され得る。
操作された免疫細胞は、免疫細胞のための２種類以上の組み換え発現ベクターをトランスフェクトすることによって取得され得る。
免疫細胞のための組み換え発現ベクターは、最終的に発現されるヌクレオチド配列のサイズに従って、組み換え発現ベクターを適切な数の組み換え発現ベクターに分裂させることによって設計され得る。
（機能的に操作された組み換え発現ベクター）
一実施形態において、機能的に操作された免疫細胞を調製するための組み換え発現ベクターが提供される。
一実施形態において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、野性型受容体または免疫調節因子遺伝子をノックアウトするための組み換えヌクレオチド配列を含む。
遺伝子をノックアウトするための組み換え発現ベクターは、上記ガイド核酸－エディタータンパク質複合体を発現するための組み換え発現ベクターを含む。特に、ｇＲＮＡの標的配列は、野性型受容体のヌクレオチド配列、または、免疫調節因子のヌクレオチド配列との相補性を有し得る。追加的に、組み換え発現ベクターは、必要に応じて、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される位置に挿入されるヌクレオチドの鋳型を含み得る。
一実施形態において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、野性型受容体または免疫調節因子遺伝子のトランスフェクションのための組み換えヌクレオチド配列を含む。
特に、機能的に操作された組み換え発現ベクターはエピソームベクターであり得る。エピソームベクターは遺伝子発現のためのプロモーターを含み得る。
一実施形態において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、生体のゲノムに融合する機能を有するものであり得る。特に、機能的に操作された組み換え発現ベクターはウイルスベクターであり得る。特に、好適なウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
一実施形態において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、挿入標的部位と相同であるヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチド配列は、ＨＲプロセスの間に挿入されるヌクレオチドの鋳型であり得る。ヌクレオチドの鋳型は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される領域の配列と相同であり得る。
一実施形態において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、独立に、同一ベクター内または異なるベクター内のいずれかで、上記のようなガイド核酸－エディタータンパク質複合体の発現のための配列を含み得る。
別の態様において、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、野性型受容体、または、免疫調節因子遺伝子をノックアウトするための、または、異なる野性型受容体または免疫調節因子遺伝子のトランスフェクションのための組み換えヌクレオチド配列を含む。
遺伝子をノックアウトするための組み換えヌクレオチド配列は、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体を発現するための組み換え発現ベクターのヌクレオチド配列を含む。特に、ｇＲＮＡの標的配列は、免疫調節因子のヌクレオチド配列との相補性を有し得る。
トランスフェクションのための組み換え発現ベクターはエピソームベクターであり得る。特に、エピソームベクターは、遺伝子発現のプロモーターを含み得る。
トランスフェクションのための組み換え発現ベクターは、生体のゲノムへ融合する機能を有し得る。
トランスフェクションのための組み換え発現ベクターはウイルスベクターであり得る。特に、好適なウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
トランスフェクションのための組み換え発現ベクターは、挿入標的部位に相同であるヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチド配列は、ＨＲプロセスの間に挿入されるヌクレオチドの鋳型であり得る。ヌクレオチドの鋳型は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される領域の配列に相同であり得る。
追加的に、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の発現のための組み換え発現ベクターを含み得る。
（人工構造を補足した組み換え発現ベクター）
一実施形態において、人工構造を補足した免疫細胞を調製するための組み換え発現ベクターが提供される。
人工構造を補足した組み換え発現ベクターは、免疫調節因子遺伝子をトランスフェクトするための組み換えヌクレオチド配列を含む。
一例において、人工構造を補足した組み換え発現ベクターは、エピソームベクターであり得る。エピソームベクターは、真核細胞生物の核において外来遺伝子として作用し、ゲノムに融合しないベクターを指す。特に、エピソームベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含み得る。
別の例において、人工構造を補足した組み換え発現ベクターは、生体のゲノムに融合する機能を有し得る。
特に、人工構造を補足した組み換え発現ベクターはウイルスベクターであり得る。特に、好適なウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
追加的に、人工構造を補足した組み換え発現ベクターは、挿入部位と相同であるヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチド配列は、ＨＲプロセスの間に挿入されるヌクレオチドの鋳型であり得る。ヌクレオチドの鋳型は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される配列と相同であり得る。
追加的に、人工構造を補足した組み換え発現ベクターは、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の発現のための組み換え発現ベクターを含み得る。
（ハイブリッド操作された組み込み発現ベクター）
ハイブリッド操作された組み込み発現ベクターは、野性型受容体、または、免疫調節因子遺伝子をノックアウトするための、および、異なる遺伝子を人工構造でトランスフェクトするための組み換えヌクレオチド配列を含み得る。
遺伝子をノックアウトするための組み換えヌクレオチド配列は、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体を発現するための組み換え発現ベクターのヌクレオチド配列を含み得る。特に、ｇＲＮＡの標的配列は、免疫調節因子のヌクレオチド配列と相補性を有し得る。
一例において、トランスフェクションのための組み換え発現ベクターはエピソームベクターであり得る。特に、エピソームベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含み得る。
別の例において、トランスフェクションのための組み換え発現ベクターは、生体のゲノムと融合する機能を有し得る。
特に、トランスフェクションのための組み換え発現ベクターはウイルスベクターであり得る。特に、好適なウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
追加的に、トランスフェクションのための組み換え発現ベクターは、挿入標的部位と相同であるヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチド配列は、ＨＲプロセスの間に挿入されるヌクレオチドの鋳型であり得る。ヌクレオチドの鋳型は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって開裂される配列と相同であり得る。
追加的に、機能的に操作された組み換え発現ベクターは、上記のガイド核酸－エディタータンパク質複合体の発現のための組み換え発現ベクターを含み得る。
一方、本発明の特定の例示的な実施形態において、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に操作された免疫調節因子を含む免疫細胞を調製するための方法が提供される。
一実施形態において、方法は、細胞における標的核酸の配列が変更される、操作された免疫細胞を調製するためのものであり得て、当該方法は、（ａ）ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１および／またはＴＥＴ２遺伝子を標的化する１または複数のガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）、および、（ｂ）エディタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に細胞を接触させることを含む。
接触させる方法は、従来の方法によって、ガイド核酸およびエディタータンパク質を免疫細胞に直接導入することであり得る。
接触させる方法は、ガイド核酸およびエディタータンパク質をコードする各ＤＮＡ分子を、１つのベクターに含まれる、または、別個のベクターにある状態で、免疫細胞に導入することであり得る。
接触させる方法は、ベクターを使用して実現され得る。ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルス、アデノ関連ベクターであり得る。
方法において、当技術分野で知られている様々な方法（例えば、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、および、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法など）が、免疫細胞への輸送のために採用され得る。
方法は更に、異なる遺伝子を標的化するｇＲＮＡを細胞に導入する、または、そのようなｇＲＮＡをコードする核酸を細胞に導入することを含み得る。
方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えばｅｘ ｖｉｖｏで進行し得る。
例えば、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行され得て、接触後、接触された細胞は対象の身体に戻され得る。
方法は、例えば、人体から単離された免疫細胞、または、人工的に生成された免疫細胞など、ｉｎ ｖｉｖｏの免疫細胞または生物を採用し得る。一例において、癌を患う対象からの細胞を接触させることが含まれ得る。
上記の方法において使用される免疫細胞は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳類に由来する免疫細胞であり得る。例えば、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などであり得る。特に、免疫細胞は、免疫受容体が補足された（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が補足された）操作された免疫細胞であり得る。免疫細胞は、免疫受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＧＫＡ（Ｄｇｋα）、ＤＧＫＡＺ（Ｄｇｋζ）、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１および／またはＴＥＴ２遺伝子のうち１または複数の遺伝子における、免疫細胞の標的位置変異の導入に関して、前、後、または同時に発現されるように操作され得る。
方法は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファを含み得る、免疫細胞のための適切な培地において、または、当業者に知られている、細胞の増殖のための他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地、ＲＰＭＩ培地１６４０、または、Ｘ－ｖｉｖｏ－１０、－１５、－２０（ロンザ））において実行され得るが、培地はこれらに限定されない。
［用途］
一実施形態において、本発明は、免疫療法のアプローチを使用する疾患の治療のための用途に関し、人工的に操作された細胞（例えば、遺伝子操作された免疫細胞または幹細胞）を対象に投与することを含む。
治療される対象は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳類であり得る。
［医薬組成物］
本発明の一実施形態は、免疫応答を使用する、疾患の治療における用途のための組成物であり、例えば、人工的に操作された免疫調節遺伝子またはそれを含む免疫細胞を含む組成物などである。組成物は、治療用組成物、医薬組成物、または、細胞治療剤と称され得る。
一実施形態において、組成物は免疫細胞を含み得る。
一実施形態において、組成物は、免疫調節のための人工的に操作された遺伝子、および／または、それにより発現されるタンパク質を含み得る。
免疫細胞は、既に分化を経た免疫細胞であり得る。
免疫細胞は、骨髄または臍帯血から抽出され得る。
免疫細胞は、幹細胞であり得る。特に、幹細胞は造血幹細胞であり得る。
組成物は操作された免疫細胞を含み得る。
組成物は、機能的に操作された免疫細胞を含み得る。
組成物は、人工構造を補足した免疫細胞を含み得る。
別の実施形態において、組成物は更に、追加の因子を含み得る。
組成物は、抗原結合剤を含み得る。
組成物はサイトカインを含み得る。
組成物はサイトカインの分泌促進剤または阻害剤を含み得る。
組成物は、操作された免疫細胞の身体への移入のための好適な担体を含み得る。
組成物に含まれる免疫細胞は、患者に対して同種異系であり得る。
［治療の方法］
本発明の別の実施形態は、患者における疾患を治療する方法であり、組成物（組成物の生成、および、組成物の有効量は上記の通り）をその必要に応じて患者に投与することを含む。
一実施形態において、方法は、養子免疫療法を利用するものであり得る。
［治療される疾患］
養子免疫療法は、任意の特定の疾患を治療するものであり得る。
任意の特定の疾患は免疫疾患であり得る。特に、免疫疾患は、免疫能力が低下した疾患であり得る。
免疫疾患は自己免疫疾患であり得る。
例えば、自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症などを含み得る。
免疫疾患は過形成性疾患であり得る。
例えば、免疫疾患は、血液癌または固形癌であり得る。代表的な血液癌には、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれる。固形腫瘍の例には、胆道癌、膀胱癌、骨および軟部組織癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸腺癌、大腸癌、デスモイド腫瘍、胚癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、原発性星状細胞腫、原発性甲状腺癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮細胞癌、子宮肉腫、子宮癌などが含まれる。
幅広い悪性固形腫瘍および血液癌を含む癌が、治療の対象疾患となり得る。
例えば、治療され得る癌の種類には、胸部、前立腺、膵臓、結腸、直腸腺癌と、すべての形態の肺の気管支原性癌（扁平上皮癌、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む）と、骨髄腫と、黒色腫と、ヘパトーマと、神経芽細胞腫と、乳頭腫と、アプドーマと、分離芽腫と、鰓裂嚢胞と、悪性カルチノイド症候群と、カルチノイド心疾患と、癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細、ブラウン・ピアース、導管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液、非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞、移行細胞）とが含まれる。
例えば、治療され得る追加の種類の癌には、組織球細胞障害、白血病、悪性組織球症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮腫、黒色腫、腎細胞癌、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、アダマンチオ、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍が含まれる。
更に、腺腫、胆管腫、真珠腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、性腺芽細胞腫、ヘパトーマ、汗腺腫、膵島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、子宮平滑筋腫、子宮肉腫、筋芽腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣腫、神経節腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クローム親和性傍神経節腫、多形性膠芽腫などの種類の癌も治療に適していると考えられ得る。
また、治療され得る癌の種類には、血管角化腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、血管硬化症、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢胞性肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、新生物、神経線維腫症、子宮頸部異形成が含まれ得る。
追加的に、任意の特定の疾患は、病原体が知られているが治療が知られていない難病であり得る。
難病はウイルス感染疾患であり得る。
難病はプリオン病原体によって引き起こされる疾患であり得る。
任意の特定の疾患は細菌性疾患であり得る。
任意の特定の疾患は炎症性疾患であり得る。
任意の特定の疾患は加齢に関連する疾患であり得る。
［免疫増強治療］
免疫が著しく低下した患者の場合、軽度な感染でも致命的結果をもたらすことがり得る。免疫低下は、免疫細胞の機能低下、免疫細胞生産量の低下などによって引き起こされる。免疫を増強して免疫機能の劣化を治療するための方法として、１つの方法は、正常免疫細胞の生産を活性化する恒久的治療方法であり得て、別の方法は、免疫細胞が一時的に注入される一時的治療方法であり得る。
免疫増強治療は、患者の身体に治療用組成物を注入して免疫を恒久的に増強することを意図するものであり得る。
免疫増強治療は、治療用組成物を患者の特定の身体部分に注入する方法であり得る。特に、特定の身体部分とは、免疫細胞発生源を供給する組織を有する部分であり得る。
免疫増強治療は、患者の身体において、免疫細胞の新規の発生源を生成することであり得る。特に、一例において、治療用組成物は幹細胞を含み得る。特に、幹細胞は、造血幹細胞であり得る。
免疫増強治療は、治療用組成物を患者の身体に注入して免疫を一時的に増強することを意図するものであり得る。
免疫増強治療は、患者の身体に治療用組成物を注入するものであり得る。
特に、好適な治療組成物は分化した免疫細胞を含み得る。
免疫増強治療に使用される治療用組成物は特定の数の免疫細胞を含み得る。
特定の数は、免疫の劣化の程度に応じて変動し得る。
特定の数は、身体の体積に応じて変動し得る。
特定の数は、患者から放出されるサイトカインの量に従って調節され得る。
［難病の治療］
免疫細胞操作技法は、ＨＩＶ、プリオン、癌などの病原体のための完全な治療が知られていない疾患を治療するための方法を提供し得る。これらの疾患の病原体は知られているが、抗体がほとんどと形成されない、疾患が急激に進行して患者の免疫系を不活性化する、病原体が身体において潜伏期間を有するという問題があるため、多くの場合、これらの疾患は治療が難しい。操作された免疫細胞は、これらの問題を解決するための強力な手段であり得る。
難病の治療は、治療用組成物を身体に注入することによって実行され得る。特に、好適な治療組成物は、操作された免疫細胞を含み得る。加えて、治療用組成物は、身体の特定の部分に注入され得る。
操作された免疫細胞は、標的疾患の病原体を認識する能力が改善された免疫細胞であり得る。
操作された免疫細胞は、免疫応答の強度または活性が増強されたものであり得る。
［遺伝子修正治療］
外部で抽出された免疫細胞を使用する治療方法に加えて、生体の遺伝子を操作することによって、免疫細胞の発現に直接影響する治療方法であり得る。そのような治療方法は、遺伝子を操作するための遺伝子修正組成物を身体に直接注入することによって実現され得る。
遺伝子修正組成物は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体を含み得る。
遺伝子修正組成物は、身体の特定の部分に注入され得る。
身体の特定の部分は、免疫細胞の発生源、例えば骨髄であり得る。
本発明の一実施形態は、上記の人工的に操作された免疫系の成分を含む有効量の組成物を対象に投与することによって免疫関連疾患を治療する方法に関する。
任意の実施形態において、治療方法は、例えばウイルスベクターなど、ｅｘ ｖｉｖｏの組み換え方式で操作または改変された細胞集団の使用を提供する。更なる実施形態において、改変された細胞集団は、相同、同種異系、または、自己細胞である。上記の実施形態のいずれかにおいて、操作または改変された細胞集団は更に、本明細書において説明されるような、薬学的に許容される担体、希釈剤、または、賦形剤と共に製剤化され得る。
投与の対象は、霊長類（例えば、ヒト、猿など）、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳類であり得る。
投与とは、移入の経路または方式に関係なく、物質を対象に移入することを指す。投与は、連続的または間欠的に、非経口的に実行され得る。
特定の実施形態において、アジュバント治療剤との併用投与は、任意の順序および任意の用法で複数の薬剤を同時および／または順次に移入することを伴い得る（例えば、抗原特異的組み換え宿主Ｔ細胞および抗原発現細胞との１または複数のサイトカインの投与、例えばカルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量ミコフェノール酸、プロドラッグ、または、それらの任意の組み合わせなどの免疫抑制療法）。
特定の実施形態において、投与は複数回、数週間、数か月、または、最大２年間の期間にわたって反復され得る。
組成物は、医療分野の当業者によって決定される、治療または予防される疾患または病状に好適な方式で投与され得る。組成物の適切な用量、好適な期間、および、投与頻度は、患者の健全状態、患者のサイズ（すなわち、重量、質量、身体の表面積）、患者の疾患の種類および重症度、活性成分の特定の形態、投与方法などの因子によって決定される。
例えば、組成物の投与は、例えば、注射、輸血、インプラント、移植などの任意の好都合な方式で実行され得る。投与経路は、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ管内、腹腔内の投与などから選択され得る。
組成物（所望の効果を達成するための薬学的有効量）の単回投与量は、投与される対象の体重（ｋｇ）あたり、約１０４～１０９の範囲のすべての整数値のうちから選択され得る個数の細胞（例えば、約１０５～１０６細胞／ｋｇ（体重））であり得るが、投与量はこれに限定されず、組成物の単回投与量は、投与される対象の年齢、健全状態、体重と、該当する場合は併用療法の種類と、治療の頻度と、所望の効果の性質とを考慮して適切に処方され得る。
人工的に操作された免疫調節因子が本明細書の方法および組成物によって調節されるとき、生存、増殖、持続性、細胞傷害性、サイトカイン放出および／または透過などに関与する、免疫細胞の免疫効果が改善され得る。
［実験例］
［例１：細胞調製（活性化および培養）およびトランスフェクション］
ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ／ＴＩＢ－１５２、ヒトＴ細胞の不死化細胞株）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＧｅｎｅＡｌｌ）が補足されたＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。３７℃および５％ＣＯ２の条件で、細胞を培養器において培養した。
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＧｅｎｅＡｌｌ）および／またはＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）が補足されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ）において、ヒトナイーブＴ細胞（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培養した。細胞活性化のために、培地における細胞の濃度は、それぞれ、１×１０６細胞／ｍＬに維持した。
ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビード（抗ＣＤ２／３／ＣＤ２８ダイナビーズ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を、３：１の比率（ビード：細胞、ビードおよび細胞の数）で追加し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で、培養器において細胞を培養した。細胞活性化を７２時間実行した後に、磁石を使用してＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビードを除去し、ビードの非存在下で、細胞を更に１２～２４時間培養した。
高効率で特異的遺伝子をノックアウト可能なｇＲＮＡを見つけるべく、以下の例２および３において説明されるように、エレクトロポレーション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によって、１μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｓｇＲＮＡ、および、４μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）を１×１０６個のジャーカット細胞に導入した。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、グランドアイランド、ニューヨーク州）の１０μＬのチップを使用して、以下の条件、すなわち、Ｊｕｒｋａｔｓ（緩衝液Ｒ）：１，４００Ｖ、２０ｍｓ、２パルスという条件で遺伝子を導入した。
同様に、Ｔ細胞における特異的遺伝子をノックアウトするべく、エレクトロポレーションによって、１μｇのｇＲＮＡおよび４μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）を１×１０６個のヒト一次Ｔ細胞に導入した。この試験で使用されるｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されてＡＰ（アルカリホスファターゼ）処理されたｓｇＲＮＡ、または、化学的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。エレクトロポレーションのために、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、グランドアイランド、ニューヨーク州）の１０μＬチップを使用して、以下の条件、すなわち、ヒト一次Ｔ細胞（緩衝液Ｔ）：１５５０Ｖ、１０ｍｓ、３パルスという条件で遺伝子を導入した。
細胞を５００μＬの非抗生物質培地に播種し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で、培養器において培養した。
［例２：ｓｇＲＮＡの設計および合成］
［２．１ ｓｇＲＮＡの設計］
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を使用して、ヒトＰＤ－１遺伝子（ＰＤＣＤ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８．２）、ＣＴＬＡ－４遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７６３１．２）、Ａ２０遺伝子（ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２７０５０７．１）、ＤＧＫ－アルファ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３４５．４）、ＤＧＫ－ゼータ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１０５５４０．１）、ＥＧＲ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３９９．４）、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２９１３１０．１）、ＰＳＧＬ－１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１９３５３８．１）、ＴＥＴ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１７６２８．４）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域を選択し、オフターゲット試験によって推定した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域について、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）におけるオンターゲット配列領域を除き、０、１、または２ｂｐのミスマッチ部位が無いＤＮＡ配列をｓｇＲＮＡの標的領域として選択した。
［２．２ ｓｇＲＮＡの合成］
２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングして延長することによって、ｓｇＲＮＡ合成のための鋳型をＰＣＲ増幅した。
このとき使用された標的領域配列、それを増幅するためのプライマー配列、および、それから取得されるｓｇＲＮＡによって標的化されるＤＮＡ標的配列を以下の表２において説明する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、鋳型ＤＮＡ（標的配列の３'末端におけるＮＧＧを除く）のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して実行し、ＲＮＡは、製造元の指示に従って合成し、次いで、ＤＮＡａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して鋳型ＤＮＡを除去した。転写されたＲＮＡは、Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびイソプロパノール沈殿によって精製した。
Ｔ細胞を使用する実験において、ｓｇＲＮＡの免疫原性および分解を最小化するべく、アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して上記の方法によって合成されたｓｇＲＮＡから、５'末端のリン酸残基を除去し、次いで、Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびイソプロパノール沈殿によってＲＮＡを再度精製した。加えて、いくつかのＴ細胞実験において、化学的に合成されたｓｇＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用した。
特定の例において使用された化学的に合成されたｓｇＲＮＡは、２'ＯＭｅおよびスホロチオエートで改変されたｓｇＲＮＡである。
例えば、この例において使用されたＤＧＫα ｓｇＲＮＡ ＃１１は、５'－２'ＯＭｅ（Ｃ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｃ（ｐｓ）） ＵＣＡ ＡＧＣ ＵＧＡ ＧＵＧ ＧＧＵ ＣＣＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＧ ＡＡＡ ＵＡＧ ＣＡＡ ＧＵＵ ＡＡＡ ＡＵＡ ＡＧＧ ＣＵＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＵＡＵ ＣＡＡ ＣＵＵ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＵ ＣＧＧ ＵＧＣ ２'ＯＭｅ（Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ－３'という構造を有する（２'ＯＭｅ＝２'－メチルＲＮＡ、ｐｓ＝スホロチオエート）。
別の例において、この実施形態で使用されるＡ２０ ｓｇＲＮＡ ＃１は、ＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＣＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵである（ＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＣＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡの部分は、標的配列領域にハイブリダイズされる配列であり、他の標的遺伝子または他の標的配列のｓｇＲＮＡは、その太字配列が標的配列を有することであり（ただし、ＴがＵに変化する）、配列の３'末端における３つのヌクレオチドおよび５'末端における３つのヌクレオチドが、２'－ＯＭｅおよびスホロチオエート主鎖導入により改変されるように改変される）。
［表２］
Figure 2023052426000012
Figure 2023052426000013
Figure 2023052426000014
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［２．３ディープシーケンシング］
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用して、オンターゲットおよびオフターゲット部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法により取得されたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ装置（イルミナ（登録商標））を使用してシーケンシングし、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮツールのＣａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）によって解析した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９開裂部位から５ｂｐ以内の挿入／欠失は、ＲＧＥＮにより誘導された変異と考えられる。
表４および表６に示されるように、ディープシーケンシングの結果として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が移入されたとき、様々な免疫細胞において、インデル変異が高効率で生じたことが確認された。
［例３：ｓｇＲＮＡの調製］
［３．１ ジャーカット細胞におけるｓｇＲＮＡのスクリーニング］
例２において説明された方法によって取得される、Ａ２０、ＤＧＫα、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２ｒ２ｄＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ｄｇｋζ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６Ａ、ＦＡＳ、ＴＥＴ２ＴＥＴ２ＴＥＴ２のエクソンを標的化するｓｇＲＮＡの活性をジャーカット細胞において試験した。
例２において取得されたｓｇＲＮＡの各々を、例１の方法によってＣａｓ９でトランスフェクトされたジャーカット細胞と、形質導入無しのジャーカット細胞との間のインデル率を比較することによって試験した。表３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列およびヒトゲノムにおける同様の標的配列を有するミスマッチ部位の数を示し、表４は、各ｓｇＲＮＡのインデル率を示す。各遺伝子を標的化するｇＲＮＡのうち、活性が良いＤＮＡ標的領域を太字で示す。
［表３］
Figure 2023052426000049
Figure 2023052426000050
Figure 2023052426000051
Figure 2023052426000052
Figure 2023052426000053
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Figure 2023052426000055
Figure 2023052426000056
Figure 2023052426000057
Figure 2023052426000058
［表４］
標的配列についてのジャーカット細胞に対する各ｓｇＲＮＡの活性
Figure 2023052426000059
Figure 2023052426000060
Figure 2023052426000061
Figure 2023052426000062
Figure 2023052426000063
Figure 2023052426000064
Figure 2023052426000065
Figure 2023052426000066
Figure 2023052426000067
［３．２ ヒト一次Ｔ細胞におけるｓｇＲＮＡの選択］
上記の例３．１において取得されたジャーカット細胞におけるｓｇＲＮＡ活性の結果に基づいて、ジャーカット細胞において比較的高い活性を有するｓｇＲＮＡ（表３および表４における太字を参照）を選択して、ヒト一次Ｔ細胞において試験した。
シングルまたはデュアルｇＲＮＡおよびＣａｓ９をヒト一次Ｔ細胞に移入した。試験したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列を表５に示す。ｓｇＲＮＡによるインデル率は、それぞれ、表６にまとめられている。
［表５］
ヒト一次Ｔ細胞における標的配列およびミスマッチ
Figure 2023052426000068
Figure 2023052426000069
［表６］
ヒト一次Ｔ免疫細胞における標的配列に対する各ｇＲＮＡの活性
Figure 2023052426000070
同様に、上記の例３．１において取得されたジャーカット細胞におけるｓｇＲＮＡ活性に結果に基づいて、ジャーカット細胞において比較的高い活性を有するＰＳＧＬ－１ ＃１７ ｓｇＲＮＡを選択して、ヒト一次Ｔ細胞における活性を試験した。
加えて、活性化されたヒト一次Ｔ細胞を４μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質と、１μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写してＡＰ処理したｓｇＲＮＡとを、エレクトロポレーション（Ｎｅｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でトランスフェクトした。５日後、ｇＤＮＡを各Ｔ細胞から単離および抽出し、標的ディープシーケンシングによってインデル効率を解析した（図１８のＡ）。加えて、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）フローサイトメトリー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、Ｔ細胞表面上でのＰＳＧＬ－１発現を解析し、ＰＳＧＬ－１のノックアウトを確認した（図１８のＢ、Ｃ）。
図１７ａ～図１７ｃは、ジャーカット細胞におけるｈＰＳＧＬ－１ ｓｇＲＮＡスクリーニングの解析の結果を示す。これらの図は、インデル効率、および、ノックアウト後にＰＳＧＬ－１を発現しないジャーカット細胞（ｈＰＳＧＬ－１陰性細胞）の程度（図１７ａ）と、ノックアウト後のジャーカット細胞表面上におけるＰＳＧＬ－１の発現量（図１７ｂ、図１７ｃ）とを示すグラフである。
図１８は、ヒト一次Ｔ細胞におけるｈＰＳＧＬ－１ノックアウト（ＫＯ）実験の結果を示す。これは、（Ａ）インデル効率、（Ｂ）ノックアウト後にＰＳＧＬ－１を発現しないＴ細胞の程度、（Ｃ）ノックアウト後のＴ細胞表面上におけるＰＳＧＬ－１の発現の程度を示している。結果として、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体の移入を通して、ＰＳＧＬ－１が効果的にノックアウトされ、それにより、表面タンパク質であるＰＳＧＬ－１がフローサイトメトリーによって観察できなかったことが確認された。
［例４：ジャーカット細胞の活性およびサイトカイン分泌の促進］
Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡが導入されるジャーカット細胞において、導入されたｓｇＲＮＡの標的領域に対応するゲノムＤＮＡ配列が開裂され、開裂されたＤＮＡ配列の周囲の領域は、ＮＨＥＪを通した欠失、挿入および／または置換によって変異され、その結果、開裂されたＤＮＡ配列が位置するノックアウト遺伝子が生じる。
例１において説明されたようにエレクトロポレーションによってＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトされたジャーカット細胞を、エレクトロポレーションの後に７日間培養し、ＣＤ３ダイナビーズ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して活性化した。
２４時間後、ＩＬ－２受容体であるＣＤ２５の発現、および、ＩＦＮ－ガンマの放出量を、それぞれ、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって解析した。
まず、ＩＬ－２受容体であるＣＤ２５の発現量をフローサイトメトリーにより測定した。Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトされたジャーカット細胞を各導入後に７日間培養し、３：１の比率（ビード：細胞、数）でＣＤ３またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して再刺激し、次いで、ＣＤ２５の発現を測定した。
細胞活性化の１日後に表現型解析を実行した。ビードで再刺激（活性化）した細胞を、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、ＰＥが結合した抗ＣＤ２５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４℃で３０分間染色した。
取得された細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁し、その後、ＢＤ ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリーにかけ、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によってＣＤ２５発現量を測定した。
比較のために、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡが導入されなかった野性型細胞に対して、および、ＣＤ３またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）で処理されなかった細胞に対して同一の方式でフローサイトメトリーを実行した。
取得されたＣＤ２５発現量（ＣＤ２５ ＭＦＩ）が図１～図４に示されている。
図１は、ＤＧＫ－アルファのためのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ＃１１と称される）を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子がノックアウトされた細胞におけるＣＤ２５ ＭＦＩを示す。
図２は、Ａ２０のためのｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０ ＃１１と称される）を使用してＡ２０遺伝子がノックアウトされた細胞におけるＣＤ２５ ＭＦＩを示す。
図３は、ＥＧＲ２のためのｓｇＲＮＡ（＃１、ＥＧＲ２ ＃１と称される）を使用してＥＧＲ２遺伝子がノックアウトされた細胞におけるＣＤ２５ ＭＦＩを示す。
図４は、ＰＰＰ２Ｒ２ＤのためのｓｇＲＮＡ（＃１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ ＃１０と称される）を使用してＰＰＰ２Ｒ２Ｄ遺伝子がノックアウトされた細胞におけるＣＤ２５ ＭＦＩをそれぞれ示す。
図１～４に示されるように、ＣＤ３またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）で処理されていない細胞の場合、遺伝子のノックアウトの有無は、ＣＤ２５発現量に影響しなかった。一方で、ＣＤ３またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）で処理された細胞の場合、遺伝子がノックアウトされたときにＣＤ２５の発現量が野性型と比較して大幅に増加したことが確認された。
加えて、サイトカインの一種であるＩＦＮ－ガンマの分泌量は、ＥＬＩＳＡによって試験した。
上述のように、ＣＤ３またはＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）によって再刺激したジャーカット細胞を３６時間活性化した後に、培地を採取し、（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＥＬＩＳＡキットによって提供される）希釈剤緩衝液を使用して１／１００または１／２００の比率（ｗ／ｖ）で希釈し、その後、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して発色させ、分光光度計（ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ ＧＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。
比較のために、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡが導入されなかった野性型細胞に対して同一の方式でＥＬＩＳＡを実行した。
取得された結果を図５に示す。
図５は、ＤＧＫ－アルファのためのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ ＃１１と称される）を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベルと、Ａ２０のためのｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０ ＃１１と称される）を使用してＡ２０遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベルと、ＥＧＲ２のためのｓｇＲＮＡ（＃１、ＥＧＲ２ ＃１と称される）を使用してＥＧＲ２遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベルとを示す（ＩＦＮ－ガンマレベル単位：ｐｇ／ｍＬ）。
図５に示されるように、遺伝子がノックアウトされたとき、野性型と比較してＩＦＮ－ガンマの分泌量は著しく増加したことが確認された。
［例５：ヒト一次Ｔ細胞の活性およびサイトカイン分泌の増強］
上記の例４において説明された方法に関連して、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトされたヒト一次Ｔ細胞をＣＤ３ビード（ビード：細胞の比率はそれぞれ、１：１、２：１、３：１）で活性化した。２日後、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２の分泌量をＥＬＩＳＡによって測定した（ＩＦＮ－ガンマまたはＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
取得された結果を図６および図７に示す。
図６は、ＤＧＫ－アルファのためのｓｇＲＮＡ（＃１１、ＤＧＫ－アルファ ＃１１と称される）を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベル、ｓｇＲＮＡ（＃８および＃１１の組み合わせを使用、ＤＧＫ－アルファ＃８＋１１と称される）を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベル、ＤＧＫ－ゼータのためのｓｇＲＮＡ（＃５、ＤＧＫ－ゼータ＃５と称される）を使用してＤＧＫ－ゼータ遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベル、Ａ２０のためのｓｇＲＮＡ（＃１１、Ａ２０ ＃１１と称される）を使用してＡ２０遺伝子がノックアウトされた細胞培養液におけるＩＦＮ－ガンマレベルを示す（ＩＦＮ－ガンマレベル単位：ｐｇ／ｍＬ）。
図７は、ＤＧＫアルファ＃１１を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子をノックアウトした細胞培養液におけるＩＬ－２レベルと、ＤＧＫ－アルファ＃８＋１１を使用してＤＧＫ－アルファ遺伝子をノックアウトした細胞培養液におけるＩＬ－２レベルと、ＤＧＫ－ゼータ＃５を使用してＤＧＫ－ゼータ遺伝子をノックアウトした細胞培養液におけるＩＬ－２レベルと、Ａ２０＃１１を使用してＡ２０遺伝子をノックアウトした細胞培養液におけるＩＬ－２レベルとを示す（ＩＬ－２レベル単位：ｐｇ／ｍＬ）。
図６および図７において、「ＡＡＶＳ１」は、ＡＡＶＳ１部位がＣＲＩＳＰＲシステムで開裂された細胞のネガティブコントロールとして使用した。
図６および図７において示されるように、遺伝子がノックアウトされたとき、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２などのサイトカインの分泌量は、野性型と比較して著しく増加した。
ジャーカット細胞およびヒト一次Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現およびサイトカイン分泌の増加を示すこれらの結果は、遺伝子がノックアウトされたときＴＣＲ媒介活性シグナルが増加したこと、および、Ｔ細胞の免疫機能は活性の増加によって増強できることを示す。
［例６：ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化およびサイトカイン分泌の増強］
ヒト末梢血Ｔ細胞（ｐａｎ－Ｔ細胞）はＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹから購入した。５０Ｕ／ｍＬのｈＩＬ－２および５ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－７で補足したＸ－ＶＩＶＯ１５培地を細胞培養に使用した。細胞を活性化するために、ビードと細胞との比率を３：１にして、抗ＣＤ３／２８ダイナビーズ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
活性化の２４時間後、レトロネクチン（登録商標）でコーティングしたプレート上で、Ｔ細胞を１３９－ＣＡＲレンチウイルスと４８時間混合した。１３９－ＣＡＲとは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に認識して免疫応答を誘導することが可能なＣＡＲである。その後、４０μｇの組み換えストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）および１０μｇの化学的に合成されたｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ロンザ）を用いたエレクトロポレーションにより、細胞に導入した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験については、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で事前に染色されたＵ８７ｖＩＩＩ癌細胞を１３９ＣＡＲ－Ｔと、適切な比率で共培養した。このとき、培養は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１または０．５μｇ／ｍＬのＰＧＥ２の存在下または非存在下で実行した。癌細胞株との共培養後、細胞傷害性試験の実験のために、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で細胞を染色した。染色した試料をＡｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上に集め、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）で解析した。
細胞傷害性は、［（サンプル溶解率－最小溶解率）／（最大溶解率［１００％］－最小溶解率）］×１００％という式によって計算した。加えて、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの内容を同定するために、共培養の上清をＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によっても解析した。１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖実験については、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）で染色された１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的癌細胞株Ｕ８７ｖＩＩＩと共培養し、次いで、１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーを使用してＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（登録商標）の希釈度を測定した。
実験の設計（図８ａ、Ａ）によれば、ＤｇｋαまたはＤｇｋζ（図８ａ、Ｂ）を標的化する単一のＣａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を移入した１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞上でのＤＧＫαおよびＤＧＫζのインデル効果はそれぞれ７５．９％、９３．５％であった。
ＤＧＫαおよびＤＧＫζのためのデュアル陰性１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するべく、ＤＧＫαおよびＤＧＫζを標的化する２つのｇＲＮＡをそれぞれ、エレクトロポレーションによって細胞に導入した。その結果、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのインデル効果はそれぞれ、４９．２％、９２．４％であった（図８ａ、Ｂ）。
標的ディープシーケンシング（図８ｂ）を使用して、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのそれぞれのｇＲＮＡに対する著しいオフターゲット効果は確認されなかった。
加えて、ＤＧＫａ、ＤＧＫζおよびＤＧＫαζのＫＯ（ノックアウト）１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞では、野性型１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、細胞傷害性、サイトカイン産生能力、および、増殖能力が著しく増加した（図９ａ Ａ、Ｂ、および、図９ｂ）ことが観察された。
興味深いことに、ＤＧＫαζのＫＯ １３９ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、単一のＤＧＫαまたはＤＧＫζのＫＯ １３９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、サイトカイン放出がより著しく増加することが示された。これは、ＤＧＫαおよびＤＧＫζの相乗効果と考えられる。そのようなＤＧＫ ＫＯ １３９ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能の増加は、ＣＤ３末端シグナルの増加、すなわち、ＥＲＫ１／２の増加、および、抗原暴露後のＣＡＲの高い発現に起因する（図１０のＡ、Ｂ）と考えられる。
加えて、ＤＧＫ ＫＯ １３９ＣＡＲ－Ｔ細胞においてシグナルが強く活性化されるにもかかわらず、標的癌細胞の非存在下では、基礎的なサイトカインの増加は観察されなかったことから、ＤＧＫ ＫＯの高い安全性が示唆される（図１１のＡ）。更に、疲弊マーカーであるＰＤ－１１およびＴＩＭ－３３の発現は、１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＤＧＫ ＫＯ １３９ＣＡＲ－Ｔ細胞において増加しなかった。（図１１のＢ）。これらの結果は、延長された抗原暴露後でも、ＤＧＫ ＫＯがＴ細胞の疲弊を促進しないことを示唆する（図１１のＢ）。
ＴＧＦ－β１およびＰＧＥ２などのシグナリング１免疫抑制阻害剤を用いた治療により１３９ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果が大幅に低下したが、一方で、ＤＧＫαζ ＫＯ １３９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、阻害性細胞溶解因子の存在下でも、細胞傷害性およびサイトカイン放出は維持されることが確認された（図１２のＡ、Ｂ）。
これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＤＧＫ遺伝子を不活性化によって、Ｔ細胞機能を活性化できることを示す。
換言すれば、ＤＧＫ遺伝子の不活性化は、ＣＤ３末端シグナルを増強でき、それにより、抗癌機能およびＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖が増強されることが確認された。
加えて、ＤＧＫαζ（２つのアイソフォーム型）のノックアウト（ＫＯ）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、疲弊マーカーの著しい増加を示さず、ＴＧＦ－βおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの免疫抑制細胞溶解因子への反応がより小さかった。
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＤＧＫ ＫＯは、増加したＴ細胞のエフェクター機能を増強できることが確認された。
［例７：ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞活性化およびサイトカイン分泌の増強］
［７．１ ＮＫ９２細胞株およびヒト一次ＮＫ細胞培養］
ＮＫ９２細胞株は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－２４０７）から購入し、一次ＮＫ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹから購入し、提供されたプロトコルに従って培養した。
ＮＫ９２細胞は、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ Ｉ、２００～３００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２および１０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－１５が補足された、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（ＷｅｌｌＧｅｎｅ）において培養した。
［７．２ エレクトロポレーションによる導入］
ＮＫ９２細胞株におけるＤＧＫαおよびＤＧＫζをノックアウトするべく、１２００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスで、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるエレクトロポレーションを実行した。一次ＮＫ細胞については、１２００Ｖ、２０ｍｓ、３パルスを使用した。
４μｇの組み換えストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）および１μｇの化学的に合成されたｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０分間培養し、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を取得した。
Ｒバッファに再懸濁された２×１０５個のＮＫ９２細胞を、プレインキュベートしたＣａｓ９ ＲＮＰ複合体に添加（接触）してエレクトロポレーションを実行した。その後、培地において、４×１０５細胞／ｍＬの濃度で細胞を播種した。
実験で使用したｃｒＲＮＡ標的配列は以下の通りである。
ＤＧＫα：ＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣ
ＤＧＫζ：ＡＣＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣ
［７．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイ］
ＮＫ９２細胞および一次ＮＫ細胞の細胞傷害性を解析するべく、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））によって染色されたＲａｊｉ細胞、または、１×１０５個のＫ５６２細胞と共に細胞をＵ－ｂｏｔｔｏｍ９６プレート上で共培養した。１８時間の共培養後、細胞を採取して、７－ＡＡＤで染色し、次いで、フローサイトメトリーにより解析した。すべての細胞傷害性実験は３回実行した。
結果を図１３に示す。ＮＫ９２細胞および一次ＮＫ細胞におけるＤＧＫαノックアウト効率（ＫＯ効率）は良好であった（図１３のＡおよびＢ）ことが確認された。加えて、ＮＫ－９２の殺傷活性を、７－ＡＡＤ陽性Ｒａｊｉ細胞の測定を通して確認し、細胞傷害性はＤＧＫαノックアウトによって増加することが示された。
特に、これらの結果から、遺伝子操作が難しいことが知られているＮＫ細胞に対して免疫機能を効果的に操作できることが確認される。
［例８；ＮＫＴ（ナチュラルキラー）細胞活性化およびサイトカイン分泌の増強］
［８．１ ＮＫＴ細胞培養］
ヒトＰＢＭＣをＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（カナダ）から購入した。これらの細胞は、１０００Ｕ／ｍＬインターフェロンγ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）が追加された、１０％のＦＢＳ補足ＲＰＭＩ培地において、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で播種した。５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＯＫＴ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を培地に添加して５日間放置し、４００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）を添加して２０日放置した。
［８．２ エレクトロポレーションによる導入］
ＮＫＴ細胞株においてＤＧＫα、ＤＧＫζ、および、ＰＤ１をノックアウトするべく、１５５０Ｖ、１０ｍｓ、３パルスで、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってエレクトロポレーションを実行した。
４μｇの組み換えストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）および１μｇの化学的に合成されたｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０分間培養し、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を取得した。
Ｒバッファに再懸濁された２×１０５個のＮＫＴ細胞を、プレインキュベートしたＣａｓ９ ＲＮＰ複合体に添加（接触）してエレクトロポレーションを実行した。その後、培地において、４×１０５細胞／ｍＬの濃度で細胞を播種した。
実験で使用したｃｒＲＮＡ標的配列は以下の通りである。
ＤＧＫα：ＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣ
ＤＧＫζ：ＡＣＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣ
ＰＤ－１１：ＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧ
［８．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイ］
ＮＫＴ細胞の細胞傷害性を解析するべく、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））によって染色された２×１０４個のＵ８７ｖＩＩＩ細胞と共にＮＫＴ細胞をＵ－ｂｏｔｔｏｍ９６ウェルプレート上で共培養した。１８時間の共培養後、細胞を採取し、７－ＡＡＤで染色して、次いで、フローサイトメトリーによって解析した。すべての細胞傷害性実験は３回実行した。
結果として、図１４に示されるように、ヒトＮＫＴ細胞におけるＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって効率的に実行されたことが確認された。
インデル効率はディープシーケンシングによって確認され（図１４のＡ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理されたＮＫＴ細胞をトリパンブルー染色によって解析し、細胞増殖（図１４のＢ）および細胞生存率がよく維持されていることが確認された（生存率＝生存細胞数／合計細胞数）。更に、ウエスタンブロットを通して、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトがタンパク質のレベルでもよく生じたことが確認された（図１４のＤ）。
更に、図１５に示されるように、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトにより、ＮＫＴ細胞のエフェクター機能が改善されたことが確認された。
Ｕ８７ｖＩＩＩ、Ｈ４６０、Ｋ５６２細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、Ｅ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞の比率）の比率を２０：１にして、９６ウェルプレートで１８時間培養した。フローサイトメトリーによる７－ＡＡＤ陽性癌細胞のアポトーシスレベルの解析から、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトにより、対応するＮＫＴ細胞のＮＫＴ殺傷活性が増加したことが明らかになった。ＤＧＫαおよびＤＧＫζの各々のノックアウトにはまた、殺傷活性を増加させる効果があったが、２つの遺伝子が同時にノックアウトされたとき、殺傷活性がより改善されたことが更に確認された（図１５のＡ）。
他方で、ＩＦＮ分泌をＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ－キット、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により測定した。その結果、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのノックアウトにより、対応する細胞のＩＦＮ放出能力が増加することが示された。ＤＧＫαおよびＤＧＫζのそれぞれのノックアウトには、ＩＦＮ分泌を増強させる良い効果もあったが、両方の遺伝子が同時にノックアウトされたとき、ＩＦＮ分泌は更に増強されたことが確認された（図１５のＢ）。
加えて、図１６に示されるように、ヒトＮＫＴ細胞におけるＰＤ－１ノックアウト媒介ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＮＫＴ細胞のエフェクター機能を増強したことが確認された。ＮＫＴ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、ＰＤ－１ノックアウトが誘導され、ＰＤ－１のノックアウト効率は標的ディープシーケンシングによって解析された。更に、ＰＤ－１ノックアウトを通して抗癌エフェクターとしてのＮＫＴ細胞の機能を確認するべく、Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞およびＮＫＴ細胞を共培養した。Ｅ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）の比率を５０：１にして、Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）で、９６ウェルプレートにおいて１８時間処理し、フローサイトメトリーによって７－ＡＡＤ陽性癌細胞を殺傷活性について解析した。
その結果、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による、ＰＤ－１遺伝子における高いインデル効率が確認され（図１６のＡ）、それにより、細胞傷害性が改善された（図１６のＢ）ことが確認された。
全体として、上記の結果は、ＤＧＫなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介免疫調節遺伝子のノックアウトが、様々な種類の免疫細胞において著しい免疫増強効果もたらし得ることを示す。
ＤＧＫ遺伝子ノックアウトのこれらの生物学的効果は、免疫機能の改善を通して、臨床的に適用可能な細胞の形態の免疫治療剤として、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴなどを含む免疫細胞を開発できることを示す。
［産業上の適用］
効果的な免疫細胞治療は、人工的に操作された免疫調節因子に従って機能が人工的に操作された改変免疫系、および、それを含む細胞により実現することができる。
例えば、免疫調節因子が本明細書の方法または組成物により人工的に制御されるとき、免疫細胞の生存率、増殖、持続性、細胞傷害性、サイトカイン放出および／または透過などに関与する免疫効果が改善され得る。
［項目１］
核酸配列において改変を有するＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される、人工的に設計された免疫調節遺伝子。
［項目２］
核酸配列における改変は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に引き起こされる、人工的に設計された項目１に記載の免疫調節遺伝子。
［項目３］
免疫調節遺伝子はＡ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、ＥＧＲ２、ＰＳＧＬ－１またはＫＤＭ６Ａである、人工的に設計された項目１または２に記載の免疫調節遺伝子。
［項目４］
免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）、または、ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１ｂｐ～５０ｂｐの連続ヌクレオチド配列領域において、
１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、
野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、
少なくとも１つの外来ヌクレオチドの挿入、
免疫調節遺伝子を構成する核酸配列における少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾
から成る群から選択される少なくとも１つの改変を含む、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体によって人工的に設計された免疫調節遺伝子である、人工的に設計された項目１から３のいずれか一項に記載の免疫調節遺伝子。
［項目５］
核酸配列の改変は免疫調節遺伝子のプロモーター領域において生じる、人工的に設計された項目１から４いずれか一項に記載に記載の免疫調節遺伝子。
［項目６］
核酸配列の改変は免疫調節遺伝子のエクソン領域において生じる、人工的に設計された項目１から５のいずれか一項に記載に記載の免疫調節遺伝子。
［項目７］
核酸配列の改変は免疫調節遺伝子のイントロン領域において生じる、人工的に設計された項目１から６のいずれか一項に記載に記載の免疫調節遺伝子。
［項目８］
核酸配列の改変は免疫調節遺伝子のエンハンサー領域において生じる、人工的に設計された項目１から７のいずれか一項に記載に記載の免疫調節遺伝子。
［項目９］
ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、および、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
の配列（５'から３'の方向に記載）のうち１または複数を含む、人工的に設計された項目４に記載の免疫調節遺伝子。
［項目１０］
ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸。
［項目１１］
Ａ２０の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および１１の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、
Ｄｇｋαの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１および２３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、
ＥＧＲ２の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、
ＰＰＰ２Ｒ２Ｄの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、
ＰＤ－１の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、
Ｄｇｋζの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、１１０、１１１、１１２および１１３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、
Ｔｅｔ－２の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、１２８および１２９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、
ＰＳＧＬ－１の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、
ＦＡＳの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２、２５４、２５７および２６４の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、および、
ＫＤＭ６Ａの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸
から成る群から選択される少なくとも１つのガイド核酸を含む、項目１０に記載のガイド核酸。
［項目１２］
ガイド核酸は１８ｂｐ～２３ｂｐのヌクレオチドである、項目１０に記載のガイド核酸。
［項目１３］
核酸配列において改変を含むＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子、および、
免疫調節遺伝子から発現される少なくとも１つの産物
を含む人工的に設計された免疫細胞。
［項目１４］
免疫細胞は、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞から成る群から選択される少なくとも１つの細胞である、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目１５］
免疫調節遺伝子の活性が抑制または不活性化される、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目１６］
免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目１７］
Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または設計されたＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を更に含む、人工的に設計された項目１４に記載の免疫細胞。
［項目１８］
免疫細胞は、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体、または、ガイド核酸－エディタータンパク質複合体をコードする核酸配列を更に含む、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目１９］
ガイド核酸－エディタータンパク質複合体のエディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目２０］
ガイド核酸は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から選択される少なくとも１つ遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能である、人工的に設計された項目１８に記載の免疫細胞。
［項目２１］
免疫細胞は、核酸配列において改変を含むＤｇｋαの遺伝子およびＤｇｋζの遺伝子から選択される、少なくとも１つの人工的に設計された遺伝子を含む、人工的に設計された項目１３に記載の免疫細胞。
［項目２２］
免疫細胞は、核酸配列において改変を含む、人工的に設計されたＤｇｋαの遺伝子およびＤｇｋζの遺伝子を含む、項目１３に記載の人工的に設計された免疫細胞。
［項目２３］
ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、エディタータンパク質をコードする核酸と
を含む、遺伝子操作のための組成物。
［項目２４］
エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、項目２３に記載の組成物。
［項目２５］
遺伝子操作は、免疫調節遺伝子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）において、または、ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１ｂｐ～５０ｂｐの連続ヌクレオチド配列領域において、
少なくとも１つのヌクレオチドの欠失または挿入、
野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、
少なくとも１つの外来ヌクレオチドの挿入、または、
免疫調節遺伝子を構成する核酸配列における少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾
から成る群から選択される少なくとも１つの改変を含む、遺伝子操作のための項目２３に記載の組成物。
［項目２６］
ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、および、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
の配列（５'から３'の方向に記載）から成る群から選択される少なくとも１つを含む、遺伝子操作のための項目２４に記載の組成物。
［項目２７］
免疫細胞を人工的に操作するための方法であって、
人体から単離された免疫細胞を、
（ａ）ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、および、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つであるエディタータンパク質
から選択される少なくとも１つに接触させる段階
を備える方法。
［項目２８］
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸配列の形態で少なくとも１つのベクターに各々存在する、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質との結合を介して複合体を形成することによって各々存在する、項目２７に記載の方法。
［項目２９］
接触させる段階はｅｘ ｖｉｖｏで実行される、項目２７に記載の方法。
［項目３０］
接触させる段階は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって実行される、項目２７に記載の方法。
［項目３１］
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスの群から選択される少なくとも１つである、項目３０に記載の方法。
［項目３２］
ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２の群から選択される少なくとも１つの遺伝子をシーケンシングすることによって、対象における免疫細胞標的位置の配列に関する情報を提供するための方法。
［項目３３］
項目３２の方法を通して提供される情報を使用してライブラリを構築するための方法。
［項目３４］
（ａ）ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｄｇｋζ、Ｆａｓ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＳＧＬ－１、ＫＤＭ６ＡおよびＴｅｔ２から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の核酸配列におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２８９の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸、および、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含むエディタータンパク質
を備える遺伝子操作キット。

Claims (14)

  1. 設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子を含むゲノムを有する設計された免疫細胞であって、
    前記設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子は、前記設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子のエクソン領域に人工的な改変を含み、前記人工的な改変はインデルである、
    設計された免疫細胞。
  2. 前記人工的な改変はＤＧＫＡタンパク質のＥＦハンドドメインをコードする核酸領域に位置し、
    これにより、前記設計された免疫細胞のＤＧＫＡタンパク質の発現または機能が不活性化される、
    請求項１に記載の設計された免疫細胞。
  3. 前記改変は、前記設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子のエクソン６、エクソン７、およびエクソン８から選択される領域に位置する、
    請求項１または２に記載の設計された免疫細胞。
  4. 免疫細胞の野性型ゲノムに基づいて、前記インデルは、Ｄｇｋα遺伝子の配列番号１３～２４から選択される配列に位置し、
    前記設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子は、前記Ｄｇｋα遺伝子のエクソン領域において、配列番号１３～２４から選択される同一のヌクレオチド配列を含まない、
    請求項１から３のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  5. 前記改変は、Ｄｇｋα遺伝子のエクソン７およびエクソン８から選択される領域に位置する、
    請求項１から３のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  6. 免疫調節遺伝子の野性型ゲノムに基づいて、前記インデルは、Ｄｇｋα遺伝子の配列番号１９～２４から選択される配列に位置し、
    前記設計された内在性Ｄｇｋα遺伝子は、前記Ｄｇｋα遺伝子において、配列番号１９～２４から選択される同一のヌクレオチド配列を含まない、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  7. 前記設計された免疫細胞は、設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子をさらに含み、
    前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子は人工的な改変を含み、前記人工的な改変はインデルであり、
    これにより、前記設計された免疫細胞のＤＧＫＺタンパク質の発現または機能が不活性化される、
    請求項１から６のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  8. Ｄｇｋζ遺伝子の前記人工的な改変は、前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子のエクソン領域に位置する、
    請求項７に記載の設計された免疫細胞。
  9. Ｄｇｋζ遺伝子の前記人工的な改変は、前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子のエクソン３、エクソン５、エクソン６、エクソン８、エクソン１０、エクソン１１、およびエクソン１２から選択される領域に位置する、
    請求項８に記載の設計された免疫細胞。
  10. Ｄｇｋζ遺伝子の前記人工的な改変は、Ｃ１Ａ、Ｃ１Ｂ、およびＤＧＫＺタンパク質の触媒ドメインから選択されるＤＧＫＺタンパク質のドメインをコードする核酸領域に位置する、
    請求項７から９のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  11. 免疫細胞の野性型ゲノムに基づき、Ｄｇｋζ遺伝子の前記人工的な改変は、Ｄｇｋζ遺伝子の配列番号１０９～１２５から選択される配列に位置し、
    前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子は、Ｄｇｋζ遺伝子において、配列番号１０９～１２５から選択される同一のヌクレオチド配列を含まない、
    請求項７から９のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  12. 免疫細胞の野性型ゲノムに基づき、Ｄｇｋζ遺伝子の前記人工的な改変は、Ｄｇｋζ遺伝子の配列番号１０９～１１３、１１６、１２０、１２１および１２３から選択される配列に位置し、
    前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子は、前記設計された内在性Ｄｇｋζ遺伝子において、配列番号１０９～１１３、１１６、１２０、１２１および１２３から選択される同一のヌクレオチド配列を含まない、
    請求項７、８、９および１１のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  13. キメラ抗原受容体または設計されたＴ細胞受容体をさらに含む、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
  14. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および幹細胞から分化した免疫細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞である、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の設計された免疫細胞。
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