JP2023039908A - 操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよびステビオールグリコシドのグルコシル化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
配列表の公式コピーは、ファイル名が「CX8-180USP1A_ST25.txt」であり、作成日が2018年7月31日であり、サイズが8,929キロバイトである、ASCII形式のテキストファイルとして、本明細書と同時にEFS-Web経由で提出されている。EFS-Web経由で出願したこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、配列番号2に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ改変体を提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号20に対して、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、41/72/233/338、41/72/338、41/144/233、41/233、41/233/338、61、61/87/91/107、61/87/91/259、61/91/431、61/107、61/259/428、61/407/428、61/411、72、72/76、72/76/163/197、72/76/195/233、72/76/197/204、72/76/207/233、72/76/207/338、72/81、72/81/195/233、72/139/195/204、72/144/338、72/200/204/207、72/207、76/144/197/200、76/195/197/204/207/233、76/197/207/233、76/233、81/139/144/195/200/204/207/233、81/144/233、81/197/200/207/233/338、81/233/338、81/338、107、107/259、139/144/233、144/233、144/233/338、156/407、163/233/338、200/204/207/233、233/338、および259から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号20を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、41E/72P/233Q/338A、41E/72P/338A、41E/144Q/233T、41E/233Q、41E/233Q/338V、41E/233T、41E/233T/338V、61D、61D/87K/91L/107L、61D/87K/91L/259T、61D/107V、61D/259T/428I、61D/407T/428I、61E/87K/91L/107V、61E/91L/431M、61E/411T、72P、72P/76S、72P/76S/163A/197K、72P/76S/207V/338V、72P/76T、72P/76T/195Q/233T、72P/76T/197K/204T、72P/76T/207V/233Q、72P/81T、72P/81T/195Q/233Q、72P/139N/195Q/204T、72P/144Q/338V、72P/200R/204T/207V、72P/207V、76S/144Q/197K/200R、76S/195Q/197K/204T/207V/233T、76S/197K/207V/233Q、76S/233T、81T/139N/144Q/195Q/200R/204T/207V/233Q、81T/144Q/233Q、81T/197K/200R/207V/233Q/338A、81T/233Q/338V、81T/338V、107V、107V/259T、139N/144Q/233Q、144Q/233T、144Q/233T/338V、156S/407T、163A/233T/338A、200R/204T/207V/233T、233Q/338V、および259Tから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号20を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、A41E/T72P/W233Q/C338A、A41E/T72P/C338A、A41E/M144Q/W233T、A41E/W233Q、A41E/W233Q/C338V、A41E/W233T、A41E/W233T/C338V、Q61D、Q61D/A87K/Q91L/A107L、Q61D/A87K/Q91L/E259T、Q61D/A107V、Q61D/E259T/K428I、Q61D/I407T/K428I、Q61E/A87K/Q91L/A107V、Q61E/Q91L/D431M、Q61E/R411T、T72P、T72P/R76S、T72P/R76S/L163A/Q197K、T72P/R76S/I207V/C338V、T72P/R76T、T72P/R76T/H195Q/W233T、T72P/R76T/Q197K/D204T、T72P/R76T/I207V/W233Q、T72P/H81T、T72P/H81T/H195Q/W233Q、T72P/K139N/H195Q/D204T、T72P/M144Q/C338V、T72P/K200R/D204T/I207V、T72P/I207V、R76S/M144Q/Q197K/K200R、R76S/H195Q/Q197K/D204T/I207V/W233T、R76S/Q197K/I207V/W233Q、R76S/W233T、H81T/K139N/M144Q/H195Q/K200R/D204T/I207V/W233Q、H81T/M144Q/W233Q、H81T/Q197K/K200R/I207V/W233Q/C338A、H81T/W233Q/C338V、H81T/C338V、A107V、A107V/E259T、K139N/M144Q/W233Q、M144Q/W233T、M144Q/W233T/C338V、C156S/I407T、L163A/W233T/C338A、K200R/D204T/I207V/W233T、W233Q/C338V、およびE259Tから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号20を基準にして番号が付けられている。
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、9/12/107/161/199/209/337、9/12/161/169/199/209/337、9/12/199/204/209/337/455、9/12/199/209/337/451/455、9/107/131/204/259/417/451、9/107/156/161/199/204/417/455、9/107/161/209/259/289/451/455、9/131/156/209/289/337、9/131/204/337/451、9/156/169/204/337、9/169/204/289/337/451/455、9/204、9/204/259/289、9/337、12/14/107/204/289/455、12/107/131/204/289/337/417/451/455、12/107/156/209/289/455、107/161/169/199/204/259/451、107/199/204/289、107/199/209/259/451/455、107/204、156/169/199/204/209/259/289、161/204/417、204/451/455、289、および451/455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、9L/12Q/107C/161E/199S/209Y/337N、9L/12Q/161E/169T/199S/209Y/337W、9L/12Q/199S/204M/209Y/337N/455R、9L/12Q/199S/209Y/337W/451E/455R、9L/107C/131A/204M/259E/417V/451E、9L/107C/156S/161E/199S/204M/417V/455R、9L/107C/161E/209Y/259E/289A/451E/455R、9L/131A/156S/209Y/289A/337N、9L/131A/204M/337N/451E、9L/156S/169T/204M/337N、9L/169T/204M/289A/337W/451E/455R、9L/204M、9L/204M/259E/289A、9L/337W、12Q/14I/107C/204M/289A/455R、12Q/107C/131A/204M/289A/337W/417V/451E/455R、12Q/107C/156S/209Y/289A/455R、107C/161E/169T/199S/204M/259E/451E、107C/199S/204M/289A、107C/199S/209Y/259E/451E/455R、107C/204M、156S/169T/199S/204M/209Y/259E/289A、161E/204M/417V、204M/451E/455R、289A、および451E/455Rから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、V9L/R12Q/A107C/L161E/A199S/E209Y/S337N、V9L/R12Q/L161E/E169T/A199S/E209Y/S337W、V9L/R12Q/A199S/D204M/E209Y/S337N/S455R、V9L/R12Q/A199S/E209Y/S337W/Q451E/S455R、V9L/A107C/P131A/D204M/T259E/P417V/Q451E、V9L/A107C/C156S/L161E/A199S/D204M/P417V/S455R、V9L/A107C/L161E/E209Y/T259E/K289A/Q451E/S455R、V9L/P131A/C156S/E209Y/K289A/S337N、V9L/P131A/D204M/S337N/Q451E、V9L/C156S/E169T/D204M/S337N、V9L/E169T/D204M/K289A/S337W/Q451E/S455R、V9L/D204M、V9L/D204M/T259E/K289A、V9L/S337W、R12Q/V14I/A107C/D204M/K289A/S455R、R12Q/A107C/P131A/D204M/K289A/S337W/P417V/Q451E/S455R、R12Q/A107C/C156S/E209Y/K289A/S455R、A107C/L161E/E169T/A199S/D204M/T259E/Q451E、A107C/A199S/D204M/K289A、A107C/A199S/E209Y/T259E/Q451E/S455R、A107C/D204M、C156S/E169T/A199S/D204M/E209Y/T259E/K289A、L161E/D204M/P417V、D204M/Q451E/S455R、K289A、およびQ451E/S455Rから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16、53、54、78、80、95、111、221、257、336、349、391、410、413、426および430から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16M、53Q、54P、78V、80A、95W、111C、111G、111S、221A、257A、336R、349V、391R、410V、413L、426Sおよび430Qから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、L16M、K53Q、T54P、L78V、T80A、H95W、T111C、T111G、T111S、F221A、L257A、K336R、I349V、L391R、I410V、V413L、A426SおよびK430Qから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、9/12/199/204/209/337/455、9/131/156/209/289/337、9/204、12/14/107/204/289/455、107/161/169/199/204/259/451、107/199/204/289、および204/451/455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、9L/12Q/199S/204M/209Y/337N/455R、9L/131A/156S/209Y/289A/337N、9L/204M、12Q/14I/107C/204M/289A/455R、107C/161E/169T/199S/204M/259E/451E、107C/199S/204M/289A、および204M/451E/455Rから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、V9L/R12Q/A199S/D204M/E209Y/S337N/S455R、V9L/P131A/C156S/E209Y/K289A/S337N、V9L/D204M、R12Q/V14I/A107C/D204M/K289A/S455R、A107C/L161E/E169T/A199S/D204M/T259E/Q451E、A107C/A199S/D204M/K289A、およびD204M/Q451E/S455Rから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号520を基準にして番号が付けられている。
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16、16/59/80/413、16/80、16/80/111、16/80/111/257、16/80/221/257/336/410、16/80/221/336/410、16/80/257、16/111/221、16/111/221/257/391、16/221、16/221/257、16/221/257/336/391、16/221/410、16/257、16/257/336/413/420、80/111/221/257/410、111/221/257/336/391、111/221/257/391、221、および221/257から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16M、16M/59Q/80A/413L、16M/80A、16M/80A/111C、16M/80A/111S/257A、16M/80A/221A/257A/336R/410V、16M/80A/221A/336R/410V、16M/80A/257A、16M/111C/221A/257A/391R、16M/111S/221A、16M/221A、16M/221A/257A、16M/221A/257A/336R/391R、16M/221A/410V、16M/257A、16M/257A/336R/413L/420G、80A/111S/221A/257A/410V、111S/221A/257A/336R/391R、111S/221A/257A/391R、221A、および221A/257Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、L16M、L16M/H59Q/T80A/V413L、L16M/T80A、L16M/T80A/T111C、L16M/T80A/T111S/L257A、L16M/T80A/F221A/L257A/K336R/I410V、L16M/T80A/F221A/K336R/I410V、L16M/T80A/L257A、L16M/T111C/F221A/L257A/L391R、L16M/T111S/F221A、L16M/F221A、L16M/F221A/L257A、L16M/F221A/L257A/K336R/L391R、L16M/F221A/I410V、L16M/L257A、L16M/L257A/K336R/V413L/E420G、T80A/T111S/F221A/L257A/I410V、T111S/F221A/L257A/K336R/L391R、T111S/F221A/L257A/L391R、F221A、およびF221A/L257Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、5、7、14、65、91、99、102、118、138、194、254、286、416、418および420から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、5L、5M、5N、5Q、7L、14L、65V、91V、99L、99S、102R、118S、118V、138I、194P、254G、254T、254V、286L、416E、418Dおよび420Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、S5L、S5M、S5N、S5Q、T7L、V14L、I65V、Q91V、E99L、E99S、K102R、A118S、A118V、L138I、S194P、S254G、S254T、S254V、V286L、D416E、E418DおよびE420Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16/80/221/257/336/410、16/111/221、16/221/257、16/221/410、16/257、80/111/221/257/410、および221から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、16M/80A/221A/257A/336R/410V、16M/111S/221A、16M/221A/257A、16M/221A/410V、16M/257A、80A/111S/221A/257A/410V、および221Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、L16M/T80A/F221A/L257A/K336R/I410V、L16M/T111S/F221A、L16M/F221A/L257A、L16M/F221A/I410V、L16M/L257A、T80A/T111S/F221A/L257A/I410V、およびF221Aから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号626を基準にして番号が付けられている。
る。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、E3A、E4V、H22L、H22T、L32S、T34E、T34S、R38L、R38N、R38V、R38W、P47S/D488N、Y51A、Y51H、Y51H/L433P、Y51T、V62I、M75I/Q169A、L101V、Q169E、S195K/A213T、T708V、およびA718Hから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号1652を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、44/52/97/442/724、52/97/442、97/442、および434/442から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号1652を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、44I/52V/97T/442Y/724S、52G/97T/442Y、97T/442Y、および434G/442Yから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号1652を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、R44I/P52V/A97T/H442Y/K724S、P52G/A97T/H442Y、A97T/H442Y、およびY434G/H442Yから選択される少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号1652を基準にして番号が付けられている。
遺伝子コードされるアミノ酸について使用される略号は、従来通りであり、以下の通りである:アラニン(AlaまたはA)、アルギニン(AreまたはR)、アスパラギン(AsnまたはN)、アスパラギン酸(AspまたはD)、システイン(CysまたはC)、グルタミン酸(GluまたはE)、グルタミン(GlnまたはQ)、ヒスチジン(HisまたはH)、イソロイシン(IleまたはI)、ロイシン(LeuまたはL)、リシン(LysまたはK)、メチオニン(MetまたはM)、フェニルアラニン(PheまたはF)、プロリン(ProまたはP)、セリン(SerまたはS)、トレオニン(ThrまたはT)、トリプトファン(TrpまたはW)、チロシン(TyrまたはY)、およびバリン(ValまたはV)。3文字略号が使用されるとき、特に、「L」もしくは「D」が先行する場合または略号が使用される文脈から明らかである場合を除き、アミノ酸は、α炭素(Cα)についてL立体配置であってもよく、またはD立体配置であってもよい。例えば、「Ala」は、α炭素についての立体配置の指定のないアラニンを示すが、「D-Ala」および「L-Ala」は、それぞれ、D-アラニンおよびL-アラニンを示す。1文字略号が使用されるとき、大文字は、α炭素についてL-立体配置のアミノ酸を示し、小文字は、α炭素についてD-立体配置のアミノ酸を示す。例えば「A」は、L-アラニンを示し、「a」は、D-アラニンを示す。ポリペプチド配列が一連の1文字または3文字略号(またはその混合形)として提示されるとき、配列は、一般的な慣習に従ってアミノ(N)からカルボキシ(C)への方向で提示される。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390 [1962];Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897 [1986];Freier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377 [1986];Kierzek et al., Biochem., 25:7840-7846 [1986];Rychlik et al., Nucl. Acids Res., 18:6409-6412 [1990](誤植、Nucl. Acids Res., 19:698 [1991]);Sambrook et al.、上掲;Suggs et al., 1981, in Developmental Biology Using Purified Genes, Brown et al.[eds.], pp. 683-693, Academic Press, Cambridge, MA [1981];およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 [1991]を参照されたい)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるポリペプチドをコードし、中等度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件などの定義された条件下で、本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする配列の相補配列とハイブリダイズする。
NaCl中、65℃で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが、0.018M NaCl中、65℃で、安定しない場合、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定しないことになる)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、0.1×SSPE、および0.1%SDS中、65℃での洗浄が続く、42℃で50%ホルムアミド、5×デンハート液、5×SSPE、0.2%SDSに相当する条件でのハイブリダイゼーションによって、提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、0.1%(w/v)SDSを含有する5×SSC中、65℃でのハイブリダイゼーションおよび0.1%SDSを含有する0.1×SSC中、65℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中等度にストリンジェントな条件は、上記の参考文献に記載されている。
[1986];Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984];Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985];Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999];Christians et al.,
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グリコシル化は、安定性、薬力学、溶解度および膜輸送を含む、天然および合成産物の多くの特性を変更することができる。本発明は、様々なアグリコンおよびグリコシル化基質からの新しいグリコシル化化合物の生成に好適な組成物、方法および酵素を提供する。一部の実施形態では、本発明は、容易に得られる前駆体から公知のグリコシル化化合物を効率的に生成するための手段を提供する。一部の場合には、グリコシル化は、化学合成方法によって果たされる。しかし、これらの方法は、望ましくない化学物質およびプロセスを概して必要とし、混合産物(例えば、誤った位置に結合を有する、および/または望ましくないアノマー配置を有する)を生じさせる結果となり得る。さらに、炭水化物化学は、複数の保護および脱保護ステップを必要とする。
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、その説明がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明することを理解されたい。一部の実施形態では、本発明は、野生型GT酵素と比較して改善された特性を有する、操作された、天然に存在しないGT酵素を提供する。任意の好適な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法は、トランスフェラーゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために使用される。一部の実施形態では、反応条件は、下記でおよび実施例でさらに説明されるように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補基質、緩衝剤、共溶媒、pH、温度および反応時間を含む条件、ならびに/または固体支持体上に固定化されたポリペプチドに伴う条件に関して改良される。
本発明は、操作されたスクロースシンターゼ(SuS)ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、その説明がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明することを理解されたい。一部の実施形態では、本発明は、野生型SuS酵素と比較して改善された特性を有する、操作された、天然に存在しないSuS酵素を提供する。任意の好適な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法は、シンターゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために使用される。一部の実施形態では、反応条件は、下記でおよび実施例でさらに説明されるように、操作されたSuSの濃度もしくは量、基質、緩衝剤、溶媒、pH、温度および反応時間を含む条件、ならびに/または固体支持体上に固定化された操作されたSuSポリペプチドに伴う条件に関して改良される。
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現させることができる組換えポリヌクレオチドを作出するために遺伝子発現を制御する1つまたは複数の異種調節配列に動作可能に連結している。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応する酵素ポリペプチドを発現させるために適切な宿主細胞に導入される。
stearothermophilusアルファ-アミラーゼ、Bacillus licheniformisサブチリシン、Bacillus licheniformisベータ-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、およびBacillus subtilis prsAの遺伝子からのものを含むがこれらに限定されない、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である(例えば、Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]を参照されたい)。一部の実施形態では、糸状真菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、これらに限定されないが、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼ、およびHumicola lanuginosaリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞についての有用なシグナルペプチドとしては、これらに限定されないが、Saccharomyces cerevisiaeアルファ因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子からのものが挙げられる。
遂行した実験および結果を含む以下の実施例は、説明に役立つことを目的として提供するものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実際、下記の試薬および機器の多くには様々な好適な供給元がある。本発明をいずれかの試薬または機器物品についていずれかの特定の供給元に限定することを意図していない。
合成、最適化およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するUGT酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を説明する。
ステビオールビオシドをグルコシル化して、レバウジオシドBにすることおよびステビオシドをグルコシル化してレバウジオシドAにすることが報告されている、野生型Stevia rebaudianaポリペプチド(配列番号2)をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号1)(例えば、Richman et al., Plant J.,
41:56-67 [2005]を参照されたい)をコドン最適化し、配列番号3の遺伝子として合成した。この合成遺伝子(配列番号3)をpCK110900ベクター系(例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006/0195947号を参照されたい)にクローニングし、その後、E.coli W3110(ΔfhuA)において発現させた。E.coli株W3110は、lacプロモーターの制御下でUGT酵素を発現した。進化ラウンドは、以下の実施例で説明する通りに行った。
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末(SFP)調製によって、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物(例えば、総タンパク質の>30%まで)が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一コロニーを、30μg/mLのクロラムフェニコールと1%グルコースとを含有する5mLのルリア-ベルターニブロスに接種した。細胞を30℃のインキュベーターにおいて250rpmで振盪しながら一晩(少なくとも16時間)増殖させた。1Lフラスコ内の30μg/mlのCAMを含有する250mLのテリフィックブロス(12g/Lのバクト-トリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMリン酸カリウム、pH7.0、1mM MgSO4)に培養物を添加して希釈して0.2の600nm光学密度(OD600)にし、30℃で増殖させた。
SFPを再構成して20g/Lの粉末を得た。次いで、これらのストックの50μLを、3mM MgSO4および1mMステビオシド(ChromaDex、純度>94%)と2mMウリジンジホスホグルコースを伴う50mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5の200μLの総反応体積で、希釈した。30℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、反応を行った。
0.2%ギ酸を伴う0.5体積/体積のアセトニトリルで上記の反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。以下の計器およびパラメーターを用いてLC-MS/MSにより上清中のグリコシル化ステビオシド産物を検出した:
配列番号4のGT改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号4に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置に変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号3によりコードされるGT(すなわち、配列番号4)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第1ラウンド(「ラウンド1」)の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。ラウンド1における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット(HTP)増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
細胞を96ウェルプレートに採取し、1%グルコースと30μg/mLのCAMとを含有するLB培地中、30℃、200rpm、湿度85%で一晩増殖させた。次いで、一晩増殖させたもの20μLを、30μg/mLのCAMを含有する380μLのTB増殖培地を含有するディープウェルプレートに移し、1mM IPTGで誘導し、18時間、30℃、200rpm、湿度85%でインキュベートした。細胞培養物を4000rpm、4℃で10分間、遠心分離し、培地を廃棄した。このようにして得た細胞ペレットを-80℃で凍結させ、タイタープレートシェーカーを用いて室温で2時間、低速で振盪しながら250μLの溶解緩衝液(20mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5中の0.5g/Lのリゾチームおよび0.5g/LのPMBS)中で溶解した。次いで、プレートを4000rpmおよび4℃で20分間、遠心分離し、清澄化溶解物上清を、下で説明するHTPアッセイ反応に使用した。
配列番号3改変体を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いて、200μL反応物中50μL溶解物の溶解物負荷量で、ならびに50%エタノール中の20mMストック溶液からの1mMステビオシド(ChromaDex、純度>94%)の基質負荷量、および0.5mM ADP-グルコース(Sigma、純度>93%)の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら18時間、50mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5、3mM MgCl2、30℃。0.2%ギ酸を伴う100μL/ウェルのアセトニトリルで反応物をクエンチし、10分、4℃で遠心分離し、実施例1、表1.1に記載のHPLC-MS/MSにより上清を分析した。
グルコシル化活性を有するグリコシルトランスフェラーゼ酵素の合成、最適化およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するUGT酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を説明する。
ベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼSolanum tuberosumをコードするポリヌクレオチド配列をコドン最適化し、配列番号11の遺伝子として合成した。これらの合成遺伝子をpCK110900ベクター系(例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9,714,437号を参照されたい)にクローニングし、その後、E.coli W3110(ΔfhuA)において発現させた。E.coli株W3110は、lacプロモーターの制御下でUGT酵素を発現した。
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末(SFP)調製によって、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物(例えば、総タンパク質の>30%まで)が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一コロニーを、30μg/mlのクロラムフェニコールと1%グルコースとを含有する5mLのルリア-ベルターニブロスに接種した。細胞を30℃のインキュベーターにおいて250rpmで振盪しながら一晩(少なくとも16時間)増殖させた。1Lフラスコ内の30μg/mlのCAMを含有する250mLのテリフィックブロス(12g/Lのバクト-トリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMリン酸カリウム、pH7.0、1mM MgSO4)に培養物を添加して希釈して0.2の600nm光学密度(OD600)にし、30℃で増殖させた。
先ず、50μLの精製タンパク質を、50mM Tris-HCl緩衝剤pH7.5、3mM塩化マグネシウム、1mMレバウジオシドAおよび0.5mMウリジンジホスホグルコースからなる200μLの総反応体積で、希釈した。30℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら18時間、反応を行った。煮沸した酵素反応を陰性対照として使用した。0.2%ギ酸を伴う90μLのアセトニトリルで10μLの反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。実施例1、表1.1に記載のLC-MS/MSにより上清中のグリコシル化レバウジオシドA産物を検出した。不良な可溶性発現にもかかわらず、配列番号12は、ステビオールグリコシド基質におけるβ-1,2-グルコース結合の生成への高い比活性および良好な選択性を実証した。
凍結乾燥振盪フラスコ粉末を20mg/mLに再構成した。次いで、これらのストックの10μLを、3mM MgCl2と1mMレバウジオシドA(純度>97%)と2mMウリジンジホスホグルコース(UDP-グルコース)とを伴う50mMリン酸カリウム(KPhos)緩衝剤、pH7の100μLの総反応体積で、希釈した。40℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、反応を行った。陰性対照より高い活性が配列番号12について検出された。レバウジオシドAのレバウジオシドDへの低度の変換(すなわち、<10%)がLC-MS/MS分析で観察された。
配列番号12のGT改変体
この実施例では、ステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号12に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素の表面残基に関連する位置に変異誘発を施した改変体遺伝子の組合せライブラリーを構築することによって、配列番号11によりコードされるGT(すなわち、配列番号12)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ステビオールグリコシドへのβ-1,2-グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第1ラウンド(「ラウンド1」)の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。ラウンド1における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット(HTP)増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
細胞を96ウェルプレートに採取し、1%グルコースと30μg/mLのCAMとを含有するLB培地中、30℃、200rpm、湿度85%で一晩増殖させた。次いで、一晩増殖させたもの20μLを、30μg/mLのCAMを含有する380μLのTB増殖培地を含有するディープウェルプレートに移し、1mM IPTGで誘導し、18時間、30℃、200rpm、湿度85%でインキュベートした。細胞培養物を4000rpm、4℃で10分間、遠心分離し、培地を廃棄した。このようにして得た細胞ペレットを-80℃で凍結させ、タイタープレートシェーカーを用いて室温で2時間、低速で振盪しながら250μLの溶解緩衝液(20mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5中の0.5g/Lのリゾチームおよび0.5g/LのPMBS)中で溶解した。次いで、プレートを4000rpmおよび4℃で20分間、遠心分離し、清澄化溶解物上清を、下で説明するHTPアッセイ反応に使用した。
酵素改変体を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いて、100μL反応物中25μL溶解物の溶解物負荷量で、ならびに50%エタノール中の20mMストック溶液からの1mMレバウジオシドA(Sigma、純度>96%)の基質負荷量、および0.5mM UDP-グルコース(Sigma、純度>98%)の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、50mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5、3mM MgCl2、30℃。0.2%ギ酸を伴う0.5体積/体積のアセトニトリルで反応物をクエンチし、10分、4℃での遠心分離により沈殿させた。水で1:20希釈した後、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメーターを用いてLC-MS/MSにより上清中のグリコシル化産物を検出した。参照骨格配列より多い量でレバウジオシドAからレバウジオシドDを産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定し、後続の進化ラウンドに使用した。改変体の分析のために、実施例1で説明したように凍結乾燥粉末産生のための振盪フラスコ規模の培養物を増殖させた。
先ず、250mL振盪フラスコ培養物を増殖させ、誘導し、溶解した。細胞デブリを実施例1で説明したように遠心分離により除去し、清澄化溶解物上清を回収した。次いで、10μLの溶解物を、50mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5と3mM MgCl2と1mMレバウジオシドA(Sigma、純度>96%)と2mM UDP-グルコース(Sigma、純度>98%)との100μLの総反応体積で、希釈した。30℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら0~18時間、反応を行った。0.2%ギ酸を伴う0.5体積/体積のアセトニトリルで上記の反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。水で1:20希釈した後、実施例1、表1.1に記載の計器およびパラメーターを用いてLC-MS/MSにより上清中のグリコシル化産物を検出した。
配列番号6のスクロースシンターゼ改変体
この実施例では、スクロースおよびADPからのADP-グルコースの産生の改善のための、コドン最適化Acidothiobacillus caldusスクロースシンターゼポリヌクレオチド(配列番号5)に由来するスクロースシンターゼ(SuS)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置に飽和変異誘発を施した、および公開データベース内のホモログからの多様性を組み換えた、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号5によりコードされるSuS(すなわち、配列番号6)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの合成への活性が改善された第1ラウンド(「ラウンド1」)の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。ラウンド1における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット(HTP)増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
配列番号5改変体(すなわち、配列番号6の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いて、100μL反応物中25μL溶解物の溶解物負荷量で、ならびに水中の60%ストック溶液からの30%w/vスクロース(Sigma)の基質負荷量、および2mM ADP(Sigma、純度>95%)の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:Thermocyclerにおいて2時間、50mM Tris-HCl緩衝剤、pH7.5、3mM MgCl2、30℃。反応物を95℃で10分間、熱でのクエンチを行い、次いで、文献から適応させた比色D-フルクトースデヒドロゲナーゼアッセイにより分析した(例えば、Ameyama et al., J. Bacteriol., 145:814-823 [1981];およびAmeyama, Meth. Enzymol., 89:20-29 [1982]を参照されたい)。手短に述べると、一晩酵素結合アッセイを、96ウェルプレートにおいて、フルクトース濃度が<1g/Lになるように希釈した20μLの試料と、20μLの100mMフェリシアン化カリウム(Sigma P-8131)と、0.1%Triton(登録商標) X-100を伴うpH4.6マッキルバイン緩衝剤に溶解した0.8単位/mLのフルクトースデヒドロゲナーゼ(Sigma F4892)160μLとを用いて行った。この反応は、フルクトースをK4Fe(CN)6に定量的に変換するものであり、したがって、67μLの一晩反応物を、33μLの停止溶液(0.3w/v%ドデシル硫酸ナトリウム、Sigma L-4509、8.1v/v%リン酸、Sigma P-6560、および0.5w/v%硫酸第二鉄、Sigma F-1135)に添加し、20分間振盪してK4Fe(CN)6のプルシアンブルーへの完全変換を可能ならしめ、プレートリーダーを用いてこの吸光度を690nmの波長で読み取ることにより、K4Fe(CN)6を比色分析で定量する。一次アッセイ後、配列番号6よりフルクトース形成活性が高い、したがって化学量論的ADP-グルコース形成活性が高い、操作されたスクロースシンターゼ(SuS)改変体ポリペプチドを、2w/v%スクロース(Sigma)のより低い基質負荷および1mM ADP(Sigma、>95%)の補基質負荷で3連でスクリーニングした。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う250μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物をTris-HCl、pH7.5に添加して20倍希釈した。次いで、10μLの希釈されたSuS溶解物および2g/LのGT配列番号8を、100μLの反応体積で、約1mMレバウジオシドDの基質負荷量ならびに1mM ADP(Sigma、>95%)および10mMスクロース(Sigma)の補基質負荷量と組み合わせた。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH7、3mM MgCl2、50℃。0.2%ギ酸を伴う90μLアセトニトリルに10μLアッセイ混合物を添加することにより上記反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で10倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末(SFP)を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末(SFP)調製によって、HTPアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物(例えば、総タンパク質の>30%まで)が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一コロニーを、30μg/mlのクロラムフェニコールと1%グルコースとを含有する5mLのルリア-ベルターニブロスに接種した。細胞を30℃のインキュベーターにおいて250rpmで振盪しながら一晩(少なくとも16時間)増殖させた。1Lフラスコ内の30μg/mlのCAMを含有する250mLのテリフィックブロス(12g/Lのバクト-トリプトン、24g/Lの酵母抽出物、4mL/Lのグリセロール、65mMリン酸カリウム、pH7.0、1mM MgSO4)に培養物を添加して希釈して0.2の600nm光学密度(OD600)にし、30℃で増殖させた。
レバウジオシドDからのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対する操作されたSuS改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH7と3mM塩化マグネシウムと1g/LのレバウジオシドDと10mMスクロースと1mM ADPと2g/LのGT配列番号10とを含有する100μLの総反応体積に0.125g/Lの濃度で振盪フラスコ粉末(SFP)を添加した。反応を50℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら1時間行った。0.2%ギ酸を伴う90μLアセトニトリルに10μLの反応混合物を添加することにより反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で10倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシドについて分析した。これらの結果に基づいて、酵素を最適化するために追加の進化ラウンドを行った。
スクロースシンターゼ改変体
前の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、スクロースシンターゼ酵素の定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成への活性を有する追加の反復ラウンドの操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、組合せライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物をTris-HCl、pH7.5に添加して約90倍希釈した。次いで、10μLの希釈されたSuS溶解物および1g/LのGT配列番号14を、100μLの反応体積で、4.5~7.5mMレバウジオシドA97の基質負荷量ならびに0.2~0.25mM ADP(Sigma、>95%)および30mMスクロース(Sigma)の補基質負荷量と組み合わせた。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、55℃。上記の反応物を、90~190μLの水に10μLのアッセイを添加することにより可溶化し、0.2%ギ酸を伴う90μLアセトニトリルに10μLの可溶化アッセイを添加することによりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で4.4~6.7倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。分析後、GTと結合してレバウジオシドAに対する活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定した。
レバウジオシドAからのレバウジオシドDの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対する操作されたSuS改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と7.5mMレバウジオシドA97と30mMスクロースと0.2mM ADPと1g/LのGT配列番号14とを含有する100μLの総反応体積に、0.02g/Lの濃度で振盪フラスコ粉末(SFP)を添加した。反応を50℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら1時間行った。反応物を水に添加して20倍希釈することにより可溶化し、0.2%ギ酸を伴う90μLアセトニトリルに10μLの希釈された反応物を添加することによりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で4.4倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシドについて分析した。活性が参照配列より高く、レバウジオシドAから産生されるレバウジオシドDがより高レベルである、改変体を、さらなる定向進化のために、スクロースからADPにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用のために選択した。
配列番号20のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号8598に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号19によりコードされるGT(すなわち、配列番号20)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの72種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号19改変体(すなわち、配列番号20の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して10倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、Thermotron(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら1時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.025g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.05g/LのSUS SFP配列番号18、0.12g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号16、および40g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号20より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表7.1および表7.2に収載する。配列番号20と比較して表7.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.05g/LのSUS SFP配列番号18と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.05g/LのSUS SFP配列番号18と0.12g/Lのβ1,2GT SFP配列番号16と30g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈し、24時間、75.1℃でインキュベートした後の10μLの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号36のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号36に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびN末端コード領域を標的化した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号35によりコードされるGT(すなわち、配列番号36)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの58種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号35(すなわち、配列番号36の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して20倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.03g/LのSUS SFP配列番号22、0.08g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号858、および30g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号36より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表8.1に収載する。修飾N末端DNAコード配列を有するが、アミノ酸変異を有さない、4つの追加の改変体も、配列番号277/278、279/280、281/282、および283/284で同定した。配列番号36と比較して表8.2に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.05g/LのSUS SFP配列番号22と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号22と0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号858と30g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈し、24時間、75.2℃でインキュベートした後の10μLの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号174のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号174に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号173によりコードされるGT(すなわち、配列番号174)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの60種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号173改変体(すなわち、配列番号174の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して25~33.3倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.03g/LのSUS SFP配列番号1652、0.08g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号858、および30g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号174より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表9.1および表9.2に収載する。加えて、表9.2に収載する飽和変異誘発改変体をさらに4つの条件下でアッセイした。1つは、16時間、70℃でインキュベートしたことを除き、上記のアッセイと同じであった。別の1つは、40g/LのRebA60をリン酸カリウム希釈緩衝剤のプレインキュベーションに含めたことを除き、上記と同じであった。他の2つは、清澄化溶解物を50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して25倍希釈し、75℃で2時間プレインキュベートし、次いで、10倍希釈して、15mMステビオールグリコシド95%またはレバウジオシドDと30g/Lのスクロースと0.02g/LのADPと50mMリン酸カリウムpH6と0.03g/L SUS SFP配列番号1652とを含有する100μLの反応物にした、単一基質反応条件であった。これらの反応物を16時間、60℃でインキュベートし、水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、低温遠心分離により沈殿させた。次いで、上清を水で15倍希釈し、RapidFire-MS/MSにより分析した。配列番号174と比較して表9.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1652と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1652と0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号858と30g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈し、24時間、75.2℃でインキュベートした後の10μLの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号406のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号406に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号405によりコードされるGT(すなわち、配列番号406)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの16種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号405改変体(すなわち、配列番号406の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して15倍希釈し、別途、40g/LのレバウジオシドA60%基質を伴う同じ緩衝剤に添加して15倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.03g/LのSUS SFP配列番号1822、0.06g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号994、および30g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号406より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表10.1に収載する。
配列番号408のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号408に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号407によりコードされるGT(すなわち、配列番号408)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの39種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号407改変体(すなわち、配列番号408の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、60g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して20倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.03g/LのSUS SFP配列番号1822、0.06g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号1080、および30g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号408より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表11.1および表11.2に収載する。配列番号408と比較して表11.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と0.06g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1080と30g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈し、24時間、75.2℃でインキュベートした後の10μLの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号440のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号440に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号439によりコードされるGT(すなわち、配列番号440)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの36種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号440改変体を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、80g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して20倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、20g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.03g/LのSUS SFP配列番号1822、0.06g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号1080、および30g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号440より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表12.1および表12.2に収載する。配列番号440と比較して表12.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。Thermotron(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と0.06g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1080と30g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、80g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中で2時間、75℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。78.5℃で24時間インキュベートした50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中の1.5mg/mLの振盪フラスコ粉末10μLを用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号520のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号520に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号519によりコードされるGT(すなわち、配列番号520)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの44種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号519改変体(すなわち、配列番号520の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して49倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、40g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.06g/LのSUS SFP配列番号2182、0.12g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号1216、および60g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での40倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号520より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表13.1および表13.2に収載する。配列番号520と比較して表13.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号2182と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と40g/LのRebA60と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号2182と0.12g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1216と60g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、100g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中で2時間、75℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での40倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で25倍希釈して24時間、75.2℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号626のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号626に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号625によりコードされるGT(すなわち、配列番号626)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの43種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号625改変体(すなわち、配列番号626の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して100倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、40g/LのレバウジオシドA60%基質、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.06g/LのSUS SFP配列番号2182、0.09g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号1488、および60g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での40倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号626より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表14.1および表14.2に収載する。配列番号626と比較して表14.3に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDと0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.03g/LのSUS SFP配列番号2182と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.005~0.15g/LのSFPに希釈した。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と50g/LのRebA60と0.025g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.075g/LのSUS SFP配列番号2182と0.09g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1488と75g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.01~0.3g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、100g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中で2時間、75℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で25倍希釈して24時間、75.2℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号678のベータ-1,3-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、in situで合成されるADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号678に由来するβ1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号677によりコードされるGT(すなわち、配列番号678)の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの47種の操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。
配列番号677改変体(すなわち、配列番号678の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例6で説明したように清澄化し、次いで、100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に添加して70倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら2時間、75℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。100μLの反応物に10μLのプレインキュベートされた溶解物を用い、50g/LのレバウジオシドA60%基質、0.025g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質、0.075g/LのSUS SFP配列番号2322、0.09g/Lのβ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼ(β12GT)配列番号1488、および75g/Lのスクロース(蔗糖)を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を水での50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のRapidFire-MS/MSにより試料を分析した。in situで合成されるADP-グルコースを用いてレバウジオシドA60からレバウジオシドMを配列番号678より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表15.1に収載する。配列番号678と比較して表15.2に示す改変体の分析のために、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を20g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と15mMステビオシド(純度>95%)またはレバウジオシドDまたはレバウジオシドE(β1,2GTで処理したステビオシドから社内で調製した)と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.025g/LのSUS SFP配列番号2322と37.5mMスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中、0.0125~0.2g/LのSFPに希釈した。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら4時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で15倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と100g/LのRebA60と0.05g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と0.2g/LのSUS SFP配列番号2322と0.2g/Lのβ1,2GT
SFP配列番号1516と150g/Lのスクロース(蔗糖)との100μLの総反応体積中の0.0125~0.2g/LのSFPを用いて、ワンポット反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、100g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中で2時間、75℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16時間、60℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での100倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で25倍希釈して24時間、75.2℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
配列番号24のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号24に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号23によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから16種の操作された改変体を同定し(表16.1)、飽和変異誘発ライブラリーから51種を同定した(表16.2)。
配列番号23改変体(すなわち、配列番号24の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して150倍希釈し、1時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、20g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と30g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.03g/LのSUS SFP配列番号22および0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号20を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表16.1および16.2に収載する。表16.3に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA97(単一基質)またはRebA60(ワンポット)と0.02g/LのADPと20(単一基質)または30g/L(ワンポット)のスクロースと0.04g/LのSUS SFP配列番号22と、ワンポット反応についてのみ、0.15g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号36とを含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で1時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で200倍希釈して24時間、66.2℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似の単一基質レバウジオシドA反応も行った。0.01g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表16.3に示す。
配列番号858のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号858に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号857によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。44種の操作された改変体を組合せライブラリーから同定した(表17.1)。
配列番号857改変体(すなわち、配列番号858の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して200倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、20g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と30g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.03g/LのSUS SFP配列番号1652および0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号174を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表17.1に収載する。表17.2に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA97(単一基質)またはRebA60(ワンポット)と0.02g/LのADPと20(単一基質)または30g/L(ワンポット)のスクロースと0.03g/LのSUS SFP配列番号1652と、ワンポット反応についてのみ、0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号174とを含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似の単一基質レバウジオシドA反応も行った。0.005g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表17.2に示す。
配列番号994のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号994に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号994によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから19種の操作された改変体を同定し(表18.1)、飽和変異誘発ライブラリーから25種を同定した(表18.2)。
配列番号994改変体(すなわち、配列番号994の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を、20g/L(組合せライブラリー)または30g/L(飽和変異誘発ライブラリー)レバウジオシドA60%を伴うまたは伴わない50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、20g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と30g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.03g/LのSUS SFP配列番号1822および0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号350を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表18.1および90.2に収載する。表18.3に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA97(単一基質)またはRebA60(ワンポット)と0.02g/LのADPと20(単一基質)または30g/L(ワンポット)のスクロースと0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と、ワンポット反応についてのみ、0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号350とを含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、10g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、10g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットRebA60反応も行った。0.005g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表18.3に示す。
配列番号1080のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号1080に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号1079によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから33種の操作された改変体を同定し(表19.1)、飽和変異誘発ライブラリーから38種を同定した(表19.2)。
配列番号1079改変体(すなわち、配列番号1080の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を、30g/L(組合せライブラリー)または10g/L(飽和変異誘発再試験)レバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、20g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と30g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.03g/LのSUS SFP配列番号1822および0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号350を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表19.1および19.2に収載する。表19.3に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA97もしくはステビオールグリコシド95%(単一基質)またはRebA60(ワンポット)と0.02g/LのADPと20(単一基質)または30g/L(ワンポット)のスクロースと0.03g/LのSUS SFP配列番号1822と、ワンポット反応についてのみ、0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号440とを含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、30g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、30g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットRebA60反応も行った。0.01g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびレバウジオシドEならびにワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表19.3に示す。
配列番号1216のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号1216に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号1215によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから91種の操作された改変体を同定し(表20.1)、飽和変異誘発ライブラリーから11種を同定した(表20.2)。
配列番号1215改変体(すなわち、配列番号1216の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を、60g/L(組合せライブラリー)または80g/L(飽和変異誘発再試験)レバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して60倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、20g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.01g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と30g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.03g/LのSUS SFP配列番号2182および0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号520を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対してグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表20.1および20.2に収載する。表20.3に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6と20g/LのRebA97もしくはステビオールグリコシド95%(単一基質)またはRebA60(ワンポット)と0.02g/LのADPと20(単一基質)または30g/L(ワンポット)のスクロースと0.03g/LのSUS SFP配列番号2182と、ワンポット反応についてのみ、0.1g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号520とを含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、80g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットRebA60反応も行った。0.005g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびレバウジオシドEならびにワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表20.3に示す。
配列番号1488のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号1488に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号1487によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから26種の操作された改変体を同定し(表21.1)、飽和変異誘発ライブラリーから17種を同定した(表21.2)。
配列番号1487改変体(すなわち、配列番号1488の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を、100g/LのレバウジオシドA60%を伴う50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して60または100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、50g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.025g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と75g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.075g/LのSUS SFP配列番号2182および0.25g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号626を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表21.1および21.2に収載する。表21.3に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6を含有する100μLの総反応体積中、0.0013~0.04g/Lに希釈した。単一基質反応は、20g/LのRebA97、0.02g/LのADP、20g/Lのスクロース、および0.03g/LのSUS SFP配列番号2182からなった。ワンポット反応は、50g/LのRebA60、0.025g/LのADP、75g/Lのスクロース、0.075g/LのSUS SFP配列番号2182、および0.25g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号626からなった。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、100g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を、水中1g/Lの基質に希釈することにより可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットRebA60反応も行った。0.005g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびレバウジオシドEならびにワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表21.3に示す。
配列番号1516のベータ-1,2-ADP-グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ADP-グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号1516に由来するGTポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号1516によりコードされるGTの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するHTPアッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースおよびステビオールグリコシドに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたGT改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから21種の操作された改変体を同定した(表22.1)。
配列番号1515改変体(すなわち、配列番号1516の改変体)を発現する清澄化E.coli培養溶解物の96ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、400μLであり、溶解物を、100g/LのレバウジオシドA60%を伴うおよび伴わない50mMリン酸カリウム、pH6.0に添加して33倍希釈し、100g/LのRebA60を伴うプレートを2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、50g/LのレバウジオシドA60%(RebA60)基質と0.025g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補基質と75g/Lのスクロースとを伴う100μLの反応体積中の、10μLの希釈された溶解物、0.075g/LのSUS SFP配列番号2322および0.25g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号678を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。反応物を、水への添加による50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により20倍希釈した。RebA60に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表22.1に収載する。表22.2に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
振盪フラスコ粉末(SFP)を4g/Lの濃度に再構成し、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6を含有する100μLの総反応体積中、0.013~0.2g/Lに希釈した。単一基質反応は、20g/LのレバウジオシドA97%またはステビオールグリコシド95%、0.02g/LのADP、20g/Lのスクロース、および0.03g/LのSUS SFP配列番号2322からなった。ワンポット反応は、100g/LのRebA60、0.05g/LのADP、150g/Lのスクロース、0.2g/LのSUS SFP配列番号2322、および0.3g/Lのβ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼ(β1,3GT)SFP配列番号678からなった。60℃でTHERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで4時間(単一基質)または16~18時間(ワンポット)、反応を行った。SFP希釈物の一方のセットは、75℃で2時間、100g/LのレバウジオシドA60%と共に50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を、水中1g/Lの基質に希釈することにより可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で20倍希釈した。実施例5、表5.1に記載のSPE-QQQによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で70倍希釈して24時間、71.8℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットRebA60反応も行った。0.0125g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドDおよびレバウジオシドEならびにワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表22.2に示す。
配列番号22のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号21によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、このライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成への活性が増加した別のラウンドの88種の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、14.5g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して60~120倍希釈し、1~1.5時間、75~77℃でプレインキュベートした。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号24、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号20を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。分析後、このワンポット反応で活性改善を示した操作されたSuS改変体ポリペプチドを同定した。それらを表23.1に収載する。表23.2に示すアミノ酸変異を有する改変体については、実施例1で説明したようにタンパク質を特徴付けるために振盪フラスコ規模の培養物を増殖させた。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対するこれらの操作されたSuS改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、リン酸カリウム緩衝剤、pH6中の14.5g/LのRebA60中、0.016~0.5g/Lに構成し、アリコートを75℃で1.5時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号24、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号20を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈して20時間、73.5℃で、100μLの反応体積で15mMのレバウジオシドA基質、0.02mM ADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)補因子、37.5mMスクロース補基質、9mMフルクトースおよび0.5g/Lのβ1,2GT SFP配列番号24と共にインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。これらの単一基質反応物を4時間、60℃でインキュベートし、次いで、水での40倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈および遠心分離による沈殿によりクエンチし、次いで、上清を水で7.5倍希釈し、上で説明したように分析した。0.006g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表23.2に示す。
配列番号1652のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号1651によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成に対する活性が増加した別のラウンドの111種の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、14.5g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して120倍希釈し、または40g/LのRebA60を伴う同じ緩衝剤に添加することにより20倍希釈(組合せライブラリーについて)もしくは60倍希釈(飽和変異誘発ライブラリーについて)し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号858、および0.14g/Lのβ1,3GT SFP配列番号174を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。飽和変異誘発ライブラリーを、40g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0で200倍希釈して2時間、75℃でプレインキュベートした溶解物を使用して、0.02g/LのADP、30g/Lのスクロース、7.2g/Lのフルクトース、および0.12g/Lのβ1,2GT SFP配列番号994を用いて、20g/Lでの単一基質レバウジオシドA97%に関してもアッセイした。上記の反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表24.1および24.2に収載する。表24.3に収載する改変体については、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対するこれらの操作されたSuS改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、40g/LのRebA60を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、pH6中、0.016~0.5g/Lに構成し、RebA60を伴う溶液を75℃で2時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.08g/Lのβ1,2GT SFP配列番号858、および0.14g/Lのβ1,3GT SFP配列番号174を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、40g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で20倍希釈して24時間、71.1℃で、100μLの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、10μLの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。0.0125g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表24.3に示す。
配列番号1822のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号1821によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成に対する活性が増加した追加のラウンドの63の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、40g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して90倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。このプレインキュベーション条件を用いて、および80g/LのRebA60のプレインキュベーションを用いて、飽和変異誘発試料を再試験した。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.04g/Lのβ1,2GT
SFP配列番号994、および0.08g/Lのβ1,3GT SFP配列番号350を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表25.1および25.2に収載する。表25.3に収載する改変体については、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対するこれらの操作されたSuS改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、80g/LのRebA60を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、pH6中、0.016~0.5g/Lに構成し、RebA60を伴う溶液を75℃で2時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.04g/Lのβ1,2GT SFP配列番号994、および0.08g/Lのβ1,3GT SFP配列番号350を、20g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水で20倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、40g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で200倍希釈して24時間、71.1℃で、100μLの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、10μLの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。0.0125g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表25.3に示す。
配列番号2092のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号2092によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成に対する活性が増加した別のラウンドの74種の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、100g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して50~100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.04g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1080、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号440を、30g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。飽和変異誘発ライブラリーをまた、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.2g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1080、および0.43g/Lのβ1,3GT SFP配列番号440を、50g/LのRebA60、0.01g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、75g/Lのスクロース(蔗糖)、および18g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で用いて、再試験した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を、水中1~1.5g/Lの出発RebA60に希釈することにより可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表26.1および26.2に収載する。表26.3に収載する改変体については、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対する操作されたSuS改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、100g/LのRebA60を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、pH6中、0.016~0.5g/Lに構成し、RebA60を伴う溶液を75℃で2時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.04g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1080、および0.2g/Lのβ1,3GT SFP配列番号440を、30g/LのRebA60、0.02g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、30g/Lのスクロース(蔗糖)、および7.2g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での30倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で100倍希釈して24時間、71.1℃で、100μLの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、10μLの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。0.0125g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表26.3に示す。
配列番号2182のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号2182によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成への活性が増加した別のラウンドの80種の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、100g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して75~100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.2g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1216、および0.43g/Lのβ1,3GT SFP配列番号520を、50g/LのRebA60、0.01g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、75g/Lのスクロース(蔗糖)、および18g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表27.1および99.2に収載する。表27.3に収載する改変体については、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対する操作されたSuS改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、100g/LのRebA60を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、pH6中、0.016~0.5g/Lに構成し、RebA60を伴う溶液を75℃で2時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.2g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1216、および0.43g/Lのβ1,3GT SFP配列番号520を、50g/LのRebA60、0.01g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、75g/Lのスクロース(蔗糖)、および18g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での50倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6に0.2g/Lで溶解して24時間、71.1℃でインキュベートした10μLの振盪フラスコ粉末でも反応を行い、次いで、100μLの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でアッセイした。0.0125g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表27.3に示す。
配列番号2322のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号2321によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット(HTP)アッセイを使用してスクリーニングして、ADP-グルコースの生成への活性が増加した追加のラウンドの18の操作されたSuS改変体ポリペプチドを得た。
以下のHTP酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状E.coli培養物を、1mM硫酸マグネシウムと0.5mg/mLのリゾチームとポリミキシンB硫酸塩(PMBS)とを伴う400μLのTris-HCl、pH7.5で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、100g/LのRebA60を伴うリン酸カリウム緩衝剤、pH6.0に添加して100倍希釈し、2時間、75℃でプレインキュベートした。次いで、10μLの希釈されプレインキュベートされたSuS溶解物、0.4g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1516、および0.9g/Lのβ1,3GT SFP配列番号678を、100g/LのRebA60、0.05g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、150g/Lのスクロース(蔗糖)、および36g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での100倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表28.1に収載する。表28.2に収載する改変体については、実施例1で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
レバウジオシドA60%からのレバウジオシドMの形成を助長するためのスクロースおよびADPに対する操作されたSuS改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末(SFP)を、100g/LのRebA60を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、pH6中、0.125~2g/Lに構成し、RebA60を伴う溶液を75℃で2時間プレインキュベートした。10μLの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないSuS溶解物、0.4g/Lのβ1,2GT SFP配列番号1516、および0.9g/Lのβ1,3GT SFP配列番号678を、100g/LのRebA60、0.05g/LのADP(Amresco、ウルトラピュアグレード)、150g/Lのスクロース(蔗糖)、および36g/Lのフルクトースと共に、100μLの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した:THERMOTRON(登録商標)タイタープレートシェーカーにおいて300RPMで振盪しながら16~18時間、50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6、60℃。上記の反応物を水での100倍希釈により可溶化し、0.2%ギ酸を伴うアセトニトリルでの5倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で20倍希釈し、表5.1に記載の計器およびパラメーターを用いてRapidFire SPE-MS/MSによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、100g/LのRebA60を伴う50mMリン酸カリウム緩衝剤、pH6で25倍希釈して24時間、71.1℃でインキュベートした10μLの粗清澄化溶解物を用いる反応も行い、次いで、100μLの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でアッセイした。0.025g/LのSFP負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドMの熱安定性結果および産生レベルを表28.2に示す。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号2に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目2)
配列番号20に対して、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチドを含む、項目1に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目3)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、41/72/233/338、41/72/338、41/144/233、41/233、41/233/338、61、61/87/91/107、61/87/91/259、61/91/431、61/107、61/259/428、61/407/428、61/411、72、72/76、72/76/163/197、72/76/195/233、72/76/197/204、72/76/207/233、72/76/207/338、72/81、72/81/195/233、72/139/195/204、72/144/338、72/200/204/207、72/207、76/144/197/200、76/195/197/204/207/233、76/197/207/233、76/233、81/139/144/195/200/204/207/233、81/144/233、81/197/200/207/233/338、81/233/338、81/338、107、107/259、139/144/233、144/233、144/233/338、156/407、163/233/338、200/204/207/233、233/338、および259から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号20を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目4)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、71、80、81、81/270、83、85、97、124、263、286、334、402、420および456から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号20を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目5)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、41/72/233/338、41/72/338、61、61/91/431、61/259/428、61/407/428、81/139/144/195/200/204/207/233および81/197/200/207/233/338から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号20を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目6)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、73/81/144/207/259、73/81/144/207/285/451、73/81/259/285/426/451、73/81/259/451、73/111/285/451、73/144/207/252/426/451、73/144/207/259/285/426/451、73/144/207/259/285/451、73/144/207/259/426/451、73/144/259/285、73/259/426/451、73/259/451、81/111/144/207/285/451、81/111/259/451、81/144/207/252/285/426、81/144/207/259/451、81/144/252/259/285/451、81/144/259、81/144/259/285、81/144/259/451、81/207/252/259/451、81/207/285/426/451、81/285、81/285/451、111/144/207/252/285/426/451、111/144/252/259/285/451、111/144/259/285/426/451、111/207/285、144/207/252/259、144/207/259、144/207/259/285/451、144/207/259/426/451、144/207/285/426、144/207/451、144/252/259/285、144/252/259/285/451、144/252/259/426、144/252/259/426/451、144/259/285、144/285、144/285/451、144/451、207、207/252/259/451、207/252/451、207/259、207/259/426/451、207/285/426/451、207/451、252/259、259、259/285/451、285、および285/451から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号36を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目7)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、81/111/144/207/285/451、144/207/252/259、144/207/259/285/451、144/252/259/426、144/252/259/426/451および144/285/451から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号36を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目8)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、80/81、80/81/85、80/81/85/238、80/81/85/251/259、80/81/85/252/256/259、80/81/85/259、80/81/251/252/259、80/85、80/85/238、80/85/238/251/259、80/85/251、80/85/251/252、80/85/251/252/256/259、80/85/251/252/259、80/85/251/259、80/85/259、80/259、81/85、81/85/251/252、81/85/259、85、85/238、85/251、85/251/252/256、85/251/259、85/256/259、175/402、251/252/259、259、270/402、および420から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号174を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目9)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、3、5、7、99、153、232/317、252、273、299、326、393、404、409、422、443、451および455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号174を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目10)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、80/81/85、80/85、80/85/251/259、85、85/251/252/256、175/402および270/402から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号174を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目11)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、81/85、81/85/175/259/402、81/85/251、81/85/251/259、81/85/259、81/85/259/402、85、85/175、85/175/251、85/175/251/259/402、85/175/259、85/175/259/402、85/175/402、85/259、85/259/402、および85/402から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号406を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目12)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、153、153/326、153/326/443、153/326/443/455、232、232/273/299、232/393/451、299/451、326、404および451から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号408を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目13)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、25、116、146、170、173、227、296、300、315、327、330、361、408、412、438、448および449から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号408を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目14)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、153、232、232/393/451および451から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号408を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目15)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、146/170/196、146/170/196/232、146/170/196/232/423、146/170/196/232/451/455、146/170/196/408/451、146/170/232、146/170/232/423、146/170/232/423/448/451/455、146/170/259、146/196、146/196/232、146/196/232/259/448/451、146/196/455、146/232/259/455、146/232/315、146/232/315/423/451/455、146/232/326、146/232/448、146/232/451、および146/413/451/455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号440を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目16)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、9、12、107、131、156、161、169、199、204、209、233、262、289、337および417から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号440を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目17)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、146/170/196、146/170/196/232、146/170/196/232/451/455、146/170/232、146/170/232/423/448/451/455、146/196/232、146/196/232/259/448/451および146/232/448から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号440を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目18)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、9/12/107/161/199/209/337、9/12/161/169/199/209/337、9/12/199/204/209/337/455、9/12/199/209/337/451/455、9/107/131/204/259/417/451、9/107/156/161/199/204/417/455、9/107/161/209/259/289/451/455、9/131/156/209/289/337、9/131/204/337/451、9/156/169/204/337、9/169/204/289/337/451/455、9/204、9/204/259/289、9/337、12/14/107/204/289/455、12/107/131/204/289/337/417/451/455、12/107/156/209/289/455、107/161/169/199/204/259/451、107/199/204/289、107/199/209/259/451/455、107/204、156/169/199/204/209/259/289、161/204/417、204/451/455、289、および451/455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号520を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目19)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、16、53、54、78、80、95、111、221、257、336、349、391、410、413、426および430から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号520を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目20)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、9/12/199/204/209/337/455、9/131/156/209/289/337、9/204、12/14/107/204/289/455、107/161/169/199/204/259/451、107/199/204/289および204/451/455から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号520を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目21)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、16、16/59/80/413、16/80、16/80/111、16/80/111/257、16/80/221/257/336/410、16/80/221/336/410、16/80/257、16/111/221、16/111/221/257/391、16/221、16/221/257、16/221/257/336/391、16/221/410、16/257、16/257/336/413/420、80/111/221/257/410、111/221/257/336/391、111/221/257/391、221、および221/257から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号626を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目22)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5、7、14、65、91、99、102、118、138、194、254、286、416、418および420から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号626を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目23)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、16/80/221/257/336/410、16/111/221、16/221/257、16/221/410、16/257、80/111/221/257/410および221から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号626を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目24)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5、5/14/99、5/14/416、5/91、5/91/102/118、5/91/102/254/418、5/91/106/254/286、5/91/118/194/254/286、5/91/118/194/254/418、5/91/118/194/418、5/91/118/254/286/418、5/91/118/286、5/91/194/254、5/91/194/418、5/91/254、5/91/254/286、5/102/418、5/118/194/286/418、5/118/254、5/118/286、5/194、5/254/286、5/418、7/14、7/14/65/99、7/14/99/416、14、14/65/99/416、14/99、14/99/254、14/99/254/416、14/99/254/416/455、14/99/416、14/167、14/254、14/455、91、91/102/194、91/118、91/118/194、91/118/194/286、91/118/194/418、91/118/286、91/194/254/286、91/286、および118/286/418から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号678を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目25)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5/91/106/254/286、5/91/118/286、5/91/254/286、14、14/65/99/416、14/99および14/99/254から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号678を基準にして番号が付けられている、項目2に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目26)
配列番号12に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目27)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、16、16/127/169、16/134、16/143/423、16/169、16/169/398/399、16/169/423、16/398、16/398/399、16/398/427、16/423、16/423/427、134、143、399/423および423/427から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号24を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目28)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、3、8、11、41、44、56、60、122、135、137、138、139、158、164、176、221、232、233、235、248、249、281、284、285、301、322、372、392、400、421、426、427、433、440、443および446から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号24を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目29)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、16、16/127/169および16/169から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号24を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目30)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、3/22/198/421、3/22/421、3/201/248/322、3/201/248/322/392、13/233/331/440、13/440/443、22/32/56/60/198/248/322/392/421、22/56、22/56/137/198/201/248/322/392、22/56/137/198/248/392/421、22/56/137/322、22/56/137/322/392/423、22/56/198/202/248、22/56/198/248/322/392/421、22/56/198/248/421/423、22/56/421/423、22/60/392/421、22/137、22/137/198/202/248、22/198/202/248/392、22/248/392、22/392、22/421、22/421/423、22/423、44/164/233、44/164/233/329/331、44/331、125、125/233/443/446、164/221/233/331/440/446、164/233/331/440、164/233/446、164/331、164/440、164/443、198/202/392、221/329/331、233、233/446、329、421/423、および443/446から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号858を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目31)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、3/22/198/421、13/440/443、22/56/198/202/248、22/137、22/198/202/248/392、164/221/233/331/440/446、164/233/331/440および233/446から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号858を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目32)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、83/202/233、164、164/202、164/202/233/331、164/202/248/272、164/202/331、164/202/331/423、164/423、202/233、202/233/248、202/233/248/423、202/248、202/331、202/421/423、202/423、202/446、233、248、および423から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号994を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目33)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、7、9、10、54、73、84、106、115、116、132、165、286、309、389、406、422および438から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号994を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目34)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、83/202/233、164、164/202、164/423、202/233/248および233から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号994を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目35)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、7/9/73/165/286、7/9/165/286、7/9/422、7/116/165/286、7/165、9/73/116/165/286/422、9/286/389、54、54/84、54/406、73、73/116/165/286/389、73/116/286、73/116/286/422、73/165/286、73/286/389、73/286/422、73/422、84、115、116、116/165、116/165/286/422、116/389、165、165/286、165/389、165/389/422、286、286/422、389/422、および422から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1080を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目36)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、185/190、219、220、255、257、302、385、395、395/437、399、401、409、412、416、434、441、445、447および449から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1080を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目37)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、9/73/116/165/286/422、54、54/84、54/406、73/116/286/422、116/165/286/422および286/422から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1080を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目38)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、54、54/185/190、54/185/190/219/257/302/385/389/395/445/447/449、54/185/190/219/385、54/185/190/219/385/389/395/399/441/445/447/449、54/185/190/219/385/395/399/441/445/447/449、54/185/190/219/385/445/447、54/185/190/219/389/395/399/441/445/447/449、54/185/190/302、54/185/190/302/395/399、54/185/190/385/447/449、54/185/190/389/395、54/185/190/389/441/445/447/449、54/185/190/389/445、54/185/190/395/399/441/445/447/449、54/185/219/389、54/185/257/389/441/445/447/449、54/185/302/385/399/445/447、54/185/385/389/395/441/445/449、54/185/385/395/399/445/447/449、54/185/389/395/445/447、54/190/219/257/302、54/190/219/257/395/445/447/449、54/190/257、54/190/257/302/399、54/190/257/309/385/389/395/399/445、54/190/257/385/389、54/190/257/395/445/449、54/190/302/389、54/190/302/389/395/399/445/447、54/190/385/389/395/441/445、54/190/385/395、54/190/385/445/447/449、54/190/395、54/190/395/445/447、54/219/302/395/441/445/447、54/219/385/389/395/441/445/447、54/257、54/257/385/449、54/257/389、54/257/399、54/257/441/447、54/257/441/449、54/302/385/399/441/445/447、54/302/385/399/441/445/449、54/385、54/385/389/441/445/447/449、54/389/395/399/447/449、185/190/219/257/389/395/445/447、185/190/257/302/395/441/445/447、185/190/257/385/389/399、185/190/257/385/399/445/447、185/190/257/389/395、185/190/257/389/395/399/441/447/449、185/190/385/389/441/445/447、185/190/389/447/449、185/190/395/399、185/219/257/399/445/447、185/257/385/395/399/445/447、185/302/395/399/441/445/447/449、185/395/399/441/445/447、190/219/257/385/389/441/445/447/449、190/219/302/385/399/445、190/257/302/385/399、190/257/385/389/399、190/257/385/389/445/447、190/257/385/395、190/257/385/441/445/447/449、190/257/389/395/441/445/447、190/257/399/447/449、190/302/385/389/395/399/441/445/447、190/389、219/257/385/389/395/441/447/449、219/257/395、219/385/389/399/445/449、219/395、257/385/389/399、257/389/395/399/445/447、257/389/395/399/445/449、257/389/399、302/389/395/445、385/389、385/395、389/395/445/447、395/399、および399から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1216を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目39)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、5、14、96、108、157、181、188、278、293および341から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1216を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目40)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、54/185/190/219/257/302/385/389/395/445/447/449、54/185/190/385/447/449、54/190/257/302/385/395/399、54/190/302/389/395/399/445/447、54/257/385/449、54/257/389、および54/389/395/399/447/449から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1216を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目41)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14/42/51/108/181、14/42/51/157/341、14/42/341、14/51/96/157、14/51/96/157/341、14/51/96/341、14/51/108、14/51/341、14/96、14/96/108/133、14/96/108/181/341、14/96/108/188、14/96/341、14/108/157、14/108/157/188、14/157/181/278、14/278、42/96/157/341、42/188/341、96/108/181/293、96/108/188、96/108/188/341、96/188、181、188、および293から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1488を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目42)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、122、144、147、187、196、197、198、199、201、268および324から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1488を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目43)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、14/42/341、14/96、14/96/108/133、14/96/108/181/341および188から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1488を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目44)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、147/188/196/201、152/187/188/324、152/188、152/188/196/198/199/324、152/188/196/199、152/188/196/201/324、152/188/324、188、188/196/198/199/201、188/196/198/199/201/324、188/196/198/201、188/196/198/324、188/196/201、188/198/199/201/324、188/198/199/268、188/198/201/324、188/198/324、188/199/201、188/201、188/201/324、および188/324から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1516を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目45)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、152/188/196/198/199/324、188/196/198/199/201、188/196/198/201、188/196/201、188/198/199/268、188/201および188/324から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1516を基準にして番号が付けられている、項目26に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目46)
ベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼから選択される、項目1から45のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目47)
ADP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(AGT)、CDP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(CGT)、GDP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(GGT)、TDP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(TGT)およびIDP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ(IGT)から選択される、NDP-グリコシルトランスフェラーゼである、項目1から46のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目48)
ADP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼである、項目1から47のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目49)
ウラシル二リン酸以外の糖ドナーを優先的に使用する、項目1から48のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
(項目50)
項目1から48のいずれかで提供される少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目51)
項目50に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目52)
少なくとも1つの制御配列をさらに含む、項目51に記載のベクター。
(項目53)
項目50に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
(項目54)
項目51および/または52に記載の少なくとも1つのベクターを含む宿主細胞。
(項目55)
真核生物および原核生物から選択される、項目53または54に記載の宿主細胞。
(項目56)
項目1から45のいずれかで提供される少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを産生するための方法であって、項目53から55のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼが前記宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む、方法。
(項目57)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼを回収するステップをさらに含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
項目1から45のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む組成物。
(項目59)
配列番号6に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
(項目60)
配列番号22に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
(項目61)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、3/548、4、7、12、41、42、44、47、52、57、59、71、81、85、93、97、122、129、134、136、139、154、175、215、266、270、343、358、381、388、434、442、519、524、532、536、570、589、603、606、615、635、641、652、724、727、および738から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号22を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目62)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、41、52、134、381、442、519、524および724から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号22を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目63)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、25/44/52/134/434/724、41/44/52/97/442/719/724、41/44/52/134/442、41/44/52/434/442/532/724、41/44/52/434/724、41/44/136/329、41/44/136/442、41/44/532、41/52/97/434/442/532/724、41/52/134/136/434、41/52/134/442/724、41/52/136、41/52/434、41/52/434/442、41/52/434/442/724、41/52/442、41/97/134/434/442/532/553、41/134/442/532、41/329/442、41/434/442/532、41/434/442/532/724、41/434/532、41/532、44/52/97/434/442/724、44/52/97/442/724、44/52/134/136/329/434/442/532、44/52/134/434/532、44/136/329/434/532、44/136/532、44/434/442/553、52、52/97、52/97/434/442、52/97/442、52/97/532、52/134、52/134/136/434、52/134/136/442、52/134/329/434、52/134/329/532、52/134/434/442/532/553、52/134/442/724、52/136、52/136/434、52/136/434/442、52/136/434/442/532、52/136/434/724、52/136/442、52/434、52/434/442/532、52/434/442/724、52/434/532、52/442、52/442/532/724、52/442/553/724、52/442/724、52/532、52/553、57/97/434/442/724、97/134/136/442/532、97/134/136/532、97/134/442、97/136/434/442、97/329/724、97/442、134、134/136/434/442、134/136/434/442/532/553/724、134/136/434/442/553/724、134/136/434/532/724、134/136/442/532、134/434/442/724、136、136/442、136/442/724、136/532/724、434、434/442、442、442/724、および532/724から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1652を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目64)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、3、4、22、32、34、38、47/488、51、51/433、62、75/169、101、169、195/213、708および718から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1652を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目65)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、44/52/97/442/724、52/97/442、97/442および434/442から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1652を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目66)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、4/22、4/22/34、4/22/34/38、4/22/34/38/169/708、4/22/34/47/51/169/213、4/22/51/708、4/22/101、4/34/38/101、4/34/708、4/62/433/708、4/169、4/169/433、4/169/708、4/433、4/708、22/34、22/34/38、22/34/101/169、22/34/101/169/195、22/34/169/708、22/47/169/433、22/75、34/38/62、34/62/169/433、34/101、62/708、75/169、169/708、および195/708から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1822を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目67)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、4、22、34、121、169、341、411、433、441、518、526、527、528、544、557、558、565、585、602、604、623、708、731および770から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1822を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目68)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、4、4/22/34/38、4/169、4/169/433、4/433、62/708および169/708から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1822を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目69)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34/62/411/526/557、34/62/411/557/602/604、34/62/441/557/623、34/62/518/623、34/62/623/731、34/121/441/544/604/623、34/121/526/604/731、34/411/441、34/411/441/518/526/557/565/731、34/411/441/518/544/557/565/708/731、34/411/441/518/585/604/770、34/441/518/526/585/604/731、34/441/526/565/708/770、34/441/544/557/585/602/623、34/441/585/623/708/731、34/526/585/623、62/121/329/518/557/565/623/708、62/121/411/441/518/544/557/585/604/623、62/121/441/518/526/623/770、62/121/441/565/585、62/121/518/557/585/604/708/770、62/411/526/565/604/623、62/411/585/731、62/441/518/557/604/623/708/731、62/441/623/708/770、62/441/770、121/441/518/526/602/604、121/441/518/526/623/708、121/441/526/557/565/708、121/604/708/731/770、411/441/518/557/623、411/441/518/708、411/441/604/623/708/731、411/518/526/604/623/731、411/565/604/623、411/585/623、441/518/526/557/565/602/604/623/708、441/518/526/557/585/604/623/708、441/518/526/604/623、441/518/557/565/585、441/518/565/623/731/770、441/518/585、441/585、441/585/602/604/623/708/731、441/708/731、557/602/604、557/604、585/623/708、および623から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2092を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目70)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、63、65、269、323、406、416、469、511および640から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2092を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目71)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34/62/441/557/623、34/441/585/623/708/731、62/441/623/708/770、411/441/518/557/623、411/441/604/623/708/731、441/518/526/557/585/604/623/708、441/518/557/565/585、および441/585/602/604/623/708/731から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2092を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目72)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34、34/62、34/62/65/640、34/62/323、34/63/65/323/528/640、34/63/65/406/528/640/713、34/63/323/526/528/640、34/63/406/528/640/731、34/65、34/65/528/640、34/323/406/640、34/323/640、34/640、38/640、62/63、62/63/65/528/640、62/63/69/323/406/640、62/63/526/640/731、62/323/640、63/65/323/406/526/528/640/731、63/65/406/731、63/65/528/640/731、63/65/640、63/323/406/640、63/406、63/406/640、63/526/528/640/731、63/731、323/406/640、323/406/640/731、323/526/528/640、323/526/640、323/640/731、406/640、526/528/640/731、および731から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2182を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目73)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、28、30、30/158、37、59、102、108、158、164、183、191、206、235、307、311、409、419、533、543、546、559、683、710、752および793から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2182を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目74)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34/62、34/65、34/323/640、34/640、38/640および63/65/406/731から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2182を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目75)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34/65/323/406/411/565、34/323/406/411/565、34/323/406/565/731、62/65/323/406/565、62/65/323/406/565/731、62/65/323/411/565、62/65/406/411/565/731、62/323/406/411、62/323/406/411/565、62/323/411/565、63/65/323/406/565/731、63/65/406/411/565、65/323/406/565、323/406/411/565、323/411/565、および636から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2322を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目76)
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、34/65/323/406/411/565、34/323/406/411/565、62/65/323/406/565、62/65/406/411/565/636/731、62/65/406/411/565/731、62/323/406/411、62/323/406/411/565、および62/323/411/565から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2322を基準にして番号が付けられている、項目59に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
(項目77)
項目59から76のいずれかで提供される少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
(項目78)
項目77に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目79)
少なくとも1つの制御配列をさらに含む、項目78に記載のベクター。
(項目80)
項目78に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
(項目81)
項目78または項目79に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目82)
真核生物および原核生物から選択される、項目80および/または81に記載の宿主細胞。
(項目83)
項目59から76のいずれかで提供される少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を産生するための方法であって、項目80から82のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたスクロースシンターゼ改変体が前記宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む、方法。
(項目84)
前記操作されたスクロースシンターゼ改変体を回収するステップをさらに含む、項目83に記載の方法。
(項目85)
項目60から75のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を含む組成物。
(項目86)
基質のグリコシル化のための方法であって、少なくとも1つの基質、項目1から45のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、および前記基質と前記グリコシルトランスフェラーゼとを、前記基質がグリコシル化されて少なくとも1つのグリコシル化産物を産生するような条件下で接触させるステップを含む、方法。
(項目87)
前記基質が、少なくとも1つのステビオールグリコシドを含む、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記グリコシル化産物が、少なくとも1つのモノグリコシル化および/またはポリグリコシル化産物を含む、項目86に記載の方法。
(項目89)
レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP-グルコース、ならびに項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドDおよびレバウジオシドI基質、NDP-グルコース、ならびに前記グリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目90)
レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP-グルコース、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP-グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目91)
レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP-グルコース、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP-グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目92)
前記NDP-グルコースが、ADP-グルコース、CDP-グルコース、TDP-グルコース、GDP-グルコース、および/またはIDT-グルコースから選択される、項目86から91のいずれかに記載の方法。
(項目93)
前記NDP-グルコースが、UDP-グルコースではない、項目86から92のいずれかに記載の方法。
(項目94)
前記グリコシルトランスフェラーゼが、項目1から25および/または項目26から45のいずれかに記載の少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼを含む、項目86から93のいずれかに記載の方法。
(項目95)
レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、ADP-グルコース、ならびに項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、ADP-グルコース、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目96)
レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ADP-グルコース、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたADP-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ADP-グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目97)
レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ADP-グルコース、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ADP-グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目98)
レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドD基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目99)
レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目100)
レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目101)
レバウジオシドMを産生するための方法であって、少なくとも1つのステビオシドを含むおよび/またはステビオシドとrebAの混合物を含むステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目102)
レバウジオシドMを産生する方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、少なくとも1つのスクロースシンターゼ、および項目1から45に記載の少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAが先ず産生され、次いでレバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドIが産生され、最後にレバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
(項目103)
前記スクロースシンターゼが、項目59から76のいずれかで提供される操作されたスクロースシンターゼである、項目98から102のいずれかに記載の方法。
(項目104)
ワンポット反応として行われる、項目86から103のいずれかに記載の方法。
(項目105)
逐次的に行われる、項目86から104のいずれかに記載の方法。
(項目106)
前記方法の前記ステップを反復するステップをさらに含む、項目86から104のいずれかに記載の方法。
(項目107)
前記スクロースが、反復されるステップを通して再利用される、項目106に記載の方法。
(項目108)
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび/または他の反応成分が、再利用される、項目106および/または101に記載の方法。
(項目109)
前記ステビオシド基質が、Stevia rebaudianaから抽出される、項目86から108のいずれかに記載の方法。
(項目110)
前記ステビオシド基質が、合成により産生される、項目86から108のいずれかに記載の方法。
(項目111)
前記グリコシルトランスフェラーゼおよび/または前記スクロースシンターゼが、固定化されている、項目86から110のいずれかに記載の方法。
(項目112)
フルクトースを含む反応産物を産生する、項目86から110のいずれかに記載の方法。
(項目113)
前記フルクトースが、前記反応産物から除去される、項目112に記載の方法。
(項目114)
洗浄ステップをさらに含む、項目86から113のいずれかに記載の方法。
(項目115)
少なくとも1つのカラムクロマトグラフィーステップをさらに含む、項目86から114のいずれかに記載の方法。
(項目116)
前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、項目26から45のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼである、項目86から115のいずれかに記載の方法。
(項目117)
前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、項目1から25のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼである、項目86から116のいずれかに記載の方法。
(項目118)
前記少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、項目26から45のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼであり、少なくとも1つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、項目1から25のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼであることをさらに含む、項目86から117のいずれかに記載の方法。
(項目119)
項目59から76のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼをさらに含む、項目86から118に記載の方法。
(項目120)
項目86から119のいずれかに記載の方法に従って産生される、少なくとも1つのレバウジオシド。
(項目121)
項目120に記載のレバウジオシドを含む、組成物。
(項目122)
項目86から89、92から95、98、および/または101から121のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドM。
(項目123)
項目122に記載のレバウジオシドMを含む、組成物。
(項目124)
項目86から94、96、99、および/または101から121のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドA。
(項目125)
項目124に記載のレバウジオシドAを含む、組成物。
(項目126)
項目86から94、96、99、および/または101から121のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドI。
(項目127)
項目126に記載のレバウジオシドIを含む、組成物。
(項目128)
項目86から94、97、および/または100から121のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドD。
(項目129)
項目128に記載のレバウジオシドDを含む、組成物。
(項目130)
項目122、124、126および/または128で提供される少なくとも2つのレバウジオシドを含む、組成物。
(項目131)
項目123、125、127および/または129で提供される少なくとも2つの組成物の混合物を含む、組成物。
Claims (23)
- 配列番号22、1652、1822、2092、2182、または2322に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼであって、前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が:
(a)441、518、585、169、38、526、557、および604の1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異を含むか、または4V、381R、640R、442Y、623R、および708Vの1つまたは複数の変異を含み、前記位置が、配列番号22、1652、1822、または2092を基準にして番号が付けられている;
(b)3/548、4、7、12、41、42、44、47、52、57、59、71、81、85、93、97、122、129、134、136、139、154、175、215、266、270、343、358、381、388、434、442、519、524、532、536、570、589、603、606、615、635、641、652、724、727、738の1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号22を基準にして番号が付けられている;
(c)25/44/52/134/434/724、41/44/52/97/442/719/724、41/44/52/134/442、41/44/52/434/442/532/724、41/44/52/434/724、41/44/136/329、41/44/136/442、41/44/532、41/52/97/434/442/532/724、41/52/134/136/434、41/52/134/442/724、41/52/136、41/52/434、41/52/434/442、41/52/434/442/724、41/52/442、41/97/134/434/442/532/553、41/134/442/532、41/329/442、41/434/442/532、41/434/442/532/724、41/434/532、41/532、44/52/97/434/442/724、44/52/97/442/724、44/52/134/136/329/434/442/532、44/52/134/434/532、44/136/329/434/532、44/136/532、44/434/442/553、52、52/97、52/97/434/442、52/97/442、52/97/532、52/134、52/134/136/434、52/134/136/442、52/134/329/434、52/134/329/532、52/134/434/442/532/553、52/134/442/724、52/136、52/136/434、52/136/434/442、52/136/434/442/532、52/136/434/724、52/136/442、52/434、52/434/442/532、52/434/442/724、52/434/532、52/442、52/442/532/724、52/442/553/724、52/442/724、52/532、52/553、57/97/434/442/724、97/134/136/442/532、97/134/136/532、97/134/442、97/136/434/442、97/329/724、97/442、134、134/136/434/442、134/136/434/442/532/553/724、134/136/434/442/553/724、134/136/434/532/724、134/136/442/532、134/434/442/724、136、136/442、136/442/724、136/532/724、434、434/442、442、442/724、532/724、3、4、22、32、34、38、47/488、51、51/433、62、75/169、101、169、195/213、708、および718の1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1652を基準にして番号が付けられている;
(d)4/22、4/22/34、4/22/34/38、4/22/34/38/169/708、4/22/34/47/51/169/213、4/22/51/708、4/22/101、4/34/38/101、4/34/708、4/62/433/708、4/169、4/169/433、4/169/708、4/433、4/708、22/34、22/34/38、22/34/101/169、22/34/101/169/195、22/34/169/708、22/47/169/433、22/75、34/38/62、34/62/169/433、34/101、62/708、75/169、169/708、195/708、4、22、34、121、169、341、411、433、441、518、526、527、528、544、557、558、565、585、602、604、623、708、731、および770の1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号1822を基準にして番号が付けられている;
(e)34/62/411/526/557、34/62/411/557/602/604、34/62/441/557/623、34/62/518/623、34/62/623/731、34/121/441/544/604/623、34/121/526/604/731、34/411/441、34/411/441/518/526/557/565/731、34/411/441/518/544/557/565/708/731、34/411/441/518/585/604/770、34/441/518/526/585/604/731、34/441/526/565/708/770、34/441/544/557/585/602/623、34/441/585/623/708/731、34/526/585/623、62/121/329/518/557/565/623/708、62/121/411/441/518/544/557/585/604/623、62/121/441/518/526/623/770、62/121/441/565/585、62/121/518/557/585/604/708/770、62/411/526/565/604/623、62/411/585/731、62/441/518/557/604/623/708/731、62/441/623/708/770、62/441/770、121/441/518/526/602/604、121/441/518/526/623/708、121/441/526/557/565/708、121/604/708/731/770、411/441/518/557/623、411/441/518/708、411/441/604/623/708/731、411/518/526/604/623/731、411/565/604/623、411/585/623、441/518/526/557/565/602/604/623/708、441/518/526/557/585/604/623/708、441/518/526/604/623、441/518/557/565/585、441/518/565/623/731/770、441/518/585、441/585、441/585/602/604/623/708/731、441/708/731、557/602/604、557/604、585/623/708、623、63、65、269、323、406、416、469、511、および640から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2092を基準にして番号が付けられている;
(f)34、34/62、34/62/65/640、34/62/323、34/63/65/323/528/640、34/63/65/406/528/640/713、34/63/323/526/528/640、34/63/406/528/640/731、34/65、34/65/528/640、34/323/406/640、34/323/640、34/640、38/640、62/63、62/63/65/528/640、62/63/69/323/406/640、62/63/526/640/731、62/323/640、63/65/323/406/526/528/640/731、63/65/406/731、63/65/528/640/731、63/65/640、63/323/406/640、63/406、63/406/640、63/526/528/640/731、63/731、323/406/640、323/406/640/731、323/526/528/640、323/526/640、323/640/731、406/640、526/528/640/731、731、28、30、30/158、37、59、102、108、158、164、183、191、206、235、307、311、409、419、533、543、546、559、683、710、752、および793から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2182を基準にして番号が付けられている;あるいは
(g)34/65/323/406/411/565、34/323/406/411/565、34/323/406/565/731、62/65/323/406/565、62/65/323/406/565/731、62/65/323/411/565、62/65/406/411/565/731、62/323/406/411、62/323/406/411/565、62/323/411/565、63/65/323/406/565/731、63/65/406/411/565、65/323/406/565、323/406/411/565、323/411/565、および636から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号2322を基準にして番号が付けられている、
操作されたスクロースシンターゼ。 - 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、441、518、585、169、38、526、557、および/または604の1つまたは複数の位置に少なくとも1つの変異を含み、前記変異が、441L、518S、585A、169A、38H、526H、557P、および/または604Aであり、前記位置が、配列番号22を基準にして番号が付けられている、請求項1に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、4V、381R、640R、442Y、623R、および/または708Vの少なくとも1つまたは複数の変異を含み、前記位置が、配列番号22を基準にして番号が付けられている、請求項1に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼが、配列番号1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2256、2258、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、または2506を含むポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼが、配列番号22の配列を有する操作されたスクロースシンターゼと比較して増加した活性により特徴づけられる、請求項1から4のいずれか一項に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼが、配列番号22の配列を有する操作されたスクロースシンターゼの活性と比較して、少なくとも1.3倍改善された活性により特徴づけられる、請求項5に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 前記操作されたスクロースシンターゼが、配列番号22の配列を有する操作されたスクロースシンターゼと比較して改善された熱安定性により特徴づけられる、請求項1から6のいずれか一項に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
- 請求項1から7のいずれか一項で提供される少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも1つの制御配列をさらに含む、請求項9に記載のベクター。
- 請求項8に記載の少なくとも1つの操作されたポリヌクレオチド、あるいは請求項9または10に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 真核生物および原核生物から選択される、請求項11に記載の宿主細胞。
- 請求項1から7の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を産生するための方法であって、請求項11または12に記載の宿主細胞を、前記操作されたスクロースシンターゼが前記宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む、方法。
- 前記操作されたスクロースシンターゼ改変体を回収するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の少なくとも1つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を含む組成物。
- (a)レバウジオシドMを産生するための方法であって、レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP、スクロース、請求項1から7のいずれか一項に記載のスクロースシンターゼ、ならびに少なくとも操作されたベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼまたは操作されたベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドI基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法;
(b)レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、請求項1から7のいずれか一項に記載のスクロースシンターゼ、および少なくとも1つの操作されたベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAおよび/またはレバウジオシドIが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法;
(c)レバウジオシドDを産生するための方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、請求項1から7のいずれか一項に記載のスクロースシンターゼ、ならびに少なくとも1つの操作されたベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼおよび操作されたベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドDが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法;
(d)レバウジオシドMを産生するための方法であって、少なくとも1つのステビオシドを含むおよび/またはステビオシドとrebAの混合物を含むステビオシド基質、NDP、スクロース、請求項1から7のいずれか一項に記載のスクロースシンターゼ、ならびに少なくとも1つの操作されたベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法;あるいは
(e)レバウジオシドMを産生する方法であって、ステビオシド基質、NDP、スクロース、請求項1から7のいずれか一項に記載の少なくとも1つのスクロースシンターゼ、ならびに少なくとも1つの操作されたベータ-1,2-グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、NDP、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドAが先ず産生され、次いでレバウジオシドDおよび/またはレバウジオシドIが産生され、最後にレバウジオシドMが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。 - 前記ベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼが、ADP-グルコース、CDP-グルコース、TDP-グルコース、GDP-グルコース、および/またはIDT-グルコースを利用できる操作されたベータ-1,3-グリコシルトランスフェラーゼである、請求項16に記載の方法。
- (i)前記NDPがADP、CDP、TDP、GDP、またはIDTである;(ii)前記NDPがUDPではない;かつ/または(iii)前記NDPがADPである、請求項17に記載の方法。
- 前記方法が、
(i)ワンポット反応として行われる、かつ/または
(ii)逐次的に行われる、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステビオシド基質が、Stevia rebaudianaから抽出されるか、または合成により産生される、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリコシルトランスフェラーゼおよび/または前記スクロースシンターゼが、固定化されている、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- フルクトースを含む反応産物を産生する、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フルクトースが、前記反応産物から除去される、請求項22に記載の方法。
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