JP2023038201A - 亜塩素酸水含有薬剤耐性菌および改良型細菌殺傷剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)亜塩素酸水を含む薬剤耐性菌殺傷剤。
(2)前記薬剤耐性菌殺傷剤は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、多剤耐性緑膿菌、およびバンコマイシン耐性腸球菌から選択される菌を不活化するものである、(1)に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(3)少なくとも100ppmで存在する、(1)または(2)に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(4)少なくとも200ppmで存在する、(1)~(3)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(5)少なくとも500ppmで存在する、(1)~(4)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(6)前記薬剤耐性菌殺傷は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を不活化するものであり、pH6.5以上である、(1)~(5)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(7)前記薬剤耐性菌殺傷は、多剤耐性緑膿菌、およびバンコマイシン耐性腸球菌から選択される菌を不活化するものであり、pH6.5以下である、(1)~(6)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(8)pHが約6.5である、(1)~(7)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(9)尿中の薬剤耐性菌の殺傷剤である、(1)~(8)のいずれか1項に記載の薬剤耐性菌殺傷剤。
(1)亜塩素酸水を含む細菌殺傷剤であって、グラム陰性菌に対して適用される場合酸性とされ、グラム陽性菌に対して適用される場合中性とされる、細菌殺傷剤。
(2)前記酸性は、pH6.5以下であり、前記中性は、pH6.5以上である、(1)に記載の細菌殺傷剤。
(3)前記細菌殺傷剤は、亜塩素酸水と、酸性および/または中性を付与する薬剤とを備えるキットとして提供される、(1)または(2)に記載の細菌殺傷剤。
(4)前記細菌は病原菌を含む、(1)~(3)のいずれか1項に記載の細菌殺傷剤。
(5)前記細菌は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、バチルス属菌、パエニバチルス属菌、緑膿菌、腸球菌、サルモネラ菌、カンピロバクターおよび歯周病菌からなる群より選択される少なくとも1種の菌を含む、(1)~(4)のいずれか1項に記載の細菌殺傷剤。
(6)亜塩素酸水を含む歯周病菌殺傷剤。
(7)pHが約6.5である、(1)~(6)のいずれか1項に記載の殺傷剤。
(8)pH調整剤と、(1)~(7)のいずれか1項に記載の殺傷剤とを含む、細菌殺傷キット。
(9)亜塩素酸水を含む細菌殺傷剤であって、該殺傷剤は、接触時に少なくとも25ppmの濃度で対象細菌に接触される、細菌殺傷剤。
(10)前記濃度は、少なくとも50ppmである、(9)に記載の細菌殺傷剤。
されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。
等を挙げることができる。試験は代表的に、Fusobacterium nucleatum F-1を用いることができる。Fusobacterium nucleatum F-1は、偏性嫌気性グラム陰性桿菌、ワンサンアンギーナ(紡錘菌とワンサンボレリアの混合感染による急性扁桃炎である。潰瘍偽膜性扁桃炎、壊死性潰瘍性扁桃炎とも呼ばれる。)である。本発明では、亜塩素酸水は歯周病菌に対して優れた細菌殺傷効果を示し、その効果は次亜塩素酸ナトリウムと同等かそれ以上であり、30分で生残菌数を10-5以下に低下させたことが実証されている。
例えば、クエン酸とクエン酸金属塩との組み合わせ、リン酸とリン酸緩衝液との組み合わせ、あるいはそれらの組み合わせ等を挙げることができるがそれらに限定されない。
本発明で使用される亜塩素酸水は、本発明者らが見出した特徴を有するものである。特許文献1に記載されるような既知の製法等の任意の方法により製造された亜塩素酸水を用いることができる。代表的な組成として、たとえば、亜塩素酸水61.40%、リン酸二
水素カリウム1.00%、水酸化カリウム0.10%および精製水37.50%のものを配合し、使用することができる(出願人より「オウトゥロックスーパー」との名称で販売される。亜塩素酸水72%は亜塩素酸30000ppmに該当する。)が、これに限定されず、亜塩素酸水は0.25%~75%、リン酸二水素カリウムは、0.70%~17.42%、水酸化カリウムは、0.10%~5.60%であっても良い。リン酸二水素カリウムの代わりにリン酸二水素ナトリウムを、水酸化カリウムの代わりに水酸化ナトリウムを使用しても良い。この薬剤は、酸性条件下で、有機物との接触による亜塩素酸の減衰を低減させているが、殺菌効果は維持している。かつ、塩素ガスの発生が軽微であり、塩素と有機物が混合した臭いの増幅をおさえるという特徴をも有する。
A式では塩素酸ナトリウム(NaClO3)水溶液のpH値が酸性内に維持できる量および濃度の硫酸(H2SO4)またはその水溶液を加えることで塩素酸を得ることを示している。次いで、B式では、塩素酸(HClO3)は、過酸化水素(H2O2)で還元され、亜塩素酸(HClO2)が生成されることを示している。
2)の状態を長く維持できるように調製する必要がある。
腸菌、黄色ブドウ球菌、バチルス属菌、パエニバチルス属菌、緑膿菌、腸球菌、サルモネラ菌、カンピロバクターおよび歯周病菌等を挙げることができるがそれに限定されない。したがって、1つの実施形態では、本発明はまた、亜塩素酸水を含む歯周病菌殺傷剤を提供する。
本実施例では、代表的に以下の細菌を用いた。実施例7における細菌は実施例7において示す。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌:Methicillin-resistant Staphylococcus aureus COL(MRSA;選択培地:BHI寒天培地)
多剤耐性緑濃菌:Multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa TUH(MDRP;選択培地:BHI寒天培地)
バンコマイシン耐性腸球菌:Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis BM1447(VRE;選択培地:BHI寒天培地)
(亜塩素酸水の定量法)
本品約5 gを精密に量り,水を加えて正確に100mlとする。この試料液20 mlを正確に量り、ヨウ素ビンに入れ、硫酸(1→10)10 mlを加えた後、ヨウ化カリウム1 gを加え、直ちに密栓をしてよくふり混ぜる。ヨウ素瓶の上部にヨウ化カリウム試液を流し込み、暗所に15分間放置する。次に栓を緩めてヨウ化カリウム試液を流し
込み、直ちに密栓してよくふり混ぜた後、遊離したヨウ素を0.1 mol/Lチオ硫酸ナトリウムで滴定する(指示薬 デンプン試液)。指示薬は液の色が淡黄色に変化した後に加える。別に空試験を行い補正する。0.1 mol/Lチオ硫酸ナトリウム溶液1 ml=1.711 mg HClO2)。
以下の実施例で使用される亜塩素酸水製剤は、以下のように生産した。本明細書では、亜塩素酸水は「亜水」と略称することがあるが、同義である。
亜塩素酸水の成分分析表
多剤耐性菌に対する亜塩素酸水の殺菌(細菌殺傷)効果
実施例1の調製方法に基づき調製した「亜塩素酸水で製造した亜塩素酸水製剤」を上記の「亜塩素酸水」の定量法に基づき「亜塩素酸水」の濃度を測定し、被検菌との接触時の「亜塩素酸水」の有効塩素濃度が10ppm、50ppm、100ppm、200ppm、500ppmになるように緩衝液の調製方法に基づき調製した各緩衝液を用いて調製した。
対照の薬剤としては、亜塩素酸ナトリウムを用いた。いずれも和光純薬等から入手可能である。
本実施例では、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する効果を確認した。方法は上記(殺菌作用(細菌殺傷作用)の測定法)に準じた。結果は図2に示す。
等のグラム陽性細菌では中性~アルカリ領域が好ましいことが理解される。より詳細には、100ppmでpHが高いpH6.5~8.5、亜塩素酸ナトリウムとの峻別を考慮するとpH6.5以上7.0未満の中性の領域では、完全にMRSAが殺傷されることがわかった。このことから、従前の予想に反してMRSA等のグラム陽性細菌では中性領域が好ましいことが理解される。
本実施例では、多剤耐性緑膿菌に対する効果を確認した。方法は上記(殺菌作用(細菌殺傷作用)の測定法)に準じた。結果は図3に示す。
faecalis BM1447に対する効果)
本実施例では、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)に対する効果を確認した。方法は上記(殺菌作用(細菌殺傷作用)の測定法)に準じた。結果は図4に示す。
亜塩素酸水は多剤耐性菌3株に対して優れた殺菌能を示し、100 ppm以上の濃度においては30秒で、99%以上の被験菌株を完全に殺傷した。
本実施例では、亜塩素酸水の尿中汚染細菌(MDRP)およびMRSAに対する増殖抑制効果を検討した。試験方法は、上記実施例に準ずるものであり、試料も上述のように準備したものを使用した。
本実施例では、歯周病菌としてFusobacterium nucleatum F
-1に対する亜塩素酸水の効果を確認した。以下にその手法および結果を示す。
菌液として、6.6×105cfu (0.1 ml)を用い、各種試験液 (0.1
ml;亜塩素酸水;次亜塩素酸ナトリウム;高度さらし粉および亜塩素酸ナトリウムを用い、緩衝液としてクエン酸リン酸緩衝液(0.8ml;pH8.5、7.5、6.5、5.5、4.5)を用いた。これを、25℃、30分で嫌気培養し、コロニー数より生残菌数を算出した。
本実施例では、感染性病原菌に対する細菌殺傷効果確認試験を行った。方法および結果は以下のとおりである。
亜塩素酸水の定量法は上述した(亜塩素酸水の定量法)に記載のとおりである。
1) 腸管出血性大腸O157:Escherichia coli O157 sakai株(1996,RIMD0509952)
2) 腸管出血性大腸O111:Escherichia coli O111患者からの分離株(2008,RIMD05092028)
3) 腸管出血性大腸O26 :Escherichia coli O26 集団食中毒からの分離株(2000,RIMD05091992)
4) 大腸菌:Escherichia coli IFO3927
5) メチシリン耐性黄色ブドウ球菌:Methicillin-resistant Staphylococcusaureus COL
6) 黄色ブドウ球菌:Stanphylococcus aureus IFO12732
7) 薬剤耐性緑濃菌:Multidrug-resistant Pseudomonasaeruginosa TUH
8) 緑濃菌:
9) バンコマイシン耐性腸球菌:Vancomycin-resistant Enterococcusfaecalis BM144710) 腸球菌:
11)サルモネラ菌:Salmonella Enteritidis IFO3313※ 4)大腸菌、6)黄色ブドウ球菌、8)緑濃菌、10)腸球菌は、現場におけるモニタリング時の指標菌として参照することを目的として設定した。
1) O157:腸管出血性大腸菌O157:H7 (選択培地:マッコンキー培地)
2) O111:腸管出血性大腸菌O111:HNM(選択培地:マッコンキー培地)
3) O26:腸管出血性大腸菌O26:H11(選択培地:マッコンキー培地)
4) 大腸菌:Escherichia coli IFO3927(選択培地:デゾキシコレート培地)
選択培地に画線し、37℃で24時間、培養した被検菌を各々滅菌生理食塩水に懸濁し、菌液(107 個/ml)を調製した。
5) サルモネラ菌:Salmonella Enteritidis IFO3313(選択培地:DHL培地)
選択培地に画線し、37℃で24時間、培養した被検菌を各々滅菌生理食塩水に懸濁し、菌液(107 個/ml)を調製した。
6) 黄色ブドウ球菌:Stanphylococcus aureus IFO 12732(選択培地:卵黄加マンニット食塩培地)
選択培地に画線し、37℃で24~48時間、培養した被検菌を各々滅菌生理食塩水中に均一に懸濁し、菌液(107個/ml)を調製した。
調製方法に基づき調製した「亜塩素酸水」を上記の「亜塩素酸水」の定量法に基づき「亜塩素酸水」の濃度を測定し、被検菌との接触時の「亜塩素酸水」の有効塩素濃度が10ppm、50 ppm、100 ppm、200 ppm、500 ppmになるように緩衝液の調製方法に基づき調製した各緩衝液を用いて調製した。それらの液9 mlを各々滅菌済試験管に加え、これらの検体を試料液とした。これらの試料液に被検菌液1mlを加え、均一に混合し、1分後、5分後、10分後に、再度均一に混合し、各1 mlを採取した。その採取した液を、滅菌済の0.01 mol/Lチオ硫酸ナトリウム溶液(各種緩衝液で調整)9 mLが入った試験管に加え、均一に混合し中和した後に、各0.1 mLを採取し、シャーレ1プレートに撒く。その後、各選択培地を約20 mL加えて混釈し、各温度と時間で培養後、生残菌数を測定した。
感染症の原因菌、並びに、当該原因菌の指標菌に対する「亜塩素酸水」の細菌殺傷効果確認試験結果
本実施例では、感染性病原菌に対する細菌殺傷効果確認試験を行った。方法および結果は以下のとおりである。
亜塩素酸水の定量法は上述した(亜塩素酸水の定量法)に記載のとおりである。
1)腸管出血性大腸O157:Escherichia coli O157 sakai株(1996,RIMD0509952)
2)カンピロバクター:Campylobacter jejuni JCM2013
(被検菌の調製方法)
1)O157:腸管出血性大腸菌O157:H7 (選択培地:マッコンキー培地)
選択培地に画線し、37℃で24時間、培養した被検菌を各々滅菌生理食塩水に懸濁し、菌液(109 個/ml)を調製した。
2)カンピロバクター:Campylobacter jejuni JCM2013(選択培地:CCDA平板培地)
選択培地に画線し、37℃で48時間、微好気条件下で培養した被検菌のシングルコロニーを白金耳で釣菌し、BHI培地50mL×3に植菌し、37℃で48時間、微好気条件下で震盪培養(震盪速度:100rpm)した。
鶏肉(ムネ肉):量販店で国産(産地不明)の鶏ムネ肉を試験前日に約2kg購入したものを用いた。
各培養した菌液を遠心分離(遠心速度:6000rpm)をかけ、上清の液体培地を捨て、滅菌済の生理食塩水で107程度になるように希釈調製した菌液を等量手動式噴霧器に入れ、106菌懸濁液を作成した。
結果を以下の表8および9に示す。
感染性病原菌として、腸管出血性大腸菌O157、カンピロバクターでも殺傷しうることが実証された。
本実施例では、無菌マウス飼育用アイソレーターが環境細菌に汚染された為、このアイソレーターから細菌類を分離し、各種対象消毒剤を用いて、細菌殺傷効果をIn vitroで確認した。
(1)Paenibacillus属細菌
(2)Bacillus属細菌
(3)N.D.
3種の細菌を分離し、16SrDNAを解析した結果、上記の菌種を同定した(PaenibacillusやBacillusの属名は解析出来たが、類縁の種が多数存在する為、種名は同定出来てない。また、No.(3)の菌種に関しては属名を同定することが出来なかった)。
Control:滅菌イオン交換水
(1)次亜塩素酸ナトリウム(南海化学社製)
(2)上記実施例で製剤化した「亜塩素酸水」
(3)Exspor (エコラボ社製:二酸化塩素)
<試験方法>
(1)BHI寒天培地で培養した各分離菌のシングルコロニーを5mLのBHI培地で37℃、2日間培養した。
(2)培養した菌液を遠心分離(3000×g、4℃、10min)によって集菌後、滅菌生理食塩水(0.85%)で2回洗浄し、約107CFU/mlの菌液を調製した(Inoculam値)。
(3)各対象薬剤を滅菌イオン交換水で所定濃度になるように希釈調製し、滅菌済試験管に9mLずつ分注した。
(4)この薬剤入試験管に(2)で調製した菌液を1 mL添加し、ボルテックスを用いて、よく混合した。
(5)所定時間に(4)の試験管から1 mL抜取、9mL 0.05mol/Lのチオ硫酸Na液に添加・混合し、中和を行った。
(6)中和処理後の液1 mLをシャーレに撒き、BHI寒天培地で混釈し、37℃、24時間培養を行い生育してきた生残菌数を測定した。
<結果>
する参考として援用されるべきであることが理解される。
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